DE60025008T2

DE60025008T2 - Bestimmung von adrenomedullin-bindenden proteinen

Info

Publication number: DE60025008T2
Application number: DE60025008T
Authority: DE
Inventors: Frank Cuttitta; H. Ted ELSASSER; Alfredo Martinez; Ruben Pio
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Government
Priority date: 1999-09-10
Filing date: 2000-09-08
Publication date: 2006-09-14
Anticipated expiration: 2020-09-09
Also published as: US20090053734A1; WO2001018550A9; US7659081B2; ES2254220T3; CA2383419A1; WO2001018550A3; EP1214600B1; ATE313802T1; AU774725B2; US20100098703A1; US7993857B2; WO2001018550A2; DE60025008D1; PT1214600E; EP1214600A2; US20070025915A1; AU7362200A

Description

TECHNISCHER BEREICH
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neu entwickelte Methoden zum Nachweis von Adrenomedullin (AM)-bindenden Proteinen. Die Erfindung bezieht sich des Weiteren auf die Isolation, Identifikation und Verwendung solcher AM-bindenden Proteine und auf solche Proteine beinhaltende Zusammensetzungen und Methoden. Die (AM)-bindenden Proteine finden ihre Verwendung bei der Diagnose, Behandlung und dem Monitoring von mit AM assoziierten Krankheiten. Auch bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Isolation von AM/AM-bindenden Proteinkomplexen, die Herstellung von Antikörpern für diese Komplexe sowie die Verwendung dieser Antikörper zum Nachweis von AM/AM-bindenden Proteinkomplexen und die Behandlung von mit AM assoziierten Krankheiten. Die Erfindung bezieht sich zudem auf einen neu entdeckten Komplex umfassend AM und ein neu identifiziertes AM-bindendes Protein, den humanen Komplementfaktor H (fH; Faktor H). Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Identifikation von Antagonisten, die den AM/fH-Komplex auflösen oder die AM/fH-Komplexbildung hemmen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Adrenomedullin (AM) ist ein aus 52 Aminosäuren bestehendes amidiertes Peptidhormon, welches ursprünglich aus Nebennierentumoren isoliert wurde. AM ist an zahlreichen physiologischen Aktivitäten, einschließlich Vasodilatation, Angiogenese, Mitogenese und antimikrobiellen Funktionen beteiligt. Folglich stehen AM-Wirkungen mit einer großen Reihe von Krankheiten in Verbindung, wie beispielsweise Herz- und Lungenerkrankungen, Zirrhose, Krebs, Diabetes, Sepsis, Entzündungen und Präeklampsie bei Säugetieren, einschließlich dem Menschen (siehe Europäische Patent-Nr. 0 845 036).
In klinischen Studien zeigen Patienten mit chronischer dekompensierter Herzinsuffizienz erhöhte Plasma-AM-Werte. Diese Konzentrationen steigen proportional zum Schweregrad der Herzinsuffizienz an zusammen mit anderen Hormonen, die dafür bekannt sind, dass sie die Krankheitsprogression beeinflussen (J. Kato et al., 1996, J. Clin. Endocrinol. Metab. 81:180-3). Ähnlich zeigen Patienten mit dekompensierter zyanotischer Herzinsuffizienz erhöhte AM-Plasmakonzentrationen und erhöhte AM-Aufnahme im Lungenkreislauf (M. Yoshibayashi et al, 1999, Clin. Sci. (Colch.), 1999, 96:543-7). Auch Patienten mit chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung zeigen bedeutend erhöhte AM-Plasmakonzentrationen (B. Cheung et al., 1997, Clin. Sci. (Colch.). 92:59-62). Entsprechend könnte eine erhöhte Konzentration an AM (ein wirksamer Vasodilatator) als Kompensationsmechanismus für Hypoxämie wirken (Kato et al., 1996, supra, Yoshibayashi et al., 1999, supra).
In mehreren unabhängigen klinischen Studien wurde belegt, dass Patienten mit Leberzirrhose eine erhöhte AM-Zirkulation aufweisen und diese Konzentrationen mit dem Schweregrad der Krankheit ansteigen (E. Fabrega et al., 1997, Am. J. Gastroenterol. 92:1901-4; CM. Fernandez-Rodriguez et al., 1998, J. Hepatol. 29:250-6; M. Guevara et al., 1998, Gastroenterology 114:336-43; H Kojima et al., 1998, J. Hepatol. 28:840-6). Bei der Progression von Leberzirrhose spielt die periphere Vasodilatation eine Rolle, aber auch AM ist möglicherweise direkt an der Pathogenese dieser Krankheit beteiligt (Fabrega et al., 1997, supra; Fernandez-Rodriguez et al., 1998, supra; Guevara et al., 1998, supra; Kojima et al., 1998, supra).
Es wurde gezeigt, dass gegen AM gerichtete monoklonale Antikörper das Tumorzellwachstum in Abhängigkeit von der Konzentration hemmen, ein Effekt der durch die Zugabe von exogenem AM reversibel ist (M. J. Miller et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:23345-51). Die AM-Expression wurde auch in zahlreichen und unterschiedlichen Krebszelllinien gefunden (M.J. Miller et al., 1996, supra) sowie im kleinzelligen und nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom (A. Martinez et al., 1995, Endocrinology 136:4099-105). Darüber hinaus bindet AM an spezifische Stellen auf humanen malignen Melanomzellen und exogenes AM stimuliert das Melanomzellwachstum (A. Martinez et al., 1997, Endocrinology 138:5597-604). Zudem wird die Konzentration an zyklischem AMP in Tumorzellen durch die Anwesenheit von AM erhöht (M.J. Miller et al., 1996, supra; K. Takahashi et al., 1997, Peptides 18:1117-24), was darauf hindeutet, dass AM möglicherweise als autokriner Wachstumsfaktor wirkt, der die Tumorproliferation begünstigt (M.J. Miller et al., 1996, supra).
Es wurde gezeigt, dass AM die Insulinsekretion dosisabhängig hemmt, während durch neutralisierende monoklonale Antikörper, die gegen AM gerichtet sind, die Insulinfreisetzung um das 5-fache steigt; dieser Effekt ist durch die Zugabe von synthetischem AM umkehrbar (A. Martinez, 1996, Endocrinology 137:2626-32). Darüber hinaus senkt die intravenöse Injektion von AM die Insulinkonzentration im Blut mit einem begleitenden Anstieg der zirkulierenden Glukose (Martinez, 1996, supra). Diese Beobachtungen deuten auf AM als Insulin regulierenden Faktor hin, der bei Diabetes und Adipositas eine Rolle spielt.
In klinischen Untersuchungen zeigten Sepsis-Patienten extrem erhöhte Plasma-AM-Konzentrationen und Patienten mit akutem Nierenversagen hatten deutlich erhöhte Plasma-AM-Konzentrationen während des Krankheitsfrühstadiums; allerdings fielen die AM-Konzentrationen während der Rekonvaleszenz rasch ab (Y. Hirata et al., 1996, J. Clin. Endocrinol. Metab. 81:1449-53). Patienten mit systemischem Entzündungsreaktionssyndrom, Pankreatitis, traumatischem Schock oder schwerer Sepsis wiesen ähnlich deutlich erhöhte Plasmakonzentrationen an AM auf; diese Konzentrationen stiegen proportional zum Schweregrad der Erkrankung an (S. Ueda et al., 1999, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 160:132-6). Die AM-Konzentrationen korrelieren auch mit Sepsismarkern, wie beispielsweise dem Scoring-System „Acute Physiology and Chronic Health Evaluation II" und „Peak Multiple Organ Failure", woraus sich schließen lässt, dass die AM-Konzentrationen eingesetzt werden können, um den Schweregrad einer Sepsis zu bewerten und als Prädiktor für Organversagen und Krankheitsverlauf dienlich sind (Ueda et al., 1999, supra).
Angenommen wird, dass die diversen Wirkungen von AM durch temporale und/oder Gewebe spezifische Regulationsfaktoren hervorgerufen werden. Die Wirkungen verschiedener anderer Peptidhormone werden durch Bindung von in den extrazellulären Flüssigkeiten vorkommenden Bindungsproteinen beeinflusst. Eine der am besten charakterisierten Klassen/Familien von Hormon bindenden Proteinen zum Beispiel sind die insulinartige Wachstumsfaktor-bindende Proteine (IGF-BPs). IGF-BPs steuern, verstärken oder hemmen die Wirkung von IGF-1 auf Zellen, indem sie die Fähigkeit von IGF-1, sich an Zelloberflächenrezeptoren zu binden, regulieren (D.R. Clemmons et al., 1998, Mol. Cell. Endocrinol. 140:19-24).
Nachweis, Isolation und Identifikation von AM-bindenden Proteinen oder Familien solcher Proteine sind daher wichtige Ziele für das weitere Verständnis der AM-Regulation und -funktion sowohl bei Normal- als auch Krankheitszuständen bei Tieren, einschließlich Säugetieren, vorzugsweise Menschen. Solche AM-bindende Proteine stabilisieren oder destabilisieren AM, lenken AM an spezifische Stellen, beeinflussen die AM-Bindung an seinen Rezeptoren oder interagieren auf andere Weise mit AM, um dessen Aktivität und/oder Funktion zu regulieren oder zu verändern. AM-bindende Proteine können daher eine molekulare Grundlage darstellen für die Wirkungen von AM auf verschiedene Gewebe zu verschiedenen Zeitpunkten sowie bei verschiedenen Erkrankungen und Krankheitsstadien.
Als ein Ergebnis der vorliegenden Erfindung können AM-bindende Proteine dazu verwendet werden, Plasma-AM-Konzentrationen zu quantifizieren, um bestehende Krankheiten oder Krankheitsprogressionen zu diagnostizieren und/oder zu überwachen, welche durch veränderte Konzentrationen von zirkulierendem AM charakterisiert sind. AM-bindende Proteine sind möglicherweise auch für die Prävention oder Behandlung von Krankheiten verwendbar, die durch erhöhte AM-Plasmakonzentrationen verschlechtert werden, indem AM-bindende Proteine in Dosierungen verabreicht werden, welche ausreichend für die Bindung von AM sind und somit die AM-Wirkungen oder Interaktionen mit anderen Komponenten hemmen.
DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung liefert neu entwickelte Methoden für Nachweis, Isolation und Identifikation von AM-bindenden Proteinen oder funktionellen Bestandteilen dieser Proteine, zum Beispiel in Form von funktionellen AM-Polypeptiden oder Peptiden. Die vorliegende Erfindung liefert im Weiteren diagnostische Hilfsmittel und Behandlungen unter Verwendung von AM-bindenden Proteinen, Polypeptiden oder Peptiden. Die Erfindung liefert zudem einen neu identifizierten Komplex aus AM und einem AM-bindenden Protein, welches hierin als humaner Komplementfaktor H (fH; Faktor H), (GenBank, Zugangsnr. CAA30403) identifiziert wird. Der humane Komplementfaktor H wurde bereits als Marker für Blasenkrebs festgelegt (R. Heicappell et al., 1999, Eur. Urol. 35:81-7). Gemäß der vorliegenden Erfindung werden neue Therapeutika bereitgestellt, die den AM-bindenden Proteinfaktor H oder verwandte AM-bindende Proteine oder Peptide für die Behandlung von Krebsarten, insbesondere Blasenkrebs, verwenden.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, Methoden zur Isolierung von AM-bindenden Proteinen zu liefern, wobei AM mit einem Label oder Marker konjugiert ist und mit zellulären oder extrazellulären Lysaten inkubiert wird. Label oder Marker können radioaktiv oder nicht-radioaktiv sein; bevorzugt werden nicht-radioaktive. Gemäß dem Aspekt der Erfindung, der sich auf die nicht-radioaktiven Label oder Marker von AM bezieht, wird AM mit fluoreszierenden, chemilumineszenten oder immunoreaktiven Molekülen oder Epitop-Tags markiert.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, diagnostische Reagenzien, beinhaltend AM-bindende Proteine oder Peptide zum Nachweis und/oder Monitoring von AM-Konzentrationen in Proben von Körperflüssigkeit, einschließlich Zell- und Gewebelysaten und -extrakten, zu liefern.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, Methoden bereitzustellen für die Verwendung von AM-bindenden Proteinen oder Peptiden als diagnostische Reagenzien zur Quantifizierung der AM-Konzentrationen, insbesondere zirkulierender AM-Konzentrationen. Solche Methoden sind nützlich zur Diagnose einer Krankheit, zur Bestimmung des Schweregrades und zum Nachverfolgen des Behandlungsverlaufs bei Erkrankungen, die durch veränderte oder abnorme AM-Konzentrationen charakterisiert sind. Zu diesen Erkrankungen zählen Herz- und Lungenkrankheiten, Leberzirrhose, Krebs, Diabetes, Sepsis, Entzündungen und andere krankhafte Störungen, die durch veränderte AM-Plasmakonzentrationen charakterisiert sind.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, verbesserte quantitative Assays für den Nachweis von AM im Serum anzubieten unter Verwendung eines chaotropen Agenzes, z.B. Natriumthiocyanat, um vor der AM-Serumextraktion und -Quantifizierung den Komplex von AM und Faktor H aufzulösen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, quantitative Assays anzubieten für den Nachweis von AM oder Peptiden davon unter Verwendung von Faktor H oder verwandten AM-bindenden Polypeptiden oder Peptiden anstelle von Anti-AM-Antikörpern zur Bindung des AM-Liganden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es auch, Kits bereitzustellen für den AM-Nachweis, beinhaltend AM-bindende Proteine, z.B. Faktor H oder AM-bindende Peptide davon.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, pharmazeutische Zusammensetzungen bereitzustellen, die AM-bindende Proteine oder Peptide enthalten. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden solche pharmazeutische Verbindungen zur Behandlung von Zuständen verwendet, die durch abnorme, z.B. erhöhte AM-Plasmakonzentrationen verursacht oder verstärkt werden. Zu diesen Zuständen gehören Leberzirrhose, Krebs, Diabetes oder andere durch erhöhte AM-Plasmakonzentrationen verursachte oder verstärkte Krankheiten.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines neuen Komplexes aus AM und dem AM-bindenden Proteinfaktor H. Der Komplex wird hierin mit AM/fH bezeichnet.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, isolierte und im Wesentlichen gereinigte Antikörper zur Verfügung zu stellen, die eine spezifische Bindungsaffinität oder Immunreaktivität mit einem AM/AMBP-Komplex oder Fragmente des Komplexes aufweisen, vorzugsweise mit dem AM/fH-Komplex oder Fragmenten davon.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der oben genannten Antikörper in Methoden für den Nachweis des AM/AMBP-Komplexes oder des AM/fH-Komplexes in vivo oder in vitro oder zur Behandlung von mit AM-assoziierten Zuständen wie Krebs oder Diabetes.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von Kits zur Messung der Konzentrationen des AM/AM-bindenden Proteinkomplexes beinhaltend Anti-AM/AMBP-Antikörper, insbesondere Anti-AM/fH-Antikörper.
Ein zusätzlicher Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, Methoden anzubieten für die Identifikation von Antagonistagenzien, die die Wirkung von AM, Faktor H oder AM/fH hemmen.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch das Angebot von Methoden zur Behandlung von Krebs durch Verabreichung von Antikörpern, die sich spezifisch an AM/Faktor H binden und zwar in Konzentrationen, die ausreichend sind, um die Wirkung der Komplexe AM/Faktor H und AM/fH zu hemmen.
Weitere Gegenstände und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch die unten gegebene detaillierte Beschreibung ersichtlich.
BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
Die anhängigen Abbildungen dienen dazu, die Erfindung näher zu beschreiben und helfen durch die Klärung zahlreicher Aspekte, diese besser zu verstehen.
1 zeigt den Nachweis von aus dem Plasma erhaltenem AM-bindenden Protein 1 (AMBP-1), das an markiertes AM bindet. AMBP-1 wurde hierin als humaner Komplementfaktor H (Faktor H) identifiziert, basierend auf vergleichenden biochemischen und Proteinbestimmungen sowie Sequenzinformationen, die in öffentlich zugänglichen Datenbanken zu finden sind. Bahn 1: AM radioaktiv markiert mit ¹²⁵Jod; Bahn 2: AM markiert mit Biotin; Bahn 3: AM markiert mit Fluoreszein; Bahn 4: AM markiert mit Dinitrophenol. Die Bande in jeder Bahn zeigt den Komplex, der durch die Bindung von markiertem AM an AMBP-1 (Faktor H) gebildet wird.
2 zeigt die Ergebnisse eines repräsentativen kompetitiven Bindungsassays zur Bewertung der Spezifität der Bindung zwischen mit Fluoreszein markiertem AM und AMBP-1 (Faktor H). Bahn 1: kein Konkurrent zugegeben; Bahn 2: AM zugegeben; Bahn 3: Insulinartiger Wachstumsfaktor (IGF-1) zugegeben; Bahn 4: Proadrenomedullin N-terminal-20 Peptid (PAMP) zugegeben; Bahn 5: Insulin zugegeben. „f-AM+" bedeutet Fluoreszein markiertes AM. Die Bande zeigt den AM/AMBP-1 (AMIfH)-Komplex, der durch die Anwesenheit der Konkurrenzpeptide nicht beeinflusst wird.
3 zeigt die Ergebnisse eines repräsentativen kompetitiven Bindungsassays zur Bewertung der Spezifität der Bindung zwischen mit Fluoreszein markiertem AM und AMBP-1 (Faktor H). Bahn 1: kein Konkurrent zugegeben; Bahn 2: AM in voller Länge zugegeben; Bahn 3: AM_1–12 zugegeben; Bahn 4: AM_16–21 zugegeben; Bahn 5: AM_22–52 zugegeben; Bahn 6: AM_13–52 zugegeben; Bahn 7: AM_34–52 zugegeben; Bahn 8: mit Calcitoningen verwandte Peptide (CGRP) zugegeben; Bahn 9: Amylinpeptide zugegeben. „f-AM+" bedeutet Fluoreszein markiertes AM. Die Bande zeigt den AM/AMBP-1 (Faktor H)-Komplex, der durch die Anwesenheit der Konkurrenzpeptide nicht beeinflusst wird.
4 zeigt die Isolation von AMBP-1. 4A zeigt die Fraktionierung von Humanplasma durch Reversed-Phase HPLC. Die gepunktete Linie stellt den Acetonitril-Gradienten dar. 4B zeigt die Coomassie Blue-Färbung der HPLC-Fraktionen 47–51. 4C zeigt das Ligand-Blotting der HPLC-Fraktionen 47–51.
5 zeigt die biochemische Charakterisierung von AMBP-1 als humaner Komplementfaktor H. 5A zeigt Coomassie Blue- und Glycoprotein-Färbung (GelCode Glycoprotein Staining Kit, Pierce, Rockford, IL) von mit SDS-PAGE aufgetrennten Proben. Bahn 1: Meerrettich-Peroxidase (5 μg), ein glycosyliertes Protein, das als Positivkontrolle verwendet wird; Bahn 2: Sojabohnen-Trypsininhibitor (5 μg), ein nicht-glycosyliertes Protein, das als Negativkontrolle verwendet wird; Bahn 3: AMBP-1 (2 μg). 5B zeigt die Coomassie Blue-Färbung von durch Elektrophorese auf einem isoelektrischen Fokussierungsgel mit pH 3–10 (Novex, San Diego, CA) aufgetrennten Proben. Bahn 1: isoelektrische Fokussierungsmarker; Bahn 2: AMBP-1 (4 μg). 5C zeigt die Western Blot Analyse von Proben mit einem Anti-Faktor-H-Antikörper. Bahn 1: AMBP-1 (100 ng); Bahn 2: AMBP-1 (200 ng); Bahn 3: kommerziell erhältlicher humaner Faktor H (50 ng); Bahn 4: Humanplasma (0,2 μl). 5D zeigt das nicht-radioaktive Ligand-Blotting von 1 μg AMBP-1 (Bahn 1) und Faktor H (Bahn 2). 5E zeigt das Ligand-Blotting von AMBP-1 (250 ng) unter nicht reduzierten (Bahn 1) oder reduzierten Bedingungen (Bahn 2). 5F zeigt, dass die Bindung von mit Fluoreszein markiertem AM (50 nM) an eine Multi-Well-Mikrotiterplatte beschichtet mit Faktor H (5 ng/Well) durch zunehmende Konzentrationen von unmarkiertem AM (•) kompetitiv gehemmt wird. Im Gegensatz dazu wird die Bindung von AM an Faktor H nicht durch PAMP (*) oder CGRP (o) beeinflusst. Die Ergebnisse stehen für eines von zwei unabhängigen Experimenten. Die Werte jeweils den Mittelwert und die Standardabweichung von drei Bestimmungen dar. „B/B₀" bezieht sich auf das Verhältnis von Signalen, die in Ab-/Anwesenheit von unmarkierten Konkurrenten erzeugt wurden.
