ES2373986T3 - Actividad relacionada con ubiquitinación y/o degradación de siva y moduladores de la misma. - Google Patents

Abstract

Un método para identificar un polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B de SEQ ID NO: 6 o un homólogo del mismo que tiene un motivo con dedo de anillo semejante a caja B que carece de histidina y que tiene actividad relacionada con ubiquitinación, que comprende: (i) poner en contacto polipeptidos que comprenden una ubiquitina, un E1, un E2, y dicho polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B de SEQ ID NO: 6 o dicho homólogo del mismo; (ii) medir el enlace de ubiquitina a dicho polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B, en donde la detección de la ubiquitina enlazada a dicho polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B es indicativa de que dicho polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B tiene actividad relacionada con ubiquitinación.

Description

Actividad relacionada con ubiquitinaci6n y/o degradaci6n de SIVA y moduladores de la misma.

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invenci6n se refiere a la actividad relacionada con ubiquitinaci6n y/o degradaci6n de un polipeptido SIVA 5 y a agentes capaces de modular dicha actividad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

SIVA es una proteina adaptadora que se fija a la cola citoplasmica de los receptores CD27 y GITR de la familia de receptores TNF (TNFR). La misma existe como dos isoformas alternativas de corte y empalme, SIVA1 y SIVA2. SIVA1 es mas larga y contiene una regi6n de homologia de dominio de muerte (DDHR) con una helice anfipatica

10 supuesta en su parte central. SIVA2 es mas corta y carece de la DDHR. Ambas isoformas contienen un dedo de anillo semejante a caja B y un dominio semejante a un dedo de cinc en sus terminos C. Borden et al., 1995 proporciona datos estructurales del dominio de caja B en el factor nuclear de Xenopus, XNF7.

Se ha demostrado que la expresi6n forzada tanto de SIVA1 como de SIVA2 induce apoptosis (Prasad et al., 1997, Yoon et al., 1998, Spinicelli et al., 2003 (Py et al., 2004). Se ha sugerido que la apoptosis inducida por SIVA1 es

15 efectuada por su fijaci6n a e inhibici6n de los miembros antiapopt6ticos de la familia Bcl2 a traves de su regi6n helicoidal anfipatica (Chu et al., 2005; Chu et al., 2004; Xue et al., 2002). Consistentemente con el papel proapopt6tico, SIVA es una diana transcripcional directa para los supresores de tumores p53 y E2F1 (Fortin et al., 2004). Diversas evidencias indican que SIVA es una proteina inducida por estres y esta regulada en sentido creciente en la lesi6n isquemica aguda (Palanilam et al., 1998), la infecci6n de coxavirus (Henke et al., 2000), y tambien por

20 tratamiento con cisplatino (Qin et al., 2002), asi como la expresi6n de TIP30 que induce apoptosis (Xiao et al., 2000). Recientemente, se ha demostrado que los terminos N y C comunes de SIVA1 y SIVA2, pero no el dominio de muerte, son suficientes y capaces de mediar apoptosis en celulas linfoides por activaci6n de un camino mitocondrial dependiente de caspasas (Py et al., 2004).

La quinasa inductora de NFKB, NIK (MAP3K14) fue descubierta (Malinin et al., 1997) en un cribado de proteinas

25 que se fijan a la proteina adaptadora asociada al receptor TNF, TRAF2. La activaci6n acusada de NFKB por sobreexpresi6n de esta proteina quinasa, y la inhibici6n efectiva de la activaci6n de NFKB en respuesta a una diversidad de proteinaquinasas, asi como la inhibici6n efectiva de la activaci6n de NFKB en respuesta a una diversidad de agentes inductores, despues de la expresi6n de mutantes de NIK cataliticamente inactivos sugirieron que NIK participa en la senalizaci6n para la activaci6n de NFKB (Malinin et al., 1997).

30 NIK tiene un desarrollo en los 6rganos linfoides (Shinkura et al., 1999). Aparte de la contribuci6n a la regulaci6n del desarrollo y la funci6n del sistema inmunitario, parece ser que NIK esta implicada tambien en la regulaci6n de diversas funciones no inmunitarias tales como el desarrollo de las glandulas mamarias (Miyawaki et al., 1994). Estudios in vitro implicaron NIK en la senalizaci6n que conduce a la diferenciaci6n de las celulas musculares esqueleticas (Canicio et al., 2001), y en la supervivencia y diferenciaci6n de las neuronas (Foehr et al., 2006).

35 La evaluaci6n del patr6n de las especies NFKB en los 6rganos linfoides indic6 que, aparte de su papel en la regulaci6n del o de los complejos de NFKB constituidos por proteinas Rel e IKB, NIK participa tambien en el control de la expresi6n/activaci6n de otras especies NFKB. De hecho, se ha demostrado que NIK participa en la fosforilaci6n de p100 de acci6n especifica, que sirve como disparador molecular para la ubiquitinaci6n y el procesamiento activo de p100 para formar p52. Se ha encontrado que esta actividad de procesamiento de p100 es anulada por la mutaci6n

40 aly de NIK (Xiao et al., 2001b).

En el estroma timico, NIK es importante para la producci6n normal de celulas Treg, que son esenciales para el mantenimiento de la tolerancia inmunol6gica. La mutaci6n de NIK daba como resultado una estructura timica desorganizada y empeoraba la producci6n de celulas Treg en los ratones aly (Kajiura et al., 2004). Consistentemente, estudios de ratones deficientes en NIK sugerian tambien un papel para NIK en el control del desarrollo y la expansi6n de las

45 celulas Treg (Lu et al., 2005). Estos descubrimientos sugieren un papel esencial de NIK en el establecimiento de la autotolerancia de una manera dependiente del estroma. NIK participa tambien en la activaci6n de NFKB como consecuencia de infecci6n viral. La infecci6n por el virus respiratorio sincitial da como resultado una actividad incrementada de quinasas de NIK y la formaci6n de un complejo constituido por NIK activada, IKK1, p100 y la p52 procesada en las celulas a549 semejantes a alveolos. En este caso, NIK llega a autotranslocarse al nucleo fijado a p52 y, sor

50 prendentemente, estos sucesos preceden a la activaci6n del camino can6nico de NFKB (Choudhary et al., 2005). Estos descubrimientos indican que NIK actua de hecho como mediador de la activaci6n de NFKB, pero puede desempenar tambien otras funciones, y que ejerce estas funciones de una manera especifica de la celula y el receptor.

NIK puede activarse como consecuencia de fosforilaci6n del 'bucle de activaci6n' dentro de la molecula NIK. De hecho, la mutaci6n de un sitio de fosforilaci6n dentro de este bucle (Thr559) impide la activaci6n de NFKB despues

55 de sobreexpresi6n de NIK (Lin et al., 1999). Adicionalmente, la actividad de NIK parece estar regulada por la capacidad de las regiones situadas aguas arriba y aguas abajo de su motivo quinasa para unirse una a otra. Se ha demostrado que la regi6n C terminal de NIK aguas abajo de su resto quinasa es capaz de fijarse directamente a IKK1

(Regnier et al., 1997) asi como a p100 (Xiao et al., 2001b), y estas interacciones son necesarias aparentemente para la funci6n de NIK en la senalizaci6n de NFKB. La regi6n N terminal de NIK contiene un dominio regulador negativo (NRD), que esta compuesto de un motivo basico (BR) y un motivo de repetici6n rico en prolina (PRR) (Xiao y Sun, 2000). El NRD Nterminal interacciona con la regi6n Cterminal de NIK en cis, impidiendo con ello la fijaci6n de NIK a su sustrato (IKK1 y p100). La NIK expresada ect6picamente forma de modo espontaneo olig6meros en los cuales estas uniones de las regiones Nterminales a las Cterminales en cada molecula de NIK estan aparentemente rotas, y presentan un nivel elevado de actividad constitutiva (Lin et al., 1999). La fijaci6n de la regi6n Cterminal de NIK a TRAF2 (asi como a otras TRAF's) participa muy probablemente en el proceso de activaci6n. Sin embargo, su modo de participaci6n exacto se desconoce.

Recientemente, ha ganado mucha atenci6n un nuevo mecanismo de regulaci6n de NIK. Este se refiere a la interacci6n dinamica de NIK y TRAF3 que conduce a degradaci6n de NIK mediada por proteasomas. Es interesante que se ha demostrado que los inductores del camino alternativo de NFKB, como CD40 y BLyS, inducen la degradaci6n de TRAF3 y la mejora concomitante de la expresi6n de NIK (Liao et al., 2004).

Existe todavia informaci6n mas bien limitada de los mecanismos aguas abajo en la acci6n de NIK. Se han presentado pruebas de que NIK, por la fijaci6n de su regi6n Cterminal a IKK1, puede activar el complejo IKBquinasa (IKK). De hecho, se ha demostrado que es capaz de fosforilar la serina 176 en el bucle de activaci6n de IKK1 y por consiguiente su activaci6n (Ling et al., 1998).

Se ha sugerido que NIK no participa en absoluto en el camino NFKB can6nico, sino que mas bien sirve exclusivamente para activar el camino alternativo (vease Pomerantz y Baltimore, 2002, para revisi6n).

Finalmente, se demostr6 que aunque la inducci6n de la degradaci6n de IkappaB en los linfocitos por TNF es independiente de NIK, su inducci6n por CD70, ligando CD40, y BLyS/FAFF, que inducen tambien el procesamiento de NFKB2/p100, depende de hecho de la funci6n de NIK (Ramakrishnan et al. 2004). Tanto CD70 como TNF inducen reclutamiento del complejo de quinasas IKK en sus receptores. En el caso de CD70, pero no de TNF, este proceso esta asociado con reclutamiento de NIK y va seguido por una asociaci6n prolongada de receptores de IKK1 y NIK. El reclutamiento del complejo de IKK en CD27, pero no el de NIK, depende de la funci6n de la quinasa NIK. Estos descubrimientos indican que NIK participa en una serie unica de sucesos de senalizaci6n proximales iniciados por inductores especificos, que activan los dimeros NFkappaB tanto can6nicos como no can6nicos.

La familia TRAF en los mamiferos esta constituida por siete miembros TRAF1TRAF7 (Bradley y Pober 2001, Xu et al., 2004). Las TRAFs desempenan funciones importantes tanto en la inmunidad adaptativa como en la innata, principalmente por la activaci6n de los factores de transcripci6n NFkB y AP1 (Wajant y Scheurich, 2004). Todas las proteinas TRAF comparten una regi6n de homologia Cterminal denominada dominio TRAF que es capaz de fijarse a los dominios citoplasmicos de receptores y a otras proteinas TRAF. Adicionalmente, las proteinas TRAF2TRAF7 tienen motivos con dedos de anillo y dedos de cinc en su termino N que son importantes para sucesos de senalizaci6n aguas abajo.

Se establecieron ratones knockout en genes TRAFs (revisado por Bishop 2004, Bradley 2001, y Chung 2002). Los knockout TRAF2 mueren prematuramente, y no presentan activaci6n alguna de JNK mediada por TNF en los fibroblastos. Los mismos presentan niveles elevados de TNF en suero y sensibilidad incrementada a la muerte inducida por TNF en timocitos y fibroblastos. Adicionalmente, dichos ratones tienen celulas B deterioradas en el TNF y activaci6n NFKB can6nica inducida por CD40. Asimismo, dichos animales presentan una degradaci6n deficiente de TRAF3 inducida por CD40 y activaci6n constitutiva alternativa de NFKB en las celulas B. Los knockout TRAF3 exhiben deficiencia en todos los linajes de leucocitos perifericos. Los mismos presentan un cambio de isotipo deficiente en respuesta a los antigenos dependientes de T y senalizaci6n LMP1 deficiente en las celulas B.

SUMARIO DE LA INVENCION

En un aspecto, la invenci6n se refiere a un metodo para identificar un polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B de SEQ ID NO: 6 o un hom6logo del mismo que tiene un motivo con dedo de anillo semejante a caja B que carece de histidina y que tiene actividad relacionada con ubiquitinaci6n que comprende: (i) poner en contacto polipeptidos que comprenden una ubiquitina, un E1, un E2, y dicho polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B de SEQ ID NO: 6 o dicho hom6logo del mismo; (ii) medir el enlace de ubiquitina a dicho polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B, en donde la detecci6n de la ubiquitina enlazada a dicho polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B es indicativa de que dicho polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B tiene actividad relacionada con ubiquitinaci6n.

En un aspecto adicional, y como se define en las reivindicaciones, la invenci6n se refiere a un metodo para identificar un polipeptido SIVA que tiene actividad relacionada con ubiquitinaci6n que comprende: (i) poner en contacto polipeptidos que comprenden una ubiquitina, un E1, un E2, y un polipeptido SIVA; (ii) y detectar si dicha ubiquitina se enlaza a dicho polipeptido SIVA, en donde la detecci6n de ubiquitina enlazada a dicho polipeptido SIVA es indicativa de que dicho polipeptido SIVA tiene actividad relacionada con ubiquitinaci6n.

En una realizaci6n de la invenci6n, el metodo tiene por objeto la identificaci6n de un polipeptido SIVA capaz de exhibir actividad relacionada con ubiquitinaci6n K63.

En una realizaci6n adicional de la invenci6n, el polipeptido de ubiquitina es ubiquitina mutada en K48.

En otro aspecto adicional, la invenci6n se refiere a un metodo para identificar un polipeptido SIVA que tiene actividad directa o indirecta relacionada con ubiquitinaci6n que comprende: (i) poner en contacto polipeptidos que comprenden una ubiquitina, un E1, un E2, un polipeptido TRAF2, y opcionalmente un E3 en presencia o ausencia de un polipeptido SIVA; (ii) medir el nivel de ubiquitinaci6n del polipeptido TRAF2 en presencia y en ausencia del polipeptido SIVA; y (iii) comparar el nivel de ubiquitinaci6n de TRAF2 en presencia y en ausencia del polipeptido SIVA, en donde el aumento en el nivel de ubiquitinaci6n de TRAF2 en presencia del polipeptido SIVA es indicativo de que el polipeptido SIVA tiene actividad directa o indirecta relacionada con ubiquitinaci6n.

En una realizaci6n de la invenci6n, se testa la actividad relacionada con ubiquitinaci6n K48 de un polipeptido SIVA.

En una realizaci6n adicional de la invenci6n, el polipeptido SIVA consiste en SIVA2.

En otro aspecto adicional, la invenci6n se refiere a un metodo para identificar un agente capaz de modular la actividad relacionada con ubiquitinaci6n de un polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B de SEQ ID NO: 6 o un hom6logo del mismo, teniendo un motivo con dedo de anillo semejante a caja B que carece de histidina y que tiene actividad relacionada con ubiquitinaci6n, que comprende: (i) poner en contacto polipeptidos que comprenden una ubiquitina, un E1, E2, el polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B de SEQ ID NO: 6 o un hom6logo del mismo en presencia o en ausencia de un agente candidato, en condiciones que permiten la ubiquitinaci6n de dicho polipeptido que alberga un polipeptido de anillo semejante a caja B mediada por dicho polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B; (ii) medir el nivel de ubiquitinaci6n de dicho polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B en presencia o en ausencia de dicho agente candidato; y (iii) comparar el nivel de ubiquitinaci6n en presencia y en ausencia de dicho agente candidato, en donde un cambio en el nivel de ubiquitinaci6n de un polipeptido que alberga un polipeptido de anillo semejante a caja B en presencia de dicho agente candidato es indicativo de que el agente candidato es capaz de modular la actividad relacionada con ubiquitinaci6n de dicho polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B.

En otro aspecto adicional y como se define en las reivindicaciones, la invenci6n se refiere a un metodo para identificar un agente capaz de modular una actividad relacionada con ubiquitinaci6n de un polipeptido SIVA, que comprende: (i) poner en contacto polipeptidos que comprenden una ubiquitina, un E1, E2, y el polipeptido SIVA en presencia

o en ausencia de un agente candidato, en condiciones que permiten la autoubiquitinaci6n del polipeptido SIVA; (ii) medir el nivel de autoubiquitinaci6n del polipeptido SIVA en presencia y en ausencia del agente candidato; y (iii) comparar el nivel de autoubiquitinaci6n de dicho polipeptido SIVA en presencia y en ausencia de dicho agente de test, en donde un cambio en el nivel de autoubiquitinaci6n de dicho polipeptido SIVA en presencia de dicho agente candidato es indicativo de que el agente candidato es capaz de modular la actividad de SIVA relacionada con ubiquitinaci6n.

En una realizaci6n de la invenci6n, la ubiquitinaci6n es ubiquitinaci6n mutada en K48.

En una realizaci6n adicional de la invenci6n, el contacto de los polipeptidos se lleva a cabo dentro de celulas.

En una realizaci6n adicional de la invenci6n, el contacto de los polipeptidos se lleva a cabo in vitro o en un sistema o ensayo exento de celulas.

En una realizaci6n adicional de la invenci6n, la ubiquitinaci6n se detecta por analisis de transferencia Western.

En otra realizaci6n adicional de la invenci6n, dicho agente candidato se selecciona de moleculas organicas pequenas, peptidos, acidos nucleicos, moleculas de extractos naturales, y compuestos organicos sinteticos.

La descripci6n se refiere al uso de un agente capaz de modular la actividad relacionada con ubiquitinaci6n directa o indirecta de un polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B de la secuencia en SEQ ID NO: 6 o una secuencia hom6loga de la misma, en la fabricaci6n de un medicamento para tratamiento o prevenci6n de una enfermedad, trastorno o afecci6n cuya patologia o cuyo curso esta asociado con la actividad y/o niveles de TRAF2, NIK, TRAF3 y/o SIVA.

La enfermedad puede ser infecci6n viral.

En otro aspecto adicional, la invenci6n proporciona un polipeptido aislado constituido por una caja B de la secuencia indicada en SEQ ID NO: 6.

En otro aspecto adicional, la invenci6n proporciona un polipeptido aislado que comprende un fragmento Cterminal de un polipeptido SIVA que incluye el dedo de anillo semejante a caja B y/o los motivos con dedo de cinc excepto en lo que respecta a SIVA1 y SIVA2.

En otro aspecto adicional, la invenci6n proporciona un polipeptido aislado constituido por los residuos de aminoacido 58 a 110 de SIVA3 que se muestran en SEQ ID NO: 3.

Se describe un polipeptido aislado que comprende un fragmento Nterminal de un polipeptido SIVA que carece del motivo con dedo de cinc 181 (SEQ ID NO: 5), o un fragmento del mismo.

Se describe adicionalmente un polipeptido aislado que comprende un fragmento Nterminal de un polipeptido SIVA que carece del motivo con dedo de Zn y el motivo con dedo de anillo semejante a caja B de SIVA 2 158 (SEQ ID NO: 4).

En otro aspecto adicional, la invenci6n proporciona un polipeptido aislado constituido por SEQ ID NO: 3, o un fragmento del mismo.

Se describe un polipeptido aislado que comprende un polipeptido SIVA mutado en un residuo cisteina localizado en el motivo con dedo de anillo.

En otro aspecto adicional, la invenci6n proporciona una sal de un polipeptido de acuerdo con la invenci6n.

En otro aspecto adicional, la invenci6n proporciona un polinucle6tido aislado que codifica un polipeptido de acuerdo con la invenci6n.

En otro aspecto adicional, la invenci6n proporciona un polinucle6tido aislado que comprende la secuencia tal como SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9.

En otro aspecto adicional, la invenci6n proporciona un vector que comprende un polinucle6tido de acuerdo con la invenci6n.

En otro aspecto adicional, la invenci6n proporciona una celula hospedadora que alberga un vector de acuerdo con la invenci6n.

En otro aspecto adicional, la invenci6n proporciona un metodo para preparar un polipeptido de acuerdo con la invenci6n, que comprende cultivar una celula hospedadora de acuerdo con la invenci6n y aislar el polipeptido producido.

En otro aspecto adicional, la invenci6n proporciona un kit util para la ubiquitinaci6n de un sustrato proteinico que comprende E1, E2, ubiquitina y un polipeptido SIVA. Pueden proporcionarse instrucciones.

En una realizaci6n de la invenci6n, el sustrato proteinico se selecciona de TRAF2, TRAF3, NIK y SIVA.

En otro aspecto adicional, la invenci6n proporciona, como se define en las reivindicaciones, una composici6n farmaceutica que comprende un vector de acuerdo con la invenci6n y un vehiculo farmaceuticamente aceptable.

En otro aspecto adicional, la invenci6n proporciona, como se define en las reivindicaciones, una composici6n farmaceutica que comprende un polipeptido de acuerdo con la invenci6n o una sal del mismo y un vehiculo farmaceuticamente aceptable.

En otro aspecto adicional, la invenci6n proporciona, como se define en las reivindicaciones, una composici6n farmaceutica que comprende un polinucle6tido de acuerdo con la invenci6n y un vehiculo farmaceuticamente aceptable.

Se describe tambien una composici6n farmaceutica que comprende un agente capaz de modular la actividad relacionada con ubiquitina de un polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B de la secuencia de SEQ ID NO: 6

o una secuencia hom6loga de la misma, y un vehiculo farmaceuticamente aceptable, v.g. siendo el polipeptido que alberga el anillo semejante a caja B un polipeptido SIVA.

Se describe una composici6n farmaceutica que comprende un agente capaz de modular la degradaci6n de proteinas mediada por la actividad de un polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B de la secuencia de SEQ ID NO: 6 o una secuencia hom6loga de la misma y un vehiculo farmaceuticamente aceptable.

En una realizaci6n de la invenci6n, el polipeptido que alberga el anillo semejante a caja B es un polipeptido SIVA.

La memoria descriptiva proporciona una composici6n farmaceutica que comprende un agente capaz de modular la actividad de ubiquitinaligasa de un polipeptido SIVA o un hom6logo del mismo, y un vehiculo farmaceuticamente aceptable.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figs. 1A1J muestran que SIVA se fija a NIK tanto in vivo como in vitro y modula su funci6n. A. Fijaci6n de NIK a SIVA en tests de dos hibridos en levadura. La fijaci6n de NIK y su mutante truncado en el terminal N (NIK 624947) a la parte terminal de SIVA (aminoacidos 123175 en SIVA1 o 58110 en SIVA2) o TRAF2 se valor6 en levadura transformada SFY526. '++' y '+' indican el desarrollo de color intenso dentro de 1 hora y 3 horas despues de la iniciaci6n del ensayo, respectivamente, y '' la ausencia de desarrollo de color dentro de 24 horas. B. Coinmunoprecipitaci6n de NIK (o de NIK en el que se habia introducido una mutaci6n sin sentido correspondiente a la encontrada en los ratones aly) con SIVA y C, SIVA con NIK de celulas HEK 293T transfectadas transitoriamente. D. Aumento de la expresi6n de NIK transfectada por coexpresi6n de SIVA, NIK, SIVA, IKK1 y GFP se transfectaron en ratio 1:1 y los

lisados totales se analizaron por transferencia Western 24 horas despues de la transfecci6n. E. Fijaci6n in vitro de NIK y SIVA2. GSTSIVA2 expresado bacterialmente y NIK expresado en baculovirus sin termino N se mezclaron y se incubaron a 10°C durante 30 min. El inmunoprecipitado antiNIK se analiz6 por transferencia Western con antiSIVA. F. CD70 facilita la asociaci6n de SIVA2 con NIK. Celulas Ramos que expresaban constitutivamente NIK marcada con myc se trataron durante 20 min con CD70 seguido por inmunoprecipitaci6n de NIK y analisis Western de la asociaci6n de SIVA con el mismo. El sobrenadante de cultivo de las celulas HEK 293T que expresaban CD70 se utiliz6 a diluci6n de 50% para tratamiento de las celulas en todos los experimentos. G. El disparo de CD40L impulsa la asociaci6n de NIK con SIVA2. Celulas linfoblastoides humanas BJAB que expresaban constitutivamente NIK transfectada se infectaron con un vector retroviral que expresaba SIVA2 y un marcador de selecci6n de resistencia a puromicina. La agrupaci6n de celulas resistentes a puromicina se activ6 durante los momentos indicados con CD4L

o H. TRAIL (100 ng/ml). Se inmunoprecipit6 NIK y el SIVA coprecipitado se analiz6 por transferencia Western. Para el tratamiento con CD40L, las celulas se resuspendieron en sobrenadantes de cultivo de celulas HEK 2931 que expresaban CD40L. I. Coexpresi6n de NIK y sus mutantes del dominio de fijaci6n TRAF2 en celulas HeLa. (Aminoacidos NIK 304* 332335, SVEE mutado a SVAA y aminoacidos NIK 704* 702705, PAEE mutado a PAAA). Inmunoprecipitados antiNIK analizados por transferencia Western para coprecipitaci6n de SIVA2 (4 pistas de la izquierda), y lisados totales que muestran el nivel de expresi6n de SIVA2 (4 pistas de la derecha). J. Aumento de la activaci6n de NFKB mediada por NIK por SIVA coexpresado. El efecto de la sobreexpresi6n de NIK, sola o junto con SIVA1 o SIVA2 sobre la expresi6n de NFKB luciferasa en las celulas HEK 293T se valor6 24 horas despues de la transfecci6n. Observese que la expresi6n de NIK aly da tambien como resultado una activaci6n significativa de NFKB. Sin embargo, SIVA no aumenta esta activaci6n. Los datos presentados son los valores medios de los obtenidos en dos experimentos en los cuales cada test se realiz6 por triplicado.

Figs. 2A2F muestran que la regi6n con dedo de anillo /cinc de SIVA esta implicada en la modulaci6n de la funci6n de NIK. A. Representaci6n diagramatica de la estructura de SIVA2 y de los mutantes de deleci6n utilizados en los experimentos. B. NIK marcado con myc y SIVA2 marcado con HIS y dos mutantes de deleci6n Cterminales de los mismos se expresaron en celulas HEK 293T seguido por inmunoprecipitaci6n de NIK y analisis por transferencia Western como se indica. C. El efecto de la sobreexpresi6n de NIK, sola o junto con SIVA2 y sus mutantes de deleci6n sobre la expresi6n de NFKB luciferasa en celulas HEK 293T se evalu6 24 horas despues de la transfecci6n. D. Efecto de la expresi6n de SIVAC sobre la activaci6n de NFKB inducida por NIK y NIK aly, y E. Efecto de la expresi6n de SIVAC sobre la activaci6n de NFKB inducida por CD70 en celulas HEK 293T transfectadas por CD27. Los datos presentados son los valores medios de los obtenidos en dos experimentos en los cuales cada test se realiz6 por triplicado. F. El termino C de SIVA se expres6 constitutivamente en celulas B Ramos linfoblastoides. Detecci6n por transferencia Western de SIVA2 marcado con His (panel inferior). Se sondaron extractos nucleares con anticuerpo antip52 (panel superior).

