CN1816564A - 能选择性杀伤癌细胞的RasGAP衍生肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及能增强药物选择性地杀伤细胞的能力的肽，它存在于RasGAP蛋白的N2序列，它的片段，或它的变体上。另外，本发明涉及药用组合物，作为活性物质，它包括药用有效量的所述肽。

Description

能选择性杀伤癌细胞的RasGAP衍生肽
技术领域
本发明涉及能增强药物选择性地杀伤癌细胞能力的肽。另外，本发明涉及药用组合物，它包括作为活性物质的药用有效量的至少一种所述肽。
背景技术
肿瘤是多样化的和不同种类的，不过，都具有不受控制地增殖的能力。不受控制的细胞增殖与受到抑制的细胞凋亡灵敏性相关，构成了发生肿瘤演变的最低要求。
细胞凋亡是细胞进入编程的细胞死亡的过程，它是在发育过程中发生的一种重要现象，并且是保持体内平衡所必须的。被认为不可避免地让细胞进入细胞凋亡的生物化学事件是半胱氨酸蛋白酶(caspases，能裂解天冬氨酸残基后面的位点)的激活。发生细胞凋亡的细胞表现出特有的形态学和生物化学变化，包括细胞膜起泡，细胞变圆，染色质凝聚，DNA分裂，细胞凋亡标记在细胞表面上的表达，和抗-细胞凋亡信号的传导途径的抑制。所有这些事件都可能被特殊的半胱氨酸蛋白酶抑制剂抑制。因此，半胱氨酸蛋白酶底物的裂解决定了在细胞凋亡期间观察到的特殊特性变化的大部分(如果不是全部的话)。
细胞凋亡的执行阶段是当半胱氨酸蛋白酶底物在细胞中被裂解时启动的。业已鉴定了多种半胱氨酸蛋白酶底物，并且这些底物的清单正在稳定的加长(Earnshaw W.C.等，“哺乳动物半胱氨酸蛋白酶：结构，激活，底物，和在细胞凋亡期间的功能”Annu.Rev.Biochem.68，383，1999)。半胱氨酸蛋白酶底物一旦裂解，就会导致在细胞凋亡期间出现的生物化学和形态学事件，如半胱氨酸蛋白酶激活的放大，DNA分裂，细胞核降解等。
另外，业已证实促细胞分裂剂-激活的蛋白激酶(MAPK)途径能以正面或负面的方式调控细胞凋亡(Jarpe M.B.等，“抗-细胞凋亡与促-细胞凋亡信号传导：死亡途径上的检验点和终止信号”Oncogene，17，1475，1998；Widmann C.等，“促细胞分裂剂-激活的蛋白激酶：从酵母到人类的三种激酶模块的保守性”Physiol.Rev.79，143，1999)。这可以解释所述细胞凋亡半胱氨酸蛋白酶为什么靶定调控MAPK的某些信号传导蛋白和/或是MAPK途径的成分(Widmann C.等，“在细胞凋亡期间半胱氨酸蛋白酶-决定型信号蛋白的裂解。抗-细胞凋亡信号的支路机制”J.Biol.Chem.，273，7141，1998)。所述蛋白包括MEKK1，PAK2，Mst1和RasGAP。
最近，Yang和Widmann(Yang J.-Y.和Widmann C.，“通过半胱氨酸蛋白酶-诱导的RasGAP裂解产生的抗细胞凋亡信号”Mol.Cell.Biol.，21，5346，2001；“一种类型的半胱氨酸蛋白酶底物起着细胞凋亡的两种不同面目的作用”Eur.Cytokine Netw.，13，387，2002a；“通过半胱氨酸蛋白酶裂解产生的RasGAP N-末端片段能以Ras/PI3K/Akt-决定型方式保护细胞，它不取决于NFκB”J.Biol.Chem.，277，14641，2002b)业已证实了RasGAP，和Ras和Rho GTP-结合蛋白的调节剂是不常见的半胱氨酸蛋白酶底物，因为它可以诱导抗-和促-细胞凋亡信号，这取决于它对半胱氨酸蛋白酶裂解的程度。它们业已证实，在低水平的半胱氨酸蛋白酶活性下，RasGAP在455号位置上裂解，产生N-末端序列(序列N)和C-末端序列(序列C)。
序列C，而不完整长度的RasGAP在HeLa细胞中诱导了强的细胞凋亡反应，正如通过它诱导固缩细胞核的出现，半胱氨酸蛋白酶3的激活，和PARP的裂解能力所证实的。
在同一项研究中，作者还证实了序列N，不是促进细胞死亡，而似乎是半胱氨酸蛋白酶激活的细胞凋亡下游的通用抑制剂。在较高水平的半胱氨酸蛋白酶活性上，序列N阻碍细胞凋亡的能力当它在157号位置上被裂解时受到抑制。后一种裂解事件产生两种序列，N1和N2，这些序列与序列N不同，业已证实能使细胞敏化，它可以产生向细胞凋亡发展的高的半胱氨酸蛋白酶活性，它是通过顺氯氨铂诱导的，这是用于化疗的治疗癌症的药物。
不过，Leblanc等(Leblanc V.等，“Ras-GTPase激活了蛋白抑制剂，特别是诱导肿瘤细胞的细胞凋亡的蛋白抑制剂”Oncogene，18，4884，1999)业已证实注射针对RasGAP的N2序列的SH3结构域的单克隆抗体，以便抑制这种蛋白，在癌细胞中专一性地诱导了细胞凋亡。从专利申请WO99/65947(Parker等)中还了解到针对RasGAP SH3-结构域-结合蛋白，G3BP的单克隆抗体，在癌细胞中诱导了细胞凋亡。其中，G3BP是专一性地超量表达的。
以上结果似乎表明，RasGAP途径通过RasGAP SH3结构域调控生长，它是某些癌细胞存活所必须的。以上发现似乎与Yang和Widmann获得的结果相反，并因此得出这样的结论，RasGAP SH3结构域在细胞中诱导和调控细胞凋亡的功能方面具有相当矛盾的功能。
化疗本身或与其他治疗(例如放射治疗)的组合是目前用来治疗癌症的最常见的和最有效的治疗工具之一。用于治疗癌症的化疗中的药物的效力取决于它们杀伤癌细胞的能力。不过，这些药物的使用存在限制，原因是，它们还可能对正常细胞，非癌细胞产生负面影响，因为它们不仅能在癌细胞中诱导强的半胱氨酸蛋白酶刺激，而且还能在正常细胞，非癌细胞，特别是快速分裂的细胞中诱导这种作用。
因此，对临床医生提出的挑战是选择药物的剂量，该剂量要高大到足以消除肿瘤，而且又不会高到在患者体内诱导严重的副作用，如脱发，恶心和呕吐，心脏毒性和继发性癌症。
改善药物对癌细胞的选择性，显然能加强化疗治疗的效力，从而可以使用较低剂量的药物，由此还可导致尽可能地降低上面所列举的严重的副作用。
因此，本发明的目的是提供改善了的方法，它与药物组合用于治疗或预防癌症，它不具有上述缺陷。
发明内容
这一目的业已通过提供主要包括RasGAP蛋白的N2序列的肽，它的片段，或它的变体而实现，它能增强药物选择性地杀伤癌细胞的能力。
另外，本发明提供了编码所述肽的纯化的和分离的核酸序列，包括至少一个拷贝的纯化的和分离的核酸序列的表达载体，和包括所述肽的真核或原核宿主细胞，分离的和纯化的核酸序列和/或所述表达载体。
本发明还提供了药用组合物，它包括药用有效量的至少一种本发明的肽作为活性物质。
附图说明
图1表示通过各种药物在用片段N2或空的pcDNA质粒转染过的HeLa细胞中细胞凋亡诱导的百分比。
将HeLa细胞(2×106)铺平到直径为10-cm的陪替氏培养皿中，用1μg的GFP-表达质粒(标记转染过的细胞)与2μg的空的pcDNA3质粒或2μg的编码片段N2的pcDNA3载体一起转染。在转染一天之后，用所标浓度的顺氯氨铂，阿霉素或米托蒽醌培养细胞24小时。然后统计表现固缩的细胞核的GFP-阳性细胞的数量。
结果反映出三次独立测定的平均值±标准误差。星号表示对照细胞和用顺氯氨铂处理过的细胞之间的显著差异(*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001)。
图2A是用于本研究的不同构建体的示意图。
SH表示Src同源结构域。
图2B表示在用编码图2A所示构建体的质粒转染的HeLa细胞中通过顺氯氨铂诱导的细胞凋亡诱导的百分比。
按图1所示用编码图2A所示的构建体的质粒转染HeLa细胞。然后用0.15μM顺氯氨铂处理HeLa细胞，或者不处理，20小时之后测定细胞凋亡程度。结果反映三次独立测定的平均值±标准误差。星号表示用0.15μM顺氯氨铂处理过的细胞和没有处理过的细胞之间的显著差异(**，p＜0.01；***，p＜0.001)。
