JP4184875B2 - 新規スクリーニング方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２）の新規用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
多くのホルモンや神経伝達物質などの生理活性物質は、細胞膜に存在する特異的なレセプター蛋白質を通じて生体の機能を調節している。これらのレセプター蛋白質のうち多くは共役しているguanine nucleotide-binding protein（以下、Ｇ蛋白質と略称する場合がある）の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行ない、また、７個の膜貫通領域を有する共通した構造をもっていることから、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質あるいは７回膜貫通型レセプター蛋白質（７ＴＭＲ）と総称される。
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質は生体の細胞や臓器の各機能細胞表面に存在し、それら細胞や臓器の機能を調節する分子、例えば、ホルモン、神経伝達物質および生理活性物質等の標的として生理的に重要な役割を担っている。レセプターは生理活性物質との結合を介してシグナルを細胞内に伝達し、このシグナルにより細胞の賦活や抑制といった種々の反応が惹起される。
各種生体の細胞や臓器の内の複雑な機能を調節する物質と、その特異的レセプター蛋白質、特にはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との関係を明らかにすることは、各種生体の細胞や臓器の機能を解明し、それら機能と密接に関連した医薬品開発に非常に重要な手段を提供することとなる。
【０００３】
例えば、生体の種々の器官では、多くのホルモン、ホルモン様物質、神経伝達物質あるいは生理活性物質による調節のもとで生理的な機能の調節が行なわれている。特に、生理活性物質は生体内の様々な部位に存在し、それぞれに対応するレセプター蛋白質を通してその生理機能の調節を行っている。生体内には未知のホルモンや神経伝達物質その他の生理活性物質も多く、それらのレセプター蛋白質の構造に関しても、これまで報告されていないものが多い。さらに、既知のレセプター蛋白質においてもサブタイプが存在するかどうかについても分かっていないものが多い。
生体における複雑な機能を調節する物質と、その特異的レセプター蛋白質との関係を明らかにすることは、医薬品開発に非常に重要な手段である。また、レセプター蛋白質に対するアゴニスト、アンタゴニストを効率よくスクリーニングし、医薬品を開発するためには、生体内で発現しているレセプター蛋白質の遺伝子の機能を解明し、それらを適当な発現系で発現させることが必要であった。
近年、生体内で発現している遺伝子を解析する手段として、ｃＤＮＡの配列をランダムに解析する研究が活発に行なわれており、このようにして得られたｃＤＮＡの断片配列がExpressed Sequence Tag（ＥＳＴ）としてデータベースに登録され、公開されている。しかし、多くのＥＳＴは配列情報のみであり、その機能を推定することは困難である。
オーファンＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の１つとして、ヒトＦＰＲＬ１が知られている（非特許文献１）。ＦＰＲＬ１のアゴニストとしては、これまでにバクテリア由来のｆＭＬＦ、ＨＩＶ由来のｇｐ４１あるいはｇｐ１２０の部分ペプチド、プリオンの部分ペプチド、内因性の物質としてはＡβ４２、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｉの部分ペプチド、Ａｃｕｔｅ ｐｈａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ、ｈＣＡＰ１８、ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅなどの部分ペプチド、脂質であるリポキシンＡ４などが報告されている（非特許文献２）。
アルツハイマー病（Alzheimer’s disease）は進行性痴呆および認知能力の失調を伴う神経変性疾患の代表的なものであるが、これまでに効果的な治療法は見出されていない。アルツハイマー病は高齢化社会を迎えつつある現在において最も重要な疾患の一つであることは言うまでもなくその治療薬の開発は医療経済的にも極めて大きな意義を有する。
最近、橋本らは、アルツハイマー病患者の後頭葉に病変が少ないことに着目して「デス・トラップ」法（L. D’Adamioら、Semin. Immunol.、9巻、17-23頁、1997年）により家族性アルツハイマー病の原因遺伝子を導入した神経細胞の細胞死を抑制する遺伝子を後頭葉よりクローニングした（非特許文献３）。この遺伝子は、ｈｕｍａｎｉｎ（特許文献１）と名付けられた２４残基からなるペプチドをコードしており、合成ｈｕｍａｎｉｎペプチドは、家族性アルツハイマー病遺伝子を導入した神経細胞死を抑制したのみならず、アルツハイマー病の原因である可能性があると考えられているβアミロイド添加によって誘導される神経細胞死をも抑制した。ｈｕｍａｎｉｎは細胞外に分泌され、神経細胞に作用して細胞死を抑制するものと考えられているが、その受容体は明らかにされていなかった。
Ａβ４２がＦＰＲＬ１のアゴニストであり、ＦＰＲＬ１を介して走化性を示すこと、および、アルツハイマー病の特徴病変である老人班にＦＰＲＬ１が集積していることが報告されている。これらのことより、ＦＰＲＬ１とアルツハイマー病で見られる炎症反応との関連性が示唆されている（非特許文献４）。
Ａβ４２がＦＰＲＬ１を介してマクロファージ細胞内に取り込まれることにより、繊維素凝集（アミロイド様沈着）を形成することも報告されている（非特許文献５）。
さらに、オーファンＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の１つとして、マウスＦＰＲＬ２が知られている（非特許文献６）。
ヒトＦＰＲＬ２とｆＭＬＦ（ｆｏｒｍｙｌ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ）のレセプターであるＦＰＲ１との相同性が大きいが、ヒトＦＰＲＬ２はｆＭＬＦと反応しないことが報告されている。また、ＦＰＲＬ２は単球に発現が認められたが、ＦＰＲ１およびＦＰＲＬ１の発現が認められた好中球には発現が認められなかったことが報告されている（非特許文献７）。
Ｗ−Ｐｅｐｔｉｄｅ（Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Met-NH₂）がＦＰＲＬ１およびＦＰＲＬ２のアゴニストであり、ＦＰＲＬ２が単球で高発現していることが報告されている（非特許文献８)。
ヘリコバクターピロリ由来ペプチドＨｐ（２−２０）がＦＰＲＬ２のアゴニストであり、ＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２を介して単球を活性化することが報告されている（非特許文献９）。
抗原提示細胞の一種である樹状細胞（成熟型、未成熟型）に機能を保持したＦＰＲＬ２が発現しており、樹状細胞のｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ（輸送）を制御しているのではないかと報告されている。（非特許文献１０）。
ラット型ｈｕｍａｎｉｎが神経保護活性を有することが記載されている（非特許文献１１）。
【０００４】
【特許文献１】
ＷＯ ０１／２１７８７
【非特許文献１】
J. Biol. Chem. 267(11), 7637-7643(1992)
【非特許文献２】
Immunopharmacol. 2巻、1-13頁、2002年
【非特許文献３】
Proc. Natl. Acad. Sci. USA、９８巻、６３３６−６３４１頁、２００１年
【非特許文献４】
The Journal of Neuroscience, 2001, Vol.21 RC123
【非特許文献５】
The FASEB Journal, Vol.15 November 2001, 2454-2462
【非特許文献６】
Genomics 13 (2), 437-440 (1992)
【非特許文献７】
Biochem. Biophys. Res. Commun., 1994 May 30;201(1):174-9
【非特許文献８】
J. Biol. Chem. 276(24), 21585-21593(2001)
【非特許文献９】
J. Clin. Invest., 2001 Oct;108(8):1221-8
【非特許文献１０】
J. Leukoc. Biol., 2002 Sep;72(3):598-607
【非特許文献１１】
The FASEB Journal, Vol.16, August 2002, 1331-1333
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従来、Ｇ蛋白質共役型レセプターと生理活性物質（すなわち、リガンド）との結合を阻害する物質や、結合して生理活性物質（すなわち、リガンド）と同様なシグナル伝達を引き起こす物質は、これらレセプターの特異的なアンタゴニストまたはアゴニストとして、生体機能を調節する医薬品として活用されてきた。従って、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の特異的リガンドを決定することは、医薬品開発の標的ともなりうるアゴニスト、アンタゴニストを見出す際に、非常に重要な手段となる。
しかし、現時点でもなお、機能未知のＧ蛋白質共役型レセプター、また対応するリガンドが同定されていない、いわゆるオーファンレセプターが多数存在しており、Ｇ蛋白質共役型レセプターのリガンド探索および機能解明が切望されている。
Ｇ蛋白質共役型レセプターは、そのシグナル伝達作用を指標とする、新たな生理活性物質（すなわち、リガンド）の探索、また、該レセプターに対するアゴニストまたはアンタゴニストの探索に有用である。これら該レセプターに対するリガンド、アゴニストまたはアンタゴニストなどは、Ｇ蛋白質共役型レセプターの機能不全や機能亢進に関連する疾患の予防・治療薬や診断薬として活用することが期待できる。
さらにまた、Ｇ蛋白質共役型レセプターの遺伝子変異に基づく、生体での該レセプターの機能の低下または昂進が、何らかの疾患の原因となっている場合も多い。この場合には、該レセプターに対するアンタゴニストやアゴニストの投与だけでなく、該レセプター遺伝子の生体内（またはある特定の臓器）への導入や、該レセプター遺伝子に対するアンチセンス核酸の導入による、遺伝子治療に応用することもできる。この場合には該レセプターの塩基配列は遺伝子上の欠失や変異の有無を調べるために必要不可欠な情報であり、該レセプターの遺伝子は、該レセプターの機能不全に関与する疾患の予防・治療薬や診断薬に応用することもできる。
本発明は、オーファンＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質であるＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するリガンドの決定、およびＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２とリガンドであるｈｕｍａｎｉｎの用途に関する。すなわち、本発明は、ｈｕｍａｎｉｎとＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性を変化させる化合物（アンタゴニスト、アゴニスト）またはその塩のスクリーニング方法、該スクリーニング用キット、該スクリーニング方法もしくはスクリーニングキットを用いて得られうるｈｕｍａｎｉｎとＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性を変化させる化合物（アンタゴニスト、アゴニスト）またはその塩、およびｈｕｍａｎｉｎとＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性を変化させる化合物（アンタゴニスト、アゴニスト）もしくはＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の発現量を変化させる化合物またはその塩を含有してなる医薬などを提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために、鋭意研究を重ねた結果、ＦＰＲＬ１およびＦＰＲＬ２のリガンドがｈｕｍａｎｉｎまたはその塩であることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて、さらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、
〔１〕（１）配列番号：１（ヒトＦＰＲＬ１）、配列番号：１０（ラットＦＰＲＬ１）、配列番号：１２（マウスＦＰＲＬ２）または配列番号：１４（ヒトＦＰＲＬ２）で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）ｈｕｍａｎｉｎまたはその塩を用いることを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩とｈｕｍａｎｉｎまたはその塩との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
〔２〕ｈｕｍａｎｉｎが、
（１）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、
（２）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列中の連続する６〜２０個のアミノ酸からなるペプチドまたはその塩、または
（３）配列番号：７で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩である上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔３〕ｈｕｍａｎｉｎが、
（１）ａ）配列番号：３で表されるアミノ酸配列、ｂ）配列番号：３で表されるアミノ酸配列中の１〜１０個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、ｃ）配列番号：３で表されるアミノ酸配列に１〜１０個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ｄ）配列番号：３で表されるアミノ酸配列中の１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはｅ）これらの欠失・付加・置換を組み合わせたアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩、
（２）ａ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列、ｂ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列中の１〜１０個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、ｃ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列に１〜１０個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ｄ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列中の１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはｅ）これらの欠失・付加・置換を組み合わせたアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩、
（３）ａ）配列番号：８で表されるアミノ酸配列、ｂ）配列番号：８で表されるアミノ酸配列中の１〜１０個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、ｃ）配列番号：８で表されるアミノ酸配列に１〜１０個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ｄ）配列番号：８で表されるアミノ酸配列中の１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはｅ）これらの欠失・付加・置換を組み合わせたアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩、
（４）ａ）配列番号：３、配列番号：４または配列番号：８で表されるアミノ酸配列の第１９番目〜２４番目、第５番目〜２４番目、第１番目〜２０番目、第５番目〜２０番目もしくは第５番目〜２１番目のアミノ酸配列、ｂ）該アミノ酸配列中の１〜６個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、ｃ）該アミノ酸配列に１〜６個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ｄ）該アミノ酸配列中の１〜６個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、ｅ）またはこれらの欠失・付加・置換を組み合わせたアミノ酸配列からなり、アミノ酸の数が６〜２０個であるペプチド（ただし、配列番号：５で表されるアミノ酸配列の第１９番目〜２４番目、第５番目〜２４番目、第１番目〜２０番目、第５番目〜２０番目または第５番目〜２１番目のアミノ酸配列からなるペプチドを除く）またはその塩、または
（５）ａ）配列番号：７で表されるアミノ酸配列、ｂ）配列番号：７で表されるアミノ酸配列中の１〜１０個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、ｃ）配列番号：７で表されるアミノ酸配列に１〜１０個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ｄ）配列番号：７で表されるアミノ酸配列中の１〜１０個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはｅ）これらの欠失・付加・置換を組み合わせたアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩である上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔４〕ｈｕｍａｎｉｎが、
（１）配列番号：３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩、
（２）配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩、
（３）配列番号：６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩、
（４）配列番号：７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩、
（５）配列番号：８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩、
（６）配列番号：９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩、または
（７）配列番号：３、配列番号：４または配列番号：８で表されるアミノ酸配列の第１９番目〜２４番目、第５番目〜２４番目、第１番目〜２０番目、第５番目〜２０番目もしくは第５番目〜２１番目のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩、
である上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔５〕ｈｕｍａｎｉｎのＮ末端メチオニン残基のアミノ基がホルミル化されている上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔６〕ｈｕｍａｎｉｎが、Ｎ末端メチオニン残基のアミノ基がホルミル化されている配列番号：３、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩である上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔７〕（１）配列番号：１、配列番号：１０、配列番号：１２または配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および
（２）ｈｕｍａｎｉｎまたはその塩を含有することを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩とｈｕｍａｎｉｎまたはその塩との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
〔８〕上記〔１〕記載のスクリーニング方法または上記〔７〕記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、ｈｕｍａｎｉｎまたはその塩と配列番号：１、配列番号：１０、配列番号：１２または配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩、
〔９〕アゴニストである上記〔８〕記載の化合物、
〔１０〕アンタゴニストである上記〔８〕記載の化合物、
〔１１〕ｈｕｍａｎｉｎまたはその塩と配列番号：１、配列番号：１０、配列番号：１２または配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩を含有してなる医薬、
〔１２〕配列番号：１、配列番号：１０、配列番号：１２または配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストを含有してなる神経変性疾患もしくは脳機能障害の予防・治療剤、
〔１３〕アルツハイマー病、パーキンソン病、ダウン症、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン舞踏病、糖尿病性ニューロパチー、多発性硬化症、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血、虚血性脳疾患、硬膜外血腫または硬膜下血腫の予防・治療剤である上記〔１２〕記載の予防・治療剤、
〔１４〕配列番号：１、配列番号：１０、配列番号：１２または配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストを含有してなる細胞死抑制剤、
〔１５〕配列番号：１、配列番号：１０または配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有してなる神経変性疾患もしくは脳機能障害の予防・治療剤、
〔１６〕アルツハイマー病、パーキンソン病、ダウン症、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン舞踏病、糖尿病性ニューロパチー、多発性硬化症、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血、虚血性脳疾患、硬膜外血腫または硬膜下血腫の予防・治療剤である上記〔１５〕記載の予防・治療剤、
〔１７〕配列番号：１、配列番号：１０、配列番号：１２または配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有してなる細胞死抑制剤、
〔１８〕配列番号：１、配列番号：１０、配列番号：１２または配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる神経変性疾患もしくは脳機能障害の予防・治療剤、
〔１９〕アルツハイマー病、パーキンソン病、ダウン症、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン舞踏病、糖尿病性ニューロパチー、多発性硬化症、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血、虚血性脳疾患、硬膜外血腫または硬膜下血腫の予防・治療剤である上記〔１８〕記載の予防・治療剤、
〔２０〕配列番号：１、配列番号：１０、配列番号：１２または配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる細胞死抑制剤、
〔２１〕配列番号：１、配列番号：１０、配列番号：１２または配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる神経変性を伴う疾病の診断剤、
〔２２〕アルツハイマー病、パーキンソン病、ダウン症、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン舞踏病、糖尿病性ニューロパチー、多発性硬化症、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血、虚血性脳疾患、硬膜外血腫または硬膜下血腫の診断剤である上記〔２１〕記載の診断剤、
〔２３〕配列番号：１、配列番号：１０、配列番号：１２または配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる神経変性を伴う疾病の診断剤、
〔２４〕アルツハイマー病、パーキンソン病、ダウン症、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン舞踏病、糖尿病性ニューロパチー、多発性硬化症、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血、虚血性脳疾患、硬膜外血腫または硬膜下血腫の診断剤である上記〔２３〕記載の診断剤、
〔２５〕配列番号：１、配列番号：１０、配列番号：１２または配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを用いることを特徴とする当該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を増加し、神経変性疾患もしくは脳機能障害を予防・治療する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
〔２６〕配列番号：１、配列番号：１０、配列番号：１２または配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる当該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を増加し、神経変性疾患もしくは脳機能障害を予防・治療する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
〔２７〕上記〔２５〕記載のスクリーニング方法または上記〔２６〕記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加し、神経変性疾患もしくは脳機能障害を予防・治療する化合物またはその塩、
〔２８〕配列番号：１、配列番号：１０、配列番号：１２または配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加する化合物またはその塩を含有してなる神経変性疾患もしくは脳機能障害の予防・治療剤、
〔２９〕アルツハイマー病、パーキンソン病、ダウン症、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン舞踏病、糖尿病性ニューロパチー、多発性硬化症、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血、虚血性脳疾患、硬膜外血腫または硬膜下血腫の予防・治療剤である上記〔２８〕記載の予防・治療剤、
〔３０〕配列番号：１、配列番号：１０、配列番号：１２または配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを用いることを特徴とする当該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を増加し、細胞死を抑制する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
〔３１〕配列番号：１、配列番号：１０、配列番号：１２または配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる当該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を増加し、細胞死を抑制する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
〔３２〕上記〔３０〕記載のスクリーニング方法または上記〔３１〕記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる配列番号：１、配列番号：１０、配列番号：１２または配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加し、細胞死を抑制する化合物またはその塩、