Figs. 3A3F muestran que la ubiquitinaci6n de NIK esta mediada por SIVA2. A. Plasmidos que codificaban NIK y ubiquitina se transfectaron a una ratio 1:3 en celulas HEK 293T. Veinticuatro horas mas tarde, se prepararon lisados y se inmunoprecipitaron con anticuerpo antiNIK y se analizaron por transferencia Western. B. Se transfectaron celulas HeLa con NIK y se expusieron al inhibidor proteas6mico MG132 (25 IM) durante las 4 ultimas horas de la transfecci6n de 24 horas. Se utiliz6 DMSO como el control de diluyente y los lisados totales se analizaron por transferencia Western utilizando antiNIK. C. Se coexpres6 NIK con mutantes de ubiquitina a una ratio 1:3 en celulas HEK 293T. La NIK inmunoprecipitada se analiz6 por transferencia Western con anticuerpo antiubiquitina. D. Cotransfecci6n de NIK o NIK K670A con SIVA2 y una ubiquitina en la que 4 lisinas estaban reemplazadas por arginina para eliminar la poliubiquitinaci6n en celulas HeLa. Los lisados totales de celulas se analizaron por transferencia Western antiNIK. E. Cotransfecci6n de NIK con SIVA2 y un plasmido mutante de ubiquitina marcado con HA que no puede formar cadenas de poliubiquitina K63. El inmunoprecipitado antiNIK se analiz6 por transferencia Western antiHA para monitorizar las cadenas de poliubiquitina enlazadas a K48. F. Se sobreexpres6 transitoriamente NIK en celulas HEK 293T con SIVA1, SIVA2 o SIVA2 en la cual el dedo de anillo estaba mutado (C73A). Se inmunoprecipit6 NIK de los lisados de celulas y se sond6 respecto a conjugaci6n de ubiquitina a NIK (panel superior) sondada respecto a la coprecipitaci6n de las proteinas SIVA (panel inferior). G. Celulas Ramos que expresaban NIK transducida retroviralmente se trataron con CD70. La NIK inmunoprecipitada se analiz6 por transferencia Western utilizando anticuerpo antiNIK. H. Celulas HEK 293T que expresaban de manera estable el receptor CD27 y NIK se trataron con CD70. La NIK inmunoprecipitada se analiz6 por transferencia Western utilizando anticuerpo antiubiquitina para monitorizar la ubiquitinaci6n de NIK.

Figs. 4A4E muestra la regulaci6n negativa de NIK por SIVA2. A. NIK 0,5 Ig y SIVA2 a las ratios indicadas se expresaron transitoriamente en celulas HEK 293T con una luciferasa informadora de NFKB. Veinticuatro horas mas tarde, se lisaron las celulas y se determin6 luminometricamente su actividad de luciferasa. El resultado representa el valor medio de duplicados de uno de los tres experimentos independientes. B. NIK (0,5 Ig de plasmido) sin o con SIVA2 (1,5 Ig y 3 Ig de plasmido) se expres6 transitoriamente en celulas HeLa. Durante las ultimas 6 horas de las 30 horas de incubaci6n, las celulas se trataron con los inhibidores proteas6micos, Lactacistina 20 IM o MG132 50 IM, y los lisados totales se analizaron por transferencia Western. C. El plasmido SIVA2 (1,5 Ig y 3 Ig) se transfect6 en celulas HEK 293T que expresaban establemente NIK. Treinta horas despues de la transfecci6n, los lisados totales se analizaron por transferencia Western para los niveles de NIK y SIVA2. D. Se cotransfectaron dos mutantes de deleci6n de SIVA2 con NIK (0,5 Ig) a ratios 1:3 y 1:6. Los niveles de NIK en los lisados se evaluaron 30 horas despues de la transfecci6n. El panel inferior muestra actina como control de carga. E. Se cotransfect6 el plasmido NIK

(4 Ig) con SIVA 158 o SIVAplasmido C (8 Ig) y HAUbiquitina K48R o el plasmido mutante K63R (6 Ig) en celulas HeLa. Veinticuatro horas despues de la transfecci6n, se cosecharon las celulas, se lisaron y se inmunoprecipitaron con anticuerpo antiNIK. La transferencia Western se realiz6 con antiHA para detecci6n de los conjugados de ubiquitina en NIK.

Figs. 5A5F muestran que la mutaci6n del residuo lisina 670 en NIK protege NIK contra la regulaci6n decreciente por SIVA2. A. Tabla que muestra la extensi6n de ubiquitinaci6n de diversas deleciones de NIK. B. coexpresi6n de NIK K670A con mutantes de ubiquitina K48R y K63R en celulas HEK 293T (panel derecho) comparada con la NIK de tipo salvaje (panel izquierdo). La NIK inmunoprecipitada se analiz6 con un anticuerpo antiubiquitina. C. Degradaci6n de la NIK de tipo salvaje (0,5 Ig de plasmido) comparada con el mutante NIK K670A por la concentraci6n creciente de SIVA2 (1,0, 2,0 y 3,0 Ig de plasmido) y D. por TRAF3 en celulas HeLa transfectadas. E. Degradaci6n de NIK de tipo salvaje, NIK aly y NIK K670A por SIVA2C73A en celulas HeLa transfectadas. Los paneles inferiores en C, D y E muestran actina como control de carga. F. Coprecipitaci6n de SIVAC con NIK y su ubiquitinaci6n (condiciones como en Fig. 4E).

Figs. 6A6D muestran que SIVA2 es una ligasa E3. La ubiquitinaci6n de K63 inducida por SIVA2 es inhibida por A. mutante cataliticamente inactivo Ubcl3 (C87A) y B. sobreexpresi6n de CYLD. Los plasmidos indicados se cotransfectaron en celulas HeLa y se prepararon lisados de celulas 24 horas despues de la transfecci6n. Se sondaron inmunoprecipitados antiNIK en transferencia Western con antiHA para detectar la ubiquitinaci6n y los lisados totales con antiNIK. C. Se coexpres6 NIK (0,5 Ig de plasmido) con SIVA2 (1,5 Ig y 3,0 Ig de plasmido) y TRAF2 (0,5 Ig de plasmido) como se indica. Se prepararon lisados totales de celulas 30 horas despues de la transfecci6n y se sondaron con antiNIK y antiIKK1. D. Se incub6 GSTSIVA2 con E1 (200 ng/50 Il) y E2, Ubcl3/Uev1 (500 ng/50 Il), enzimas en un ensayo de ubiquitinaci6n in vitro. Despues de una hora a 37°C, las muestras se inmunoprecipitaron con anticuerpo antiGST. Tanto IP como los lisados totales se analizaron por transferencia Western utilizando antiSIVA.

Figs. 7A7H muestran que la regulaci6n creciente o regulaci6n decreciente de SIVA interfiere con la funci6n de NIK.

A. RTPCR para testar la eficiencia de diversos pSUPERsiRNAs para suprimir SIVA en celulas HEK 293T. Se sembraron placas de 6 pocillos con 200.000 celulas/pocillo y se transfectaron con diversos pSUPERsiRNAs por el reactivo lipofectamina 2000 (Invitrogen). Las celulas se cosecharon despues de 48 horas de transfecci6n y el RNA se extrajo utilizando el reactivo TRIZOL (Invitrogen). El panel inferior muestra GAPDH como control para la cuantificaci6n. B. Se cotransfectaron celulas HEK 293T con CD27 o p55 TNFR y p35 (inhibidor de pancaspasas para proteger las celulas de la muerte inducida por TNFR), informador NFKB luciferasa y pSUPERSIVA siRNA NC3. Veintiseis horas despues, las celulas transfectadas CD277 se trataron con CD70 durante 4 h, seguido por evaluaci6n de la actividad de luciferasa asi como la generaci6n de p52. C. Niveles de mRNA de SIVA en celulas Ramos transducidas con vector lentiviral codificante de siRNA NC3 bajo el promotor H1. D. CD70 inducia translocaci6n nuclear de NFKB en celulas Ramos en las cuales la expresi6n de SIVA estaba reprimida por transducci6n lentiviral de SIVA de siRNA. E. Celulas Ramos (1 x 106/momento) que expresaban constitutivamente SIVA2 y celulas de control de vector se trataron con CD70 o TNF durante los tiempos indicados. Los extractos citoplasmicos y nucleares se analizaron utilizando los anticuerpos indicados. F. Inmunoprecipitaci6n de FLAGSIVA2 expresado transitoriamente a partir de celulas HeLa. Se aplic6 MG132 a 25 IM durante las 4 ultimas horas de una transfecci6n de 24 horas. G. Se expresaron de manera estable el receptor CD27 y SIVA2 inducible por ecdisona en celulas 293 con el represor de ecdisona. Se sembraron placas de 6 pocillos con 200.000 celulas/pocillo y se indujo SIVA2 con 10 IM del analogo de ecdisona, ponasterona. Se aplic6 CD70 junto con el inductor durante 12 horas o durante los 20 ultimos minutos de una inducci6n de 12 horas. Se cosecharon las celulas, se prepararon extractos nucleares y citoplasmicos y se analizaron por transferencia Western. H. Muestra el efecto de la silenciaci6n de SIVA sobre la translocaci6n nuclear de p52 y p65 mediada por NIK en celulas 293CD27 tratadas con CD70. Las celulas HEK 293T que expresaban NIK transducida retroviralmente se transfectaron con pSUPER SIVA o vector vacio pSUPER como control tratado con medio que expresaba CD70 durante 8 horas o se dejaron sin tratar, se prepararon extractos nucleares y citoplasmicos y se analizaron por transferencia Western con anticuerpos especificos apropiados para detecci6n de NIK, p100, p52, y p65. Se utilizaron anticuerpos especificos de actina para detectar actina, como el control interno. Los resultados muestran que la silenciaci6n de SIVA eleva los niveles de NIK en el citoplasma y de p52 en el nucleo.

Figs. 8A8C muestran que SIVA2 puede ser posiblemente un sustrato de NIK. A. Se coexpresaron mycNIK, HISSIVA2 y sus mutantes como se indica en celulas HEK 293T seguido por inmunoprecipitaci6n de SIVA y reacci6n de quinasas in vitro. B. Se coexpres6 SIVA2 con NIK de tipo salvaje o inactiva por quinasas en celulas HeLa. Veinticuatro horas despues de la transfecci6n se analizaron los lisados totales respecto a expresi6n de SIVA. El panel inferior muestra actina como control de carga. C. Ensayo de quinasas in vitro (panel superior). Se coexpresaron NIK (6 Ig de plasmido) e IKK1 o IKK2 desactivadas por quinasas (6 Ig de plasmido cada una) con FLAGSIVA2 (8 Ig de plasmido) en celulas HEK 293T. Veinticuatro horas despues de la transfecci6n, se realiz6 una inmunoprecipitaci6n con antiFLAG a partir de los lisados y se realiz6 un ensayo de quinasas. Los lisados totales se analizaron por transferencia Western utilizando los anticuerpos indicados para verificar el nivel de expresi6n de proteinas transfectadas (panel inferior).

Figs. 9A9H muestran la ubiquitinaci6n de TRAF3 y la escisi6n mediada por NIK cooperativamente con SIVA2. A. Se sembraron celulas HEL293T (200.000 celulas/pocillo) en placas de 6 pocillos y se transfectaron 24 horas mas tarde

con los plasmidos siguientes como se indica en la figura: myc NIK 0,2 Ig, FLAGSIVA2 0,3 Ig, HISTRAF3 0,3 Ig y HIVluciferasa 1,0 Ig. Veinticuatro horas mas tarde, se lisaron las celulas y se determin6 luminometricamente su actividad de luciferasa. Los resultados representan el valor medio de duplicados de uno de los dos experimentos independientes. B. El plasmido TRAF3 (3,0 Ig), el plasmido NIK (4,0 Ig) y el plasmido ubiquitina (4,0 Ig) se cotransfectaron en celulas HEK 293T en placas de 9 cm (1,5 x 106 celulas/placa). Las celulas se cosecharon 24 horas despues de la transfecci6n y los lisados totales se analizaron por transferencia Western utilizando anticuerpo antiTRAF3. Las marcas de flecha indican formas TRAF3 modificadas. C. HEK 293T (1,5 x 106 celulas/placa) sembradas en 9 cm se transfectaron con 4,0 Ig cada una de los plasmidos indicados. Las celulas se cosecharon 24 horas despues de la transfecci6n y los lisados totales se analizaron por transferencia Western antiTRAF3. D. HISTRAF3 (3,0 Ig), FLAGSIVA2 (6,0 Ig) y HAUbiquitina K48R (6,0 Ig) se transfectaron como en B y el inmunoprecipitado antiHIS se someti6 a transferencia Western utilizando anticuerpo antiHA. E. Se realizaron transfecciones como en D. En la pista 4, se cotransfectaron tambien 4,0 Ig de plasmido p35. La pista 5 se trat6 con 25 IM de MG132 durante las 8 horas de una incubaron de 24 horas subsiguiente a la transfecci6n. F y G. Se realizaron transfecciones como en C y 28 horas despues de las transfecciones se cosecharon las celulas y se lisaron en tamp6n que contenia 1% Triton X100 durante 20 min en hielo. El lisado se centrifug6 a 10.000 g y el sobrenadante se recogi6 como fracci6n soluble en Triton. El sedimento se resuspendi6 en tamp6n de muestra y se hirvi6 para obtener una fracci6n insoluble en Triton. H. Se realizaron transfecciones como en C, y los lisados se inmunoprecipitaron con anticuerpo antiFLAG para precipitar SIVA2 y se sondaron con antiTRAF3.

Figs. 10A10D muestran el efecto de SIVA2 sobre la activaci6n de ligando de NFKB en celulas HEK 293T, HeLa y Ramos. A. Celulas HeLa TREX capaces de expresar SIVA2 inducible por tetraciclina (o doxiciclina) se trataron con medio enriquecido LIGHT durante 8 horas a fin de activar NFKB. Despues del tratamiento con LIGHT se lisaron las celulas y la fracci6n nuclear se aisl6 y se someti6 a analisis por transferencia Western sondado con anticuerpos especificos antip52, RelB o p65. LIGHT inducia translocaci6n nuclear tanto de p52 como de p65 en las celulas HeLa. Una inducci6n breve de SIVA2 mejoraba la translocaci6n nuclear tanto de p52 como de p65, mediada por LIGHT, mientras que una inducci6n larga de SIVA2 interferia con la translocaci6n nuclear tanto de p52 como de p65 mediada por LIGHT.

B. cDNA de SIVA2 clonado en el vector pIND se expresaba de manera estable en el sistema de celulas 293ecr (Invitrogen). Este sistema permite la expresi6n inducible mediada por ecdisona (o el analogo ponasterona) de SIVA2 clonado. Estas celulas se trataron durante 8 horas con CD70 para inducir la activaci6n del camino alternativo NFKB

o se dejaron sin tratar. Despues del tratamiento, las celulas se lisaron, se fraccionaron en fracciones citoplasmica y nuclear y se sometieron a analisis por transferencia Western sondado con anticuerpos antiNIK, TRAF2, TRAF3 p100 y p52, La inducci6n de SIVA2 por un tiempo breve, al menos durante la ultima hora de la inducci6n con CD70, reducia el nivel de TRAF2/3 y aumentaba los niveles de procesamiento de NIK y p100, dando como resultado niveles de p52 nuclear incrementados. La inducci6n de SIVA2 durante un tiempo largo, 8 horas junto con el tratamiento con CD70, reducia los niveles de NIK y p52 nuclear. C. Celulas Ramos que albergaban el sistema TREX capaces de expresar SIVA2 inducible por tetraciclina (o doxiciclina) o el mutante SIVA2C73A se trataron con CD70 durante 0, 0,3 u 8 horas, y se explor6 el efecto de la inducci6n de SIVA2 o el mutante SIVA2C73A durante largo tiempo (8 horas), un tiempo breve (1 hora) sobre la activaci6n de NFKB inducida por CD70. Como se indica en la figura, durante el tratamiento de 8 horas de ligando con inducci6n de SIVA, se aplic6 doxiciclina junto con el ligando. Para 1 hora de inducci6n de SIVA, se anadi6 doxiciclina en la hora final del tratamiento de ligando de 8 horas. En el caso de tratamiento con CD70 durante tiempo breve, se anadi6 doxiciclina durante 8 horas o durante 1 hora y el ligando se aplic6 durante las 0,3 horas finales. Las celulas tratadas e inducidas como se indica, se lisaron, se fraccionaron en extractos nucleares y citoplasmicos, y estas fracciones se sometieron a analisis por transferencia Western sondado con anticuerpos especificos antiIKBa, p65, p100 y p52. La inducci6n de SIVA2 de tipo salvaje bloqueaba la degradaci6n de IKBa inducida por CD70 y translocaci6n de p65 al nucleo. La inducci6n del mutante de SIVA con dedo de anillo no bloqueaba la degradaci6n de IKBa inducida por CD70 e intensificaba la translocaci6n nuclear de p65. La inducci6n de SIVA2 bloqueaba tambien la translocaci6n nuclear de p52 inducida por CD70 de una manera dependiente del dedo de anillo. D. Celulas Ramos TREX capaces de expresar SIVA2 inducible por tetraciclina o el mutante SIVA2C73A se trataron con TNF durante 0, 0,3 y 4 horas, y el efecto de la inducci6n durante largo tiempo (4 horas)

o tiempo breve (1 hora) de SIVA2 o SIVA2C73A sobre la translocaci6n de p65 inducida por TNF al nucleo se explor6 como se ha descrito arriba. Despues de los tratamientos, las celulas se lisaron, se fraccionaron en extractos nuclear y citoplasmico, y se sometieron a analisis por transferencia Western sondados con anticuerpos especificos antip65. La inducci6n de SIVA2 de tipo salvaje bloqueaba la translocaci6n de p65 inducida por TNF al nucleo. La inducci6n del mutante SIVA con dedo de anillo no bloqueaba la translocaci6n nuclear de p65 inducida por TNF.

Figs. 11A11H A muestra la ubiquitinaci6n in vitro de TRAF2 por SIVA2. Se realizaron ensayos de ubiquitinaci6n in vitro en una reacci6n que contenia solamente HISUbiquitinaK63 recombinante, E1, E2 (heterodimero Ubc13/Uev1) (tanto E1 como E2 se adquirieron de Boston Biochem) y de GSTSIVA o GSTSIVAC73A recombinantes con TRAF2 marcado con FLAG en un tamp6n que contenia 30 mM HEPES de pH 7,6, 5 mM MgCl2, 2 mM ATP, 0,2 mM DTT, 5 mM citrato de sodio, 10 mM fosfato de creatina, 0,2 Ig/ml creatinaquinasa y 5 IM ubiquitinaaldehido. TRAF2 marcado con FLAG se prepar6 por transfecci6n de pcFLAG TRAF2 en celulas HEK 293T. Veinticuatro horas despues de la transfecci6n, las celulas se lisaron en tamp6n de lisis que contenia 1% Triton X100 y se inmunoprecipitaron utilizando cuentas antiFLAG M2 (Sigma). El TRAF2 inmunoprecipitado se eluy6 con el peptido FLAG y se concentr6 utilizando una columna Microcon (MWCO3000) y se utiliz6 en la reacci6n de ubiquitinaci6n in vitro. Las reacciones

se incubaron a 30°C durante 1 hora. Se inmunoprecipit6 TRAF2 utilizando cuentas antiFLAG M2 durante 4 horas a 4°C. Los inmunoprecipitados se sometieron a transferencia Western con anticuerpo antiTRAF2 (H249, Santa Cruz).

B. Muestra que las celulas Ramos que se modificaron por ingenieria genetica para expresar de manera estableel termino C de SIVA exhiben un nivel elevado de p52 asi como TRAF3 y una expresi6n reducida de TRAF2. C. Muestra que TRAF2 se fija a SIVA2. Se incub6 TRAF2 marcado con FLAG a 30°C durante 1 hora con SIVA2 recombinante marcado con GST (expresado bacterialmente) o con el mutante SIVA2 con dedo de anillo marcado con GST. A continuaci6n, se llev6 a cabo la inmunoprecipitaci6n con antiFLAG para TRAF2 y se realiz6 el analisis por transferencia Western con antiSIVA para detectar el SIVA coprecipitante. El SIVA2 recombinante expresado bacterialmente marcado con GST aparece como dos bandas en las transferencias Western. La mutaci6n con dedo de anillo en SIVA2 podia causar una variaci6n de la conformaci6n que de como resultado una afinidad de fijaci6n alterada a TRAF2. Esto esta en linea con la observaci6n en Fig. 11D, donde se encontr6 que TRAF2 se fijaba al dedo de anillo de SIVA2. D. Muestra que el dedo de anillo de SIVA es importante para la fijaci6n a TRAF2. Se cotransfectaron celulas HEK 293T con un plasmido que codificaba HISSIVA2 o deleciones de SIVA2, SIVA2 158 que carecia del dedo de anillo o SIVA181 y un plasmido que codificaba FLAGTRAF2. Veinticuatro horas despues de la transfecci6n, se cosecharon y lisaron las celulas. Se inmunoprecipit6 TRAF2 utilizando cuentas antiFLAGM2 y el SIVA2 coprecipitado se sond6 por transferencia Western utilizando anticuerpo antiHIS. La lisis total muestra los niveles de expresi6n de las proteinas. SIVA no coprecipitaba con TRAF2 cuando el dedo de anillo esta ausente (SIVA2 158) y coprecipita unicamente cuando el dedo de anillo esta presente (SIVA2 intacto y SIVA2 181). E. Muestra que la sobreexpresi6n de SIVA en celulas HEK 293T aumenta la ubiquitinaci6n K48 de TRAF2. Se transfectaron celulas HEK 293T con el plasmido codificante de FLAG2TRAF2, HISSIVA2 y mutante de ubiquitina. Veinticuatro horas despues de la transfecci6n, las celulas se lisaron, se inmunoprecipitaron, y se analizaron por transferencia Western utilizando anticuerpos especificos. Se utiliz6 el mutante TRAF2 con dedo de anillo (C34A) para impedir su autoubiquitinaci6n. La mutaci6n con dedo de anillo en TRAF2 impedia unicamente la autoubiquitinaci6n K63. La sobreexpresi6n de SIVA2 aumentaba la ubiquitinaci6n K48 de TRAF2 en funci6n de su dedo de anillo. El mutante TRAF2 con dedo de anillo retenia su capacidad para fijarse a SIVA2. F. Muestra que SIVA2 regula la ubiquitinaci6n de TRAF2 reclutado en el receptor CD27 en las celulas Ramos. El reclutamiento de TRAF2 en el receptor CD27 se inducia por estimulaci6n con FLAGCD70 y el TRAF2 reclutado en el receptor se inmunoprecipit6 utilizando antiFLAG. Se indujo SIVA2 durante 2 horas con 1 IM doxiciclina antes de estimulaci6n con CD70. El reclutamiento de IKK1 en el receptor CD27 no se ve afectado por la inducci6n de SIVA. La cantidad de SIVA2 total expresada despues de la inducci6n de doxiciclina se muestra en el panel inferior. La inducci6n de SIVA2 aumenta TRAF2 ubiquitinado en el complejo receptor de una manera dependiente del anillo en las celulas Ramos. G. Muestra el efecto de la silenciaci6n de SIVA sobre la ubiquitinaci6n de TRAF2 reclutado en el receptor CD27. Se transfectaron celulas 293CD27 con pSUPER SIVA, y 48 horas mas tarde se trataron con medio que expresaba FLAGCD70 durante 0, 15, 30 y 60 minutos, se lisaron y el complejo receptor CD27 se inmunoprecipit6 utilizando anticuerpo antiFLAG. El TRAF2 asociado al receptor se sond6 con anticuerpo antiTRAF2. El receptor CD27 e IKK1 precipitados por el ligando se muestran en los paneles inferiores. H. Muestra que SIVA facilita el reclutamiento inicial de TRAF2 en el receptor CD27, que es necesario para la degradaci6n de TRAF2 despues de estimulaci6n de CD27. Las celulas pSUPER SIVA transfectadas se compararon con las celulas de control pSUPER transfectadas respecto al nivel de TRAF2 en el citoplasma despues de estimulaci6n con CD27. El disparo de CD70 da como resultado la degradaci6n de TRAF2 de una manera dependiente de SIVA.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

Se encontr6, de acuerdo con la presente invenci6n, que SIVA tiene actividad relacionada con ubiquitinaci6n y es capaz de inducir directamente autoubiquitinaci6n y ubiquitinaci6n de TRAF2.

La ubiquitilaci6n, denominada tambien ubiquitinaci6n, hace referencia al proceso particular para los eucariotas por el cual una proteina se modifica posteriormente a la traducci6n por fijaci6n covalente de una pequena proteina denominada ubiquitina [originalmente polipeptido inmunopoyetico ubiquitoso (UBIP)]. La ubiquitinaligasa es una proteina que fija covalentemente ubiquitina a un residuo lisina en una proteina diana. La ubiquitinaligasa esta implicada tipicamente en la poliubiquitilaci6n: una segunda ubiquitina se fija a la primera, una tercera se fija a la segunda, y asi sucesivamente.

La ubiquitinaligasa se conoce como un "E3" y opera en conjunci6n con una enzima activadora de ubiquitina (a la que se hace referencia en esta memoria como "E1") y una enzima conjugante de ubiquitina (a la que se hace referencia en esta memoria como "E2"). Existe una enzima principal E1, compartida por todas las ubiquitinaligasas, que utiliza ATP para activar la ubiquitina para conjugaci6n y transfiere la misma a una enzima E2. La enzima E2 interacciona con una pareja especifica E3 y transfiere la ubiquitina a la proteina diana. La E3, que puede ser un complejo multiproteinico, es generalmente responsable de direccionar la ubiquitinaci6n a proteinas sustrato especificas. En algunos casos, la misma recibe la ubiquitina de la enzima E2 y la transfiere a la proteina diana o la proteina sustrato; en otros casos, aquella actua por interacci6n tanto con la enzima E2 como con el sustrato.

Se ha demostrado, de acuerdo con la invenci6n, que SIVA2 es una ligasa E3. Asi, en un aspecto, la invenci6n se refiere, como se define en las reivindicaciones, a un metodo para identificar un polipeptido SIVA que tiene actividad relacionada con ubiquitinaci6n, que comprende: (i) poner en contacto polipeptidos que comprenden una ubiquitina, un E1, y un E2, con un polipeptido SIVA; (ii) y detectar si dicha ubiquitina se enlaza o se fija covalentemente a dicho

polipeptido SIVA, en donde la detecci6n de ubiquitina enlazada a dicho polipeptido SIVA es indicativa de que dicho polipeptido SIVA tiene actividad relacionada con ubiquitinaci6n.

El polipeptido SIVA puede ser cualquier polipeptido derivado de o basado en SIVA. Ejemplos de polipeptidos SIVA incluyen, pero sin caracter limitante, SIVA1 (SEQ ID NO: 1), SIVA2 (SEQ ID NO: 2), una muteina, proteina fusionada, derivado funcional, fracci6n activa, isoforma, o derivado permutado circularmente del mismo. Un ejemplo de E2 es Ubc13/Uev1.

Pueden utilizarse metodos in vitro o metodos basados en celulas para identificar un polipeptido SIVA que tiene actividad relacionada con ubiquitinaci6n.

En una realizaci6n de la invenci6n, el metodo es un metodo in vitro y puede llevarse a cabo como sigue. Se prepara una mixtura de reacci6n que comprende una ubiquitina recombinante, E1, E2 y polipeptido SIVA recombinante. La cantidad de proteina recombinante utilizada puede ser 8, 0,2, 12 Ig/ml de ubiquitina, E1, E2 y el polipeptido SIVA, respectivamente. Las proteinas pueden encontrarse en un tamp6n adecuado, por ejemplo, un tamp6n que contenga 30 mM HEPES de pH 7,6, 5 mM MgCl2, 2 mM ATP, 0,2 mM DTT, 5 mM citrato de sodio, 10 mM fosfato de creatina, 0,2 Ig/ml creatinaquinasa y 5 IM ubiquitinaaldehido. La reacci6n se incuba a 30°C durante aproximadamente 14 horas. La reacci6n puede terminarse por adici6n de tamp6n de muestra Laemmli o diluirse hasta 1 ml con tamp6n que contiene 20 mM HEPES de pH 7,6, 150 mM NaCl, 1% Triton X100, 1 mM EDTA y c6ctel completo de inhibidores de proteasas. SIVA se inmunoprecipita utilizando antiSIVA o utilizando un anticuerpo contra un marcador en el caso de que el SIVA este marcado.