6 zeigt die Dissoziation des AM/fH-Komplexes. 6A: Gereinigtes AMBP-1 (Fraktion-Nr. 48) wurde mittels Elektrophorese aufgetrennt und auf eine Membran übertragen. Nach der Inkubation mit Fluoreszein markiertem AM und vor der letztendlichen Entwicklung wurde die Membran unter verschiedenen Bedingungen inkubiert (neutraler pH-Wert, falls nicht anders angegeben). Bahn 1: PBS; Bahn 2: pH 11,5; Bahn 3: pH 2,5; Bahn 4: 4M NaCl; Bahn 5: 4M NaCl; pH 11,5; Bahn 6: 4M NaCl; pH 2,5; Bahn 7: 1 % SDS; Bahn 8: 3M Harnstoff; Bahn 9: 3M Guanidin-HCl; Bahn 10: 3M Natriumthiocyanat (NaSCN); Bahn 11: 50 % Ethylenglycol pH 11,5; Bahn 12: 50 % Ethylenglycol Bahn 13: 1 % β-Mercaptoethanol. Die Bande repräsentiert den AM/fH-Komplex, der durch die Inkubationsbedingungen unbeeinträchtigt bleibt. 6B zeigt die Dissoziation des AM/fH-Komplexes in einem Assaysystem mit Multi-Well-Mikrotiterplatten. Mit Faktor H überzogene Wells wurden mit Fluoreszein markiertem AM inkubiert und diese Wells vor der Assay-Entwicklung in PBS mit 3M NaSCN pH 7,4 über unterschiedliche Zeiträume inkubiert. Die Werte stellen jeweils den Mittelwert und die Standardabweichung von sechs Bestimmungen dar. B/B₀ steht für den Prozentsatz an Gesamtbindung.
7 zeigt Western Blot Analysen von Faktor H und AM nach C18-Extraktion. 7A zeigt Humanplasma (1 ml) aufgearbeitet über eine Sep Pak C18 Cartridge und analysiert mittels Western Blotting mit Anti-Faktor-H-Antikörpern. Bahn 1: kommerziell erhältlicher humaner Faktor H (10 ng); Bahn 2: humanes Vollserum (0,5 μl); Bahn 3: ungebundene Fraktion (1 μl). Bahn 4, gebundene Fraktion (1 μl). 7B zeigt Humanplasma (1 ml) aufgearbeitet über eine Sep Pak C18 Cartridge und analysiert mittels Western Blotting, gefolgt von Immunopräzipitation mit Anti-AM-Antikörpern. Bahn 1: synthetisch AM (1 ng); Bahn 2: Fraktion immunopräzipitiert mit normalem Kaninchenserum (30 μl); Bahn 3: Fraktion immunopräzipitiert mit Anti-AM-Antikörpern vom Kaninchen (30 μl).
8 zeigt die kompetitiven Bindungskurven, erzeugt mit Humanplasma im AM-Radioimmunassay. Die Verdünnungskurven von Plasma (4 ml) extrahiert gemäß dem Standardprotokoll (+) oder der NaSCN-Modifikation (•) wurden mit der Standardkurve von synthetischem AM (o) verglichen. B/B₀ bezieht sich auf das Verhältnis von gebundener Radioaktivität zu Radioaktivität, die in Abwesenheit von zugegebenem Standard gebunden wurde. Der Skalierungsbalken über den Kurven stellt die unterschiedlichen Plasmaverdünnungen dar.
9 zeigt die Wirkung von Faktor H auf die AM-Aktivität. 9A zeigt die Wirkung von Faktor H bei der AM vermittelten cAMP-Induktion. Zyklisches AMP wurde nach der Inkubation von Rat-2-Zellen mit AM und steigenden Konzentrationen von Faktor H gemessen. Inkubationen mit AM und 100 oder 200 nM Faktor H führten zu einem deutlichen Anstieg von cAMP im Vergleich zu den mit AM allein (p < 0,01** beziehungsweise p < 0,001***) erhaltenen Konzentrationen. Die Inkubation mit Faktor H allein hatte keine Auswirkung auf die cAMP-Konzentrationen. Die Werte stellen jeweils den Mittelwert und die Standardabweichung von vier unabhängigen Bestimmungen dar. 9B zeigt die antimikrobielle Wirkung von AM (•), Faktor H (*) oder AM in Gegenwart von 50 μg/ml Faktor H (o). Die Ergebnisse sind in Einheiten für die Hemmung ausgedrückt (10 Einheiten entsprechen 1 mm des Durchmessers im Hemmhof). MHK-Werte wurden anhand der Durchführung einer linearen Regression und Bestimmung der X-Achsenabschnitte bestimmt. Der MHK-Wert für AM lag bei 18,4 ± 1,3 μg/ml und stieg bis auf 35,4 ± 1,1 μg/ml bei der Zugabe von Faktor H (p < 0,001) an. Die Werte stellen jeweils den Mittelwert und die Standardabweichung aus acht Bestimmungen dar.
10 zeigt die Wirkung von AM auf die Faktor-H-Aktivität. C3b (104 kDa α'-Kette und 71 kDa β-Kette) wurde für 24 h bei 37°C mit Faktor H, Faktor I und verschiedenen Peptiden inkubiert. Die Spaltung der C3b α'-Kette führte zu drei Banden mit Molekulargewichten von 68 kD, 43 kD und 42 kD.
10A zeigt die Wirkung von verschiedenen AM-Konzentrationen auf die Cofaktor-Aktivität von Faktor H. 10B zeigt die Wirkung von AM auf die Faktor-H-Aktivität verglichen mit der Wirkung des strukturell verwandten Peptids CGRP und dem Gen-verwandten Peptid PAMP auf Faktor H. Jede der Abbildungen zeigt ein repräsentatives Beispiel von drei verschiedenen Experimenten.
11 zeigt die Northern Blot Analyse von Faktor H (4,3 kb) und Faktor H-ähnliche (FHL-1, 1,8 kb) Message-Expression in humanen Tumorzelllinien. 11A zeigt die Ergebnisse der Northern Blot Analyse unter Verwendung der Faktor-H-Sonde. 11B zeigt die Ethidiumbromid-Färbung zur Darstellung der Gesamtmenge von RNA in jedem Well. „Ca" steht für Karzinom; „BAC" steht für bronchioalveoläres Karzinom; „vSCLC" steht für Variant Small Cell Lung Cancer (Variante des kleinzelligen Lungenkarzinoms); „Adeno-Ca" steht für Adenokarzinom; „Plattenepithel-Ca" steht für Plattenepithelkarzinom.
12 zeigt die immunohistochemische Markierung von Faktor H in Rattenpankreas. Anti-Faktor-H-Antikörper lokalisierten Faktor H an Zellen in den Langerhans'schen Inseln (12A). Diese Lokalisierung zeigte bei stärkerer Vergrößerung ein granuläres Muster (12B). Anti-Faktor-H-Antikörper lokalisierten Faktor H auch auf einigen exokrinen Acini (12C). Affinitätsgereinigte Anti-Faktor-H-Antikörper zeigten das gleiche Färbemuster (12D). Die Pfeile bedeuten die Regionen der Faktor-H-Lokalisierung.
13 zeigt die Immunofluoreszenzmarkierung von Insulin (13A, 13E und 13I), Faktor H (13B, 13F und 13J) und entweder Glucagon (13C), Somatostatin (13G) oder Pankreaspeptid (13K) im Rattenpankreas. Die vierte Spalte (13D, 13H und 13L) stellt eine Zusammensetzung (COMP) aus der Dreifachmarkierung dar. In allen Fällen kommt Faktor H (FH) colokalisiert mit Insulin (INS) in den zentralen β-Zellen vor und fehlt in den peripheren Zellen, die Somatostatin (SST), Glucagon (GLUC) oder Pankreaspolypeptid (PP) produzieren. Die Proben wurden mithilfe der konfokalen Mikroskopie analysiert.
14 zeigt die Immunogold-Markierung von Faktor H (kleine Goldteilchen mit einem Durchmesser von 10 nm) und Insulin (große Teilchen mit einem Durchmesser von 20 nm) im Rattenpankreas. Bilder mit geringer Vergrößerung (14A) zeigen, dass Faktor H auf den charakteristischen sekretorischen Granulen der β-Zellen lokalisiert ist und auf den umgebenden endokrinen Zelltypen fehlt. Bilder mit starker Vergrößerung (14B) zeigen, dass Faktor H hauptsächlich auf den durchscheinenden Halos (Ringe) lokalisiert ist und Insulin vor allem in den dichten Granulakernen. Zusätzlich liegt Faktor H in den sekretorischen Granula einiger exokriner Zellen vor (14C). Die Proben wurden mithilfe des Elektronenmikroskops analysiert.
15 zeigt die RT-PCR Analyse zur Bestimmung der Faktor H Expression in Mäuseleber und -pankreas. 15A zeigt das mit PCR amplifizierte Faktor-H-Produkt (839 bp) aus Leber- und Pankreaszellen der Maus. Das PCR-Produkt wurde sequenziert, um herauszufinden, ob es die Sequenz vom Faktor H der Maus enthält. Die RT-PCR-Ergebnisse wurden mittels Southern Blot Analyse bestätigt (15B).
16 zeigt die Wirkung von Faktor H auf die Insulinsekretion. Die Inkubation der Inseln mit AM und/oder Faktor H resultierte in einer dosisabhängigen Abnahme der Insulinsekretion (16A) und begleitendem Anstieg in cAMP in 16B. Ein repräsentatives Experiment wird angeführt. Die Werte für die jeweilige Behandlung entsprechen dem Mittelwert und der Standardabweichung von drei unabhängigen Wells.
Die Insulinfreisetzung wird ausgedrückt als Verhältnis der Insulinmenge im Medium mit hoher Glukosekonzentration dividiert durch die Menge in dem Medium mit geringer Glukosekonzentration, um so die Abweichungen in der Anzahl der Sekretzellen und/oder deren sekretorischen Effizienz mit zu berücksichtigen. Alle Werte unterschieden sich statistisch (p < 0,05) von den negativen Kontrollen (erster Balken).
17 zeigt die AM-bindenden Proteine in verschiedenen Spezies nachgewiesen durch Ligand-Blot-Analyse unter Verwendung von mit ¹²⁵I markiertem humanem AM. Die Banden entsprechen den 120 kD oder 140 kD Untereinheiten identifiziert im Plasma oder Serum der zehn analysierten Spezies.
18 zeigt verringerte Konzentrationen von AM-bindenden Proteinen beobachtet im Plasma von mit Parasiten befallenen Kälbern im Vergleich zu Plasma von gesunden Kälbern. Die mittlere Intensität der Banden war um 67 % (P < 0,03) verringert.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Eine erfindungsgemäße Ausführungsform umfasst einen Ligand-Blotting-Assay, bei dem AM als Ligand mit einem radioaktiven oder nicht-radioaktiven Molekül, einem Marker oder Tag markiert wird und als Sonde zur Identifizierung eines AM-bindenden Proteins oder einem AM-bindenden Fragment davon, eingesetzt wird. In der vorliegenden Erfindung werden nicht-radioaktiv markierte AM-Liganden bevorzugt.
Markierung von AM
Für die nicht-radioaktive Markierung von AM oder damit verwandten Peptiden stehen zahlreiche Methoden zur Verfügung. Beispielsweise können Kopplungsagenzien wie Aldehyde, Carbodiimide, Dimaleimide, Iminodiacetate, Succinimide, Aminobenzamidine und verwandte Verbindungen dazu verwendet werden, AM-Peptide mit fluoreszierenden, chemilumineszierenden oder chemischen Markern zu konjugieren. Zu den verwendbaren, aber nicht nur darauf beschränkten nicht-radioaktiven Markern zählen beispielsweise Fluoreszenzmarker wie Fluoreszein und seine Derivate, z.B. Fluoreszein-Isothiocyanat, Rhodamin und seine Derivate, Dansyl und Umbelliferon, chemilumineszierende Verbindungen wie 2,3-dihydrophthalazin-dion und chemische Gruppen wie beispielsweise Dinitrophenol (DNP), Digoxigenin und Biotin.
AM oder daraus erhaltene Peptide können daher auch mit Aminosäuresequenzen getaggt werden, die immunoreaktive Epitope tragen. Eine nicht-einschränkende Liste an geeigneten Epitop-Tags beinhaltet c-myc-, Hämagglutinin (HA)-, Polyhistidin (6X-HIS)-, GLU-GLU- und DYKDDDDK (FLAG^®)-Tags. Epitop-Tags können an Polypeptide oder Peptide mithilfe einer Reihe von etablierten Methoden angehängt werden. Die DNA-Sequenzen der Epitop-Tags werden dabei in die Polypeptid- oder Peptid-kodierenden Sequenzen als Oligonukleotide eingebracht oder über in der PCR-Amplifizierung verwendete Primer. Alternativ dazu ist es auch möglich, Polypeptid- oder Peptid-kodierende Sequenzen in spezifische Vektoren zu klonen, die zu einer Fusion mit Epitop-Tags führen, beispielsweise pRSET-Vektoren (Invitrogen Corp., San Diego, CA). Das vollständige AM-Peptid oder von AM erhaltene Fragmente, vorzugsweise mit gleicher oder ähnlicher Funktion wie AM können auch verwendet werden.
Unter einem anderen erfindungsgemäßen Aspekt kann AM mit radioaktiven Isotopen getaggt oder markiert werden, wie beispielsweise mit ¹²⁵I, ¹³⁵I, ³⁵S, ¹⁴C, oder [³H]-Thymidin, als den Erfindungsgedanken nicht einschränkende Beispiele. Den Fachleute auf diesem Gebiet ist bekannt, wie Proteine und Peptide unter Verwendung von Methoden und Protokollen, welche hierfür routinemäßig gebräuchlich sind, mit radioaktiven Isotopen markiert werden. AM kann beispielsweise durch Inkorporation von mit ¹⁴C oder ³⁵S markierten Aminosäuren während der Proteinsynthese in Wirtszellen oder zellfreien Expressionssystemen (siehe unten) markiert werden. Dieses radioaktiv markierte AM wird dann isoliert und in einem entsprechenden Assay auf die Bindung an AM-Rezeptoren zur Bestätigung seiner biologischen Funktion getestet.
Identifikation von AM-bindenden Proteinen
Mögliche AM-bindende Proteine, Polypeptide oder davon erhaltene Peptide sind über den Fachmännern wohl bekannte Methoden identifizier- und analysierbar (siehe T.E. Creighton, Ed., 1997, Proteins Structure: A Practical Approach, IRL Press at Oxford Press, Oxford, England). Die Begriffe Protein und Polypeptid sind, wie in diesem Patent gebraucht, Synonyme. Peptide sind definiert als Fragmente oder Teile von Proteinen oder Polypeptiden, vorzugsweise Fragmente oder Teile mit gleicher oder ähnlicher Funktion oder Aktivität wie das vollständige Protein.
AM-bindende Proteine können aus biologischen Proben gewonnen werden, wie beispielsweise aus Proben von Plasma- und Körperflüssigkeiten von Tieren, einschließlich Zellen, Geweben, Lysaten oder Extrakten daraus. Zu den geeigneten Tierreservoiren für AM-bindende Proteine gehören Vögel, Fische, Insekten und Säugetiere, einschließlich der Mensch. Die aus diesen Reservoiren erhaltenen Proteine lassen sich mithilfe der Größenfraktionierung über Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) in Banden auftrennen und mittels Elektroblotting übertragen, beispielsweise auf eine geeignete Festphasenmatrix, einen Träger oder eine Membran (z.B., Glas- oder Polymerbeads oder mit Nylon verstärkte Nitrocellulose oder Polyvinylidenfluorid). Der Träger kann dann mit markiertem AM inkubiert werden. Proteine/Polypeptide, die zu den Banden passen, welche eine spezifische Bindung mit markiertem AM zeigen, werden dann identifiziert, isoliert/gereinigt und mithilfe von Aminosäureanalyse und Edman-Abbau analysiert, um so die Aminosäuresequenz der daraus erhaltenen Peptide zu bestimmen.
Die mit Edman-Abbau bestimmten Sequenzen werden mit den entsprechenden Sequenzen des Subjektes in verfügbaren Datenbanken wie GenBank, SwissProt, BLOCKS und Pima II, aber auch ohne Einschränkung mit anderen, verglichen. Diese Datenbanken, welche bereits zuvor identifizierte und kommentierte Sequenzen enthalten, können nach der Gesamtlänge des Polypeptids und der Gensequenz durchsucht werden, zum Beispiel: Basic Local Alignment Search Tool (BLAST; S.F. Altschul, 1993, J. Mot. Evol. 36:290-300; S.F. Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-10).
In Fällen, in denen die vollständigen Sequenzen der AM-bindenden Proteine nicht verfügbar sind, besteht die Möglichkeit, erweiterte oder überlappende Teilklone durch auf diesem Gebiet bekannte und praktizierte konventionelle Techniken zu erhalten. Nicht-einschränkende Beispiele solcher Techniken beinhalten die Untersuchung von Plasmid- oder Phagen-Bibliotheken durch Hybridisierung von genomischer DNA oder cDNA, PCR aus der gleichen Bibliothek unter Verwendung von AM-bindenden Proteinprimerpaaren oder Hybridisierung oder PCR direkt an genomischer DNA oder cDNA. Diese Klone können dann sequenziert und zu Genen mit vollständiger Länge mithilfe des Fragment Sequence Alignment Program (PHRAP; Nickerson et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:2745-2751) zusammengesetzt werden.
Reinigung von AM-bindenden Proteinen
Isolierte AM-bindende Proteine oder Peptide können zur Diagnostik und bei Behandlungen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Ein, wie hierin verwendetes, isoliertes Protein oder Peptid bezieht sich auf eine Komponente, die aus ihrer ursprünglichen Umgebung entfernt wurde (beispielsweise ihrer natürlichen Umgebung, falls sie natürlich vorkommt). Ein isoliertes Protein oder Peptid enthält weniger als etwa 50 %, vorzugsweise weniger als etwa 25 %, und idealerweise weniger als etwa 10 % der Komponente, mit der es ursprünglich assoziiert war. Vorzugsweise besitzt ein isoliertes Polypeptid oder Peptid mindestens einen Reinheitsgrad von etwa 80–90 %, idealerweise von mindestens etwa 90–100 %.