〔３３〕配列番号：１、配列番号：１０、配列番号：１２または配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加する化合物またはその塩を含有してなる細胞死抑制剤、
〔３４〕（１）配列番号：１、配列番号：１０、配列番号：１２または配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）ｈｕｍａｎｉｎまたはその塩と該レセプター蛋白質またはその塩との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩を用いることを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、
〔３５〕試験化合物を配列番号：１、配列番号：１０または配列番号：１２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞に接触させた場合における細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性を測定することを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストのスクリーニング方法、
〔３６〕哺乳動物に対して、▲１▼配列番号：１、配列番号：１０、配列番号：１２または配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩、▲２▼配列番号：１、配列番号：１０、配列番号：１２または配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、または▲３▼配列番号：１、配列番号：１０、配列番号：１２または配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストの有効量を投与することを特徴とする（ｉ）神経変性疾患もしくは脳機能障害の予防・治療方法、（ii）アルツハイマー病、パーキンソン病、ダウン症、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン舞踏病、糖尿病性ニューロパチー、多発性硬化症、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血、虚血性脳疾患、硬膜外血腫または硬膜下血腫の予防・治療方法または（iii）細胞死抑制方法、
〔３７〕（ｉ）神経変性疾患もしくは脳機能障害の予防・治療剤、（ii）アルツハイマー病、パーキンソン病、ダウン症、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン舞踏病、糖尿病性ニューロパチー、多発性硬化症、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血、虚血性脳疾患、硬膜外血腫または硬膜下血腫の予防・治療剤または（iii）細胞死抑制剤を製造するための▲１▼配列番号：１、配列番号：１０、配列番号：１２または配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩、▲２▼配列番号：１、配列番号：１０、配列番号：１２または配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、または▲３▼配列番号：１、配列番号：１０、配列番号：１２または配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するアゴニストの使用、
〔３８〕Ｎ末端メチオニン残基のアミノ基がホルミル化されているｈｕｍａｎｉｎまたはその塩、
〔３９〕Ｎ末端メチオニン残基のアミノ基がホルミル化されている配列番号：３、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩である上記〔３８〕記載のｈｕｍａｎｉｎまたはその塩、
〔４０〕配列番号：６（ヒトｈｕｍａｎｉｎ（１−２１））または配列番号：９（ラットｈｕｍａｎｉｎ（１−２１））で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩、
〔４１〕上記〔３８〕記載のｈｕｍａｎｉｎもしくはその塩または上記〔４０〕記載のポリペプチドもしくはその塩を含有してなる医薬、
〔４２〕神経変性疾患もしくは脳機能障害の予防・治療剤である上記〔４１〕記載の医薬、
〔４３〕アルツハイマー病、パーキンソン病、ダウン症、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン舞踏病、糖尿病性ニューロパチー、多発性硬化症、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血、虚血性脳疾患、硬膜外血腫または硬膜下血腫の予防・治療剤である上記〔４１〕記載の医薬、
〔４４〕細胞死抑制剤である上記〔４１〕記載の医薬、
〔４５〕哺乳動物に対して、上記〔３８〕記載のｈｕｍａｎｉｎもしくはその塩または上記〔４０〕記載のポリペプチドもしくはその塩の有効量を投与することを特徴とする（ｉ）神経変性疾患もしくは脳機能障害の予防・治療方法、（ii）アルツハイマー病、パーキンソン病、ダウン症、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン舞踏病、糖尿病性ニューロパチー、多発性硬化症、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血、虚血性脳疾患、硬膜外血腫または硬膜下血腫の予防・治療方法または（iii）細胞死抑制方法、および
〔４６〕（ｉ）神経変性疾患もしくは脳機能障害の予防・治療剤、（ii）アルツハイマー病、パーキンソン病、ダウン症、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン舞踏病、糖尿病性ニューロパチー、多発性硬化症、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血、虚血性脳疾患、硬膜外血腫または硬膜下血腫の予防・治療剤または（iii）細胞死抑制剤を製造するための上記〔３８〕記載のｈｕｍａｎｉｎもしくはその塩または上記〔４０〕記載のポリペプチドもしくはその塩の使用を提供する。
【０００８】
さらに、本発明は、
〔４７〕（ｉ）配列番号：１、配列番号：１０、配列番号：１２または配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（以下、ＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２と略記する）、その部分ペプチドまたはその塩と、ｈｕｍａｎｉｎまたはその塩とを接触させた場合と、（ii）ＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２、その部分ペプチドまたはその塩と、ｈｕｍａｎｉｎまたはその塩および試験化合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔４８〕（ｉ）標識したｈｕｍａｎｉｎまたはその塩をＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２、その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合と、（ii）標識したｈｕｍａｎｉｎまたはその塩および試験化合物をＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２、その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合における、標識したｈｕｍａｎｉｎまたはその塩のＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２、その部分ペプチドまたはその塩に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔４９〕（ｉ）標識したｈｕｍａｎｉｎまたはその塩をＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２を含有する細胞に接触させた場合と、（ii）標識したｈｕｍａｎｉｎまたはその塩および試験化合物をＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２を含有する細胞に接触させた場合における、標識したｈｕｍａｎｉｎまたはその塩の該細胞に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔５０〕（ｉ）標識したｈｕｍａｎｉｎまたはその塩をＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２を含有する細胞の膜画分に接触させた場合と、（ii）標識したｈｕｍａｎｉｎまたはその塩および試験化合物をＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２を含有する細胞の膜画分に接触させた場合における、標識したｈｕｍａｎｉｎまたはその塩の該細胞の膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔５１〕（ｉ）標識したｈｕｍａｎｉｎまたはその塩を、ＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換した形質転換体を培養することによって当該形質転換体の細胞膜に発現したＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２に接触させた場合と、（ii）標識したｈｕｍａｎｉｎまたはその塩および試験化合物を当該質転換体の細胞膜に発現したＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２に接触させた場合における、標識したｈｕｍａｎｉｎまたはその塩のＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔５２〕（ｉ）ＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２を活性化する化合物またはその塩をＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２を含有する細胞に接触させた場合と、（ii）ＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２を活性化する化合物またはその塩および試験化合物をＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２を含有する細胞に接触させた場合における、ＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２を介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔５３〕ＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２を活性化する化合物またはその塩を、ＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換した形質転換体を培養することによって当該形質転換体の細胞膜に発現したＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２に接触させた場合と、ＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２を活性化する化合物またはその塩および試験化合物を当該形質転換体の細胞膜に発現したＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２に接触させた場合における、ＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２を介する細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする上記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔５４〕ＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２を活性化する化合物がｈｕｍａｎｉｎである上記〔５２〕または〔５３〕記載のスクリーニング方法、
〔５５〕ＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２を含有する細胞またはその膜画分を含有することを特徴とする上記〔７〕記載のスクリーニング用キット、および
〔５６〕ＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換した形質転換体を培養することによって当該形質転換体の細胞膜に発現したＦＰＲＬ１／ＦＰＲＬ２を含有することを特徴とする上記〔７〕記載のスクリーニング用キット等を提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明で使用されるＦＰＲＬ１は、配列番号：１、配列番号：１０または配列番号：１２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプター蛋白質である。
本発明で使用されるＦＰＲＬ２は、配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプター蛋白質である。
ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２は、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）のあらゆる細胞（例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）や血球系の細胞、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、腸管、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、特に、脾臓、骨髄、腸管、単球、マクロファージなどの免疫担当臓器と免疫担当細胞に由来する蛋白質であってもよく、また合成蛋白質であってもよい。
【００１０】
配列番号：１、配列番号：１０または配列番号：１２で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：１、配列番号：１０または配列番号：１２で表わされるアミノ酸配列と約８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
本発明の配列番号：１、配列番号：１０または配列番号：１２で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、配列番号：１、配列番号：１０または配列番号：１２で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１、配列番号：１０または配列番号：１２で表わされるアミノ酸配列からなるＦＰＲＬ１と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列と約８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
本発明の配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列からなるＦＰＲＬ２と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができるが、例えば、後に記載するスクリーニング方法に従って測定することができる。
また、ＦＰＲＬ１としては、ａ）配列番号：１、配列番号：１０または配列番号：１２で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、ｂ）配列番号：１、配列番号：１０または配列番号：１２で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ｃ）配列番号：１、配列番号：１０または配列番号：１２で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはｄ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども用いられる。
ＦＰＲＬ２としては、ａ）配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、ｂ）配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ｃ）配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはｄ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども用いられる。
【００１１】
本明細書におけるＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２は、ペプチド標記の慣例に従って、左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するＦＰＲＬ１をはじめとするＦＰＲＬ１は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート(−ＣＯＯ⁻)、アミド（−ＣＯＮＨ_２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ_１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ_３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ_６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ_１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ_１−２アルキル基などのＣ_７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２には、上記した蛋白質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ_２−６アルカノイル基などのＣ_１−６アシル基など）で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ_２−６アルカノイル基などのＣ_１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
本発明のＦＰＲＬ１の具体例としては、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるヒト由来ＦＰＲＬ１、配列番号：１０で表わされるアミノ酸配列からなるラット由来ＦＰＲＬ１、配列番号：１２で表わされるアミノ酸配列からなるマウス由来ＦＰＲＬ２などが用いられる。このヒト由来ＦＰＲＬ１は、J. Biol. Chem. 267(11), 7637-7643(1992)に記載されている公知の蛋白質である。マウス由来ＦＰＲＬ２は、J. Immunol. 169, 3363-3369 (2002)に記載されている公知の蛋白質である。
本発明のＦＰＲＬ２の具体例としては、例えば、配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列からなるヒト由来ＦＰＲＬ２などが用いられる。このヒト由来ＦＰＲＬ２は、Genomics 13 (2), 437-440 (1992)に記載されている公知の蛋白質である。
【００１２】
ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の部分ペプチド（以下、本発明の部分ペプチドと略記する場合がある）としては、上記したＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の部分ペプチドであれば何れのものであってもよいが、例えば、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の蛋白質分子のうち、細胞膜の外に露出している部位であって、実質的に同質のレセプター結合活性を有するものなどが用いられる。
具体的には、配列番号：１、配列番号：１０または配列番号：１２で表わされるアミノ酸配列を有するＦＰＲＬ１の部分ペプチドまたは配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列を有するＦＰＲＬ２の部分ペプチドとしては、疎水性プロット解析において細胞外領域（親水性（Hydrophilic）部位）であると分析された部分を含むペプチドである。また、疎水性（Hydrophobic）部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。
本発明の部分ペプチドのアミノ酸の数は、上記した本発明のレセプター蛋白質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
実質的に同一のアミノ酸配列とは、これらアミノ酸配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を示す。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。ここで、「実質的に同質のレセプター活性」とは、上記と同意義を示す。「実質的に同質のレセプター活性」の測定は上記と同様に行なうことができる。
【００１３】
また、本発明の部分ペプチドは、上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、本発明の部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ⁻）、アミド（−ＣＯＮＨ_２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。本発明の部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明の部分ペプチドには、上記したＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明のＦＰＲＬ１、ＦＰＲＬ２またはその部分ペプチドの塩としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００１４】
本発明のＦＰＲＬ１またはその塩は、上記したヒトや哺乳動物の細胞または組織から自体公知のレセプター蛋白質の精製方法によって製造することもできるし、後に記載する本発明のＦＰＲＬ１をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後に記載する蛋白質合成法またはこれに準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００１５】
本発明のＦＰＲＬ１もしくはその部分ペプチドまたはその塩またはそのアミド体の合成には、通常市販の蛋白質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とする蛋白質の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂から蛋白質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的の蛋白質またはそのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、蛋白質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００１６】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、蛋白質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することができる。
【００１７】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ_２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００１８】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢt）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
【００１９】
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
蛋白質のアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（蛋白質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いた蛋白質とＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去した蛋白質とを製造し、この両蛋白質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護蛋白質を精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗蛋白質を得ることができる。この粗蛋白質は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の蛋白質のアミド体を得ることができる。
蛋白質のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、蛋白質のアミド体と同様にして、所望の蛋白質のエステル体を得ることができる。
【００２０】
本発明のＦＰＲＬ１の部分ペプチドまたはその塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明のＦＰＲＬ１を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明のＦＰＲＬ１を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下のａ）〜ｅ）に記載された方法が挙げられる。
ａ）M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
ｂ）SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
ｃ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
ｄ）矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 蛋白質の化学IV、 205、(1977年)
ｅ）矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成 広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
本発明のＦＰＲＬ２、その部分ペプチドまたはその塩も上記と同様の方法で製造することができる。
【００２１】
本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２をコードするポリヌクレオチドとしては、上記した本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２をコードする塩基配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を含有するものであればいかなるものであってもよい。該ポリヌクレオチドとしては、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２をコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであり、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード鎖）であってもよい。
本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２をコードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、公知の実験医学増刊「新ＰＣＲとその応用」15(7)、1997記載の方法またはそれに準じた方法により、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２のｍＲＮＡを定量することができる。