图3表示与FITC-标记的TAT-RasGAP317-326肽一起培养的活细胞的相差和落射荧光图像。
在37℃，5％CO2的条件下，在含有20μM FITC-标记的TAT-RasGAP317-326肽的培养基中培养以下细胞系(HeLa，U2OS，H-Mesol，MCF-7，HaCat和HUV-EC-C)3小时，然后用培养基洗三次。
图4A表示在用TAT-RASGAP317-326处理或未处理过的癌细胞中各种药物进行细胞凋亡诱导的百分比。
在没有或有20μM TAT-RasGAP317-326的条件下，将两个非癌细胞系(HaCat和HUV-EC-C)与浓度逐渐增加的顺氯氨铂，阿霉素和米托蒽醌一起培养。20小时之后评估细胞凋亡程度。
图4B表示在用或不用TAT-RASGAP317-326处理过的四种癌细胞系中各种药物进行细胞凋亡诱导的百分比。
将四种癌细胞系(HeLa，U2OS，MCF-7，和H-Mesol)铺平到6-孔平板上，并且在有或没有20μM HIV-TAT48-57或TAT-RasGAP317-326肽的条件下用所标明浓度的顺氯氨铂，阿霉素和米托蒽醌处理20小时。然后统计表现出固缩的细胞核的细胞的数量。结果相应于三次独立测定的平均值±标准误差。星号表示与TAT-RasGAP317-326一起培养的基因毒素-处理过的细胞和未处理过的或者与HIV-TAT48-57肽一起培养的细胞之间的显著差异(**，p＜0.01；***，p＜0.001)。
图5A表示在用顺氯氨铂处理过的U2OS细胞中在存在HIV-TAT48-57或TAT-RasGAP317-326肽的条件下的NFκB活性
将U2OS细胞(1×105)铺平到6孔平板上，并且用1μg的NFκB活性的荧火虫荧光素酶报道质粒和0.1μg的编码Renilla荧光素酶的质粒转染。一天之后在有或没有20μM HIV-TAT48-57或TAT-RasGAP317-326肽的条件下用所标明浓度的顺氯氨铂处理20小时。数据表示相对Renilla荧光素酶活性标准化了的火虫荧光素酶活性，并且表示为在对照未处理过的细胞中获得的基础NFκB活性的增加倍数。结果相应于三次独立测定的平均值±标准误差。星号表示所标明的条件之间的显著差异(**，p＜0.01；***，p＜0.001)。
图5B表示在存在HIV-TAT48-57肽和IκBαΔN2或TAT-RasGAP317-326肽和IκBαΔN2的条件下在用顺氯氨铂处理过的U2OS细胞中的NFκB活性。
用1μg的NFκB活性的荧火虫荧光素酶报道质粒，0.1μg的编码Renilla荧光素酶的质粒，0.5μg的GFP-表达质粒(标记转染过的细胞)，1μg的编码能抑制NFκB途径的IκBαΔN2的质粒或用1μg的空的pcDNA3载体转染U2OS细胞。培养所述细胞一天之后，在存在20μM HIV-TAT48-57或20μM TAT-RasGAP317-326的条件下，用浓度逐渐加大的顺氯氨铂再处理20小时。然后裂解所述细胞，并且按图A所示评估NFκB活性，所不同的是，结果是以在与对照HIV-TAT48-57肽一起培养的细胞中检测到的NFκB活性的增加倍数表示的。
图5C表示图5A和B所示转染细胞的细胞凋亡百分比
选择性地，测定了表现出固缩的细胞核的GFP-阳性细胞的数量。结果相应于三次独立测定的平均值±标准误差。
图6表示用HIV-TAT48-57或TAT-RasGAP317-326肽转染并且用顺氯氨铂处理过的U2OS细胞western印迹和JNK磷酸化的百分比。
将U2OS细胞(2×105)放置在6孔平板上，并且用所标明的HIV-TAT48-57或TAT-RasGAP317-326肽(浓度为20μM)和顺氯氨铂(浓度为30μM)的组合处理所标明的时间。在分别用1μg/ml茴香霉素刺激所述细胞3小时和用0.5M山梨糖醇刺激所述细胞30分钟之后获得了JNK和p38激活的阳性对照。在印迹中所表示的定量是对12小时的带进行的，并且相对所述阳性对照统一化。结果相应于三次独立实验的平均值±标准误差。
发明的详细说明
在本文中，术语“肽”，“蛋白”，“多肽”，“模拟多肽”和“模拟肽”可交替地用于表示通过相邻的残基之间的α-氨基和羧基之间的肽键彼此连接在一起的一系列的氨基酸残基。
RasGAP，Ras和Rho GTP-结合蛋白的调节剂，是非常规的半胱氨酸蛋白酶底物，因为它能诱导抗-和促-细胞凋亡信号，这取决于它被半胱氨酸蛋白酶裂解的程度。在低水平的半胱氨酸蛋白酶条件下，RasGAP是在455号位置上裂解的，产生了N-末端片段(片段N，大约为56kD)和C-末端片段(片段C，大约为64kD)。片段N似乎是半胱氨酸蛋白酶激活的细胞凋亡下游的通用抑制剂(Yang J.-Y.和Widmann C.，Mol.Cell.Biol.，21，5346，2001和J.Biol.Chem.，277，14641，2002b)。在高水平的半胱氨酸蛋白酶活性下，片段N在157号位置上进一步裂解，由此产生了两种片段，N1(1-157号氨基酸)和N2(158-455号氨基酸)。
“癌细胞”表示在动物体内产生的细胞，这些细胞能够进行不受欢迎的不受控制的细胞生长或不正常的持续存在或不正常的入侵组织。该术语中的体外还表示能永久性地永生化的细胞系，能建立无限增殖的细胞培养物，并且在提供合适的新的培养基和空间的条件下能够以不受控制的方式增殖。
术语“药物”表示能够杀伤哺乳动物细胞，优选人类细胞的药物。存在来自不同来源的并且具有不同作用模式的若干种类型的药物。
本发明的药物涉及来自或者优选调控宿主生物学过程的制剂。干扰素，肿瘤生长因子，肿瘤坏死因子，生长因子如GM-CSF和G-CSF和白细胞间介素如白细胞间介素-2，白细胞间介素-6，白细胞间介素-7和白细胞间介素-12是目前用于癌症治疗中的所述生物学药物的例子。
本发明的药物还可以涉及能破坏DNA和/或抑制细胞繁殖的制剂，如基因毒素。基因毒素可选自下列一组：烷基化剂，抗代谢物，DNA裂解剂，DNA连接剂，拓扑异构酶抑制剂和纺缍体抑制剂。
烷基化剂的例子包括环己亚硝脲，双氯乙基亚硝脲，链脲霉素，二氯甲基二乙胺，苯丙氨酸氮芥，尿嘧啶氮芥，苯丁酸氮芥，环磷酰胺，异环磷酰胺，顺氯氨铂，卡波铂，丝裂霉素，硫化三环氮丙基磷，达卡巴嗪(dacarbazin)，甲基苄肼，六甲三聚氰胺，乙撑三聚氰酰胺，二甲磺酸丁酯，双溴丙基哌嗪，邻氯苯对氯苯二氯乙烷和其他锌铜合金衍生物。
DNA裂解剂的例子是博来霉素。
拓扑异构酶抑制剂可选自下列一组：拓扑替康，依立替康，喜树碱钠盐，多柔比星(daorubicin)，亚德里亚霉素，伊达红菌素，米托蒽醌替尼泊苷，阿霉素会议依托泊苷。
DNA连接剂的例子是放线菌素D和光辉霉素，而纺缍体抑制剂可选自下列一组：长春花碱，长春新碱，去甲长春花碱，紫杉醇和多烯紫杉醇。
可以使用的药物和抗代谢物可选自下列一组的化合物：甲氨喋呤，三甲氧苯氨喹唑啉，脱氧助间型霉素，阿糖胞嘧啶，ara-CMP，硫酸氟达拉宾，羟基脲，氟尿嘧啶，氟尿嘧啶脱氧核苷，克拉屈滨，吉西他滨，硫代鸟嘌呤和6-咪唑硫嘌呤。
优选将基因毒素，更优选将顺氯氨铂，米托蒽醌和阿霉素用作本发明的药物。
这些药物可以单独使用或者彼此组合使用。在使用一种以上药物的场合下，药物的有用组合的确定属于本领域技术人员的技能范围，并且取决于，例如，要杀伤的癌细胞。
在本文中，术语“增强”表示肽增强药物杀伤细胞的作用的能力。这种能力可以在体外测定，例如，测定与肽接触，并且用至少一种药物处理的细胞的细胞凋亡百分比，包括统计具有固缩细胞核的细胞数量(细胞凋亡细胞的标记)。通常将上述结果与来自药物处理过的细胞的不包括所述肽的结果进行比较。肽能在特定浓度下导致细胞的细胞凋亡增加两倍或两倍以上，或者将诱导特定细胞凋亡反应的药物的剂量降低至少两倍，这样的肽被认为能增强药物杀伤细胞的能力。
