JP5086273B2 - Ｓｉｖａユビキチン化および／または分解関連活性ならびにそのモジュレーター - Google Patents

Ｓｉｖａユビキチン化および／または分解関連活性ならびにそのモジュレーター Download PDF

Info

Publication number
JP5086273B2
JP5086273B2 JP2008549987A JP2008549987A JP5086273B2 JP 5086273 B2 JP5086273 B2 JP 5086273B2 JP 2008549987 A JP2008549987 A JP 2008549987A JP 2008549987 A JP2008549987 A JP 2008549987A JP 5086273 B2 JP5086273 B2 JP 5086273B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
polypeptide
siva
nik
ubiquitination
siva2
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2008549987A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2009523023A (ja
Inventor
ワラク、デイビット
ラマクリシュナン、パラメスワラン
ワンシア、ワン
コバレンコ、アンドレイ
Original Assignee
イエダ リサーチ アンド ディベロップメント カンパニー リミテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by イエダ リサーチ アンド ディベロップメント カンパニー リミテッド filed Critical イエダ リサーチ アンド ディベロップメント カンパニー リミテッド
Publication of JP2009523023A publication Critical patent/JP2009523023A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5086273B2 publication Critical patent/JP5086273B2/ja
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/25—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving enzymes not classifiable in groups C12Q1/26 - C12Q1/66
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/9015—Ligases (6)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

本発明は、ＳＩＶＡポリペプチドのユビキチン化および／または分解関連活性、ならびにこの活性を調節可能な薬剤に関する。
ＳＩＶＡは、ＴＮＦレセプター（ＴＮＦＲ）ファミリーのＣＤ２７およびＧＩＴＲレセプターの細胞質尾に結合するアダプタータンパク質である。２つの異なるスプライスアイソフォームとして、ＳＩＶＡ１およびＳＩＶＡ２が存在する。ＳＩＶＡ１はより長く、その中心部分に推定両親媒性へリックスを有する、デスドメイン相同領域（ＤＤＨＲ）を含む。ＳＩＶＡ２はより短く、ＤＤＨＲを欠く。両方のアイソフォームは、それらのＣ−末端にＢ−ボックス様リングフィンガーおよび亜鉛フィンガー様ドメインを含む。ＳＩＶＡ１およびＳＩＶＡ２両方の強制発現が、アポトーシスを誘導することが示された（Prasad et al., 1997, Yoon et al., 1998, Spinicelli et al., 2003, Py et al., 2004）。ＳＩＶＡ１誘導アポトーシスは、その両親媒性へリックス領域を通して、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーへのその結合と、そのメンバーの阻害によって影響を受けることが指摘された（Chu et al., 2005; Chu et al., 2004; Xue et al., 2002）。プロアポトーシスの役割と一致して、ＳＩＶＡは、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３およびＥ２Ｆ１に対する直接の転写標的である（Fortin et al., 2004）。証拠の種々の要点によって、ＳＩＶＡが、ストレス誘導性タンパク質であり、急性虚血性傷害（Padanilam et al., 1998）、ＣｏｘＡウイルス感染（Henke et al., 2000）において、またシスプラチン治療（Qin et al., 2002）、ならびにアポトーシスを誘導するＴＩＰ３０発現（Xiao et al., 2000）によって、アップレギュレートされることが示される。最近、デスドメインではない、ＳＩＶＡ１およびＳＩＶＡ２の共通Ｎ−およびＣ−末端が、カスパーゼ依存ミトコンドリア経路の活性化を介して、リンパ細胞におけるアポトーシスを仲介するのに十分であり、可能であることが示された（Py et al., 2004）。
ＮＦ−κＢ−誘導キナーゼ、ＮＩＫ、（ＭＡＰ３Ｋ１４）が、ＴＮＦ−レセプター関連アダプタータンパク質ＴＲＡＦ２に結合するタンパク質に対するスクリーニングにおいて発見された（Malinin et al., 1997）。本タンパク質キナーゼの過剰発現に際したＮＦ−κＢの明らかな活性化、および種々のタンパク質キナーゼに対する応答でのＮＦ−κＢ活性化の効果的な阻害、および触媒的に不活性なＮＩＫ変異体の発現に際した、種々の誘導薬剤に対する応答での、ＮＦ−κＢ活性化の効果的な阻害が、ＮＦ−κＢ活性化のためのシグナル伝達におけるＮＩＫの関与を示す（Malinin et al., 1997）。
ＮＩＫは、リンパ器官発達において有する（Shinkura et al., 1999）。免疫系の発達および機能の制御に関与することとは別に、ＮＩＫはまた、乳腺発達のような種々の非免疫機能の調節に関与すると思われる（Miyawaki et al., 1994）。インビトロ研究によって、骨格筋細胞分化を引き起こすシグナル伝達（Canicio et al., 2001）、およびニューロンの生存および分化（Foehr et al., 2000）におけるＮＩＫが示された。
リンパ器官におけるＮＦ−κＢ種のパターンの査定によって、ＲｅＩタンパク質およびＩκＢからなるＮＦ−κＢ複合体（類）の制御におけるその役割とは別に、ＮＩＫも他のＮＦ−κＢ種の発現／活性化を制御することに関与することが示された。実際、ＮＩＫは、ユビキチン化に対する分子トリガーとして働く、ｐ１００の部位特異的リン酸化に関与し、ｐ１００の活性処理に関与して、ｐ５２を形成する。このｐ１００処理活性が、ＮＩＫのａｌｙ変異導入によって除去されることが発見された（Xiao et al., 2001b）。