本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２をコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞・組織よりtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
具体的には、本発明のＦＰＲＬ１をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１、配列番号：１０または配列番号：１２で表わされるアミノ酸配列からなるＦＰＲＬ１と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するレセプター蛋白質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：２、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされる塩基配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
本発明のＦＰＲＬ２をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：１５で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列からなるＦＰＲＬ２と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するレセプター蛋白質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：１５で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１５で表わされる塩基配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。
【００２２】
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
該ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＲＬ１をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。配列番号：１０で表わされるアミノ酸配列からなるラットＦＰＲＬ１をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１１で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。配列番号：１２で表わされるアミノ酸配列からなるマウスＦＰＲＬ２をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１３で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列からなるヒトＦＰＲＬ２をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１５で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。
【００２３】
本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２をコードするＤＮＡの塩基配列の一部、または該ＤＮＡと相補的な塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチドとは、下記の本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡを包含するだけではなく、ＲＮＡをも包含する意味で用いられる。
本発明に従えば、ＦＰＲＬ１遺伝子またはＦＰＲＬ２遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）を、クローン化した、あるいは決定されたＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうしたポリヌクレオチド（核酸）は、ＦＰＲＬ１遺伝子またはＦＰＲＬ２遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいはＦＰＲＬ１関連ＲＮＡまたはＦＰＲＬ２関連ＲＮＡとの相互作用を介してＦＰＲＬ１遺伝子またはＦＰＲＬ２遺伝子の発現を調節・制御することができる。ＦＰＲＬ１関連ＲＮＡまたはＦＰＲＬ２関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、およびＦＰＲＬ１関連ＲＮＡまたはＦＰＲＬ２関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外でＦＰＲＬ１遺伝子またはＦＰＲＬ２遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とペプチド（蛋白質）との間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド（蛋白質）のアミノ酸を通常指している。ＦＰＲＬ１遺伝子またはＦＰＲＬ２遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、蛋白質コード領域、ＯＲＦ翻訳開始コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、ＦＰＲＬ１遺伝子またはＦＰＲＬ２遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、対象物と「アンチセンス」であるということができる。アンチセンス・ポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシリボヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販の蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えば蛋白質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、プソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
【００２４】
本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうして修飾は当該分野で数多く知られており、例えばJ. Kawakami et al., Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395, 1992; S. T. Crooke et al. ed., Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993 などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった粗水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞に適用できる。
【００２５】
本発明のＦＰＲＬ１の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、上記した本発明のＦＰＲＬ１の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞・組織よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
具体的には、本発明のＦＰＲＬ１の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、（１）配列番号：２、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または（２）配列番号：２、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１、配列番号：１０または配列番号：１２で表わされるアミノ酸配列からなるＦＰＲＬ１と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するレセプター蛋白質をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされる塩基配列ハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２、配列番号：１１または配列番号：１３で表わされる塩基配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
本発明のＦＰＲＬ２の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、（１）配列番号：１５で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または（２）配列番号：１５で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列からなるＦＰＲＬ２と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するレセプター蛋白質をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：１５で表わされる塩基配列ハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１５で表わされる塩基配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
該ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
【００２６】
本発明のＦＰＲＬ１またはその部分ペプチド（以下、ＦＰＲＬ１と略記する場合がある）または本発明のＦＰＲＬ２またはその部分ペプチド（以下、ＦＰＲＬ２と略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００２７】
ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、Ｍｕｔａｎ^ＴＭ−ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ（宝酒造（株））、Ｍｕｔａｎ^ＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））などを用いて、ＯＤＡ−ＬＡ ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法などの自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
【００２８】
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰ_Ｌプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００２９】
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ^ｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏ^ｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁻）細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のレセプター蛋白質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
【００３０】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research），９巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology），１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ⁻，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Pichia pastoris）などが用いられる。
【００３１】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh Five^ＴＭ 細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Vivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁻）細胞と略記）、マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
【００３２】
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６９巻，２１１０（１９７２）やジーン（Gene），１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メッソズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７５巻，１９２９(１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology），６，４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００３３】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Molecular Genetics），４３１−４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリル アクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００３４】
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.C.C., ネイチャー（Nature）, 195, 788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The Journal of the American Medical Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を生成せしめることができる。
【００３５】
上記培養物から本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００^ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的新和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００３６】
かくして得られるＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を、精製前または精製後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の活性は、標識したリガンド（ｈｕｍａｎｉｎ）との結合実験および特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。
【００３７】
本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対する抗体は、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対する抗体は、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
【００３８】
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２は、哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化レセプター蛋白質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature）、２５６巻、４９５頁（１９７５年）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウイルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で約１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
【００３９】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、レセプター蛋白質の抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したレセプター蛋白質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００４０】
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
【００４１】
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（ＦＰＲＬ１抗原またはＦＰＲＬ２抗原）とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０.１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００４２】
本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２のリガンドはｈｕｍａｎｉｎまたはその塩である。
ｈｕｍａｎｉｎとしては、（１）配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、（２）配列番号：７で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドなどが用いられる。
ｈｕｍａｎｉｎは、ヒトや非ヒト温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル等）の細胞（例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞等）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、唾液腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、軟骨、関節、骨格筋等に由来するポリペプチドであってもよく、組換えポリペプチドであってもよく、合成ポリペプチドであってもよい。
【００４３】
「実質的に同一」とはｈｕｍａｎｉｎの活性、例えば、細胞死抑制作用（例、各種疾患に伴う細胞死に対する抑制作用）、細胞生存維持作用、または神経変性疾患、癌、免疫疾患、感染症、消化管疾患、循環器疾患、内分泌疾患等の予防・治療活性（作用）など、生理的な特性などが、実質的に同じことを意味する。アミノ酸の置換、欠失、付加あるいは挿入が、ポリペプチドの生理的な特性や化学的な特性に大きな変化をもたらさない限り、当該置換、欠失、付加あるいは挿入を施されたポリペプチドは、当該置換、欠失、付加あるいは挿入のされていないものと実質的に同一である。該アミノ酸配列中のアミノ酸の実質的に同一な置換物としては、たとえばそのアミノ酸が属するところのクラスのうち他のアミノ酸類から選ぶことができる。
非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニンなどがあげられる。極性（中性）アミノ酸としてはグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンなどがあげられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としてはアルギニン、リジン、ヒスチジンなどがあげられる。負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００４４】
配列番号：３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、該アミノ酸配列を含有するポリペプチドが、配列番号：３で表されるアミノ酸配列からなるｈｕｍａｎｉｎと実質的に同一の活性（性質）を有する限り、特に限定されるものではなく、例えば配列番号：３で表されるアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約８５％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列等が挙げられる。
配列番号：７で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、該アミノ酸配列を含有するポリペプチドが、配列番号：７で表されるアミノ酸配列からなるｈｕｍａｎｉｎと実質的に同一の活性（性質）を有する限り、特に限定されるものではなく、例えば配列番号：７で表されるアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約８５％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列等が挙げられる。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。上記の実質的に同質の活性（性質）としては、例えば、配列番号：３または配列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有するｈｕｍａｎｉｎの有する細胞死抑制作用（例、各種疾患に伴う細胞死に対する抑制作用）、細胞生存維持作用、または神経変性疾患、癌、免疫疾患、感染症、消化管疾患、循環器疾患、内分泌疾患等の予防・治療活性（作用）などが定性的に同質であることを示す。
また、配列番号：３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するｈｕｍａｎｉｎとしてより具体的には、例えば、ａ）配列番号：３、配列番号：４または配列番号：８で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１０個程度、好ましくは１〜６個程度、より好ましくは１〜３個程度、さらに好ましくは１または２個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、ｂ）配列番号：３、配列番号：４または配列番号：８で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜１０個程度、好ましくは１〜６個程度、より好ましくは１〜３個程度、さらに好ましくは１または２個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ｃ）配列番号：３、配列番号：４または配列番号：８で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜５個程度、好ましくは１〜３個程度、さらに好ましくは１または２個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはｄ）それらの欠失・付加・置換を組み合わせたアミノ酸配列からなるポリペプチドなども含まれるが、配列番号：５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号：５で表されるアミノ酸配列の第１番目〜２１番目のアミノ酸配列からなるポチペプチドは含まれない。
配列番号：７で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するｈｕｍａｎｉｎとしてより具体的には、例えば、ａ）配列番号：７で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１０個程度、好ましくは１〜６個程度、より好ましくは１〜３個程度、さらに好ましくは１または２個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、ｂ）配列番号：７で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜１０個程度、好ましくは１〜６個程度、より好ましくは１〜３個程度、さらに好ましくは１または２個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ｃ）配列番号：７で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１０個程度、好ましくは１〜６個程度、より好ましくは１〜３個程度、さらに好ましくは１または２個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはｄ）それらの欠失・付加・置換を組み合わせたアミノ酸配列からなるポリペプチドなども含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、特に限定されない。
具体的には、ｈｕｍａｎｉｎとしては、例えば、
（１）配列番号：３で表わされるアミノ酸配列からなるヒト型ｈｕｍａｎｉｎ（１−２４）、
（２）配列番号：４で表わされるアミノ酸配列からなる［Ｇｌｙ^１４］−ヒト型ｈｕｍａｎｉｎ（１−２４）、
（３）配列番号：６で表わされるアミノ酸配列からなるヒト型ｈｕｍａｎｉｎ（１−２１）、
（４）配列番号：７で表わされるアミノ酸配列からなるラット型ｈｕｍａｎｉｎ（１−３８）、
（５）配列番号：８で表わされるアミノ酸配列からなるラット型ｈｕｍａｎｉｎ（１−２４）、
（６）配列番号：９で表わされるアミノ酸配列からなるラット型ｈｕｍａｎｉｎ（１−２１）などが挙げられる。
【００４５】
ｈｕｍａｎｉｎは、上記したポリペプチドの部分ペプチドであってもよい。ｈｕｍａｎｉｎの部分ペプチドとしては、前記したｈｕｍａｎｉｎの部分ペプチドであれば何れのものであってもよいが、例えば、ｈｕｍａｎｉｎと実質的に同質の活性（「実質的に同質の活性」は上記と同意義を示す）ものなどが好ましく用いられる。
ｈｕｍａｎｉｎの部分ペプチドとしてより具体的には、前記した配列番号：３または配列番号：７で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドの部分ペプチドなどが挙げられ、好ましくは前記した配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列中の連続する６〜２０個程度、好ましくは６〜１５個程度、より好ましくは６〜１０個程度のアミノ酸配列からなる部分ペプチドなどが用いられる。
「実質的に同一」とは、上記のｈｕｍａｎｉｎの説明における「実質的に同一」と同意義を示す。
また、ｈｕｍａｎｉｎの部分ペプチドとしてより具体的には、例えば、ａ）配列番号：３、配列番号：４または配列番号：８で表されるアミノ酸配列中の６〜２０個程度、好ましくは６〜１５個程度、より好ましくは６〜１０個程度のアミノ酸配列からなるペプチド、またはｂ）該アミノ酸配列中の１または２個以上（例、１〜６個程度、好ましくは１〜３個程度、より好ましくは１または２個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、ｃ）該アミノ酸配列に１または２個以上（例、１〜６個程度、好ましくは１〜３個程度、より好ましくは１または２個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ｄ）該アミノ酸配列中の１または２個以上（例、１〜６個程度、好ましくは１〜３個程度、より好ましくは１または２個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはｅ）それらの欠失・付加・置換を組み合わせたアミノ酸配列からなる部分ペプチドなども含まれ、なかでも配列番号：３、配列番号：４または配列番号：８で表されるアミノ酸配列中のＮ末端から数えて６〜２０個程度、好ましくは６〜１５個程度、より好ましくは６〜１０個程度のアミノ酸配列からなるペプチドなどが好ましく用いられる。上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、特に限定されない。ただし、上記の置換に関しては、配列番号：３または配列番号：４で表されるアミノ酸配列の第３、１２、１４、１５、１６または２４番目のアミノ酸の置換は含まれない。