Por ejemplo, SIVA marcado puede ser GSTSIVA y el anticuerpo utilizado puede ser especifico para GST como en las realizaciones ilustradas mas adelante. A continuaci6n, el anticuerpo se adsorbe a cuentas de proteina G durante 4 horas a 4°C. Los inmunoprecipitados se someten a transferencia Western con anticuerpos especificos, por ejemplo un anticuerpo antiubiquitina. La ubiquitina en el metodo puede emplear una ubiquitina mutante en la cual todas las lisinas en la ubiquitina excepto K48 estan mutadas a arginina (Boston Biochem) para identificar un polipeptido SIVA capaz de ubiquitinaci6n K48. Alternativamente, la ubiquitina en el metodo puede utilizar una ubiquitina mutante en la cual todas las lisinas en la ubiquitina excepto K63 estan mutadas a arginina (Boston Biochem) para identificar un polipeptido SIVA capaz de ubiquitinaci6n K63 como en el caso de la autoubiquitinaci6n.

La ubiquitina enlazada a SIVA puede detectarse, por ejemplo, por analisis mediante transferencia Western utilizando anticuerpo antiSIVA y detecci6n de la aparici6n de bandas mas pesadas de SIVA y/o utilizando anticuerpos contra ubiquitina. Por ejemplo, la ubiquitina puede estar marcada con HIS o HA. SIVA puede estar marcado con GST o FLAG.

En un metodo de la invenci6n, pueden utilizarse polipeptido SIVA marcado y/o ubiquitina y detectarse o inmunoprecipitarse con anticuerpos especificos para el marcador. Por ejemplo, GSTSIVA2 se incuba con E1 (v.g. 200 ng/50 Il) y E2, Ubc13/Uev1 (v.g. 500 ng/50 Il), y las enzimas HISUbiquitina en el ensayo de ubiquitinaci6n in vitro. Despues de 1 hora a 37°C, las muestras se inmunoprecipitan con anticuerpo antiGST. Tanto IP como los lisados totales se analizan por transferencia Western utilizando antiSIVA, antiubiquitina o antiHIS.

En un aspecto adicional, la invenci6n proporciona, como se define en la reivindicaciones, metodos para identificar agentes candidato capaces de modular la actividad relacionada con ubiquitina de SIVA o un polipeptido SIVA, por realizaci6n del metodo anterior en presencia o ausencia de un agente candidato, en donde un cambio en el nivel de autoubiquitinaci6n de dicho polipeptido SIVA en presencia del agente es indicativo de que el agente candidato es capaz de modular la actividad de SIVA relacionada con ubiquitinaci6n.

Se encontr6 que NIK sufre monoubiquitinaci6n asi como poliubiquitinaciones K48 inductoras de degradaci6n, y K63 estabilizadoras por coexpresi6n transitoria con los mutantes de ubiquitina respectivos. Resulta muy interesante que una sola molecula exhibe todos los tipos conocidos de conjugaci6n con ubiquitina. Esta diversidad de ubiquitinaciones podria ser perfectamente el determinante de la versatilidad funcional de NIK. Por exploraci6n del papel de SIVA en la ubiquitinaci6n de NIK, se encontr6 de acuerdo con la invenci6n que la coexpresi6n de SIVA intensificaba la ubiquitinaci6n de NIK tanto en K48 como en K63. Consistentemente, en experimentos de ubiquitinaci6n in vitro se encontr6 que SIVA2 recombinante es una ligasa E3 potente dependiente con dedos de anillo es. SIVA2 es una ligasa E3 directa y especifica de TRAF2.

Un polipeptido SIVA que tiene actividad directa o indirecta relacionada con ubiquitinaci6n puede identificarse de acuerdo con la invenci6n por un metodo que comprende: (i) poner en contacto polipeptidos que comprenden una ubiquitina, un E1, un E2, un polipeptido NIK, y opcionalmente un E3 en presencia o ausencia de un polipeptido SIVA;

(ii) medir el nivel de ubiquitinaci6n del polipeptido NIK en presencia y en ausencia del polipeptido SIVA; y (iii) comparar el nivel de ubiquitinaci6n de NIK en presencia y en ausencia del polipeptido SIVA, en donde el aumento en el nivel de ubiquitinaci6n de NIK en presencia del polipeptido SIVA es indicativo de que el polipeptido SIVA tiene actividad directa o indirecta relacionada con ubiquitinaci6n.

Por ejemplo, en un ensayo basado en celulas, plasmidos que codifican NIK, un polipeptido SIVA y ubiquitina marcada con HA pueden cotransfectarse en celulas y el inmunoprecipitado antiNIK de las celulas lisadas puede analizarse por transferencia Western utilizando anticuerpos antiHA. En una realizaci6n, las celulas pueden ser celulas

Ramos que expresan NIK transducido retroviralmente y se tratan con CD70. En otra realizaci6n, las celulas pueden ser celulas no linfoides tales como HEK 293T que expresan de manera estable el receptor CD27 y NIK que se tratan con CD70. El NIK inmunoprecipitado de los lisados de celulas puede analizarse por transferencia Western utilizando anticuerpo antiubiquitina para monitorizar la ubiquitinaci6n de NIK.

Asimismo, un plasmido que codifica un polipeptido SIVA puede cotransfectarse con un plasmido NIK y un plasmido codificante de ubiquitina. El polipeptido SIVA puede ser, por ejemplo, SIVA 158 o plasmido SIVAC y la ubiquitina puede ser una ubiquitina marcada tal como HAubiquitina. La ubiquitina puede ser una ubiquitina mutante mutada en una lisina tal como el mutante K48R o K63R. La cantidad de plasmido que puede utilizarse es aproximadamente 4 Ig, 6 Ig y 8 Ig para NIK, SIVA y el plasmido de ubiquitina, respectivamente. Las celulas pueden ser celulas HeLa. Veinticuatro horas despues de la transfecci6n, las celulas se cosechan, se lisan y se inmunoprecipitan con anticuerpo antiNIK. La transferencia Western puede realizarse con antiHA para detecci6n de conjugados de ubiquitina en NIK.

En uno de los metodos basados en celulas para identificaci6n de un polipeptido SIVA que tiene actividad relacionada con ubiquitinaci6n y/o actividad de degradaci6n de proteinas, NIK puede coexpresarse con un polipeptido SIVA y un polipeptido TRAF2 en celulas. La cantidad de plasmido que puede utilizarse es aproximadamente 0,5 Ig, 1,5 Ig y 3,0 Ig para SIVA y 0,5 Ig para NIK y TRAF2. Los lisados de celulas totales se preparan 30 horas despues de la transfecci6n y se sondan con antiNIK para detecci6n de conjugados de ubiquitina en NIK o degradaci6n de NIK.

En uno de los metodos basados en celulas para identificaci6n de un polipeptido SIVA que tiene actividad relacionada con ubiquitinaci6n, celulas tales como celulas HEK 293 se transfectan con plasmido codificante de FLAGTRAF2, HISSIVA2 y ubiquitina. Veinticuatro horas despues de la transfecci6n, las celulas se lisan, se inmunoprecipitan y se analizan por transferencia Western utilizando anticuerpos especificos para FLAG2 que se utilizan para detectar TRAF2 ubiquitinado. El mutante TRAF2 con dedo de anillo (C34A) puede utilizarse en lugar de TRAF2 de tipo salvaje para impedir su autoubiquitinaci6n. El mutante con dedo de anillo TRAF2 retenia su capacidad para fijar SIVA2.

En otro ensayo basado en celulas, puede utilizarse TRAF2 ubiquitinado reclutado en el receptor CD27 por estimulaci6n con FLAGCD70 y sobreexpresi6n de SIVA y coinmunoprecipitaci6n por antiFLAG. SIVA2 puede sobreexpresarse utilizando el sistema TREX e inducci6n con 1 IM doxiciclina antes de estimulaci6n con CD70.

Pueden realizarse ensayos basados en celulas de ubiquitinaci6n inducida por polipeptidos SIVA sin ubiquitina ex6gena y con cualquier clase de celulas que incluyen, pero sin caracter limitante, celulas HeLa, celulas HEK 293T, y celulas Ramos.

Pueden realizarse ensayos de ubiquitinaci6n in vitro, empleando por ejemplo una reacci6n que contiene HISUbiquitina recombinante, E1, E2 (heterodimero v.g. Ubc13/Uev1), un polipeptido SIVA recombinante que puede ser una proteina de fusi6n con GST, como por ejemplo GSTSIVA2 o GSTSIVA C73A, y un TRAF2 recombinante que puede ser un TRAF2 marcado con FLAG. Las proteinas pueden hallarse en un tamp6n que contiene 30 mM HEPES de pH 7,6. 5 mM MgCl2, 2 mM ATP, 0,2 mM DTT, 5 mM citrato de sodio, 10 mM fosfato de creatina, 0,2 Ig/ml creatinaquinasa y 5 IM ubiquitinaaldehido. Puede utilizarse antiFLAG o antiTRAF2 para detectar TRAF2 modificado (ubiquitinado).

SIVA induce la muerte celular en un camino mitocondrial dependiente de caspasas (Py et al., 2003). Consistentemente con su funci6n supuesta como inductor de apoptosis, SIVA esta regulado de modo creciente en respuesta a UV y estres oxidante en diferentes tipos de celulas y es una diana transcripcional directa de los supresores de tumores p53 y E2F1 (Fortin et al., 2004). En el proceso de la apoptosis, se sabe que la caspasa 8 escinde las proteinas como NIK y reprime por consiguiente NFKB, que juega un papel central en la supervivencia y proliferaci6n celulares (Foehr et al., 2000). Analogamente, dosis altas de SIVA2 degradaban tambien la NIK coexpresada y este efecto se veia comprometido por inhibici6n de proteasomas. Se encontr6, de acuerdo con la presente invenci6n, que SIVA2 induce tambien la ubiquitinaci6n K48 de NIK, que se reducia notablemente por mutaci6n del residuo K670 de NIK. En conjunto, estas observaciones apuntan a la regulaci6n de NIK por SIVA2 por el camino clasico ubiquitinaproteasoma (Glickman y Ciechanover, 2002). Es interesante que tanto la ubiquitinaci6n K48 como la degradaci6n de NIK en respuesta a la sobreexpresi6n de SIVA ocurrian incluso en ausencia total de la regi6n con dedo de anillo de SIVA2, asi como con el mutante SIVA con dedo de anillo cataliticamente inactivo, lo que sugiere que SIVA puede no ser un E3 directo de NIK para inducir la ubiquitinaci6n K48. SIVA puede requerir una proteina E3 accesoria que trabaje en tandem para mediar la ubiquitinaci6n. Se ha demostrado que SIVA se fija a otra proteina con dedo de anillo denominada OSTL. OSTL puede ser la proteina E3 accesoria, dado que la misma contiene un motivo con dedo de anillo semejante a caja B y se supone que tiene un papel en la senalizaci6n de las celulas B y la supervivencia (Fontanari Krause et al., 2003). Analogamente, se ha informado tambien que TRAF3 es una enzima de ubiquitinaci6n indirecta de NIK, causando su degradaci6n (Liao et al., 2004). Sin embargo, se demostr6 de acuerdo con la invenci6n que TRAF3 degradaba tanto NIK de tipo salvaje como el mutante de NIK K670A, con eficacia similar, lo que indicaba que los mecanismos moleculares implicados en la degradaci6n de NIK mediada por SIVA2 y TRAF3 difieren. SIVA3 y TRAF3 puede funcionar cooperativamente para ubiquitinar NIK.

Sorprendentemente, se encontr6 de acuerdo con la invenci6n, mientras se evaluaba la capacidad de TRAF3 para imponer la degradaci6n de NIK, que NIK modula TRAF3 afectando a sus niveles celulares, su ubiquitinaci6n y su

tasa de degradaci6n. Esta modulaci6n de TRAF3 era peculiar en el sentido de que no daba como resultado la degradaci6n completa de TRAF3, sino mas bien la acumulaci6n de una forma distinta de peso molecular bajo de TRAF3 (dTRAF3). Es interesante que SIVA2, pero no SIVA1, aumentaba notablemente esta escisi6n de TRAF3 inducida por NIK. Esta es la primera observaci6n que demuestra una diferencia funcional entre las dos variantes de corte y empalme de SIVA. Aunque la fijaci6n directa de SIVA2 y TRAF3 ocurria s6lo debilmente, la presencia de NIK de tipo salvaje o NIK desactivado por quinasas estabilizaba notablemente su interacci6n. Como en el caso del complejo p100NIKIKK1 donde la fijaci6n no se ve influenciada por la funci6n de quinasa de NIK (Xiao et al., 2004), tambien aqui parece que NIK juega el papel de una proteina adaptadora que enlaza TRAF3 y SIVA2. Esta es la primera vez que se ha observado la formaci6n de un complejo NIKSIVA2TRAF3, la escisi6n de TRAF3 y la ubiquitinaci6n operativa por NIK y SIVA2.

Explorando ulteriormente el tipo de ubiquitinaci6n de TRAF3 por coexpresi6n de mutantes de ubiquitina, se encontr6 de acuerdo con la invenci6n que TRAF3 sufre predominantemente ubiquitinaci6n K63 y que SIVA2 genera dTRAF3 de una manera dependiente de la ubiquitinaci6n K63. Adicionalmente, la mutaci6n con dedo de anillo de SIVA2 bloqueaba tambien la generaci6n de dTRAF3. LA formaci6n de dTRAF3 tanto inducida por NIK como inducida por SIVA2 era bloqueada por inhibici6n de proteasomas y no por inhibici6n de lisosomas o caspasas. El procesamiento del mutante D347A de TRAF3 (Lee et al., 2001), por SIVA2 y NIK sugeria tambien que este proceso es independiente de caspasas. Este es un descubrimiento importante, que sugiere la implicaci6n de la ubiquitinaci6n K63 en el procesamiento de TRAF3 dependiente de proteasomas. SIVA2 puede ser un E3 para ubiquitinaci6n K63 de TRAF3 y NIK puede funcionar, como adaptador o como quinasa, en el procesamiento de TRAF3. Estos descubrimientos muestran una regulaci6n mutua de NIK y TRAF3 cooperativamente con SIVA2.

El dedo de anillo de TRAF3, aunque no contribuye a la ubiquitinaci6n de TRAF3 por SIVA2 o la generaci6n subsiguiente de dTRAF3, resultaba tener un impacto importante sobre la alteraci6n inducida de la solubilidad de la proteina. Notablemente, el mutante con dedo de anillo TRAF3 sufria ubiquitinaci6n masiva y se mantenia en el compartimiento insoluble en Triton, indicando un papel para el dedo de anillo en el trafico de TRAF3.

Dado que se encontr6 de acuerdo con la invenci6n que SIVA puede inducir la ubiquitinaci6n de TRAF3, se describe un metodo para identificar un polipeptido SIVA que tiene actividad directa o indirecta relacionada con ubiquitinaci6n, que comprende: (i) poner en contacto polipeptidos que comprenden una ubiquitina, un E1, un E2, un polipeptido TRAF3, y opcionalmente un E3 en presencia o ausencia de un polipeptido SIVA; (ii) medir el nivel de ubiquitinaci6n del polipeptido TRAF3 en presencia y en ausencia del polipeptido SIVA; y (iii) comparar el nivel de ubiquitinaci6n de TRAF3 en presencia y en ausencia del polipeptido SIVA, en donde el aumento en el nivel de ubiquitinaci6n de TRAF3 en presencia del polipeptido SIVA es indicativo de que el polipeptido SIVA tiene actividad directa o indirecta relacionada con ubiquitinaci6n. En el paso (i) puede anadirse un polipeptido NIK.

En un aspecto ilustrativo, se realiza un ensayo basado en celulas que utiliza un plasmido TRAF3, un plasmido NIK y un plasmido de ubiquitina cotransfectado en celulas tales como celulas HEK 293T. La cantidad de plasmido que puede utilizarse es aproximadamente 3, 4 y 4 Ig para TRAF3, NIK y ubiquitina, respectivamente, o puede utilizarse la misma cantidad de plasmido de aproximadamente 4 Ig para cada proteina. Las celulas se cosechan 24 horas despues de la transfecci6n y los lisados totales se analizan por transferencia Western utilizando anticuerpo antiTRAF3 para ver las formas modificadas de TRAF3 que representan TRAF3 ubiquitinado.

En otro aspecto ilustrativo, las celulas se transfectan con HISTRAF3, FLAGSIVA2 y HAUbiquitina K48R, se lisan y el inmunoprecipitado antiHIS del lisado se somete a transferencia Western utilizando anticuerpo antiHA. La cantidad de plasmido utilizada puede ser 6, 6, y 4 Ig/ml de HISTRAF3, FLAGSIVA2 y HAubiquitina, respectivamente. Como alternativa, el lisado se inmunoprecipita con anticuerpo antiFLAG para precipitar SIVA2 y se sonda con antiTRAF3 en transferencias Western.

Adicionalmente, se describen metodos para identificar agentes candidato capaces de modular una actividad directa

o indirecta relacionada con ubiquitinaci6n de un polipeptido SIVA sobre un polipeptido NIK y/o TRAF3, por realizaci6n del metodo anterior en presencia o ausencia de un agente candidato, en donde un cambio en el nivel de ubiquitinaci6n de dicho polipeptido NIK y/o TRAF3 en presencia del agente candidato es indicativa de que el agente candidato es capaz de modular la actividad relacionada con ubiquitinaci6n de SIVA sobre un polipeptido NIK y/o TRAF3. La molecula candidato puede ser una molecula pequena.

Se ha encontrado, siguiendo la degradaci6n de NIK y NIK K670A por el mutante SIVA con dedo de anillo, que la mutaci6n con dedo de anillo en SIVA2 anulaba la protecci6n de NIK conferida por su mutaci6n lisina 670, dando como resultado una degradaci6n efectiva del NIK K670A despues de su coexpresi6n con el mutante SIVA2 con dedo de anillo. Una posible explicaci6n es que existen dos tipos opuestos de ubiquitinaci6n de NIK, mediados ambos por SIVA2. En los experimentos de ubiquitinaci6n transitoria in vivo se ha encontrado de acuerdo con la invenci6n que SIVA2 promueve ambos tipos K48 y K63 de ubiquitinaci6n de NIK y que el termino N de SIVA2 esta implicado en la ubiquitinaci6n K48 y la degradaci6n de NIK. Ligando estas dos observaciones, de la ubiquitinaci6n K63 de NIK por SIVA2 y no por SIVA2 158 y de la capacidad del mutante SIVA2 con dedo de anillo para interferir con la ubiquitinaci6n de NIK, parece muy posible que el dedo de anillo este implicado en la ubiquitinaci6n K63. Por consiguiente, cuando NIK K670A y SIVA C73A se expresan juntos, NIK tendra unicamente el tipo de ubiquitinaci6n K48 en sitios distintos de lisina 670. En ausencia de la ubiquitinaci6n estabilizadora K63, el impacto de la ubiquitinaci6n residual

K48 prevalecera, dando como resultado una degradaci6n efectiva de NIK. Dicho de otro modo, la mutaci6n con dedo de anillo en SIVA2 parece neutralizar el efecto protector que la mutaci6n NIK K670A tiene contra la degradaci6n de NIK por SIVA2. Una confirmaci6n ulterior de la ubiquitinaci6n K63 inducida por SIVA2 se obtuvo a partir de los efectos inhibidores del mutante Ubc13, un E2 especifico de K63 (Deng et al., 2000), y CYLD, una desubiquitinasa especifica K63 (Kovalenko et al., 2003) sobre la ubiquitinaci6n de NIKK63 despues de coexpresi6n con SIVA2. Dado que la autoubiquitinaci6n K63 in vitro de SIVA2 era bloqueada tambien por la mutaci6n con dedo de anillo, tanto in vivo como in vitro, parece que la ubiquitinaci6n K63 es la funci6n exclusiva del dedo de anillo de SIVA2.

SIVA se expresa basalmente a un nivel extremadamente bajo y una posibilidad para los debiles efectos de la supresi6n de SIVA podria ser que SIVA ejerce su funci6n unicamente despues de regulaci6n creciente de su nivel. Pertinentemente, se ha demostrado que SIVA es una proteina inducida por estres y que los niveles elevados de SIVA causan la muerte celular (Fortin et al., 2004; Henke et al., 2000; Padanilam et al., 1998). En linea con esto, tanto en la expresi6n constitutiva como en la inducible, SIVA2 interferia con la activaci6n de NFKB inducida por CD27 y CD40. Esta inhibici6n del camino NFKB alternativo mediado por NIK refleja muy probablemente la capacidad de SIVA2 para causar la degradaci6n de NIK. Basandose en esto, uno se siente tentado a especular que la regulaci6n decreciente de la funci6n prosupervivencia de NIK por SIVA2 contribuye al papel apopt6tico del ultimo en condiciones de estres.

SIVA es una proteina celular menor, que se expresa normalmente a un nivel extremadamente bajo y es capaz de ejercer un efecto biol6gico fuerte. NIK parece jugar un papel importante en la estabilizaci6n de SIVA por fosforilaci6n directa de SIVA. Consistentemente, NIK desactivado como quinasa no lograba estabilizar la expresi6n de SIVA2. Ni IKK1 o IKK2 desactivados como quinasas fallaban en lo referente a interferir con la fosforilaci6n de SIVA2 inducida por NIK en un ensayo de quinasas in vitro, demostrando que SIVA2 es un nuevo sustrato genuino de NIK. La fosforilaci6n de muchas proteinas celulares precede a su ubiquitinaci6n (Karin y BenNeriah, 2000). La fosforilaci6n por NIK parece ser un requisito previo para la funci6n de ubiquitinaci6n de SIVA2.

Se muestra en esta memoria una regulaci6n compleja de mecanismos de modificaci6n y degradaci6n de proteinas que, sin estar unidos por el mecanismo, pueden verse como un sistema programado de ajuste fino donde NIK, despues de activaci6n, fosforila SIVA conduciendo a su estabilizaci6n. Posteriormente, NIK utiliza SIVA para su ubiquitinaci6n K63 inductora de estabilizaci6n y para la escisi6n de TRAF3, que es un inhibidor de la funci6n de NIK. Una vez que la celula requiere la terminaci6n de la senalizaci6n de NIK, SIVA se fija probablemente a una nueva proteina sintetizada como resultado de la activaci6n de NFKB, y forma un complejo de ubiquitinaci6n K48 que efectua la degradaci6n de NIK. Probablemente, esto actua como un bucle autoregulador que limita la senalizaci6n de NIK y, cuando el estres regula ulteriormente en sentido creciente el nivel de SIVA, el mismo funciona para inhibir los caminos de supervivencia e inducir apoptosis. Estos resultados indican que SIVA tiene un efecto dual sobre la ubiquitinaci6n de NIK con consecuencias opuestas. La intensificaci6n del nivel de NIK y por consiguiente su funci6n resultante de la coexpresi6n de dosis bajas de SIVA2 podria ser muy bien una consecuencia de la supresi6n de represores de NIK, v.g. TRAF3. Asi, SIVA2 puede ubiquitinar y degradar TRAF3 in vivo, dando como resultado una elevaci6n del nivel de NIK.

La identificaci6n de la localizaci6n exacta de la acci6n de SIVA, a saber, en la membrana o en el citoplasma es tambien crucial para definir su funci6n exacta. Ademas del receptor CD27 por el cual se identific6 SIVA, se han sugerido tambien otros dos receptores de membrana que se fijan directamente a SIVA. Uno de ellos es GITR, un miembro de la familia TNFR expresado principalmente en las celulas T, implicado tanto en la apoptosis como en caminos de activaci6n de NFKB (Spinicelli et al., 2002, Nocentini et al., 2005). CD4 es el tercer receptor de membrana que se ha dicho se fija a SIVA, y se sugiere que esta fijaci6n modula la apoptosis de las celulas T CD4+ a traves de un camino mitocondrial dependiente de caspasas (Petit et al., 2004).

Aunque se ha sugerido que SIVA se fija a los sitios de fijaci6n de TRAF2 en CD27, GITR y OX40 (Spinicelli et al., 2002), no se ha presentado a este respecto prueba autentica alguna. Este posible reclutamiento de SIVA en la membrana es particularmente importante por el hecho de que se ha encontrado en esta invenci6n que el adaptador genuino de NIK, TRAF2, degrada NIK en expresi6n transitoria y SIVA2 protege NIK de la degradaci6n inducida por TRAF2. Ademas, se ha sugerido recientemente que TRAF2 actua como un regulador negativo del camino alternativo de NFKB (Grech et al., 2004). Dado que la funci6n de NIK, una proteina interactiva con TRAF2, es crucial para el camino alternativo de NFKB, especulativamente, esta nueva funci6n de TRAF2 para inhibir el camino alternativo podria ser resultado de la degradaci6n de NIK inducida por TRAF2. Si SIVA2 juega cualquier papel a nivel end6geno en la estabilizaci6n de NIK, una vez que el mismo es reclutado en el receptor v.g. CD27, a traves de TRAF2, es una cuesti6n fascinante. En linea con esto, el TRAF2 reclutado en el receptor CD27 se encontraba masivamente ubiquitinado, lo que le distingue del TRAF2 reclutado en el receptor TNF que no recluta NIK. Los resultados de esta memoria demuestran que SIVA2, pero no el mutante SIVA2C73A, induce directamente la ubiquitinaci6n K63 en TRAF2. Se considera que TRAF5 es un hom6logo pr6ximo funcional y estructural de TRAF2, y ambos estan implicados en la activaci6n de NFKB (Chung et al., 2002). TRAF2 se asemeja a TRAF6, pero en menor grado, si bien difiere significativamente de TRAF1 y TRAF3.

Se demostr6 como se describe en esta memoria por ensayos de ubiquitinaci6n in vitro realizados en un volumen de reacci6n de 50 Il que contenia unicamente HISUbiquitinaK63 recombinante (una HISUbiquitina recombinante en la cual todas las lisinas en la ubiquitina excepto K63 estan mutadas a arginina, Boston Biochem) (8 Ig), E1 (0,2 Ig),

E2 (0,5 Ig) y 12 Ig de GSTSIVA recombinante o GSTSIVAC73A con TRAF2 marcado con FLAG que TRAF2 marcado con FLAG se expresaba transitoriamente y se purificaba utilizando antiFLAG M2. SIVA2, pero no el mutante SIVA2C73A, induce directamente la ubiquitinaci6n K63 de TRAF2. El termino C que expresa constitutivamente SIVA en las celulas Ramos, mimetiza la deficiencia de TRAF2 en las celulas B, por lo que puede utilizarse SIVA C en enfermedades asociadas con una actividad o expresi6n excesiva de TRAF2, o sensibles de la inhibici6n de TRAF2. La silenciaci6n de SIVA en las celulas por siRNA puede utilizarse en enfermedades asociadas con actividad

o expresi6n disminuida de TRAF2, o sensibles al aumento de TRAF2. TRAF2 se fija a SIVA2 y la fijaci6n ocurre unicamente cuando el dedo de anillo esta presente, tal como en SIVA2 y SIVA2 181. El mutante TRAF2 con dedo de anillo retenia su capacidad para fijar SIVA2. SIVA2 intensifica la ubiquitinaci6n K48 de TRAF2 en HEK 293T como funci6n de su dedo de anillo.