胸腺間質におけるＮＩＫは、免疫学的耐性を維持するために必須であるＴｒｅｇ細胞の正常な産出のために重要である。ＮＩＫ変異導入は結果として、ａｌｙマウスにおけるＴｒｅｇ細胞の無秩序な胸腺構造、および障害のある産出となった（Kajiura et al., 1004）。一貫して、ＮＩＫ−欠損マウスの研究によってまた、Ｔｒｅｇ細胞の発達および増殖を制御することにおけるＮＩＫの役割がまた示された（Lu et al., 2005）。これらの発見は、間質依存様式で、自己耐性を確立することにおける、ＮＩＫの重要な役割を示している。ＮＩＫはまた、ウイルス感染の結果として、ＮＦ−κＢ活性化に参加する。呼吸器合胞体ウイルス感染が、結果として、ａ５４９細胞のような肺胞中、ＮＩＫのキナーゼ活性の増加、および活性化ＮＩＫ、ＩＫＫ１、ｐ１００および処理ｐ５２からなる複合体の形成となる。この場合、ＮＩＫ自身が、ｐ５２に結合した核内へ転位し、驚くべきことに、これらの事象が、正規ＮＦ−κＢ経路活性化の活性化に先行する（Choudhary et al., 2005）。これらの発見は、ＮＩＫが実際、ＮＦ−κＢ活性化の調節因子として働くが、他の機能も担ってよいこと、および細胞−およびレセプター特異的様式で、これらの機能を発揮することを示している。
ＮＩＫは、ＮＩＫ分子内の「活性化ループ（activation loop）」のリン酸化の結果として活性化されることが可能である。実際に、本ループ内のリン酸化部位（Ｔｈｒ−５５９）の変異導入が、ＮＩＫ過剰発現に際したＮＦ−κＢの活性化を防止する（Lin et al., 1999）。さらに、ＮＩＫの活性化が、そのキナーゼモチーフの上流および下流の領域の、互いに結合する能力を介して、制御されるようである。そのキナーゼモチーフのＮＩＫ下流のＣ末端領域が、ＩＫＫ１（Regnier et al., 1997）ならびにｐ１００（Xiao et al., 2001b）に直接的に結合することが可能であることが示されており、これらの相互作用は、ＮＦ−κＢシグナル伝達における、ＮＩＫ機能のために明らかに必要である。ＮＩＫのＮ末端領域は、陰性調節ドメイン（ＮＲＤ）を含み、これは、基礎モチーフ（ＢＲ）と、プロリン−リッチ繰り返しモチーフ（ＰＲＲ）からなる（Xiao and Sun, 2000）。Ｎ末端ＮＲＤは、ｃｉｓでＮＩＫのＣ−末端領域に結合し、それによって、ＮＩＫのその基質（ＩＫＫ１およびｐ１００）への結合を阻害する。異所的に発現したＮＩＫは、各ＮＩＫ分子中のＣ−末端領域へのＮ−末端のこれらの結合が、明らかに乱されているオリゴマーを自然発生的に形成し、高レベルの構造的活性を表示する（Lin et al., 1999）。ＮＩＫ Ｃ−末端領域のＴＲＡＦ２（ならびに他のＴＲＡＦｓ）への結合が、活性化工程に関与するであろう。しかしながら、その実際の関与の様式は未知である。
最近、ＮＩＫ調節の新規メカニズムが非常に注目を浴びている。これは、ＮＩＫのプロテアゾーム仲介分解を引き起こす、ＮＩＫおよびＴＲＡＦ３の動的な相互作用を考慮する。興味深いことに、ＣＤ４０およびＢＬｙＳのようなＮＦ−κＢの他の経路が、ＴＲＡＦ３分解と、ＮＩＫ発現の同時増強を誘導することが示された（Liao et al., 2004）。
ＮＩＫ活性における下流メカニズムの情報はまだ限られている。そのＣ−末端領域のＩＫＫ１への結合を介して、ＮＩＫがＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）複合体を活性化することが可能であるという証拠が存在する。実際、ＩＫＫ１の活性化ループ中のセリン−１７６をリン酸化可能であり、それによってその活性化を可能にすることが示された（Ling et al., 1998）。
ＮＩＫが、正規のＮＦ−κＢ経路においてまったく関与しないことが示されたが、他のものを独占的に活性化するために働くことが示された（Pomerantz and Baltimore, 2002,概説のため）。
最近、ＴＮＦによるリンパ球中のＩｋａｐｐａＢ分解の誘導がＮＩＫに依存しない一方で、すべてがまたＮＦ−κＢ２／ｐ１００処理を誘導する、ＣＤ７０、ＣＤ４０リガンド、およびＢＬｙＳ／ＢＡＦＦによるその誘導がＮＩＫ機能に依存することが示された（Ramakrishnan et al., 2004）。ＣＤ７０およびＴＮＦ両方が、そのレセプターへのＩＫＫキナーゼ複合体の動員を誘導する。ＴＮＦではなく、ＣＤ７０の場合、本工程が、ＮＩＫ動員に関連し、ＩＫＫ１およびＮＩＫのレセプター結合の延長が続く、ＮＩＫのではなく、ＩＫＫ複合体のＣＤ２７への動員は、ＮＩＫキナーゼ機能に依存する。これらの発見は、ＮＩＫが、標準および非標準両方のＮＦ−κＢダイマーを活性化する、特定の誘導剤によって開始される遠位シグナル伝達事象の固有の組に関与することを示している。
哺乳動物中のＴＲＡＦファミリーは、７つのメンバーＴＲＡＦ１−ＴＲＡＦ７からなる（Bradley and Pober 2001; Xu et al., 2004）。ＴＲＡＦｓは、主に転写因子ＮＦ−κＢおよびＡＰ１による、後天性および先天性免疫両方において、重要な機能を発揮する（Wajant and Scheurich, 2004）。すべてのＴＲＡＦタンパク質が、レセプターの細胞質ドメインへ、および他のＴＲＡＦタンパク質へ結合可能な、ＴＲＡＦドメインと呼ばれるＣ−末端相同領域を共有する。さらに、ＴＲＡＦ２−ＴＲＡＦ７タンパク質は、シグナル伝達下流事象のために重要である、それらのＮ末端において、リングおよび亜鉛フィンガーを有する。
ＴＲＡＦｓ遺伝子のノックアウトマウスが確立された（Bishop 2004; Bradley 2001、およびChung 2002によって概説された）。ＴＲＡＦ２ノックアウトは、若くして死亡し、繊維芽細胞中のＴＮＦ−仲介ＪＮＫ活性化は示されない。これらＴＲＡＦ２ノックアウトは、血清ＴＮＦレベルの上昇、および胸腺細胞および繊維芽細胞におけるＴＮＦ誘導死に対する感受性の増加を示す。さらに、これらＴＲＡＦ２ノックアウトは、ＴＮＦおよびＣＤ４０誘導標準ＮＦ−κＢ活性化において障害のあるＢ細胞を有する。また、これらＴＲＡＦ２ノックアウトは、Ｂ細胞中の、欠損ＣＤ４０誘導ＴＲＡＦ３分解および構成性の他のＮＦ−κＢ活性化を示す。ＴＲＡＦ３ノックアウトは、末梢リンパ球のすべての系統での欠損を示す。これらＴＲＡＦ３ノックアウトは、Ｂ細胞におけるＴ−依存抗原およびＬＭＰ１シグナル伝達欠損に応答して、欠損イソ型切り替えを示す。
１つの態様において、本発明は、（ｉ）ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２および配列番号６のＢ−ボックス様リングを有するポリペプチドまたはその相同体を含むポリペプチドを接触させること、（ii）Ｂ−ボックス様リングを有する前記ポリペプチドへのユビキチンの結合を測定すること、を含み、前記Ｂ−ボックス様リングをもつポリペプチドに結合したユビキチンの検出が、前記Ｂ−ボックス様リングを有するポリペプチドが、ユビキチン化関連活性を有することを示す、ユビキチン化関連活性を有する、配列番号６のＢ−ボックス様リングを有するポリペプチドまたはその相同体を同定するための方法に関する。