Sowohl natürlich vorkommende als auch rekombinante Formen von AM-bindenden Proteinen oder Peptiden können verwendet werden. Methoden für die direkte Isolation und Reinigung von Polypeptiden aus natürlichen Reservoiren wie zellulären oder extrazellulären Lysaten gehören zum bereits wohl bekannten Stand der Technik (siehe E.L.V. Harris and S. Angal, Eds., 1989, Protein Purification Methods: A Practical Approach, IRL Press at Oxford Press, Oxford, England). Solche Methoden beinhalten, ohne dabei einzuschränken, präparative Disc-Gelelektrophorese, isoelektrische Fokussierung, Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC = High-Performance Liquid Chromatography), Reversed-Phase HPLC, Gelfitration, Ionenaustauscher- und Verteilungschromatographie und Gegenstromverteilung sowie Kombinationen davon. Natürlich vorkommende Polypeptide können aus vielen möglichen Reservoiren gereinigt werden, wie zum Beispiel aus Plasma, Körperzellen und Geweben oder Körperflüssigkeiten.
Um rekombinante AM-bindende Proteine oder Peptide herzustellen, werden DNA-Sequenzen, die für AM-bindende Proteine oder Peptide kodieren, in einem geeigneten Vektor zur Expression in intakten Wirtszellen oder zellfreien Translationssystemen geklont (siehe J. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY). Prokaryotische und eukaryotische Vektoren und Wirtszellen können eingesetzt werden. Die Wahl von Vektor/Wirt/Translationssystem ist für den erfindungsgemäßen Gebrauch nicht ausschlaggebend. DNA-Sequenzen können, falls gewünscht, für eine wirksamere Expression in einem gegebenen Wirtsorganismus optimiert werden. Beispielsweise können Codons verändert werden, um der bevorzugten Codonverwendung in einer gegebenen Wirtszelle oder einem zellfreien Translationssystem unter Anwendung von routinemäßig auf diesem Gebiet gemäß dem Stand der Techniken praktizierten Methoden zu entsprechen.
Klonvektoren beinhalten pUC, pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA), pET (Novagen, Inc., Madison, WI) und pREP (Invitrogen Corp.)-Plasmide, sind aber nicht auf diese beschränkt. Vektoren können ein oder mehrere Replikations- und Vererbungssystem(e) für das Klonen oder die Expression enthalten sowie einen oder mehrere Marker für die Selektion im Wirt, z.B. Antibiotikaresistenz, und eine oder mehrere Expressionskassetten. Die eingebrachte Kodierungssequenz kann mit Standardmethoden synthetisiert, aus natürlichen Reservoiren isoliert oder in Form von Hybriden hergestellt werden. Die Ligation der kodierenden Sequenzen mit den transkriptionellen regulatorischen Elementen (z.B. Promotoren, Verstärkern und/oder Isolatoren) und/oder für andere Aminosäuren kodierende Sequenzen können mit etablierten Methoden durchgeführt werden.
Für manche Zwecke mag es von Vorteil sein, Peptide oder Polypeptide in einem rekombinanten System herzustellen, in dem die Peptide oder Polypeptide zusätzliche Sequenzmarker tragen, um die Reinigung zu erleichtern. Zu solchen Markern zählen Epitop-Tags (oben beschrieben) und Protein-Tags zum Beispiel Glutathion-S-Transferase (GST), Green Fluorescent Protein (GFP) und Maltose-bindendes Protein (MBP). Protein-Tags werden an Peptiden oder Polypeptiden mithilfe von zahlreichen wohl bekannten Methoden angebracht. Als ein den Erfindungsgedanken nicht einschränkendes Beispiel kann die Kodierungssequenz eines Polypeptids oder Peptids in einen Vektor geklont werden, um eine Fusion zwischen dem Polypeptid oder Peptid und einem interessanten Protein-Tag herbeizuführen. Geeignete Vektoren umfassen, ohne dabei auf diese beschränkt zu sein, die typischen Plasmide pGEX (Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ), pEGFP (CLONETECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) und pMAL^TM (New England BioLabs, Inc., Beverly, MA). Das getaggte Polypeptid oder Peptid kann dann aus einem unverarbeiteten (crude) Lysat des Translationssystems oder der Wirtszelle über Chromatographie mit einer geeigneten Festphasenmatrix gereinigt werden.
Geeignete zellfreie Expressionssysteme für die erfindungsgemäße Verwendung beinhalten Kaninchen-Retikulozytenlysat, Weizenkeimextrakt, mikrosomale Membranen aus Hundepankreas, E. coli S30 Extrakt und gekoppelte Transkriptions-/Translationssysteme (Promega Corp., Madison, WI). Diese Systeme ermöglichen das Exprimieren von rekombinanten Polypeptiden oder Peptiden bei der Zugabe von Klonierungsvektoren, DNA-Fragmenten oder RNA-Sequenzen, die die Kodierungsabschnitte und geeignete Promoterelemente enthalten.
Zu den Wirtszellen für rekombinante Klonierungsvektoren zählen Bakterien-, Archäbakterien-, Pilz-, Pflanzen-, Insekten- und Tierzellen, insbesondere Säugetierzellen. Von besonderem Interesse sind E. coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Neurospora crassa, SF9, C129, 293, NIH 3T3, CHO, COS und HeLa-Zellen. Solche Zellen können gegebenenfalls transformiert, transfiziert oder transduziert werden mit jeder geeigneten Methode einschließlich Elektroporation, CaCl₂-, LiCl-, LiAc/PEG-, Spheroplasting-, Ca-Phosphat, DEAE-Dextran, Liposomen-vermittelter DNA-Aufnahme, Injektion, Mikroinjektion, Mikroprojektil-Bombardment oder anderen etablierten Methoden.
Antikörper-basierte Methoden können auch zur Reinigung von natürlichen oder rekombinant produzierten AM-bindenden Proteinen oder Peptiden verwendet werden. Antikörper, die diese Polypeptide oder davon erhaltene Peptide erkennen, können mithilfe dem Stand der Technik bereits bekannten und praktizierten Methoden hergestellt und isoliert werden. AM-bindende Polypeptide oder Peptide können dann aus dem unverarbeiteten Lysat über Chromatographie mit Antikörper-konjugierten Festphasenmatrices (siehe E. Harlow and D. Lane, 1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) gereinigt werden. Andere zum Stand der Technik gehörende Reinigungsmethoden können ebenfalls verwendet werden.
Der „AM-binding protein human complement factor H (fH)" (humaner Komplementbindungsfaktor H (fH) als AM-bindendes Protein)
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das AM-bindende Protein der humane Komplementfaktor H. Der Faktor H wurde ursprünglich als ein bedeutender Modulator der Komplementkaskade des Immunsystems (siehe M.P. Dierich, 1988, Mol. Immunol. 25:1043-51) identifiziert. Speziell Faktor H bildet einen Komplex mit Faktor I; der fH-fI-Komplex baut selektiv C3b ab, inaktiviert die C3-Konvertase und konkurriert mit Faktor B um die Bindung an C3b (P.F. Zipfel, et al., 1999, Immunopharmacol. 42:53-60). Darüber hinaus kann sich Faktor H an den Integrinrezeptor (CD11b/CD18), der in einer Vielzahl von Humangeweben exprimiert wird, binden sowie an bestimmte Oberflächen-Glykosaminoglykane, die sowohl auf prokaryotischen als auch auf eukaryotischen Zellen (P.F. Zipfel, et al., 1999, Immunopharmacol. 42:53-60) vorkommen.
Die vollständige cDNA (4,3 kb) für den humanen Faktor H wurde bereits geklont und sequenziert. Herausgefunden wurde, dass sie alternativem Gen-Splicing unterliegt und auf diese Weise ein kürzerer Informationsstrang (1,8 kb) (P.F. Zipfel et al., 1999, Mol. Immunol. 36:241-8) entsteht. Dieser kürzere Informationsstrang wird translatiert in ein trunkiertes Faktor H-Molekül (43 kDa), welches als Faktor H-ähnliches Protein (FHL-1) bezeichnet wird und die gleichen Komplement-regulatorischen Funktionen wie Faktor H (P.F. Zipfel et al., 1999, Mol. Immunol. 36:241-8) besitzt. Strukturell betrachtet besitzt Faktor H zwanzig Domänen (SCRs = Short Consensus Repeats), während FHL-1 nur sieben enthält. Der konventionellen Nomenklatur entsprechend wird Faktor H als SCR 1–20 dargestellt und FHL-1 als SCR 1–7 (P.F. Zipfel, et al., 1999, Immunopharmacol. 42:53-60). Sowohl Faktor H als auch Faktor H-ähnliche Proteine wurden bereits als Marker für Harnblasenkarzinome verwendet (R. Heicappell et al., 1999, Eur. Urol. 35:81-7).
Entsprechend der hierin beschriebenen Methoden zur Isolation und Identifikation von AM-bindendem Protein haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung gezeigt, dass Faktor H ein aus humanem Plasma isoliertes AM-bindendes Protein ist. Insbesondere ermöglichen eine nicht-radioaktive Ligand-Blotting-Technik (Beispiele 1 und 2; 1) und HPLC/SDS-PAGE (Beispiel 4; 4A–4C) Reinigungstechniken die Isolation des AMBP-1-Proteins. Das gereinigte Protein wurde einer Gesamtaminosäureanalyse unterzogen, einer N-terminalen Aminosäuresequenzierung und einer Massenspektrometrie (Beispiel 5, Tabelle 1). Zusätzlich dazu wurde gereinigtes AMBP-1 mit Faktor H verglichen, basierend auf dem offensichtlichen Molekulargewicht, Glykosylierung, AM-Bindung und Erkennung durch Anti-Faktor-H-Antikörper (Beispiel 6; 5A, 5C und 5D). Anhand der Ergebnisse wurde AMBP-1 als humaner Komplementfaktor H identifiziert.
Es wurden, wie hierin beschrieben, zusätzliche Experimente durchgeführt, um die AM/fH-Interaktion zu charakterisieren (Beispiel 7). Diese Experimente zeigten, dass der AM/fH-Komplex nicht in Gegenwart von Säure oder hohen Salzkonzentrationen zerfiel (6A). Im Gegensatz dazu löste sich der AM/fH-Komplex in Gegenwart von chaotropen Agenzien, wie NaSCN, auf (6A).
Die Auflösung des AM/fH-Komplexes durch NaSCN wurde mithilfe eines Multi-Well AM-Bindungsassays, 96-Well-Mikrotiterplatte, bestätigt (Beispiel 7). Die Verdrängungskurve lässt auf das Vorliegen von zwei Dissoziationsmechanismen schließen, wie sich anhand einer initialen raschen Dissoziationsphase zeigt, gefolgt von einer langsameren Dissoziationsphase (6B).
Die hierin beschriebenen Experimente haben gezeigt, dass die AM/fH-Interaktion mit etablierten Methoden zur Quantifizierung von zirkulierendem AM (Beispiel 8) interferiert. Somit ist es nicht möglich, mit der routinemäßigen Radioimmunassay (RIA)-Quantifizierung für AM die Menge an AM zu bestimmen, die an das Bindungsprotein, Faktor H, gebunden ist. Die Untersuchungen der Erfinder deuten darauf hin, dass die Standard-C18-Reversed-Phase Trenntechnik, die zur Herstellung von Plasma für die RIA-Analyse verwendet wird, effektiv AMBP-1 (Faktor H) aus dem Extrakt (T. H. Elsasser et al., 1999, Endocrinology 140:4908-4911; 7A) eliminiert. Weitere Studien haben gezeigt, dass AM nach der Trennung über eine C18 Reversed-Phase-Säule (7B) sowohl in den ungebundenen als auch den gebundenen Fraktionen nachweisbar wird. Dies bestätigt, dass mit dem traditionellen Verfahren die Gesamtmenge an AM im Plasma nicht gewonnen werden kann. Darüber hinaus haben die Erfinder eine abgeänderte RIA-Analyse unter Verwendung von Plasma, das zuvor mit einem chaotropen Agenz, NaSCN, behandelt wurde, durchgeführt, um die AM/fH-Komplexe im Plasma vor der Extraktion aufzulösen. Mit dem geänderten Protokoll wurden AM-Konzentrationen nachgewiesen, die zweimal so hoch lagen, wie die mit der Standardtechnik ermittelten Konzentrationen (8).
Die Experimente der Erfinder haben des Weiteren gezeigt, dass Faktor H die AM-Aktivität und AM die Aktivität von Faktor H beeinflusst. Insbesondere verstärkt Faktor H die AM-vermittelte Induktion von cAMP in Fibroblasten (Beispiel 9; 9A), unterdrückt allerdings die antibakterielle Wirkung von AM gegen E. coli (Beispiel 9; 9B). AM verstärkt zusätzlich die fH/fI-vermittelte Spaltung von C3b (Beispiel 9; 10A und 10B). Die Interaktion von AM und Faktor H ruft somit weit reichende Effekte bei der AM- und Faktor-H-Funktion hervor.
Außerdem haben Experimente, die hierin detailliert beschrieben werden, gezeigt, dass Faktor H und FHL-1 in Zellen des nicht-kleinzelligen Lungenkarzinoms, in Adenokarzinomzellen und Plattenepithelkarzinomzellen stark exprimiert werden. Faktor H und FHL-1 werden auch in anderen Zellen von soliden Tumoren, wie bei Brust, Dickdarm-, Eierstock und Prostatakarzinomzellen, exprimiert (11). Diese Ergebnisse stimmen mit jüngsten Befunden überein, welche festgelegt haben, dass Faktor H in einer Vielzahl von humanen Krebszellen (d.h. Blasenkrebs, Brustkrebs und Glioblastomzellen) exprimiert wird und Faktor H die Krebszellresistenz gegenüber Komplement-vermittelter Zelllyse erleichtert (N.S. Fedarko et al., 2000, J. Biol. Chem. 275:16666-16672; S. Junnikkala et al., 2000, J. Immunol. 164:6075-6081; P.F. Zipfel et al., 1999, Mol. Immunol. 36:241-8).
In ähnlicher Weise haben die Untersuchungen der Erfinder gezeigt, dass AM in mehreren Krebszelllinien exprimiert wird und gegen AM gerichtete monoklonale Antikörper das Tumor- oder Krebszellwachstum konzentrationsabhängig hemmen (Martinez et al., 1995, supra; M. Garayoa et al., 2000, Mol. Endocrinol. 14(6):848-862; Martinez et al., 1997, supra; Miller et al., 1996, supra). Die hierin beschriebenen Experimente zeigen zudem, dass AM den fH/fI-vermittelten Abbau von C3b potenziert (Beispiel 9; 10A und 10B). Die Summe dieser Beobachtungen deutet darauf hin, dass der AM/fH-Komplex möglicherweise die Krebszellresistenz gegenüber der Komplement-vermittelten Zelllyse vermittelt. Dementsprechend können Antagonisten, die die AM-Aktivität und die Aktivität von Faktor H hemmen oder die Interaktion von AM und Faktor H verhindern, die Krebszellresistenz gegenüber der Zelllyse herabsetzen. Solche Antagonisten sind somit möglicherweise als Krebstherapeutika einsetzbar.
In einer separaten Reihe von Experimenten, die hierin weiter unten beschrieben sind, haben die Erfinder immunohistochemische Marker verwendet (Beispiel 11; 12A–12D) und verschiedene Immunofluoreszenzmarker, gefolgt von Konfokalmikroskopie (Beispiel 12; 13B, 13F und 13J), um zu zeigen, dass Faktor H von β-Zellen der Ratten-Pankreasinseln exprimiert wird. Die doppelte Immunogold-Färbung unter dem Elektronenmikroskop zeigte auch eine Colokalisation von Insulin und Faktor H innerhalb der gleichen sekretorischen Granulen (Beispiel 13; 14B). Faktor H wurde auf elektronendurchlässigen Halos lokalisiert, während Insulin vornehmlich in den elektronendichten Kernen zu finden war (14B). Das Vorhandensein von Faktor H mRNA wurde durch RT-PCR-Analyse bestätigt (Beispiel 14, 15A).
Die Erfinder haben vorher bestimmt, dass AM die Insulinsekretion im Pankreas senkt (A. Martinez, 1996, Endocrinology 137:2626-32). Daher wurden die hierin beschriebenen Insulinsekretionsassays verwendet, um zu untersuchen, welche Rolle der Faktor H bei der Pankreasfunktion spielt (Beispiel 15). Solche Assays haben gezeigt, dass in Anwesenheit von AM der Faktor H eine weitere Verringerung der Insulinsekretion mit einem begleitenden Anstieg an cAMP induziert (16A und 16B). Antagonisten, die die AM-Aktivität hemmen, hemmen auch die Aktivität von Faktor H oder verhindern die Interaktion von AM und Faktor H und können daher einen Anstieg in der Insulinproduktion bewirken. Solche Antagonisten sind möglicherweise als Therapeutika für mit reduzierter Insulinsekretion assoziierten Krankheitszuständen anwendbar (z.B. bestimmte Formen des Diabetes Typ 2 und Phäochromozytom).
Wie oben angegeben, kann Faktor H die Komplement-vermittelte Zelllyse supprimieren. Insbesondere zeigt sich, dass Faktor H die Resistenzbildung von Bakterienzellen (C. Neeleman et al., 1999, Infect. Immun. 67:4517-4524) und Tumorzellen (N.S. Fedarko et al., 2000, J. Biol. Chem. (in press)) gegenüber der Komplement-vermittelten Lyse erleichtert. Es ist daher möglich, dass Faktor H normalerweise die β-Zellen vor der Komplement-vermittelten Lyse schützt und die Hemmung oder geringere Expression von Faktor H in β-Zellen zu einer autoimmunen Zerstörung der Zellen führt. Weiterhin ist es möglich, dass AM den Faktor H beim Schutz der β-Zellen vor der Komplement-vermittelten Lyse unterstützt (siehe 10A und 10B). In diesem Sinn können Faktor H, der AM/fH-Komplex oder funktionelle Fragmente davon zur Behandlung von mit Autoimmunreaktion gegenüber β-Zellen assoziierten Krankheitszuständen verwendet werden (z.B. Diabetes Typ 1).
Die Erfinder haben des Weiteren gezeigt, dass Plasmaproteine aus verschiedenen Spezies spezifisch an AM binden (T.H. Elsasser et al., 1999, Endocrinology 140:4908-4911; Beispiel 16; 17). Diese AM-bindenden Proteine wurden mittels der entsprechend angepassten Radioligand-Blotting-Technik von P. Hossenlopp et al. (1986, Anal. Biochem. 154:138-143) identifiziert. Ein AM-bindendes Protein mit einem Molekulargewicht (M_r) von 120 kD (unter nicht-reduzierten Bedingungen) wurde im Plasma der meisten analysierten Spezies, einschließlich dem Menschen, beobachtet. Es ist zu beachten, dass das humane 120 kD AM-bindende Protein dem AMBP-1 (Faktor H), wie hierin detailliert beschrieben, entspricht. Interessanterweise wurde eine zusätzliche Bande von M_r 140 kD im Plasma von Wiederkäuern entdeckt (d.h. Rind, Ziege und Schaf). Diese Bande repräsentiert vermutlich ein anderes Protein oder ein anderes Glykosylierungsmuster des 120 kD-Proteins. Aus diesen Experimenten wird geschlussfolgert, dass AM-bindende Proteine in Tier- darunter auch Vogelspezies mit AM zur Bildung von AM/AMBP-Komplexen, die ähnlich dem hierin beschriebenen AM/fH-Komplex sind, interagieren können.
Antikörper gegen AM-bindende Proteine
Die vorliegende Erfindung liefert Antikörper, die spezifisch AM/AMBP-Komplexe oder Fragmente dieser Komplexe, vorzugsweise AM/fH-Komplexe oder Fragmente davon erkennen. Die vorliegende Erfindung liefert ebenso Assay-Methoden, die diese Antikörper zur Identifizierung und/oder Unterscheidung von AM/AMBP-Komplexen, vorzugsweise dem AM/fH-Komplex in vivo oder in vitro beinhalten. Beispielsweise beziehen sich die Methoden auf die Verwendung von Antikörpern oder markierten Antikörpern, die in Assays an einen festen Träger oder eine Matrix gebunden sind, z.B. in Immunoassays, um an den AM/AMBP-Komplex oder ein Komplex-spezifisches Fragment davon zu binden.