Se demostr6 que SIVA2 regula la ubiquitinaci6n de TRAF2 reclutado en el receptor CD27 en las celulas Ramos. Se explor6 el efecto de la silenciaci6n de SIVA en la ubiquitinaci6n de TRAF2 reclutado en el receptor CD27. Para este prop6sito, se transfectaron celulas 293CD27 con pSUPER SIVA. Cuarenta y ocho horas mas tarde, las celulas se trataron con FLAGCD70 para inducir el reclutamiento de TRAF2 en el receptor CD27. Se lisaron las celulas y el complejo del receptor CD27 se inmunoprecipit6 utilizando anticuerpo antiFLAG. El TRAF2 asociado al receptor se sond6 con anticuerpo antiTRAF2. Las celulas transfectadas con pSUPER SIVA se compararon con celulas transfectadas con pSUPER de control respecto al nivel de TRAF2 en el citoplasma despues de estimulaci6n con CD70. El disparo de CD70 daba como resultado la degradaci6n de TRAF2 de una manera dependiente de SIVA.

Asi, en otro aspecto, la descripci6n se refiere a un metodo para identificar un polipeptido SIVA capaz de inducir actividad relacionada con ubiquitinaci6n en un polipeptido TRAF2, TRAF5 o TRAF6 que comprende: (i) poner en contacto polipeptidos que comprenden una ubiquitina, un E1, un E2, y un polipeptido SIVA con un polipeptido TRAF2, TRAF5 o TRAF6; (ii) y detectar si dicha ubiquitina se fija a dicho polipeptido TRAF2, TRAF5 o TRAF6 en donde la detecci6n de ubiquitina enlazada a dicho polipeptido TRAF2, TRAF5 o TRAF6 es indicativa de que dicho polipeptido SIVA tiene actividad relacionada con ubiquitinaci6n.

En un aspecto, se prepara la reacci6n siguiente. La reacci6n contiene HISUbiquitina recombinante o HISUbiquitinaK63 unicamente, E1, E2 (heterodimero Ubc13/Uev1) (tanto E1 como E2 se adquirieron de Boston Biochem) y un polipeptido GSTSIVA recombinante o GSTSIVA o mutante, con TRAF2 marcado con FLAG en un tamp6n que contiene 30 mM HEPES de pH 7,6, 5 mM MgCl2, 2 mM ATP, 0,2 mM DTT, 5 mM citrato de sodio, 10 mM fosfato de creatina, 0,2 Ig/ml creatinaquinasa y 5 IM ubiquitinaaldehido. TRAF2 marcado con FLAG puede prepararse por transfecci6n de TRAF2 pcFLAG en celulas HEK 293T. Aproximadamente 24 horas despues de la transfecci6n, las celulas se lisan en tamp6n de lisis que contiene 1% Triton X100 y se inmunoprecipitan utilizando cuentas antiFLAG M2 (Sigma). El TRAF2 inmunoprecipitado se eluye con peptido FLAG y se concentra utilizando una columna Microcon (MWCO3000) y se utiliza en la reacci6n de ubiquitinaci6n in vitro. Las reacciones se incuban a 30°C durante una hora. Se inmunoprecipita TRAF2 utilizando cuentas antiFLAG M2 durante 4 horas a 4°C. Los inmunoprecipitados se someten a transferencia Western con anticuerpo antiTRAF2 (H249, Santa Cruz).

Se describen metodos para identificaci6n de agentes candidato capaces de modular una actividad relacionada con ubiquitinaci6n de un polipeptido SIVA sobre un polipeptido TRAF2, por realizaci6n del metodo anterior en presencia

o ausencia de un agente candidato, en donde un cambio en el nivel de ubiquitinaci6n de dicho polipeptido TRAF2 en presencia del agente candidato es indicativo de que el agente candidato es capaz de modular la actividad relacionada con ubiquitinaci6n de SIVA sobre el polipeptido TRAF2. La molecula candidato puede ser una molecula pequena.

Es interesante que las proteinas SIVA poseen un dedo de anillo exclusivo semejante a caja B que carece de cualesquiera residuos His (CSSCVRAVDGKAVCGQCERALCGQCVRTCWGC, SEQ ID NO: 6) y tiene un dedo de cinc en su termino C (Prasad et al., 1997). El dedo de anillo aminoterminal y las estructuras de dominio carboxiterminales del serpentin enrollado, que son caracteristicas de otras proteinas que contienen caja B estan ausentes en SIVA. En su lugar, el dedo de anillo semejante a caja B de SIVA tiene una regi6n rica en Cys en el termino carboxilo. El descubrimiento de los autores de la invenci6n (conseguido por cribado de dos hibridos) fue que la regi6n con dedo cinc/anular de SIVA se fija al termino C de NIK, que ha llamado inicialmente la atenci6n de los autores de la invenci6n hacia la posible implicaci6n de NIK en la senalizaci6n de CD27. Hasta ahora, no se ha adscrito funci6n alguna al dedo de anillo semejante a caja B de SIVA, y es sumamente sorprendente que en esta decada en la que la investigaci6n de ubiquitina abre el camino del campo de senalizaci6n, se haya pasado por alto la potente actividad de 'ligasa E3' del dedo de anillo, que se encontr6, de acuerdo con la presente invenci6n, esta asociada con el dedo de anillo semejante a caja B de SIVA.

Asi pues, la invenci6n se refiere a un metodo para testar o identificar una actividad relacionada con ubiquitinaci6n de un polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B de SEQ ID NO: 6 o un hom6logo del mismo que tiene un motivo con dedo de anillo semejante a caja B que carece de histidina y que tiene actividad relacionada con ubiquitinaci6n que comprende: (i) poner en contacto polipeptidos que comprenden una ubiquitina, un E1, y un E2, un polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B de SEQ ID NO: 6 o un hom6logo del mismo y opcionalmente TRAF22; (ii) y detectar si dicha ubiquitina se enlaza a dicho polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B o a TRAF2, en donde la detecci6n de ubiquitina enlazada a dicho polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B o a TRAF2 es indicativa de que dicho polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B tiene actividad relacionada con ubiquitinaci6n. Se dice que dos o mas estructuras son hom6logas si las mismas son semejantes debido a una

ascendencia compartida. La homologia entre proteinas y DNA se deduce a menudo sobre la base de semejanza de secuencia, especialmente en bioinformatica. Por ejemplo, en general, si dos genes tienen una secuencia de DNA casi identica, es probable que los mismos sean hom6logos. Existen muchos algoritmos para agrupar secuencias de proteinas en familias de secuencia, que son series de secuencias mutuamente hom6logas. La homologia de secuencias puede ser de dos tipos: ort6loga o paraloga. Dos genes similares en dos especies diferentes que se han originado a partir de un ancestro comun son ort6logos. Las secuencias hom6logas son ort6logas si las mismas se separaron por un suceso de especiaci6n: si existe un gen en una especie, y dicha especie diverge en dos especies, entonces las copias divergentes de este gen en especies resultantes son ort6logas. Una segunda definici6n de ort6logos describe dos genes cualesquiera en dos especies diferentes con funciones muy similares. Las secuencias hom6logas son paralogas si las mismas se separaron por un suceso de duplicaci6n genica: si un gen en un organismo se duplica para ocupar dos posiciones diferentes en el mismo genoma, entonces las dos copias son paralogas. Los genes que codifican mioglobina y hemoglobina se considera que son paralogos antiguos.

Se describen metodos para identificar agentes candidato capaces de modular la actividad relacionada con ubiquitinaci6n de un polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B de SEQ ID NO: 6 o un hom6logo del mismo sobre dicho polipeptido o sobre un polipeptido TRAF2, por realizaci6n del metodo anterior en presencia o ausencia de un agente candidato, en donde un cambio en el nivel de ubiquitinaci6n de dicho polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B o de un polipeptido TRAF2 en presencia del agente candidato es indicativo de que el agente candidato es capaz de modular la actividad relacionada con ubiquitinaci6n de un polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B de SEQ ID NO: 6 o un hom6logo del mismo. La molecula candidato puede ser una molecula pequena.

Ejemplos de polipeptidos que albergan un anillo semejante a caja B de SEQ ID NO: 6 o un hom6logo del mismo incluyen polipeptidos que tienen un motivo con dedo de anillo de caja B que carece de HIS.

En una realizaci6n de la invenci6n, el polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B es un polipeptido SIVA.

Las proteinas o polipeptidos ubiquitinados pueden detectarse por transferencias Western como se ilustra en la presente invenci6n o por cualquier otro ensayo conocido en la tecnica.

Como se ha mencionado, SIVA es una proteina celular menor, que se expresa normalmente a un nivel extremadamente bajo y es capaz de ejercer un efecto biol6gico fuerte. NIK parece jugar un papel importante en la estabilizaci6n de SIVA. Analogamente, dosis altas de SIVA2 degradaban tambien el NIK coexpresado y este efecto se veia comprometido por la inhibici6n de proteasomas. Los autores de la invenci6n encontraron que SIVA2 induce tambien ubiquitinaci6n K48 de NIK, que se reducia notablemente por la mutaci6n del residuo K670 en NIK. En conjunto, estas observaciones apuntan a la regulaci6n de NIK por SIVA2 a traves del camino clasico de ubiquitinaproteasoma (Glickmam y Ciechanover, 2002). Es interesante que, tanto la ubiquitinaci6n K48 como la degradaci6n de NIK en respuesta a la sobreexpresi6n de SIVA, ocurrian incluso en total ausencia de la regi6n con dedo de anillo de SIVA2 asi como con el mutante SIVA con dedo de anillo cataliticamente inactivo, lo que sugiere que SIVA puede no ser un E3 directo de NIK para inducir la ubiquitinaci6n K48. SIVA puede requerir una proteina accesoria E3 que trabaja en tandem para mediar la ubiquitinaci6n. Se ha demostrado que SIVA se fija a otra proteina con dedo de anillo llamada OSTL. OSTL puede ser la proteina E3 accesoria, dado que contiene un motivo con dedo de anillo semejante a caja B y se postula que tiene un papel en la senalizaci6n y supervivencia de las celulas B (Fontanari Krause et al., 2003). Analogamente, se consider6 tambien TRAF3 como una enzima ubiquitinadora indirecta de NIK, causando su degradaci6n (Liao et al., 2004). Sin embargo, se ha demostrado en esta memoria que TRAF3 degradaba tanto NIK de tipo salvaje como el mutante NIK K670A con eficacia similar, lo que indica que los mecanismos moleculares implicados en la degradaci6n de NIK mediada por SIVA2 y TRAF3 difieren. SIVA2 y TRAF3 pueden funcionar cooperativamente para ubiquitinar NIK.

Como se ha mencionado, se encontr6 como se describe en esta memoria que una concentraci6n elevada de SIVA induce degradaci6n de NIK, incluso en ausencia del termino C de SIVA. Asimismo, se encontr6 de acuerdo con la invenci6n que SIVA2, pero no SIVA1, aumentaba notablemente la escisi6n de TRAF3 inducida por NIK. Esta es la primera observaci6n que demuestra una diferencia funcional entre las dos variantes de corte y empalme de SIVA. Aunque la fijaci6n directa de SIVA2 y TRAF3 ocurria s6lo debilmente, la presencia de NIK de tipo salvaje o desactivado por quinasas estabilizaba notablemente su interacci6n. Como en el caso del complejo p100NIKIKK1 en el que la fijaci6n no se ve influida por la funci6n de quinasa de NIK (Xiao et al., 2004), aqui parece que NIK juega tambien el papel de una proteina adaptadora que enlaza TRAF3 y SIVA2. Esta es la primera vez que se ha observado la formaci6n del complejo NIKSIVA2TRAF3, la escisi6n de TRAF3 y la ubiquitinaci6n cooperativa por NIK y SIVA2.

Asi, se describe un metodo para identificar un polipeptido SIVA capaz de inducir la degradaci6n de las proteinas que comprende poner en contacto un polipeptido SIVA con un polipeptido NIK y/o TRAF3 y detectar la degradaci6n del polipeptido NIK y/o TRAF3, en donde la detecci6n de la degradaci6n total o parcial de NIK y/o TRAF3 es indicativa de la capacidad de dicho polipeptido SIVA para inducir la degradaci6n de las proteinas.

El metodo puede llevarse a cabo in vitro o puede ser un metodo basado en celulas. En un aspecto ilustrativo, se aborda el metodo siguiente, basado en celulas. Se cotransfectan celulas con un plasmido que codifica NIK de tipo salvaje (0,5 Ig de plasmido) o NIK K670A mutante y con concentraci6n creciente de plasmido codificante de SIVA2

(v.g. 1,0, 2,0 y 3,0 Ig de plasmido) y/o con plasmido codificante de TRAF3. Despues de la transfecci6n, las celulas

se lisan y se detecta la degradaci6n de NIK, y/o TRAF3 por analisis mediante transferencia Western utilizando anticuerpo especifico. Puede utilizarse actina como control de carga.

Adicionalmente, se describen metodos para identificar agentes candidato capaces de modular la capacidad de dicho polipeptido SIVA para inducir la degradaci6n de proteinas, por realizaci6n del metodo anterior en presencia o ausencia de un agente candidato, en donde un cambio en el nivel de degradaci6n total o parcial de NIK y/o TRAF3 en presencia del agente candidato es indicativo de que el agente candidato es capaz de modular la degradaci6n total o parcial de NIK y/o TRAF3 por SIVA. La molecula candidato puede ser una molecula pequena.

Otro aspecto se refiere a la identificaci6n de un agente capaz de modular la asociaci6n del complejo entre NIK, TRAF3 y un polipeptido SIVA que comprende formar un complejo de NIK, TRAF3 y un SIVA en presencia o en ausencia de un agente candidato y detectar la capacidad de la molecula candidato para modular la asociaci6n de NIK, TRAF2 y un polipeptido SIVA, en donde una molecula candidato capaz de alterar la fracci6n del complejo es un agente capaz de modular la asociaci6n de NIK, TRAF3 y SIVA. Por ejemplo, pueden transfectarse celulas con cada uno del plasmido que codifica un polipeptido SIVA y un polipeptido TRAF con y sin un polipeptido NIK e incubarse en presencia o ausencia de un agente de test. Veinticuatro horas despues de la transfecci6n, los lisados totales pueden inmunoprecipitarse por un anticuerpo que precipita SIVA, y los inmunoprecipitados pueden sondarse en transferencia Western con antiTRAF3. Un agente capaz de inhibir o inducir la coprecipitaci6n de TRAF2 mediada por SIVA y NIK es un agente que modula la formaci6n de dicho complejo NIKSIVA2TRAF3. El agente puede aumentar o reducir el nivel del complejo NIKTRAF3 SIVA.

En un aspecto adicional, se describe un complejo tripartito que comprende NIK, TRAF3 y un SIVA.

Se ha demostrado en esta memoria que una regulaci6n compleja de los mecanismos de modificaci6n y degradaci6n de proteinas puede verse como un sistema programado de ajuste fino en el que NIK, despues de activaci6n, conduce a la estabilizaci6n de SIVA. Posteriormente, NIK utiliza SIVA para su ubiquitinaci6n K63 inductora de estabilizaci6n y para la escisi6n de TRAF3, que es un inhibidor de la funci6n de NIK. Una vez que la celula requiere la terminaci6n de la senalizaci6n de NIK, SIVA se fija probablemente con una nueva proteina sintetizada como resultado de la activaci6n de NFKB, y forma un complejo de ubiquitinaci6n K48 que efectua la degradaci6n de NIK. Probablemente, esto actua como un bucle autorregulador limitante de la senalizaci6n de NIK y, cuando el estres regula ulteriormente en sentido creciente el nivel de SIVA, aquel funciona para inhibir los caminos de supervivencia e inducir apoptosis. Estos resultados indican que SIVA tiene un efecto dual sobre la ubiquitinaci6n de NIK con consecuencias opuestas. El aumento del nivel de NIK y por consiguiente su funci6n resultante de la coexpresi6n de dosis bajas de SIVA2 podria ser muy bien una consecuencia de la supresi6n de represores de NIK, v.g. TRAF3. Asi pues, SIVA2 puede ubiquitinar y degradar TRAF3 in vivo, dando como resultado una elevaci6n del nivel de NIK.

La identificaci6n de la localizaci6n exacta de la acci6n de SIVA, es decir en la membrana o en el citoplasma, es tambien crucial para definir su funci6n exacta. Ademas del receptor CD27 por el cual fue identificado SIVA, se ha sugerido tambien que otros dos receptores de membrana se fijan directamente a SIVA. Uno de ellos es GITR, un miembro de la familia TNFR expresado principalmente en las celulas T, implicado tanto en caminos de apoptosis como en caminos de activaci6n de NFKB (Spinicelli et al., 2002, Nocentini et al., 2005). CD4 es el tercer receptor de membrana que se dice esta fijado a SIVA, y se ha sugerido que esta fijaci6n modula la apoptosis de las celulas T CD4+ a traves de un camino mitocondrial dependiente de caspasas (Petit et al., 2004).

Basandose en los descubrimientos que se describen en esta memoria, los candidatos favoritos para ser sustratos de SIVA son NIK, TRAF2, TRAF3 y posiblemente TRAF5 y TRAF6. La actividad no regulada de SIVA, NIK, TRAF2, y TRAF3 estan asociadas con ciertas enfermedades, trastornos o afecciones por ejemplo en la patologia de la infecci6n viral (TRAF2�3, NIK, SIVA), efectos secundarios de la quimioterapia (SIVA), efectos secundarios de la reperfusi6n de isquemia (SIVA), situaciones asociadas con la regulaci6n creciente de SIVA, enfermedades autoinmunes asociadas con la activaci6n del camino alternativo NFKB de una manera que depende de NIK (TRAF2�3, SIVA), y enfermedades asociadas con actividad no regulada de los linfocitos (NIK, SIVA, TRAF2�3). Por ejemplo, la regulaci6n creciente/activaci6n de TRAF2 esta asociada con activaci6n inmunitaria excesiva e inflamaci6n. La regulaci6n creciente/activaci6n de NIK esta asociada con condiciones autoinmunes y cancer. La regulaci6n creciente/activaci6n de TRAF3 esta asociada quizas con deficiencia inmunitaria. La regulaci6n creciente/activaci6n de SIVA esta asociada con los efectos secundarios de quimioy radioterapia y con isquemia y reperfusi6n isquemica. Asi pues, la modulaci6n, es decir la activaci6n o inhibici6n de la actividad relacionada con ubiquitinaci6n o relacionada con la degradaci6n de un polipeptido SIVA o un de un polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B de SEQ ID NO: 6 o un hom6logo del mismo puede ser beneficiosa para tratar o prevenir dicha enfermedad, afecci6n o trastorno.

Asi pues, la memoria descriptiva se refiere al uso de un agente capaz de modular la actividad directa o indirecta relacionada con ubiquitinaci6n de un polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B de la secuencia en SEQ ID NO: 6 o una secuencia hom6loga de la misma, tal como SIVA, en la fabricaci6n de un medicamento para el tratamiento o prevenci6n de una enfermedad, trastorno o afecci6n cuya patologia o cuyo curso esta asociada con la actividad y/o niveles de TRAF2, NIK, TRAF3 y/o SIVA.

La invenci6n proporciona metodos especificos para identificar agentes candidato capaces de modular la actividad relacionada con ubiquitina de SIVA, un polipeptido SIVA o un polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B de SEQ ID NO: 6 o un hom6logo del mismo.

Ejemplos de agentes de test o agentes candidato que pueden escrutarse en los metodos de la invenci6n incluyen, pero sin caracter limitante, moleculas organicas pequenas, peptidos (v.g., anticuerpos), acidos nucleidos, y moleculas de extractos naturales, carbohidratos o cualquier otra sustancia. Los agentes de test incluyen compuestos organicos sinteticos creados v.g. por quimica combinatoria. Los compuestos testados pueden obtenerse no s6lo por quimica combinatoria, sino tambien por otros metodos de sintesis de alta potencia. Las tecnicas automaticas permiten la sintesis rapida de bibliotecas de moleculas, grandes colecciones de compuestos discretos, que pueden cribarse. La producci6n de bibliotecas de compuestos mayores y mas diversas aumenta la probabilidad de descubrir un farmaco util dentro de la biblioteca. Para el cribado de alta capacidad pueden utilizarse robots a fin de testar la inhibici6n o la activaci6n de una ubiquitinaci6n mediada por SIVA y/o degradaci6n de proteinas por miles de compuestos.

Se ha demostrado en esta memoria que las celulas Ramos que expresan constitutivamente el termino SIVAC mimetiza la deficiencia de TRAF2 en las celulas B. las celulas B deficientes en TRAF2 exhiben alto nivel de p52 (NFKB alternativa constitutiva) y TRAF3 (Grech et al., 2004). Analogamente, se encontr6 que las celulas Ramos que se habian modificado por ingenieria genetica para expresar de manera estable el termino C de SIVA exhiben un nivel alto de p52 asi como TRAF3 y una expresi6n reducida de TRAF2. La hiperactivaci6n de NFKB resultante de la expresi6n de SIVAc puede dar como resultado una expresi6n intensificada de inmunomediadores dependientes de NFKB en las celulas.

Asi pues, se describe el uso de un polipeptido SIVA tal como SIVAc, SIVA158, SIVA181 y SIVA 2C73A o un agente capaz de modular la actividad relacionada con ubiquitina o relacionada con degradaci6n de proteinas de SIVA en la fabricaci6n de un medicamento para tratamiento de una enfermedad, trastorno o afecci6n por o a traves de modulaci6n del sistema inmunitario.

Se ha encontrado que SIVA2 induce tambien la ubiquitinaci6n K48 de NIK, que se reducia notablemente por mutaci6n del residuo K670 de NIK. Asi pues, dicho mutante de NIK puede utilizarse en la fabricaci6n de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afecci6n sensible a la modulaci6n del sistema inmunitario.

Se describe el uso de un agente capaz de modular la formaci6n del complejo NIKSIVATRAF3, en la fabricaci6n de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afecci6n inmunitaria y/o una enfermedad, trastorno o afecci6n cuya patologia o cuyo curso esta asociada(o) con una expresi6n o actividad excesiva de NFKB y/o una enfermedad, trastorno o afecci6n cuya patologia o cuyo curso esta asociada(o) con actividad excesiva de NIK, tal como inflamaci6n o cancer.

La invenci6n proporciona polipeptidos aislados tales como un polipeptido aislado que comprende un fragmento Cterminal de un polipeptido SIVA que incluye el dedo de anillo semejante a caja B y/o los motivos con dedo de cinc excepto SIVA1 y SIVA2. La invenci6n proporciona polipeptidos aislados tales como los residuos de aminoacido 58 a 110 de SIVA2 indicados en SEQ ID NO: 3; un fragmento Nterminal de un polipeptido SIVA que carece del motivo con dedo de cinc 181 (SEQ ID NO: 5); un polipeptido que comprende un fragmento Nterminal de un SIVA; un polipeptido que carece del motivo con dedo de cinc y el motivo con dedo de anillo semejante a caja B de SIVA2 158 (SEQ ID NO: 4); un polipeptido constituido por SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5; un polipeptido que comprende un polipeptido SIVA mutado en un residuo cisteina localizado en el motivo con dedo de anillo. Se describe un mutante NIK en el residuo de lisina 670, o un fragmento del mismo.

Como se utiliza en esta memoria, el termino "muteinas" se refiere a analogos de una proteina, en los cuales uno o mas de los residuos de aminoacido de los componentes existentes naturalmente de la proteina estan reemplazados por residuos de aminoacido diferentes, o estan delecionados, o se anaden uno o mas residuos de aminoacido a la secuencia original de la proteina, sin cambiar considerablemente la actividad de los productos resultantes en comparaci6n con la proteina original. Estas muteinas se preparan por tecnicas conocidas de sintesis y/o de mutagenesis orientada, o cualquier otra tecnica conocida adecuada para ello.

Las muteinas de acuerdo con la presente invenci6n incluyen proteinas codificadas por un acido nucleico, tal como DNA o RNA, que se hibrida al DNA o RNA, que codifica la proteina, de acuerdo con la presente invenci6n, en condiciones severas. El termino "condiciones severas" hace referencia a condiciones de hibridaci6n y lavado subsiguiente, a las cuales se refieren convencionalmente quienes poseen una experiencia ordinaria en la tecnica como "severas". Vease Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., ��6.3 y 6.4 (1987, 1992), y Sambrook et al. (Sambrook, J. C., Fritsch, E. F., y Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Sin caracter limitante, ejemplos de condiciones severas incluyen condiciones de lavado 1220°C por debajo del valor Tm calculado del hibrido en estudio en, v.g., 2 x SSC y 0,5% SDS durante 5 minutos, 2 x SSC y 0,1% SDS durante 15 minutos; 0,1 x SSC y 0,5% SDS a 37°C durante 3060 minutos y luego, un 0,1 x SSC y 0,5% SDS a 68°C durante 3060 minutos. Quienes poseen una experiencia ordinaria en esta tecnica entienden que las condiciones de severi

dad dependen tambien de la longitud de las secuencias de DNA, sondas oligonucleotidicas (tales como 1040 bases) o sondas oligonucleotidicas mixtas. Si se utilizan sondas mixtas, es preferible utilizar cloruro de tetrametilamonio (TMAC) en lugar de SSC. Vease Ausubel, supra.

Cualquiera de tales muteinas tiene preferiblemente una secuencia de aminoacidos suficientemente duplicativa de la de SIVA, de tal modo que tenga una actividad sustancialmente similar, o aun mejor, que SIVA. Por ejemplo, una actividad de SIVA es la capacidad de inducir autoubiquitinaci6n o ubiquitinaci6n de TRAF2. Ensayos para medir la ubiquitinaci6n de SIVA y TRAF2, se describen en los ejemplos que siguen. Otra actividad de SIVA es la inducci6n de la ubiquitinaci6n directa o indirecta de NIK o TRAF3 descrita en los ejemplos siguientes. Una actividad adicional de SIVA es la inducci6n de la degradaci6n de proteinas, tal como degradaci6n de NIK y/o TRAF3 (total o parcial) como se describe en los ejemplos que siguen. Con tal que la muteina sea capaz de exhibir una actividad sustancial, tal como una de las actividades de SIVA mencionadas, puede considerarse que tiene actividad sustancialmente similar a SIVA. Asi pues, puede determinarse si cualquier muteina dada tiene al menos sustancialmente la misma actividad que la SIVA de la presente invenci6n por medio de experimentaci6n de rutina como se muestra para SIVA en los ejemplos que siguen.

Dicha muteina puede tener al menos 40% de identidad u homologia con la secuencia de aminoacidos de SIVA. Mas preferiblemente, la misma tiene al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80% o, muy preferiblemente, al menos 90% de identidad u homologia con ella.

La identidad refleja una relaci6n entre dos o mas secuencias de polipeptidos o dos o mas secuencias de polinucle6tidos, determinada por comparaci6n de las secuencias. En general, la identidad hace referencia a una correspondencia exacta de nucle6tido a nucle6tido o de aminoacido a aminoacido de los dos polinucle6tidos o las dos secuencias polipeptidicas, respectivamente, a lo largo de toda la longitud de las secuencias que se comparan.