他の態様において、本発明は、（ｉ）配列番号６のＢ−ボックス様リングを有するポリペプチドまたはその相同体の存在下または非存在下で、ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２、ＴＲＡＦ２ポリペプチドを含むポリペプチドを接触させること、（ii）配列番号６のＢ−ボックス様リングまたはその相同体を有するポリペプチドの存在下および非存在下で、ＴＲＡＦ２ポリペプチドに結合するユビキチンを測定すること、および（iii）ポリペプチドの存在下および非存在下におけるＴＲＡＦ２に結合したユビキチンのレベルを比較すること、を含み、Ｂ−ボックスリングを有するポリペプチドの存在下におけるＴＲＡＦ２に結合したユビキチンのレベルの増加が、配列番号６のＢ−ボックス様リングを有するポリペプチドまたはその相同体が、ユビキチン化関連活性をもつことを示す、ユビキチン化関連活性を有する配列番号６のＢ−ボックス様リングを有するポリペプチドまたはその相同体を同定するための方法に関する。
さらなる態様において、本発明は、（ｉ）ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２およびＳＩＶＡポリペプチドを含むポリペプチドを接触させること、（ii）前記ユビキチンが、前記ＳＩＶＡポリペプチドに結合するかどうかを検出すること、を含み、前記ＳＩＶＡポリペプチドに結合したユビキチンの検出が、前記ＳＩＶＡポリペプチドがユビキチン化関連活性を有することを示す、ユビキチン化関連活性を有するＳＩＶＡポリペプチドを同定するための方法に関する。
本発明の１つの実施形態において、方法は、Ｋ６３ユビキチン化関連活性を有することが可能なＳＩＶＡポリペプチドの同定のためである。
本発明のさらなる実施形態において、ユビキチンポリペプチドは、Ｋ４８で変異したユビキチンである。
他のさらなる態様において、本発明は、（ｉ）ＳＩＶＡポリペプチドの存在下または非存在下で、ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２、ＮＩＫポリペプチド、ＴＲＡＦ３ポリペプチドおよび任意にＥ３を含むポリペプチドを接触させること、（ii）ＳＩＶＡポリペプチドの存在下および非存在下で、ＮＩＫおよびＴＲＡＦ３のユビキチン化のレベルを測定すること、および（iii）ＳＩＶＡポリペプチドの存在下および非存在下における、ＮＩＫおよびＴＲＡＦ３のユビキチン化のレベルを比較すること、を含み、ＳＩＶＡポリペプチドの存在下における、ＮＩＫおよびＴＲＡＦ３のユビキチン化のレベルの増加が、ＳＩＶＡポリペプチドが、直接または間接ユビキチン化関連活性を有することを示す、直接または間接ユビキチン化関連活性を有するＳＩＶＡポリペプチドを同定するための方法に関する。
他のさらなる態様において、本発明は、（ｉ）ＳＩＶＡポリペプチドが存在下または非存在下で、ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２、ＮＩＫポリペプチド、および任意にＥ３を含むポリペプチドを接触させること、（ii）ＳＩＶＡポリペプチドの存在下および非存在下で、ＮＩＫポリペプチドのユビキチン化のレベルを測定すること、および（iii）ＳＩＶＡポリペプチドの存在下および非存在下におけるＮＩＫのユビキチン化のレベルを比較すること、を含み、ＳＩＶＡポリペプチドの存在下におけるＮＩＫのユビキチン化のレベルの増加が、ＳＩＶＡポリペプチドが、直接または間接ユビキチン化関連活性を有することを示す、直接または間接ユビキチン化関連活性を有するＳＩＶＡポリペプチドを同定するための方法に関する。
本発明の１つの実施形態において、ＮＩＫポリペプチドに関するＳＩＶＡポリペプチドの直接または間接Ｋ４８またはＫ６３ユビキチン化関連活性を試験する。
他のさらなる態様において、本発明は、（ｉ）ＳＩＶＡポリペプチドが存在下または非存在下で、ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２、ＴＲＡＦ３ポリペプチド、および任意にＥ３を含むポリペプチドを接触させること、（ii）ＳＩＶＡポリペプチドの存在下または非存在下で、ＴＲＡＦ３ポリペプチドのユビキチン化のレベルを測定すること、および（iii）ＳＩＶＡポリペプチドの存在下および非存在下における、ＴＲＡＦ３のユビキチン化のレベルを比較すること、を含み、ＳＩＶＡポリペプチドの存在下におけるＴＲＡＦ３のユビキチン化のレベルの増加が、ＳＩＶＡポリペプチドが、直接または間接ユビキチン化関連活性を有することを示す、直接または間接ユビキチン化関連活性を有するＳＩＶＡポリペプチドを同定するための方法に関する。
本発明の１つの実施形態において、ＴＲＡＦ３ポリペプチドに関するＳＩＶＡポリペプチドの直接または間接Ｋ６３ユビキチン化関連活性を試験する。
本発明のさらなる実施形態において、ＳＩＶＡポリペプチドは、デスドメインを欠く。
他のさらなる態様において、本発明は、（ｉ）ＳＩＶＡポリペプチドが存在下または非存在下で、ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ５またはＴＲＡＦ６ポリペプチド、および任意にＥ３を含むポリペプチドを接触させること、（ii）ＳＩＶＡポリペプチドの存在下および非存在下で、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ５またはＴＲＡＦ６ポリペプチドのユビキチン化のレベルを測定すること、および（iii）ＳＩＶＡポリペプチドの存在下または非存在下における、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ５またはＴＲＡＦ６のユビキチン化のレベルを比較することを含み、ＳＩＶＡポリペプチドの存在下における、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ５またはＴＲＡＦ６のユビキチン化のレベルの増加が、ＳＩＶＡポリペプチドが、直接または間接ユビキチン化関連活性を有することを示す、直接または間接ユビキチン化関連活性を有するＳＩＶＡポリペプチドを同定するための方法に関する。
他のさらなる態様において、本発明は、（ｉ）ＳＩＶＡポリペプチドが存在下または非存在下で、ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２、ＴＲＡＦ２ポリペプチド、および任意にＥ３を含むポリペプチドを接触させること、（ii）ＳＩＶＡポリペプチドの存在下および非存在下で、ＴＲＡＦ２ポリペプチドのユビキチン化のレベルを測定すること、および（iii）ＳＩＶＡポリペプチドの存在下および非存在下におけるＴＲＡＦ２のユビキチン化のレベルを比較することを含み、ＳＩＶＡポリペプチドの存在下におけるＴＲＡＦ２のユビキチン化のレベルの増加が、ＳＩＶＡポリペプチドが、直接または間接ユビキチン化関連活性を有することを示す、直接または間接ユビキチン化関連活性を有するＳＩＶＡポリペプチドを同定するための方法に関する。
本発明の１つの実施形態において、ＳＩＶＡポリペプチドのＫ４８ユビキチン化関連活性を試験する。
本発明のさらなる実施形態において、ＳＩＶＡポリペプチドは、ＳＩＶＡ２からなる。
