CN1753909A - 肽,含有该肽的药物组合物和用于治疗癌症的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了含有从SEQ ID NO：1所示氨基酸序列N－末端缺失至少一个氨基酸所衍生的氨基酸序列的肽，所述肽具有抑制癌细胞的血管新生，和由于这种抑制作用所产生的对癌细胞增殖进行抑制的效应。所述肽可用于治疗如胃癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、肝癌或胰腺癌等癌症。

Description

肽，含有该肽的药物组合物和用于治疗癌症的药物组合物
技术领域
本发明涉及对于治疗癌症有效的肽、含有所述肽或其类似物的药物组合物。
背景技术
近来，癌症已成为继心脏病之后的第二大人类死亡因素。癌症通常是通过外科手术、放疗、化疗、免疫疗法和高热等方法来治疗。在所有这些疗法中，为了清除癌症细胞，切除活细胞以及诱导细胞死亡成为重要的目标。
如上面提到的，癌症治疗的目的是清除癌症细胞。将诱导癌细胞死亡或增强免疫应答的基因引入癌细胞的基因治疗方法已发展起来。
然而，在涉及导入诱导癌细胞死亡的基因的基因治疗方法中，目前还没有办法将基因导入所有的癌细胞。因此，很难达到预期目标，也就是清除癌细胞。再者，在涉及导入可增强免疫应答的基因的基因治疗方法中，由于免疫应答在多个步骤上受到复杂的调控，已证实很难通过单独操作一个基因来增强免疫应答。
另一方面，对于由于缺失细胞内某一特定物质而造成的疾病，如免疫缺陷而言，将可补充该物质的基因导入细胞的基因治疗方法已显示很成功。因此，这种策略在癌症的基因治疗，也即通过产生某种物质来治疗癌症中也是重要的。
促肾上腺髓质素(adrenomedullin)首先是在人嗜铬细胞瘤中发现的，它是一种包含52个氨基酸的肽(Kitamura，K.et al.“Adrenomedullin，a novelhypotensive peptide isolated from human pheochromocytoma”，Biochem.Biophys.Res.Commun.192：553-560(1993))。促肾上腺髓质素是通过连续的酶促降解和酰胺化过程，从含有185个氨基酸的前激素原产生出来的一种降血压肽。经过这些酶促降解和酰胺基化步骤，产生了含有52个氨基酸的促肾上腺髓质素。
促肾上腺髓质素存在于许多组织，包括正常的肾上腺/髓质、心房、心室、内皮细胞、肺、脑、肾和骨，并且已知其具有血管扩张活性。通过其血管扩张活性，促肾上腺髓质素还参与多种细胞的血管新生。已经证明，在各种癌细胞中的促肾上腺髓质素含量高于正常细胞。由于血管新生对于癌细胞的增殖是必须的，为治疗癌症的目的，可通过抑制血管新生来抑制癌细胞的增殖。
因此，一旦发现一种能够抑制促肾上腺髓质素诱导的血管新生的化合物，就有可能证明其可有效用于治疗各种癌症。
因此，本发明的目的之一是提供新的可用于治疗各种癌症如胃癌、结肠直肠癌、肺癌、卵巢癌、肝癌以及胰腺癌的化合物。
发明内容
注意到促肾上腺髓质素在癌细胞中高水平表达并且涉及血管新生后，本发明者们考虑在癌症治疗中使用促肾上腺髓质素的拮抗剂，并且寻找了在治疗癌症中有用的新化合物。
经过深入研究后，本发明者们发现，含有经部分缺失的促肾上腺髓质素氨基酸序列的一种肽，对癌细胞具有细胞毒作用，因此在癌症治疗中有效。
因此，本发明提供一种肽，其含有在SEQ ID NO：1氨基酸序列N-末端缺失至少一个氨基酸的氨基酸序列。
本发明还提供用于治疗癌症的肽，其含有在SEQ ID NO：1公布的氨基酸序列N-末端至少缺失一个氨基酸的氨基酸序列。
此外，本发明提供基因，所含的DNA中具有编码上述肽或用于治疗癌症的肽的核苷酸序列。
而且，本发明提供重组载体，其含有编码上述肽或用于治疗癌症的肽的DNA。
另外，本发明提供含有前述重组载体的转化子。
本发明还提供用于产生上述肽或治疗癌症的肽的方法，包括培养转化子、产生并富集所述肽或用于治疗癌症的肽、以及收集所述肽等步骤。
本发明还提供药物组合物、尤其是用于癌症治疗的药物组合物，其包括上述肽或用于癌症治疗的肽。
附图简述
图1描述在缺氧条件下，各种细胞系培养中促肾上腺髓质素mRNA的表达。
图2描述由于对肿瘤施用本发明肽引起的肿瘤大小的变化。
图3是一张照片，描述从小鼠摘出的肿瘤。
图4描述对从小鼠摘出的肿瘤称重的结果。
图5是一系列的照片，显示用抗-CD31抗体对肿瘤组织染色后的结果。
图6是一系列照片，显示用抗-PCNA抗体染色肿瘤细胞的结果。
实施本发明的最好模式
在下文中，对本发明进行了详细描述。
本发明的肽包含在由SEQ ID NO：1公布的氨基酸序列组成的肽的N-末端至少缺失了一个氨基酸的氨基酸序列。具体地说，本发明的肽包含在由SEQ ID NO：1公布的氨基酸序列组成的肽的N-末端缺失了1～25、1～20、1～15、1～10或1～5个氨基酸的氨基酸序列。在这里，由SEQ ID NO：1公布的氨基酸序列组成的肽是人源的促肾上腺髓质素。