ｈｕｍａｎｉｎの部分ペプチドの具体例として、例えば、ａ）配列番号：３、配列番号：４または配列番号：８で表されるアミノ酸配列の第１９番目〜２４番目、第５番目〜２４番目、第１番目〜２０番目、第５番目〜２０番目または第５番目〜２１番目のアミノ酸配列、またはｂ）該アミノ酸配列中の１または２個以上（例、１〜６個程度、好ましくは１〜３個程度、より好ましくは１または２個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、ｃ）該アミノ酸配列に１または２個以上（例、１〜６個程度、好ましくは１〜３個程度、より好ましくは１または２個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ｄ）該アミノ酸配列中の１または２個以上（例、１〜６個程度、好ましくは１〜３個程度、より好ましくは１または２個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはｅ）それらの欠失・付加・置換を組み合わせたアミノ酸配列からなり、アミノ酸の数が６〜２０個程度、好ましくは６〜１５個程度、より好ましくは６〜１０個程度である部分ペプチドなどが挙げられる。ただし、上記の置換に関しては、配列番号：３または配列番号：４で表されるアミノ酸配列の第３、１２、１４、１５、１６または２４番目のアミノ酸の置換は含まれない。
また、ｈｕｍａｎｉｎの部分ペプチドには、配列番号：５で表されるアミノ酸配列の第１９番目〜２４番目、第５番目〜２４番目、第１番目〜２０番目、第５番目〜２０番目または第５番目〜２１番目のアミノ酸配列からなるペプチドは含まれない。
ｈｕｍａｎｉｎの部分ペプチドのより好ましい具体例として、配列番号：３、配列番号：４または配列番号：８で表されるアミノ酸配列の第１９番目〜２４番目、第５番目〜２４番目、第１番目〜２０番目、第５番目〜２０番目または第５番目〜２１番目のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
【００４６】
また、ｈｕｍａｎｉｎまたはその部分ペプチドには、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
さらに、ｈｕｍａｎｉｎは、それぞれ単量体の他に、２量体、３量体、４量体などとして存在していてもよく、具体的には、ｈｕｍａｎｉｎ同士で２量体を形成する場合、本発明の部分ペプチド同士で２量体を形成する場合、ｈｕｍａｎｉｎと本発明の部分ペプチドとで２量体を形成する場合などが挙げられる。
さらに、ｈｕｍａｎｉｎまたはその部分ペプチド（以下、ｈｕｍａｎｉｎと略記する）には、おのおののＮ末端またはＣ末端などにエピトープ（抗体認識部位）となりうる任意の外来ペプチド配列（例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、ＨＳＶタグなど）を有しているものも含まれる。
ｈｕｍａｎｉｎは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：３または配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをはじめとするｈｕｍａｎｉｎは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ⁻）、アミド（−ＣＯＮＨ_２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよいが、特にアミド（−ＣＯＮＨ_２）が好ましい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチル等のＣ_１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル等のＣ_３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチル等のＣ_６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチル等のフェニル−Ｃ_１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチル等のα−ナフチル−Ｃ_１−２アルキル基等のＣ_７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基等が用いられる。
ｈｕｍａｎｉｎがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本願明細書におけるｈｕｍａｎｉｎに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステル等が用いられる。
【００４７】
さらに、ｈｕｍａｎｉｎには、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基等のＣ_１−６アルカノイル等のＣ_１−６アシル基等）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基等）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基等のＣ_１−６アルカノイル基等のＣ_１−６アシル基等）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ポリペプチド等の複合ポリペプチド等も含まれる。ｈｕｍａｎｉｎとしては、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基がホルミル化されているものが好ましく、特にＮ末端にメチオニン残基を有し、そのＮ末端メチオニン残基のアミノ基がホルミル化されているものが好ましい。
具体的には、Ｎ末端メチオニン残基のアミノ基がホルミル化されている配列番号：３、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドなどが好ましく用いられる。
ｈｕｍａｎｉｎの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）等との塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩等が用いられる。
以下、明細書では、ｈｕｍａｎｉｎまたはその塩をｈｕｍａｎｉｎと略記する。
【００４８】
ｈｕｍａｎｉｎは、前述したヒトや非ヒト温血動物の細胞または組織から公知のポリペプチドの精製方法によって製造することもできるし、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトや非ヒト哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや非ヒト哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸等で抽出を行ない、得られた抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
ｈｕｍａｎｉｎまたはそのアミド体の合成には、通常市販のポリペプチド合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂等をあげることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするポリペプチドの配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からポリペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のポリペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、ポリペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミド等が用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対応する酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００４９】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ポリペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドン等の酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノール等のアルコール類、ジメチルスルホキシド等のスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフラン等のエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリル等のニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチル等のエステル類あるいはこれらの適宜の混合物等が用いられる。反応温度はポリペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃ等が用いられる。
【００５０】
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチル等の直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化等によって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基等の低級（Ｃ_１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基等のアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基等の炭酸から誘導される基等が用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ-ブチル基等である。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ_２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチル等が用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃ等が用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕等が用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
【００５１】
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素等の触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液等による酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジン等による塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元等も用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオール等のようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオール等の存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニア等によるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化等は公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
【００５２】
ｈｕｍａｎｉｎのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（ポリペプチド）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたポリペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したポリペプチドとを製造し、この両ポリペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ポリペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ポリペプチドを得ることができる。この粗ポリペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のｈｕｍａｎｉｎのアミド体を得ることができる。
ｈｕｍａｎｉｎのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、ｈｕｍａｎｉｎのアミド体と同様にして、所望のポリペプチドのエステル体を得ることができる。
ｈｕｍａｎｉｎは、公知のペプチドの合成法に従っても製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、ｈｕｍａｎｉｎを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の▲１▼〜▲５▼に記載された方法などが挙げられる。
▲１▼M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)、
▲２▼SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)、
▲３▼泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）、
▲４▼矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タンパク質の化学IV、 205、(1977年)、および
▲５▼矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、広川書店。
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶等を組み合わせて本発明のポリペプチド、本発明の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られるポリペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００５３】
ｈｕｍａｎｉｎは細胞死抑制作用、細胞生存維持作用などを有しているので、ｈｕｍａｎｉｎに対する受容体である本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２をコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）、本発明のＤＮＡに対するアンチセンスＤＮＡ（以下、本発明のアンチセンスＤＮＡと略記する場合がある）は、以下の用途を有している。
（１）本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤
ｈｕｍａｎｉｎは生体内に存在し、細胞死抑制作用、細胞生存維持作用などを有することが知られているので、本発明のＦＰＲＬ１もしくはＦＰＲＬ２、またはそれをコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ等）などに異常があったり、欠損している場合あるいは発現量が異常に減少または亢進している場合、例えば、神経変性を伴う疾病など、例えば、神経変性疾患〔例、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病、若年性アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病など）、パーキンソン病、ダウン症、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン舞踏病、糖尿病性ニューロパチー、多発性硬化症など〕、脳機能障害（例、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血、虚血性脳疾患、硬膜外血腫、硬膜下血腫など）、癌（例、星状細胞腫、乏枝神経膠腫など）、免疫疾患、感染症（例、髄膜炎、原虫感染症、リケッチア感染症、後生動物感染症、Ｂｏｒｎａ病などの細菌性またはウイルス性髄膜炎、ワクチン接種後脳炎、ＡＩＤＳ脳症など）、消化管疾患、循環器疾患、内分泌疾患などの種々の疾病が発症する。
したがって、生体内において本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２が減少しているために、リガンドであるｈｕｍａｎｉｎの生理作用が期待できない（ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の欠乏症）患者がいる場合に、ａ）本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を該患者に投与し該ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の量を補充したり、ｂ）（イ）本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２をコードするＤＮＡを該患者に投与し発現させることによって、あるいは（ロ）対象となる細胞に本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２をコードするＤＮＡを挿入し発現させた後に、該細胞を該患者に移植することなどによって、患者の体内におけるＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の量を増加させ、リガンドの作用を充分に発揮させることができる。したがって、ａ）本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２またはｂ）ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２をコードするＤＮＡを、本発明のＦＰＲＬ１の機能不全に関連する疾患の予防・治療剤などの医薬として使用することができる。
具体的には、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２、または本発明のＤＮＡは、例えば、細胞死抑制剤として、さらには、例えば神経変性を伴う疾病など、例えば、神経変性疾患〔例、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病、若年性アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病など）、パーキンソン病、ダウン症、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン舞踏病、糖尿病性ニューロパチー、多発性硬化症など〕、脳機能障害（例、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血、虚血性脳疾患、硬膜外血腫、硬膜下血腫など）、癌（例、星状細胞腫、乏枝神経膠腫など）、免疫疾患、感染症（例、髄膜炎、原虫感染症、リケッチア感染症、後生動物感染症、Ｂｏｒｎａ病などの細菌性またはウイルス性髄膜炎、ワクチン接種後脳炎、ＡＩＤＳ脳症など）、消化管疾患、循環器疾患、内分泌疾患等の種々の疾病の予防・治療剤、好ましくは神経変性疾患、脳機能障害の予防・治療剤として、さらに好ましくはアルツハイマー病の予防・治療剤として、低毒性で安全な医薬として使用することができる。
本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を上記予防・治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
一方、本発明のＤＮＡを上記予防・治療剤として使用する場合は、本発明のＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。本発明のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
例えば、ａ）本発明のＦＰＲＬ１もしくはＦＰＲＬ２またはｂ）本発明のＤＮＡは、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、ａ）本発明のＦＰＲＬ１もしくはＦＰＲＬ２またはｂ）本発明のＤＮＡを生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００５４】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０^ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【００５５】
また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、アルツハイマー病患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、アルツハイマー病患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のＤＮＡの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、アルツハイマー病患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、アルツハイマー病患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００５６】
（２）遺伝子診断剤
本発明のＤＮＡおよびアンチセンスＤＮＡは、プローブとして使用することにより、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）における本発明のＦＰＲＬ１またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。
本発明のＤＮＡまたはアンチセンスＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Genomics），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションによりＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の発現低下が検出された場合やＰＣＲ−ＳＳＣＰ法によりＤＮＡの突然変異が検出された場合は、例えば、神経変性を伴う疾病など、例えば、神経変性疾患〔例、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病、若年性アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病など）、パーキンソン病、ダウン症、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン舞踏病、糖尿病性ニューロパチー、多発性硬化症など〕、脳機能障害（例、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血、虚血性脳疾患、硬膜外血腫、硬膜下血腫など）、癌（例、星状細胞腫、乏枝神経膠腫など）、免疫疾患、感染症（例、髄膜炎、原虫感染症、リケッチア感染症、後生動物感染症、Ｂｏｒｎａ病などの細菌性またはウイルス性髄膜炎、ワクチン接種後脳炎、ＡＩＤＳ脳症など）、消化管疾患、循環器疾患、内分泌疾患等の疾病である可能性が高いと診断することができる。
【００５７】
（３）本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の発現量を変化させる化合物またはその塩を含有する医薬
本発明のＤＮＡは、プローブとして用いることにより、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、例えば、（ｉ）非ヒト哺乳動物のａ）血液、ｂ）特定の臓器、c）臓器から単離した組織もしくは細胞、または（ii）形質転換体等に含まれる本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２のｍＲＮＡ量を測定することによる、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
【００５８】
本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２のｍＲＮＡ量の測定は具体的には以下のようにして行なう。
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的にはアルツハイマー病モデルラット、マウス、ウサギなど）に対して、薬剤（例えば、免疫調節薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓など）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。
得られた細胞に含まれる本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２のｍＲＮＡは、例えば、通常の方法により細胞等からｍＲＮＡを抽出し、例えば、ＴａｑＭａｎＰＣＲなどの手法を用いることにより定量することができ、自体公知の手段によりノーザンブロットを行うことにより解析することもできる。
（ii）本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を発現する形質転換体を上記の方法に従い作製し、該形質転換体に含まれる本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２のｍＲＮＡを同様にして定量、解析することができる。
【００５９】
本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニングは、
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、薬剤あるいは物理的ストレスなどを与える一定時間前（３０分前〜２４時間前、好ましくは３０分前〜１２時間前、より好ましくは１時間前〜６時間前）もしくは一定時間後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に試験化合物を投与し、投与後一定時間経過後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、細胞に含まれる本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２のｍＲＮＡ量を定量、解析することにより行なうことができ、
（ii）形質転換体を常法に従い培養する際に試験化合物を培地中に混合させ、一定時間培養後（１日後〜７日後、好ましくは１日後〜３日後、より好ましくは２日後〜３日後）、該形質転換体に含まれる本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２のｍＲＮＡ量を定量、解析することにより行なうことができる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが用いられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【００６０】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の発現量を変化させる作用を有する化合物またはその塩であり、具体的には、（イ）本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の発現量を増加させることにより、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を介する細胞刺激活性を増強させる化合物またはその塩、（ロ）本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の発現量を減少させることにより、該細胞刺激活性を減弱させる化合物またはその塩である。
細胞刺激活性としては、例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ^２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性などが挙げられるが、なかでも細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性が好ましい。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２のリガンドは、上記のとおりｈｕｍａｎｉｎである。したがって、上記スクリーニング方法で得られる化合物またはその塩は、
（１）本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の発現量を増加し、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の機能不全に関連する疾患を予防・治療する化合物またはその塩、具体的には、神経変性疾患もしくは脳機能障害を予防・治療する化合物またはその塩、または細胞死を抑制する化合物またはその塩、または