Spezifische Antikörper können erfindungsgemäß hergestellt werden, die einen spezifischen Komplex von AM und ein AM-bindendes Protein erkennen und binden und so bei der Identifizierung und dem Nachweis oder der Isolation des Komplexes helfen. Bevorzugt werden Antikörper, die den AM/fH-Komplex erkennen und binden, aber weder AM noch Faktor H allein erkennen oder daran binden. Eine Methode für die Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper für die Isolation von AM/AM-bindenden Protein-Komplexen in einer biologischen Probe umfasst die Bereitstellung eines festen Trägers, an den Antikörper gebunden sind, die einen spezifischen AM/AM-bindenden Protein-Komplex oder ein Komplex-spezifisches Fragment davon erkennen, das in Kontakt bringen des Trägers mit der Probe oder einem Aliquot der Probe und die Elution des Komplexes, der sich an die am Träger adsorbierten Antikörper bindet. Eine andere Methode für den Nachweis von AM/AM-bindenden Protein-Komplexen in einer Probe umfasst die Inkubation der Probe mit Antikörpern, die einen Komplex von AM und einem AM-bindenden Protein oder ein Komplex-spezifisches Fragment spezifisch erkennen und binden und zwar unter Bedingungen, die es den Antikörpern ermöglichen, sich an den AM/AM-bindenden Protein-Komplex zu binden sowie die Bestimmung der Bindung der Antikörper an den Komplex.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Antikörper" auf intakte Moleküle sowie Fragmente davon, wie beispielsweise Fab, F(ab)₂ und Fv, welche zur Bindung einer Epitop-Determinanten fähig sind. Antikörper, die an den AM/AMBP-Komplex binden, vorzugsweise AM/fH, können unter Verwendung des isolierten AM/AMBP-Komplexes, vorzugsweise AM/fH oder Fragmenten, die kleine komplexspezifische Peptide als Immunogen oder immunisierendes Antigen enthalten, hergestellt werden. Es können Antikörper für AM-bindende Proteine oder Fragmenten davon hergestellt werden, indem das isolierte AM-bindende Protein oder ein davon erhaltenes Fragment als Immunogen verwendet wird. Das Immunogen kann, falls gewünscht, zu einem Trägerprotein konjugiert werden, um die Immunogenität zu erhöhen, besonders wenn kleine Peptide benutzt werden, was die Fachleute auf diesem Gebiet zu schätzen wissen. Zu den üblicherweise verwendeten Trägern, welche routinemäßig über eine chemische Bindung an Peptide gebunden sind, gehören Serumalbumine, d.h. Serumalbumin aus Rind, Schaf, Ziege oder Fisch, Thyroglobulin und Hämocyanin aus Megathura crenulata (Schlüssellochschnecke). Der gebundene Immunogen-Träger wird dann für die Immunisierung eines Empfänger-Tieres (z.B. Maus, Ratte, Schaf, Ziege oder Kaninchen) eingesetzt.
Der Begriff „antigene Determinante" bezieht sich auf das Fragment eines Moleküls (d.h. ein Epitop), das in Kontakt mit einem bestimmten Antikörper tritt. Wenn der AM/AMBP-Komplex verwendet wird, um ein Wirtstier zu immunisieren, induzieren möglicherweise zahlreiche Regionen des Komplexes die Produktion von Antikörpern, die sich spezifisch an eine bestimmte Region oder die dreidimensionale Struktur des Komplexes binden; diese Regionen oder Strukturen werden als antigene Determinanten oder Epitope bezeichnet. Eine antigene Determinante kann mit dem intakten Antigen (d.h. das zur Verstärkung der Immunantwort verwendete Immunogen) um die Bindung am Antikörper konkurrieren. Bevorzugt werden diejenigen Antigene, die spezifisch für den AM/AMBP-Komplex sind.
Erfindungsgemäße AM/AMBP-Komplex-spezifische Antikörper umfassen polyklonale und monoklonale Antikörper. Die Antikörper können in einem Wirtstier durch Immunisierung mit aus dem AM/AMBP-Komplex erhaltenen immunogenen Bestandteilen gebildet werden oder durch In-vitro-Immunisierung (Sensibilisierung) von Immunzellen. Die als Immunogene zur Stimulation der Antikörperproduktion eingesetzten immunogenen Bestandteile können aus Plasma isoliert, rekombinant produziert oder chemisch synthetisiert werden. Ebenso können die Antikörper in rekombinanten Systemen hergestellt werden, die mit geeigneter für die Antikörper kodierender DNA programmiert sind. Alternativ dazu besteht die Möglichkeit, die Antikörper durch biochemische Rekonstitution von gereinigten schweren (H-Ketten) und leichten Ketten (L-Ketten) zusammenzusetzen. Zu den Antikörpern gehören Hybrid-Antikörper, chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper (siehe, zum Beispiel U.S. Patent Nr. 5,585,089) und univalente Antikörper. Auch Fab-Fragmente, Fab- und F(ab)₂-Fragmente von Antikörpern zählen dazu.
Der AM/AMBP-Komplex als Immunogen kann mithilfe der wie oben beschriebenen Techniken gewonnen werden. Beispielsweise ist es möglich, AM/AMBP-Komplexe durch Herausschneiden der Komplexe aus den Gelen, insbesondere SDS-PAGE-Gelen, zu isolieren und zu reinigen. Alternativ dazu können rekombinante AM und AM-bindende Proteine oder verwandte Fragmente in einer Wirtszelle oder zellfreien Expressionssystemen co-exprimiert und mitgereinigt werden.
Die immunogenen Komponenten des erfindungsgemäßen AM/AM-bindenden Proteinkomplexes sind als Antigene für die Herstellung mithilfe von Standardmethoden nützlich. Diese Antikörper, ob polyklonal oder monoklonal, sind beispielsweise in immobilisierter Form, mit wohl bekannten Methoden gebunden an einen festen Träger, einsetzbar, um die immunogenen Bestandteile, speziell AM/AMBP-Komplexe, wie AM/fH, über Immunaffinitätschromatographie zu reinigen. Zudem kann der AM/AM- bindende Protein-Komplex dazu verwendet werden, Antikörper zu screenen, insbesondere monoklonale Antikörper, die wie oben beschrieben, hergestellt werden. Hybridome, die monoklonale Antikörper gegen erfindungsgemäße immunogene Bestandteile produzieren, können mithilfe von wohl bekannten Techniken hergestellt werden. Hybridome können auch durch die Verschmelzung einer unsterblichen Zelllinie mit einem B-Lymphozyten, der den gewünschten Antikörper produziert, hergestellt werden. Nicht-Verschmelzungstechniken für die Herstellung von unsterblichen Antikörper-produzierenden Zelllinien sind alternativ möglich und fallen in den erfindungsgemäßen Anwendungsbereich (siehe Casali et al., 1986, Science, 234:476). Unsterbliche Zelllinien sind typischerweise transformierte Säugetierzellen, insbesondere Myelomzellen von Nagetieren, Rind oder humanen Ursprungs. Häufig werden aus Gründen der Bequemlichkeit und Verfügbarkeit Myelomzelllinien von Ratte oder Maus eingesetzt.
Verwendet werden können Standardverfahren zur Selektion von Hybridomen, wie beispielsweise HAT (Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin). Hybridome, die die gewünschten monoklonalen Antikörper sezernieren, werden durch Untersuchen des Zellkulturmediums mithilfe von Standard-Immunoassays, wie beispielsweise Immunoblotting, ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay; E. Engvall et al., 1971, Immunochemistry, 8:871-4; and D.J. Reen, 1994, Methods Mol. Biol. 32:461-6), RIA, oder vergleichbaren Assays, selektiert. Die Antikörper können aus dem Medium über standardmäßige Proteinreinigungstechniken gewonnen werden (siehe Tijssen, 1985, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Elsevier, Amsterdam). Agonisten/Antagonisten von AM, AM-bindenden Proteinen oder Faktor H Agonisten/Antagonisten, die die AM-Aktivität, die Aktivität von AM-bindendem Protein (z.B. Faktor H) oder die Interaktion von AM/AMBP (z.B. AM/fH) beeinflussen, sind als Therapeutika einsetzbar. Beispielsweise wäre es möglich, dass Antagonisten, die die Aktivität von AM oder Faktor H hemmen oder die AM/fH-Interaktion blockieren, in pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert werden, welche Wachstum oder Proliferation von Krebszellen, insbesondere Blasenkrebs, Brustkrebs und Glioblastomazellen hemmen. Als Alternative bietet sich die Möglichkeit, Agonisten, die die AM-Aktivität erhöhen und Antagonisten, die die Faktor H-Aktivität verringern oder die AM/fH-Interaktion verhindern, in pharmazeutischen Zusammensetzungen zu formulieren und für die Behandlung von mikrobiellen Infektionen, insbesondere bakteriellen Infektionen, einzusetzen.
Die Modulatoren können Nukleinsäuren, Oligonukleotide, Polypeptide, Peptide, Oligosaccharide, Lipide, Antikörper oder Derivate sowie Fragmente von einer der zuvor genannten Verbindungen oder anderen organischen oder anorganischen Molekülen umfassen. Mit dem Stand der Technik bereits bekannten Methoden, wie beispielsweise durch Screenen von Bibliotheken mit natürlichen Produkten, Fermentations-Bibliotheken (beinhaltend Pflanzen und Mikroorganismen), kombinatorischen Bibliotheken, Dateien mit Verbindungen und Bibliotheken mit synthetischen Verbindungen, die sich an AM oder AM-bindendes Protein (z.B. Faktor H) binden und/oder deren Funktion beeinflussen können, sind Modulatoren identifizierbar. Insbesondere Bibliotheken mit synthetischen Verbindungen können über kommerzielle Anbieter durchsucht werden (z.B., Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK); Comgenex (Princeton, NJ); Brandon Associates (Merrimack, NH) und Microsource (New Milford, CT). Darüber hinaus bietet die Aldrich Chemical Company, Inc. (Milwaukee, WI) Zugang zu einer Bibliothek mit seltenen Chemikalien an. Alternativ dazu stehen Bibliotheken mit natürlichen Verbindungen in Form von Bakterien, Pilzen, Pflanzen- und Tierextrakten, beispielsweise von Pan Laboratories (Bothell, WA), zur Verfügung oder sind leicht erstellbar. Außerdem sind natürlich und synthetisch hergestellte Verbindungen in Bibliotheken leicht mit konventionellen chemischen, physikalischen und biochemischen Mitteln veränderbar (Blondelle et al., 1996, Trends in Biotech. 14:60).
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform können die Modulatoren durch Screenen von Testmolekülen im Vergleich zu AM oder AM-bindendem Protein (z.B. Nukleinsäure- oder Aminosäure-Sequenzen in Assays mit hohem Probendurchsatz) identifiziert werden. Solche Assays beinhalten, ohne dabei einzuschränken, genetische, biochemische und Ligand-Bindungs-Assays. Es wurden bereits verschiedene Methoden für automatisierte Assays entwickelt, die das Screening von zehntausenden von Verbindungen in kurzer Zeit ermöglichen. Diese Methoden werden besonders bevorzugt. Der Einsatz von Screening-Assays mit hohem Durchsatz zum Testen auf Modulatoren wird zu einem großen Teil durch die Verfügbarkeit von großen Mengen an gereinigten Nukleinsäure- oder Aminosäure-Sequenzen, wie erfindungsgemäß bereitgestellt, erleichtert.
Ligand-Bindungsassays können eingesetzt werden, um die Bindung der Testverbindung an bestimmte Sequenzen nachzuweisen. Der Nachweis bezieht sich auf die direkte Messung der Bindung. Alternativ dazu kann ein indirekter Hinweis einer Bindung die Stabilisierung einer Proteinstruktur oder die Zerstörung einer biologischen Funktion mit sich bringen. Den Erfindungsgedanken nicht einschränkende Beispiele für hilfreiche Ligand-Bindungsassays sind unten detailliert ausgeführt.
Eine nützliche Methode für den Nachweis und die Isolation von Bindungsproteinen oder -peptiden ist das System „Biomolecular Interaction Assay (BIAcore)" (Pharmacia Biosensor, LKB Pharmacia, Schweden). Das System BIAcore macht sich die affinitätsgereinigten Anti-GST-Antikörper zu Nutze, um so GST-Fusionsproteine auf einem Sensorchip zu immobilisieren. Ein Protein oder Peptid von Interesse wird auf den Chip aufgebracht und die Testkomponenten über den Chip gegeben. Die Bindung wird dann nachgewiesen durch eine Veränderung in der Oberflächen-Plasmonresonanz. Es handelt sich dabei um ein optisches Phänomen, das auf Veränderungen in den Refraktionsidizes reagiert.
Bindungsproteine können alternativ dazu durch Scintillation Proximity-Assays (SPAs, beschrieben im U.S. Patent Nr. 4,568,649) identifiziert werden. In einer geänderten Version dieses Assays wird ein getaggtes Protein an SPA-Beads angebracht und dann die Testverbindungen hinzugegeben. Das getaggte Protein wird dann milden Denaturierungsbedingungen (wie z.B. Hitze, Kontakt zu SDS, usw.) ausgesetzt und ein gereinigtes markiertes Chaperonin zugegeben. Wenn sich bereits eine Testverbindung an ein markiertes Protein gebunden hat, wird das markierte Chaperonin nicht mehr binden; hat sich keine Testkomponente gebunden, wird dafür das Chaperonin gebunden.
In einer anderen Methode können Bindungsproteine oder -peptide mithilfe des Bindungsassays (wie von Fodor et al., 1991, Science 251:767-773, beschrieben) identifiziert werden. Die Identifikation von Bindungsproteinen ist auch möglich mithilfe von In-vitro-Mitochondrial-Targeting Assays (MTAs, basierend auf Hurt et al., 1985, EMBO J. 4:2061-2068; Eilers and Schatz, Nature, 1986, 322:228-231). Übereinstimmend mit MTAs werden Expressionsvektoren gebildet, die eine Kodierungssequenz für ein Polypeptid oder Peptid, verschmolzen mit einer Kodierungssequenz für ein Mitochondrienlokalisierungssignal beinhalten. Die entstehenden Fusionsproteine werden hergestellt für den Import in die isolierten Mitochondrien mit oder ohne eine Testverbindung und auf diese Importfähigkeit getestet. Es ist vorhersehbar, dass eine Testverbindung, die an ein Fusionsprotein bindet, den Import in die Mitochondrien hemmen wird.
Bindungsproteine können darüber hinaus mit dem Yeast Two-Hybrid System (Fields and Song, 1989, Nature 340:245-246; U.S. Patent No. 5,283,173) identifiziert werden. Das Two-Hybrid-System untersucht die Rekonstitution der Transkriptionsaktivität durch die Assoziation einer DNA-bindenden Domäne und einer Transkriptionsaktivierungsdomäne eines transkriptionellen Aktivators über Protein-Protein-Interaktionen. Der transkriptionelle Aktivator Yeast GAL4 kann in diesem System verwendet werden, obwohl auch andere Transkriptionsfaktoren bereits eingesetzt wurden. Kurz zusammengefasst werden sowohl die GAL4 DNA-bindende Domäne als auch die Transkriptionsdomäne einzeln exprimiert und zwar fusioniert mit potenziell interagierenden Polypeptiden oder Peptiden. Wenn die beiden coexprimierten Fusionsproteine auf den Nukleus gerichtet sind und interagieren, führt die Aktivierung eines Reportergens (z.B. LacZ) zu einem nachweisbaren Phänotyp. Verwandte In-vivo-Methoden, wie das Three-Hybrid- (Licitra and Liu, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:12817-12821), und umgekehrte Two-Hybrid-System (Vidal et al., 1996, Proc. Natl. Acad Sci. USA 93:10315-10320) stehen als Alternativen zur Verfügung.
Da nicht alle Sequenzen für die Ligand-Bindungsassays geeignet sind, werden auch andere Assaytypen, z.B. zellfreie biochemische Assays in Betracht gezogen. Die Fachleute werden es zu schätzen wissen, dass verschiedene Assaytypen für den Nachweis verschiedener Modulatortypen eingesetzt werden können.
Diagnostik mithilfe von AM-bindenden Proteinen
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft das In-vitro-Screening und diagnostische Methoden zum Nachweis oder Monitoring von AM oder AM-bindenden Proteinen, vorzugsweise Faktor H oder verwandte Proteine oder Peptide in biologischen Proben, z.B. Serum, Plasma oder Zell- und Gewebeextrakten oder -lysaten. Zur Verwendung in den Methoden als Screening- und Diagnostikreagenzien können AM, AM-bindende Proteine oder Peptide, vorzugsweise Faktor H oder verwandte Proteine oder Peptide durch verschiedene etablierte Methoden gemäß dem Stand der Technik markiert werden. Polypeptide oder Peptide können zu Markern konjugiert werden unter Verwendung einer Reihe von unterschiedlichen Kopplungsagenzien, wie oben beschrieben. Zu den geeigneten Markern zählen, ohne dabei einzuschränken, Enzym-basierte, fluoreszierende, chemilumineszierende, radioaktive oder Farbmoleküle für den Einsatz in Assays, in denen solche markierten AM-bindenden Proteine benötigt werden. Geeignete Assays, die die Signale vom Ziel oder der Sonde amplifizieren sind wohl bekannt, z.B. Biotin- und Avidin-Assays und ELISA sind mit den markierten AM-bindenden Proteinen einsetzbar, um AM-Konzentrationen nachzuweisen oder zu überwachen.
Zur Bereitstellung einer Basis für die Diagnose von mit AM in Verbindung stehenden Erkrankungen, die mit abnormen AM-Konzentrationen assoziiert sind, kann ein Normal- oder Standardprofil für die AM-Expression etabliert werden. Erstellt wird dieses durch Inkubation von Körperflüssigkeiten, Gewebepräparationen oder Zelllysaten oder -extrakten, erhalten beispielsweise aus normalen Subjekten, entweder Tier oder Mensch, unter Bedingungen, die für die Bindung mit markierten AM-bindenden Proteinen oder Peptiden geeignet sind. Standardmäßige Bindungskonzentrationen von AM zu AM-bindenden Proteinen oder Peptiden können durch Vergleichen von Werten, erhalten von normalen Subjekten, mit Werten, erhalten von einer Standard- oder einer Kontrollprobe, die eine bekannte Menge an wesentlich gereinigtem AM beinhaltet, quantifiziert werden. Standardwerte von normalen Proben können mit Werten von Proben aus Subjekten mit Symptomen der Erkrankung verglichen werden. Eine bedeutende Abweichung zwischen Standard- und Test- oder experimentellen Werten wird dann verwendet, um das Bestehen und den Schweregrad einer Störung oder Krankheit, welche mit abnormen oder erhöhten AM-Konzentrationen einhergeht, insbesondere, zirkulierendem AM im Plasma, zu bestimmen.