本发明的肽可以使用本领域内熟知的方法，通过用蛋白水解酶切割由SEQ ID NO：1公布的氨基酸序列组成的肽而获得。
人促肾上腺髓质素cDNA的核苷酸序列已经确定出来(Kitamura，et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.194，720(1993))。因此，所需要的肽可以通过如下步骤获得，合成含有编码所需肽核苷酸序列的DNA，将合成的DNA插入载体，用含有该DNA的载体转化宿主，培养由此获得的转化子以便产生该肽。作为选择，本发明的肽可以通过任何本领域已知的常规肽合成方法来产生。
本发明的肽还可以是在C-末端有1～10、优选1～5个氨基酸缺失的那些。此类在C-末端有氨基酸缺失的肽，可以通过上述肽合成方法或转化子方法来制备。
本发明的肽可用作治疗癌症的组合物。一些氨基酸可以缺失、替换或添加，只要所得的肽具有对癌症的治疗效果即可。一般来说，即使当肽的全部氨基酸序列中1～5、更优选1～3个氨基酸已经缺失、替换或添加，也基本上认为这些肽是等同的。
本发明肽的C-末端通常是羧基(-COOH)或羧酸根(-COO-)，但也可以是酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)。这里，酯中R的例子包括C1-6烷基如甲基、乙基、n-丙基、异丙基以及n-丁基；C3-8环烷基如环戊烷基和环己烷基；C6-12芳基如苯基和α-萘基；以及广泛用作口服酯的新戊酰氧甲基(pivaloyloxymethyl)酯。
另外，当上述肽在除了C-末端以外的其它位置具有羧基(或羧酸根)时，这种羧基可以被酰氨化或酯化。举例来说如酯，诸如上述C-末端的酯，可以用作本发明中的肽。此外，本发明还包括下述肽，其N-末端通过体内切割作用产生的谷氨酸残基转变成了焦谷氨酸；还包括下述肽，其中分子内氨基酸侧链上的OH、COOH、NH2、SH等用适当的保护基团(例如，C1-6酰基诸如甲酰基和乙酰基)保护起来；还包括偶联蛋白，诸如与糖链偶联的糖蛋白。
上述肽的盐优选那些明确可被生理所接受的酸的盐。此类盐包括与无机酸(如盐酸、磷酸、氢溴酸以及硫酸)以及与有机酸(如乙酸、甲酸、丙酸、反丁烯二酸、顺丁烯二酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸以及苯甲磺酸)形成的盐。
本发明中用于治疗癌症的肽描述如下。
本发明中用于治疗癌症的肽是那些具有如下氨基酸序列的肽，其中在由SEQ ID NO：1公布的氨基酸序列组成的肽的N-末端缺失了至少一个氨基酸。具体地说，本发明的肽包含以下氨基酸序列，其中在由SEQ ID NO：1公布的氨基酸序列组成的肽的N-末端缺失了1～25、1～20、1～15、1～10或1～5个氨基酸。在这里，由SEQ ID NO：1公布的氨基酸序列组成的肽是人源的促肾上腺髓质素。
本发明中用于治疗癌症的肽，可以使用本领域内熟知的方法，通过用蛋白水解酶切割由SEQ ID NO：1公布的氨基酸序列组成的肽而获得。
人促肾上腺髓质素cDNA的核苷酸序列已经确定出来(Kitamura，et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.194，720(1993))。因此，所需要的用于治疗癌症的肽可以通过如下步骤获得，合成含有编码所需肽核苷酸序列的DNA，将合成的DNA插入载体，用含有该DNA的载体转化宿主，培养由此获得的转化子以便产生该肽。该肽也可以通过任何本领域已知的常规肽合成方法来产生。
本发明中用于治疗癌症的肽，还可以是那些其中C-末端的1～10、优选1～5个氨基酸缺失的肽。此类在C-末端有氨基酸缺失且用于治疗癌症的肽，可以通过上述肽合成方法或转化子方法来制备。
在本发明用于癌症治疗的肽中，与上述本发明的肽相似，其它氨基酸也可以缺失、替换或添加。
而且，用于治疗癌症的肽的酰胺、酯或盐也与上述那些本发明中的肽相似。
本发明的肽和用于治疗癌症的肽的一个具体例子是，含有SEQ ID NO：2公布的氨基酸序列的肽。
本发明的肽和用于治疗癌症的肽，可用于治疗各种癌症，如胃癌、结肠直肠癌、肺癌、卵巢癌、肝癌以及胰腺癌。引导入癌细胞后，相信本发明的肽和用于治疗癌症的肽可以抑制癌细胞的血管新生，并通过这种抑制效果抑制癌细胞的增殖。
本发明的肽和用于治疗癌症的肽的抗癌活性，可以进行评估，例如通过将这些肽施用给已产生了癌症的动物如小鼠，然后研究癌细胞的消失。
其次，对带有含编码本发明肽或用于治疗癌症的肽(下文中也简单称为“肽”)的核苷酸序列的DNA的基因也进行了描述。如上所述，人促肾上腺髓质素cDNA已经测序。因此，根据公布的核苷酸序列，需要的肽可通过合成含有编码所需肽的核苷酸序列的DNA分子来获得。