（２）本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の発現量を減少させ、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の発現過多に起因する疾患を予防・治療する化合物またはその塩などである。
したがって、上記スクリーニング方法で得られる本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の発現量を増加する化合物またはその塩は、例えば、細胞死抑制剤として、さらには、例えば神経変性を伴う疾病など、例えば、神経変性疾患〔例、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病、若年性アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病など）、パーキンソン病、ダウン症、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン舞踏病、糖尿病性ニューロパチー、多発性硬化症など〕、脳機能障害（例、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血、虚血性脳疾患、硬膜外血腫、硬膜下血腫など）、癌（例、星状細胞腫、乏枝神経膠腫など）、免疫疾患、感染症（例、髄膜炎、原虫感染症、リケッチア感染症、後生動物感染症、Ｂｏｒｎａ病などの細菌性またはウイルス性髄膜炎、ワクチン接種後脳炎、ＡＩＤＳ脳症など）、消化管疾患、循環器疾患、内分泌疾患等の種々の疾病の予防・治療剤、好ましくは神経変性疾患、脳機能障害の予防・治療剤として、さらに好ましくはアルツハイマー病の予防・治療剤として、低毒性で安全な医薬として使用することができる。
一方、上記スクリーニング方法で得られる本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の発現量を減少させる化合物またはその塩は、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の発現過多に起因する疾患の予防・治療剤などの医薬として使用することができる。
【００６１】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組成物として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、該化合物またはその塩は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０^ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【００６２】
また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、アルツハイマー病患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の発現量を増加する化合物またはその塩を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、アルツハイマー病患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の発現量を増加する化合物またはその塩を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００６３】
（４）本発明の抗体を用いる診断方法
本発明の抗体は、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を特異的に認識することができるので、被検液中のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の検出や中和に使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化されたＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の割合を測定することを特徴とする被検液中のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の定量法、および
（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の定量法を提供する。
【００６４】
上記（ii）の定量法においては、一方の抗体がＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体がＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２のＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。
また、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するモノクローナル抗体を用いてＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の定量を行うことができるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')_２、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。本発明の抗体を用いるＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、ＦＰＲＬ１量またはＦＰＲＬ２量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
【００６５】
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔^１２５Ｉ〕、〔^１３１Ｉ〕、〔^３Ｈ〕、〔^１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常ＦＰＲＬ１、ＦＰＲＬ２あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のＦＰＲＬ１量またはＦＰＲＬ２量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
【００６６】
本発明のサンドイッチ法によるＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原(Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のＦＰＲＬ１の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D : Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E : Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I : Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明のＦＰＲＬ１を感度良く定量することができる。
【００６７】
さらには、本発明の抗体を用いてＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の濃度を定量することによって、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の濃度の減少が検出された場合、例えば、例えば、神経変性を伴う疾病など、例えば、神経変性疾患〔例、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病、若年性アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病など）、パーキンソン病、ダウン症、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン舞踏病、糖尿病性ニューロパチー、多発性硬化症など〕、脳機能障害（例、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血、虚血性脳疾患、硬膜外血腫、硬膜下血腫など）、癌（例、星状細胞腫、乏枝神経膠腫など）、免疫疾患、感染症（例、髄膜炎、原虫感染症、リケッチア感染症、後生動物感染症、Ｂｏｒｎａ病などの細菌性またはウイルス性髄膜炎、ワクチン接種後脳炎、ＡＩＤＳ脳症など）、消化管疾患、循環器疾患、内分泌疾患等の疾病である可能性が高いと診断することができる。
また、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の濃度の増加が検出された場合には、例えば、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の過剰発現に起因する疾患である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
【００６８】
（５）ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するアゴニストのスクリーニング方法
ｈｕｍａｎｉｎがＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に結合することによって、細胞内ｃＡＭＰの生成抑制が見られる。したがって、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２は、細胞内ｃＡＭＰの生成抑制活性を指標としてＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するｈｕｍａｎｉｎ以外のアゴニスト（天然リガンドを含む）を探索し、または決定するための試薬として有用である。
すなわち、本発明は、試験化合物をＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞に接触させた場合における、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を介した細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性を測定することを特徴とするＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するアゴニストの決定方法を提供する。
試験化合物としては、公知のリガンド（例えば、アンギオテンシン、ボンベシン、カナビノイド、コレシストキニン、グルタミン、セロトニン、メラトニン、ニューロペプチドＹ、オピオイド、プリン、バソプレッシン、オキシトシン、ＰＡＣＡＰ（例、ＰＡＣＡＰ２７，ＰＡＣＡＰ３８）、セクレチン、グルカゴン、カルシトニン、アドレノメジュリン、ソマトスタチン、ＧＨＲＨ、ＣＲＦ、ＡＣＴＨ、ＧＲＰ、ＰＴＨ、ＶＩＰ（バソアクティブ インテスティナル アンド リレイテッド ポリペプチド）、ソマトスタチン、ドーパミン、モチリン、アミリン、ブラジキニン、ＣＧＲＰ（カルシトニンジーンリレーティッドペプチド）、ロイコトリエン、パンクレアスタチン、プロスタグランジン、トロンボキサン、アデノシン、アドレナリン、ケモカインスーパーファミリー（例、ＩＬ−８，ＧＲＯα，ＧＲＯβ，ＧＲＯγ，ＮＡＰ−２，ＥＮＡ−７８，ＧＣＰ−２，ＰＦ４，ＩＰ−１０，Ｍｉｇ，ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１などのＣＸＣケモカインサブファミリー；ＭＣＡＦ／ＭＣＰ−１，ＭＣＰ−２，ＭＣＰ−３，ＭＣＰ−４，ｅｏｔａｘｉｎ，ＲＡＮＴＥＳ，ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β，ＨＣＣ−１，ＭＩＰ−３α／ＬＡＲＣ、ＭＩＰ−３β／ＥＬＣ，Ｉ−３０９，ＴＡＲＣ，ＭＩＰＦ−１，ＭＩＰＦ−２／ｅｏｔａｘｉｎ−２，ＭＤＣ，ＤＣ−ＣＫ１／ＰＡＲＣ，ＳＬＣなどのＣＣケモカインサブファミリー；ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎなどのＣケモカインサブファミリー；ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅなどのＣＸ３Ｃケモカインサブファミリー等）、エンドセリン、エンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロテンシン、ＴＲＨ、パンクレアティックポリペプタイド、ガラニン、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、スフィンゴシン１−リン酸など）の他に、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サルなど）の組織抽出物、細胞培養上清、低分子合成化合物などが用いられる。例えば、該組織抽出物、細胞培養上清などをＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に添加し、細胞刺激活性などを測定しながら分画し、最終的に単一のリガンドを得ることができる。
試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【００６９】
具体的には、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するアゴニスト決定方法は、本発明の組換え型ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の発現系を構築し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用いることによって、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を介する細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性を有する化合物またはその塩を決定する方法である。
より具体的には、本発明は、次のような決定方法を提供する。
（１）試験化合物をＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞に接触させた場合における細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性を測定することを特徴とするＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するアゴニストの決定方法、および
（２）試験化合物をＦＰＲＬ１ＤＮＡまたはＦＰＲＬ２ＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に接触させた場合におけるＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を介する細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性を測定することを特徴とするＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するアゴニストの決定方法を提供する。
特に、試験化合物がＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に結合することを確認した後に、上記の試験を行なうことが好ましい。
【００７０】
本発明のアゴニスト決定方法において、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法は公知の方法に従って行なうことができる。
ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞の膜画分としては、細胞を破砕した後、公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
【００７１】
ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞やその細胞膜画分中のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の量は、１細胞当たり１０^３〜１０^８分子であるのが好ましく、１０^５〜１０^７分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
本発明のアゴニスト決定方法を実施するためには、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を介する細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。具体的には、まず、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。アゴニスト決定を行なうにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、ｃＡＭＰなど）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。
本発明のアゴニスト決定用キットは、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞またはその細胞膜画分を含有するものである。
本発明のアゴニスト決定方法を用いることによって、細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性を示す化合物をＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するアゴニストとして選択することができる。
このようにして決定されるＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するアゴニストは、例えば、細胞死抑制剤として、さらには、例えば神経変性を伴う疾病など、例えば、神経変性疾患〔例、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病、若年性アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病など）、パーキンソン病、ダウン症、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン舞踏病、糖尿病性ニューロパチー、多発性硬化症など〕、脳機能障害（例、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血、虚血性脳疾患、硬膜外血腫、硬膜下血腫など）、癌（例、星状細胞腫、乏枝神経膠腫など）、免疫疾患、感染症（例、髄膜炎、原虫感染症、リケッチア感染症、後生動物感染症、Ｂｏｒｎａ病などの細菌性またはウイルス性髄膜炎、ワクチン接種後脳炎、ＡＩＤＳ脳症など）、消化管疾患、循環器疾患、内分泌疾患等の種々の疾病の予防・治療剤、好ましくは神経変性疾患、脳機能障害の予防・治療剤として、さらに好ましくはアルツハイマー病の予防・治療剤として、低毒性で安全な医薬として使用することができる。
【００７２】
（６）本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２とｈｕｍａｎｉｎとの結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩（アゴニスト、アンタゴニストなど）のスクリーニング方法、および本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２とｈｕｍａｎｉｎとの結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩を含有する医薬
本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を用いるか、または組換え型ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の発現系を構築し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用いることによって、リガンドであるｈｕｍａｎｉｎと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物（例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など）またはその塩を効率よくスクリーニングすることができる。
このような化合物には、（イ）ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を介して細胞刺激活性を有する化合物（いわゆる、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するアゴニスト）、（ロ）ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を介する細胞刺激活性を阻害する化合物（いわゆる、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するアンタゴニスト）、（ハ）ｈｕｍａｎｉｎと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合力を増強する化合物、または（ニ）ｈｕｍａｎｉｎと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合力を減少させる化合物などが含まれる。
すなわち、本発明は、（ｉ）本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２とｈｕｍａｎｉｎとを接触させた場合と（ii）本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２とｈｕｍａｎｉｎおよび試験化合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とするｈｕｍａｎｉｎと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法においては、（ｉ）と（ii）の場合における、例えば、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するｈｕｍａｎｉｎの結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較することを特徴とする。
細胞刺激活性としては、例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ^２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性などが挙げられるが、なかでも細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性が好ましい。
【００７３】
より具体的には、本発明は、
ａ）標識したｈｕｍａｎｉｎを、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に接触させた場合と、標識したｈｕｍａｎｉｎおよび試験化合物を本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に接触させた場合における、標識したｈｕｍａｎｉｎの該ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするｈｕｍａｎｉｎと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
ｂ）標識したｈｕｍａｎｉｎを、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、標識したｈｕｍａｎｉｎおよび試験化合物を本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、標識したｈｕｍａｎｉｎの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするｈｕｍａｎｉｎと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
ｃ）標識したｈｕｍａｎｉｎを、本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に接触させた場合と、標識したｈｕｍａｎｉｎおよび試験化合物を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に接触させた場合における、標識したｈｕｍａｎｉｎの該ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするｈｕｍａｎｉｎと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
【００７４】
ｄ）本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を活性化する化合物またはその塩（例えば、ｈｕｍａｎｉｎなど）を本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞に接触させた場合と、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を活性化する化合物および試験化合物を本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞に接触させた場合における、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とするｈｕｍａｎｉｎと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
ｅ）本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を活性化する化合物またはその塩（例えば、ｈｕｍａｎｉｎなど）を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に接触させた場合と、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を活性化する化合物および試験化合物を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に接触させた場合における、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を介する細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とするｈｕｍａｎｉｎと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
さらに、リガンドとしては、ｈｕｍａｎｉｎに代えて、ｈｕｍａｎｉｎとＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性を変化させる化合物またはその塩を用いることもできる。このｈｕｍａｎｉｎとＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性を変化させる化合物またはその塩は、例えば、リガンドとしてｈｕｍａｎｉｎを用いて、後述する本発明のスクーニング方法を実施することによって得ることができる。以下のスクリーニング方法においては、ｈｕｍａｎｉｎとＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性を変化させる化合物またはその塩を含めて、単にｈｕｍａｎｉｎと表記する。
【００７５】
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、本発明のスクリーニング方法に用いる本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２としては、上記した本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有するものであれば何れのものであってもよいが、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する哺乳動物の臓器の細胞膜画分が好適である。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させたヒト由来のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２などが適している。