他のさらなる態様において、本発明は、（ｉ）Ｂ−ボックス様リングを有するポリペプチドによって仲介される、Ｂ−ボックス様リングポリペプチドを有する前記ポリペプチドのユビキチン化を可能にする条件下、候補薬剤の存在下または非存在下で、ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２、配列番号６のＢ−ボックス様リングを有するポリペプチドまたはその相同体を接触させること、（ii）前記候補薬剤の存在下または非存在下で、Ｂ−ボックス様リングを有する前記ポリペプチドのユビキチン化のレベルを測定すること、および（iii）前記候補薬剤の存在下および非存在下におけるユビキチン化のレベルを比較することを含み、前記候補薬剤の存在下における、Ｂ−ボックス様リングポリペプチドを有するポリペプチドのユビキチン化のレベルの変化が、候補薬剤が、Ｂ−ボックス様リングを有する前記ポリペプチドのユビキチン化関連活性を調節することが可能であることを示す、配列番号６のＢ−ボックス様リングを有するポリペプチドまたはその相同体のユビキチン化関連活性を調節可能な薬剤を同定するための方法に関する。
他のさらなる態様において、本発明は、（ｉ）Ｂ−ボックス様リングを有するポリペプチドによって仲介される、Ｂ−ボックス様リングを有する前記ポリペプチドおよび／またはＴＲＡＦ２ポリペプチドのユビキチン化を可能にする条件下、候補薬剤の存在下または非存在下で、ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２、配列番号６のＢ−ボックス様リングを有するポリペプチドまたはその相同体およびＴＲＡＦ２を含むポリペプチドを接触させること、（ii）前記候補薬剤の存在下または非存在下で、Ｂ−ボックス様リングを有する前記ポリペプチドおよび／またはＴＲＡＦ２ポリペプチドのユビキチン化のレベルを測定すること、および（iii）前記候補薬剤の存在下および非存在下におけるユビキチン化のレベルを比較することを含み、前記候補薬剤の存在下における、Ｂ−ボックス様リングポリペプチドを有するポリペプチドのユビキチン化のレベルの変化が、候補薬剤が、Ｂ−ボックス様リングを有する前記ポリペプチドおよび／またはＴＲＡＦ２ポリペプチドのユビキチン化関連活性を調節することが可能であることを示す、配列番号６のＢ−ボックス様リングを有するポリペプチドまたはその相同体のユビキチン化関連活性を調節可能な薬剤を同定するための方法に関する。
他のさらなる態様において、本発明は、（ｉ）ＳＩＶＡポリペプチドの自己ユビキチン化を可能にする条件下、候補薬剤の存在下または非存在下で、ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２、およびＳＩＶＡポリペプチドを含むポリペプチドを接触させること、（ii）候補薬剤の存在下および非存在下で、ＳＩＶＡポリペプチドのユビキチン化のレベルを測定すること、および（iii）候補薬剤の存在下および非存在下における、前記ＳＩＶＡポリペプチドの自己ユビキチン化のレベルを比較することを含み、候補薬剤の存在下におけるＳＩＶＡポリペプチドの自己ユビキチン化のレベルの変化が、候補薬剤が、ＳＩＶＡのユビキチン化関連活性を調節することが可能であることを示す、ＳＩＶＡポリペプチドのユビキチン化関連活性を調節可能な薬剤を同定するための方法に関する。
本発明の１つの実施形態において、ユビキチンは、Ｋ４８で変異したユビキチンである。
他のさらなる態様において、本発明は、（ｉ）ＳＩＶＡポリペプチドによって仲介される、ＮＩＫおよび／またはＴＲＡＦ３ポリペプチドのユビキチン化を可能にする条件下、候補薬剤の存在下または非存在下で、ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２、ＳＩＶＡポリペプチド、ＮＩＫおよび／またはＴＲＡＦ３ポリペプチド、および任意にＥ３を含むポリペプチドを接触させること、（ii）前記候補薬剤の存在下または非存在下で、前記ＮＩＫおよび／またはＴＲＡＦ３ポリペプチドのユビキチン化のレベルを測定すること、および（iii）前記候補薬剤の存在下および非存在下におけるユビキチン化のレベルを比較することを含み、前記候補薬剤の存在下における、ＮＩＫおよび／またはＴＲＡＦ３ポリペプチドユビキチン化のレベルの変化が、候補薬剤が、ＳＩＶＡの間接または直接ユビキチン化関連活性を調節することが可能であることを示す、ＳＩＶＡポリペプチドの直接または間接ユビキチン化関連活性を調節可能な薬剤を同定するための方法に関する。
本発明の１つの実施形態において、ＳＩＶＡポリペプチドは、ＳＩＶＡ２である。
他のさらなる態様において、本発明は、（ｉ）ＳＩＶＡポリペプチドによって仲介される、ＮＩＫポリペプチドのユビキチン化を可能にする条件下、候補薬剤の存在下または非存在下で、ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２、ＳＩＶＡポリペプチド、ＮＩＫポリペプチド、および任意にＥ３を含むポリペプチドを接触させること、（ii）前記候補薬剤の存在下または非存在下で、前記ＮＩＫポリペプチドのユビキチン化のレベルを測定すること、および（iii）前記候補薬剤の存在下および非存在下におけるユビキチン化のレベルを比較することを含み、前記候補薬剤が存在下におけるＮＩＫポリペプチドのユビキチン化のレベルの変化が、候補薬剤が、ＳＩＶＡの間接または直接ユビキチン化関連活性を調節することが可能であることを示す、ＳＩＶＡポリペプチドの直接または間接ユビキチン化関連活性を調節可能な薬剤を同定するための方法に関する。
本発明の１つの実施形態において、薬物が、ＮＩＫポリペプチドに関するＳＩＶＡポリペプチドの直接または間接Ｋ４８またはＫ６３ユビキチン化関連活性を調節する。
他のさらなる態様において、本発明は、（ｉ）ＳＩＶＡポリペプチドによって仲介される、ＴＲＡＦ３ポリペプチドのユビキチン化を可能にする条件下、候補薬剤の存在下または非存在下で、ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２、ＳＩＶＡポリペプチド、ＴＲＡＦ３ポリペプチド、および任意にＥ３を含むポリペプチドを接触させること、（ii）前記候補薬剤の存在下または非存在下で、前記ＴＲＡＦ３ポリペプチドのユビキチン化のレベルを測定すること、および（iii）前記候補薬剤の存在下または非存在下におけるユビキチン化のレベルを比較することを含み、前記候補薬剤の存在下におけるＴＲＡＦ３ポリペプチドユビキチン化のレベルの変化が、候補薬剤が、ＳＩＶＡの間接または直接ユビキチン化関連活性を調節することが可能であることを示す、ＳＩＶＡポリペプチドの直接または間接ユビキチン化関連活性を調節可能な薬剤を同定するための方法に関する。
本発明の１つの実施形態において、薬物は、ＳＩＶＡポリペプチドの直接または間接Ｋ６３ユビキチン化関連活性を調節する。
他のさらなる簡単において、本発明は、（ｉ）ＳＩＶＡポリペプチドによって仲介される、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ５またはＴＲＡＦ６ポリペプチドのユビキチン化を可能にする条件下、候補薬剤の存在下または非存在下で、ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２およびＳＩＶＡポリペプチドを含むポリペプチドを、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ５またはＴＲＡＦ６ポリペプチドと接触させること、（ii）前記候補薬剤の存在下または非存在下で、前記ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ５またはＴＲＡＦ６ポリペプチドのユビキチン化のレベルを測定すること、および（iii）前記候補薬剤の存在下および非存在下におけるユビキチン化のレベルを比較することを含み、前記候補薬剤の存在下における、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ５またはＴＲＡＦ６ポリペプチドのユビキチン化のレベルの変化が、候補薬剤が、ＳＩＶＡのユビキチン化関連活性を調節することが可能であることを示す、ＳＩＶＡポリペプチドのユビキチン化関連活性を調節可能な薬剤を同定するための方法に関する。