Para secuencias en las cuales no existe una correspondencia exacta, puede determinarse un "porcentaje de identidad". En general, las dos secuencias a comparar se alinean para dar una correlaci6n maxima entre las secuencias. Esto puede incluir la inserci6n de "lagunas" en una o ambas secuencias, a fin de mejorar el grado de alineaci6n. Puede determinarse un porcentaje de identidad a lo largo de toda la longitud de cada una de las secuencias que se comparan (denominada alineaci6n global), que es particularmente adecuada para secuencias de la misma longitud o de longitud muy similar, o longitudes definidas mas cortas (la denominada alineaci6n local), que es mas adecuada para secuencias de longitud desigual.

Los metodos para comparar la identidad y homologia de dos o mas secuencias son bien conocidos en la tecnica. Asi, por ejemplo, pueden utilizarse los programas disponibles en el Wisconsin Sequence Analysis Package, Version

9.1 (Devereux J et al., 1984, Nucleic Acids Res. 1984, enero de 2011; 12(1 Pt 1); 38795.); por ejemplo los programas BESTFIT y GAP, para determinar el porcentaje de identidad entre dos polinucle6tidos y el porcentaje de identidad y el porcentaje de homologia entre dos secuencias polipeptidicas. BESTFIT utiliza el algoritmo de "homologia local" de Smith y Waterman (J Theor Biol. 1981, julio 21; 91(2): 37980 y J Mol Biol. 1981 marzo 25; 147 (1): 1957, 1981) y encuentra la regi6n individual 6ptima de semejanza entre dos secuencias. Otros programas para determinaci6n de identidad y/o semejanza entre secuencias se conocen tambien en la tecnica, por ejemplo la familia de programas BLAST (Altschul S F et al, 1990 J Mol Biol. 1990 Oct 5; 215(3): 40310, Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 Jul; 87(14): 550913, Altschul S F et al, Nucleic Acids Res. 1997 Sep 1; 25(17): 3389402, accesibles en la pagina digital del NCBI en www.ncbi.nlm.nih.gov) y FASTA (Pearson W R, Methods Enzymol. 1990; 183: 6398. Pearson J Mol Biol. 1998 Feb 13; 276(1): 7184).

Las muteinas de SIVA, que se pueden utilizar de acuerdo con la presente invenci6n, incluyen un conjunto finito de secuencias sustancialmente correspondientes como peptidos o polinucle6tidos de sustituci6n que pueden obtenerse rutinariamente por una persona con experiencia ordinaria en la tecnica, sin experimentaci6n excesiva, basandose en la doctrina y orientaciones presentadas en esta memoria.

Los cambios preferidos para las muteinas de acuerdo con la presente invenci6n son los que se conocen como sustituciones "conservadoras". Las sustituciones conservadoras de aminoacidos de SIVA pueden incluir aminoacidos sin6nimos dentro de un grupo que tiene propiedades fisicoquimicas suficientemente similares para que la sustituci6n entre miembros del grupo preserve la funci6n biol6gica de la molecula (Grantham Science, 1974, septiembre 6; 185(4154); 8624). Esta claro que pueden hacerse tambien inserciones y deleciones de aminoacidos en las secuencias arriba definidas sin alteraci6n de su funci6n, particularmente si las inserciones o deleciones implican unicamente un pequeno numero de aminoacidos, v.g., menos de 30, y preferiblemente menos de 10, y no eliminan o desplazan aminoacidos que son criticos para una conformaci6n funcional, v.g. residuos cisteina. Las proteinas y muteinas producidas por tales deleciones y/o inserciones estan dentro del alcance de la presente invenci6n.

Ejemplos de producci6n de sustituciones de aminoacidos en proteinas que pueden utilizarse para la obtenci6n de muteinas de SIVA, para uso en la presente invenci6n incluyen cualesquiera pasos de metodos conocidos, tales como los presentados en las Patentes US 4.959.314, 4.588.585 y 4.737.462. otorgadas a Mark et al; 5.116.943 a Koths et al., 4.965.195 a Namen et al; 4.879.111 a Chong et al; y 5.017.691 a Lee et al; y las proteinas sustituidas con lisina expuestas en la Patente US 4.904.584 (Shaw et al.).

En una realizaci6n de la invenci6n, la muteina SIVA es una mutada en un residuo cisteina localizado en el dedo de anillo semejante a caja B de SIVA, preferiblemente en el residuo cisteina 73 de SIVA2.

El termino "derivados funcionales" como se utiliza en esta memoria, abarca derivados de SIVA, y sus muteinas, que pueden prepararse a partir de los grupos funcionales que existen como cadenas laterales en los residuos o son adiciones a los grupos terminales N o C, por medios conocidos en la tecnica, y se incluyen en la invenci6n con tal que sigan siendo farmaceuticamente aceptables, es decir que no destruyan la actividad de la proteina que es sustancialmente similar a la actividad de SIVA.

La expresi6n "derivados funcionales" comprende tambien multimeros constituidos por SIVA en los cuales se han introducido cambios en la secuencia de los aminoacidos que constituyen el SIVA por cualquier metodo convencional. Estos cambios pueden comprender elongaci6n o truncaci6n de la molecula SIVA o deleci6n o reemplazamiento de uno o mas aminoacidos del SIVA. Debe entenderse que ninguna de las tecnicas anteriores puede afectar a las propiedades de ubiquitinaci6n y/o degradaci6n de SIVA.

Estos derivados pueden incluir, por ejemplo, cadenas laterales de polietilenglicol, que pueden enmascarar sitios antigenicos y prolongar la residencia de SIVA en los fluidos corporales. Otros derivados incluyen esteres alifaticos de los grupos carboxilo, amidas de los grupos carboxilo por reacci6n con amoniaco o con aminas primarias o secundarias, derivados acilados en N de grupos amino libres de los residuos de aminoacido formados con restos acilo (v.g. grupos alcanoilo o aroilo carboxilico) o derivados acilados en O de grupos hidroxilo libres (por ejemplo el de residuos serilo o treonilo) formados con restos acilo.

Una "fracci6n activa" de acuerdo con la presente invenci6n puede ser v.g. un fragmento de SIVA. El termino fragmento hace referencia a cualquier subconjunto de la molecula, es decir, un peptido mas corto que retiene la actividad biol6gica deseada de SIVA8. Los fragmentos pueden prepararse facilmente por eliminaci6n de aminoacidos de cualquier extremo de SIVA y testado del fragmento resultante respecto a su actividad en macr6fagos y/o en el modelo de inflamaci6n local. Se conocen proteasas para eliminaci6n de un aminoacido de una vez del terminal N o el terminal C de un polipeptido, y por tanto la determinaci6n de fragmentos que retienen la actividad biol6gica deseada, implica solamente experimentaci6n de rutina.

En una realizaci6n de la invenci6n, la fracci6n activa de SIVA es una correspondiente a un fragmento Cterminal de un polipeptido SIVA que incluye el dedo de anillo semejante a caja B y/o el motivo con dedo de cinc, tales como fragmentos de SIVA2 constituidos por los residuos 58 a 110 (SEQ ID NO: 3). En otra realizaci6n, la fracci6n activa de SIVA es una correspondiente a un fragmento Nterminal de SIVA que carece del motivo con dedo de cinc, el dedo de anillo semejante a caja B o ambos, tal como fragmentos de SIVA de los residuos 158 (SEQ ID NO: 4) o de los residuos 181 (SEQ ID NO: 5).

Como fracciones activas de SIVA, muteinas y proteinas fusionadas del mismo, la presente invenci6n abarca adicionalmente cualesquiera fragmentos o precursores de la cadena polipeptidica de la molecula proteinica sola o junto con moleculas asociadas o residuos enlazados a ellas, v.g. residuos azucar o fosfato, o agregados de la molecula de proteina o los residuos azucar por si mismos, con tal que dicha fracci6n tenga una actividad sustancialmente similar a SIVA.

La expresi6n "proteina fusionada" hace referencia a un polipeptido que comprende un SIVA, o una muteina o fragmento de la misma, fusionada con otra proteina, que, v.g., tiene un tiempo de residencia prolongado en fluidos corporales. Un SIVA puede estar fusionado asi a v.g., una inmunoglobulina o un fragmento de la misma.

Las "isoformas" de SIVA son proteinas capaces de tener actividad de SIVA o fragmentos de las mismas, que pueden producirse por corte y empalme alternativos.

La expresi6n "derivados permutados circularmente" como se utiliza en esta memoria, hace referencia a una molecula lineal en la cual los terminos se han unido unos a otros, sea directamente o a traves de un enlazador, para producir una molecula circular, despues de lo cual la molecula circular se abre en otro punto para producir una nueva molecula lineal con terminos diferentes de los terminos existentes en la molecula original. Las permutaciones circulares incluyen aquellas moleculas cuya estructura es equivalente a una molecula que se ha circularizado y se ha abierto despues. Asi, una molecula permutada circularmente puede sintetizarse de novo como una molecula lineal sin llegar nunca a un paso de circularizaci6n y apertura. La preparaci6n de derivados permutados circularmente se describe en WO 95/27732.

En otro aspecto, la invenci6n proporciona polinucle6tidos aislados, tales como los expuestos en SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9, que codifican polipeptidos de acuerdo con la invenci6n.

La expresi6n de un polipeptido de la invenci6n en una celula de mamifero puede abordarse por inserci6n del DNA codificante del peptido en un vector que comprende un promotor, opcionalmente una secuencia intr6nica y senales de corte y empalme donante/aceptor, y que comprende opcionalmente ademas una secuencia de terminaci6n. Estas tecnicas se describen en general en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Capitulo 16), Greene Publications y Wiley Interscience, Nueva York, NY, 19871995; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Las secuencias anteriores de promotor, intr6n, y de terminaci6n son operativas en celulas de mamifero. El promotor es preferiblemente un promotor fuerte tal como el promotor RSV, CMV o MPSV arriba indicados. El promotor puede ser tambien el promotor temprano SV40 (Everett, et al. 1983), o un promotor celular, tal como el promotor betaactina o el promotor ELF1 (Tokushige, et al., 1997). Puede utilizarse tambien un promotor hibrido, tal como el hibrido entre el operador lac y el promotor ELF1 alfa humano, como ha sido descrito por Edamatsu et al. 1997, el promotor hibrido CMVbeta actina descrito por Akagi et al (1997), o el hibrido entre las secuencias operadoras y el promotor CMV (Furth et al., 1994).

Secuencias de intr6n, que pueden insertarse como secuencias completas, es decir, que incluyen los sitios de corte y empalme donantes y aceptores, pueden insertarse en la secuencia codificante del polipeptido que se desea expresar. La inserci6n de tales secuencias de intr6n puede aumentar la estabilidad del RNA y aumentar asi la producci6n del polipeptido deseado. Si bien en principio pueden seleccionarse secuencias de intr6n adecuadas a partir de cualquier gen que contenga intrones, secuencias intr6nicas ilustrativas son el intr6n de betaactina, el intr6n de SV40, y el intr6n receptor p55 de TNF.

La secuencia intr6nica puede contener elementos intensificadores, que pueden mejorar la transcripci6n de los promotores arriba indicados.

A menudo, las secuencias intr6nicas contienen tambien consecuencias de control de la transcripci6n o la traducci6n que confieren expresi6n especifica de tejido. Por tanto, cuando se desea expresar un polipeptido de la invenci6n de una manera especifica de tejido, pueden emplearse ventajosamente tales secuencias intr6nicas. Un ejemplo de un intr6n que contiene elementos intensificadores especificos de tejido es el intensificador especifico de los eritroides localizado en el intr6n 8 del gen 2 de 5aminolevulinatosintasa humano (Surinya et al. 1998), y una discusi6n del principio de aumento de la producci6n de proteinas utilizando secuencias intr6nicas, junto con secuencias intr6nicas ilustrativas, se proporciona en Huang et al. 1990.

Pueden anadirse secuencias de terminaci6n de la transcripci6n y senales de poliadenilaci6n en el extremo 3' del DNA codificante del polipeptido que se desea expresar. Tales secuencias pueden encontrarse en muchos o incluyo la mayoria de los genes. Ventajosamente, puede utilizarse la senal de poliadenilaci6n de SV40 (Schek et al., 1992).

Podrian utilizarse vectores para la expresi6n de los polipeptidos de la invenci6n en una celula de mamifero, por ejemplo el vector pcDNA 3.1 (Invitrogen), que contiene el promotor CMV para dirigir la expresi6n del gen que codifica el polipeptido deseado y vectores pMPSVEH con los promotores MPSV.

Pueden producirse polipeptidos recombinantes en celulas hospedadoras cultivadas bacterianas o eucariotas (v.g. CHO) transfectadas con vectores que codifican tales polipeptidos o en animales transgenicos. Cuando se utilizan animales transgenicos, es particularmente ventajoso producir polipeptidos heter6logos en su leche. Animales productores de leche tales como ganado vacuno, ovejas y cabras son por tanto hospedadores ilustrativos. Veanse, por ejemplo, las memorias descriptivas de patente WO 88/00239, WO 90/05188, WO 91/02318, y WO 92/11757; y U.S. Pat. Nos. 4.873.191; 4.873.316; y 5.304.489.

Los polipeptidos pueden comprender restos prolongadores de la semivida tales como polimeros de peso molecular alto que dan como resultado "polipeptidos o proteinas de fusi6n" con semivida prolongada en los fluidos corporales. Por ejemplo, polipeptidos de acuerdo con la invenci6n pueden fusionarse a una proteina tal como, por ejemplo, una inmunoglobulina o a un polimero de peso molecular alto, tal como polietilenglicol (PEG) o analogos.

La invenci6n se refiere a un polipeptido de acuerdo con la invenci6n como se define arriba, o a una sal del mismo y/o un derivado del mismo.

El termino "sales" se refiere en esta memoria tanto a sales de grupos carboxilo como a sales de adici6n de acido de grupos amino de los peptidos de la invenci6n. Sales de un grupo carboxilo pueden formarse por medios conocidos en la tecnica e incluyen sales inorganicas, por ejemplo, sales de sodio, calcio, amonio, ferricas o de cinc, y analogas, y sales con bases organicas tales como las formadas, por ejemplo, con aminas, tales como trietanolamina, arginina

o lisina, piperidina, procaina y analogas. Sales de adici6n de acido incluyen, por ejemplo, sales con acidos minerales tales como, por ejemplo, acido clorhidrico o acido sulfurico, y sales con acidos organicos tales como, por ejemplo, acido acetico o acido oxalico. Por supuesto, cualquiera de dichas sales puede tener una actividad sustancialmente similar al peptido de la invenci6n.

La presente invenci6n proporciona tambien vectores de expresi6n que comprenden la secuencia de DNA que codifica un polipeptido de la invenci6n y metodos para su producci6n por introducci6n de dicho vector en celulas hospedadoras procariotas o eucariotas, tales como celulas de insecto, celulas de levadura, o celulas de mamifero tales como celulas HeLa, HEK 293T y CHO, cultivo de las celulas y aislamiento de la proteina producida.

Ademas, la invenci6n proporciona un vector viral que codifica un polipeptido.

Se describe una composici6n farmaceutica que comprende un agente capaz de modular la actividad relacionada con ubiquitina de un polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B de la secuencia de SEQ ID NO: 6 o una secuencia hom6loga de la misma, y un vehiculo farmaceuticamente aceptable.

Se describe una composici6n farmaceutica que comprende un agente capaz de modular la degradaci6n de la proteina mediada por la actividad de un polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B de la secuencia de SEQ ID NO: 6 o de una secuencia hom6loga de la misma, y un vehiculo farmaceuticamente aceptable.

De acuerdo con la invenci6n, se ha demostrado que el fragmento Cterminal de SIVA, tal como el fragmento de SIVA que abarca los residuos 58 a 110 (SEQ ID NO: 3), tiene un efecto dominante negativo sobre la activaci6n de NFKB inducida por NIK y CD27 a concentraciones altas. A bajas concentraciones, y en una linea de celulas estable, el mismo exhibe efectos intensificadores sobre la activaci6n de NFKB. Asi, en otro aspecto adicional, la invenci6n proporciona un polipeptido que corresponde al fragmento Cterminal de SIVA que incluye el dedo de anillo semejante a caja B y/o los motivos con dedo de cinc y un polinucle6tido (o DNA) que codifica dicho polipeptido.

Asimismo, se ha encontrado de acuerdo con la invenci6n, que el fragmento Nterminal de SIVA, tal como el fragmento de SIVA que abarca los residuos 1 a 58 (SEQ ID NO: 4) o 1 a 81 (SEQ ID NO: 5), al igual que SIVA intacto, puede inducir la degradaci6n de NIK. Por tanto, otro aspecto de la invenci6n se refiere a un polipeptido correspondiente al fragmento Nterminal de un polipeptido SIVA que carece del motivo con dedo de cinc, el motivo con dedo de anillo semejante a caja B o ambos, y a un polinucle6tido (o DNA) que codifica dicho polipeptido.

La invenci6n se refiere tambien a polinucle6tidos que codifican los polipeptidos de la invenci6n tales como los indicados en SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9.

Los polipeptidos de la invenci6n pueden producirse, en eucariotas o sistemas de expresi6n eucariotas, intracelularmente, periplasmicamente, o pueden secretarse al medio. Los polipeptidos producidos de la invenci6n pueden recuperarse en forma soluble o insoluble (cuerpos de inclusi6n). Un vector que comprende un polinucle6tido que codifica los polipeptidos de la invenci6n podria utilizarse para expresi6n de dichos polipeptidos en sistemas procariotas o eucariotas. Un vector de expresi6n que codifica un peptido de senalizaci6n efectivo, tal como el peptido de senal de la hormona del crecimiento humano, fusionado al polinucle6tido (o DNA) que codifica los polipeptidos de la invenci6n puede utilizarse para expresi6n y secreci6n en eucariotas.

La presente invenci6n proporciona polipeptidos de la invenci6n tales como los indicados en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5 o una muteina, proteina de fusi6n, derivado funcional, derivado permutado circularmente o fragmento del mismo, o sal del mismo, o un polinucle6tido que codifica dichos polipeptidos de la invenci6n, para la fabricaci6n de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afecci6n. Por ejemplo, para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afecci6n asociada con SIVA, NIK, TRAF2 y TRAF3 tal como la patologia de infecci6n viral, efectos secundarios de quimioterapia, efectos secundarios de reperfusi6n de isquemia, situaciones asociadas con regulaci6n creciente de SIVA, enfermedades autoinmunes asociadas con activaci6n del camino alternativo NFKB de una manera que depende de NIK, y enfermedades asociadas con actividad no regulada de los linfocitos.

Un uso terapeutico o asociado a investigaci6n de estas herramientas necesita su introducci6n en celulas de un organismo vivo. Para este prop6sito, es deseable mejorar la permeabilidad de membrana de peptidos, polipeptidos y polinucle6tidos.

La derivatizaci6n con estructuras lip6filas puede utilizarse en la creaci6n de peptidos y proteinas con permeabilidad de membrana mejorada. Por ejemplo, puede anadirse la secuencia de un peptido membranotr6pico conocido como se ha indicado arriba a la secuencia del peptido o polipeptido. Adicionalmente, el peptido o polipeptido puede ser derivatizado por estructuras parcialmente lip6filas tales como las cadenas hidrocarbonadas arriba indicadas, que estan sustituidas con al menos un grupo polar o cargado. Por ejemplo, derivados lauroilo de peptidos ha sido descritos por Muranishi et al., 1991. Modificaciones adicionales de peptidos y polipeptidos comprenden la oxidaci6n de residuos metionina para crear con ello grupos sulf6xido, como ha sido descrito por Zacharia et al., 1991. Zacharia y sus colaboradores describen tambien peptidos o derivados en los cuales el enlace peptidico relativamente hidr6fobo esta reemplazado por su isoester cetometileno (COCH2). Estas y otras modificaciones conocidas por las personas expertas en la tecnica de la quimica de proteinas y peptidos aumentan la permeabilidad de membrana.

La orientaci6n para utilizaci6n de vehiculos de base lipidica para suministro intracelular de moleculas terapeuticas, tales como los polipeptidos de la presente invenci6n es bien conocida en la tecnica (Abra RM. et al., 2002. J Liposome Res. 12:13; Park JW., 2002. Breast Cancer Res.; 4(3):959; Bendas G., 2001. BioDrugs 15:21524; Maruyama K., 2000. Biol Pharm Bull. 23:7919; Hong K. et al., 1999. Ann N Y Acad Sci. 886:2936; Margalit R., 1995. Crit Rey Ther Drug Carrier Syst. 12:23361; Storm G. y Crommelin DJ., 1997. Hybridoma 16:11925; Park JW. et al., 1997. Adv Pharmacol. 40:399435).

Otra via de mejora de la permeabilidad de membrana es el uso de receptores, tales como receptores virales, en superficies celulares a fin de inducir la captura celular del peptido o proteina. Este mecanismo es utilizado frecuentemente por los virus, que se fijan especificamente a ciertas moleculas de la superficie celular. Despues de la fijaci6n, la celula captura el virus en su interior. La molecula de la superficie celular se conoce como un receptor de virus. Por ejemplo, las moleculas de integrina CAR y AdV han sido descritas como receptores virales para adenovirus, vease Hemmi et al. 1998. Las moleculas CD4, GPR1, GPR15, y STRL33 han sido identificadas como receptores/correceptores para HIV, vease Edinger et al., 1998.

Asi pues, la conjugaci6n de peptidos, polipeptidos o polinucle6tidos con moleculas que se sabe se fijan a receptores de la superficie celular aumentara la permeabilidad de membrana de dichos peptidos, polipeptidos o polinucle6tidos. Ejemplos de grupos adecuados para formaci6n de conjugados son azucares, vitaminas, hormonas, citoquinas, transferrina, asialoglicoproteina, y moleculas analogas. Low et al., U.S. Pat. No. 5.108.921 describe el uso de estas moleculas para el prop6sito de aumentar la permeabilidad de membrana de peptidos, polipeptidos y polinucle6tidos, y la preparaci6n de dichos conjugados.

Low y sus colaboradores exponen adicionalmente que pueden utilizarse moleculas tales como folato o biotina para direccionar el conjugado a una multitud de celulas en un organismo, debido a la expresi6n abundante e inespecifica de los receptores para estas moleculas.

El uso anterior de proteinas de la superficie celular para aumentar la permeabilidad de membrana de un peptido, polipeptido o polinucle6tido de la invenci6n puede emplearse tambien en el direccionamiento de dicho polipeptido, o polinucle6tido de la invenci6n a ciertos tipos de celulas o tejidos. Por ejemplo, si se desea direccionar celulas de cancer, es preferible utilizar una proteina de la superficie celular que se exprese mas abundantemente en la superficie de dichas celulas. Ejemplos son el receptor folato, los antigenos de mucina MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, y MUC7, los antigenos de glicoproteinas KSA, el antigeno carcinoembrionario, el antigeno de membrana especifico de pr6stata (PSMA), HER2/neu, y la gonadotropinabeta cori6nica humana. Wang et al., citados anteriormente, 1998, exponen el uso de folato para direccionar celulas de cancer, y Zhang et al., 1998, exponen la abundancia relativa de cada uno de los otros antigenos arriba indicados en diversos tipos de cancer y en celulas normales.

El polipeptido, peptido o polinucle6tido de la invenci6n puede por tanto, utilizando las tecnicas de coagulaci6n arriba descritas, direccionarse a cierto tipo de celulas, segun sea deseado. Por ejemplo, si se desea inhibir la activaci6n de NIK en celulas del linaje linfocitico, puede direccionarse un polipeptido, peptido o polinucle6tido de la invenci6n o fragmento del mismo, mutantes y derivados de la invenci6n a dichas celulas, por ejemplo, utilizando las moleculas del MHC clase II que se expresan en estas celulas. Esto puede conseguirse por acoplamiento de un anticuerpo, o el sitio de fijaci6n de antigeno del mismo, dirigido contra la regi6n constante de dicha molecula del MHC clase II al polipeptido o peptido de la invenci6n. Adicionalmente, han sido descritos numerosos receptores de la superficie celular para diversas citoquinas y otras moleculas de comunicaci6n celular, y muchas de estas moleculas se expresan de una manera mas o menos restringida respecto a un tipo de tejido o celula. Asi, cuando se desea direccionar un subgrupo de celulas T, puede utilizarse la molecula de la superficie de las celulas T CD4 para producir el conjugado de la invenci6n. Moleculas de fijaci6n CD4 son proporcionadas por el virus HIV, cuyo antigeno de superficie gp42 es capaz de fijarse especificamente a la molecula CD4.

Las secuencias de polipeptidos y polinucle6tidos de la invenci6n pueden introducirse en las celulas por el uso de un vector viral. El uso del vector vaccinia para este prop6sito se detalla en el capitulo 16 de Current Protocols in Molecular Biology. El uso de vectores de adenovirus ha sido descrito v.g. por Teoh et al., 1998, Narumi et al, 1998, Pederson et al, 1998, GuangLin et al., 1998, Nishida et al., 1998, Schwarzenberger et al 1998, y Cao et al., 1998. La transferencia retroviral de secuencias antisentido ha sido descrita por Daniel et al. 1998.

Cuando se utilizan virus como vectores, se emplean generalmente proteinas de la superficie viral para direccionar el virus. Dado que muchos virus, tales como el adenovirus anterior, son mas bien inespecificos en su tropismo celular, puede ser deseable impartir especificidad adicional utilizando un promotor especifico del tipo de celula o tejido. Griscelli et al., 1998, exponen el uso del promotor 2 de la cadena ligera de la miosina cardiaca especifica del ventriculo para direccionamiento especifico al coraz6n de un gen cuya transferencia esta mediada por adenovirus.

Alternativamente, el vector viral puede modificarse por ingenieria genetica para expresar una proteina adicional en su superficie, o la proteina de la superficie del vector viral puede cambiarse para incorporar una secuencia peptidica deseada. El vector viral puede modificarse asi por ingenieria genetica para expresar uno o mas epitopes adicionales, que pueden utilizarse para direccionar dicho vector viral. Por ejemplo, epitopes de citoquinas, peptidos de fijaci6n al MHC clase II, o epitopes derivados de moleculas Homing pueden utilizarse para direccionar el vector viral de acuerdo con la doctrina de la invenci6n.

Se describen composiciones farmaceuticas que comprenden una o mas sustancias activas seleccionadas de uno o mas polipeptidos de la invenci6n y/o polinucle6tidos o vectores que albergan sus secuencias o antisentido. La presente invenci6n abarca composiciones farmaceuticas que comprenden anticuerpos especificos capaces de reconocer y fijarse a regiones de un polipeptido SIVA responsables de la ubiquitinaci6n de SIVA, TRAF2, NIK y TRAF3.

Debe entenderse que la definici6n de "farmaceuticamente aceptable" abarca cualquier portador que no interfiere con la efectividad de la actividad biol6gica del ingrediente activo y que no es t6xico para el hospedador al que se administra. Por ejemplo, para administraci6n parenteral, la o las proteinas activas pueden formularse en una forma de dosificaci6n unitaria para inyecci6n en vehiculos tales como soluci6n salina, soluci6n de dextrosa, seroalbumina y soluci6n de Ringer.

Los ingredientes activos de la composici6n farmaceutica de acuerdo con la invenci6n pueden administrarse a un individuo de una diversidad de vias. Las rutas de administraci6n incluyen rutas intradermica, transdermica, (v.g. en

formulaciones de liberaci6n lenta), intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutanea, oral, intracraneal, epidural, t6pica, e intranasal. Puede utilizarse cualquier otra ruta de administraci6n terapeuticamente eficaz, por ejemplo absorci6n a traves de tejidos epiteliales o endoteliales o por terapia genica en la cual se administra al paciente una molecula de DNA que codifica el agente activo (v.g. por la via de un vector), que hace que el agente activo se exprese y secrete in vivo. Adicionalmente, el o los polipeptidos de acuerdo con la invenci6n pueden administrarse junto con otros componentes de agentes biol6gicamente activos tales como agentes tensioactivos, excipientes, portadores, diluyentes y vehiculos farmaceuticamente aceptables.