在本文中，术语“选择性”表示本发明的肽能在特定浓度下增强药物杀伤细胞的能力，特别是杀伤癌细胞，但是，令人吃惊的是不会杀伤非癌细胞。
所述肽能增强药物在癌细胞中的选择性地杀伤细胞的能力的体外药物的浓度范围通常取决于所使用的药物。例如，在使用基因毒素的场合下，体外药物的浓度为0.1至100μM，优选0.15至30μM。
RasGAP蛋白的N2序列优选来自人，并且涉及由297个氨基酸组成的36kD的蛋白，如图2A所示，它包括两个SH2结构域和一个SH3结构域。
一般，Src同源性2(SH2)结构域与磷酸化的酪氨酸的识别相关，而Src同源性3(SH3)结构域通常是一种蛋白参与和细胞骨骼组构相关的信号转导的蛋白的指标。
“片段”表示包括长度比RasGAP蛋白的N2序列短的氨基酸的序列。只要它具有与产生它的天然序列相同的特性，就可以使用这种序列。优选的是，该序列所包括的氨基酸的长度与相应的RasGAP蛋白的N2序列相比少于90％，优选少于60％，特别是少于30％。
本发明还包括RasGAP蛋白的N2序列的变体。术语“变体”表示一种肽的氨基酸序列与天然序列肽存在某种程度的差别，它是通过保守性氨基酸取代由天然序列产生的氨基酸序列，以便一个或多个氨基酸被具有相同的特征和构像作用的其他氨基酸所取代。所述氨基酸序列变体在天然氨基酸序列的氨基酸序列内的某些位置上具有取代，缺失和/或插入。在本文中，保守性氨基酸取代被定义为在下列五种类型之一内的取代：
I.小的脂肪族，非极性或弱极性残基：Ala，Ser，Thr，Pro，Gly
II.极性，带正电荷的残基：His，Arg，Lys
III.极性，带正负荷的残基：和它们的酰胺：Asp，Asn，Glu，Gln
IV.大的，芳香族残基：Phe，Tyr，Trp
V.大的，脂肪族，非极性残基：Met，Leu，Ile，Val，Cys。
N2序列，以及它的片段和变体，可以通过本领域所公知的多种方法和技术制备，例如，披露于以下文献中的化学合成或重组技术：Maniatis等1982，分子克隆，实验室手册，Cold Spring Harbor实验室。
优选的是，所述RasGAP蛋白的N2序列的片段包括N2序列的SH3结构域的氨基酸序列，它的一部分，或它的变体。
申请人业已吃惊地表征了RasGAP蛋白的N2序列的较短的序列仍然能增强药物选择性地杀伤癌细胞的能力，并且还具有更便于合成的优点。为了评估它的一部分是否能够分离，申请人业已制备了一系列截短形式的片段N，如图2A所示，并且测定它们强化药物在癌细胞系中诱导细胞凋亡的能力(图2B)。业已将N2序列的所述部分克隆到载体上，并且转染到癌细胞系(HeLa)中。
申请人业已证实了用空的构建体或用编码N2的SH2结构域的构建体转染的HeLa细胞只是不能增强顺氯氨铂-诱导的死亡。相反，如图2B所示，能表达包括SH3结构域的构建体能够增强顺氯氨铂-诱导的细胞凋亡。
申请人业已制备了SH3结构域的逐渐截短的形式，以便鉴定最低增强序列。N2序列的所有上述构建体或它的部分(图2A)，包括编码10个氨基酸长的肽的它的最短的形式(317-326)，都能加强顺氯氨铂杀伤HeLa细胞的能力(图2B)。以上结果表明，片段2的细胞死亡增强特性不需要完整的SH3结构域，而是由部分SH3结构域，如短的肽序列介导的。
部分SH3结构域或它的变体包括SH3结构域的氨基酸序列的优选少于或等于70，更优选少于或等于30，最优选少于或等于10个氨基酸。
本发明具体涉及部分SH3结构域，它包括由以下的表1所示DNA序列编码的氨基酸序列：
                                             表1
  序列   名称   DNA序列   氨基酸序列
  SEQ ID N°1   RasGAP284-351   Gaagatagaaggcgtgtacgagctattctaccttacacaaaagtaccagacactgatgaaataagtttcttaaaaggagatatgttcattgttcataatgaattagaagatggatggatgtgggttacaaatttaagaacagatgaacaaggccttattgttgaagacctagtagaagaggtgggccgggaagaagatccacatgaaggaaaaatatggttccatgggaagatttccaaacaggaagct   EDRRRVRAILPYTKVPDTDEISFLKGDMFIVHNELEDGWMWVTNLRTDEQGLIVEDLVEEVGREEDPHEGKIWFHGKISKQEA
  SEQ ID N°2   RasGAP284-341   gtacgagctattctaccttacacaaaagtaccagacactgatgaaataagtttcttaaaaggagatatgttcattgttcataatgaattagaagatggatggatgtgggttacaaatttaagaacagatgaacaaggccttattgttgaagacctagtagaagaggtgggccggg   RVRAILPYTKVPDTDEISFLKGDMFIVHNELEDGWMWVTNLRTDEQGLIVEDLVEEVGREEDPHEGKIW
  aagaagatccacatgaaggaaaaatatgg
  SEQ ID N°3   RasGAP284-336   Gtacgagctattctaccttacacaaaagtaccagacactgatgaaataagtttcttaaaaggagatatgttcattgttcataatgaattagaagatggatggatgtgggttacaaatttaagaacagatgaacaaggccttattgttgaagacctagtagaagaggtgggccgg   RVRAILPYTKVPDTDEISFLKGDMFIVHNELEDGWMWVTNLRTDEQGLIVEDLVEEVGR
  SEQ ID N°4   RasGAP317-326   tggatgtgggttacaaatttaagaacagat   WMWVTNLRTD
当N2序列的SH3结构域的所述部分是SEQ ID N°4(RasGAP317-326)时，在人体中由SEQ ID N°4编码的所得到的氨基酸序列是WMWVTNLRTD。不同物种之间的比较，揭示了在物种之间存在保守的不同的氨基酸，如表2所示。
                 表2
  物种   RasGAP317-326的氨基酸序列
  人   WMWVTNLRTD
  黄牛   WMWVTNLRTD
  小鼠   WMWVTNLRTD
  家鼠   WMWVTNLRTD
  按蚊   WLWVTAHRTG
  果蝇   WLWVTAHRTG
  比对   Wx WVTxx RTx
物种之间的保守的氨基酸表示为粗体加下划线的残基，而X表示可以通过保守性，或非保守性氨基酸取代改变的氨基酸残基，这种改变不会破坏N2的SH3结构域的10个氨基酸部分的独特的特性。
本发明还涉及人类N2的SH3结构域的这10个氨基酸部分的肽变体，特别涉及比对序列 WX WVTXX RTX，并且它们表示氨基酸序列与天然序列肽在某种程度上不同的肽，所述变体是通过保守性或非保守性氨基酸取代由天然序列WMWVTNLRTD改变而来的氨基酸序列，以便一个或多个氨基酸残基被具有相同特征和构像作用的另一种氨基酸所取代。
通常，所述肽主要包括RasGAP蛋白的N2序列的肽，它的片段，或它的变体，正如在本发明中所披露的，它是与能增加所述肽在细胞中的积累的试剂缀合的。