他のさらなる態様において、本発明は、（ｉ）ＳＩＶＡポリペプチドによって仲介される、ＴＲＡＦ２ポリペプチドのユビキチン化を可能にする条件下、候補薬剤の存在下または非存在下で、ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２およびＳＩＶＡポリペプチドおよびＴＲＡＦ２ポリペプチドを含むポリペプチドを接触させること、（ii）前記候補薬剤の存在下または非存在下で、前記ＴＲＡＦ２ポリペプチドのユビキチン化のレベルを測定すること、および（iii）前記候補薬剤の存在下または非存在下におけるユビキチン化のレベルを比較することを含み、前記候補薬剤が存在下におけるＴＲＡＦ２ポリペプチドのユビキチン化のレベルの変化が、候補薬剤が、ＳＩＶＡのユビキチン化関連活性を調節することが可能であることを示す、ＳＩＶＡポリペプチドのユビキチン化関連活性を調節可能な薬剤を同定するための方法に関する。
本発明の１つの実施形態において、薬剤は、ＳＩＶＡポリペプチドの直接または間接Ｋ６３ユビキチン化活性を調節する。
本発明のさらなる実施形態において、ポリペプチドの接触は、細胞内で行われる。
本発明のさらなる実施形態において、ポリペプチドの接触は、インビトロで行われる。
本発明のさらなる実施形態において、ユビキチン化を、ウエスタンブロット解析によって検出する。
他のさらなる態様において、本発明は、（ｉ）ＳＩＶＡポリペプチドの存在下または非存在下で、ＮＩＫおよび／またはＴＲＡＦ３ポリペプチドを含むペプチドを接触させること、（ii）ＳＩＶＡポリペプチドの存在下または非存在下で、ＮＩＫおよび／またはＴＲＡＦ３ポリペプチド分解を測定すること、および（iii）ＳＩＶＡポリペプチドの存在下または非存在下における、ＮＩＫおよび／またはＴＲＡＦ３ポリペプチドの分解のレベルを比較することを含み、ＳＩＶＡポリペプチドの存在下における、ＮＩＫおよび／またはＴＲＡＦ３の全または部分分解が、タンパク質分解を誘導するＳＩＶＡポリペプチドの能力を示す、タンパク質分解を誘導することが可能なＳＩＶＡポリペプチドを同定するための方法に関する。
他のさらなる態様において、本発明は、（ｉ）ＳＩＶＡポリペプチドの存在下または非存在下で、ＮＩＫポリペプチドを含むペプチドを接触させること、（ii）ＳＩＶＡポリペプチドの存在下または非存在下で、ＮＩＫポリペプチド分解を測定すること、および（iii）ＳＩＶＡポリペプチドの存在下または非存在下におけるＮＩＫポリペプチドの分解のレベルを比較することを含み、ＳＩＶＡポリペプチドの存在下におけるＮＩＫの全または部分分解が、タンパク質分解を誘導するＳＩＶＡポリペプチドの能力を示す、タンパク質分解を誘導することが可能なＳＩＶＡポリペプチドを同定するための方法に関する。
他のさらなる態様において、本発明は、（ｉ）ＳＩＶＡポリペプチドの存在下または非存在下で、ＴＲＡＦ３ポリペプチドを含むペプチドを接触させること、（ii）ＳＩＶＡポリペプチドの存在下または非存在下で、ＴＲＡＦ３ポリペプチド分解を測定すること、および（iii）ＳＩＶＡポリペプチドの存在下または非存在下におけるＴＲＡＦ３ポリペプチドの分解のレベルを比較することを含み、ＳＩＶＡポリペプチドの存在下におけるＴＲＡＦ３の全または部分分解が、タンパク質分解を誘導するＳＩＶＡポリペプチドの能力を示す、タンパク質分解を誘導することが可能なＳＩＶＡポリペプチドを同定するための方法に関する。
本発明の１つの実施形態において、ＲＡＦ３のより小さな断片（ｄＴＲＡＦ３）の検出が、タンパク質分解を誘導する前記ＳＩＶＡポリペプチドの能力を示す。
他のさらなる態様において、本発明は、（ｉ）ＳＩＶＡポリペプチドによって仲介されるＮＩＫおよび／またはＴＲＡＦ３の分解を可能にする条件下、候補薬剤の存在下または非存在下で、ＳＩＶＡポリペプチドをＮＩＫおよび／またはＴＲＡＦ３と接触させること、（ii）候補薬剤の存在下または非存在下で、ＮＩＫおよび／またはＴＲＡＦ３の分解を測定すること、および（iii）候補薬剤の存在下または非存在下における、ＮＩＫおよび／またはＴＲＡＦ３の分解のレベルを比較することを含み、候補薬剤の存在下におけるＮＩＫおよび／またはＴＲＡＦ３の全または部分分解のレベルの変化が、その候補薬剤が、ＳＩＶＡポリペプチドの活性によって仲介されるタンパク質分解を調節することが可能であることを示す、ＳＩＶＡポリペプチドの活性によって仲介されるタンパク質分解を調節可能な薬剤を同定するための方法に関する。
他のさらなる態様において、本発明は、（ｉ）ＳＩＶＡによって仲介されるＮＩＫの分解を可能にする条件下、候補薬剤の存在下または非存在下で、ＳＩＶＡポリペプチドをＮＩＫと接触させること、（ii）候補薬剤の存在下または非存在下で、ＮＩＫの分解を測定すること、および（iii）候補薬剤の存在下または非存在下におけるＮＩＫの分解のレベルを比較することを含み、候補薬剤の存在下におけるＮＩＫ分解のレベルの変化が、その候補薬剤が、ＳＩＶＡポリペプチドの活性によって仲介されるタンパク質分解を調節することが可能であることを示す、ＳＩＶＡポリペプチドの活性によって仲介されるタンパク質分解を調節可能な薬剤を同定するための方法に関する。
他のさらなる態様において、本発明は、（ｉ）ＳＩＶＡによって仲介されるＴＲＡＦ３の分解を可能にする条件下、候補薬剤の存在下または非存在下で、ＳＩＶＡポリペプチドをＴＲＡＦ３と接触させること、（ii）候補薬剤の存在下または非存在下で、ＴＲＡＦ３の分解を測定すること、および（iii）候補薬剤の存在下または非存在下におけるＴＲＡＦ３の分解のレベルを比較することを含み、候補薬剤の存在下におけるＴＲＡＦ３の全または部分分解のレベルの変化が、その候補薬剤が、ＳＩＶＡポリペプチドの活性によって仲介されるタンパク質分解を調節することが可能であることを示す、ＳＩＶＡポリペプチドの活性によって仲介されるタンパク質分解を調節可能な薬剤を同定するための方法に関する。
本発明の１つの実施形態において、候補薬剤の存在下における、ＴＲＡＦ３のより小さな断片（ｄＴＲＡＦ３）の部分分解および発生のレベルの変化が、その候補薬剤が、ＳＩＶＡポリペプチドの活性によって仲介されるタンパク質分解を調節することが可能であることを示す。
他のさらなる態様において、本発明は、（ｉ）候補薬剤の存在下または非存在下で、ＮＩＫ、ＴＲＡＦ３、およびＳＩＶＡポリペプチドを含むポリペプチドを接触させること、（ii）候補薬剤の存在下または非存在下で、ＮＩＫ−ＴＲＡＰ３−ＳＩＶＡ複合体のレベルを測定すること、および（iii）候補薬剤の存在下および非存在下において形成されるＮＩＫ−ＴＲＡＦ３−ＳＩＶＡ複合体のレベルを比較することを含み、候補薬剤の存在下で形成されるＮＩＫ−ＴＲＡＦ３−ＳＩＶＡ複合体のレベルにおける変化が、その候補薬剤が、ＮＩＫ、ＴＲＡＦ３、およびＳＩＶＡポリペプチド複合体の結合を調節することが可能であることを示す、ＮＩＫ、ＴＲＡＦ３およびＳＩＶＡポリペプチドを含むタンパク質複合体の結合を調節可能な薬剤を同定するための方法に関する。