含有编码本发明肽的DNA的重组载体，可按照本领域内已知的常规方法来制备，例如，通过将编码本发明肽的核苷酸序列与一个合适的载体相连接(插入)。本发明不限于某一特定的载体，只要该载体可以在所选择的宿主中复制。实例可包括质粒DNA和噬菌体DNA。
重组载体可通过如下步骤来制备，切出含有编码本发明肽的DNA的DNA片断，然后将它连接在适宜表达载体中的启动子的下游。可用于本发明的合适载体包括，起源于大肠埃希氏菌(Escherichia coli)的质粒(如pBR322、pBR325、pUC18、pUC19、pUC118或pBluescript)；起源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的质粒(如pUB110、pTP5、或pC194)；起源于酵母的质粒(如pSH19、pSH15、YEp13或YCp50)；噬菌体如λ噬菌体；以及动物病毒，如逆转录病毒、痘苗病毒或杆状病毒。在本发明的上下文中，任何启动子都可以使用，只要他们适于在用来表达目的基因的宿主中使用。举例来说，优选的启动子如下：当宿主是大肠埃希氏菌时，有trp启动子、lac启动子、recA启动子、λPL启动子、lpp启动子、T7启动子、T3启动子和araBAD启动子；当宿主属于芽孢杆菌属(Bacillus)时，有SPO1启动子、penP启动子、XYL启动子、HWP启动子和CWP启动子；当宿主是枯草芽孢杆菌时，有SPO1启动子、SPO2启动子和penP启动子；而当宿主是酵母时，有PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子以及ADH启动子。当动物细胞用作宿主时，可用的启动子包括SRα启动子、SV40启动子、LTR启动子、CMV启动子、HSV-TK启动子等等。另外，当昆虫细胞用作宿主时，多角体启动子、OplE2启动子等是优选的。
除了上述的启动子，如果需要，表达载体还可包括增强子、剪接信号、poly(A)加尾信号、选择标记、SV40复制起点(在下文中有时缩写为“SV40ori”)，以及诸如此类本领域内已知的那些。此外，如果需要的话，用本发明的DNA编码的蛋白也可以表达为与另一种蛋白(例如，谷胱甘肽-S-转移酶和蛋白A)的融合蛋白。这种融合蛋白可以用位点特异性蛋白酶切割来分成各自独立的蛋白。
合适的宿主细胞的例子包括，埃希氏菌属(Escherichia)细菌、芽孢杆菌属细菌、酵母、昆虫细胞、昆虫、以及动物细胞。合适的埃希氏菌属细菌的具体实例包括大肠埃希氏菌K12·DH1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 60，160(1968))、JM103(Nucleic Acids Research 9，309(1981))、JA221(Journal ofMolecular Biology 120，517(1978))、HB101(Journal of Molecular Biology 41，459(1969))、DH5α和JM109。合适的芽孢杆菌属细菌实例包括，枯草芽孢杆菌MI114(Gene 24，255(1983))、207-21(Journal of Biochemistry 95，87(1984))和短芽孢杆菌(Bacillus brevis)。合适的酵母实例包括，酿酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)AH22、AH22R-、NA87-11A、DKD-5D、20B-12，粟酒裂殖酵母(Schizosaccaromyces pombe)NCYC1913、NCYC2036，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)。合适的动物细胞实施例包括，猴COS-7细胞、Vero细胞、中国仓鼠卵巢细胞(下文中缩写为CHO)、中国仓鼠卵巢细胞dhfr基因缺陷型(下文缩写为CHO(dhfr-))、小鼠L细胞、小鼠AtT-20细胞、小鼠骨髓瘤细胞、大鼠GH3细胞、人FL细胞以及HEK293细胞。
上述宿主细胞的转化可以按照本领域内已知的方法来完成。典型的用于转化宿主细胞的方法在下述文献中进行了描述：Proc.Natl.Acad.Sci.USA69，2110(1972)；Gene 17，107(1982)；Molecular & General Genetics 168，111(1979)；Methods in Enzymology 194，182-187(1991)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75，1929(1978)；Cell Technology(Suppl.8)New Cell TechnologyExperimental Protocol 263-267(1995)(Shujunsha)；以及Virology 52，456(1973)。