所述制剂可以是能诱导受体介导的胞吞的化合物，例如膜铁传递蛋白受体介导的与治疗性药物缀合的铁传递蛋白的胞吞作用(Qian Z.M.等，“通过铁传递蛋白受体-介导的胞吞作用途径进行定向药物输送”药理评论(Pharmacological Reviews)，54，561，2002)或细胞膜渗透性载体，它能够选自，例如下列一组：脂肪酸，如癸酸，肉豆蔻酸和硬脂酸，业已将它们用于输送蛋白激酶C的肽抑制剂(Ioannides C.G.等，“通过蛋白激酶C的新型肽抑制剂在人白血病细胞系Jurkat中抑制IL-2受体诱导和IL-2生产”Cell Immunol.，131，242，1990)和蛋白-酪氨酸磷酸酶(Kole H.K.等，“肽型蛋白-酪氨酸磷酸酶抑制剂，能专一性增强在完整细胞中的胰岛素受体功能”J.Biol.Chem.271，14302，1996)等等。优选的是，使用细胞膜渗透性载体，更优选使用细胞膜渗透性载体肽。
当细胞膜渗透性载体是肽时，它优选是富含精氨酸的肽。Futaki等最近业已证实(Futaki S.等，“富含精氨酸的肽。具有作为细胞内蛋白输送载体潜力的膜渗透性肽的丰富资源”J.Biol.Chem.，276，5836，2001)，细胞膜渗透性载体肽中的精氨酸残基的数量对内在化的方法具有显著影响，并且似乎存在用于内在化的最佳数量的精氨酸残基，优选的是，它们包括超过6个精氨酸。
本发明的肽通常是通过间隔基团与所述细胞膜渗透性载体缀合的。在这种场合下，所述细胞膜渗透性载体优选是肽。
通常，富含精氨酸的肽选自下列一组：HIV-TAT48-57肽，FHV-外被35-49肽，HTLV-II Rex4-16肽和BMV gag7-25肽。优选的是，所述富含精氨酸的肽是HIV-TAT48-57肽。
当HIV-TAT48-57肽与RasGAP序列，例如RasGAP317-326缀合时，将两个甘氨酸残基作为间隔基团插在TAT和RasGAP序列之间，以便具有灵活性。
由于天然肽(L-形式)的固有的问题是能被天然蛋白酶降解，本发明的肽可以制备成包括所述肽的D-形式和/或″逆转(retro-inverso)异构体″。
在这种场合下，制备了本发明的肽的较短片段的retro-inverso异构体和变体。
因此，保护所述肽不受天然蛋白水解，提高了所述专一性异源二价或异源多价化合物的效果。与包括类似物的非-retro-inverso相比，由于阻止了天然蛋白酶的降解作用，预计包括retro-inverso的肽具有更高的生物学活性。另外，业已证实它们具有较高的稳定性和较低的免疫原性(Sela M.和Zisman E.，“D-氨基酸在免疫现象中的不同作用”FASEBJ.11，449，1997)。
Retro-inverso肽是根据具有已知序列的肽制备的，例如，参见Sela和Zisman，(1997)。
″retro-inverso异构体″表示线性肽的异构体，其中，序列的方向是相反的，并且每一个氨基酸残基的手性是颠倒的。因此，不可能存在端基互补性。
本发明还涉及所述肽的修饰(通常这种修饰不会改变一级序列)，包括肽的体内或体外化学衍生化，如乙酰化或羧基化。还包括糖基化的修饰，例如，在它的合成和加工或在进一步的加工步骤中通过改变所述肽的糖基化形式而修饰过的，例如，通过让所述肽接触能影响糖基化的酶，例如，哺乳动物糖基化或脱糖基化酶。还包括具有磷酸化氨基酸残基的序列，例如，磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸。
本发明还包括类似物，其中，一个或多个肽键业已被不容易被肽酶裂解的其他类型的共价键(″肽模拟物″)所取代。当在注射到对象体内后所述肽的蛋白水解降解构成问题时，用不可谅解的肽模拟物取代特别敏感的肽键将会使得所得到的肽更稳定，并因此更适合用作活性物质。所述肽，以及将它们整合到肽上的方法为本领域所公知。
同样有用的是氨基末端封端基团，如t-丁氧基羰基，乙酰，theyl，琥珀酰，甲氧基琥珀酰，环庚基，己二酰，azelayl，丹酰，苄氧基羰基，芴基甲氧基羰基，甲氧基azelayl，甲氧基己二酰，甲氧基环庚基，和2，4，-二硝基苯基。封闭所述肽的带电荷的氨基和羧基末端，具有增强所述肽穿过疏水性细胞膜并且进入细胞的额外优点。
在利用重组技术制备本发明的主要包括RasGAP蛋白的N2序列的肽，它的片段，或它的变体的肽时，优选使用编码所述多肽的核酸序列。用于实施重组技术的方法，参见，例如Maniatis等1982，分子克隆，实验室手册，Cold Spring Harbor实验室和可以通过商业渠道获得的方法。
因此，本发明还涉及纯化的和分离的核酸序列，它编码上文所述的主要包括RasGAP蛋白的N2序列的肽，它的片段，或它的变体的肽。
“纯化的和分离的核酸或核酸序列”表示编码本发明的肽的核酸序列，或编码本发明的主要包括RasGAP蛋白的N2序列的肽，它的片段，或它的变体的肽的核酸所呈现的状态。
本发明所涉及的纯化的和分离的核酸或核酸序列可以是DNA，RNA，或DNA/RNA杂合体。
可以在本发明中使用的DNA可以是任何多核苷酸序列，例如，包括双链DNA，单链DNA，其中一条或两条链是由两个或两个以上片段组成的双链DNA，其中一条或两条链具有连续的磷酸二酯主链的双链DNA，包括一个或多个单链部分和一个或多个双链部分的DNA，其中所述双链DNA是完全互补的双链DNA，其中所述DNA链仅仅是部分互补的双链DNA。环状DNA，共价闭合的DNA，线性DNA，共价交联的DNA，cDNA，化学合成的DNA，半合成DNA，生物合成DNA，天然分离的DNA，酶消化的DNA，剪切过的DNA，标记过的DNA，如放射性标记过的DNA和荧光色素-标记的DNA，包括一种或多种非天然存在的核酸的DNA。
编码主要包括RasGAP蛋白的N2序列，它的片段，或它的变体的肽的DNA序列，可以是通过标准化学技术合成的，例如，磷酸三酯方法，或通过自动化合成方法和PCR方法合成。
本发明的编码所述主要包括RasGAP蛋白的N2序列，它的片段，或它的变体的肽的纯化的和分离的DNA序列还可以通过酶促技术生产。因此，能在预定识别序列上裂解核酸分子的限制酶可用于从包括所述核酸序列的大量核酸分子中分离所述核酸序列，如编码主要包括RasGAP蛋白的N2序列，它的片段，或它的变体的肽的DNA(或RNA)。
本发明还涉及多核苷酸(RNA)形式的核酸，包括，例如，单链RNA，cRNA，双链RNA，其中一条或两条链是由两个或两个以上片段组成的双链RNA，其中一条或两条链具有连续的磷酸二酯主链双链的RNA，包括一个或多个单链部分和一个或多个双链部分的RNA，其中所述RNA链是完全互补的双链RNA，其中所述RNA链仅仅是部分互补的双链RNA，共价交联的RNA，酶消化的RNA，剪切的RNA，mRNA，化学合成的RNA，半合成的RNA，生物合成的RNA，天然分离的RNA，标记的RNA，如放射性标记过的RNA和荧光色素-标记过的RNA，包括一种或多个种非天然存在的核酸类型的RNA。
被优选用作核酸的是选自下列一组的纯化的和分离的DNA序列：SEQID N°1，SEQ ID N°2，SEQ ID N°3，或SEQ ID N°4。
本发明还包括上述序列的变体，它是通过保守性核苷酸取代而相对参考序列改变了的核苷酸序列，以便一个或多个核苷酸被具有相同特征的其他核苷酸所取代。
本发明还包括所披露的纯化的和分离的核酸序列的等位变体；就是说，所述分离的和纯化的核酸的天然存在的其他形式，它同样编码与由所述纯化的和分离的核酸序列所编码的肽相同，同源或相关的肽。另外，非天然存在的变体可以通过诱变技术或通过直接合成生产。
编码主要包括RasGAP蛋白的N2序列的肽，它的片段，或它的变体的上述纯化的和分离的核酸序列，还可以包括编码细胞膜渗透性载体的核苷酸序列。
本发明所涉及的另一方面，编码上述主要包括RasGAP蛋白的N2序列的肽，它的片段，或它的变体的分离的和纯化的核酸序列的表达载体。优选的是，编码本发明的肽的分离的和纯化的核酸序列是DNA。
在本文中，″载体″，″质粒″和“表达载体”可以交换使用，而质粒是最经常使用的载体形式。