Se describe el uso de anticuerpos especificos capaces de reconocer y fijarse a una regi6n de un polipeptido SIVA responsable de la ubiquitinaci6n de SIVA, TRAF2, TRAF3 y NIK, en la fabricaci6n de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad.

La memoria descriptiva se refiere a un metodo para el tratamiento de una enfermedad que implica ubiquitinaci6n de SIVA, TRAF2, TRAF3 y/o NIK en la patogenesis de dicha enfermedad que comprende administraci6n de una cantidad terapeuticamente eficaz de anticuerpos especificos capaces de reconocer regiones en SIVA sensibles a la ubiquitinaci6n, a un individuo que se halla en necesidad.

Para administraci6n parenteral (v.g. intravenosa, subcutanea, intramuscular), la o las proteinas activas pueden formularse como una soluci6n, suspensi6n, emulsi6n o polvo liofilizado en asociaci6n con un vehiculo parenteral farmaceuticamente aceptable (v.g. agua, soluci6n salina, soluci6n de dextrosa) y aditivos que mantienen la isotonicidad

(v.g. manitol) o la estabilidad quimica (v.g. conservantes y tampones). La formulaci6n se esteriliza por tecnicas utilizadas comunmente.

La biodisponibilidad del o de los polipeptidos activos de acuerdo con la invenci6n puede mejorarse tambien utilizando procedimientos de conjugaci6n que aumentan la semivida de la molecula en el cuerpo humano, por ejemplo enlazando la molecula a polietilenglicol, como se describe en la Solicitud de Patente PCT WO 92/13095.

Una "cantidad terapeuticamente eficaz" es aquella que, cuando se administra, dichos polipeptidos, polinucle6tidos o virus de la invenci6n inducen un efecto beneficioso en la prevenci6n o el curso de una enfermedad. La dosis administrada, en forma de dosis simples o multiples, a un individuo puede variar dependiendo de una diversidad de factores, que incluyen la ruta de administraci6n, condiciones y caracteristicas del paciente (sexo, edad, peso corporal, estado general de salud, y volumen), alcance de los sintomas, tratamientos concurrentes, frecuencia de tratamiento y el efecto deseado. El ajuste y la manipulaci6n de intervalos de dosificaci6n establecidos estan plenamente dentro de la capacidad de los expertos en la tecnica.

EJEMPLOS

MATERIAL Y METODOS

Reactivos: mCD70, hCD40L y hBLyS/BAFF se produjeron por transfecci6n en gran escala de celulas de rin6n embrionario humano (HEK) 293T con los constructos de expresi6n relevantes (vease mas adelante). TNF, un obsequio del Dr. G. Adolf, Boehringer Institute, Viena, Austria, se aplic6 a las celulas a una concentraci6n de 100 ng/ml. MG132 y Lactacistina se adquirieron de Calbiochem, y G418 era de Life Technologies, Zeocina era de Invivogen y Blasticidina, Puromicina y Ponasterona eran de Invitrogen. TRAIL recombinante se adquiri6 de Alexis. La HISUbiquitina recombinante K48 sola, HISUbiquitina K63 sola, E1 humana, y el heterodimero Ubc13Uev1 se obtuvieron de Boston Biochem. La ubiquitinaaldehido era de A.G. Scientific.

Anticuerpos: El anticuerpo antip52 se adquiri6 de Upstate Biotechnologies, los anticuerpos contra p65, p52, p50, Re1B, TRAF2, IKK1 (M280 � H744), SIVA, TRAF3, NIK (H248) eran de Santa Cruz Biotechnology, antiHIS, antiFLAG, cuentas antiFLAG M2, y antib actina de Sigma, antiubiquitina y antiGST de Covance, antiGFP de Roche, antiIKBa de Transduction Laboratories. El anticuerpo monoclonal antiNIK, NIK81, se gener6 por inmunizaci6n de ratones con un peptido acoplado a KLH correspondiente a una secuencia dentro del dominio de la quinasa NIK (CRLGRGSFGEVHRMEDK aminoacidos 405420, SEQ ID NO: 34). Los anticuerpos monoclonales antiNIK, antiHA y antimyc (clon9E10) se purificaron a partir de fluidos de ascitis de rat6n en columnas de afinidad a las que se acoplaron sus peptidos correspondientes.

Las lineas linfoblastoides B humanas procedentes de linfoma de Burkitt, Ramos, Raji y BJAB, se cultivaron en medio RPMI. Todas las celulas adherentes HEK 293T, HeLa y MEF se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco. Ambos medios de cultivo se complementaron con 10% de suero de ternero fetal, 100 U/ml de penicilina, y 100 mg/ml de estreptomicina.

Se crearon celulas BJAB que expresaban NIK de manera estable con un marcador TAP Cterminal (Rigaut et al., 1999), por selecci6n con 1 mg/ml de G418 de celulas sometidas a electroporaci6n. Se introdujo SIVA2 en la linea de celulas BJAB NIK estable por transducci6n retroviral seguida por selecci6n con 1 mg/ml de puromicina. Se crearon celulas Ramos que expresaban de manera estable NIK marcado en el terminal N con myc (mycNIK), por nucleofecci6n utilizando un dispositivo nucleofector Amaxa y selecci6n utilizando 1 mg/ml de puromicina. Las celulas Ramos expresaban de manera estable HISSIVA2 y Ramos myc NIK.

Se crearon lineas de celulas 293 inducibles por ecdisona que expresaban SIVA2 siguiendo las instrucciones de los fabricantes (Invitrogen), y posteriormente se introdujeron myc NIK y myc NIKK670A se introdujeron en estas celulas por transducci6n retroviral y selecci6n con 1 mg/ml de puromicina.

Vectores de expresi6n: Los cDNAs para los dominios extracelulares de mCD70, hCD40L, se amplificaron por PCR a partir de ESTs y se clonaron en fusi6n con una cremallera de leucina modificada y el marcador FLAG (Fanslow et al., 1994) en pcDNA3 (Invitrogen). pCS3MTNIK y pCS3MTNIKKK429, 430AA, vectores de expresi6n para NIK de tipo salvaje y NIK 'mutante sin actividad de quinasa' fusionados en el terminal N a un marcador six myc, se obtuvieron del Dr. Michael Kracht, Alemania. pEGFP se adquiri6 de Clontech. NIK humano con una mutaci6n (G860R) correspondiente a la mutaci6n aly del rat6n (G856R) (Shinkura et al., 1999), y todas las restantes mutaciones puntuales descritas se generaron con un kit de mutagenesis orientada (Stratagene). El plasmido de ubiquitina para evaluar la monoubiquitinaci6n (Ub KKKK 11, 29, 48, 63 RRRR) fue proporcionado amablemente por el Prof. Yosef Yarden, Instituto Weizmann de la Ciencia, Israel. La subunidad de proteasomas C8, con un marcador myc Cterminal se gener6 por PCR y se clon6 en el vector pcDNA3 (Invitrogen).

NIKpCS3MTNIK con marcador 6 myc Nterminal, NIK aly, NIK mutante sin actividad de quinasa, y NIK K670A se generaron a partir de pCS3MTNIK por mutagenesis orientada utilizando DNApolimerasa pfu con empleo del protocolo del fabricante (Stratagene).

Un vector para expresi6n de NIK fusionado en el terminal N al marcador myc (EQKLISEEDL, SEQ ID NO: 35) se obtuvo del Dr. Michael Kracht, Alemania.

Cribado de dos hibridos en levadura: el sistema utilizado para el cribado fue la versi6n III de Matchmaker (Clontech). La presa era una biblioteca de medula 6sea humana pretransformada (Cat� HY4053AH) que ofrece una selecci6n de 'dropout' cuadruple (QDO) muy severa junto con un ensayo agal. Clones que crecian en placas SIN LEU, TRP, HIS y ADE se reconfirmaron por un ensayo agal, que es mucho mas especifico que el ensayo usual bgal, que sufre fugas a menudo. Se prepararon como sigue plasmidos de los clones positivos. Se inocularon clones simples en caldo liquido QDO y se dejaron crecer durante una noche a 37°C. Las celulas se redujeron a un sedimento a 10.000 g y se resuspendieron en 200 Il de tamp6n que contenia 2% Triton X100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris de pH 8,0 y 1 mM EDTA. Los lisados se agitaron vorticialmente durante 2 minutos despues de anadir 200 Il de fenol:cloroformo:alcohol isoamilico (25:24:1) y 0,3 g de cuentas de vidrio de 600 micr6metros lavadas a los acidos (Sigma). El sobrenadante se recogi6 por centrifugaci6n a 12.000 g y el DNA se precipit6 por el metodo de precipitaci6n con acetato de sodio/etanol (Sambrook et al., 1989). Inserciones codificadas de los plasmidos se amplificaron por PCR con los cebadores especificos para el vector de biblioteca pACT2. Para analisis bioquimico ulterior de los clones individuales, los amplicones se clonaron directamente en el vector de expresi6n de mamifero marcado terminalmente con HIS, pcDNA 3.1 (Invitrogen).

Expresi6n de proteinas recombinantes: Para expresi6n bacteriana de las proteinas de fusi6n GST, se clonaron IKBa 154, SIVA2 y SIVA2C73A en el vector pGEX y se expresaron en celulas BL21 siguiendo el protocolo del fabricante (GST Gene Fusion Systems, 3� edici6n, Pharmacia Biotech). La inducci6n se realiz6 a DO600 de 0,6 con 1 mM IPTG. Para evitar la formaci6n de proteina insoluble y cuerpos de inclusi6n, el cultivo bacteriano se dej6 crecer a 25°C en lugar de 37°C.

Se expres6 baculoviralmente HISNIK 338947 en celulas de insecto en el laboratorio de los autores como se ha descrito anteriormente.

PCR y RTPCR: Se realizaron PCRs para mutagenesis orientada y amplificaci6n de diversos cDNAs utilizando DNApolimerasa Pfu Turbo siguiendo las instrucciones del fabricante (Stratagene). Todas las RTPCRs se llevaron a cabo utilizando Superscript II siguiendo el protocolo de los fabricantes (Invitrogen).

Transfecciones de plasmido, inmunotransferencia, e inmunoprecipitaciones:

Se llevaron a cabo transfecciones de plasmido por uno de los metodos siguientes:

a.

Metodo de precipitaci6n con fosfato de calcio (Sambrook et al., 1989).

b.

Nucleofecci6n Amaxa (Amaxa Biosystems).

c.

Gene Porter (Gene Therapy Systems)

d.

Lipofectamina 2000 (Invitrogen)

e.

La electroporaci6n regular se llev6 a cabo como sigue

Las celulas (10 x 106/electroporaci6n) se lavaron una sola vez y se resuspendieron en 400 Il de medio exento de suero con 25 Ig del plasmido. Las celulas mezcladas con DNA se transfirieron a una cubeta de 0,4 cm de abertura y se incubaron en hielo durante 10 min. La electroporaci6n se realiz6 a 0,24 KV, 960 IF, y la constante de tiempo se optimiz6 a 40, en un instrumento BIORAD Genepulser. Despues de la pulsaci6n, las celulas se mantuvieron en hielo durante 5 min y se transfirieron mas tarde a medio de crecimiento.

La inmunotransferencia y las inmunoprecipitaciones se llevaron a cabo como se ha descrito (Ramakrishnan et al., 2004). Tipicamente, se sembraron 1,5 x 106 celulas HEK 293T en placas de 10 cm. Despues de un periodo de 24 horas de incubaci6n, los cultivos se transfectaron con los plasmidos respectivos mientras se mantenia una concentraci6n total de DNA de 15 Ig por placa con adici6n de vector vacio.

Tipicamente, se sembraron celulas HEK 293T en placas de 90 mm (1.5 x 106 celulas/placa) y se transfectaron utilizando el metodo de precipitaci6n con fosfato de calcio (Sambrook et al., 1989) un dia mas tarde utilizando una cantidad total de 10 Ig de DNA en 10 ml de medio DMEM con 10% de FBS. Para cotransfecci6n se utiliz6 una mixtura

1:1 de los plasmidos que codificaban las proteinas testadas. Veinticuatro horas despues de la transfecci6n, se lavaron las celulas una sola vez con soluci6n salina tamponada con fosfato (PBS) y se lisaron en 1 ml de tamp6n de lisis (10 mM TrisHCl (pH 7,6), 250 mM NaCl, 1% NP40, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF) que incluia c6ctel completo de inhibidores de proteasas 1' (Roche Molecular Biochemicals). Los lisados preaclarados se incubaron durante 2 horas a 4°C con 2 Ig de anticuerpo antimyc o antiHIS preabsorbido en cuentas de proteina GSepharose (Amersham Biosciences). Las cuentas se lavaron luego con tamp6n de lisis, se sometieron a SDSPAGE, y las proteinas se transfirieron a una membrana de microcelulosa y se sondaron con los anticuerpos indicados. Los anticuerpos se visualizaron con anticuerpos secundarios acoplados a peroxidasa de rabano picante (HRP), utilizando el sistema de detecci6n por transferencia Western de quimioluminiscencia intensificada (ECL) (Amersham) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Para preparar el lisado de celulas, tipicamente, se cosecharon las celulas 24 horas despues de la transfecci6n, se lisaron luego en tamp6n de lisis con 1% Triton X100 [(1% Triton X100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM TriscI (pH 7,6) y 1X inhibidor completo de proteasas (Roche)]. Todas las inmunoprecipitaciones se llevaron a cabo por incubaci6n durante 4 horas a 4°C con los anticuerpos especificos y cuentas de proteina GSepharose (Amersham Pharmacia).

La condici6n de lisis difiere donde se separan el extracto nuclear y el citoplasmico (Schreiber et al., 1989).

Ensayo de quinasas in vitro: Los ensayos de quinasas de las proteinas transfectadas y end6genas se llevaron a cabo como se ha descrito (Ramakrishnan et al., 2004).

Ensayo de luciferasa: Se sembraron celulas en placas de 6 pocillos (HEK 293T 200.000, HeLa 100.000 MEF

100.000 celulas/pocillo). Se transfectaron celulas HEK 293T y HeLa por el metodo de precipitaci6n con fosfato de calcio, y las MEFs se transfectaron con un reactivo basado en liposomas (Gene therapy systems). Se utiliz6 cDNA de luciferasa bajo regulaci6n del promotor NFKB HIVLTR (repetici6n terminal larga del virus de la inmunodeficiencia humana) como el plasmido informador. Despues de 24 horas, las celulas se lisaron en 120 Il de tamp6n de lisis como se ha descrito (Fred M. Ausubel, 1996), y se utilizaron 1020 Il del lisado para el ensayo de luciferasa.

siRNA y transducci6n lentiviral: Se realizaron la expresi6n estable y transitoria de siRNA y las transducciones lentivirales como se ha descrito (Ramakrishnan et al., 2004).

Secuencia de nucle6tidos y aminoacidos de SIVA1 y SIVA2 y fragmentos:

Secuencia de nucle6tidos de SIVA1 (Acc� NM�006427) (SEQ ID NO: 10)

Secuencia de nucle6tidos de SIVA2 (Acc� NM�021709) (SEQ ID NO: 11)

Secuencia de aminoacidos de SIVA1: (SEQ ID NO: 1) Secuencia de aminoacidos de SIVA2: (SEQ ID NO: 2)

Secuencia de aminoacidos de SIVAc (SEQ ID NO: 3)

Secuencia de nucle6tidos de SIVAc (SEQ ID NO: 7)

Secuencia de aminoacidos de SIVA2 158 (SEQ ID NO: 4)

10 Secuencia de nucle6tidos de SIVA2 158 (SEQ ID NO: 8)

Secuencia de aminoacidos de SIVA2 181 (SEQ ID NO: 5)

15 Secuencia de nucle6tidos (SEQ ID NO: 9)

Secuencias de nucle6tidos para mutagenesis orientada y para supresi6n de la sintesis de proteinas por RNA de interferencia: Se gener6 NIK humano con una mutaci6n correspondiente a la de la mutaci6n aly del rat6n (G860R) con 5'ccaagctatttcaatcgtgtgaaagtccaaatac3' de sentido (SEQ ID NO: 12)

20 y 5'gtatttggactttcacacgattgaaatagcttgg3' antisentido (SEQ ID NO: 13) NIK, con su secuencia alterada para hacerlo no complementario con el siRNA NIK que se utiliz6, tenia generalmente

sentido 5'gagggtctggaatacctacattcccgcaggattctgcatggg3' (SEQ ID NO: 14) y 25 5'cccatgcagaatcctgcgggaatgtaggtattccagaccctc3' antisentido (SEQ ID NO: 15) como cebadores. Los motivos de fijaci6n de TRAF2 en el termino N y C de NIK se mutaron por los olig6meros siguientes:

NIK334 cadena de sentido 5'catgagaagttttctgtggcggcatacctagtgcatgctctg3' (SEQ ID NO: 16) cadena antisentido 5'cagagcatgcactaggtatgccgccacagaaaacttctcatg3' (SEQ ID NO: 17) NIK704

5 cadena de sentido 5'gggccccggccagctgcggcgacaacaggcagagcc3' (SEQ ID NO: 18), cadena antisentido 5'ggctctgcctgttgtcgccgcagctggccggggccc3' (SEQ ID NO: 19). Las secuencias de siRNA siguientes se introdujeron en el vector pSUPER (con la secuencia ttcaagaga como espaciador):

Para SIVANC3 humano, cadena de sentido 5'gatcccctgaataaacctctttatatttcaagagaatataaagaggtttattcatttttggaaa3' (SEQ ID NO: 20)

10 cadena antisentido 5'agcttttccaaaaatgaataaacctctttatattctcttgaaatataaagaggtttattcaggg3' (SEQ ID NO: 21) SIVA131 cadena de sentido 5'gatccccgcagtgacatgtacgagaattcaagagattctcgtacatgtcactgctttttggaaa3' (SEQ ID NO: 22) cadena antisentido 5'agcttttccaaaaagcagtgacatgtacgagaatctcttgaattctcgtacatgtcactgcggg3' (SEQ ID NO: 23)

15 SIVA275 cadena de sentido

cadena antisentido

SIVA278 cadena de sentido

cadena antisentido

SIVA518 cadena de sentido

25 cadena antisentido

SIVA521 cadena de sentido

cadena antisentido 5

(SEQ ID NO: 31) GFP cadena de sentido

cadena antisentido

RNAi knock-out. Se expres6 siRNA en horquilla utilizando el vector pSUPER, como se ha descrito previamente (Brummelkamp et al., 2002). Resumidamente, se disen6 un oligonucle6tido bicatenario que contenia las secuencias directa e inversa correspondientes a una regi6n en la cadena antisentido del marco de lectura abierta de SIVA humano. Los dos oligonucle6tidos se reasociaron y se clonaron en el vector pSUPER para expresi6n bajo el control del promotor de RNA H1 (Brummelkamp et al., 2002). Se realiz6 una transfecci6n transitoria con hasta un exceso de 5 veces de este pSUPERSIVA, como se describe anteriormente.

Se utiliz6 un vector lentiviral (como ha sido descrito previamente por Lois et al., 2002) a fin de expresar el pSUPERSIVA constitutivamente en celulas Ramos. Tipicamente, la casete que incluia el promotor H1 (Brummelkamp et al., 2002) y SIVA RNAi se escindi6 del vector pSUPER utilizando EcoRI y HindIII (ambas de New England Biolabs), se hicieron romos los extremos cohesivos utilizando DNApolimerasa T4 (New England Biolabs), y el fragmento romo se insert6 en el sitio romo PacI del vector lentiviral FUGW que expresaba GFP (Lois et al., 2002). Las celulas transducidas se clasificaron por FACS para expresi6n de GFP (FACS Vantage, BectonDickinson). Las celulas clasificadas exhibian expresi6n de GFP y deficiencia de SIVA durante meses.

Autoubiquitinaci6n in vitro: Tipicamente, se realizaron ensayos de ubiquitinaci6n in vitro en un volumen de reacci6n de 50 Il que contenia recombinante utilizando una HISUbiquitina recombinante en la que todas las lisinas en la ubiquitina excepto K63 estan mutadas a arginina (Boston Biochem) (8 Ig), E1 (0,2 Ig), E2 (0,5 Ig) y 12 Ig de GSTSIVA recombinante o GSTSIVAC73A en un tamp6n que contenia 30 mM HEPES de pH 7,6, 5 mM MgCl2, 2 mM ATP, 0,2 mM DTT, 5 mM citrato de sodio, 10 mM fosfato de creatina, 0,2 Ig/ml creatinaquinasa y 5 IM ubiquitinaaldehido. Las reacciones se incubaron a 30°C durante una hora. Las reacciones se terminaron por adici6n de tamp6n de muestra Laemmli o se diluyeron a 1 ml con tamp6n que contenia 20 mM HEPES de pH 7,6, 150 mM NaCl, 1% Triton X100, 1 mM EDTA y c6ctel completo de inhibidores de proteasas. Se inmunoprecipit6 SIVA utilizando anticuerpo antiGST adsorbido a cuentas de proteina G durante 4 horas a 4°C. Los inmunoprecipitados se sometieron a transferencia Western con los anticuerpos indicados.

Preparaci6n de in6culo viral. Se transfectaron celulas Phoenixampho (1,5 x 106 celulas sembradas en placas de 9 cm) (obsequio del Prof. Gary Nolan, Universidad de Stanford) por el metodo del fosfato de calcio con vector SIVA2 pBABE puro (20 Ig/placa) y el medio acondicionado que contenia el virus se recogi6 48 horas despues de la transfecci6n. Se anadieron 5 Il de medio que contenia virus a 45 Il de medio RPMI que contenia las celulas BJAB (20 x 106 celulas) y dos dias mas tarde se sometieron las celulas a selecci6n en medio que contenia puromicina (Sigma p7255) (500 ng/ml) durante 4 dias. Despues de 4 dias, se increment6 la concentraci6n de puromicina (1 Ig/ml) y se dej6 que las celulas se expandieran en condiciones de cultivo.

Celulas Ramos que expresan constitutivamente SIVAc. Se aislaron y se dejaron crecer varios clones de celulas Blinfoblastoides Ramos simples que expresaban SIVAc (transfectado constitutivamente con pSIVAc). El vector de expresi6n empleado para obtener los clones de celulas que expresaban SIVAc produce SIVAc marcado con HIS (el marcador HIS se fusiona al termino C de SIVAc). Se prepararon como sigue clones de celulas Blinfoblastoides Ramos que expresaban SIVAc. Las celulas Blinfoblastoides se transfectaron por nucleofecci6n (Amaxa Biosystems) con pSIVAc o el vector de control pC HIS. Cuarenta y ocho horas despues de la transfecci6n, se seleccionaron las celulas en medio complementado con 1000 ng/ml de neomicina (G418, Gibco BRL 1181103) durante 30 dias. Despues de la selecci6n, se analizaron los clones de celulas simples por transferencia Western utilizando antiHIS para monitorizar la expresi6n de SIVAc. un clon positivo seleccionado se dej6 crecer y se utiliz6 para los experimentos.

Ejemplo 1. NIK se fija a SIVA, una proteina adaptadora asociada con CD27.

Por cribado de una biblioteca de dos hibridos de medula 6sea humana utilizando NIK como cebo, se encontr6 que el NIK se fija a un fragmento Cterminal de SIVA (vease Fig. 1A). Como en el caso de la fijaci6n de NIK a TRAF2 (Malinin et al., 1997), se encontr6 que el fragmento de SIVA se fija a la parte Cterminal de NIK, y esta fijaci6n era mas

fuerte que la observada con la proteina NIK de longitud total (Fig. 1A), debido muy probablemente a la propensi6n de la parte Nterminal de NIK a fijarse a su termino C y bloquear asi su fijaci6n a otras proteinas (Xiao y Sun, 2000).

Para testar si NIK puede fijar SIVA en celulas de mamifero, se expres6 NIK con SIVA1 o SIVA2, las dos variantes de corte y empalme de SIVA conocidas (Yoon et al., 1999), en celulas HEK293T transfectadas transitoriamente. Como se muestra en Figs. 1B y 1C, NIK coinmunoprecipitaba bidireccionalmente con ambas variantes de corte y empalme de SIVA procedentes de lisados de las celulas transfectadas.

Es interesante que los niveles celulares de SIVA1 y SIVA2 en las celulas transfectadas se incrementaban por la coexpresi6n de NIK, reflejando aparentemente la estabilizaci6n de SIVA por sus moleculas NIK asociadas. A la dosis particular de cDNA de SIVA aplicada en esta serie de experimentos, la expresi6n de NIK se incrementaba tambien por la coexpresi6n de cualquiera de las dos variantes de corte y empalme de de SIVA. Dicho aumento no se observaba despues de coexpresi6n de GFP o IKK1 con NIK (Figs. 1B, C y D). Es notable que, despues de coexpresi6n con NIK aly, las dos isoformas de SIVA exhibian diferencia en efectos. Mientras que tanto SIVA1 como NIK aly se estabilizaban e interaccionaban despues de su coexpresi6n, SIVA2 no estabilizaba la NIK aly coexpresada ni SIVA2 era estabilizada por NIK aly. Debido a esta falta de estabilizaci6n, la fijaci6n de NIK aly a SIVA2 no pudo evaluarse (Figs. 1B y C).

Para recapitular la interacci6n de NIK y SIVA in vitro, se expres6 SIVA2 marcado con GST en bacterias y un mutante de deleci6n Nterminal de NIK (NIK 338947) se expres6 en baculovirus. La coincubaci6n de las dos proteinas, seguida por inmunoprecipitaci6n de NIK degradaba especificamente SIVA2, reconfirmando asi que su interacci6n in vivo es directa (Fig. 1E).

Adicionalmente, se encontr6 tambien que SIVA2 end6geno interacciona con un NIK expresado de manera estable en celulas Ramos despues de tratamiento con el ligando CD70 (Fig. 1F).Analogamente, en celulas BJAB que expresaban NIK de manera estable y transducidas retroviralmente con SIVA2, estas dos proteinas interaccionaban despues de tratamiento de larga duraci6n con el ligando CD40, pero no con TRAIL, otro ligando de la familia TNF (Figs. 1GH). En contraste, no se observ6 interacci6n alguna de SIVA1 y NIK en una linea de celulas estable que expresaba las dos proteinas (no representado).

Un informe previo que abordaba la interacci6n de SIVA con los receptores CD27 y GITR sugeria que SIVA se fija a los dominios de fijaci6n de TRAF2 en los dos receptores (Spinicelli et al., 2002). Dado que NIK es tambien una proteina de fijaci6n de TRAF, podria sospecharse que SIVA y TRAF2 se fijan competitivamente a NIK. Sin embargo, dos versiones mutantes de NIK con los dominios de fijaci6n de TRAF2 alterados en los terminos N y C de NIK fijaban SIVA tan eficazmente como NIK de tipo salvaje (Fig. 1). Parece ser tambien que SIVA es capaz de afectar a la funci6n de NIK. Cuando se expresaban solos, SIVA1 y SIVA2 causaban s6lo una ligera activaci6n de NFKB. Sin embargo, ambas variantes de corte y empalme de SIVA mejoraban significativamente la activaci6n de NFKB por NIK coexpresado, si bien no tenian efecto alguno sobre la activaci6n de NFKB por el mutante NIK aly (Fig. 1J).