本発明の１つの実施形態において、前記候補薬剤が、ＮＩＫ、ＴＲＡＦ３およびＳＩＶＡポリペプチド複合体のレベルを減少させる。
本発明のさらなる実施形態において、前記候補薬剤が、ＮＩＫ、ＴＲＡＦ３およびＳＩＡＶポリペプチド複合体のレベルを増加させる。
本発明の他のさらなる実施形態において、ＳＩＶＡポリペプチドは、ＳＩＶＡ２である。
本発明の他のさらなる実施形態において、前記候補薬剤が、小有機分子、ペプチド、核酸、天然抽出物からの分子、および合成有機化合物から選択される。
他のさらなる態様において、本発明は、その病因または経過が、ＴＲＡＦ２、ＮＩＫ、ＴＲＡＦ３および／またはＳＩＶＡの活性および／またはレベルと関連する、疾患、障害または症状の治療または予防のための医薬の製造における、配列番号６中の配列またはその相同配列の、Ｂボックス様リングを有するポリペプチドの直接または間接ユビキチン化関連活性を調節可能な薬剤の使用を提供する。
本発明の１つの実施形態において、疾患がウイルス感染である。
本発明の他の実施形態において、薬剤が、ＳＩＶＡからなるＢボックス様リングを有するポリペプチドの直接または間接ユビキチン化関連活性を調節することが可能である。
本発明のさらなる実施形態において、ＳＩＶＡポリペプチドが、ＳＩＶＡ２からなる。
本発明の他のさらなる実施形態にいて、疾患、障害または症状は、その病因または経過が、ＴＲＡＦ２の活性および／またはレベルに関連した疾患、障害または症状である。
本発明の他のさらなる実施形態において、病因は、ＴＲＡＦ２アップレギュレーション／活性化に関連する。
本発明の他のさらなる実施形態において、疾患は炎症である。
本発明の他のさらなる実施形態において、疾患、障害または症状は、その病因または経過が、ＮＩＫの活性および／またはレベルに関連した疾患、障害または症状である。
本発明の他のさらなる実施形態において、病因は、ＮＩＫアップレギュレーション／活性化に関連する。
本発明の他のさらなる実施形態において、疾患は癌である。
本発明の他のさらなる実施形態において、疾患は自己免疫疾患である。
本発明の他のさらなる実施形態において、疾患、障害または症状は、その病因または経過が、ＴＲＡ３の活性および／またはレベルと関連する。
本発明の他のさらなる実施形態において、病因は、ＴＲＡＦ３アップレギュレーション／活性化に関連する。
本発明の他のさらなる実施形態において、症状は免疫不全である。
本発明の他のさらなる実施形態において、疾患、障害または症状は、その病因または経過が、ＳＩＶＡの活性および／またはレベルに関連する。
本発明は他のさらなる実施形態において、病因は、ＳＩＶＡアップレギュレーション／活性化に関連する。
本発明の他のさらなる実施形態において、疾患、障害または症状は、化学および放射線療法副作用に、また虚血および虚血再灌流に関連する。
他のさらなる態様において、本発明は、その病因または経過が、ＴＲＡＦ３の過度の、または増加したレベルに関連する疾患、障害または症状の治療または予防のための医薬の製造におけるＳＩＶＡ２の使用を提供する。
他のさらなる態様において、本発明は、その病因または経過が、ＴＲＡＦ３のレベルの減少に関連する疾患、障害または症状の治療または予防のための医薬の製造における、リングフィンガーにおいて変異したＳＩＶＡの使用を提供する。
本発明の１つの実施形態において、変異ＳＩＶＡは、ＳＩＶＡ２ Ｃ７３Ａである。
他のさらなる態様において、本発明は、その病因または経過が、細胞中のＴＲＡＦ３のレベル、ＴＲＡＦ３のユビキチン化、および／またはＴＲＡＦ３の分解に関連する、疾患、障害または症状の治療または予防のための医薬の製造におけるＮＩＫの使用を提供する。
他のさらなる態様において、本発明は、その病因または経過が、ＴＲＡＦ２、ＮＩＫ、ＴＲＡＦ３および／またはＳＩＶＡの活性に関連する疾患、障害または症状を治療する、または予防するための医薬の製造における、ＳＩＶＡポリペプチドのユビキチン化リガーゼ活性を調節可能な、および／またはＳＩＶＡポリペプチドのタンパク質分解を調節可能な薬剤の使用を提供する。
他のさらなる態様において、本発明は、免疫系を調節することによって疾患、障害または症状を治療するための医薬の製造における、ＳＩＶＡポリペプチドのユビキチン化リガーゼ活性を調節可能な、および／またはＳＩＶＡポリペプチドのタンパク質分解を調節可能な薬剤の使用を提供する。
他のさらなる態様において、本発明は、免疫系を調節することによって疾患、障害または症状を治療するための医薬の製造における、ＳＩＶＡポリペプチドの使用を提供する。
１つの実施形態において、本発明は免疫系の増強に関する。
他の実施形態において、本発明は免疫系を阻害することに関する。
本発明のさらなる実施形態において、薬剤は、ＳＩＶＡ−Ｃ末端（配列番号３）からなる。
本発明のさらなる実施形態において、薬剤は、ＳＩＶＡ２Ｃ７３Ａからなる。
本発明のさらなる実施形態において、薬剤は、ＳＩＶＡ１−５８（配列番号４）からなる。
本発明のさらなる実施形態において、薬剤は、ＳＩＶＡ１−８１（配列番号５）からなる。
他のさらなる態様において、本発明は、免疫系の調節に応答する疾患、障害または症状を治療するための医薬の製造における、リシン残基６７０に関するＮＩＫ変異体の使用を提供する。
他のさらなる態様において、本発明は、免疫系の調節に応答する疾患、障害または症状を治療するための医薬の製造における、本発明による方法の任意の１つにしたがった方法によって同定される、ＳＩＶＡポリペプチドのユビキチン関連活性を調節することが可能である薬剤の使用を提供する。
本発明の１つの実施形態において、薬剤は、ＳＩＶＡに特異的なｓｉＲＮＡである。
他のさらなる態様において、本発明は、免疫系の調節に応答する疾患、障害または症状を治療するための医薬の製造における、ＳＩＶＡポリペプチドの使用を提供する。
他のさらなる態様において、本発明は、免疫疾患、障害または症状の治療のための医薬の製造における、ＮＩＫ−ＳＩＶＡ−ＴＲＡＦ３複合体の形成を調節可能な薬剤の使用を提供する。
本発明の１つの実施形態において、ＳＩＶＡポリペプチドはＳＩＶＡ２である。
他のさらなる態様において、本発明は、その病因または経過が、過剰ＮＦ−κＢ発現または活性に関連する疾患、障害または症状を治療するための医薬の製造における、ＮＩＫ−ＳＩＶＡ−ＴＲＡＦ３複合体の形成を調節可能な薬剤の使用を提供する。
他のさらなる態様において、本発明は、その病因または経過が、ＮＩＫの過剰な活性に関連する疾患、障害または症状を治療するための医薬の製造における、ＮＩＫ−ＳＩＶＡ−ＴＲＡＦ３複合体の形成を調節可能な薬剤の使用を提供する。
本発明の１つの実施形態において、疾患、障害または症状は炎症である。
本発明の１つの実施形態において、疾患は癌である。
他のさらなる態様において、本発明は、ＮＩＫ、ＴＲＡＦ３およびＳＩＶＡポリペプチドを含むポリペプチド複合体を提供する。
本発明の１つの実施形態において、複合体中のＳＩＶＡポリペプチドは、ＳＩＶＡ２である。
他のさらなる態様において、本発明は、配列番号６において列記された配列のＢボックスからなる単離ポリペプチドを提供する。