当用编码本发明肽的基因转化植物从而获得转基因植物时，该基因可以通过例如以下手段导入植物，电穿孔法、衣杆菌(Agrobacterium)法、粒子枪法或PEG法。举例来说，采用电穿孔法时，基因是在一个装备有脉冲控制器的电穿孔仪中，于500～600V以及100μF作用20msec的条件下导入宿主的。
使用农杆菌方法时，转基因植物可通过如下步骤获得，将植物表达载体构建入适宜的农杆菌如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中，然后在无菌条件下按照如真空浸润法(在Bechtold et al.，C.R.Acad.Sci.Ser.III Sci.Vie，316，1194-1199(1993)中描述的)，侵染宿主的叶片段。
使用粒子枪方法时，可以直接使用植物体、植物器官(如叶片、花瓣、茎、根和种子)以及植物组织(如上皮、韧皮部、薄壁组织、木质部和维管束)，或使用从其中制备的节段或原生质体。如此制备的样品接着用基因转移仪处理(例如，BIOLISTIC POS 1000/He，BioRad)。这种处理通常是在约1000～1100psi压力下进行约5～10cm距离；不过，处理条件可根据植物和样品来变化。
此外，可用于转化的植物可以是针叶类、阔叶类树木、双子叶、单子叶植物等等任何一种。
将重组载体导入细菌如大肠埃希氏菌的方法没有特别的限制，只要其能够成功地将DNA导入选择的细菌。例如，可以使用钙离子法(Cohen，S.N.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69，2110(1972))及电穿孔法。
用酵母作宿主时，其中用于导入重组载体的方法也没有特别限制，只要该法能够成功将DNA导入酵母。例如，可以使用电穿孔法、原生质球法及乙酸锂法。
用动物细胞作宿主时，其中用于导入重组载体的方法也没有特别限制，只要其能够成功将DNA导入动物细胞。例如，可以使用电穿孔法、磷酸钙法及脂转染法。
用昆虫细胞作为宿主时，用于导入重组载体的方法也没有特别限制，只要其能够成功将DNA导入昆虫细胞。例如，可以使用磷酸钙法、脂转染法及电穿孔法。
基因导入宿主可通过如PCR法、Southern杂交法以及Northern杂交法来确证。例如，从转化子制备DNA然后设计DNA特异引物来进行PCR。进行PCR的条件与用于制备上述质粒的条件相似。然后，将扩增产物进行如琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳，用溴化乙啶、SYBR绿溶液等染色。检测到单一泳带的扩增产物说明转化成功。扩增产物还可以通过用荧光染料等标记引物进行PCR来预先检测。此外，扩增产物可以被固定在固相基质如微孔板上，然后用荧光或酶反应来鉴定。
本发明的肽可通过培养上述转化子、产生并积累肽然后收集肽的过程来制备。在本发明的上下文中，肽通过培养来积累，其形式不仅可以是培养上清，也可以是任何形式的培养的细胞、培养的细菌细胞，或是细胞或细菌的裂解产物。本发明中，用于培养转化子的方法没有特别限定，任何常规用于培养宿主的方法都可以使用。
举例来说，当宿主是微生物时，如大肠埃希氏菌或酵母，培养基既可以是天然培养基也可是合成培养基，只要其含有碳源、氮源、矿物质等可被微生物代谢的物质，并能有效培养转化子。作为碳源的例子包括碳水化合物如葡萄糖、果糖、蔗糖以及淀粉；有机酸如乙酸和丙酸；以及醇类如乙醇和丙醇。作为氮源的例子包括氨、无机或有机酸的铵盐如氯化铵、硫酸铵、乙酸铵和磷酸铵；其它含氮化合物；以及蛋白胨、肉汁和玉米浆。作为矿物质的例子包括，磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜以及碳酸钙。培养通常在由振荡培养、通气搅拌培养等形成的有氧条件下进行。宿主是大肠埃希氏菌时，培养在大约15～43℃进行约12～48h。当宿主是芽孢杆菌属细菌时，培养在大约30～40℃进行约12～100h。当宿主是酵母时，培养在大约20～35℃进行约24～100h。如果必要，可对培养进行通风和搅拌。当要求调节pH时，常规采用无机或有机酸、碱溶液等进行。
当利用诱导性启动子作为重组表达载体的启动子时，用于含有该表达载体的转化子的培养基可根据需要添加诱导物。例如，当所用表达载体包含T7启动子时，可以在培养基中另外添加入IPTG等进行培养。此外，当所用表达载体包含可被吲哚乙酸(IAA)诱导的trp启动子时，可将IAA等加入培养基。