所述载体还可以包括本发明的编码细胞膜渗透性载体的核苷酸序列。正如本领域所熟知的，表达载体的选择直接取决于需要的功能特性，例如，肽表达和要转化或转染的宿主细胞。
另外，所述表达载体还可以包括可操作地与所述纯化的和分离的DNA序列连接的启动子。这意味着编码本发明的肽的所述连接的分离的和纯化的DNA序列受允许表达的合适的调控序列的控制，即所插入的分离的和纯化的DNA序列的转录和翻译。
在本文中，术语“启动子”表示本领域已知的任何其他调控序列，例如，启动子和/或增强子，聚腺苷化位点和剪接接头，常见于表达所述多肽，或者可以包括额外的一个或多个独立的导向序列，并且还可以选择性地编码选择标记。只要能与宿主细胞兼容的启动子都是可以使用的启动子，例如，从病毒的基因组中获得的启动子，如多瘤病毒，腺病毒(如腺病毒2)，乳头瘤病毒(如牛乳头瘤病毒)，禽肉瘤病毒，细胞巨化病毒(如鼠或人细胞巨化病毒立即早期启动子)，反转录病毒，乙型肝炎病毒，和猿猴病毒40(如SV40早期和晚期启动子)或从异源哺乳动物启动子中获得的启动子，如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子或热冲击启动子。
例如，可以使用的增强子可以包括来自哺乳动物基因的已知增强子序列(珠蛋白，弹性蛋白酶，白蛋白，α-胎儿球蛋白，和胰岛素)或来自真核细胞病毒的增强子。例如，SV40增强子，细胞巨化病毒早期启动子增强子，多瘤病毒，和腺病毒增强子。
可以将多种宿主/表达载体组合用于表达本发明的DNA序列。例如，有用的表达载体可以包括染色体片段，非染色体和合成DNA序列。合适的载体包括SV40的衍生物和已知的细菌质粒，例如，大肠杆菌质粒colE1，pCR1，pBR322，pcDNA3，pMB9和它们的衍生物，质粒如RP4；噬菌体DNAs，例如，噬菌体X的多种衍生物，例如，NM989，和其他噬菌体DNA，例如，M13和丝状单链噬菌体DNA；酵母质粒如2μ质粒或其衍生物；可用于真核细胞中的载体，如可用于昆虫或哺乳动物细胞中的载体；来自质粒和噬菌体DNAs的组合的载体，如业已修饰过以便利用噬菌体DNA或其他表达控制序列的质粒等等。
最优选的表达载体是pcDNA3。
本发明涉及的另一方面是提供包括本文所披露的本发明的肽，本发明的分离的和纯化的核酸序列和/或表达载体的真核或原核宿主细胞。
用包括本发明的纯化的和分离的DNA序列的表达载体转化或转染合适真核或原核宿主细胞是通过众所周知的方法完成的，这些方法通常取决于所使用的载体类型。就所述方法而言，例如，参见，Maniatis等1982，分子克隆，实验室手册，Cold Spring Harbor实验室和可以通过商业渠道获得的方法。术语″转染过的细胞″或″转化过的细胞″或″转染或转化过的细胞″表示业已导入了细胞外DNA并因此获得了所述细胞外DNA的细胞。可以将所述DNA导入所述细胞，以便所述核酸作为染色体的组成部分或作为染色体外因子复制。
所述主要包括RasGAP蛋白的N2序列的肽，它的片段，或它的变体可选择性地与能增强所述肽在细胞中的积累的制剂缀合，正如本文所披露的，它优选是在细胞表达系统中重组生产的。
可以将多种单细胞宿主细胞用于表达本发明的DNA序列。所述宿主可以包括众所周知的真核和原核宿主，如大肠杆菌，假单胞菌属，芽孢杆菌属，链霉菌属，诸如酵母的真菌的菌株，和动物细胞，如CHO，YB/20，NSO，SP2/0，R1.1，B-W和L-M细胞，非洲绿猴肾细胞(例如，COS 1，COS 7，BSC1，BSC40，和BMT10)，昆虫细胞(例如，Sf9)，和人类细胞和组织培养物中的植物细胞。优选的是，所述宿主细胞是细菌细胞，更优选的是大肠杆菌细胞。
本发明还涉及药用组合物，作为活性物质，它包括药用有效量的所披露的至少一种肽，它选择性地与可以药用的载体，稀释剂和佐剂组合。
“药理学有效量”表示化学材料或化合物，它在给人或动物肌体使用时，能诱导可检测的药理学和/或生理学效果。
相应的药理学有效量可取决于要治疗的特定患者，取决于要治疗的疾病，以及取决于服用方法。另外，药理学有效量取决于所使用的特定的肽，特别是，如果所述肽还包括所述药物或不包括这种药物时。所述治疗通常包括多次使用所述药用组合物，通常间隔数小时，数天或数周服用。所述多肽的剂量单位的药理学有效量通常在每千克要治疗的患者体重0.001ng至100μg的范围内。
优选的是，除了本文所披露的至少一种肽之外，所述药用组合物还可以包括一种或多种可以药用的载体，稀释剂和佐剂。
可以药用的有利于将活性化合物加工成制剂的可以药用的载体，稀释剂和佐剂在使用的剂量和浓度下对受体是无毒的，并且包括缓冲剂，例如磷酸，柠檬酸，和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；氯苄烷铵，氯化苄乙氧铵；苯酚，丁基或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯类如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于大约10个残基)的多肽；蛋白，如血清白蛋白，凝胶，或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸，或赖氨酸；单糖，二糖，和其他碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合剂，如EDTA；糖糖，如蔗糖，甘露糖醇，海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEEN，PLURONICS或聚乙二醇(PEG)。
所述药用组合物的服用形式可以是系统性的或局部的。例如，所述组合物的服用可以是多种肠胃外途径，如皮下，静脉内，真皮内，肌内，腹膜内，鼻内，经真皮，口腔含服途径，或通过灌输器械，并且还可以通过蠕动装置输送。
所述药用组合物包括本发明所披露的肽，作为活性制剂，还可以结合到或浸泡到生物吸收性基质中，以所述基质的悬浮液，凝胶或固体支持物的形式服用所述基质。另外，所述基质可以包括生物聚合物。
可以制备缓式制剂。缓式制剂的合适的例子包括包含抗体的固体疏水性聚合物的半渗透性基质，所述基质是成型制品形式的，例如，薄膜或微型胶囊。缓式基质的例子包括聚酯，水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)，或聚(乙烯醇))，聚交酯(美国专利号3,773,919)，L-谷氨酸和[γ]乙基-L-谷氨酸酯的共聚物，不可降解的乙烯乙酸乙烯酯，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPRON DEPOT(TM)(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林组成的可注射的微球体)，和聚-D-(-)-3-]羟基丁酸。
用于体内服用的制剂必须是无菌的。这一目的可以方便地实现，例如，通过无菌过滤膜过滤。
应当理解的是，本发明的肽的合适的剂型取决于受体的年龄，性别，健康，和体重，现有治疗的类型，如果有的话，还取决于需要的效果的性质。
合适的剂型取决于疾病，肽和服用模式；可使用的剂型包括片剂，胶囊，胶质软糖，牙膏，栓剂，吸入剂，溶液，油膏和注射用补给药。
由于本发明还包括所述肽的氨基酸修饰，可将它用于将本发明的肽交联到水不溶性基质或其他大分子载体上，或用于提高它的溶解度，吸收，以及穿过血脑屏障的渗透性。所述修饰为本领域所熟知，并且还可以消除或减弱所述肽等的任何可能的不希望的副作用。