Im Anschluss an eine Diagnose auf eine Störung oder Krankheit und Einleiten einer Behandlung können die Bindungsassays regelmäßig wiederholt werden, um zu bewerten, wie sich die AM-Konzentration, z.B. Plasma-AM, des Patienten verändert und ob sie sich der in gesunden Individuen beobachteten annähert. Die aus sukzessiven Assays gewonnenen Ergebnisse dienen dazu, die Wirksamkeit der Behandlung über einen bestimmten Zeitraum, im Bereich von einigen Tagen bis zu Monaten, zu verfolgen. Zusätzlich ist es möglich, AM-bindende Proteine oder Peptide als Reagenzien in Kits für den AM-Nachweis oder in diagnostischen Kits mit einzuschließen. Entsprechende Kits können eine oder mehrere der folgenden Komponenten enthalten:

i) ein AM-bindendes Protein oder Peptid oder mehrere AM-bindende Proteine oder Peptide, vorzugsweise Faktor H oder verwandte funktionelle Peptide davon; die mit dazu gegebenen AM-bindenden Proteine oder Peptide können vormarkiert sein; alternativ dazu ist es möglich, die AM-bindenden Proteine oder Peptide unmarkiert zu belassen und die für das Markieren benötigten Zusatzagenzien in einem separaten Behälter dem Kit hinzuzufügen; und
ii) Reaktionsverbindungen wie beispielsweise Puffer oder Reagenzien, um die AM-Bindung herbeizuführen oder zu messen. Das Kit kann auch weitere geeignet verpackte Reagenzien und Materialien beinhalten, die für das Bindungsprotokoll benötigt werden, einschließlich zum Beispiel, Festphasenmatrices, Standards und Anweisungen für die Testausführung.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform bezieht sich auf das In-vitro-Screening und diagnostische Methoden, um das Auftreten des AM/fH-Komplexes in biologischen Proben, z.B. Serum, Plasma oder Zell- und Gewebeextrakten oder -lysaten, nachzuweisen oder zu überwachen. Zum Einsatz in den Methoden als Screening- und Diagnostikreagenzien besteht die Möglichkeit Antikörper zu verwenden, die spezifisch den AM/fH-Komplex gemäß wohl bekannter Methoden des Stands der Technik erkennen. Solche Methoden umfassen die Schritte:

i) Kontakt einer Probe, von der angenommen wird, dass die veränderte Konzentrationen des AM/fH-Komplexes enthält, mit einem für den Komplex spezifischen Antikörper unter Bedingungen, in denen sich eine stabile AM/fH-Antikörper-Assoziation zwischen dem Antikörper und dem AM/fH-Komplex in der Probe bilden kann; und
ii) Nachweis einer AM/fH-Antikörper-Assoziation, gebildet in Schritt (i) unter Verwendung geeigneter dem Stand der Technik bereits bekannter Mittel, wobei die Menge an nachgewiesener AM/fH-Antibkörper-Assoziation auf die Konzentration des AM/fH-Komplexes in der Probe schließen lässt.

Dem Stand der Technik sind bereits viele Immunoassay-Formate bekannt; das zu verwendende Format wird durch die gewünschte Applikation bestimmt. In einem Immunoassay kann beispielsweise ein gegen ein einziges Am/fH-Komplex-Epitop gerichteter monoklonaler Antikörper oder eine Kombination von monoklonalen Antikörpern gegen unterschiedliche Epitope des AM/fH-Komplexes verwendet werden. In den Protokollen werden zum Beispiel auch feste Träger oder Immunopräzipitation eingesetzt. Zu den Beispielen für feste Träger zählen, ohne dabei einzuschränken, Nitrocellulose (z.B. in Membran- oder Mikrotiterwell-Form), Polyvinylchlorid (z.B. in Form von Bögen oder Mikrotiterwells), Polystyrenlatex (z.B. in Form von Beads oder Mikrotiterplatten), Polyvinylidenfluorid (bekannt als IMMUNOLON TM), diazotiertem Papier, Nylonmembranen, aktivierten Beads und Protein-A-Beads. Beispielsweise können Dynatech IMMUNOLON TM 1 oder IMMUNOLON TM 2 Mikrotiterplatten oder 0,23 Inch Polystyrenbeads (Precision Plastic Ball) eingesetzt werden.
In Immunoassays werden typischerweise entweder markierte Antikörper oder eine markierte antigene Komponente (z.B. die mit dem Antigen in der Probe um die Bindung am Antikörper konkurriert) verwendet. Zu den geeigneten Markern zählen, ohne einzuschränken, Enzym-basierte, fluoreszierende, chemilumineszierende, radioaktive oder Farbmoleküle. Auch bekannt sind Assays, die die Signale von Sonden amplifizieren, wie beispielsweise diejenigen, bei denen Biotin und Avidin eingesetzt wird, und Enzym-markierte Immunoassays wie ELISA.
Entsprechende Kits für Antikörper-basierte diagnostische Anwendungen beinhalten typischerweise eine oder mehrere der folgenden Komponenten:

(i) Anti-AM/fH-Komplex-Antikörper: Die Antikörper können vormarkiert sein; alternativ dazu kann der Antikörper unmarkiert und die für das Markieren erforderlichen Zusatzstoffe in einem gesonderten Behälter in dem Kit enthalten sein oder es wird ein sekundärer markierter Antikörper zur Verfügung gestellt; und
(ii) Reaktionskomponenten: Das Kit kann auch weitere geeignet verpackte Reagenzien und Materialien beinhalten, die für das betreffende Immunoassayprotokoll benötigt werden, einschließlich Festphasenmatrices, falls anwendbar, und Standards.

Den Kits können auch Anweisungen für die Testdurchführung beiliegen. In bevorzugten Ausführungsformen sind die diagnostischen Kits im Weiteren an hohen Probendurchsatz und/oder automatischen Betrieb anpassbar.
Therapien mit AM-bindenden Proteinen
Eine andere erfindungsgemäße Ausführungsform umfasst Behandlungen und therapeutische Methoden, die AM-bindende Proteine oder Peptide mit einschließen. Da AM-bindende Proteine oder Peptide natürlich vorkommende Plasmabestandteile sind, können sie dem Blutkreislauf eines Individuums mit minimalem Risiko für immunologische Komplikationen verabreicht werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen sind herstellbar und in Behandlungsprotokollen gemäß etablierter Methoden in Abhängigkeit der behandelnden Störung oder Krankheit einsetzbar (siehe zum Beispiel, P.D. Mayne, 1996, Clinical Chemistry in Diagnosis and Treatment, 6^th ed., Oxford University Press, Oxford, England; Gilman et al., eds., 1990, Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press; Avis et al., eds., 1993, Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Dekker, New York; and Lieberman et al., eds., 1990, Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Dekker, New York).
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform werden Peptide, abgeleitet von Faktor H, als Therapeutika verwendet. Solche Peptide sind durch Rekombinations- oder Synthesetechniken herstellbar und werden dann bei Tumor- oder Krebsleiden verabreicht, um das Wachstum und/oder die Proliferation dieser Zellen zu hemmen. Den Erfindungsgedanken nicht einschränkende Beispiele für Krebs- oder Tumorzellen für die erfindungsgemäße Verwendung umfassen Krebserkrankungen oder Tumoren an Harnblase, Nieren, Rektum, Dickdarm, Dünndarm, Magen, Ösophagus, Speicheldrüse, Gallenblase, Leber, Brust, Vagina, Endometrium, Eierstock, Gebärmutter, Prostata, Haut, Lunge oder Gehirn. Es ist zu beachten, dass Peptid-basierte Behandlungen besonders vorteilhaft wären, da Peptide vermutlich keine unerwünschte Immunreaktion im Wirtsorganismus hervorrufen, was während den Behandlungen von Mäusen mit monoklonalen Antikörpern, wie MoAb-G6 (Miller et al., 1996, supra), zu beobachten ist. In einer alternativen erfindungsgemäßen Ausführungsform werden spezifisch an den AM/fH-Komplex bindende Antikörper als Therapeutika verwendet. Beispielsweise besteht die Möglichkeit anti-AM/fH-Antikörper in eine pharmazeutische Verbindung zu formulieren und sie zur Hemmung von Wachstum oder Proliferation von Krebszellen, insbesondere Blasen-, Brust- und Gehirnkrebszellen, einzusetzen.
Festzuhalten ist, dass Antikörper-basierte Therapeutika, hergestellt aus nicht-humanen Reservoiren, zu einer unerwünschten Immunreaktion beim Menschen führen können. Um dieses Problem zu minimieren, können Derivate von chimären Antikörpern produziert werden. Chimäre Antikörper verbinden eine nicht-humane vom Tier stammende variable Region mit einer konstanten Region vom Menschen. Chimäre Antikörper können mit gemäß dem Stand der Technik bereits bekannten Methoden hergestellt werden (siehe Morrison et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851; Takeda et al., 1985, Nature 314:452; U.S. Patent No. 4,816,567; U.S. Patent Nr. 4,816,397; European Patent Publication EP 171496 ; EP 0173494 ; United Kingdom Patent GB 2177096B ). Darüber hinaus können Antikörper des Weiteren mit dem Stand der Technik bereits bekannten Techniken „humanisiert" werden (z.B. Teng et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:7308-7312; Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4: 7279; Olsson et al., 1982, Meth. Enzymol. 92:3-16; internationale Patentanmeldung WO92/06193; EP 0239400 ). Humanisierte Antikörper können auch über kommerzielle Quellen bezogen werden (z.B., Scotgen Limited, Middlesex, Großbritannien). Die Immunotherapie mit einem humanisierten Antikörper kann eine erhöhte Langzeitwirkung bei der Behandlung von chronischen Zuständen oder Zuständen, die eine wiederholte Antikörpertherapie erfordern, mit sich bringen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen sind in neutraler Form oder in Form von Salzen herstellbar. Salze können mit vielen Säuren gebildet werden, einschließlich, aber ohne Einschränkung, mit Salz-, Schwefel-, Essig-, Milch-, Wein-, Malein- und Bernsteinsäure. Die Zusammensetzungen können in Form von Lösungen, Suspensionen, Suppositorien, Tabletten, Pillen, Kapseln, Verbindungen mit kontrollierter Freisetzung oder Pulvern produziert werden. Solche Formulierungen können 10 %–95 % (w/w) des aktiven Inhaltsstoffes, vorzugsweise 25 %–70 % (w/w) enthalten. Pharmazeutische Zubereitungen und Zusammensetzungen können auch einen/ein oder mehrere physiologisch akzeptable Trägerstoff(e), Vehikel, Verdünner, Zerfallhilfsmittel, Gleitmittel, Weichmacher, Füllstoff(e), Farbstoff(e), Dosierungsvehikel, Resorptionsverstärker, Stabilisator(en), oder Bakterizid(e) beinhalten. Die Produktion und Formulierung solcher Zusammensetzungen und Zubereitungen werden mit dem Stand der Technik bereits bekannten Methoden ausgeführt.
Folgend auf die Zubereitung der pharmazeutischen Zusammensetzungen werden diese in geeignete Behälter gepackt und entsprechend der Verwendung für die Behandlung der angegebenen Krankheitszustände beschriftet. Eine solche Beschriftung kann Auskunft geben über die Menge, Häufigkeit der Verabreichung sowie den Verabreichungsweg. Die Zubereitungen sind systemisch über die orale oder parenterale Route verabreichbar. Zur parenteralen Route zählen ohne Einschränkung die subkutane, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, transdermale Verabreichung sowie Inhalation, intranasale, intra-arterielle, intrathekale, enterale, sublinguale oder rektale Route.
Eine therapeutisch wirksame Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung, enthaltend ein oder mehrere AM-Bindungsprotein(e) oder -peptid(e), ist eine Menge, die ausreicht, um eine mit abnormen AM-Konzentrationen assoziierte Erkrankung oder Störung zu mindern, zu verbessern oder zu heilen. Eine wirksame Menge kann der zu behandelnden Person mit einer einzigen Gabe oder über wiederholte Gaben verabreicht werden. Der therapeutischen Verabreichung kann im Anschluss an die Krankheitstherapie eine prophylaktische Verabreichung folgen. Eine prophylaktisch wirksame Dosis besteht in einer Menge, die effektiv ist, die Krankheit zu verhindern, und sie ist abhängig von der spezifischen Erkrankung des Patienten. Die therapeutisch effektive Dosis kann initial geschätzt werden, zum Beispiel entweder in Zellkulturassays oder in Tiermodellen, gewöhnlich Mäuse, Ratten, Kaninchen, Hunde, Schafe, Ziegen, Schweine oder nicht-humane Primaten. Das Tiermodell wird auch zur Bestimmung der maximal tolerablen Dosierung und des geeigneten Verabreichungsweges herangezogen. Solche Informationen können dann dazu benutzt werden, für den Menschen nützliche Dosierungen und Verabreichungswege festzulegen.
Mit einer alternativen Methode ist es möglich, Wirtszellen so genetisch zu manipulieren, dass sie eine Nukleinsäure tragen, die für ein AM-bindendes Protein oder ein davon erhaltenes Peptidfragment kodiert, und dann in ein Subjekt einzubringen, bei dem die Notwendigkeit zur Beeinflussung oder Senkung der AM-Konzentration besteht. Folgend auf die Expression und Produktion von AM-bindendem Protein durch die Zelle kann das so produzierte AM-bindende Protein oder Peptid AM binden und somit Einfluss auf einen mit abnormen AM-Konzentrationen assoziierten Krankheitszustand oder eine krankhafte Störung nehmen. Die Wirtszellen können durch eine Vielzahl von Molekulartechniken, die dem Stand der Technik bereits bekannt sind, genetisch verändert werden, zum Beispiel durch Transfizierung, Infektion oder Transduktion. Der Begriff „Transduktion", wie er hierin gebraucht wird, bezieht sich im Allgemeinen auf Zellen, die genetisch manipuliert wurden und dadurch ein fremdes oder heterologes Gen aufgrund der Einschleusung eines viralen oder nicht-viralen Vektors in die Zellen besitzen. Der Begriff „Transfizierung" bezieht sich häufig auf Zellen, die genetisch manipuliert wurden, um ein fremdes Gen auf einem Plasmid zu beherbergen oder einen nicht-viralen Vektor aufweisen. Wirtszellen können über verschiedene Vektoren transfiziert oder transduziert werden und somit als Gen-liefernde Vehikel für den Transfer der exprimierten Produkte in den Muskel dienen.
Obwohl virale Vektoren für die Gentransfer-Therapien bevorzugt werden, können Zellen mit zahlreichen dem Stand der Technik bereits bekannten Methoden so genetisch manipuliert werden, dass sie Nukleinsäuresequenzen enthalten, welche für das/die gewünschte(n) Genprodukt(e) kodieren. Beispielsweise werden Zellen durch Fusion, Transfizierung, Lipofektion vermittelt durch den Einsatz von Liposomen, Elektroporation, Präzipitation mit DEAE-Dextran oder Kalziumphosphat, Partikel-Bombardment (Biolistik) mit Nukleinsäure überzogenen Partikeln (z.B. Goldpartikeln), Mikroinjektion oder genetisch veränderte Mikroorganismen (K. Yazawa et al, 2000, Cancer Gene Ther. 7:269-274) genetisch manipuliert. Vektoren für die Einschleusung heterologer (d.h. fremder) Nukleinsäuren (DNA oder RNA) in die Muskelzellen zur Expression aktiver bioaktiver Produkte sind dem Stand der Technik wohl bekannt. Solche Vektoren besitzen eine Promoter-Sequenz, vorzugsweise ein Promoter, der zellspezifisch und strangaufwärts (upstream) der Sequenz platziert ist, die exprimiert werden soll. Die Vektoren können auch optional ein oder mehrere exprimierbare(s) Markergen(e) für die Expression als ein Hinweis auf eine erfolgreiche Transfizierung und Expression von im Vektor enthaltenen Nukleinsäuresequenzen beinhalten. Zusätzlich dazu können die Vektoren optimiert werden, um unerwünschte Immunogenität zu minimieren und die langfristige Expression des/der gewünschten Genprodukts/Genprodukte zu maximieren (siehe Nabel, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:324-326). Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, Vektoren basierend auf dem Zelltyp, auf den die Behandlung ausgerichtet ist, auszuwählen Beschrieben wurden beispielsweise Vektoren für die Behandlung von Tumoren oder Krebszellen (P.L. Hallenbeck et al., 1999, Hum. Gene Ther. 10:1721-1733; T. Shibata et al., 2000, Gene Ther. 7:493-498; M. Puhlmann et al., 2000, Cancer Gene Ther. 7:66-73; N. Krauzewicz et al., 2000, Adv. Exp. Med. Biol. 465:73-82).
Anschauliche Beispiele für Vehikel oder Vektorkonstrukte für die Transfizierung oder Infektion von Wirtszellen beinhalten replikationsdefekte virale Vektoren, DNA-Virus- oder RNA-Virus (Retrovirus)-Vektoren, wie beispielsweise Adenoviren, Herpes-simplex-Virus und Adenoviren-assoziierte Vektoren. Adenoviren-assoziierte Vektoren sind einzelsträngig und ermöglichen die effiziente Lieferung mehrfacher Kopien von Nukleinsäuren zum Zellkern. Bevorzugt werden Adenoviren-Vektoren. Die Vektoren sind normalerweise im Wesentlichen frei von prokariotischer DNA und beinhalten eine Reihe an unterschiedlichen funktionellen Nukleinsäuresequenzen. Ein Beispiel für solche funktionelle Sequenzen kann eine DNA-Region sein, die transkriptionelle und translationelle Initiation- und Termination-regulierende Sequenzen umfasst einschließlich Promotoren (z.B. starke Promotoren, induzierbare Promotoren und ähnliche) und Verstärker, die in den Wirtszellen aktiv sind. Auch mit eingeschlossen als Teil der funktionellen Sequenzen ist ein offener Leserahmen (Polynukleotidsequenz), der für das betreffende Protein kodiert. Flankierende Sequenzen können ebenso enthalten sein für die auf den Zielort ausgerichtete (site-directed) Integration. In manchen Situationen wird die 5'-flankierende Sequenz eine homologe Rekombination ermöglichen und somit das Wesen der transkriptionalen Initiationsregion verändern, um so die induzierbare oder nicht-induzierbare Transkription zum Erhöhen oder Senken der Transkriptionsebene, als Beispiel, zu ermöglichen.
Im Allgemeinen ist das kodierte und exprimierte AM-bindende Protein intrazellulär vorhanden, d.h. zurückgehalten im Zytoplasma, Nukleus oder einer Organelle einer Zelle oder wird von der Zelle sezerniert. Für die Sekretion kann die natürliche Signalsequenz, die in dem AM-bindenden Protein vorliegt, zurückgehalten werden. Alternativ dazu kann ein AM-bindendes Protein oder ein davon erhaltenes Fragment mit einer Signalsequenz verschmolzen werden, um die Sekretion des Fusionsproteins zu ermöglichen.
Wie zuvor erwähnt, kann ein Marker für die Selektion von Vektor enthaltenden Zellen anwesend sein. Bei dem Marker kann es sich um ein induzierbares oder nicht-induzierbares Gen handeln. Generell wird er jeweils die positive Selektion mit Induktion oder ohne Induktion ermöglichen. Zu den Beispielen für Markergene gehören Neomycin, Dihydrofolatreduktase, Glutaminsynthetase und ähnliche. Der eingesetzte Vektor wird im Allgemeinen ebenfalls ein Original des Replikationsgens oder anderer Gene enthalten, die für die Replikation in den Wirtszellen nötig sind, wie routinemäßig von den Fachmännern auf diesem Gebiet verwendet. Beispielsweise kann das Replikationssystem das Original der Replikation und alle Proteine, die mit der Replikation assoziiert sind, welche durch ein bestimmtes Virus kodiert wurde, als Teil seines Aufbaus enthalten. Das Replikationssystem muss ausgewählt werden, damit die Gene, die für die Produkte kodieren, welche für die Replikation erforderlich sind, letztendlich nicht die Zellen transformieren. Replikationsdefekte Adenoviren stellen solche Replikationssysteme dar (siehe G. Acsadi et al., 1994, Hum. Mol. Genet. 3:579-584) und das Epstein-Barr-Virus. Zu den Beispielen für Replikations-defekte Vektoren, insbesondere Retroviren-Vektoren, die replikationsdefekt sind, gehören BAG (siehe Price et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:156; Sanes et al., 1986, EMBO J., 5:3133). Es ist verständlich, dass das Endprodukt ein betreffendes Gen oder mehrere der betreffenden Gene enthalten kann, zum Beispiel ein Gen oder mehrere Gene, das/die für bioaktive AM-bindende Proteine kodiert/kodieren. Darüber hinaus wird cDNA, synthetisch produzierte DNA, PCR amplifizierte oder chromosomale DNA unter Anwendung von Methoden und Protokollen eingesetzt, die gemäß dem Stand der Technik bereits bekannt sind.