培养利用动物细胞作为宿主所获得的转化子时，合适的培养基有通常使用的RPMI1640培养基、DMEM培养基或是在其中补充了胎牛血清的此类培养基。培养一般是在约5％二氧化碳中，在37℃进行1～30天。
当本发明中的肽通过细胞培养产生时，蛋白粗提物可通过例如，包括以下步骤的方法来获得：用本领域内已知的方法收集细胞；在适宜的缓冲液中悬浮；通过如超声波、溶菌酶、和/或冻融法破碎细胞；然后离心并/或过滤。缓冲液可以包括蛋白变性剂，如尿素和盐酸胍，以及表面活性剂如Triton X-100。当肽分泌到培养基中的情况下，在培养后利用本领域已知的方法收集培养上清液并使之与细胞分离。包含在上清液中的蛋白质或因此获得的提取物，可通过恰当地结合使用本领域内已知的分离/纯化方法来进行纯化。也就是说，所感兴趣的蛋白可单独或恰当地结合使用如硫酸铵沉淀、凝胶层析、离子交换层析以及亲和层析来纯化。
由此获得的本发明肽可通过本领域内已知的方法或那些与已知方法相似的方法转变为盐类。同样地，肽以盐的形式获得后，利用本领域内已知的方法或那些与已知方法相类似的方法，可将之转变为自由形式或另一种盐的形式。此外，由转化子产生的蛋白，可以根据需要在纯化前或纯化后，用适宜的蛋白修饰酶如胰蛋白酶和糜蛋白酶处理成片断。另外，蛋白可通过用蛋白修饰酶如激酶处理而进行修饰。本发明蛋白或其盐形式在样品中的存在，可通过各种结合试验、使用特异性抗体的酶免疫检测等方法来确定。
本发明的药物组合物或用于癌症治疗的药物组合物阐述如下。本发明的药物组合物或用于癌症治疗的药物组合物含有本发明的肽或用于治疗癌症的肽。本发明的药物组合物或用于癌症治疗的药物组合物除了本发明的肽或用于治疗癌症的肽外，还含有药物可接受的载体。本发明的肽的含量，是根据能够抑制癌细胞生长、减少癌细胞数目、或受试病人用药后表现疗效所需的量来确定的。对病人的用药剂量通常是根据病人的体表面积、体重、征兆等来确定的。动物和人之间剂量的相互关系是本领域内所熟知的，而病人的体表面积可以从病人的身高和体重来测定。
本发明中肽的适宜剂量可在约0.1mg/kg～约0.5mg/kg范围内。剂量优选根据用药方法和赋型剂的量来变化；当其它治疗方法如其它抗癌药和放疗与该肽联合使用时，剂量还会改变。
本发明的药物组合物或用于癌症治疗的药物组合物可以非肠道方式用药，例如，皮下、腹膜内、肌肉内或静脉内方式。肠道内用药的药物制剂具体实例可包括，含约5％葡萄糖或其它药用赋形剂以及本领域内已知在等渗盐溶液中使用的活化剂的水溶液。增溶剂如环糊精和其它本领域内已知的增溶剂，是可添加的赋形剂实例。
本发明的药物组合物或用于癌症治疗的药物组合物可利用常规技术，采用本领域已知的其它方法掺入用于给药的药物制剂中。举例来说，药物组合物或用于癌症治疗的药物组合物可掺入用于口服给药的药物制剂如胶囊、凝胶或片剂中。胶囊由本领域内已知的药物可接受材料如明胶或纤维素衍生物组成。片剂可通过将本发明的肽和固相载体以及润滑剂混合后，利用本领域内已知的方法压制而成。适宜的固相载体实例包括淀粉和糖皂土。本发明的肽可以如下方式给药，如含有乳糖或甘露醇作为粘合剂、并含有已知的填充材料和/或片成形剂的硬壳片剂形式，或为胶囊的形式。
含有本发明的肽或用于治疗癌症的肽的药物组合物或用于癌症治疗的药物组合物，可用于治疗各种癌症，如胃癌、结肠直肠癌、肺癌、卵巢癌、肝癌和胰腺癌。本发明的药物组合物或用于癌症治疗的药物组合物当导入癌细胞后，所含的肽或用于治疗癌症的肽确信可以抑制癌细胞的血管新生，并由于有该抑制作用可阻止癌细胞的增殖。
本发明的药物组合物或用于癌症治疗的药物组合物的抗癌活性，可通过以下过程来评估，在动物如小鼠中产生癌症，然后将药物组合物或用于癌症治疗的药物组合物对该动物给药，继而检查癌的消失。
另一个实施方案中，本发明的药物组合物或用于癌症治疗的药物组合物可包含含有编码本发明肽或用于治疗癌症的肽的DNA的基因。
本发明的药物组合物或用于癌症治疗的药物组合物可以采用非病毒载体或病毒载体的剂型来给药。
使用非病毒载体时，编码本发明肽或用于治疗癌症的肽的DNA可采用重组表达载体导入细胞或组织，该载体可通过下述技术将该DNA插入常用的基因表达载体来制备。介导基因进入细胞的方法实例包括，磷酸钙共沉淀法和采用玻璃毛细管的DNA直接注射法。
其它介导基因进入组织的方法实例包括，利用内在型脂质体、静电类脂质体、HVJ-纸质体和改进型HVJ-脂质体(HVJ-AVE脂质体)进行的基因转移法；受体介导的基因转移法；用粒子枪将DNA分子和载体(金属粒子)一起转入细胞的方法；直接转移裸-DNA的方法；以及通过正电荷聚合物介导的转移方法。这里，适宜的表达载体包括pCAGGS(Gene 108，193-200(1991))、pBK-CMV、pcDNA3.1和pZeoSV(Invitrogen，Stratagene)。