本发明的优选的药用组合物包括作为活性制剂的肽，另一种药用组合物可以包括本文所披露的编码所述肽的纯化的和分离的核酸序列作为活性制剂。该药用组合物可以包括单纯的纯化的和分离的DNA序列，包括所述纯化的和分离的DNA序列的表达载体，或事先用本文所披露的载体转染或转化过的宿主细胞。在后一种例子中，宿主细胞优选是从要治疗的患者体内分离的，以便避免任何免疫原性问题。所述基因和细胞治疗方法特别适合需要重复服用所述药用组合物的患者，因为所述纯化的和分离的DNA序列，表达载体或事先用表达载体转染或转化过的宿主细胞可以整合到患者的细胞中，然后能够以内源方式产生所述蛋白。
通常，本文所披露的药用组合物被用于治疗或预防癌症。
本发明还涉及将本发明的药用组合物用于制备用于治疗或预防癌症的药品的用途。
术语“癌症”表示或描述哺乳动物的生理学状态，通常以不受控制的细胞生长为特征。
通常，要治疗或预防的癌症可选自下列一组：癌瘤，淋巴瘤，胚细胞瘤，肉瘤，脂肪肉瘤，神经内分泌肿瘤，间皮瘤，神经膜瘤，脑脊膜瘤，腺癌，黑素瘤，白血病，淋巴癌，鳞状上皮细胞癌，上皮鳞状上皮细胞癌，肺癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺腺癌，肺鳞状上皮细胞癌，腹膜癌，肝细胞癌，胃癌，胃肠癌，胰腺癌，成胶质细胞瘤，子宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结直肠癌，子宫内膜或子宫癌，唾液管癌，肾癌，前列腺癌，阴门，甲状腺癌，肝癌，肛门癌，阴茎癌，睾丸癌，食道癌，胆道肿瘤，和头脖癌。
优选的是所述癌症是间皮瘤，睾丸癌或胰腺癌。
本发明的肽通常是以能实现预期目的的用量使用的。在用于治疗或预防癌症时，所述肽或它的药用组合物是以治疗有效量服用或使用的。“治疗有效量”是能有效减轻或预防接受治疗的对象的症状，或延长其存活时间的用量。治疗有效量的确定属于本领域技术人员的技能范围，特别是在阅读本文所提供的详细说明之后。
对于系统性服用来说，最初可以根据体外试验估算治疗有效量或剂量。例如，可以在动物模型上配制剂量，以便获得循环浓度范围，包括在细胞培养物中确定的IC50。可以将这些信息用于更精确地确定可以在人体上使用的剂量。
还可以根据体内数据估算起始剂量，例如，动物模型，使用本领域众所周知的技术估算。本领域普通技术人员可以根据动物数据方便地优化在人体上的使用，并且理所当然地取决于要治疗的对象，取决于对象的体重，疾病的严重程度，服用方式和处方医生的判断。
本说明书还提供了在需要的对象上治疗或预防癌症的方法，包括给所述对象服用治疗有效量的本发明所披露的药用组合物。
上文业已披露了可以治疗或预防的癌症的例子。优选的是，所述癌症是间皮瘤，睾丸癌或胰腺癌。
在优选方法中，所述对象是人类患者，并且所服用的能够选择性地增强至少一种药物杀伤癌细胞的能力的肽是TAT-RasGAP317-326肽。
本发明的范围还包括用于选择性地增强癌细胞的细胞凋亡的方法，包括让癌细胞与本发明的至少一种肽和药物接触。
还涉及用于选择性地杀伤癌细胞的方法，包括让癌细胞与本发明的至少一种肽和药物接触。
还涉及将本发明所披露的肽用于增强药物选择性地杀伤癌细胞的能力的用途。
本发明的另一个目的是提供用于治疗或预防对象的癌症的试剂盒，所述试剂盒包括本发明所披露的至少一种肽，以及选择性地包括试剂和/或使用说明。
一般，所述试剂盒包括容器和贴在该容器上或与该容器接触的标签或包装说明书。合适的容器包括，例如瓶子，小瓶，注射器等。所述容器可以用多种材料制成，如玻璃或塑料。所述容器容纳能有效治疗癌症的组合物，并且具有无菌入口(例如，所述容器可以是静脉内溶液袋或具有可以通过皮下注射器针头刺穿的塞子的小瓶)。所述标签或包装说明书指明了将所述组合物用于治疗特定的癌症。
所述试剂盒还可选择性地包括独立的药用剂型，包括选自下列一组的其他抗癌制剂：上文所述的药物，抗-表皮生长因子受体抗体，放射性免疫治疗剂，及其组合。
具体实施方式
实施例1：细胞和转染。
在含有10％新生牛血清(Sigma；cat.n°N4637)的RPMI 1640(Sigma；cat.n°8758)中，在37℃和5％CO2条件下保持HeLa和MCF-7细胞。U2OS细胞是在含有15％胎牛血清(Sigma；cat.n°F7524)的DMEM(Sigma；cat.n°5796)中，在37℃和5％ CO2条件下保持的。H-Meso-1细胞是在含有10％胎牛血清的RPMI 1640中在37℃和5％ CO2条件下保持的。HUV-EC-C细胞是在补充了10％胎牛血清，20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(Gibco；cat.n°13256-029)，10ng/ml的表皮生长因子(Gibco；cat.n°13247-051)，10μg/ml的纤维结合蛋白(Gibco；cat.n°33016-015)的人内皮SFM培养基(Gibco；cat.n°11111-044)中，在37℃和5％CO2的条件下保持的。HaCat细胞是在包括表皮生长因子1-53和来自牛垂体的提取物(Gibco；cat.n°17005-075)的角化细胞SFM培养基中，在37℃和5％CO2的条件下保持的。HeLa细胞是按上述方法转染的(Yang J.-Y.和Widmann C.，Mol.Cell.Biol.，21，5346，2001)。基因毒素治疗是在6-孔平板上进行的。在治疗的前一天以2.5×105细胞/孔的浓度分开所述细胞。U2OS细胞是在6孔平板上使用钙/磷酸沉淀方法转染的(Jordan M.等，″转染哺乳动物细胞：优化影响磷酸钙沉淀形成的关键参数″Nucleic Acids Res.，24，596，1996)。简单地讲，用90μl H2O稀释质粒，与10μl CaCl2 2.5M混合，并且在室温下培养10分钟。然后将100μl的HEP溶液(280mM NaCl，10mM KCl，1.5mM Na2HPO4，12mM D-葡萄糖，50mM HEPES)迅速与所述DNA溶液混合，并且在室温下精确培养1分钟，并最终转移到细胞培养基中。在37℃和5％CO2的条件下培养8小时之后，用新的培养基更换所述培养基，并且将所述细胞再培养16-24小时，然后进行分析
化合物
顺氯氨铂和米托蒽醌购自Sigma(分别为cat.n°P4394和n°M6545)。顺氯氨铂是以100mM的最终浓度在DMSO中稀释的，并且在-20℃保存。米托蒽醌是以10mM的最终浓度在100％的乙醇中稀释的，并且在-80℃下保存。阿霉素购自Calbiochem公司(cat.n°324380)。它是以10mM的最终浓度在水中稀释的，并且在-20℃下保存。Hoechst33342是从Roche公司购买的(cat.n°H-1399)。它是以10mg/ml的最终浓度在水中稀释的，并且在4℃下遮光保存。
肽合成和标记。
HIV-TAT48-57(GRKKRRQRRR)和TAT-RasGAP317-326(GRKKRRQRRRGGWMWVTNLRTD)肽是在瑞士Lausanne大学生化学院合成的，使用FMOC技术，通过HPLC纯化，并且通过质谱分析检测。
异硫氰酸荧光素(FITC)-标记是在序列β-丙氨酸-GRKKRRQRRRGGWMWVTNLRTD上进行的，它的侧链Fmoc-保护氨基酸是Arg(bpf)，Lys(Boc)，Gln(Trt)，Trp(Boc)，Thr(tBu)，Asn(Trt)，和Asp(OtBu)。所述肽是在0.2mmol Rink Amide AM树脂上使用Fmoc化学方法逐步合成的。通过水合茚三酮试验监测合成。在结合β-丙氨酸之后，用存在于二甲基甲酰胺(DMF)中的20％六氢吡啶除掉Fmoc基团。在这一阶段，荧光素基团通过FITC与肽的N-末端缀合(超出取代树脂的5倍，在4ml DMF和1ml N-乙基二异丙胺中)，以便形成荧光素-衍生的肽。
将肽以1mM的最终浓度溶解在去离子水中，并且在-20℃下保存待用。
质粒.