Ejemplo 2: Un dominio en SIVA que contiene motivos semejantes a dedo de anillo y semejantes a dedo de cinc es crucial para la fijaci6n de NIK, y contribuye a la modificaci6n de la funci6n de NIK inducida por SIVA.

SIVA contiene una regi6n rica en cisteina hom6loga a dedos de anillo/de cinc en su termino C (Fig. 2A). Hasta ahora, no se ha atribuido funci6n alguna a este dominio 'de anillo semejante a caja B'. El analisis por deleci6n para definir el dominio de fijaci6n de NIK en el anillo semejante a caja B de SIVA2 sugiri6 que el dominio terminal semejante a dedo de cinc es la regi6n principal de fijaci6n de NIK (Fig. 2B). De hecho, la fijaci6n directa de NIK a un SIVA truncado (SIVAC), que carece de la porci6n Nterminal de SIVA (desde el residuo 1 al 57, Fig. 2A) se detect6 en celulas transfectadas transitoriamente (Fig. 2F). En linea con esto, un ensayo de gen informador mostr6 que una vez que se ha delecionado el dominio con dedo de cinc, SIVA2 pierde su capacidad para potenciar la activaci6n de NFKB inducida por NIK (Fig. 2C). Para testar la posibilidad de que la expresi6n de este dominio de fijaci6n truncado pueda comportarse como un inhibidor competitivo, fijandose a y bloqueando la funci6n de NIK, se expres6 el termino SIVAC en celulas junto con NIK. Es interesante que, como el SIVA2 de longitud total, asimismo el termino SIVAC a baja concentraci6n exhibia un efecto intensificador sobre la activaci6n de NFKB inducida por NIK (Fig. 2D). Este efecto inhibidor se observaba tambien en una condici6n mas significativa fisiol6gicamente, dado que el SIVAC sobreexpresado ponia tambien en compromiso la activaci6n de NFKB inducida por CD27, debido probablemente a fijaci6n y bloqueo de la funci6n de NIK (Ramakrishnan et al., 2004) (Fig. 2E). Coherentemente con esto, los clones estables de la linea de celulas Ramos que expresaban constitutivamente un nivel bajo de SIVAC exhibian un nivel basal elevado de p52 (Fig. 2F); muy probablemente, por activaci6n de la funci6n de NIK que causaba un procesamiento mejorado de p100.

Ejemplo 3: SIVA promueve la poliubiquitinaci6n de NIK.

NIK sufre ubiquitinaci6n despues de coexpresi6n con ubiquitina (Fig. 3A). La exposici6n de celulas que expresan NIK a inhibidores de proteasomas da como resultado la acumulaci6n de NIK poliubiquitinado (Fig. 3B). Empleando diversos mutantes de ubiquitina se encontr6 que NIK podria conjugarse tanto a las cadenas de poliubiquitina K48 como a las K63 (Fig. 3C). Sorprendentemente, NIK exhibia tambien monoubiquitinaci6n despues de coexpresi6n con un mutante de ubiquitina cuyas lisinas estaban reemplazadas con argininas (K11, 29, 48, 63R) (Fig. 3D). En

consistencia con la monoubiquitinaci6n, el escaneo manual de la secuencia NIK mostraba la presencia de un Motivo de Interacci6n con Ubiquitina [UIM, una secuencia potencial de fijaci6n de ubiquitina (Hofmann y Farquet, 2001)]. Se encontr6 que la adici6n de SIVA2 aumentaba ambos tipos de ubiquitinaci6n K48 y K63 de NIK (FIGs. 3E, 3A y 3B), en tanto que no tenia efecto alguno sobre la monoubiquitinaci6n de NIK (Fig. 3D). La mera coexpresi6n de NIK y SIVA en celulas HEK 293T causaba la aparici6n de NIK poliubiquitinado con ubiquitina end6gena (Fig. 3F). Es interesante, que las formas de peso molecular alto de NIK correspondientes a NIK conjugado con cadenas end6genas de poliubiquitina se encontraban tambien en las lineas de celulas Ramos. (Fig. 3G) y HEK 293T (Fig. 3H) que expresaban marcado NIK despues de activaci6n con CD27. Este descubrimiento, junto con el reclutamiento de SIVA2 en NIK esta en linea con la posible implicaci6n de SIVA en la funci6n de CD27 (Prasad et al., 1997). SIVA1 inducia tambien ubiquitinaci6n de NIK, pero en menor proporci6n comparado con SIVA2 (Fig. 3F). Dado que el motivo con dedo de anillo es importante para la actividad catalitica de las enzimas de ubiquitinaci6n, uno de los residuos cisteina conservados en el dominio semejante a dedo de anillo de SIVA2 se mut6 (SIVA2C73A) para estudiar su consecuencia sobre la ubiquitinaci6n de NIK. Se encontr6 que el SIVA2 mutante con dedo de anillo exhibia una capacidad notablemente reducida de ubiquitinaci6n de NIK, confirmando ulteriormente la especificidad de la reacci6n (Fig. 3F).

Ejemplo 4: SIVA2 regula negativamente la activaci6n de NFKB � una actividad que refleja muy probablemente su capacidad para imponer la degradaci6n de NIK.

SIVA es una molecula proapopt6tica e induce la muerte celular en un camino mitocondrial dependiente de caspasas. Consistentemente con su papel fundamental en la apoptosis, SIVA se regula en sentido creciente en respuesta a UV y al estres oxidante en diferentes tipos de celulas, y es una diana transcripcional directa de los supresores de tumores p53 y E2F1 (Fortin et al., 2004). En el proceso de la apoptosis, se sabe que la caspasa 8 escinde proteinas como NIK para reprimir el camino NFKB, un camino que juega un papel central en la supervivencia y proliferaci6n celulares (Foehr et al., 2000). Mientras se evaluaba el efecto de la expresi6n de SIVA2 sobre la activaci6n de NFKB inducida por NIK se encontr6 que, en tanto que tenia efecto estimulador a dosis bajas, SIVA2 a dosis altas suprimia por completo la activaci6n de NFKB inducida por NIK (Fig. 4A). Esto estaba en buena correlaci6n con el nivel de expresi6n de NIK en las celulas, que tenia un nivel notablemente reducido de NIK en presencia de concentraciones altas de SIVA2 (Fig. 4B, las 3 primeras pistas). Dado que SIVA2 aumenta la ubiquitinaci6n K48 de NIK en expresi6n transitoria, se sugiri6 la hip6tesis de que SIVA2 induce la ubiquitinaci6n K48 de NIK, conduciendo a su degradaci6n proteas6mica. Consistentemente, la inhibici6n proteas6mica con MG132 o Lactacistina protegia eficientemente NIK contra la degradaci6n inducida por SIVA (Fig. 4B). Excluyendo la posibilidad de otros medios de degradaci6n, la expresi6n del inhibidor baculoviral p55 de las pancaspasas o el tratamiento con un inhibidor lisos6mico no protegia NIK contra la degradaci6n inducida por SIVA2 (no representado). SIVA2 sobreexpresado degradaba tambien el NIK expresado establemente en las celulas HEK 293T (Fig. 4C). En contraste, SIVA1 no exhibia capacidad para imponer degradaci6n de NIK (no representado). A continuaci6n, se testaron los dos mutantes de deleci6n de SIVA2, uno sin el dedo de cinc y el otro sin ambos dedos de anillo y de cinc, en cuanto a su capacidad para degradar NIK. Es interesante que, al igual que la proteina de longitud total, ambos mutantes de deleci6n se encontraron capaces de inducir degradaci6n de NIK (Fig. 4D). Dado que SIVA 158, desprovisto del dedo de anillo y el dedo de cinc, imponia tambien la degradaci6n de NIK, era tentador testar si este fragmento podria inducir tambien la ubiquitinaci6n K48 de NIK. De hecho, consistentemente con su capacidad para imponer la degradaci6n de NIK, el termino N de SIVA2, aunque incapaz de fijar NIK, inducia ubiquitinaci6n especifica K48 de NIK (Fig. 4E). Este descubrimiento sugiri6 que SIVA no es un E3 directo de NIK que induzca ubiquitinaci6n K48, sino parte de un complejo de ubiquitinaci6n que requiere otros factores accesorios. Analogamente, se inform6 tambien que TRAF3 es una enzima de ubiquitinaci6n indirecta de NIK, causando su degradaci6n (Liao et al., 2004).

Ejemplo 5: Un residuo lisina en la posici6n 670 de NIK es un sitio de ubiquitinaci6n K48 implicado en su degradaci6n por SIVA2.

Por analisis de deleci6n seriada se defini6 una regi6n corta de NIK, los aminoacidos 640720, como una regi6n potencialmente capaz de ubiquitinaci6n (Fig. 5A). Esta regi6n alberga 3 residuos lisina conservados y la mutaci6n de una de estas lisinas en alanina, K670A, reducia especificamente la ubiquitinaci6n K48 de NIK (Fig. 5B, panel derecho) en comparaci6n con la NIK de tipo salvaje (Fig. 5B, panel izquierdo). Dado que la ubiquitinaci6n K48 es un marcador de degradaci6n proteos6mica y dado que en esta invenci6n se encontr6 que SIVA2 inducia ubiquitinaci6n y degradaci6n proteas6mica de NIK, se evalu6 la degradaci6n de NIK K670A por SIVA2. De hecho, se encontr6 que la sustituci6n de lisina en el residuo 670 de NIK protegia notablemente NIK contra la degradaci6n inducida por SIVA (Fig. 5C). Sin embargo, a mayores concentraciones de SIVA2 y durante un periodo de cultivo prolongado, el nivel de NIK K670A comenzaba a descender en las celulas. Esto demuestra que lisina 670 es un residuo crucial, pero no el unico residuo implicado en la ubiquitinaci6n K48 de NIK por SIVA2, conduciendo a su degradaci6n. La lisina 670 sirve probablemente como residuo inicial que sufre la ubiquitinaci6n K48 por SIVA2, sensibilizando NIK para la degradaci6n. Previamente, se inform6 que la sobreexpresi6n de TRAF3 causaba la degradaci6n de NIK (Liao et al., 2004). Mientras se comparaba la capacidad de SIVA2 y TRAF3 para imponer la degradaci6n de NIK K670A, se encontr6 que la mutaci6n de la lisina 670 podria proteger NIK unicamente contra la degradaci6n inducida por SIVA2 y no contra la inducida por TRAF3 (Fig. 5D). Asi pues, NIK se degrada tanto en respuesta a SIVA2 como a TRAF3, pero los mecanismos moleculares implicados en los dos procesos difieren.

A continuaci6n, dado que se observ6 que la mutaci6n del dedo de anillo de SIVA (SIVA2C73A) reduce notablemente su capacidad para ubiquitinar NIK, se test6 la consecuencia de la expresi6n de este SIVA2 mutado sobre la degra

daci6n de NIK. Analogamente al tipo salvaje, el mutante SIVA con dedo de anillo2 degradaba tambien NIK y NIK aly. Inesperadamente, al contrario que el tipo salvaje, SIVA2C73A degradaba eficazmente el NIK K670A coexpresado (Fig. 5E).

Por expresi6n transitoria con diferentes mutantes de ubiquitina, se encontr6 que la regi6n del dedo de anillo, SIVAC sufre por si misma ubiquitinaci6n K63 y coprecipita con NIK (Fig. 5F). Sin embargo, al contrario que el SIVA de longitud total, se encontr6 que SIVAC era incapaz de imponer la ubiquitinaci6n K63 de NIK (Fig. 5E).

Ejemplo 6: SIVA2 es una ligasa E3 que causa ubiquitinaci6n K63, y su dedo de anillo media esta funci6n.

Las E3s son proteinaligasas de ubiquitina que determinan la selectividad y eficiencia de las reacciones de ubiquitinaci6n. Practicamente la totalidad de las E3s conocidas utilizan un dedo de anillo o dominio HECT para participar en la reacci6n de ubiquitinaci6n (Hofmann y Pickart, 2001). Para demostrar que el dedo de anillo de SIVA2 esta involucrado de hecho en la ubiquitinaci6n K63 de NIK, el mutante de ubiquitina K48R, que permite poliubiquitinaci6n unicamente a traves de las cadenas K63 enlazadas, se expres6 en celulas con NIK. Como era de esperar, la adici6n de SIVA2 potenciaba en gran medida la poliubiquitinaci6n K63 de NIK y la mutaci6n con dedo de anillo en SIVA2 bloqueaba esta capacidad, demostrando la ubiquitinaci6n K63 como una funci6n del dedo de anillo. Anteriormente, en los cribados de dos hibridos de los autores de esta invenci6n, una de las presas pescadas con el termino C de NIK era la enzima de conjugaci6n de ubiquitina, Ubc13. Esta E2 junto con un cofactor, Uev1, media especificamente la ubiquitinaci6n K63 de las proteinas (Hofmann y Pickart, 2001). Para testar la implicaci6n de Ubc13 en la ubiquitinaci6n K63 de NIK inducida por SIVA2 y reconfirmar su especificidad, se sobreexpres6 una Ubc13 cataliticamente inactiva (C87A) para bloquear este proceso (Deng et al., 2000). Consistentemente, Ubc13 C87A bloqueaba la ubiquitinaci6n K63 de NIK inducida por SIVA2 (Fig. 6A).

CYLD es una enzima de desubiquitinaci6n que direcciona las cadenas de ubiquitina enlazadas en K63 (Kovalenko et al., 2003). La coexpresi6n de CYLD desconjugaba facilmente las cadenas de ubiquitina inducidas por SIVA2 en NIK, proporcionando una prueba adicional de la ubiquitinaci6n K63 especifica de NIK (Fig. 6B).

Adicionalmente a la ubiquitinaci6n in vivo observada, se test6 la ubiquitinaci6n K63 de NIK in vitro. Lamentablemente, ha sido imposible obtener NIK recombinante a partir de bacterias o de celulas de insecto debido a la insolubilidad e inactividad de la proteina preparada en estos sistemas. Por ello, los autores decidieron utilizar NIK sobreexpresado y purificado a partir de celulas de mamifero o a partir de transcripci6n y traducci6n in vitro de un sistema de lisado de reticulocitos de conejo. El NIK preparado por ambos medios mostr6 saturaci6n de ubiquitinaci6n K63 cuando se incub6 con E1 y E2 sin adici6n de E3, obstruyendo el analisis de la capacidad de SIVA2 para servir como E3 respecto a su ubiquitinaci6n in vitro. Este descubrimiento indica que NIK expresado en sistemas de mamifero fija con avidez y abate la o las ligasas E3, efectuando su ubiquitinaci6n in vitro. O bien, alternativamente, que NIK posee en si mismo actividad de ligasa E3. A continuaci6n, se utiliz6 un sistema de baculovirus para expresar un NIK truncado, que carecia de los 337 aminoacidos Nterminales, en celulas de insecto. Este NIK truncado (338947) era mas soluble que el NIK de longitud total, y se aplic6 al experimento de ubiquitinaci6n in vitro. NIK 338947 no exhibia ubiquitinaci6n con o sin SIVA2. Esto puede ser debido a la incapacidad de este NIK truncado para participar en el proceso. Alternativamente, ello puede sugerir que el termino N de NIK es la regi6n que sufre la ubiquitinaci6n K63.

Un descubrimiento mas que resulta consistente con la idea de que SIVA2 actua para estabilizar NIK se logr6 en un experimento en el que TRAF2, NIK y SIVA2 se coexpresaron en celulas HeLa. TRAF2 inducia degradaci6n de NIK. Como se ha indicado anteriormente, SIVA2 a dosis bajas aumenta las cantidades y la funci6n de NIK. Adicionalmente, como se muestra en Fig. 6C, SIVA2 en dosis baja estabilizaba/protegia NIK contra la degradaci6n inducida por TRAF2.

Es interesante que se encontr6 que SIVA2 recombinante propiamente dicho expresado en bacterias experimentaba en si mismo autoubiquitinaci6n K63 en una reacci6n de ubiquitinaci6n in vitro con E1 y E2 anadidos (Ubc13/Uevl) estabilizandolo como una ligasa E3 potente, capaz tambien de inducir autoubiquitinaci6n (Fig. 6D).

Ejemplo 7: Exploraci6n del significado fisiol6gico de los descubrimientos de que la expresi6n inducible de SIVA2 en celulas interfiere con la funci6n de NIK.

Inicialmente, se intent6 estudiar la funci6n de SIVA suprimiendo su expresi6n por el enfoque del RNA interferente pequeno (siRNA). Se disenaron varios siRNAs y se clonaron en el vector pSUPER (Brummelkamp et al., 2002) y se testaron en celulas HEK 293T respecto a su capacidad para reducir el mensaje de SIVA. Por RTPCR, se seleccionaron dos supresores 6ptimos (pSUPERNC3 y pSUPER275 (Fig. 7A) para experimentos ulteriores. La expresi6n transitoria del pSUPERNC3 en el contexto de la activaci6n del gen informador NFKB inducida por CD27 en las celulas HEK 293T exhibia un aumento al doble en la actividad de luciferasa (Fig. 7B). Teniendo en cuenta el descubrimiento de que SIVA puede inducir la regulaci6n decreciente de NIK, este descubrimiento puede implicar que la disminuci6n de los niveles de SIVA promueve la senalizaci6n inducida por CD27 por elevaci6n de los niveles de NIK. A continuaci6n, se intent6 crear lineas de celulas deficientes en SIVA. Para este prop6sito, se prepar6 un lentivirus que expresaba siRNA especifico de SIVA como se ha descrito (Lois et al., 2002) y se transdujeron diferentes lineas de celulas. Por este metodo no se obtuvo en absoluto una supresi6n completa de SIVA en celulas Ramos, RAJI o BJAB. Testando la senalizaci6n de CD27 en celulas Ramos en la que se alcanz6 una reducci6n aproximada de 75%

en el nivel de SIVA (Fig. 7C), se encontraron unicamente diferencias menores en la translocaci6n de p52 y p65 al nucleo comparada con las celulas de control (Fig. 7D). Pudieron observarse niveles ligeramente elevados de p52 y p65 en el nucleo de las celulas en las que se habia suprimido SIVA despues de la estimulaci6n con CD70, indicando un nivel y funci6n de NIK incrementados. Sin embargo, estas diferencias sutiles no eran suficientes para deducir conclusiones fiables.

SIVA es una proteina inducida por estres (Fortin et al., 2004; Henke et al., 2000; Padanilam et al., 1998). Por esta raz6n, podria ser mas razonable y factible evaluar el papel fisiol6gico de SIVA estudiando el efecto de niveles elevados de SIVA en lugar de hacerlo siguiendo el efecto de su supresi6n. En esta direcci6n, inicialmente, se test6 la consecuencia de una expresi6n estable de SIVA2 en las celulas. En intentos repetidos, SIVA2 se expresaba constitutivamente en las celulas s6lo durante periodos cortos, despues de lo cual se perdia la expresi6n. Por testado de 3 clones diferentes de celulas Ramos que expresaban constitutivamente SIVA2 poco despues de su establecimiento, se encontr6 que estas celulas expresan un nivel basal reducido de IKBa y exhibian procesamiento reducido de p100 y translocaci6n reducida de p52 y p65 al nucleo despues de estimulaci6n con CD70 (Fig. 7E). Para consolidaci6n ulterior del efecto de la regulaci6n creciente de SIVA2 sobre la activaci6n de NFKB, se decidi6 desarrollar un sistema de expresi6n inducible para SIVA2. A este fin, se transfectaron celulas 293T Ecr inducibles por ecdisona (Invitrogen) con FLAGSIVA2 inducible y con el receptor CD27, y los clones que expresaban ambas proteinas introducidas se identificaron por selecci6n respecto a resistencia a los farmacos. La expresi6n de SIVA2 pudo detectarse despues de inducci6n de estas celulas unicamente cuando las mismas se expusieron a lactacistina, un inhibidor de proteasomas, indicando que SIVA2 es una proteina de vida corta con tasa de renovaci6n alta, que sufre degradaci6n poco despues de su sintesis. En esta condici6n, SIVA2 se acumulaba en las celulas tan pronto como 3 horas despues de la aplicaci6n del inductor. Analogamente, se observaban tambien ubiquitinaci6n y potenciaci6n extensas de la expresi6n de SIVA2 por los inhibidores proteas6micos en los tests de expresi6n transitoria (Fig. 7F). Recapitulando los experimentos realizados con SIVA2 que expresaban constitutivamente lineas de celulas, se encontr6 consistentemente que la inducci6n de la expresi6n de SIVA2 daba como resultado una reducci6n de p52 nuclear y tambien de la inducci6n de RelB por CD70, indicando la rotura de la funci6n de NIK. Sin embargo, al contrario que los clones de celulas Ramos que expresaban constitutivamente SIVA2, el SIVA2 expresado induciblemente no afectaba de modo significativo a la translocaci6n nuclear p65 inducida por CD70 en las celulas 293 (Fig. 7G).

A continuaci6n, se explor6 el efecto de la silenciaci6n de SIVA sobre la translocaci6n nuclear de p52 y p65 mediada por inducci6n con CD70 en celulas HEK 293T. Para este prop6sito, celulas HEK 293T que expresaban NIK transducido retroviralmente se transfectaron por el metodo de precipitaci6n con fosfato de calcio con pSUPER SIVA o con el vector vacio pSUPER, vector pSUPER codificante de una secuencia inespecifica enmaranada y vector pSUPER que codificaba siRNA para secuencia GFP como control. Las celulas transfectadas con pSUPER SIVA o el vector de control pSUPER se trataron con medio que expresaba CD70 durante 8 horas o se dejaron sin tratar, se prepararon extractos nucleares y citoplasmicos y se analizaron por transferencia Western con anticuerpos apropiados especificos para la detecci6n de NIK, p100, p52, y p65. Se utilizaron anticuerpos especificos de actina para detectar actina, como control interno. Los resultados demuestran que la silenciaci6n de SIVA eleva los niveles de NIK en el citoplasma y de p52 en el nucleo (Fig. 7H).

Ejemplo 8: NIK fosforila directamente SIVA2 causando su estabilizaci6n.

Para explorar el mecanismo que da cuenta del aumento de los niveles de la proteina SIVA despues de coexpresi6n con NIK, se investig6 si esta modulaci6n implica la funci6n quinasa de NIK. Utilizando un ensayo de quinasas in vitro, se encontr6 que NIK fosforilaba facilmente SIVA2, lo que sugeria que SIVA2 puede ser un sustrato fisiol6gico de NIK. Se habia informado previamente que SIVA sufre fosforilaci6n en la tirosina por la quinasa ARG en Y34 (Cao et al., 2001a). Sin embargo, se demuestra en esta memoria que la fosforilaci6n de SIVA2 inducida por NIK no se ve afectada por la mutaci6n Y34F. Asimismo, no se observ6 fosforilaci6n alguna de SIVA2 con un NIK mutante sin actividad de quinasa (Fig. 8A). Mientras se analizaban los lisados totales de las celulas en estos experimentos para comprobar la expresi6n de SIVA2, se encontr6 que, en tanto que NIK estabilizaba en gran parte el SIVA2 coexpresado, el NIK mutante sin actividad de quinasa carecia completamente de esta capacidad, indicando un papel de la fosforilaci6n de SIVA2 por NIK en la estabilizaci6n de SIVA2 (Fig. 8B). Para determinar si la fosforilaci6n de SIVA2 inducida por NIK es un suceso directo o mediado por las quinasas de aguas abajo de NIK, se test6 si IKK1 o IKK2 sin actividad de quinasa pueden interferir con el. Al contrario que la fosforilaci6n de NFKB p100 en la que NIK ejerce su efecto a traves de IKK1 (Senftleben et al., 2001), ninguno de los mutantes de IKK1 o IKK2 tenia efecto significativo sobre la fosforilaci6n de SIVA2 por NIK. Estos descubrimientos preliminares sugieren que la fosforilaci6n de SIVA2 puede ser una consecuencia directa de la interacci6n de NIK con SIVA2 (Fig. 8C).

Ejemplo 9: SIVA2, pero no SIVA1, promueve la ubiquitinaci6n inducida de NIK y la escisi6n de TRAF3.

TRAF3 funciona con un regulador negativo de NIK, induciendo su degradaci6n mediada por ubiquitina (Liao et al., 2004). En linea con esto, la sobreexpresi6n de TRAF3 suprimia la actividad del informador NFKB inducida por NIK. TRAMP3 suprimia tambien el efecto intensificador de la funci6n de NIK conferido por coexpresi6n de SIVA2, a niveles bajos (Fig. 9A).

En el curso de estos experimentos, se encontr6 sorprendentemente que NIK modula tambien los niveles de TRAF3 y afecta a su ubiquitinaci6n y degradaci6n. En presencia de ubiquitina ex6gena, NIK amplificaba notablemente la ubi

quitinaci6n de TRAF3, produciendo un patr6n de bandas multiples de TRAF3 en gel reductor. La adici6n de ubiquitina o NIK solos modulaba tambien TRAF3 en cierto grado. Un analisis cuidadoso revel6 que, ademas de la ubiquitinaci6n, una banda de peso molecular bajo que comprendia el dominio Nterminal (al tiempo que retenia el marcador HIS Nterminal) de TRAF3 (dTRAF3) aparecia como un producto de escisi6n principal (Fig. 9B).

A continuaci6n, se test6 el efecto de las proteinas SIVA sobre la ubiquitinaci6n y escisi6n de TRAF3 inducida por NIK. Dado que la expresi6n de ubiquitina sola afectaba a TRAF3, este experimento se realiz6 sin ubiquitina ex6gena a fin de limitar el ruido de fondo. En esta disposici6n, NIK solo causaba poca modificaci6n de TRAF3. Sin embargo, se detect6 un efecto diferencial claro de SIVA1 y SIVA2 sobre la modulaci6n de TRAF3 inducida por NIK. SIVA1 no tenia efecto alguno sobre TRAF3 por encima del que era inducido por NIK. Por el contrario, SIVA2 aumentaba significativamente la ubiquitinaci6n y escisi6n de TRAMP3 (Fig. 9C). Por analisis ulteriores de la clase de ubiquitinaci6n de TRAF3 (por coexpresi6n transitoria con las ubiquitinas mutantes K48 y K63), se encontr6 que la clase principal de poliubiquitinaci6n de TRAF3 estaba ligada a K63, mientras que la ubiquitinaci6n ligada a K48 era minima (Fig. 9D). Es interesante que la coexpresi6n de TRAF3, SIVA2 y el mutante de ubiquitina capaz de formar cadenas ligadas a K63, daba como resultado ubiquitinaci6n y escisi6n de TRAF3, generando el fragmento dTRAF3 incluso en ausencia de NIK transfectado. La sustituci6n de SIVA2 de tipo salvaje por el mutante SIVA con dedo de anillo2 anulaba por completo la generaci6n de dTRAF3, lo que implicaba un papel crucial del dedo de anillo de SIVA2 en el proceso. Se encontr6 tambien que la inhibici6n proteas6mica inhibia la formaci6n de dTRAF3 inducida por SIVA2, indicando que el proceso es ubiquitinaci6n K63 y dependiente de proteasomas (Fig. 9E). Consistentemente, la inhibici6n lisos6mica no impedia la escisi6n de TRAF3, fuese en respuesta a SIVA2 o a NIK (no representado). Un informe previo sugeria una escisi6n similar de TRAF3 por caspasas que producian un fragmento TRAF3 Nterminal (Lee et al., 2001). Sin embargo, la mutaci6n del residuo aspartato en el sitio de escisi6n por las caspasas en TRAF3 a alanina (TRAF3 D347A) no impedia su escisi6n en respuesta a SIVA2 (Fig. 9E). Analogamente, la escisi6n de TRAF3 inducida por NIK no era bloqueada tampoco por la mutaci6n D347A, sino que aparecia intensificada, lo que indicaba que la escisi6n de TRAF3 inducida por NIK y SIVA2 ocurria por un mecanismo diferente, muy probablemente procesamiento proteas6mico. El TRAF3 mutante con dedo de anillo era escindido tambien por NIK en un grado similar al de TRAF3 de tipo salvaje (Fig. 9F). Sorprendentemente, el mismo exhibia ubiquitinaci6n notable en presencia de NIK o SIVA2 y el mutante de ubiquitina capaz de formar cadenas enlazadas K63, y estaba presente principalmente en la fracci6n insoluble en Triton (Fig. 9G).