适于给药的病毒载体例如有，重组腺病毒和逆转录病毒。具体来讲，可利用含有编码本发明肽的DNA的重组表达载体将基因导入细胞，该DNA插入在有致毒能力的DNA或RNA病毒，如逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、新培斯病毒、仙台病毒、SV40和人免疫缺陷病毒(HIV)中，以便用这些重组病毒感染细胞。
在上述病毒载体中，已知腺病毒的感染效率与其它病毒载体相比是非常高的。从这点来看，腺病毒载体系统是优选使用的。
将本发明中的药物组合物或用于癌症治疗的药物组合物导入病人体有如下方法，即通过直接将药物组合物导入病人体内的体内方法，或是通过体外方法先将药物组合物导入从病人体提取的特定类型细胞中，然后将该细胞返回病人身体。
当本发明的药物组合物通过体内方法给药时，可根据将用于处理的靶体如细胞、组织及靶器官，通过适合的途径来用药。例如，可用静脉内、动脉内、皮下、皮内、肌肉内或直接施入靶癌病灶所在组织的方式来给药。
各种药物剂型(如液体)都适于上述给药形式并可常规使用。例如，在包含DNA作为有效成分的注射剂的情况下，该注射剂可依照常规方法制备，该常规方法是将DNA溶于适当的溶剂(例如，缓冲溶液如PBS、生理盐水和无菌水)，如果必要，使用滤器和其同类物过滤以消毒该溶液，并且随后将溶液充入无菌容器。如果必要，通常使用的载体和其同类物可添加到注射剂中。此外，脂质体，如HVJ-脂质体，可以是脂质体配制剂的形式，例如悬浮液，冷冻的形式，或经离心浓缩的冷冻形式。
另外，为了有助于将基因定位到感染区域附近，可制备缓释剂型(如，微球)以植入到感染区域的邻近地区。也可采用渗透泵或其类似物持续地并缓慢地将基因给到感染区域。
选择性导入癌细胞可通过靶向在癌细胞表面特异表达的癌症抗原或靶向在癌细胞中比在正常细胞中明显高表达的癌症抗原(如，运铁蛋白受体和EGF受体)而获得。
例如，本发明的药物组合物或用于癌症治疗的药物组合物可使用免疫-脂质体特异地导入癌细胞，该免疫-脂质体是通过将包含编码本发明肽的DNA的药物组合物放入与单克隆抗体偶联的脂质体中而获得的，该单克隆抗体抗癌细胞的特定表面抗原。
药物制剂中的DNA含量可根据所治疗的疾病，病人的年龄和体重等等进行适当调整。
本发明的药物组合物或用于癌症治疗的药物组合物可用于治疗各种癌症，如胃癌，结肠直肠癌，肺癌，卵巢癌，肝癌和胰腺癌，该组合物含有包含编码本发明肽，或者治疗癌症的肽的DNA的基因。导入细胞后，相信本发明的药物组合物或用于癌症治疗的药物组合物可产生本发明的肽，该肽抑制癌细胞的血管生成并且因为此抑制作用而抑制癌细胞的增殖。
本发明的肽或治疗癌症的肽可用于治疗上述描述的癌症。用肽进行治疗的动物没有特别限制，并且包括人类和其它哺乳动物，如大鼠，猴，狗，猫，小鼠，豚鼠，仓鼠，家兔，和野兔。
本发明的药物组合物或用于癌症治疗的药物组合物的抗癌活性可通过，例如，使动物如小鼠产生癌症，给药物组合物或治疗癌症的药物组合物，并且检查癌细胞大小的变化来进行评估。
在下文中，将用实施例来更加细致地说明本发明，但是不应直接理解为限制于此。
实施例1
不同的癌细胞株在低氧条件下培养，通过Northern印迹法检测促肾上腺髓质素mRNA的表达。使用低氧培养箱(Wakenyaku Industry)，在低氧条件下癌细胞株在1％的O2浓度中培养12小时。也在20％的O2浓度中进行培养作为对照。培养结束后，从不同的癌细胞株中用TRIZOL试剂(LIFETECHNOLOGIES)抽提RNA。在甲醛-琼脂糖凝胶上电泳RNA(20μg)，并且随后与促肾上腺髓质素特异性探针杂交。结果见图一。
下面列出了这里所使用的癌细胞株
KATO III      胃癌细胞株
HCT116        直肠癌细胞株
DLD1          直肠癌细胞株
KM-12         直肠癌细胞株
PC-6          肺癌细胞株
TAOV          卵巢癌细胞株
PCI-10        胰腺癌细胞株
HepG2         肝癌细胞株
TTOV          卵巢癌细胞株
PCI-19        胰腺癌细胞株
PCI-35        胰腺癌细胞株
PCI-43        胰腺癌细胞株
BxPC-3        胰腺癌细胞株
KMP-2         胰腺癌细胞株
图1描述了从不同癌细胞株中抽提的RNA的Northern印迹分析结果，显示28S的部分与促肾上腺髓质素特异的探针反应。如图1所示，在低氧(1％氧气)浓度下培养的癌细胞(在图1中用H表示)中，促肾上腺髓质素mRNA与正常氧(2％氧气)浓度下培养的癌细胞(在图1中用N表示)中的mRNA相比，有所增加。这一趋势在胰腺癌细胞中尤其显著。
实施例2