Entsprechend einer Vorgehensweise bei der Gentherapie wird ein für ein AM-bindendes Protein kodierender Vektor direkt in die Empfängerzellen injiziert (In-vivo-Gentherapie). Alternativ werden Zellen aus vorgesehenen Empfängerzellen explantiert, genetisch manipuliert, damit sie für ein AM-bindendes Protein kodieren und in die Spenderzelle reimplantiert (Ex-vivo-Gentherapie). Eine Ex-vivo-Methode bietet den Vorteil eines effizienten viralen Gentransfers, welche der In-vivo Genetransfermethode überlegen ist. Gemäß der Ex-vivo-Genetherapie werden die Wirtszellen zuerst mit manipulierten viralen Vektoren infiziert, die die Expression mindestens eines AM-bindenden Proteins lenken, in einem physiologisch akzeptablen Trägerstoff oder Vehikel suspendiert, wie beispielsweise Salzlösung oder Phosphat gepufferte Salzlösung und ähnliches, und dann an den Wirt verabreicht. Das gewünschte AM-bindende Protein wird von den injizierten Zellen exprimiert, welche auf diese Weise das AM-bindende Protein in die Wirtszelle einschleusen. Das eingeschleuste AM-bindende Protein kann somit eingesetzt werden, um eine krankhafte Störung, die mit veränderten Konzentrationen an zirkulierendem AM assoziiert ist, zu verbessern.
BEISPIELE
Die wie hierin beschriebenen Beispiele sind zur weiteren Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung gedacht und schränken den Erfindungsgedanken nicht ein.
BEISPIEL 1
Die nicht-radioaktive Markierung von AM wurde bewerkstelligt durch Konjugation von synthetischem AM umfassend die Aminosäuren 1–52 (Phoenix Pharmaceuticals, Inc., Mountainview, CA) mit Succinimidylestern verbunden mit Biotin (Pierce Chemical Co., Rockford, IL), Fluoreszein (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) oder Dinitrophenol (DNP; Molecular Probes, Inc.). Es wurden 100 μg AM (16 μM) in 1 ml 50 mM Natriumbicarbonat, pH 8,5 gelöst und Succinimidylester bis zu einer molaren Endkonzentration von 10:1 (Koppler:AM) zugegeben. Die Mischung wurde unter langsamem Rühren für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert und die Reaktion durch Zugabe von 0,1 M Ethanolamin beendet und für eine weitere Stunde inkubiert. Nicht aufgenommener Ligand wurde durch Extraktion von AM über Reversed-Phase Sep-Pak C-18 Cartridges (Waters, Milford, MA) entfernt und die Probe mit saurem Isopropanol eluiert. Der Extrakt wurde lyophilisiert und in 1 ml TBS (0,05 M Tris-HCl, 0,15 M NaCl), 0,1 % alkalisch behandeltem Casein (ATC), 0,1 % Tween 20 und 0,05 % Triton X-100, pH 7,4 rekonstituiert. Markiertes AM wurde bei 4°C für 3 Monate ohne bedeutenden Aktivitätsverlust gelagert.
BEISPIEL 2
AM-bindende Proteine wurden mithilfe einer In-vitro-Screeningmethode identifiziert. Gesamtproteine, gewonnen aus Humanplasma (2 μl) wurden elektrophoretisch auf einem 3–8% Tris-acetate-Gel (Novex, San Diego, CA) unter nicht-reduzierten Bedingungen fraktioniert. Für das Ligand-Blotting Experiment wurden die Proteine auf eine 0,2 mm Nitrocellulosemembran transferiert, die für 15 min mit 1 % Nonidet P-40 (NP-40) inkubiert wurde. Nicht-spezifische Bindungen wurden des Weiteren durch eine 2-stündige Inkubation in TBS, enthaltend 0,1 % ATC, blockiert. Inkubationen mit 70 nM AM markiert mit Biotin, Fluoreszein oder DNP wurden über Nacht bei 4°C in Blocking-Puffer, enthaltend 0,1 % Tween 20, durchgeführt. Für den Biotinnachweis wurde der Ligand-Blot mit einem Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex und dem AEC-Reagenz (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) inkubiert. Für Fluoreszein und DNP wurden die Ligand-Blots 1 h bei Raumtemperatur mit Anti-Fluoreszein vom Kaninchen beziehungsweise Anti-DNP IgG (1:1000 in Inkubationspuffer; Molecular Probes, Inc.) inkubiert. Anti-Kaninchen-Antikörper, markiert mit alkalischer Phosphatase (1:2000; Dako Corporation, Carpenteira, CA) wurden für 0,5 h zugegeben und der Blot unter Verwendung von 4-Nitro-Blue-Tetrazoliumchlorid/5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphat (NBT/BCIP) als Farbsubstratlösung (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) entwickelt. Ligand-Blotting wurde zum Nachweis von AMBP-1, einem 120 kD Protein, eingesetzt, das nachfolgend als humaner Komplementfaktor H identifiziert wurde, 1.
BEISPIEL 3
Der Wettbewerb um die Bindung von AM in voller Länge an die AM-Bindungsproteine wurde durch Vorinkubieren einer Membran mit aus Plasma gewonnenen Proteinen, die mit 7 μM an unmarkierten Peptiden, z.B. CGRP, Amylin, Insulin, IGF-1, PAMP oder AM-trunkierte Polypeptide (AM_1–12, AM_16–21, AM_22–52, AM_13–52) AM_34–52) daran gebunden wurden, für 6 h bei 4°C untersucht. Dieser Vorinkubation folgend wurde markiertes vollständiges AM hinzu gegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert. Kompetitionsstudien lassen darauf schließen, dass nur AM in voller Länge den AM/AMBP-1 (AM/fH)-Komplex auflösen kann. 2 und 3.
BEISPIEL 4
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde ein aus Plasma gewonnenes Polypeptid, welches eine spezifische Bindung an AM mit voller Länge zeigt, als Faktor H bestimmt. Vor der formalen Identifikation dieses AM-bindenden Proteins als Faktor H wurde es durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung als „AM-bindendes Protein" oder „AMBP-1" bezeichnet. Für isoliertes und gereinigtes AMBP-1 ergab sich ein Molekulargewicht von ungefähr 120 kD, wenn es unter nicht-reduzierten Bedingungen einer SDS-PAGE-Elektrophorese unterzogen wurde.
AMBP-1 wurde bis zur Homogenität mit HPLC gereinigt (4A), gefolgt von einer SDS-PAGE-Elektrophorese unter nicht-reduzierten Bedingungen (4B und 4C). Die präparative Reversed-Phase Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) wurde mit einer Delta Pak C18-300 Å Säule (30 mm × 30 cm, Waters, Tokyo, Japan) und dem modularen HPLC-System „System Gold" (Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA) durchgeführt. Es wurden 2,5 Milliliter Humanplasma mit einem äquivalenten Volumen von 10 % Acetonitril mit 0,2 % Trifluoressigsäure gemischt, über einen 0,2 μm Filter aufgearbeitet und auf die Säule geladen. Nach 5 min mit 0,1 % Trifluoressigsäure in 5 % Acetonitril wurde die Säule eluiert mit einem linearen Gradienten von Acetonitril, enthaltend 0,075 % Trifluoressigsäure, von 5 % bis 60 % bei einer Flussrate von 12 ml/min über 60 min. Jede Fraktion (12 ml) wurde gesammelt, gefriergetrocknet und in 0,3 ml TBS 0,1 % Tween 20 gelöst. Die Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE-Elektrophorese getrennt und dann mit Coomassie Blue (4B) gefärbt oder auf das Vorhandensein von AMBP-1 mithilfe der nicht-radioaktiven Ligand-Blotting-Technik getestet (4C).
AMBP-1 wurde in den Fraktionsnummern 48–51 identifiziert und in den Fraktionsnummern 48–49 konzentriert nachgewiesen (4B und 4C). Fraktionsnummer 49 wurde elektrophoretisch mit präparativem SDS-PAGE-Gel aufgetrennt und mit Elektroblot auf PVDF-Membran transferiert. Die AMBP-1-Bande wurde mit der Färbung mit Coomassie Brilliant Blue R^TM identifiziert, herausgeschnitten und für die Aminosäureanalyse und Aminosäuresequenzanalyse verwendet.
BEISPIEL 5
Die Aminosäureanalyse wurde durch The Protein/DNA Technology Center Rockefeller University, New York, durchgeführt. Benutzt wurden dazu eine HPLC (NovaPak C18 30 cm-Säule) zusammen mit der Waters PicoTag Workstation und ein Zwei-Pumpen-Gradient-System (Model 510) ausgestattet mit einem Model 490 UV Multiwavelength Detector, wie zuvor beschrieben (F. Gharahdaghi et al., 1992, in Techniques in Protein Chemistry III pp. Academic Press, Inc., San Diego, CA, pp 249–260). Die Ergebnisse der AMBP-1 Aminosäureanalyse sind unten in Tabelle 1 dargestellt mit einem Vergleich von % AMBP-1 mit % fH.
TABELLE 1 Aminosäurezusammensetzung von AMBP-1 und Faktor H

^aDa Tryptophan und Cystein durch die Proteinhydrolyse in 6 M HCl zerstört werden, entspricht die berechnete Zusammensetzung von Faktor H den gefundenen 18 Aminosäuren.
^bDie kombinierten Werte für Asparagin und Asparaginsäure sowie Glutamin und Glutaminsäure sind angegeben als Asx beziehungsweise Glx.
^cDie Aminosäurezusammensetzung von Faktor H wurde mithilfe der Proteinsequenz-Datenbank SWISS-PROT (Zugangsnummer: P08603) ermittelt.

Obwohl der Prozentsatz an für AMBP-1 ermitteltem Methionin etwa die Hälfte des Methioninanteils, wie für Faktor H vermutet, betrug, lag die Methioninausbeute aus dem Kontrollprotein (Rinderserumalbumin) ebenfalls bei etwa der Hälfte des erwarteten Wertes. Das Profil der Aminosäurezusammensetzung wurde dazu verwendet, die Sequenzdatenbank zu durchsuchen. Diese Suche ergab, dass das Profil der Aminosäurezusammensetzung den höchsten Ähnlichkeitsgrad mit dem humanen Komplementfaktor H hatte.
Die N-terminale Sequenzanalyse wurde von Biotechnology Resource Laboratory, Protein Sequencing and Peptide Synthesis Facility, Medical University of South Carolina, Charleston, SC, durchgeführt. Die Probe wurde einem automatischen Edman-Abbau mit Einsatz von PE Biosystems Procise 494 Protein Sequencer und einem PE Biosystems cLC Microblotter 173 unter Verwendung von Standardzyklen und -reagenzien (P. Edman and G. Begg, 1967, Eur J Biochem. 1:80-91; M.W. Hunkapiller et al., 1983 Methods Enzymo/. 91:399-413) unterzogen.
Die Ergebnisse für AMBP-1 aus dem Edman-Abbau wurden mithilfe der Protein-Datenbank ExPASy Molecular Biology Server analysiert. Diese Analyse deutet darauf hin, dass die AMBP-1 Aminosäuresequenz eine 80 %ige homologe Übereinstimmung mit dem humanen Komplementfaktor H zeigte. Sekundäre Aminosäuren wurden auf die autolytische Spaltung des Polypeptids zurückgeführt. Die Sequenz des 15 Aminosäure N-Terminus von AMBP-1 war identisch mit dem N-Terminus von Faktor H mit Ausnahme von Threonin in Position 12.
Für die Massenspektrometrieanalyse wurde AMBP-1 unter reduzierten Bedingungen (5 % β-Mercaptoethanol) auf SDS-PAGE-Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Gefärbt wurde das Gel anschließend mit Coomassie Blue und die AMBP-1-Bande herausgeschnitten. Die Proteinverdauung im Gel und die Peptidextraktion wurden durchgeführt wie zuvor beschrieben (J. Rosenfeld et al., 1992, Anal. Biochem. 203:173-179). Ein Zehntel des Proteinverdaus wurde vor LC/MS mit MALDI-TOF auf PerSeptive Voyager-DE STR (PE Biosystems, Foster City, CA) analysiert. Das Gerät wurde im Reflektormodus mit steigender Spannung auf 20000 V voreingestellt; die Laserenergie betrug 2350, die Spannung am Führungsdraht 0,05 % und die Spannung am Gitter 95 %. Das Spiegelverhältnis wurde auf 1:110 eingestellt.
Der Rest des extrahierten Proteinverdaus wurde auf eine 0,3 × 100 mm, 5 μm BetaBasic C18-Säule (Keystone Scientific, Bellafonte, PA) injiziert, welche zuvor mit 10 % Puffer B in Puffer A äquilibriert wurden (Puffer A: Wasser mit 0,1 % Ameisensäure; Puffer B: Acetonitril mit 10 % 1-Propanol und 0,1 % Ameisensäure). Die Peptidelution wurde über einen linearen Gradienten ausgehend von 10 % bis auf 60 % Puffer B über 60 min (Shimadzu Sci. LC10AD/VP Pumpen und LC10A Controller) durchgeführt. Die eluierten Peptide wurden mit einem Finnigan LCQ Massenpektrometer (ThermoQuest, Finnigan MAT Division, Piscataway, NJ) detektiert. Die Peptidsequenz-Daten wurden von den eluierten Peptiden durch MS/MS (Tandem-Massenspektrometrie) von denjenigen Ionen erhalten, die einen voreingestellten Schwellenwert von 5 × 10⁴ Ionen überschritten. Die Betriebsparameter waren wie folgt: Mantel-Gasfluss eingestellt auf 32, zusätzlicher Gasfluss eingestellt auf 1, Spannung der Elektro-Spray-Ionisation eingestellt auf 4,5 kV, Kapillartemperatur eingestellt auf 200°C, Kapillar-Spannung eingestellt auf 8,0 Volt und Tube Lens Offset eingestellt auf –20 Volt.
BEISPIEL 6
Das als AMBP-1 bezeichnete isolierte AM-bindende Plasmaprotein wurde mit Faktor H, basierend auf dem offensichtlichen Molekulargewicht, Glykosylierung, AM-Bindung und Erkennung durch anti-Faktor H-Antikörper verglichen.
Der humane Faktor H wurde als Glykoprotein charakterisiert mit einem berechneten Molekulargewicht von etwa 150 kD unter reduzierten Bedingungen (in Anwesenheit von 5 % 2-Mercaptoethanol) (R.B. Sim et al., 1982, Biochem. J. 205:285-93; P.F. Zipfel et al., 1999, Mol. Immunol. 36:241-8). Es wurde gezeigt, dass AMBP-1 mithilfe des GelCode^® Glycoprotein Staining Kit (Pierce Chemical Co.) glykosyliert wurde und AMBP-1 bis zu einem Molekulargewicht von etwa 150 kD unter reduzierten Bedingungen im elektrophoretischen Feld wanderte. 5A.
Darüber hinaus zeigte mit ¹²⁵I-markiertes AM (Phoenix Pharmaceuticals, Inc.) eine hohe Affinität zur Bindung an immobilisierten kommerziell produzierten Faktor H (10^–8 M bis 10^–9 M) (5C) und die Western Blot-Analyse deutet darauf hin, dass kommerziell produzierte Antikörper gegen Faktor H (Quidel Corporation, San Diego, CA) aus Plasma gereinigtes AMBP-1 erkannten (5D). Für die Western Blot-Analyse wurden Proteine elektrophoretisch aufgetrennt auf einem 3–8 % Tris-Acetat (für Faktor H) oder einem 4–12 % Bis-Tris enthaltenden Gel (für AM) unter nicht-reduzierten Bedingungen, anschließend transferiert auf eine 0,2 μm Nitrocellulosemembran und mit 5 % fettarmer Trockenmilch in PBS gestoppt. Im Anschluss an das Abstoppen wurde die Membran inkubiert mit 1:2000 Anti-Faktor-H Kaninchen-Antikörper (Quidel, San Diego, CA) oder 1:4000 Anti-AM Kaninchen-Antikörper (Martinez et al., 1996, supra) und mithilfe des ECL + Plus Western Blot Detection System (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) entwickelt.
BEISPIEL 7
Um die AM/fH-Interaktion zu analysieren, wurde die gereinigte AMBP-1 (Faktor H) Fraktion (Nr. 48) mithilfe des nicht-radioaktiven Ligand-Blotting-Assays gereinigt (Beispiel 1). Nach Inkubation mit Fluoreszein-markiertem AM wurde die Membran unter verschiedenen Bedingungen inkubiert, einschließlich PBS; PBS pH 11,5; PBS pH 2,5; 4M NaCl; 4M NaCl pH 11,5; NaCl pH 2,5; 1 % SDS; 3M Harnstoff; 3M Guanidin-HCl; 3M NaSCN; 50 % Ethylenglycol pH 11,5; 50 % Ethylenglycol; 1 % β-Mercaptoethanol. Entwickelt wurde der Assay dann wie beschrieben (Beispiel 1). 6A. Alternativ dazu wurde die AM/fH-Interaktion über einen Multiwell-Assay analysiert. Entsprechend diesem Assay wurde eine 96-Well Polyvinylchlorid (PVC)-Mikrotiterplatte mit Faktor H überzogen (5 ng/Well, Sigma, St. Louis, MO). Gestoppt wurde die Reaktion auf der Mikrotiterplatte mit einer Lösung enthaltend TBS, 0,1 % ATC und 0,1 % Tween 20 und dann mit Fluoreszein-markiertem AM (50 nM) für 2 h inkubiert. Vor der Entwicklung des Assays wurden die Wells über unterschiedliche Zeiträume mit PBS oder 3M NaSCN pH 7,4 inkubiert. Darauf folgend wurde die Platte gewaschen und mit Anti-Fluoreszein polyklonalen Antikörpern (1:1000, Molecular Probes) und ¹²⁵I-Protein A (Amersham Pharmacia Biotech) inkubiert. Die Radioaktivität wurde mit einem Gammazähler ermittelt. 6B.
BEISPIEL 8
Zur Bestimmung von Faktor H und AM-Verteilung nachfolgend auf die C18-Extraktion wurde 1 ml Humanplasma über eine Sep Pak C18 Cartridge aufgearbeitet. Die gebundenen und ungebundenen Fraktionen wurden auf das Vorhandensein von Faktor H mithilfe der Western Blot Analyse getestet (7A). Alternativ wurden gebundene und ungebundene Fraktionen mittels AM-Immunopräzipitation auf AM getestet, gefolgt von einer Western Blot Analyse (7B). Die Immunopräzipitation wurde wie folgt durchgeführt: eine 3 ml Probe wurde für 1 h bei 4°C inkubiert mit 1 ml Protein A-Agarose (Life Technologies, Rockville, MD), enthaltend eine Endkonzentration von 1 μM eines jeden der folgenden Proteaseinhibitoren: Pefabloc (Centerchem Inc., Stamford, CT), Bestatin und Phosphoramidon (Sigma). Die Probe wurde dann zentrifugiert und der Überstand in ein anderes Röhrchen überführt. Der Überstand wurde mit 80 μl anti-AM Antikörpern vom Kaninchen (Martinez et al., 1996, supra) oder Kaninchen-Präimmunserum für 1 h bei 4°C inkubiert. Die Antikörpermischung wurde mit 80 μl Protein A-Agarose für 30 min. inkubiert. Im Anschluss wurde das Immunpräzipitat mittels Zentrifugation gewonnen und das Pellet gründlich mit TBS mit 0,1 % Triton X-100 gewaschen. Das Pellet wurde in 100 μl LDS-Probenpuffer (Novex) resuspendiert und vor der Western Blot Analyse gekocht.