质粒名称后面的后缀dn3表示所述主链质粒是表达载体pcDNA3(Invitrogen)。所有构建体是用HA序列(MGYPYDVPDYAS)在N氨基末端标记的。质粒N2.dn3编码人RasGAP片段N2，质粒SH2-SH3.dn3编码人RasGAP氨基酸158-361，质粒SH2.dn3编码人RasGAP氨基酸158-277，质粒SH3.dn3编码人RasGAP氨基酸279-361。质粒IκBαΔN2编码一种形式的IκBα，它能抑制NFκB的激活(Yang和Widmann，2002b)。质粒pEGFP-Cl编码GFP蛋白，这种质粒是从Clontech公司购买的。pRL-TK，编码Renilla reniformis荧光素酶的载体，是从Promega公司购买的。PrLUC是报道质粒，它具有受NFκB-响应因子控制的荧火虫荧光素酶cDNA(Yang J.-Y.和Widmann C.，Mol.Cell.Biol.，21，5346，2001)。
细胞凋亡测定
细胞凋亡是通过统计具有固缩细胞核的细胞数量测定的。用Hoechst 33342(10μg/ml最终浓度)标记活细胞的细胞核大约5分钟，然后使用装有荧光和透射光光学器件的倒置Leica DMIRB显微镜分析细胞(每一种条件至少400个细胞)。在对所述细胞进行转染或处理之后一天进行细胞凋亡的评估。在涉及转染细胞的实验中，将pEGFP-Cl添加到转染溶液中，以便用GFP标记转染过的细胞。在这种场合下，仅用转染过的细胞评估细胞凋亡程度。
荧光素酶报道测定。
荧光素酶测定是使用从Promega公司购买的复式Dual-荧光素酶Reporter Assay(cat.n°E1910)进行的。使用100μl的PLB裂解缓冲液裂解来自6孔平板的细胞，所述缓冲液是由Promega’s的试剂盒提供的，并且在冰上培养30分钟。通过以16,000g的速度离心15分钟使所述裂解液澄清。通过将20μl的所述裂解液与25μl的LARII试剂混合记录荧火虫荧光素酶活性，并且通过将25μl的Stop & Glo试剂添加到上述混合物中记录Renilla荧光素酶活性。对每一次测定来说，使用Lumat LB 9501光度计(Berthold Technologies，苏黎世(Zurich)，瑞士(Switzerland))用12秒钟时间对光发射进行定量。
Western印迹分析
在裂解缓冲液(25mM Hepes，300mM NaCl，1.5mM MgCl2，0.2mMEDTA，0.1mM Na3VO4，1％ Triton X100，完全的无EDTA蛋白酶抑制剂混合物片剂(Roche；cat.n°1873580))中裂解细胞。在SDS-PAGE上分离蛋白，并且吸印到硝酸纤维素膜(BioRad；cat.n°162-0115)上。然后，用TBS(18mM HCl，130mM NaCl，20mM Tris)，5％脱脂奶粉在室温下封闭所述膜30分钟，并且与合适的一级抗体培养过夜。通过与二级抗体(分子探针；cat.n°A21109)缀合的Alexa Fluor 680检测所述抗体，所述二级抗体是以1∶2500的比例用TBS，5％脱脂奶粉稀释的，并且随后用Odyssey红外成像系统(Licor，Homburg，Germany)成像。抗磷-p38的一级抗体(Cell Signaling Technology；cat n°9211L)以1∶500的比例用含有5％BSA的TBS稀释。抗磷-JNK的一级抗体(Cell SignalingTechnology；cat n°9551L)以1∶1000的比例用含有5％BSA的TBS稀释。定量是使用Odyssey红外成像软件完成的。
统计学分析
所有统计学分析是使用Microsoft Excel(XP版)使用学生t-测验进行的。
实施例2：
RasGAP片段N2能加强通过各种基因毒素诱导的细胞凋亡反应。
申请人最近业已证实了片段N2能增强顺氯氨铂杀伤HeLa肿瘤细胞系的能力(Yang J.-Y.和Widmann C.，Mol.Cell.Biol.，21，5346，2001)。为了证实片段N2是否能够加强由其他基因毒素诱导的细胞凋亡反应，让表达或不表达片段N2的HeLa细胞接触浓度逐渐加大的阿霉素和米托蒽醌(和顺氯氨铂作为对照)。图1证实了，片段N2的存在使得HeLa细胞与对照细胞相比对各种药物的敏感度增加了至少10倍。这一结果表明，片段N2是宽光谱性基因毒素敏化剂。
确定片段N上能够增强药物杀伤癌细胞的能力的最小序列。
片段N2是36kDa的蛋白，这可能使得它难于通过化学方法合成。在用片段N2开发治疗工具的过程中，表征仍然具有基因毒素-敏化能力的更短的序列是关键步骤。为了确定这样的短序列是否可以分离，我们制备了一系列截短形式的片段N2(图2A)，并且确定它们加强在HeLa细胞中顺氯氨铂-诱导细胞凋亡的能力(图2B)。片段N2包括两个SH2结构域和一个SH3结构域(图2A)。我们首先确定了这些结构域中的哪一个包括片段N2的促-细胞凋亡活性。在存在或不存在0.15μM的顺氯氨铂的条件下，用编码各种SH结构域的质粒转染HeLa细胞，在该浓度下，能表达或不能表达片段N2的细胞之间对药物的敏感性的差异最大(参见图1)。空的构建体或编码SH2结构域的构建体不能增强顺氯氨铂杀伤用这些构建体转染过的HeLa细胞的能力。相反，包括SH3结构域的构建体能增强顺氯氨铂通过细胞凋亡杀伤细胞的能力(图2B)。SH2结构域本身不能加强HeLa细胞的细胞死亡不是由于减弱了的蛋白表达造成的，因为Western印迹分析发现，SH2结构域的表达效率与其他构建体的表达效率相同(数据未显示)。
申请人随后制备了逐渐截短形式的SH3结构域，以期确定最小基因毒素-敏化序列。所有这样的构建体(参见图2A)，包括编码长度为10个氨基酸的肽的最短的一种(317-326)，能加强顺氯氨铂杀伤HeLa细胞的能力(图2B)。以上结果表明，片段N2的细胞-死亡敏化特性不需要完整的SH结构域，而是通过非常短的肽序列介导的。
与317-326 RasGAP序列缀合的HIV-TAT48-57肽起着细胞可渗透的基因毒素-敏化肽的作用。
如果编码RasGAP的317-326号氨基的质粒具有增强药物杀伤癌细胞的能力，相当于316-326的合成肽同样应当具有这种活性，只要它能够穿透细胞。业已证实，添加来自HIV TAT蛋白的短的序列(HIV-TAT48-57)，使得多肽能够在细胞中有效积累(Schwarze S.R.等，″体内蛋白转导：将生物学活性蛋白输送到小鼠体内″科学，285，1569，1999)。因此，申请人合成了包括RasGAP的317-326号氨基酸的肽，它与氨基酸载体肽HIV-TAT48-57共价结合。将两个甘氨酸残基插入TAT和RasGAP序列之间，作为间隔基团，以便具有灵活性。作为评估细胞吸收这种肽(以下称之为TAT-RasGAP317-326肽)的手段，我们用FITC荧光团对它进行了标记。标记过的肽与四种不同的肿瘤细胞系一起培养：来自子宫颈的人腺癌(HeLa细胞)，人骨肉瘤(U2OS细胞)，乳腺癌细胞系(MCF-7细胞)和人恶性mesothelomia(H-Meso-1细胞)和两个非癌细胞系(HaCat人皮肤角化细胞细胞系和HUV-EC-C人脐带内皮细胞)。参见图3，TAT-RasGAP317-326肽能有效进入所有上述细胞系。在非癌细胞和癌细胞之间没有发现所述肽转运的差异。我们首先评估了癌细胞系对逐渐加大浓度的三种基因毒素的敏感性(数据未发表)。这使得我们能够确定实验的每一种细胞的基因毒素的亚致死浓度。令人吃惊的是，申请人业已证实TAT-RasGAP317-326肽，而不是对照缺少RasGAP序列的对照HIV-TAT48-57肽，加强了顺氯氨铂，阿霉素，和米托蒽醌杀伤试验癌细胞系的能力，并且它不会，或者只能微弱地在对照条件下诱导细胞凋亡。相反，由顺氯氨铂，阿霉素和米托蒽醌在两种非癌细胞系中诱导的细胞凋亡反应不受所述肽的存在的影响(图4B)。因此，我们业已确定了能够专门进入并且增强所述药物杀伤癌细胞的能力的最小的合成肽。
NFκB和SAPK途径与TAT-RasGAP317-326的特性无关。
作为Ras调节剂，RasGAP能够影响控制细胞死亡的某些Ras-决定型途径，如Ras-PI3K-Akt-NFκB途径(Datta S.R.等，″细胞存活：三种活性之间的游戏″Genes Dev.，13，2905，1999)。因此，我们确定了NFκB活性的调控是否参与了增强由TAT-RasGAP317-326介导的能力。参见图5A，在用顺氯氨铂或TAT-RasGAP317-326处理之后在U2OS细胞中激活了NFκB，但是在用对照肽HIV-TAT48-57处理时不能激活。用顺氯氨铂和TAT-RasGAP317-326培养所述细胞，导致了NFκB的额外的激活(图5A)。NFκB途径在很多细胞类型中参与了细胞存活反应的诱导(Van AntwerpD.J.等，″通过NF-κB抑制TNF-α-诱导的细胞凋亡″Science，274，787，1996；Beg A.A.和Baltimore D.，″NF-κB在抑制TNF-α-诱导的细胞死亡中的重要作用″Science，274，782，1996)，不过，在某些场合下可能还是诱导细胞凋亡反应所必需的(Ryan K.M.等，″NF-κB在p53-介导的编程的细胞死亡中的作用″Nature，404，892，2000)。为了确定TAT-RasGAP317-326对NFκB的激活是否是所述增强能力的功能所必需的，在细胞中表达了一种不可降解形式的IkB(IkBαΔN2)。正如所预期的，这种构建体能有效抑制顺氯氨铂和TAT-RasGAP317-326对NFκB的激活(图5B)。IkBαΔN2只能略微增强由顺氯氨铂介导的细胞凋亡反应(图5C)。不过TAT-RasGAP317-326增强顺氯氨铂通过细胞凋亡杀伤U2OS细胞的能力的效力，不会受到NFκB抑制剂的影响(图5C)。以上结果表明，NFκB途径的激活与增强通过TAT-RasGAP317-326介导的能力的细胞死亡无关。