他のさらなる態様において、本発明は、ＳＩＶＡ１およびＳＩＶＡ２を除いて、Ｂ−ボックス様リングフィンガーおよび／または亜鉛フィンガーモチーフを含むＳＩＶＡポリペプチドのＣ−末端断片を含む単離ポリペプチドを提供する。
他のさらなる態様において、本発明は、配列番号３において列記されたＳＩＶＡ２のアミノ酸残基５８−１１０からなる、単離ポリペプチドを提供する。
他のさらなる態様において、本発明は、Ｚｎフィンガーモチーフ １〜８１（配列番号５）を欠くＳＩＶＡポリペプチドのＮ−末端断片またはその断片を含む単離ポリペプチドを提供する。
他のさらなる態様において、本発明は、ＳＩＶＡ２ １〜５８（配列番号４）のＺｎフィンガーモチーフおよびＢ−ボックス様リングフィンガーモチーフを欠く、ＳＩＶＡポリペプチドのＮ−末端断片を含む単離ポリペプチドを提供する。
他のさらなる態様において、本発明は、配列番号４、配列番号５、配列番号３、ＳＩＶＡ２ Ｃ７３Ａまたはその断片からなる単離ポリペプチドを提供する。
他のさらなる態様において、本発明は、リングフィンガーモチーフにおいて局在するシステイン残基において変異したＳＩＶＡポリペプチドを含む単離ポリペプチドを提供する。
本発明の１つの実施形態において、ＳＩＶＡはＳＩＶＡ２である。
本発明の１つの実施形態において、ＳＩＶＡ２ポリペプチドが、７３位のシステイン残基において変異される。
他のさらなる態様において、本発明は、リシン残基６７０に関するポリペプチドＮＩＫ変異体を提供する。
本発明の１つの実施形態において、変異体がＮＩＫ Ｋ６７０Ａである。
他のさらなる態様において、本発明は、本発明によるポリペプチドの、融合ポリペプチドを提供する。
他のさらなる態様において、本発明は、本発明によるポリペプチドの塩を提供する。
他のさらなる態様において、本発明は、本発明によるポリペプチドをコードしている単離ポリヌクレオチドを提供する。
他のさらなる態様において、本発明は、配列番号７、配列番号８および配列番号９のような配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。
他のさらなる態様において、本発明は、本発明によるポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
他のさらなる態様において、本発明は、本発明によるベクターを含む宿主細胞を提供する。
他のさらなる態様において、本発明は、本発明による宿主細胞を増殖させ、産出されたポリペプチドを単離することを含む、本発明によるポリペプチドの調製のための方法を提供する。
他のさらなる態様において、本発明は、Ｅ１、Ｅ２、ユビキチン、ＳＩＶＡポリペプチド、および説明書を含むタンパク質基質のユビキチン化のために有用なキットを提供する。
本発明の１つの実施形態において、タンパク質基質が、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＮＩＫおよびＳＩＶＡから選択される。
他のさらなる態様において、本発明は、本発明によるベクターおよび薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を提供する。
他のさらなる態様において、本発明は、本発明によるポリペプチド、またはその塩と、薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を提供する。
他のさらなる態様において、本発明は、本発明によるポリヌクレオチドと、薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を提供する。
他のさらなる態様において、本発明は、配列番号６の配列またはその相同的配列のＢ−ボックス様リングを有するポリペプチドのユビキチン関連活性を調節可能な薬剤と、薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を提供する。
本発明の１つの実施形態において、Ｂ−ボックス様リングを有するポリペプチドは、ＳＩＶＡポリペプチドである。
他のさらなる態様において、本発明は、配列番号６の配列またはその相同的配列のＢ−ボックス様リングを有するポリペプチドの活性によって仲介される、タンパク質分解を調節することが可能である薬剤と、薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を提供する。
本発明の１つの実施形態において、Ｂ−ボックス様リングを有するポリペプチドは、ＳＩＶＡポリペプチドである。
他のさらなる態様において、本発明は、ＳＩＶＡポリペプチドまたはその相同体のユビキチンリガーゼ活性を調節可能な薬剤と、薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を提供する。
他のさらなる態様において、本発明は、細胞中のＳＩＶＡポリペプチド活性または発現のレベルを増加させること、または減少させることを含む、前記細胞内でのＮＩＫユビキチン化を調節するための方法を提供する。
他のさらなる態様において、本発明は、ユビキチン化に好適な条件下、ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２、ＳＩＶＡおよびＴＲＡＦ２を接触させることを含む、ＴＲＡＦ２ユビキチン化を誘導するための方法を提供する。
本発明にしたがって、ＳＩＶＡが、ユビキチン化−関連活性を有し、自己ユビキチン化およびＴＲＡＦ２のユビキチン化を直接誘導することが可能であることが分かった。
ユビキチン化（ubiquitination）とも呼ばれる、ユビキチン化（ubiquitylation）は、それによってタンパク質が、ユビキチン［元来は、ユビキタス免疫原性ポリペプチド（ＵＢＩＰ）］と命名された小タンパク質の共有結合によって翻訳後修飾される、真核生物に特異的な工程を指す。ユビキチンリガーゼは、ユビキチンを標的タンパク質上のリシン残基に共有結合させるタンパク質である。ユビキチンリガーゼは、典型的にポリユビキチン化に関与し、第二ユビキチンが第一に結合し、第三が第二に結合し、以下同様である。
ユビキチンリガーゼは、「Ｅ３」とも呼ばれ、ユビキチン活性化酵素（本明細書で「Ｅ１」と呼ぶ）およびユビキチン共役酵素（本明細書で「Ｅ２」と呼ぶ）と一緒に働く。共役のためにユビキチンを活性化するため、ＡＴＰを使用し、それをＥ２酵素に伝達する、全てのユビキチンリガーゼによって共有される、１つの主要なＥ１酵素が存在する。Ｅ２は、特異的Ｅ３パートナーと結合し、ユビキチンを標的タンパク質に伝達する。多重タンパク質複合体であり得るＥ３は一般的に、ユビキチンを特異的基質タンパク質に対して標的化することに関与する。いくつかの場合、ユビキチンをＥ２酵素より受け取り、標的タンパク質または基質タンパク質に伝達し、他の場合、Ｅ２酵素および基質の双方と相互作用することによって働く。
本発明にしたがって、ＳＩＶＡ２はＥ３リガーゼであることが示された。したがって、１つの態様において、本発明は、（ｉ）ユビキチン、Ｅ１およびＥ２を含むポリペプチドを、ＳＩＶＡポリペプチドに接触させること、（ii）および前記ユビキチンが、前記ＳＩＶＡポリペプチドに共有連結または結合するかどうかを検出することを含み、前記ＳＩＶＡポリペプチドに連結したユビキチンの検出が、前記ＳＩＶＡポリペプチドがユビキチン化関連活性を有することを示す、ユビキチン化関連活性を有するＳＩＶＡポリペプチドを同定するための方法に関する。