本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を製造するには、上記の方法が用いられるが、本発明のＤＮＡを哺乳細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが好ましい。目的とする蛋白質部分をコードするＤＮＡ断片には相補ＤＮＡが用いられるが、必ずしもこれに制約されるものではない。例えば、遺伝子断片や合成ＤＮＡを用いてもよい。本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２をコードするＤＮＡ断片を宿主動物細胞に導入し、それらを効率よく発現させるためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主とするバキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス（nuclear polyhedrosis virus；ＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーター、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒトヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどの下流に組み込むのが好ましい。発現したレセプターの量と質の検査はそれ自体公知の方法で行うことができる。例えば、文献〔Nambi，P．ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）,267巻,19555〜19559頁,1992年〕に記載の方法に従って行なうことができる。したがって、本発明のスクリーニング方法において、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有するものとしては、それ自体公知の方法に従って精製したＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２であってもよいし、該ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞を用いてもよく、また該ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞の膜画分を用いてもよい。
【００７６】
本発明のスクリーニング方法において、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。
本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞としては、該ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが好ましい。
細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）のよる破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＦＰＲＬ１と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞や膜画分中のＦＰＲＬ１の量は、１細胞当たり１０^３〜１０^８分子であるのが好ましく、１０^５〜１０^７分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
【００７７】
ｈｕｍａｎｉｎと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩をスクリーニングする上記のａ）〜ｃ）を実施するためには、例えば、適当なＦＰＲＬ１画分またはＦＰＲＬ２画分と、標識したｈｕｍａｎｉｎが必要である。
ＦＰＲＬ１画分またはＦＰＲＬ２画分としては、天然型のＦＰＲＬ１画分またはＦＰＲＬ２画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型ＦＰＲＬ１画分またはＦＰＲＬ２画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などを示す。
標識したｈｕｍａｎｉｎとしては、例えば〔^３Ｈ〕、〔^１２５Ｉ〕、〔^１４Ｃ〕、〔^３５Ｓ〕などで標識されたｈｕｍａｎｉｎなどが用いられる。
具体的には、ｈｕｍａｎｉｎと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物のスクリーニングを行なうには、まず本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりＦＰＲＬ１標品またはＦＰＲＬ２標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのｈｕｍａｎｉｎとＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０^ＴＭ（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによるレセプターやｈｕｍａｎｉｎの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０.０１ｌ〜１０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量（５０００〜５０００００ｃｐｍ）の標識したｈｕｍａｎｉｎを添加し、同時に１０^−４Ｍ〜１０^−１０Ｍの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識のｈｕｍａｎｉｎを加えた反応チューブも用意する。反応は約０〜５０℃、望ましくは約４〜３７℃で、約２０分〜２４時間、望ましくは約３０分〜３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント(Ｂ_０）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ_０−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が、例えば、５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００７８】
ｈｕｍａｎｉｎと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物をスクリーニングする上記のｄ）〜ｅ）の方法を実施するためには、例えば、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を介する細胞刺激活性を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。
具体的には、まず、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行なうにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、ｃＡＭＰ、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当なＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を発現した細胞が必要である。本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を発現した細胞としては、天然型の本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を有する細胞株、上記の組換え型ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を発現した細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが用いられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
また、試験化合物としては、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の活性部位の原子座標およびリガンド結合ポケットの位置に基づいて、リガンド結合ポケットに結合するように設計された化合物が好ましく用いられる。ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の活性部位の原子座標およびリガンド結合ポケットの位置の測定は、公知の方法あるいはそれに準じる方法を用いて行うことができる。
ｈｕｍａｎｉｎとＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性を変化させる化合物またはその塩がアゴニストかアンタゴニストであるかは、上記したＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するアゴニストのスクリーニング方法を用いて確認することができる。
【００７９】
ｈｕｍａｎｉｎと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞、または本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する細胞の膜画分を含有するものなどである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
１．スクリーニング用試薬
ａ）測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
ｂ）ＦＰＲＬ１標品またはＦＰＲＬ２標品
本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０^５個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ_２、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
ｃ）標識ｈｕｍａｎｉｎ
市販の〔^３Ｈ〕、〔^１２５Ｉ〕、〔^１４Ｃ〕、〔^３５Ｓ〕などで標識したｈｕｍａｎｉｎ
水溶液の状態のものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。
ｄ）ｈｕｍａｎｉｎ標準液
ｈｕｍａｎｉｎを０.１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存する。
【００８０】
２．測定法
ａ）１２穴組織培養用プレートにて培養した本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２発現ＣＨＯ細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
ｂ）１０^−３〜１０^−１０Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた後、標識ｈｕｍａｎｉｎを５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の代わりに１０^−３Ｍのｈｕｍａｎｉｎを５μｌ加えておく。
ｃ）反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞に結合した標識ｈｕｍａｎｉｎを０.２Ｎ ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
ｄ）液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding（ＰＭＢ）を次の式で求める。
ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ_０−ＮＳＢ）］×１００
ＰＭＢ：Percent Maximum Binding
Ｂ ：検体を加えた時の値
ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量）
Ｂ_０ ：最大結合量
【００８１】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、ｈｕｍａｎｉｎと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性またはシグナル伝達を変化させる作用を有する化合物またはその塩であり、具体的には、（イ）本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を介して細胞刺激活性の活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を有する化合物またはその塩（いわゆる、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するアゴニスト）、（ロ）該細胞刺激活性を有しない化合物またはその塩（いわゆる、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するアンタゴニスト）、（ハ）ｈｕｍａｎｉｎと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合力を増強する化合物またはその塩、あるいは（ニ）ｈｕｍａｎｉｎと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合力を減少させる化合物またはその塩である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【００８２】
本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するアゴニストは、ｈｕｍａｎｉｎが有する生理活性と同様の作用を有しているので、ｈｕｍａｎｉｎが有する生理活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するアンタゴニストは、ｈｕｍａｎｉｎが有する生理活性を抑制することができるので、ｈｕｍａｎｉｎの生理活性を抑制するための安全で低毒性な医薬として有用である。
ｈｕｍａｎｉｎと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合力を増強する化合物またはその塩は、ｈｕｍａｎｉｎが有する生理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。
ｈｕｍａｎｉｎと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合力を減少させる化合物またはその塩は、ｈｕｍａｎｉｎが有する生理活性を減少させるためのｈｕｍａｎｉｎの生理活性を抑制するための安全で低毒性な医薬として有用である。
具体的には、本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られるアゴニストまたはｈｕｍａｎｉｎと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合力を増強する化合物またはその塩は、例えば、細胞死抑制剤として、さらには、例えば神経変性を伴う疾病など、例えば、神経変性疾患〔例、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病、若年性アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病など）、パーキンソン病、ダウン症、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン舞踏病、糖尿病性ニューロパチー、多発性硬化症など〕、脳機能障害（例、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血、虚血性脳疾患、硬膜外血腫、硬膜下血腫など）、癌（例、星状細胞腫、乏枝神経膠腫など）、免疫疾患、感染症（例、髄膜炎、原虫感染症、リケッチア感染症、後生動物感染症、Ｂｏｒｎａ病などの細菌性またはウイルス性髄膜炎、ワクチン接種後脳炎、ＡＩＤＳ脳症など）、消化管疾患、循環器疾患、内分泌疾患等の種々の疾病の予防・治療剤、好ましくは神経変性疾患、脳機能障害の予防・治療剤として、さらに好ましくはアルツハイマー病の予防・治療剤として、低毒性で安全な医薬として使用することができる。
一方、上記スクリーニング方法で得られるアンタゴニストまたはｈｕｍａｎｉｎと本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合力を減少させる化合物またはその塩は、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の発現過多に起因する疾患の予防・治療剤などの医薬として使用することができる。
さらに、上記スクリーニング方法で得られるアンタゴニストのうち、β−アミロイド（１−４２）とＦＰＲＬ１との結合を阻害するものは、例えば、細胞死抑制剤として、さらには、例えば神経変性を伴う疾病など、例えば、神経変性疾患〔例、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病、若年性アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病など）、パーキンソン病、ダウン症、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン舞踏病、糖尿病性ニューロパチー、多発性硬化症など〕、脳機能障害（例、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血、虚血性脳疾患、硬膜外血腫、硬膜下血腫など）、癌（例、星状細胞腫、乏枝神経膠腫など）、免疫疾患、感染症（例、髄膜炎、原虫感染症、リケッチア感染症、後生動物感染症、Ｂｏｒｎａ病などの細菌性またはウイルス性髄膜炎、ワクチン接種後脳炎、ＡＩＤＳ脳症など）、消化管疾患、循環器疾患、内分泌疾患等の種々の疾病の予防・治療剤、好ましくは神経変性疾患、脳機能障害の予防・治療剤として、さらに好ましくはアルツハイマー病の予防・治療剤として、低毒性で安全な医薬として使用することができる。
【００８３】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上記の医薬組成物として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、該化合物またはその塩は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０^ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【００８４】
また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、アルツハイマー病患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につきＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するアゴニストを約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、アルツハイマー病患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につきＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するアゴニストを約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００８５】
（７）各種薬物の作用メカニズムの解明方法
ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を用いることによって、各種薬物がＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を介して薬理効果を発揮しているか否かを確認することができる。
すなわち、本発明は、
（１）ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を用いることを特徴とする、（ｉ）細胞死抑制薬、（ii）神経変性を伴う疾病など、例えば、神経変性疾患〔例、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病、若年性アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病など）、パーキンソン病、ダウン症、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン舞踏病、糖尿病性ニューロパチー、多発性硬化症など〕、脳機能障害（例、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血、虚血性脳疾患、硬膜外血腫、硬膜下血腫など）、癌（例、星状細胞腫、乏枝神経膠腫など）、免疫疾患、感染症（例、髄膜炎、原虫感染症、リケッチア感染症、後生動物感染症、Ｂｏｒｎａ病などの細菌性またはウイルス性髄膜炎、ワクチン接種後脳炎、ＡＩＤＳ脳症など）、消化管疾患、循環器疾患、内分泌疾患等の予防・治療薬または（iii）本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の発現過多に起因する疾患の予防・治療薬がＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に結合することを確認する方法、
（２）ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を用いることを特徴とする、（ｉ）細胞死抑制薬または（ii）神経変性を伴う疾病など、例えば、神経変性疾患〔例、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病、若年性アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病など）、パーキンソン病、ダウン症、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン舞踏病、糖尿病性ニューロパチー、多発性硬化症など〕、脳機能障害（例、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血、虚血性脳疾患、硬膜外血腫、硬膜下血腫など）、癌（例、星状細胞腫、乏枝神経膠腫など）、免疫疾患、感染症（例、髄膜炎、原虫感染症、リケッチア感染症、後生動物感染症、Ｂｏｒｎａ病などの細菌性またはウイルス性髄膜炎、ワクチン接種後脳炎、ＡＩＤＳ脳症など）、消化管疾患、循環器疾患、内分泌疾患等の予防・治療薬がＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するアゴニストであることを確認する方法、
（３）ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を用いることを特徴とする、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の発現過多に起因する疾患の予防・治療薬がＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対するアンタゴニストであることを確認する方法、
（４）各薬をＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に接触させた場合における、各薬とＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合量を測定することを特徴とする上記（１）〜（３）記載のスクリーニング方法を提供する。
この確認方法は、前記したｈｕｍａｎｉｎとＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法において、試験化合物に代えて、上記の薬物を使用することによって実施することができる。
また、本発明の確認方法用キットは、前記したｈｕｍａｎｉｎｎとＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との結合性を変化させる化合物のスクリーニング用キットにおいて、試験化合物に代えて、上記の薬物を含有するものである。
このように、本発明の確認方法を用いることによって、市販または開発途中の各種薬物がＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を介して薬理効果を発揮していることを確認することができる。
【００８６】
（８）細胞膜における本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の量を変化させる化合物またはその塩を含有する医薬
本発明の抗体は、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を特異的に認識することができるので、細胞膜における本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニングに用いることができる。
すなわち本発明は、例えば、
（ｉ）非ヒト哺乳動物のａ）血液、ｂ）特定の臓器、ｃ）臓器から単離した組織もしくは細胞等を破壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜画分に含まれる本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を定量することによる、細胞膜における本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（ii）本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を発現する形質転換体等を破壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜画分に含まれる本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を定量することによる、細胞膜における本発明のＦＰＲＬ１の量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（iii）非ヒト哺乳動物のａ）血液、ｂ）特定の臓器、ｃ）臓器から単離した組織もしくは細胞等を切片とした後、免疫染色法を用いることにより、細胞表層での該受容体蛋白質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上の該蛋白質を確認することによる、細胞膜における本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
（iv）本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を発現する形質転換体等を切片とした後、免疫染色法を用いることにより、細胞表層での該受容体蛋白質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上の該蛋白質を確認することによる、細胞膜における本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
【００８７】
細胞膜画分に含まれる本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の定量は具体的には以下のようにして行なう。
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的にはアルツハイマー病モデルラット、マウス、ウサギなど）に対して、薬剤（例えば、免疫調節薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓など）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。得られた臓器、組織または細胞等を、例えば、適当な緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ヘペス緩衝液など）等に懸濁し、臓器、組織あるいは細胞を破壊し、界面活性剤（例えば、トリトンＸ１００^ＴＭ、ツイーン２０^ＴＭなど）などを用い、さらに遠心分離や濾過、カラム分画などの手法を用いて細胞膜画分を得る。
細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）のよる破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
細胞膜画分に含まれる本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２は、例えば、本発明の抗体を用いたサンドイッチ免疫測定法、ウエスタンブロット解析などにより定量することができる。
かかるサンドイッチ免疫測定法は上記の方法と同様にして行なうことができ、ウエスタンブロットは自体公知の手段により行なうことができる。
（ii）本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を発現する形質転換体を上記の方法に従い作製し、細胞膜画分に含まれる本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を定量することができる。
【００８８】