Für das Standard-RIA-Protokoll wurde eine Plasmaextraktion über Reversed-Phase Sep-Pak C18 Cartridges (Waters) durchgeführt, wie zuvor berichtet (L.K. Lewis et al., 1998, Clin. Chem. 44:571-577; A. Martinez et al., 1999, Peptides 20:1471-1478). Die Cartridges wurden mit 80 % Methanol aktiviert und mit 0,9 % NaCl gewaschen.
Plasmaproben wurden mit dem gleichen Volumen an Phosphatpuffer-Salzlösung, enthaltend 0,1 % ATC und 0,1 % Triton X-100, pH 7,4. gemischt. Die Proben wurden auf die Säulen aufgegeben und nach zweimaligem Waschen mit 0,9 % NaCl wurde AM mit 80 % Isopropanol, enthaltend 125 mM HCl, eluiert. Die Extrakte wurden gefriergetrocknet, um das organische Lösungsmittel zu entfernen. Die Konzentrationen von AM in den Extrakten wurden mithilfe von Radioimmunassays gemessen, wie zuvor beschrieben (Martinez et al., 1999, supra).
Für das NaSCN-modifizierte RIA-Protokoll wurde 1 ml Plasma mit dem gleichen Volumen von 6M NaSCN in PBS mit 0,1 % ATC und 0,1 % Triton X-100 pH 7,4 für 10 min bei Raumtemperatur vorinkubiert. Das Plasma wurde danach über C18 Cartridges extrahiert und die AM-Konzentrationen quantifiziert. Die mit NaSCN-modifiziertem RIA gemessenen AM-Konzentrationen lagen zweifach höher als diejenigen der Standard-RIA. Die Mittelwerte und Werte der Standardabweichungen von drei Spendern betrugen 23,0 ± 48 pg/ml (Standard-RIA) 54,3 ± 8,6 pg/ml (NaSCN-modifiziertes RIA). Identische Ergebnisse wurden mit einem längeren NaSCN Vorinkubationsschritt (16 h bei 4°C) erhalten. Unter Verwendung des NaSCN-modifizierten RIA lag der Ertrag an unmarkiertem AM, das Humanplasma (200 pg) zugegeben wurde, bei 93,9 ± 18,7 % (n = 3), während der Ertrag von ¹²⁵I-AM 82,7 % ± 4,4 % (n = 6) betrug. Der parallele Verlauf der kompetitiven Bindungskurven lässt vermuten, dass der Anstieg in den AM-Konzentrationen, die nachfolgend auf die NaSCN-Behandlung nachgewiesen wurden, nicht auf ein Artefakt zurückzuführen war. 8.
BEISPIEL 9
Für den cAMP-Assay wurden Rat-2-Fibroblasten in RPMI 1640 enthaltend 10 % fetales Rinderserum (Life Technologies) angezogen. Die Zellen wurden in 24-Well-Mikrotiterplatten mit einer Konzentration von 2 × 10⁵ Zellen/Well eingebracht und für 48 h bei 37°C in 5 % CO₂ inkubiert. Vorinkubiert wurden die Zellen in TIS-Medium (RPMI 1640 plus 10 μg/ml Transferrin, 10 μg/ml Insulin und 50 nM Natriumselenit) für 15 min. Danach wurden die Zellen für 5 Minuten mit AM (Bachem, King of Prussia, PA) und/oder Faktor H (Sigma) in 250 μl TIS-Medium enthaltend 1 % BSA, 1 mg/ml Bacitracin und 100 μm Isobutylmethylxanthin behandelt. Die Reaktion wurde durch Zugabe des gleichen Volumens an eiskaltem Ethanol beendet. Zyklisches AMP wurde mithilfe von Biotrac cAMP RIA (Amersham Pharmacia Biotech) gemessen. 9A.
Die antimikrobielle Aktivität wurde mithilfe von E. coli Zellen (ATCC 35218, Gaithersburg, MD) und einem radialen Diffusionsassay, wie zuvor beschrieben, gemessen (R. I. Lehrer et al., 1991, J. Immunol. Methods 137:167-173). Die Bakterien wurden in ein dünnes Underlay-Gel eingebracht, welches 1 % Agarose, 2 mM HEPES pH 7,2 und 0,3 mg/ml Trypticase Soja Bouillon enthielt. Nach der Gelpolymerisation wurden kleine Wells (Fassungsvermögen 10 μl) in den Agar geschnitten. Die Testsubstanzen wurden zugegeben und für 3 h bei 37°C diffundieren gelassen. Ein 10 ml Overlay-Gel, zusammengesetzt aus 1 % Agarose und 6 % Trypticase Soja Bouillon, wurde über das vorherige Gel gegossen und die Platte für 16 h bei 37°C inkubiert. Die Durchmesser der Hemmhöfe wurden ab 0,1 mm gemessen und nach Abzug des Welldurchmessers als Einheiten für die Hemmung (10 Einheiten = 1 mm) ausgedrückt. Die minimale Hemmkonzentration (MHK) wurde über die Durchführung einer linearen Regression und Bestimmung der X-Achsenabschnitte geschätzt. 9B.
Zur statistischen Berechnung wurden die MHK-Werte mit dem Student's t-Test analysiert; die cAMP-Werte wurden durch eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) und Tukey's Test analysiert und p < 0,05 wurde als signifikant eingestuft.
Zur Messung der Cofaktor-Aktivität von Faktor H, wurde C3b (28 pmol) mit Faktor I (0,16 pmol) und Faktor H (0,16 pmol) in Anwesenheit oder Fehlen von AM und verwandten Peptiden für 24 h bei 37°C in einem Endvolumen von 50 μl PBS inkubiert Die Proben wurden über SDS-PAGE-Gelelektrophorese fraktioniert unter Verwendung von 4–12 % Tris-Bis-Gelen (Novex) unter reduzierten Bedingungen und mit Coomassie Blue gefärbt. C3b und Faktor I wurden von Advanced Research Technologies (San Diego, CA) bezogen. 10A und 10B.
BEISPIEL 10
Die Northern Blot Analyse wurde zur Bestimmung der Expression von Faktor H (4,3 kb) und FHL-1 (1,8 kb)-mRNA-Strang in verschiedenen humanen Tumorzelllinien verwendet. Ein ³²P markiertes 854 bp PCR-Produkt wurde als Sonde zum Nachweis von Faktor H- und FHL-1-mRNA im gleichen Northern Blot eingesetzt. Die Sequenzinformation für Faktor H und FHL-1 wurde von der GenBank, Zugangsnrn. Y00716 (Faktor H) und X07523 (FHL-1) erhalten. Um das PCR-Produkt/die PCR-Sonde zu erhalten, wurde PCR mithilfe eines Sense-Primers, der mit den Positionen 555–576 von Faktor H (5'-CAATGGAACCAGATCGGGATTA (SEQ ID NO:1)) korrespondiert und dem Antisense-Primer korrespondierend mit den Positionen 1378–1408 von Faktor H (5'-GACACGGATGCATCTGGGAGTA (SEQ ID NO:2)) durchgeführt. Die Gesamt-RNA aus der menschlichen Leber wurde revers transkribiert zu cDNA und als Template (Muster) benutzt Das Northern Gel wurde mit 15 μg Gesamt-RNA pro Well (Karzinom-Proben) oder mit 5 μg Gesamt-RNA pro Well (normale Hautprobe) beladen. Um die äquivalenten Mengen an Gesamt-RNA, mit denen jedes Well beladen wurde, zu überprüfen, wurde das Gel mit Ethidiumbromid gefärbt und mit UV-Licht bestrahlt. 11.
BEISPIEL 11
Für die immunohistochemische Analyse wurden 6 männliche Albino-Wistar-Ratten mit CO₂ euthanasiert und mit dem Fixiermittel (4 % Paraformaldehyd} über eine Herzkanüle perfundiert. Von jeder Ratte wurde der Pankreas entnommen und in dem gleichen Fixiermittel für eine zusätzliche Zeitdauer von 5 h eingelegt. Nach der Dehydratation wurde das Gewebe in Paraffin eingebettet und gemäß den Routinemethoden geschnitten.
Zwei kommerziell erhältliche polyklonale Antikörper gegen den Humanfaktor H wurden in Verbindung mit einem Avidin-biotinylierten Peroxidase-Nachweiskit (Dakopatts, Glostrup, Dänemark) verwendet. Bei den Antikörpern handelte es sich um Anti-Humanfaktor H von der Ziege (Quidel, San Diego, CA) und Anti-Humanfaktor H vom Kaninchen (Serotec, Raleigh, NC). Um die Spezifität des Signals sicherzustellen wurden Flüssigphasen- und Festphasen-Absorptionskontrollen mit gereinigtem Humanfaktor H (Sigma, St. Louis, MI) durchgeführt. Für die Flüssigphasen-Absorptionen wurden 10 nmol Faktor H pro ml an optimal verdünnten Antikörpern für 2 h bei Raumtemperatur zugegeben, bevor die Gewebeschnitte inkubiert wurden. Für die Festphasen-Absorptionen wurde Faktor H mit Ultralink Biosupport Medium (Pierce, Rockford, IL) gekoppelt; der optimal verdünnte Antikörper wurde für 2 h Raumtemperatur ausgesetzt und die Immunkomplexe mittels Zentrifugation entfernt. 12A–12C.
Anti-Faktor-H-Antikörper wurden dann über eine Affinitätschromatographie-Säule, enthaltend Festphasen-Faktor H, gereinigt. 1 mg Faktor H wurde kovalent an 250 mg UltraLink Biosupport Medium (Pierce) gemäß den Anweisungen des Herstellers gebunden. Anti-Faktor-H-Serum vom Kaninchen (250 μl) wurde mit dem Harz für 16 h in 5 ml PBS bei 4°C inkubiert. Danach wurde das Harz in eine Säule gepackt und intensiv mit PBS gewaschen. Der gebundene Antikörper wurde mit 0,1 M Zitronensäure, pH 3,3 eluiert. Das Eluat wurde neutralisiert mit 1 M Natriumphosphat pH 8,0 und der Puffer durch Ultrazentrifugation in Centricon 50 Säulen gegen PBS ausgetauscht (Amicon, Millipore Corporation, Bedford, MA). Die Festphasen-Absorption dieses affinitätsgereinigten Antikörpers resultierte in einem erfolgreichen Quenching der Farbe. 12D.
BEISPIEL 12
Die dreifache Immunofluoreszenz-Markierung und Konfokalmikroskopie wurde wie folgt durchgeführt. Nicht-spezifische Bindungen wurden mit Esel-Normalserum (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) gestoppt. Die Paraffinschnitte wurden in einer Mischung aus primären Antikörpern inkubiert, enthaltend: i) Meerschweinchen Anti-Rinderinsulin-Antikörper (1:2.000) (Jackson Immunoresearch Labs.); ii) Affinitätsgereinigte Kaninchen Anti-Humanfaktor-H-Antikörper (1:200) wie oben beschrieben; und iii) einer der folgenden monoklonalen Antikörper: Anti-Somatostatin-Antikörper (1:10.000), Anti-Glukagon-Antikörper (1:1.000) oder Anti-Ratte Pankreas-Polypeptid-Antikörper (1:500) (alle bezogen von CURE (UCLA, CA)).
Folgend auf die Inkubation über Nacht bei 4°C wurden die Schnitte für 1 h mit einer Mischung von sekundären Antikörpern, einschließlich Cy5-konjugierten Esel-Anti-Meerschweinchen-Antikörper (Jackson Immunoresearch Laboratories), Bodipy-konjugierten Anti-Maus-Antikörpern (Molecular Probes, Eugene, OR) und biotinylierten Ziege Anti-Kaninchen-Antikörpern (Dakopatts), alle in einer Endkonzentration von 1:200, inkubiert. Anschließend wurden die Schnitte mit Lissamin Rhodamine Streptavidin (1:200) (Jackson Immunoresearch Laboratories) für 1 h inkubiert. Nach gründlichem Waschen erfolgte die Fixierung der Schnitte mit SlowFade-Lösung (Molecular Probes) und die Untersuchung mit einem Zeiss Laser Scan-Mikroskop 510, ausgestattet mit vier Lasern. 13A–13L
BEISPIEL 13
Für die immunelektronischen mikrographischen Studien wurden 4 männliche Albino-Wistar-Ratten euthanasiert und eine Pankreas-Extraktion, wie zuvor beschrieben, durchgeführt. Kleine Fragmente eines jeden Pankreas wurden mit 1 % Glutaraldehyd plus 2 % Paraformaldehyd in 0,1 M Cacodylatpuffer, pH 7,2 bei 4°C für 2 h fixiert. Die Fragmente wurden dann dehydriert und in Epoxy-Harz TAAB-812 (TAAB Labs. England) eingebettet. Ultradünnschnitte (60–80 nm) wurden auf Nickelrastern platziert, für 5 min. in 3 % H₂O₂ geätzt und dann einer doppelten Immunogold-Färbung (J. Lopez et al., 1999, Gen. Comp. Endocrinol. 115:309-322) unterzogen. Die Schnitte wurden in einer Mischung beider primärer Antikörper (Anti-Insulin und Anti-Faktor H) bei 4°C über Nacht inkubiert. Am darauf folgenden Tag wurden die Schnitte mit den sekundären mit Gold konjugierten Antikörpern (E-Y Laboratories Inc., San Mateo, CA) inkubiert. Die großen Goldpartikel (20 nm im Durchmesser) lokalisierten den Anti-Insulin-Antikörper, während die kleinen Goldpartikel (10 nm) den Anti-Faktor-H-Antikörper lokalisierten. Die Raster wurden gründlich gewaschen und mit 5 %igem wässrigem Uranylacetat für 15 min. und mit Bleihydroxid für 7 min. gewaschen. Die Standardschnitte wurden mithilfe eines JEOL-1010 Elektronenmikroskops analysiert. 14A–14C.
BEISPIEL 14
Die Expression von Komplementfaktor H im Pankreas wurde durch die RT-PCR Analyse bestätigt. Es wurden unter Verwendung der Sequenz vom Mausgen (GenBank Zugangsnummer M12660) Primer kreiert: Sense-Primer (1877–1896) 5'-TTGGAATTCTCCTGCCATTC-3' (SEQ ID NO:3) und Antisense-Primer (2644–2663) 5'-ACCTTCCATCTTTGCACACC-3' (SEQ ID NO:4). Die Gesamt-RNA wurde aus Leber und Pankreas zweier Balb/c Mäuse hergestellt; die reverse Transkription wurde mithilfe des Superscript Preamplification System (Life Technologies, Gaithersburg, MD) durchgeführt. Die PCR-Amplifikation wurde durchgeführt mit eLONGase-Enzymmischung (Life Technologies) über 35 Zyklen mit einer Annealing-Temperatur von 57°C. Die PCR-Produkte wurden in pCR-Blunt II-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) geklont und von Lark Technologies (Houston, TX) sequenziert. Die RT-PCR-Ergebnisse wurden mittels Southern Blot Analyse bestätigt. 15A und 15B.
BEISPIEL 15
Die Pankreas-Inseln wurden wie zuvor beschrieben aus 12 Ratten isoliert (A. Martinez et al., 2000, Endocrinology 141:406-411). Jedes Rattenherz wurde mit Hank's Salzlösung (Sigma) perfundiert, um das Blut aus den Pankreasgefäßen zu entfernen. In den Ductus choledochus wurde eine kleine Kanüle eingeführt und der Choledochus verschlossen. Zwanzig bis fünfundzwanzig Milliliter einer 0,4 mg/ml Kollagenase XI (Sigma) in Hank's Salzlösung wurde durch die Kanüle gepumpt, bis der Pankreas voll aufgeblasen war. Der Pankreas wurde entnommen und bei 37°C für 20 min. inkubiert. Danach wurden 20 ml eiskalte Hank's Salzlösung zugegeben und der Pankreas durch starkes Vortexen aufgelöst. Nach mehreren Waschschritten wurden die Inseln gesammelt und in 24 Mikrotiterplatten mithilfe eines Dissektionsmikroskops verteilt mit etwa 70 Inseln pro Well. Die frisch isolierten Inseln wurden in RPMI-1640 (Life Technologies), enthaltend 5,6 mM Glukose, für 45 min bei 37°C inkubiert. Der Überstand wurde für die Analyse isoliert und die Inseln in RPMI-1640, enthaltend 20,6 mM Glukose plus die potenziellen Sekretagogen (AM und/oder Faktor H), für weitere 45 min inkubiert. Das Medium wurde für die Analyse isoliert und die Inseln in eiskaltem Ethanol zur Messung der cAMP-Produktion aufgelöst. Insulin und cAMP wurden über Radioimmunassay mit kommerziellen Kits (Amersham, Arlington Heights, IL) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. 16A und 16B
Die Insulinfreisetzung wurde ausgedrückt als Verhältnis der Konzentration im Medium mit hoher Glukosekonzentration dividiert durch die Konzentration in dem Medium mit geringer Glukosekonzentration, um so die Abweichungen in der Anzahl der Sekretzellen und/oder deren sekretorischen Effizienz mit zu berücksichtigen. Die Graphiken stellen den Mittelwert und die Standardabweichung von drei Wells pro Behandlung dar. Diese Experimente wurden dreimal mit vergleichbaren Resultaten durchgeführt. Zur Bestimmung der statistischen Signifikanz wurde der Two-Tailed Student's Test durchgeführt. P-Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.
BEISPIEL 16
Es wurden Experimente mit radiomarkiertem AM als Ligand durchgeführt. Radioligand-Blotting-Assays wurden durchgeführt, um nachzuweisen, dass AM-BPs im Plasma verschiedener Tierspezies vorhanden waren und des Weiteren, um die Spezifität der Bindung zwischen AM und dem aus dem Plasma gewonnenen AM-bindenden Protein auf einer festen Membran, wie beispielsweise Nitrocellulose, zu bestimmen (siehe T.H. Elsasser et al., 1999, Endocrinology 140:4908-4911).
Blutseren und -plasma von Kälbern (4–5 Monate alt), Schweinen (6–7 Monate alt), Ziegen (2 Jahre alt), Hunden (6–8 Jahre alt), Mäusen (4–6 Monate alt), Hühnern (6–8 Wochen alt) und vom Menschen (Erwachsen, männlich) wurden gesammelt und gepoolt, aliquotiert und bei –20°C gelagert bis sie gebraucht wurden. Die anfängliche chromatographische Bestimmung hochmolekularer Plasmaproteine, die zur Bindung von rekombinantem humanem ¹²⁵I-AM (Phoenix Pharmaceuticals, Mountain View, CA) fähig sind, wurde mit einer 0,7 × 30 cm Säule mit Sephadex^® G-50 superfine (Pharmacia LKB, Uppsala, Schweden), äquilibriert mit 50 mM Phosphat, 50 mM Dinatrium-EDTA, 135 mM NaCl, 0,1 % Tween 20 und 0,125 % alkalisch-hydrolysiertem Casein (AHC; 7), pH 7,2 durchgeführt. Für die gelchromatographischen Studien der Lösung, die ¹²⁵I-AM gebunden an Plasmaproteine enthielt, wurde Rinderplasma (0,1 oder 0,3 ml) mit 50.000 cpm ¹²⁵I-AM, gemischt, über Nacht bei 4°C inkubiert und mit Phosphat gepufferter Salzlösung in einem Endvolumen von 0,5 ml auf die Säule aufgegeben. Unter Gravitationsfluss wurden Ein-Milliliterfraktionen gesammelt und die Radioaktivität quantifiziert.