A continuaci6n, para saber si NIK, SIVA2 y TRAF3 funcionan realmente de modo dependiente, los autores llevaron a cabo experimentos de coprecipitaci6n a partir de celulas que expresaban transitoriamente estas proteinas. De hecho existia un complejo tripartito, que era independiente de la funci6n quinasa de NIK. En ausencia de NIK ex6geno, se observaba solamente una debil interacci6n de TRAF3 y SIVA2, mediada probablemente por NIK end6geno. Como en el caso del complejo p100NIKIKK1 en el que la fijaci6n no se ve influenciada por la funci6n quinasa de NIK (Xiao et al., 2004), aqui tambien juega NIK el papel de una proteina adaptadora que enlaza TRAF3 y SIVA2 (Fig. 9H).

Ejemplo 10: La inducci6n de SIVA2 en celulas HeLa y Ramos da como resultado una activaci6n ulterior de NFKB

Con objeto de examinar el efecto de SIVA2 sobre la activaci6n alternativa de NFKB, se utiliz6 el sistema de clonaci6n TREX (Invitrogen) que permite la expresi6n inducible por tetraciclina (o doxidoxiciclina, un analogo de tetraciclina) de los genes clonados. El gen SIVA2 se clon6 en el sistema TREX y se introdujo de manera estable en celulas HeLa. Las celulas exhiben expresi6n inducible de SIVA2 (datos no presentados); y adicionalmente, cuando no se inducia la expresi6n de SIVA2 las celulas responden al ligando LIGHT normalmente en terminos de activaci6n de NFKB.

Celulas HeLa TREX capaces de expresar SIVA2 inducible por tetraciclina se trataron con medio enriquecido en LIGHT durante 8 horas a fin de activar NFKB. Despues de un tratamiento con LIGHT, las celulas se lisaron, se fraccionaron en fracciones citoplasmica y nuclear, y la fracci6n nuclear se someti6 a analisis por transferencia Western sondado con anticuerpos especificos antip52, ReIB o p65. Se encontr6 que LIGHT inducia translocaci6n nuclear tanto de p52 como de p65, en las celulas HeLa. Se estudi6 el efecto de la inducci6n de SIVA2 sobre la activaci6n de NFKB mediada por LIGHT. Los resultados obtenidos muestran que la inducci6n durante un tiempo breve de SIVA2 aumentaba la translocaci6n nuclear de p52 y p65 mediada por LIGHT, mientras que una inducci6n durante largo tiempo de SIVA2 interferia con la translocaci6n nuclear mediada por LIGHT tanto de p52 como de p65 (Fig. 10A).

El gen SIVA2 se clon6 en el sistema de celulas 293ecr (Invitrogen). Este sistema permite la expresi6n inducible de SIVA2 mediada por ecdisona (o el analogo ponasterona). Las celulas 293ecr con el gen de SIVA2 clonadas se modificaron por ingenieria genetica para expresar constitutivamente CD27. Estas celulas se trataron durante 0 y 8 horas con CD70 para inducir la activaci6n del camino alternativo NFKB. Despues del tratamiento, las celulas se lisaron, se fraccionaron en fracciones citoplasmica y nuclear y se sometieron a analisis por transferencia Western sondado con anticuerpos antiNIK, TRAF2, y TRAF3 p100 y p52. Los resultados muestran que la inducci6n de SIVA2 durante un tiempo breve, en la ultima hora de la inducci6n de CD70, reducia el nivel de TRAF2/3 y aumentaba los niveles de procesamiento de NIK y p100, dando como resultado niveles nucleares incrementados de p52. La inducci6n de SIVA2 durante un tiempo largo, 8 horas a lo largo del tratamiento con CD70, reducia los niveles de NIK y p52 nuclear (Fig. 10B). Estos resultados indican que en las celulas 293 SIVA tiene efectos reguladores tanto positivos como negativos sobre NIK y la activaci6n de NFKB mediada por NIK.

Celulas Ramos que albergaban el sistema TREX capaz de expresar SIVA2 inducible por tetraciclina o el mutante SIVA2C73A se trataron con CD70 para activar NFKB y se estudi6 el efecto de la inducci6n de SIVA2 sobre la activaci6n de NFKB inducida por CD70. Para este prop6sito, se trataron celulas Ramos con CD70 durante 0, 0,3 u 8 horas y se indujeron para expresar SIVA2 o el mutante SIVA2C73A durante largo tiempo (8 horas), corto tiempo (1 hora) o no se indujeron. Como se indica en la figura, durante el tratamiento de 8 horas de ligando con inducci6n de SIVA, se aplic6 doxiciclina junto con el ligando. En el caso de 1 hora de inducci6n de SIVA, se anadi6 doxiciclina en la ultima hora de las 8 horas de tratamiento con el ligando. En el caso del tratamiento breve con CD70 se anadi6 doxiciclina durante 8 horas o durante 1 hora y se aplic6 el ligando durante las 0,3 horas finales. A continuaci6n, se lisaron las celulas, se fraccionaron en extractos nuclear y citoplasmico y se sometieron a analisis por transferencia Western sondado con anticuerpos especificos antiIKBa, p65, p100 y p52. Los resultados obtenidos muestran que la inducci6n de SIVA2 de tipo salvaje bloqueaba la degradaci6n de IKBa inducida por CD70 y la translocaci6n de p65 al nucleo (Fig. 10C). En contraste, la inducci6n del SIVA mutante con dedo de anillo no bloqueaba la degradaci6n de IKBa inducida por CD70 y aumentaba la translocaci6n nuclear de p65. La inducci6n de SIVA2 bloqueaba tambien la translocaci6n nuclear de p52 inducida por CD70 de una manera dependiente del dedo de anillo. Asi pues, al contrario que las celulas adherentes, tales como HEK 293T y HeLa, en los linfocitos la inducci6n de SIVA durante tiempo breve no aumentaba la activaci6n de NFKB, lo que indicaba que el modo de acci6n de SIVA en las celulas linfoides y no linfoides es diferente.

Celulas Ramos TREX capaces de expresar SIVA2 inducible por tetraciclina o el mutante SIVA2C73A se trataron con TNF y se estudi6 el efecto de la inducci6n de SIVA2 o SIVA2C73A sobre la translocaci6n de p65 inducida por TNF al nucleo. Para este prop6sito, se trataron celulas Ramos con TNF durante 0, 0,3 y 4 horas y se indujeron para expresar SIVA2 o el mutante SIVA2C73A durante largo tiempo (4 horas) o corto tiempo (1 hora) o se dejaron sin inducci6n como se ha descrito arriba. Las celulas se lisaron, se fraccionaron en extractos nuclear y citoplasmico, y se sometieron a analisis por transferencia Western sondado con anticuerpos especificos antip65. Los resultados obtenidos muestran que la inducci6n de SIVA2 de tipo salvaje bloqueaba la translocaci6n de p65 inducida por TNF al nucleo (Fig. 10D). En contraste, la inducci6n del mutante de SIVA con dedo de anillo no bloqueaba la degradaci6n de IKBa inducida por TNF y aumentaba la translocaci6n nuclear de p65.

Asi pues, la elevaci6n de SIVA2 reprime la activaci6n de NFKB inducida por TNF en las celulas Ramos.

Ejemplo 12: Ubiquitinaci6n in vitro de TRAF2 por SIVA2.

Se analizaron ensayos de ubiquitinaci6n in vitro en un volumen de reacci6n de 50 Il que contenia unicamente HISubiquitinaK63 recombinante (una HISubiquitina recombinante en la cual todas las lisinas en la ubiquitina excepto K63 estan mutadas a arginina, Boston Biochem) (8 Ig), E1 (0,2 Ig), E2 (0,5 Ig) y 12 Ig de GSTSIVA recombinante o GSTSIVAC73A con TRAF2 marcado con FLAG. TRAF2 marcado con FLAG se expres6 transitoriamente y se purific6 utilizando cuentas antiFLAG M2 (Sigma) y se eluy6 utilizando el peptido FLAG en un tamp6n que contenia 30 mM HEPES de pH 7,6, 5 mM MgCl2, 2 mM ATP, 0,2 mM DTT, 5 mM citrato de sodio, 10 mM fosfato de creatina, 0,2 Ig/ml creatinaquinasa y 5 IM ubiquitinaldehido. Las reacciones se incubaron a 30°C durante una hora. Las reacciones se diluyeron a 1 ml con tamp6n que contenia 20 mM HEPES de pH 7,6, 150 mM NaCl, 1% Triton X100, 1 mM EDTA y c6ctel completo de inhibidores de proteasas. Se inmunoprecipit6 TRAF2 utilizando cuentas antiFLAG M2 durante 4 horas a 4°C. Los inmunoprecipitados se sometieron a transferencia Western con anticuerpo antiTRAF2 (H249, Santa Cruz). Los resultados en Fig. 11A muestran que SIVA2, pero no el SIVA2C73A mutante, induce directamente la ubiquitinaci6n K63 de TRAF2.

Ejemplo 13: Las celulas Ramos que expresan constitutivamente el termino C de SIVA mimetizan la deficiencia de TRAF2 en las celulas B.

Las celulas B deficientes en TRAF2 exhiben un nivel alto de p52 (NFKB constitutiva alternativa) y TRAF3 (Grech et al., 2004). Analogamente, se encontr6 que las celulas Ramos que se modificaron por ingenieria genetica para expresar de manera estable el termino C de SIVA muestran un nivel alto de p52 asi como TRAF3 y una expresi6n reducida de TRAF2 (Fig. 11B). La hiperactivaci6n de NFKB resultante de la expresi6n de SIVAc puede dar como resultado una expresi6n intensificada de inmunomediadores dependientes de NFKB en las celulas.

Ejemplo 14: Fijaci6n in vitro de TRAF2 a SIVA2

Con objeto de explorar si TRAF2 se fija a SIVA2, se inmunoprecipit6 TRAF2 marcado con FLAG a partir de celulas 193T transfectadas utilizando cuentas antiFLAG M2. Se eluy6 TRAF2 de las cuentas utilizando el peptido FLAG. El TRAF2 marcado con FLAG eluido se incub6 con SIVA2 marcado con GST recombinante (expresado bacterialmente)

o con el SIVA2 mutante con dedo de anillo marcado con GST a 30°C durante una hora en un volumen de 50 Il de tamp6n (30 mM HEPES de pH 7,6, 5 mM MgCl2, 0,2 mM DTT). A continuaci6n, la mezcla de fijaci6n se diluy6 a 1 ml para alcanzar la composici6n siguiente: 30 mM HEPES, 5 mM MgCl2, 0,2 mM DTT, 150 mM NaCl, 1% Triton X100 y 1 mM EDTA. La inmunoprecipitaci6n se llev6 a cabo con antiFLAG para TRAF2 y el analisis por transferencia Western se llev6 a cabo con antiSIVA para detectar el SIVA coprecipitante. Los resultados muestran que TRAF2 se fija directamente a SIVA2 in vitro y que el dedo de anillo de SIVA es importante para esta fijaci6n (Fig. 11C). Lo ultimo se confirm6 en el experimento siguiente. Se cotransfectaron celulas HEK 293T con 12 Ig de HISSIVA2 o deleciones de SIVA2 que carecian del dedo de anillo (SIVA2 158 y SIVA181) y FLAGTRAF2 por el metodo del fosfato

de calcio. Veinticuatro horas despues de la transfecci6n, se cosecharon las celulas y se lisaron en tamp6n de lisis que contenia 1% de Triton. Se inmunoprecipit6 TRAF2 utilizando cuentas antiFLAG M2 y el SIVA2 coprecipitado se sond6 por transferencia Western utilizando anticuerpo antiHIS. La lisis total en Fig. 11D muestra los niveles de expresi6n de las proteinas. Los resultados obtenidos muestran que SIVA no se coprecipita con TRAF2 cuando esta ausente el dedo de anillo (SIVA2 158) y coprecipita unicamente cuando esta presente el dedo de anillo (SIVA2 intacto y SIVA2 181). Estos resultados confirman que el dedo de anillo de SIVA2 es necesario para la fijaci6n de TRAF2 y SIVA2 (Fig. 11D).

Ejemplo 15: La sobreexpresi6n de SIVA en las celulas HEK 293T aumenta la ubiquitinaci6n K48 de TRAF2.

Se transfectaron celulas HEK 293T por el metodo del fosfato de calcio con 4 Ig de FLAGTRAF2, 6 Ig de HISSIVA2 y 6 Ig de plasmidos mutantes de ubiquitina. Veinticuatro horas despues de la transfecci6n, las celulas se lisaron en tamp6n que contenia 1% de Triton X100, se inmunoprecipitaron y se analizaron por transferencia Western utilizando anticuerpos especificos. Se utiliz6 el mutante TRAF2 con dedo de anillo (C34A) para prevenir su autoubiquitinaci6n. La mutaci6n con dedo de anillo de TRAF2 impedia unicamente la autoubiquitinaci6n K63. SIVA2 aumentaba la ubiquitinaci6n K48 de TRAF2 en funci6n de su dedo de anillo. El mutante TRAF2 con dedo de anillo retenia su capacidad para fijar SIVA2 (Fig. 11E).

Ejemplo 16: SIVA2 regula la ubiquitinaci6n de TRAF2 reclutada en el receptor CD27 en las celulas Ramos.

El reclutamiento de TRAF2 en el receptor CD27 se indujo por estimulaci6n con FLAGCD70 y el TRAF2 reclutado en el receptor se inmunoprecipit6 utilizando antiFLAG a traves de FLAGCD70 de 100 x 106 celulas por momento puntual. Se indujo SIVA2 durante 2 horas con 1 Im doxiciclina antes de estimulaci6n con CD70. El reclutamiento de IKK1 en el receptor CD27 no se ve afectado por la inducci6n de SIVA. La cantidad de SIVA2 total expresada despues de inducci6n con doxiciclina se muestra en el panel inferior.

La inducci6n de SIVA2 aumenta TRAF2 ubiquitinado en el complejo receptor de una manera dependiente del anillo en las celulas Ramos (Fig. 11F).

Se explor6 el efecto de la silenciaci6n de SIVA en la ubiquitinaci6n de TRAF2 reclutada en el receptor CD27. Para este prop6sito, se transfectaron celulas 293CD27 en placas de 6 pocillos con 3 Ig de pSUPER SIVA (2 Ig de pSUPER275 + 1 Ig de pSUPER NC3) por el metodo del fosfato de calcio. Cuarenta y ocho horas despues, se trataron las celulas con medio de expresi6n de FLAGCD70 durante 0,15, 30 y 60 minutos para inducir el reclutamiento de TRAF2 en el receptor CD27. Las celulas se lisaron y el complejo del receptor CD27 se inmunoprecipit6 utilizando anticuerpo antiFLAG. Se sond6 TRAF2 asociado al receptor con anticuerpo antiTRAF2 (Santa Cruz H249). El receptor CD27 e IKK1 precipitados por el ligando se muestran en los paneles inferiores. B Se compararon las celulas transfectadas con pSUPER SIVA con celulas de control transfectadas con pSUPER respecto al nivel de TRAF2 en el citoplasma despues de la estimulaci6n con CD70. El disparo de CD70 da como resultado la degradaci6n de TRAF2 de una manera dependiente de SIVA. SIVA facilita el reclutamiento inicial de TRAF2 en el receptor CD27, lo cual es necesario para la degradaci6n de TRAF2 despues de la estimulaci6n con CD27.

Referencias

LISTADO DE SECUENCIAS

�110� YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT CO. LTD WALLACH, David WANGXIA, Wang

5 RAMAKRISHNAN, Parameswaran KOVALENKO, Andrei

�120� ACTIVIDAD RELACIONADA CON UBIQUITINACION Y/O DEGRADACION DE SIVA Y MODULADORES DE LA MISMA.

�130� 1052

10 �150� 173104 �151� 12012006

�160� 35

�170� PatentIn versi6n 3.3

�210� 1

15 �211� 175 �212� PRT �213� Homo sapiens

�400� 1 �210� 2 �211� 110 �212� PRT �213� Homo sapiens

�400� 2

�210� 3 �211� 52 �212� PRT

10 �213� Artificial

�220� �223� SIVA c.

�400� 3

15 �210� 4 �211� 58 �212� PRT �213� Artificial

�220� 20 �223� SIVA2 158

�400� 4 �210� 5 �211� 81 �212� PRT �213� Artificial

�220� �223� SIVA2 181

�400� 5

10 �210� 6 �211� 32 �212� PRT �213� Artificial

�220� 15 �223� Dedo de anillo semejante a caja B

�400� 6

�210� 7

20 �211� 156 �212� DNA �213� Artificial �220� �223� Termino c de SIVA

�400� 7

5 �210� 8 �211� 174 �212� DNA �213� Artificial

�220� 10 �223� SIVA 2 158

�400� 8

�210� 9 �211� 243 15 �212� DNA �213� Artificial

�220� �223� SIVA 2 181

�400� 9

�210� 10 �211� 528 �212� DNA �213� Homo sapiens

25 �400� 10 �210� 11 �211� 343 �212� DNA �213� Homo sapiens

�400� 11 �210� 21 �211� 64 �212� DNA �213� Artificial

10

�210� 12 �211� 34 �212� DNA �213� Artificial

�220� �223� Cebadorsentido

15

�400� 12 ccaagctatt tcaatcgtgt gaaagtccaa atac 34

�210� 13 �211� 34 �212� DNA �213� Artificial

20

�220� �223� Cebador antisentido

�400� 13 gtatttggac tttcacacga ttgaaatagc ttgg

34

25

�210� 14 �211� 42 �212� DNA �213� Artificial

�220� �223� Cebador sentido

30

�400� 14 gagggtctgg aatacctaca ttcccgcagg attctgcatg gg 42

�210� 15 �211� 42

�212� DNA �213� Artificial

�220� �223� Cebador antisentido

5

�400� 15 cccatgcaga atcctgcggg aatgtaggta ttccagaccc tc 42

10

�210� 16 �211� 42 �212� DNA �213� Artificial

�220� �223� Cebador sentido

�400� 16 catgagaagt tttctgtggc ggcataccta gtgcatgctc tg

42

15

�210� 17 �211� 42 �212� DNA �213� Artificial

20

�220� �223� Cebador antisentido

�400� 17 cagagcatgc actaggtatg ccgccacaga aaacttctca tg

42

25

�210� 18 �211� 36 �212� DNA �213� Artificial

�220� �223� Cebador sentido

30

�400� 18 gggccccggc cagctgcggc gacaacaggc agagcc 36

�210� 19 �211� 36 �212� DNA �213� Artificial

35

�220� �223� Cebador antisentido

�400� 19 ggctctgcct gttgtcgccg cagctggccg gggccc

36

40

�210� 20 �211� 64 �212� DNA �213� Artificial

�220� �223� siRNA SIVA NC3sentido

45

�400� 20

�220� �223� siRNA SIVA NC3antisentido

�400� 21

�210� 22 �211� 64 �212� DNA �213� Artificial

10 �220� �223� siRNA SIVA131sentido

�400� 22

�210� 23

15 �211� 64 �212� DNA �213� Artificial

�220� �223� siRNA SIVA131antisentido

20 �400� 23

�210� 24 �211� 64 �212� DNA

25 �213� Artificial

�220� �223� siRNA SIVA275sentido

�400� 24

30 �210� 25 �211� 64 �212� DNA �213� Artificial

�220� 35 �223� siRNA SIVA275antisentido

�400� 25

�210� 26

�211� 64 �212� DNA �213� Artificial

�220� �223� siRNA SIVA 278sentido

�400� 26

�210� 27 �211� 64

10 �212� DNA �213� Artificial

�220� �223� siRNA SIVA278antisentido

�400� 27

�210� 28 �211� 64 �212� DNA �213� Artificial

20 �220� �223� siRNA SIVA518sentido

�400� 28

�210� 29

25 �211� 64 �212� DNA �213� Artificial

�220� �223� siRNA SIVA518antisentido

30 �400� 29

�210� 30 �211� 64 �212� DNA

35 �213� Artificial

�220� �223� siRNA SIVA521sentido

�400� 30

�210� 31 �211� 64 �212� DNA �213� Artificial

�220� �223� siRNA SIVA521antisentido

�400� 31

10 �210� 32 �211� 64 �212� DNA �213� Artificial

�220� 15 �223� siRNA GFPsentido

�400� 32

�210� 33 �211� 64

20 �212� DNA �213� Artificial

�220� �223� siRNA GFPantisentido

�400� 33

�210� 34 �211� 17 �212� PRT �213� Artificial

30 �220� �223� Dominio de la quinasa NIK

�400� 34

35 �210� 35 �211� 10 �212� PRT �213� Artificial

�220�

�223� Marcador myc �400� 35

Claims (18)

1. REIVINDICACIONES

   1.Un metodo para identificar un polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B de SEQ ID NO: 6 o un hom6logo del mismo que tiene un motivo con dedo de anillo semejante a caja B que carece de histidina y que tiene actividad relacionada con ubiquitinaci6n, que comprende: (i) poner en contacto polipeptidos que comprenden una ubiquitina, un E1, un E2, y dicho polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B de SEQ ID NO: 6 o dicho hom6logo del mismo; (ii) medir el enlace de ubiquitina a dicho polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B, en donde la detecci6n de la ubiquitina enlazada a dicho polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B es indicativa de que dicho polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B tiene actividad relacionada con ubiquitinaci6n.
2. 2.El metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en donde el polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B de SEQ ID NO: 6 es un polipeptido SIVA.
3. 3.El metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 2, en donde el metodo tiene por objeto la identificaci6n de un polipeptido SIVA capaz de tener actividad relacionada con la ubiquitinaci6n K63.
4. 4.Un metodo para identificar un polipeptido SIVA que tiene actividad relacionada con ubiquitinaci6n directa o indirecta que comprende: (i) poner en contacto polipeptidos que comprenden una ubiquitina, un E1, un E2, un polipeptido TRAF2, y opcionalmente un E3 en presencia o ausencia de un polipeptido SIVA; (ii) medir el nivel de ubiquitinaci6n del polipeptido TRAF2 en presencia y en ausencia del polipeptido SIVA; y (iii) comparar el nivel de ubiquitinaci6n de TRAF2 en presencia y en ausencia del polipeptido SIVA, en donde el aumento en el nivel de ubiquitinaci6n de TRAF2 en presencia del polipeptido SIVA es indicativo de que el polipeptido SIVA tiene actividad directa o indirecta relacionada con ubiquitinaci6n.
5. 5.El metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 4, en donde se testa la actividad relacionada con la ubiquitinaci6n K48 de un polipeptido SIVA.
6. 6.El metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 4 6 5, en donde el polipeptido SIVA consiste en SIVA2.
7. 7.Un metodo para identificaci6n de un agente capaz de modular la actividad relacionada con ubiquitinaci6n de un polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B de SEQ ID NO: 6 o un hom6logo del mismo que tiene un motivo con dedo de anillo semejante a caja B que carece de histidina y que tiene actividad relacionada con ubiquitinaci6n, que comprende: (i) poner en contacto polipeptidos que comprenden una ubiquitina, un E1, E2, el polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B de SEQ ID NO: 6 o un hom6logo del mismo en presencia o en ausencia de un agente candidato, en condiciones que permiten la ubiquitinaci6n de dicho polipeptido que alberga un polipeptido de anillo semejante a caja B mediada por dicho polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B; (ii) medir el nivel de ubiquitinaci6n de dicho polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B en presencia o en ausencia de dicho agente candidato; y (iii) comparar el nivel de ubiquitinaci6n en presencia y en ausencia de dicho agente candidato, en donde un cambio en el nivel de ubiquitinaci6n de un polipeptido que alberga un polipeptido de anillo semejante a caja B en presencia de dicho agente candidato es indicativo de que el agente candidato es capaz de modular la actividad relacionada con ubiquitinaci6n de dicho polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B.
8. 8.El metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 7, en donde el polipeptido que alberga un anillo semejante a caja B de SEQ ID NO: 6 es un polipeptido SIVA.
9. 9.El metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 2 u 8, en donde la ubiquitina es ubiquitina mutada en K48.
10. 10.El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la puesta en contacto de los polipeptidos se lleva a cabo en el interior de celulas o in vitro.
11. 11.El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la ubiquitinaci6n se detecta por analisis de transferencia Western.
12. 12.El metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 7 u 8, en donde dicho agente candidato se selecciona de moleculas organicas pequenas, peptidos, acidos nucleicos, moleculas procedentes de extractos naturales, y compuestos organicos sinteticos.
13. 13.Un polipeptido aislado constituido por una caja B de la secuencia indicada en SEQ ID NO: 6.
14. 14.Un polipeptido aislado constituido por un fragmento Cterminal de un polipeptido SIVA que incluye el dedo de anillo semejante a caja B y/o el motivo con dedo de cinc, en donde el fragmento esta constituido por los residuos de aminoacidos 58 a 110 de SIVA2 indicados en SEQ ID NO: 3.
15. 15.Un polinucle6tido aislado que codifica un polipeptido de acuerdo con las reivindicaciones 13 6 14.
16. 16.Un polinucle6tido aislado de acuerdo con la reivindicaci6n 15, que comprende la secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9.
17. 17.Un vector que comprende un polinucle6tido de acuerdo con las reivindicaciones 15 6 16. 18.Una celula hospedadora que alberga un vector de acuerdo con la reivindicaci6n 17. 19.Un metodo para preparaci6n de un polipeptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 6 14,

    que comprende cultivar una celula hospedadora de acuerdo con la reivindicaci6n 18 y aislar el polipeptido producido.

    5 20.Un kit util para ubiquitinaci6n de un sustrato proteinico que comprende E1, E2, ubiquitina, y un polipeptido SIVA.
18. 21.El kit de acuerdo con la reivindicaci6n 20, en donde el sustrato proteinico se selecciona de TRAF2, TRAF3, NIK y SIVA. 22.Una composici6n farmaceutica que comprende un vector de acuerdo con la reivindicaci6n 17, un polipeptido de

    acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 6 14 o una sal del mismo, o un polinucle6tido de acuerdo con 10 la reivindicaci6n 15 6 16 y un vehiculo farmaceuticamente aceptable.

    51

    52

    53

    54

    NIK y sus deleciones

    Ubiquitinaci6n

    Lisado total

    Lisado total

    WB: anti actina

    Actina

    Lisado total

    Lisado total

    Actina

    WB: anti actina

    Lisado total

    Lisado total WB: anti actina

    Actina

    55

    56

    57

    Ensayo de quinasas in vitro

    Lisado total

    Ensayo de quinasas in vitro

    Lisados totales

    60

    Doxi Citoplasma

    Nucleo

    Doxi

    de la entrada

    Lisado total Lisado total

    Lisado total