細胞膜における本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニングは、
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、薬剤あるいは物理的ストレスなどを与える一定時間前（３０分前〜２４時間前、好ましくは３０分前〜１２時間前、より好ましくは１時間前〜６時間前）もしくは一定時間後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に試験化合物を投与し、投与後一定時間経過後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、細胞膜における本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の量を定量することにより行なうことができ、
（ii）形質転換体を常法に従い培養する際に試験化合物を培地中に混合させ、一定時間培養後（１日後〜７日後、好ましくは１日後〜３日後、より好ましくは２日後〜３日後）、細胞膜における本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の量を定量することにより行なうことができる。
細胞膜画分に含まれる本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の確認は具体的には以下のようにして行なう。
（iii）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的にはアルツハイマー病モデルラット、マウス、ウサギなど）に対して、薬剤（例えば、免疫調節薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓など）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。得られた臓器、組織または細胞等を、常法に従い組織切片とし、本発明の抗体を用いて免疫染色を行う。細胞表層での該受容体蛋白質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上の該蛋白質を確認することにより、定量的または定性的に、細胞膜における本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の量を確認することができる。
（iv）本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を発現する形質転換体等を用いて同様の手段をとることにより確認することもできる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが用いられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【００８９】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、細胞膜における本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の量を変化させる作用を有する化合物であり、具体的には、（イ）細胞膜における本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の量を増加させることにより、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を介する細胞刺激活性を増強させる化合物またはその塩、（ロ）細胞膜における本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の量を減少させることにより、該細胞刺激活性を減弱させる化合物またはその塩である。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
細胞膜における本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の量を増加させることにより、細胞刺激活性を増強させる化合物またはその塩は、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の機能不全に関連する疾患の予防・治療剤などの医薬として使用することができる。具体的には、該化合物またはその塩は、例えば、細胞死抑制剤として、さらには、例えば神経変性を伴う疾病など、例えば、神経変性疾患〔例、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病、若年性アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病など）、パーキンソン病、ダウン症、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン舞踏病、糖尿病性ニューロパチー、多発性硬化症など〕、脳機能障害（例、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血、虚血性脳疾患、硬膜外血腫、硬膜下血腫など）、癌（例、星状細胞腫、乏枝神経膠腫など）、免疫疾患、感染症（例、髄膜炎、原虫感染症、リケッチア感染症、後生動物感染症、Ｂｏｒｎａ病などの細菌性またはウイルス性髄膜炎、ワクチン接種後脳炎、ＡＩＤＳ脳症など）、消化管疾患、循環器疾患、内分泌疾患等の種々の疾病の予防・治療剤、好ましくは神経変性疾患、脳機能障害の予防・治療剤として、さらに好ましくはアルツハイマー病の予防・治療剤として、低毒性で安全な医薬として使用することができる。
細胞膜における本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の量を減少させることにより、細胞刺激活性を減弱させる化合物またはその塩は、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の発現過多に起因する疾患に対する安全で低毒性な予防・治療剤として有用である。
【００９０】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組成物として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、該化合物またはその塩は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０^ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、アルツハイマー病患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき細胞膜における本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の量を増加させる化合物またはその塩を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、アルツハイマー病患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき細胞膜における本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の量を増加させる化合物またはその塩を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００９１】
（９）本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対する抗体を含有してなる医薬
本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対する抗体の中和活性とは、該ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の関与するシグナル伝達機能を不活性化する活性を意味する。従って、該抗体が中和活性を有する場合は、該ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の関与するシグナル伝達、例えば、該ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ^２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ生成抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など、特にｃＡＭＰ生成抑制活性）を不活性化することができる。
したがって、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に対する抗体(例、中和抗体)は、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の過剰発現やｈｕｍａｎｉｎ過多などに起因する疾患の予防・治療剤として用いることができる。
上記予防・治療剤は、前記した本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を含有する医薬と同様にして製造し、使用することができる。
【００９２】
（１０）本発明のアンチセンスＤＮＡを含有してなる医薬
本発明のアンチセンスＤＮＡは、ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の過剰発現やｈｕｍａｎｉｎ過多などに起因する疾患の予防・治療剤として用いることができる。
例えば、該アンチセンスＤＮＡを用いる場合、該アンチセンスＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。該アンチセンスＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
さらに、該アンチセンスＤＮＡは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
【００９３】
（１１）本発明のＤＮＡ導入動物の作製
本発明は、外来性の本発明のＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
〔１〕本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
〔２〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔１〕記載の動物、
〔３〕ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第〔２〕記載の動物、および
〔４〕本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ_１系統，ＢＤＦ_１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ_１系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
【００９４】
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の機能を抑制するＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。
【００９５】
本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、▲１▼ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、▲２▼各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性蛋白質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存蛋白質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ペプチド鎖延長因子1α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎蛋白質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネーターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネーターなどが用いられる。
【００９６】
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流 に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
【００９７】
本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の機能亢進症や、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の増加症状を有することから、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に関連する疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原料として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
【００９８】
本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の機能不活性型不応症における本発明の異常ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２による正常ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の機能阻害（dominant negative作用）を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の増加症状を有することから、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
▲１▼組織培養のための細胞源としての使用、
▲２▼本発明のＤＮＡ転移動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現されたＦＰＲＬ１組織またはＦＰＲＬ２組織を分析することによる、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２により特異的に発現あるいは活性化するＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２との関連性についての解析、
▲３▼ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
▲４▼上記▲３▼記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
▲５▼本発明の変異ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の機能不活性型不応症などを含む、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどの蛋白質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明のＦＰＲＬ１産生細胞またはＦＰＲＬ２産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の機能不活性型不応症を含む、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２が関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
【００９９】
（１２）ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
〔１〕本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
〔２〕該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第〔１〕項記載の胚幹細胞、
〔３〕ネオマイシン耐性である第〔１〕項記載の胚幹細胞、
〔４〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔１〕項記載の胚幹細胞、
〔５〕ゲッ歯動物がマウスである第〔４〕項記載の胚幹細胞、
〔６〕本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
〔７〕該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる第〔６〕項記載の非ヒト哺乳動物、
〔８〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔６〕項記載の非ヒト哺乳動物、
〔９〕ゲッ歯動物がマウスである第〔８〕項記載の非ヒト哺乳動物、および
〔１０〕第〔７〕項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしている本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
【０１００】
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、polyＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知 EvansとKaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ_１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ_１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ_１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３.５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
【０１０１】
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０^６個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１〜１００００U/ml）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１〜０.５％トリプシン／０.１〜５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１〜３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー（Nature）第292巻、154頁、1981年；G. R. Martin プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschman ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２、または本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の細胞生物学的検討において有用である。
【０１０２】
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２のヘテロ発現不全個体であり、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２のヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２のホモ発現不全個体を得ることができる。
【０１０３】
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
【０１０４】
（１２ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
【０１０５】
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、例えば、該試験動物のアルツハイマー病症状が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上改善した場合、該試験化合物を上記の疾患に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩として選択することができる。該スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物またはその塩であり、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の欠損や損傷などによって引き起こされる疾患（例えば、神経変性を伴う疾病など、例えば、神経変性疾患〔例、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病、若年性アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病など）、パーキンソン病、ダウン症、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン舞踏病、糖尿病性ニューロパチー、多発性硬化症など〕、脳機能障害（例、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血、虚血性脳疾患、硬膜外血腫、硬膜下血腫など）、癌（例、星状細胞腫、乏枝神経膠腫など）、免疫疾患、感染症（例、髄膜炎、原虫感染症、リケッチア感染症、後生動物感染症、Ｂｏｒｎａ病などの細菌性またはウイルス性髄膜炎、ワクチン接種後脳炎、ＡＩＤＳ脳症など）、消化管疾患、循環器疾患、内分泌疾患など）に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２とｈｕｍａｎｉｎとの結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物またはその塩を経口投与する場合、一般的にアルツハイマー病患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物またはその塩を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物またはその塩の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、該化合物またはその塩を注射剤の形で通常、アルツハイマー病患者（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物またはその塩を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【０１０６】
（１２ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２をコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の発現する組織で、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のＦＰＲＬ１欠損マウス、ＦＰＲＬ２欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物またはその塩であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩である。
該スクリーニング方法で得られた化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【０１０７】
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の発現を促進し、該ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の機能を促進することができるので、例えば、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の機能不全に関連する疾患の予防・治療剤などの医薬として使用することができる。具体的には、該化合物は、例えば、細胞死抑制剤として、さらには、例えば神経変性を伴う疾病など、例えば、神経変性疾患〔例、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病、若年性アルツハイマー病、孤発性アルツハイマー病など）、パーキンソン病、ダウン症、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン舞踏病、糖尿病性ニューロパチー、多発性硬化症など〕、脳機能障害（例、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血、虚血性脳疾患、硬膜外血腫、硬膜下血腫など）、癌（例、星状細胞腫、乏枝神経膠腫など）、免疫疾患、感染症（例、髄膜炎、原虫感染症、リケッチア感染症、後生動物感染症、Ｂｏｒｎａ病などの細菌性またはウイルス性髄膜炎、ワクチン接種後脳炎、ＡＩＤＳ脳症など）、消化管疾患、循環器疾患、内分泌疾患等の種々の疾病の予防・治療剤、好ましくは神経変性疾患、脳機能障害の予防・治療剤として、さらに好ましくはアルツハイマー病の予防・治療剤として、低毒性で安全な医薬として使用することができる。
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の発現を阻害し、該ＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の機能を阻害することができるので、例えば、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２の発現過多に関連する疾患などの予防・治療剤などの医薬として有用である。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
【０１０８】
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２とｈｕｍａｎｉｎとの結合性を変化させる化合物またはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩を経口投与する場合、一般的にアルツハイマー病患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物またはその塩を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物またはその塩の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩を注射剤の形で通常、アルツハイマー病患者（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物またはその塩を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２のプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々の蛋白質をコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異的にそのＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２を合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明のＦＰＲＬ１またはＦＰＲＬ２そのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
【０１０９】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ ：アデニン
Ｔ ：チミン
Ｇ ：グアニン
Ｃ ：シトシン
ＲＮＡ ：リボ核酸
ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム
【０１１０】
Ｇｌｙ ：グリシン
Ａｌａ ：アラニン
Ｖａｌ ：バリン
Ｌｅｕ ：ロイシン
Ｉｌｅ ：イソロイシン
Ｓｅｒ ：セリン
Ｔｈｒ ：スレオニン
Ｃｙｓ ：システイン
Ｍｅｔ ：メチオニン
Ｇｌｕ ：グルタミン酸
Ａｓｐ ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ ：リジン
Ａｒｇ ：アルギニン
Ｈｉｓ ：ヒスチジン
Ｐｈｅ ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ ：チロシン
Ｔｒｐ ：トリプトファン
Ｐｒｏ ：プロリン
Ａｓｎ ：アスパラギン
Ｇｌｎ ：グルタミン
ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸
＊ ：終止コドンに対応する