胁迫-激活的蛋白激酶(SAPKs)-JNKs和p38MAPKs-业已参与了通过各种刺激剂诱导的细胞凋亡反应(Jarpe M.B.等，Oncogene，17，1475，1998)。图6表示，对照HIV-TAT48-57肽，或TAT-RasGAP317-326肽都不能激活所述MAPK途径。所述肽同样不能增强顺氯氨铂刺激JIK或p38MAPKs的能力(图6)。以上结果表明，胁迫-激活的MAPK途径与TAT-RasGAP317-326增强基因毒素杀伤癌细胞的能力无关。
                               序列表
                       序列表(原始公开).SEQ
序列表(原始公开)
<110>洛桑大学
<120>能选择性杀伤癌细胞的RasGAp衍生肽
<130>PFD1050117F-CF
<140>PCT/IB2004/002165
<141>2004-06-29
<150>US 60/483,691
<151>2003-06-30
<160>14
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>249
<212>DNA
<213>智人
<400>1
gaagatagaa ggcgtgtacg agctattcta ccttacacaa aagtaccaga cactgatgaa     60
ataagtttct taaaaggaga tatgttcatt gttcataatg aattagaaga tggatggatg    120
tgggttacaa atttaagaac agatgaacaa ggccttattg ttgaagacct agtagaagag    180
gtgggccggg aagaagatcc acatgaagga aaaatatggt tccatgggaa gatttccaaa    240
caggaagct                                                            249
<210>2
<211>204
                           序列表(原始公开).SEQ
<212>DNA
<213>智人
<400>2
gtacgagcta ttctacctta cacaaaagta ccagacactg atgaaataag tttcttaaaa         60
ggagatatgt tcattgttca taatgaatta gaagatggat ggatgtgggt tacaaattta        120
agaacagatg aacaaggcct tattgttgaa gacctagtag aagaggtggg ccgggaagaa        180
gatccacatg aaggaaaaat atgg                                               204
<210>3
<211>174
<212>DNA
<213>智人
<400>3
gtacgagcta ttctacctta cacaaaagta ccagacactg atgaaataag tttcttaaaa         60
ggagatatgt tcattgttca taatgaatta gaagatggat ggatgtgggt tacaaattta        120
agaacagatg aacaaggcct tattgttgaa gacctagtag aagaggtggg ccgg              174
<210>4
<211>30
<212>DNA
<213>智人
<400>4
tggatgtggg ttacaaattt aagaacagat                                          30

Claims (31)

1.一种能增强药物杀伤细胞的能力的肽，其特征在于，所述肽主要包括RasGAP蛋白的N2序列，它的片段，或它的变体，它能选择性地增强在癌细胞中的所述能力。
2.如权利要求1所述的肽，其特征在于，所述RasGAP蛋白的N2序列的片段包括N2序列的SH3结构域的氨基酸序列，它的一部分，或它的变体。
3.如权利要求2所述的肽，其特征在于，所述部分SH3结构域，或它的变体，少于或等于SH3结构域的氨基酸序列的70个氨基酸。
4.如权利要求2所述的肽，其特征在于，所述部分SH3结构域包括由以下DNA序列编码的氨基酸序列：SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ IDNo.3或SEQ ID No.4。
5.如权利要求1-4所述的肽，其特征在于，所述肽与能增加所述肽在细胞中的积累的制剂缀合。
6.如权利要求5所述的肽，其特征在于，所述制剂是细胞膜渗透性载体。
7.如权利要求6所述的肽，其特征在于，所述细胞膜渗透性载体是肽。
8.如权利要求7所述的肽，其特征在于，所述细胞膜渗透性载体肽是选自下列一组的富含精氨酸的肽：HIV-TAT48-57肽，FHV-外被35-49肽，HTLV-II Rex4-16肽和BMV gag7-25肽。
9.如权利要求8所述的肽，其特征在于，所述富含精氨酸的肽是HIV-TAT48-57肽。
10.如权利要求1-9所述的肽，其特征在于，所述药物是基因毒素。
11.如权利要求10所述的肽，其特征在于，所述基因毒素选自下列一组：顺氯氨铂，米托蒽醌和阿霉素。
12.一种分离的和纯化的核酸序列，包括编码权利要求1-4所述的肽的核苷酸序列。
13.如权利要求12所述的核酸序列，还包括编码细胞膜渗透性载体的核苷酸序列。
14.一种表达载体，包括至少一个拷贝的如权利要求12或13的分离的和纯化的核酸序列。
15.一种原核或真核宿主细胞，包括如权利要求1-4所述的肽，权利要求12或13所述的分离的和纯化的核酸序列或权利要求14所述的表达载体。
16.一种药用组合物，作为活性物质，包括药用有效量的如权利要求1-9所述的至少一种肽，选择性地可以药用的载体，稀释剂和佐剂组合。
17.将权利要求16所述的药用组合物用于治疗或预防癌症的用途。
18.如权利要求16所述的药用组合物的用途，用于制备用于治疗或预防癌症的药品。
19.如权利要求18所述的用途，其特征在于，所述癌选自下列一组：癌瘤，淋巴瘤，胚细胞瘤，肉瘤，脂肪肉瘤，神经内分泌肿瘤，间皮瘤，神经膜瘤，脑脊膜瘤，腺癌，黑素瘤，白血病，淋巴癌，鳞状上皮细胞癌，上皮鳞状上皮细胞癌，肺癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺腺癌，肺鳞状上皮细胞癌，腹膜癌，肝细胞癌，胃癌，胃肠癌，胰腺癌，成胶质细胞瘤，子宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结直肠癌，子宫内膜或子宫癌，唾液管癌，肾癌，前列腺癌，阴门，甲状腺癌，肝癌，肛门癌，阴茎癌，睾丸癌，食道癌，胆道肿瘤，和头脖癌。
20.如权利要求19所述的用途，其特征在于，所述癌是间皮瘤，睾丸癌或胰腺癌。
21.一种治疗或预防选自下列一组的癌症的方法：癌瘤，淋巴瘤，胚细胞瘤，肉瘤，脂肪肉瘤，神经内分泌肿瘤，间皮瘤，神经膜瘤，脑脊膜瘤，腺癌，黑素瘤，白血病，淋巴癌，鳞状上皮细胞癌，上皮鳞状上皮细胞癌，肺癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺腺癌，肺鳞状上皮细胞癌，腹膜癌，肝细胞癌，胃癌，胃肠癌，胰腺癌，成胶质细胞瘤，子宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结直肠癌，子宫内膜或子宫癌，唾液管癌，肾癌，前列腺癌，阴门，甲状腺癌，肝癌，肛门癌，阴茎癌，睾丸癌，食道癌，胆道肿瘤，和头脖癌，包括给需要治疗的对象服用治疗有效量的如权利要求16所述的药用组合物。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述癌是间皮瘤，睾丸癌或胰腺癌。
23.一种用于在癌细胞中选择性地增强细胞凋亡的方法，包括让癌细胞与权利要求1-11所述的至少一种肽和药物接触。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述药物是基因毒素。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述基因毒素选自下列一组：顺氯氨铂，米托蒽醌，阿霉素。
26.一种用于选择性地杀伤癌细胞的方法，包括让癌细胞与权利要求1-11所述的至少一种肽和药物接触。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述药物是基因毒素。
28.权利要求1-11所述的肽用于增强基因毒素选择性地杀伤癌细胞中的细胞的用途。
29.一种用于治疗或预防对象癌症的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1-11所述的至少一种肽，并且选择性地包括试剂和/或使用说明。
30.如权利要求29所述的试剂盒，还包括独立的药用剂型，包括选自下列一组的其他抗癌制剂：药物，抗-表皮生长因子受体抗体，放射性免疫治疗剂，及其组合。
31.如权利要求1-9所述的肽，其特征在于具有以下通式：
WXWVTXXRTX
其中，X是氨基酸残基。
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