在CB17lcr-scid J1小鼠(CLEA JAPAN Inc.)的背侧皮下植入107PCI-43细胞。已证实PCI-43细胞增殖会形成肿瘤，并且7天后肿瘤直径超过5mm。经过这一确认后，促肾上腺髓质素和本发明的肽(溶于0.1ml生理盐水)各50μg，分别从第七天起每天一次地注入肿瘤直到第16天。由SEQ ID NO：2组成的肽用作本发明的肽(在下文中也指“促肾上腺髓质素拮抗剂”)这一肽从Wako Pure Chemical Industries，Ltd购买。
肿瘤直径每三天肉眼观测。结果见图2，该图显示促肾上腺髓质素、促肾上腺髓质素拮抗剂和生理盐水(V3)各自给药的肿瘤大小。横轴代表植入PCI-43细胞后的天数，纵轴代表肿瘤体积(mm3)的大小。图上部的箭头表示促肾上腺髓质素、促肾上腺髓质素拮抗剂和生理盐水的给药时间。每组使用五只CB17lcr-scid J1小鼠。
如图2清楚显示的，在第7天到第16天于促肾上腺髓质素拮抗剂给药的组里，肿瘤尺寸变小并且在第21天时变得几乎肉眼不可见。相反地，在促肾上腺髓质素-和生理盐水-给药组里，肿瘤尺寸几乎没变。
实施例3
在CB17lcr-scid J1小鼠(CLEA JAPAN Inc.)的背侧皮下植入107PCI-43细胞。已证实PCI-43细胞增殖会形成肿瘤，并且7天后肿瘤直径超过5mm。经过这一确认后，促肾上腺髓质素和促肾上腺髓质素拮抗剂(溶于0.1ml生理盐水)各50μg，分别从第七天起每三天一次地注入肿瘤，即，第7天，第10天，第13天和第16天。这里使用的促肾上腺髓质素和促肾上腺髓质素拮抗剂与实施例1中使用的那些相同。
第21天时处死小鼠，摘出肿瘤并称重。摘出的肿瘤照片见图3，肿瘤称重结果见图4。
从图3清晰可见，在促肾上腺髓质素拮抗剂给药组中，肿瘤尺寸与促肾上腺髓质素给药组相比，变小了。此外，如图4清晰显示的，在促肾上腺髓质素给药组中的肿瘤重量约为0.05g，而促肾上腺髓质素拮抗剂给药组中约为0.03g，其减少到促肾上腺髓质素给药组的大约一半。
实施例4
检测了本发明肽对血管新生的作用。实验在实施例3中使用的小鼠的肿瘤组织上进行。摘出小鼠的肿瘤组织，用抗CD31的抗体对CD31抗原进行染色，该抗原是血管内皮细胞特异的细胞表面标记。染色按照下述方法进行。使用5只小鼠进行实验。
液氮冷冻肿瘤组织以制备冷冻切片。冷冻切片在白蛋白溶液中预处理30分钟，然后用过氧化氢抑制内源性过氧化物酶的活性，然后，用抗CD31的抗体室温处理切片1小时。漂洗后，用二抗处理切片1小时，用ECL(Amersham)显色。
染色结果见图5。来自促肾上腺髓质素给药组小鼠的肿瘤组织染色结果见图5的左侧部分，而促肾上腺髓质素拮抗剂给药小鼠的肿瘤组织染色结果见右侧部分。在图5中，染成棕色的区域代表新生成的血管。从图5清晰可见，促肾上腺髓质素给药组中，新生成粗的血管，而在促肾上腺髓质素拮抗剂给药组中，新生成的血管是细的，证明了对血管生成的抑制。
其次，任意选择实施例4中使用的血管内皮细胞的100根新生血管，来测量它们各自的直径。表1中，新生血管根据其直径分为三组(小于2μm，2μm到8μm之间以及8μm或更大)，各组的数目以及血管直径的平均值和标准偏差一同展示。表1中，AM代表促肾上腺髓质素，AMA代表促肾上腺髓质素拮抗剂。
                         表1
                血管数目   平均值±标准偏差
  小于2μm   2μm～小于8μm   8μm或更多
  AM   15   54   31   6.454±5.313
  AMA   55   44   1   2.276±1.120
如表1中明确显示的，在使用了促肾上腺髓质素拮抗剂的小鼠中，血管直径变小，几乎没有一根血管具有显著大的直径，此外还显示出了对血管新生的抑制。另外，在使用了促肾上腺髓质素拮抗剂的小鼠中，血管直径只有那些促肾上腺髓质素给药小鼠的一半。
实施例5
测定本发明肽对细胞增殖的影响。用抗-增殖细胞核抗原(PCNA)抗体对实施例2中所用小鼠肿瘤细胞的PCNA染色。染色方法与实施例4相同。实验中使用5只小鼠。结果显示于图6。施用促肾上腺髓质素的小鼠肿瘤细胞的染色结果显示于图6的左边，促肾上腺髓质素拮抗剂给药小鼠的结果显示于右边。
如在图6中明确看到的，很多与抗-PCNA抗体反应的细胞存在于促肾上腺髓质素给药组中，在促肾上腺髓质素拮抗剂给药组中只有很少细胞与抗-PCNA抗体反应。PCNA-标记指标在促肾上腺髓质素给药组和促肾上腺髓质素拮抗剂给药组中分别为25.8±3.9和6.3±5.2。因此，与促肾上腺髓质素给药小鼠相比，促肾上腺髓质素拮抗剂给药小鼠中的增殖细胞减少了约1/4。
如上所详细描述的，本发明肽抑制癌细胞的血管新生，并且由于此抑制作用而阻止了细胞增殖。因此，本发明肽可用于治疗各种癌症，诸如胃癌、结肠直肠癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、以及胰腺癌。
序列表
<110>株式会社康福来(Oncorex，Inc.)