Der weitere Nachweis und die Charakterisierung der AM-BPs wurden mithilfe von Radioligand-Blotting-Verfahren erbracht, ähnlich den für IGF-Bindungsproteine in Plasma beschriebenen (P. Hossenlopp et al., 1986, Anal. Biochem. 154:138-146). Plasma und Serum von 10 Spezies wurden 1:5 mit Wasser verdünnt und weiter mit 1:2 SDS Tris-Glycineglycerol Beladungspuffer gemischt und für 10 min bei 70°C inkubiert. Plasma- oder Serumvolumen entsprechend 1,5 μl wurden auf 10 % Acrylamidgele unter nicht-reduzierten Bedingungen geladen. Die Proteine wurden bei 115 V für 0,5 h aufgetrennt und auf 0,2 μm Nitrocellulose mithilfe eines halb-feuchten Transfers (Bio-Rad Hercules, CA) bei 18 V für 42 min. übertragen. Molekuiargewichtsmarker (29 kD, 43 kD, 66 kD, 78 kD und 116 kD) wurden zu den Komplementärbahnen auf jedem Gel zugegeben, um die relative Größe der aufgetrennten Proteine zu bestimmen. Nitrocellulose-Blots wurden für 15 min mit 1,5 % NP-40 (Sigma, St. Louis, MO) inkubiert. Nicht-spezifische Bindungen wurden des Weiteren durch eine 4-stündige Inkubation der Nitrocellulose in Phosphat-gepufferter Salzlösung, enthaltend entweder 1 % BSA (RIA Grade, SIGMA, St. Louis, MO) oder 1 % AHC, blockiert. Inkubationen mit radiomarkiertem rekombinantem humanem ¹²⁵I-AM wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Rühren durchgeführt mit 80.000 CPM ¹²⁵I-hAM pro 5 ml Protein Blocking Matrix. Am nächsten Morgen wurde die Nitrocellulose 10 min mit 0,2 % NP-40 gewaschen und weitere viermal für 15 min mit Phosphat-gepufferter Salzlösung gewaschen. Nach dem Lufttrocknen wurde die Nitrocellulose über Nacht in eine Phosphoimaging-Kassette (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) zur Analyse der getrennten Bandenbildgebung eingebracht. Die zusätzliche Charakterisierung der Bandenmuster wurde ausgeführt durch Autoradiographie der Blots auf Kodak AR-5-Film mit einer 4-tägigen Belichtung bei –80°C. Entfernt wurden die sichtbaren Bindungsprotein aus dem Plasma über die C18 Reversed-Phase Sep-Pak^® RIA Präparative Chromatographietechnik (A. Martinez et al., 1997, Endocrinology 138:5597-5604). 17.
Die kompetitive Verdrängung von ¹²⁵I-AM aus den separierten Proteinen auf den Nitrocellulose-Ligand-Blot-Strips wurde durchgeführt, um die Spezifität der AM-Bindung an das AM-bindende Protein zu bewerten. Die Blot-Strips wurden in Puffer, enthaltend 0,1 % AHC, ¹²⁵I-AM und Konzentrationen von rekombinantem humanem AM im Bereich von 10^–10 bis 10^–6 M inkubiert. Die Intensität der Bandenbilder wurde durch die Phosphoimgaing-Densitometrie aufgelöst. Zusätzliche Aspekte der AM-Spezifität für das/die Bindungsprotein(e) wurden über Co-Inkubation von ¹²⁵I-AM über Nacht mit authentischen AM_1–52 (10^–6M) oder AM_1–12, AM_13–52, AM_34–52 Peptidfragmenten oder Amylin, CGRP oder Insulin in einer Konzentration von 10^–5M ermittelt. Die Ergebnisse zeigten eine lineare kompetitive Verdrängung von ¹²⁵I-AM aus den AMBPs in Anwesenheit steigender Konzentrationen von nicht-markiertem synthetischem AM (Elsasser et al., 1999, supra).
BEISPIEL 17
Ein Vergleich von ¹²⁵I-AM Blot-Bindungsmustern in Rinderplasmen von gesunden und mit Parasiten befallenen Kälbern wurde eingesetzt, um zu bestimmen, ob der Plasma-AM-BP-Gehalt durch den Gesundheitsstatus eines Subjektes beeinflusst wird (Elsasser et al., 1999, supra). Nitrocellulose-Transferblots von Plasmaproteinen von normal gesunden 4 Monate alten Kälbern (n = 3) und Käibern infiziert mit einem vaskulär endothelialresidenten Parasiten (Sarcocystis cruzi) (n = 4), wurden mit ¹²⁵I-AM untersucht. Plasma von infizierten Kälbern wurde am Tag 30 durch postorale Inokulation (250.000 Oocysten) auf der Höhe der Expression der klinischen Anzeichen der Akutphasen-Reaktion assoziiert mit dem Austreten von Schizonten aus dem Endothel gewonnen (T.H. Elsasser et al., 1988, J. Endocrinol. 116:191-200).
Daten bezüglich der Effekte einer Parasiteninfektion auf die Menge an AM-BP in Kälberplasma wurde statistisch analysiert mithilfe einer Varianzanalysenmethode basierend auf den allgemeinen linearen Modellverfahren von SAS (SAS 1986 General Linear Models Procedure: SAS für Personalcomputer, SAS Institute, Cary, NC). Autoradiogramme von Proteinen, auf Nitrocellulose transferiert und sondiert mit radiomarkiertem ¹²⁵I-hAM, zeigten, dass Plasma aller getesteten Spezies mindestens ein Protein gebunden an den AM-Tracer, d.h. ein AM-bindendes Protein, enthielt. Dieses AM-BP war ein hochmolekulares Protein mit etwa 120–130 kD, noch spezifischer, 120 kD. Im Plasma von Kalb, Ziege, Schaf und in geringerem Maße vom Hund wurde eine zusätzliche Bande von 140 kD beobachtet.
Zudem zeigte das ¹²⁵I-AM Ligand-Blotting, dass die Menge an spezifischen AM-bindenden Proteinen um 68 % im Plasma von Kälbern, die eine Akutphasen-Reaktion auf das parasitäre Problem durchmachten, gesenkt war (P < 0,03). Da sowohl gesunde als auch von Parasiten befallene Kälber ähnliche Plasmakonzentrationen an Gesamtproteinen, Albumin und Globulinen aufwiesen, ist der gemessene Rückgang in den AM-BPs in den von Parasiten befallenen Kälbern eine spezifische Reaktion innerhalb dieser Proteinklasse in Bezug auf das Auftreten einer Krankheit. 18.
BEISPIEL 18
Eine kleine Molekül-kombinatorische Bibliothek ist über das Developmental Therapeutics Program beim NIH zugänglich. Diese Bibliothek bietet insgesamt 250.000 Verbindungen mit einem Molekulargewicht unter M_r600. Die Verbindungen sind in 8000 „Familien" organisiert mit ähnlichen strukturellen Charakteristika. Ein Mitglied jeder Familie kann auf die Bindung an AM, Faktor H oder AM/fH getestet werden. Wird eine Bindung nachgewiesen, können die restlichen Familienmitglieder analysiert werden, um die Verbindungen mit verstärkter Bindungsaffinität für AM, Faktor H oder AM/fH zu identifizieren. Im initialen Screening können 96-Well Mikrotiterplatten mit AM, Faktor H oder AM/fH (synthetisch, rekombinant oder isoliert) überzogen und dann mit verschiedenen Testverbindungen inkubiert werden. Nach gründlichem Waschen wird das Vorhandensein von AM, Faktor H oder AM/fH mit entsprechenden Antikörpern nachgewiesen, gefolgt von einem sekundären Antikörper und ¹²⁵I-Protein A. Danach können die einzelnen Wells mit einem Gammazähler gescannt werden. Wells enthaltend AM-, Faktor H- oder AM/fH-bindende Verbindungen können anhand eines Signalanstiegs im Vergleich zur Negativkontrolle (keine Verbindung zugegeben) identifiziert werden.
Verbindungen, die aufgrund ihrer Bindungsaktivität identifiziert wurden, können mit verschiedenen Bioassays weiter analysiert werden. Beispielsweise können Verbindungen unter Verwendung der Fibroblastzelllinie, Rat-2, welche spezifische AM-Rezeptoren exprimiert, getestet werden (H.A. Coppock et al., 1999, Biochem. J. 338:15-22). Zum Testen von AM-bindenden Verbindungen können die Zellen inkubiert werden mit AM allein (Negativkontrolle) oder AM plus die Verbindung. Zum Testen von fH-bindenden Verbindungen können die Zellen mit AM allein, Faktor H allein, AM plus Faktor H (Negativkontrolle) oder AM plus Faktor H und der Verbindung inkubiert werden. Zum Testen von AM/fH-bindenden Verbindungen können die Zellen mit AM/fH allein (Negativkontrolle) oder AM/fH plus der Verbindung inkubiert werden. Danach kann die cAMP-Reaktion der Zellen mit Radioimmunoassays, wie zuvor beschrieben, analysiert werden (A. Martinez et al., 1997, Endocrinology 138:55977-56048; M.J. Miller et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:23345-23351; A. Martinez et al., 1999, Peptides 20:1471-1478).
Dosis-Reaktionskurven werden geplotted und für die Identifikation der Verbindungen verwendet, die die AM-vermittelte cAMP-Produktion hemmen (verglichen mit der/den Negativkontrolle(n)). Die Kurven können auch benutzt werden, Verbindungen mit hoher Affinität zu identifizieren. Die Verbindungen mit hoher Affinität können dann als Modelle für sekundäre kombinatorische Bibliotheken benutzt werden, die ~500 Verbindungen enthalten. Solche Bibliotheken können sich aus chemisch veränderten Formen der Originalverbindungen zusammensetzen. Diese neuen Verbindungen können auf die gleiche Weise wie oben beschrieben getestet werden, um das Screeningverfahren zu verfeinern und einen potenten Inhibitor der AM-Funktion, Faktor-H-Funktion oder AM/fH-Interaktion zu identifizieren.
Da zahlreiche Änderungen an den oben angegebenen Methoden und Zusammensetzungen vorgenommen werden können, ist es beabsichtigt, dass alle Erfindungsgedanken, die in den angegebenen Beschreibungen, in den beiliegenden Zeichnungen oder in den anhängigen Ansprüchen enthalten sind, nur zu Zwecken der Veranschaulichung zu interpretieren sind und den Erfindungsgedanken nicht einschränken.

Claims

Methode für die Messung der Adrenomedullin-Konzentration in einer Probe umfassend: i) Inkubation der Probe mit einem chaotropen Agens zur Auflösung von Adrenomedullin und Faktor H; ii) Fraktionierung der Probe, um eine Peptidfraktion zu erhalten und iii) Quantifizierung der Adrenomedullin-Konzentration in der Peptidfraktion der Probe.
Methode gemäß Anspruch 1, wobei die Probe ausgewählt wird aus der Gruppe enthaltend Plasma, Serum, Zelllysat und Gewebeextrakt.
Methode gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei dem chaotropen Agens um Thiocyanat handelt.
Methode gemäß Anspruch 1, wobei die Probe über eine C18-Matrix fraktioniert wird.
Methode gemäß Anspruch 1, wobei die Adrenomedullin-Konzentration in Schritt (iii) durch Radioimmunassay-Analyse quantifiziert wird.
Methode zur Überwachung der Adrenomedullinkonzentration in einem Subjekt, welches an einer mit einer erhöhten Adrenomedullin-Konzentration assoziierten Krankheit leidet, wobei diese Erkrankung zur Gruppe bestehend aus Herzkrankheit, Lungenkrankheit, Leberzirrhose, Krebs, Diabetes, Sepsis und Entzündungen gehört, umfassend: i) Inkubation einer Probe von dem Subjekt, die mit isoliertem Faktor H oder einem Adrenomedullin-bindenden Peptidfragment davon analysiert wird unter Bedingungen, welche die Bindung von Faktor H oder dem Faktor-H-Peptid an Adrenomedullin in der Probe ermöglichen. ii) Quantifizierung der Menge an Faktor H oder Faktor-H-Peptid gebundenem Adrenomedullin und iii) Vergleich der Adrenomedullin-Konzentration in dem Subjekt mit Konzentrationen in gesunden Individuen.
Methode gemäß Anspruch 6, wobei die Überwachung der Adrenomedullin-Konzentration dabei hilft, eine Diagnose auf eine Krankheit zu stellen, den Schweregrad einer Erkrankung zu bestimmen oder die Rekonvaleszens zu verfolgen.
Methode gemäß Anspruch 6, wobei die Probe ausgewählt wird aus der Gruppe enthaltend Plasma, Serum, Zelllysat und Gewebeextrakt.
Methode gemäß Anspruch 6, wobei die Krebserkrankung zur Gruppe gehört, bestehend aus Harnblasen-, Harnröhren-, Nieren-, Mastdarm-, Darm-, Dünndarm-, Magen-, Speiseröhren-, Speicheldrüsen-, Gallenblasen-, Leber-, Brust-, Vaginal-, Endometrial-, Eierstock-, Gebärmutterhals-, Prostata-, Haut-, Lungen- und Gehirnkrebs.
Die Methode gemäß Anspruch 6, wobei der Faktor H oder das Faktor-H-Peptid markiert ist.
Die Methode gemäß Anspruch 10, wobei der Marker nicht radioaktiv ist.
Methode gemäß Anspruch 10, wobei es sich bei dem Marker um ein Enzym handelt.
Methode gemäß Anspruch 6, wobei die Probe vor Schritt (i) fraktioniert wird, um eine Peptidfraktion zu erhalten.
Methode gemäß Anspruch 13, wobei die Probe über eine C18-Matrix fraktioniert wird.
Methode gemäß Anspruch 13 oder 14, wobei die Probe vor der Fraktionierung mit einem chaotropen Agens inkubiert wird.
Methode gemäß Anspruch 15, wobei es sich bei dem chaotropen Agens um Thiocyanat handelt.
Kit zum Nachweis der Adrenomedullin-Konzentration in einer Probe umfassend mindestens ein Faktor H- oder Adrenomedullin-bindendes Peptidfragment davon.
Kit gemäß Anspruch 17, wobei das Peptid markiert ist.
Kit gemäß Anspruch 18, wobei der Marker nicht radioaktiv ist.
Kit gemäß Anspruch 18, wobei der Marker ein Enzym ist.
Methode zur Identifizierung eines Antagonisten, welcher die Interaktion zwischen Adrenomedullin und Faktor H verhindert, umfassend: i) In Kontakt bringen von Adrenomedullin mit einer Testkomponente unter Bedingungen, die es dem Adrenomedullin ermöglichen sich an die Testkomponente zu binden und so eine stabile Verbindung zu bilden; ii) Nachweis der Bildung der Adrenomedullin-Testkomponente-Verbindung aus Schritt (i); und iii) In Kontakt bringen der Verbindung von Adrenomedullin-Testkomponente mit Faktor H unter Bedingungen, die es der Testkomponente ermöglichen, die Komplexbildung von Adrenomedullin und Faktor H zu hemmen, wobei die Hemmung auf die Antagonistenwirkung hindeutet.
Methode zur Identifizierung eines Antagonisten, welcher die Interaktion zwischen Adrenomedullin und Faktor H verhindert, umfassend: i) In Kontakt bringen von Faktor H mit einer Testkomponente unter Bedingungen, die es dem Faktor ermöglichen sich an die Testkomponente zu binden und so eine stabile Verbindung zu bilden; ii) Nachweis der Bildung der Verbindung aus Faktor H-Testkomponente aus Schritt (i); iii) In Kontakt bringen der Bindung von Faktor H-Testkomponente mit Adrenomedullin unter Bedingungen, die es der Testkomponente ermöglichen, die Komplexbildung von Adrenomedullin und Faktor H zu hemmen, wobei die Hemmung auf die Antagonistenwirkung hindeutet.
Ein isolierter und gereinigter Proteinkomplex umfassend Adrenomedullin und Faktor H.
Ein Antikörper, der spezifisch mit einem Epitop reagiert, geformt durch die Komplexbildung von Adrenomedullin und Faktor H oder einem Komplex-spezifischen Fragment davon.
Antikörper gemäß Anspruch 24, wobei es sich bei dem Antikörper um einen monoklonalen Antikörper handelt.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend den Antikörper gemäß Anspruch 25 und einen physiologisch akzeptablen Träger, ein Vehikel oder einen Verdünner.
Methode für die Isolierung von Adrenomedullin/Faktor-H-Proteinkomplexen aus einer biologischen Probe umfassend: i) Bereitstellen eines festen Trägers, der sich an den Antikörper aus Anspruch 24 oder 25 gebunden hat; ii) In Kontakt bringen des genannten Trägers mit der Probe und iii) Eluieren des Adrenomedullin/Faktor-H-Komplexes, der sich an den an den Träger gebunden Antikörper bindet.
Methode gemäß Anspruch 27, wobei die biologische Probe ausgewählt wird aus der Gruppe enthaltend Plasma, Serum, Zelllysat und Gewebeextrakt.
Methode für den Nachweis von Adrenomedullin/Faktor-H-Proteinkomplexen in einer biologischen Probe umfassend: i) Inkubation der Probe mit den Antikörpern aus Anspruch 24 oder 25 unter Bedingungen, die die Bindung der Antikörper an den Adrenomedullin/Faktor-H-Komplex in der Probe ermöglichen, und ii) Bestimmung der Bindung von Antikörpern an den Adrenomedullin/Faktor-H-Komplex.
Methode gemäß Anspruch 29, wobei die Probe ausgewählt wird aus der Gruppe enthaltend Plasma, Serum, Zelllysat und Gewebeextrakt.
Methode gemäß Anspruch 29, wobei die Antikörper markiert sind.
Methode gemäß Anspruch 31, wobei die Antikörper nicht radioaktiv markiert sind.
Methode gemäß Anspruch 31, wobei die Antikörper mit einem Enzym markiert sind.
Kit für den Nachweis von Konzentrationen des Adrenomedullin/Faktor-H-Komplexes in einer Probe umfassend mindestens einen Antikörper, der spezifisch mit einem Epitop, gebildet durch Komplexbildung von Adrenomedullin und Faktor H oder einem Komplex-spezifischen Fragment davon, reagiert.
Kit gemäß Anspruch 34, wobei der Antikörper markiert ist.
Kit gemäß Anspruch 35, wobei der Marker nicht radioaktiv ist.
Kit gemäß Anspruch 35, wobei der Marker ein Enzym ist.
Antikörperverwendung gemäß Anspruch 24 bei der Herstellung eines Medikamentes zur Prävention und Behandlung von Krebs oder Tumoren.
Verwendung gemäß Anspruch 38, wobei die Tumore zur Gruppe gehören, bestehend aus Harnblasen-, Harnröhren-, Nieren-, Mastdarm-, Darm-, Dünndarm-, Magen-, Speiseröhren-, Speicheldrüsen-, Gallenblasen-, Leber-, Brust-, Vaginal-, Endometrial-, Eierstock- , Gebärmutterhals-, Prostata-, Haut-, Lungenkrebs und Gehirnkrebs oder Tumoren.
Verwendung gemäß Anspruch 38, wobei die Antikörper humanen Ursprungs sind.
Verwendung gemäß Anspruch 38, wobei es sich um rekombinante Antikörper handelt.
Antikörperverwendung gemäß Anspruch 24 bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Diabetes und Phäochromozytom.
Verwendung gemäß Anspruch 42, wobei es sich um Diabetes Typ 2 handelt.
Verwendung von Faktor H bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Diabetes Typ 1.