Ｍｅ ：メチル基
Ｅｔ ：エチル基
Ｂｕ ：ブチル基
Ｐｈ ：フェニル基
ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
【０１１１】
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ ：ホルミル
Ｂｚｌ ：ベンジル
Ｃl_２Ｂｚｌ ：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル
Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＮＰ ：ジニトロフェノール
Ｔｒｔ ：トリチル
Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１,２,３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド
ＤＣＣ ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
【０１１２】
本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
配列番号：１
ヒト由来ＦＰＲＬ１のアミノ酸配列を示す。
配列番号：２
ヒト由来ＦＰＲＬ１をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：３
ヒト型ｈｕｍａｎｉｎ（１−２４）のアミノ酸配列を示す。
配列番号：４
［Ｇｌｙ^１４］−ヒト型ｈｕｍａｎｉｎ（１−２４）のアミノ酸配列を示す。
配列番号：５
ｈｕｍａｎｉｎ類似ペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号：６
ヒト型ｈｕｍａｎｉｎ（１−２１）のアミノ酸配列を示す。
配列番号：７
ラット型ｈｕｍａｎｉｎ（１−３８）のアミノ酸配列を示す。
配列番号：８
ラット型ｈｕｍａｎｉｎ（１−２４）のアミノ酸配列を示す。
配列番号：９
ラット型ｈｕｍａｎｉｎ（１−２１）のアミノ酸配列を示す。
配列番号：１０
ラット由来ＦＰＲＬ１のアミノ酸配列を示す。
配列番号：１１
ラット由来ＦＰＲＬ１をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：１２
マウス由来ＦＰＲＬ２（ＦＰＲＬ１）のアミノ酸配列を示す。
配列番号：１３
マウス由来ＦＰＲＬ２（ＦＰＲＬ１）をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：１４
ヒト由来ＦＰＲＬ２のアミノ酸配列を示す。
配列番号：１５
ヒト由来ＦＰＲＬ２をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：１６
参考例１で用いたプライマー１の塩基配列を示す。
配列番号：１７
参考例１で用いたプライマー２の塩基配列を示す。
配列番号：１８
参考例２で用いたプライマー３の塩基配列を示す。
配列番号：１９
参考例２で用いたプライマー４の塩基配列を示す。
配列番号：２０
参考例２で用いたプライマー５の塩基配列を示す。
配列番号：２１
参考例２で用いたプライマー６の塩基配列を示す。
配列番号：２２
参考例２で用いたプライマー７の塩基配列を示す。
配列番号：２３
参考例２で用いたプライマー８の塩基配列を示す。
配列番号：２４
Ｗ−Ｐｅｐｔｉｄｅのアミノ酸配列を示す。
後述の参考例２で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＵＣ１８−ｒＦＰＲＬ１は２００３年１月１０日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８２７４として寄託されている。
【０１１３】
【実施例】
以下に参考例および実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子は、モレキュラー・クローニング（Molecular cloning）に記載されている方法に従った。
【０１１４】
【参考例１】
マウス脾臓由来ＦＰＲＬ２をコードするｃＤＮＡのクローニングと発現ベクターの構築
マウス脾臓ｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ^ＴＭ ｃＤＮＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を鋳型として、マウスＦＰＲＬ２の配列情報（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＃０７１１８０；ＮＣＢＩ）をもとに設計した２個のプライマー、プライマー１（配列番号：１６）及びプライマー２（配列番号：１７）を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲにはＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を用い、▲１▼９８℃・１分の後、▲２▼９８℃・１０秒、５５℃・３０秒、７２℃・６０秒を３５回の後、▲３▼７２℃・２分の伸長反応を行なった。反応後、増幅産物を制限酵素Ｓａｌ Ｉ及びＸｂａＩで切断した後、プラスミドベクターｐＡＫＫＯ−１１１Ｈに挿入して発現ベクターを構築した。その塩基配列を解析した結果、配列番号：１２で表されるアミノ酸配列からなるマウスＦＰＲＬ２をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：１３）を得た。
【０１１５】
【参考例２】
ラット脾臓由来ＦＰＲＬ１をコードするｃＤＮＡのクローニングとその塩基配列の決定及び発現ベクターの構築
ラット脾臓ｍＲＮＡからＭａｒａｔｈｏｎ^ＴＭ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてｃＤＮＡを合成し、その末端にアダプターを付加した。これを鋳型として、２個のプライマー、プライマー３（配列番号：１８）及びプライマー４（配列番号：１９）を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲにはＡｄｖａｎｔａｇｅ ２ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｍｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用い、▲１▼９６℃・１分、▲２▼９６℃・１０秒、７２℃・２分を５回、▲３▼９６℃・１０秒、７０℃・２分を５回、▲４▼９６℃・１０秒、６８℃・２分を２５回の後、▲５▼７２℃・５分の伸長反応を行なった。反応後、増幅産物をＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の処方にしたがってプラスミドベクターｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入し、これを大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造）に導入してクローニングした。個々のクローンの塩基配列を解析した結果、新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の一部をコードするｃＤＮＡ配列を得た。この配列情報をもとに２個のプライマー、プライマー５（配列番号：２０）及びプライマー６（配列番号：２１）を設計し、上述のラット脾臓ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡを鋳型としてＭａｒａｔｈｏｎ^ＴＭ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）の処方に従ってそれぞれ５’−ＲＡＣＥ及び３’−ＲＡＣＥを行なった。ＰＣＲは上述のものと同様に行ない、反応後増幅産物をＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の処方にしたがってプラスミドベクターｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入し、これを大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造）に導入してクローニングした。個々のクローンの塩基配列を解析した結果、新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の一部をコードするｃＤＮＡ配列を得た。これらの配列情報からさらに２個のプライマー、プライマー７（配列番号：２２）及びプライマー８（配列番号：２３）を設計し、上述のラット脾臓ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なった。ＰＣＲにはＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を用い、▲１▼９８℃・１分の後、▲２▼９８℃・１０秒、５５℃・３０秒、７２℃・６０秒を３５回の後、▲３▼７２℃・２分の伸長反応を行なった。反応後、増幅産物を制限酵素Ｓａｌ Ｉ及びＸｂａＩで切断した後、プラスミドベクターｐＡＫＫＯ−１１１Ｈに挿入して発現ベクターを構築した。これを制限酵素Ｓａｌ Ｉ及びＮｈｅ Ｉで切断して挿入断片を切出し、プラスミドベクターｐＵＣ１１９に挿入してこれらの塩基配列を解析した結果、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列からなるラットの新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：１１）を得た。このｃＤＮＡより導き出されるアミノ酸配列（配列番号：１０）を含有する新規蛋白質をラットＦＰＲＬ１と命名した。また、このプラスミドを保持する形質転換体を、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９／ｐＵＣ１１９−ｒＦＰＲＬ１と命名した。
【０１１６】
【参考例３】
ラット脾臓由来ＦＰＲＬ１をコードするｃＤＮＡを含有するプラスミドの作製
参考例２で得られた発現ベクターを制限酵素Ｓａｌ Ｉ及びＮｈｅ Ｉで切断して挿入断片を切出し、プラスミドベクターｐＵＣ１８に挿入してこれらの塩基配列を解析した結果、参考例２と同様に配列番号：１０で表されるアミノ酸配列からなるラットの新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：１１）であることが確認できた。また、このプラスミドを保持する形質転換体を、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９／ｐＵＣ１８−ｒＦＰＲＬ１と命名した。
【０１１７】
【実施例１】
ＦＰＲＬ１−ＧＦＰを発現させたＣＨＯ細胞における、ホルスコリン添加によって増加させた細胞内ｃＡＭＰ量のｈｕｍａｎｉｎによる抑制
ＦＰＲＬ１−ＧＦＰを発現させたＣＨＯ細胞をアッセイ用培地（ＨＢＳＳ（GibcoBRL）に０．１％ウシ血清アルブミン、および、０．２ｍＭ ＩＢＭＸを添加したもの）にて洗浄した後、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で３０分培養した。アッセイ用培地にて希釈した各濃度のｈｕｍａｎｉｎ（ペプチド研）または関連物質を添加し、その後フォルスコリン１μＭとなるように添加した。３７℃、５％ＣＯ_２条件下で３０分培養した。培養上清を捨てて、ｃＡＭＰ ｓｃｒｅｅｎ ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社）のプロトコールに従い、細胞内のｃＡＭＰ量をプレートリーダー（ＡＲＶＯ ｓｘマルチラベルカウンター、Wallac社）を用いて測定した。
ｈｕｍａｎｉｎおよびまたは関連物質として、次の化合物を用いた。
▲１▼ｆＭＬＦ
▲２▼Ｈｕｍａｎｉｎ：配列番号：３で表わされるアミノ酸配列からなるヒト型ｈｕｍａｎｉｎ（１−２４）
▲３▼［Ｇｌｙ^１４］Ｈｕｍａｎｉｎ：配列番号：４で表わされるアミノ酸配列からなる［Ｇｌｙ^１４］−ヒト型ｈｕｍａｎｉｎ（１−２４）
その結果、ベクターのみを導入したＣＨＯ細胞(ｍｏｃｋ)に比べ（図２）、ＦＰＲＬ１−ＧＦＰ遺伝子を導入したＣＨＯ細胞特異的に、ホルスコリン添加によって増加させた細胞内ｃＡＭＰ量のｈｕｍａｎｉｎによる用量依存的かつ特異的な減少が検出された（図１）。
【０１１８】
【実施例２】
ホルミル化ｈｕｍａｎｉｎの合成
前記した公知のペプチド合成で得られた保護ペプチドを J.C.Sheehan and D.D.H. Young によるJ.Amer.Che,Soc.,80,1154(1958) に記載の方法に従って、Ｎ末端をホルミル化した後、脱保護を行ない、次の化合物を合成した。
▲１▼ｆｏｒｍｙｌ−Ｈｕｍａｎｉｎ：Ｎ末端のＭｅｔがホルミル化された、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列からなるヒト型ｈｕｍａｎｉｎ（１−２４）
▲２▼ｍｔ−ｆｏｒｍｙｌ−Ｈｕｍａｎｉｎ：Ｎ末端のＭｅｔがホルミル化された、配列番号：６で表わされるアミノ酸配列からなるヒト型ｈｕｍａｎｉｎ（１−２１）
▲３▼ｍｔ−ｆｏｒｍｙｌ−ｒａｔｔｉｎ：Ｎ末端のＭｅｔがホルミル化された、配列番号：９で表わされるアミノ酸配列からなるラット型ｈｕｍａｎｉｎ（１−２１）
【０１１９】
【実施例３】
ヒトＦＰＲ１発現ＣＨＯ細胞（Ｎｏ．１４）、ヒトＦＰＲＬ１発現ＣＨＯ細胞（Ｎｏ．８）、ヒトＦＰＲＬ２発現ＣＨＯ細胞（Ｎｏ．１７）、マウスＦＰＲＬ２（Ｎｏ．１５）およびラットＦＰＲＬ１発現ＣＨＯ細胞（Ｎｏ．１５）における、ホルスコリン添加によって増加させた細胞内ｃＡＭＰ量の各アゴニストによる抑制
上記の受容体を発現させたＣＨＯ細胞をアッセイ用培地（ＨＢＳＳ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）に０．１％ウシ血清アルブミン、および、０．２ｍＭ ＩＢＭＸを添加したもの）にて洗浄した後、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で３０分培養した。アッセイ用培地にて希釈した各濃度のＨｕｍａｎｉｎ（ペプチド研）または関連物質を添加し、その後フォルスコリン１μＭとなるように添加した。３７℃、５％ＣＯ_２条件下で３０分培養した。培養上清を捨てて、ｃＡＭＰ ｓｃｒｅｅｎ ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社）のプロトコールに従い、細胞内のｃＡＭＰ量をプレートリーダー（ＡＲＶＯ ｓｘマルチラベルカウンター、Ｗａｌｌａｃ社）を用いて測定した。フォルスコリン１μＭ添加した細胞におけるｃＡＭＰの産生量を１００％とし、フォルスコリンを添加していない細胞のｃＡＭＰ産生量を０％として、各アゴニストを添加したときのｃＡＭＰ量を％表示した。ｃＡＭＰ産生量を５０％阻害する濃度（ＥＣ_５０）を、ｌｏｇｉｔ−ｌｏｇプロットより算出した。結果、Ｈｕｍａｎｉｎおよび［Ｇｌｙ^１４］−ＨｕｍａｎｉｎはｈＦＰＲＬ１に対してのみでなく、ｈＦＰＲＬ２に対しても強く反応すること、また、ｍＦＰＲＬ２およびｒＦＰＲＬ１に対しても反応することが分った。さらに、ホルミル化されたＨｕｍａｎｉｎ関連ペプチドであるｆｏｒｍｙｌ−Ｈｕｍａｎｉｎ、ｍｔ−ｆｏｒｍｙｌ−Ｈｕｍａｎｉｎ、ｍｔ−ｆｏｒｍｙｌ−ｒａｔｔｉｎはｈＦＰＲＬ１に対して強く反応すること、また、ｍＦＰＲＬ２およびｒＦＰＲＬ１に対しても反応することが分かった（図３）。
【０１２０】
【発明の効果】
本発明のＦＰＲＬ１、ＦＰＲＬ２、その部分ペプチドまたはその塩、または本発明のＦＰＲＬ１、ＦＰＲＬ２もしくはその部分ペプチドをコードするＤＮＡは、例えば、細胞死抑制剤として、さらには、例えば神経変性を伴う疾病など、例えば、神経変性疾患（例、アルツハイマー病）、脳機能障害、癌、免疫疾患、感染症、消化管疾患、循環器疾患、内分泌疾患等の種々の疾病の予防・治療剤として、低毒性で安全な医薬として使用することができる。
本発明のＦＰＲＬ１、ＦＰＲＬ２、その部分ペプチドまたはその塩とｈｕｍａｎｉｎとを用いることによって、ｈｕｍａｎｉｎと本発明のＦＰＲＬ１、ＦＰＲＬ２またはその塩との結合性を変化させる化合物を効率良くスクリーニングすることができる。
【０１２１】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】細胞内ｃＡＭＰ量によるＦＰＲＬ１−ＧＦＰ受容体発現させたＣＨＯ細胞に特異的なリガンド活性の用量依存性を示す。ホルスコリンで刺激しない状態（Ｂａｓａｌ）に対し、ホルスコリンを１μＭ添加、および図中に表示の濃度（Ｍ）のｆＭＬＦ、ｈｕｍａｎｉｎおよび［Ｇｌｙ^１４］ｈｕｍａｎｉｎをホルスコリンと同時に添加してインキュベーションし、細胞内ｃＡＭＰ量を比較した結果を示す。白カラムはｆＭＬＦを添加した場合を示す。斜線カラムは配列番号：３で表わされるアミノ酸配列からなるヒト型ｈｕｍａｎｉｎ（１−２４）を添加した場合を示す。黒カラムは配列番号：４で表わされるアミノ酸配列からなる［Ｇｌｙ^１４］−ヒト型ｈｕｍａｎｉｎ（１−２４）を添加した場合を示す。Ｂａｓａｌはホルスコリン（ＦＳＫ）およびリガンドを添加していない場合を示す。ＦＳＫはホルスコリンを添加した場合を示す。Ｌｉｇａｎｄ（μＭ）＋ＦＳＫは各リガンドとホルスコリンを添加した場合を示す。横軸の数字は添加した各リガンドの濃度（μＭ）を示す。縦軸のｃＡＭＰ（ｐｍｏｌ／ｗｅｌｌ）は細胞内ｃＡＭＰ量（ｐｍｏｌ／ｗｅｌｌ）を示す。
【図２】細胞内ｃＡＭＰ量によるＦＰＲＬ１−ＧＦＰ受容体を発現させていないＣＨＯ細胞（ｍｏｃｋ）に特異的なリガンド活性の用量容量依存性を示す。ホルスコリンで刺激しない状態（Ｂａｓａｌ）に対し、ホルスコリンを１μＭ添加、および図中に表示の濃度（Ｍ）のｆＭＬＦ、ｈｕｍａｎｉｎ、および［Ｇｌｙ^１４］ｈｕｍａｎｉｎをホルスコリンと同時に添加してインキュベーションし、細胞内ｃＡＭＰ量を比較した結果を示す。白カラムはｆＭＬＦを添加した場合を示す。斜線カラムは配列番号：３で表わされるアミノ酸配列からなるヒト型ｈｕｍａｎｉｎ（１−２４）を添加した場合を示す。黒カラムは配列番号：４で表わされるアミノ酸配列からなる［Ｇｌｙ^１４］−ヒト型ｈｕｍａｎｉｎ（１−２４）を添加した場合を示す。Ｂａｓａｌはホルスコリン（ＦＳＫ）およびリガンドを添加していない場合を示す。ＦＳＫはホルスコリンを添加した場合を示す。Ｌｉｇａｎｄ（μＭ）＋ＦＳＫは各リガンドとホルスコリンを添加した場合を示す。横軸の数字は添加した各リガンドの濃度（μＭ）を示す。縦軸のｃＡＭＰ（ｐｍｏｌ／ｗｅｌｌ）は細胞内ｃＡＭＰ量（ｐｍｏｌ／ｗｅｌｌ）を示す。
【図３】各レセプター蛋白質を発現するＣＨＯ細胞に各種リガンドを反応させた時の細胞内ｃＡＭＰ量を測定し、ＥＣ_５０値（ｎＭ）を求めた結果を示す。ＥＣ_５０ ＶａｌｕｅｓはＥＣ_５０値を示す。Ｓａｍｐｌｅは使用したリガンド試料を示す。ｆｏｒｍｙｌ−ＨｕｍａｎｉｎはＮ末端のＭｅｔがホルミル化された、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列からなるヒト型ｈｕｍａｎｉｎ（１−２４）を示す。ｍｔ−ｆｏｒｍｙｌ−ＨｕｍａｎｉｎはＮ末端のＭｅｔがホルミル化された、配列番号：６で表わされるアミノ酸配列からなるヒト型ｈｕｍａｎｉｎ（１−２１）を示す。ｍｔ−ｆｏｒｍｙｌ−ｒａｔｔｉｎはＮ末端のＭｅｔがホルミル化された、配列番号：９で表わされるアミノ酸配列からなるラット型ｈｕｍａｎｉｎ（１−２１）を示す。Ｈｕｍａｎｉｎは配列番号：３で表わされるアミノ酸配列からなるヒト型ｈｕｍａｎｉｎ（１−２４）を示す。［Ｇｌｙ^１４］Ｈｕｍａｎｉｎは配列番号：４で表わされるアミノ酸配列からなる［Ｇｌｙ^１４］−ヒト型ｈｕｍａｎｉｎ（１−２４）を示す。Ｗ−ＰｅｐｔｉｄｅはＴｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−ｄＭｅｔ−ＮＨ_２（配列番号：２４）を示す。ｄＭｅｔはＤ体のＭｅｔを示す。β−Ａｍｙｌｏｉｄ（１−４２）はβ−アミロイド（１−４２）を示す。ｈＦＰＲ１はヒト由来ＦＰＲＬを示す。ｈＦＰＲＬ１はヒト由来ＦＰＲＬ１を示す。ｈＦＰＲＬ２はヒト由来ＦＰＲＬ２を示す。ｍＦＰＲＬ２はマウス由来ＦＰＲＬ２（ＦＰＲＬ１）を示す。ｒＦＰＲＬ１はラット由来ＦＰＲＬ１を示す。＞１００００は１００００ｎＭ以上を示す。

Claims (8)

1. （１）配列番号：１、配列番号：１０、配列番号：１２または配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加、もしくは置換したアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）ｈｕｍａｎｉｎまたはその塩を用いることを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩とｈｕｍａｎｉｎまたはその塩との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
2. ｈｕｍａｎｉｎが、
   （１）配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、
   （２）配列番号：３で表されるアミノ酸配列中の連続する６〜２０個のアミノ酸からなるペプチドまたはその塩、または
   （３）配列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩である請求項１記載のスクリーニング方法。
3. ｈｕｍａｎｉｎが、
   （１）ａ）配列番号：３で表されるアミノ酸配列、ｂ）配列番号：３で表されるアミノ酸配列中の１〜１０個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、ｃ）配列番号：３で表されるアミノ酸配列に１〜１０個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ｄ）配列番号：３で表されるアミノ酸配列中の１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはｅ）これらの欠失・付加・置換を組み合わせたアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩、
   （２）ａ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列、ｂ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列中の１〜１０個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、ｃ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列に１〜１０個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ｄ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列中の１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはｅ）これらの欠失・付加・置換を組み合わせたアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩、
   （３）ａ）配列番号：８で表されるアミノ酸配列、ｂ）配列番号：８で表されるアミノ酸配列中の１〜１０個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、ｃ）配列番号：８で表されるアミノ酸配列に１〜１０個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ｄ）配列番号：８で表されるアミノ酸配列中の１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはｅ）これらの欠失・付加・置換を組み合わせたアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩、
   （４）ａ）配列番号：３、配列番号：４または配列番号：８で表されるアミノ酸配列の第１９番目〜２４番目、第５番目〜２４番目、第１番目〜２０番目、第５番目〜２０番目もしくは第５番目〜２１番目のアミノ酸配列、ｂ）該アミノ酸配列中の１〜６個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、ｃ）該アミノ酸配列に１〜６個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ｄ）該アミノ酸配列中の１〜６個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、ｅ）またはこれらの欠失・付加・置換を組み合わせたアミノ酸配列からなり、アミノ酸の数が６〜２０個であるペプチド（ただし、配列番号：５で表されるアミノ酸配列の第１９番目〜２４番目、第５番目〜２４番目、第１番目〜２０番目、第５番目〜２０番目または第５番目〜２１番目のアミノ酸配列からなるペプチドを除く）またはその塩、または
   （５）ａ）配列番号：７で表されるアミノ酸配列、ｂ）配列番号：７で表されるアミノ酸配列中の１〜１０個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、ｃ）配列番号：７で表されるアミノ酸配列に１〜１０個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ｄ）配列番号：７で表されるアミノ酸配列中の１〜１０個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはｅ）これらの欠失・付加・置換を組み合わせたアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩である請求項１記載のスクリーニング方法。
4. ｈｕｍａｎｉｎが、
   （１）配列番号：３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩、
   （２）配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩、
   （３）配列番号：６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩、
   （４）配列番号：７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩、
   （５）配列番号：８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩、
   （６）配列番号：９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩、または
   （７）配列番号：３、配列番号：４または配列番号：８で表されるアミノ酸配列の第１９番目〜２４番目、第５番目〜２４番目、第１番目〜２０番目、第５番目〜２０番目もしくは第５番目〜２１番目のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩、
   である請求項１記載のスクリーニング方法。
5. ｈｕｍａｎｉｎのＮ末端メチオニン残基のアミノ基がホルミル化されている請求項１記載のスクリーニング方法。
6. ｈｕｍａｎｉｎが、Ｎ末端メチオニン残基のアミノ基がホルミル化されている配列番号：３、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８または配列番号：９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩である請求項１記載のスクリーニング方法。
7. （１）配列番号：１、配列番号：１０、配列番号：１２または配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加、もしくは置換したアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）ｈｕｍａｎｉｎまたはその塩を含有することを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩とｈｕｍａｎｉｎまたはその塩との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
8. （１）配列番号：１、配列番号：１０、配列番号：１２または配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加、もしくは置換したアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）ｈｕｍａｎｉｎまたはその塩と該レセプター蛋白質またはその塩との結合性またはシグナル伝達を変化させる化合物またはその塩を用いることを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法。

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