<120>用于治疗癌症的肽及含有该肽的药物组合物
<130>PCTF149
<140>
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<150>JP 2002-075575
<151>2002-03-19
<160>2
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>52
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys
  1               5                  10                  15
Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln
             20                  25                  30
Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser
         35                  40                  45
Pro Gln Gly Tyr
     50
<210>2
<211>31
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp
  1               5                  10                  15
Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr
             20                  25                  30

Claims (31)

1.一种包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中从N-末端缺失了至少一个氨基酸。
2.一种包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中从N-末端缺失了1～25个氨基酸。
3.一种包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中从N-末端缺失了1～20个氨基酸。
4.一种包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中从N-末端缺失了1～15个氨基酸。
5.一种包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中从N-末端缺失了1～10个氨基酸。
6.一种包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的肽，其中从N-末端缺失了1～5个氨基酸。
7.权利要求1～6之一的肽，其中从C-末端缺失了1～10个氨基酸。
8.权利要求1～6之一的肽，其中从C-末端缺失了1～5个氨基酸。
9.权利要求1～8之一的肽，其中的氨基酸有部分缺失、替换或添加。
10.权利要求1～9之一所述肽的酰胺或酯或盐。
11.一种用于癌症治疗的肽，其包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列且从N-末端缺失了至少一个氨基酸。
12.一种用于癌症治疗的肽，其包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列且从N-末端缺失了1～25个氨基酸。
13.一种用于癌症治疗的肽，其包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列且从N-末端缺失了1～20个氨基酸。
14.一种用于癌症治疗的肽，其包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列且从N-末端缺失了1～15个氨基酸。
15.一种用于癌症治疗的肽，其包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列且从N-末端缺失了1～10个氨基酸。
16.一种用于癌症治疗的肽，其包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列且从N-末端缺失了1～5个氨基酸。
17.权利要求1～16之一所述用于癌症治疗的肽，其从C-末端缺失了1～10个氨基酸。
18.权利要求1～16之一所述用于癌症治疗的肽，其从C-末端缺失了1～5个氨基酸。
19.权利要求1～8之一所述用于癌症治疗的肽，其有氨基酸的部分缺失、替换或添加。
20.权利要求11～19之一所述用于癌症治疗的肽的酰胺或酯或盐。
21.权利要求11～19之一所述用于癌症治疗的肽，其中所述癌症是胃癌、结肠直肠癌、肺癌、卵巢癌、肝癌或胰腺癌。
22.权利要求20所述用于癌症治疗的肽的酰胺或酯或盐，其中所述的癌症是胃癌、结肠直肠癌、肺癌、卵巢癌、肝癌或胰腺癌。
23.一种基因，其DNA具有编码权利要求1～9之一所述肽、或权利要求11～19之一所述用于癌症治疗的肽的核苷酸序列。
24.一种重组载体，含有编码权利要求1～9之一所述的肽、或权利要求11～19之一所述用于癌症治疗的肽的DNA。
25.一种转化子，含有权利要求24的重组载体。
26.一种用于产生权利要求1～9之一所述的肽、或权利要求11～19之一所述用于癌症治疗的肽的方法，其中的方法包括如下步骤：培养权利要求25的转化子；产生并积累权利要求1～9之一所述的肽、或权利要求11～19之一所述用于癌症治疗的肽；收集该肽。
27.一种药物组合物，含有权利要求1～9之一所述的肽，或权利要求10所述肽的酰胺、酯或盐。
28.一种用于癌症治疗的药物组合物，含有权利要求1～9之一所述的肽，或权利要求10的肽的酰胺、酯或盐。
29.权利要求28的用于癌症治疗的药物组合物，其中的癌症是胃癌、结肠直肠癌、肺癌、卵巢癌、肝癌或胰腺癌。
30.一种药物组合物，其包含基因，该基因含有编码权利要求1～9之一所述的肽、或权利要求11～19之一所述用于癌症治疗的肽的DNA。
31.一种用于癌症治疗的药物组合物，其包含基因，该基因含有编码权利要求1～9之一所述的肽、或权利要求11～19之一所述用于癌症治疗的肽的DNA。
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