ＳＩＶＡポリペプチドは、ＳＩＶＡ由来またはＳＩＶＡに基づく任意のポリペプチドであることができる。ＳＩＶＡポリペプチドの例には、限定はしないが、ＳＩＶＡ１（配列番号１）、ＳＩＶＡ２（配列番号２）、それらの変異タンパク質、融合タンパク質、機能誘導体、活性画分、アイソフォーム、円順列誘導体が含まれる。Ｅ２の例は、Ｕｂｃ１３／Ｕｅｖ１である。
インビトロまたは細胞に基づく方法を使用して、ユビキチン化関連活性を有するＳＩＶＡポリペプチドを同定することが可能である。
本発明の１つの実施形態において、方法は、インビトロ法であり、以下のように実施することが可能である。反応混合液を、組換え体ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２および、組換え体ＳＩＶＡポリペプチドを含んで調製する。使用する組換え体タンパク質の量は、それぞれ、８、０．２、１−２μｇ／ｍｌ ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２およびＳＩＶＡポリペプチドであることができる。タンパク質は、好適な緩衝液中、たとえば、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＡＴＰ、０．２ｍＭＤＴＴ、５ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭリン酸クレアチニン、０．２μｇ／ｍｌクレアチニンキナーゼおよび５μＭユビキチンアルデヒドを含む緩衝液中であることができる。反応液を、３０℃で約１−４時間インキュベートする。反応を、Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液の添加によって停止し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび完全プロテアーゼ阻害剤混合物を含む緩衝液において１ｍｌまで希釈した。ＳＩＶＡを、抗−ＳＩＶＡを用いて、またはＳＩＶＡがタグ化した場合に、タグに対する抗体を使用して、免疫沈降する。たとえば、タグ化ＳＩＶＡは、ＧＳＴ−ＳＩＶＡでありえ、使用する抗体は、以下の代表的な実施形態でのように、ＧＳＴに対して特異的であり得る。次に、抗体を、４℃で４時間、プロテインＧビーズに吸着させる。免疫沈降物を、たとえば抗−ユビキチン抗体のような特異的抗体でのウエスタンブロッティングにかける。本方法でのユビキチンは、Ｋ４８以外のユビキチン中の全てのリシンがアルギニンに変異した変異体ユビキチン（ボストン バイオケム）を使用して、Ｋ４８ユビキチン化可能なＳＩＶＡポリペプチドを同定してよい。または、本方法中のユビキチンは、Ｋ６３以外のユビキチン中の全てのリシンがアルギニンに変異した変異体ユビキチン（ボストン バイオケム）を使用して、自己ユビキチンの場合のような、Ｋ６３ユビキチン化可能なＳＩＶＡポリペプチドを同定してよい。
ＳＩＶＡに連結したユビキチンを、たとえば、抗ＳＩＶＡ抗体を用い、ＳＩＶＡのより重いバンドの発現を検出するウエスタンブロット解析によって、および／またはユビキチンに対する抗体を用いることによって、検出することが可能である。たとえば、ユビキチンは、ＨＩＳまたはＨＡタグ化することが可能である。ＳＩＶＡはＧＳＴまたはＦＬＡＧタグ化することが可能である。
本発明の１つの方法において、タグ化ＳＩＶＡポリペプチドおよび／またはユビキチンを使用して、タグに対して特異的な抗体で検出または免疫沈降することが可能である。たとえば、ＧＳＴ−ＳＩＶＡ２を、インビトロユビキチン化アッセイにおいて、Ｅ１（たとえば２００ｎｇ／５０μｌ）およびＥ２、Ｕｂｃ１３／Ｕｅｖ１（たとえば５００ｍｇ／５０μｌ）、およびＨＩＳ−ユビキチン酵素とともにインキュベートする。３７℃で１時間後、試料を、抗ＧＳＴ抗体で免疫沈降する。ＩＰおよび全溶解物の双方を、抗−ＳＩＶＡ、抗ユビキチンまたは抗ＨＩＳを用いるウエスタンブロッティングによって解析する。
さらなる態様において、本発明は、候補薬剤の存在下または非存在下で、以上の方法を実施することによって、ＳＩＶＡまたはＳＩＶＡポリペプチドのユビキチン関連活性を調節可能な候補薬剤を同定するための方法を提供し、そこで、薬剤の存在下における、前記ＳＩＶＡポリペプチドの自己ユビキチン化のレベルの変化が、候補薬剤が、ＳＩＶＡのユビキチン化関連活性を調節することが可能であることを示す。
ＮＩＫが、本発明にしたがって、それぞれのユビキチン変異体との一時的共発現によって、モノユビキチン化、ならびにＫ４８−ポリユビキチン化を誘導する、そしてＫ−６３ポリユビキチン化を安定化する、分解を受けることが分かった。単一の分子が、全ての公知の種類のユビキチンとの共役を提示していることが非常に興味深い。この種々のユビキチン化は、良好なＮＩＫの機能多様性の決定基であり得る。ＮＩＫユビキチン化におけるＳＩＶＡの役割を調査することによって、本発明にしたがって、ＳＩＶＡの共発現が、ＮＩＫのＫ４８およびＫ６３ユビキチン化を増強したことが分かった。一貫して、インビトロユビキチン化実験において、組換え体ＳＩＶＡ２が、強力なリングフィンガー依存Ｅ３リガーゼであることが分かった。ＳＩＶＡ２は、ＴＲＡＦ２の直接的および特異的Ｅ３リガーゼである。
直接または間接ユビキチン化関連活性を有するＳＩＶＡポリペプチドを、（ｉ）ＳＩＶＡポリペプチドの存在下または非存在下で、ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２、ＮＩＫポリペプチド、および任意にＥ３を含むポリペプチドを接触させること、（ii）ＳＶＡポリペプチドの存在下および非存在下で、ＮＩＫポリペプチドのユビキチン化のレベルを測定すること、および（iii）ＳＩＶＡポリペプチドの存在下および非存在下におけるＮＩＫのユビキチン化のレベルを比較することを含み、ＳＩＶＡポリペプチドの存在下におけるＮＩＫのユビキチン化のレベルの増加が、ＳＩＶＡポリペプチドが、直接または間接ユビキチン化関連活性を有することを示す、方法によって本発明にしたがって同定することが可能である。
たとえば、細胞に基づくアッセイにおいて、ＮＩＫ、ＳＩＶＡポリペプチドおよびＨＡタグ化ユビキチンをコードしているプラスミドを細胞内にトランスフェクト可能であり、溶解細胞の抗−ＮＩＫ免液沈降物を、抗−ＨＡ抗体を用いるウエスタンブロッティングによって解析することが可能である。１つの実施形態において、細胞は、レトロウイルス形質導入ＮＩＫを発現しているＲａｍｏｓ細胞であり、ＣＤ７０で処理することが可能である。他の実施形態において、細胞はＣＤ７０で処理した、ＣＤ２７レセプターおよびＮＩＫを安定に発現しているＨＥＫ ２９３Ｔのような、非リンパ細胞であることができる。細胞溶解物の免疫沈降したＮＩＫを、抗−ユビキチン抗体を用いるウエスタンブロッティングによって解析して、ＮＩＫユビキチン化をモニタすることが可能である。
また、ＳＩＶＡポリペプチドをコードしているプラスミドを、ＮＩＫプラスミドおよびユビキチンをコードしているプラスミドと共トランスフェクトすることが可能である。ＳＩＶＡポリペプチドは、たとえば、ＳＩＶＡ１−５８、またはＳＩＶＡ−Ｃプラスミドであってよく、ユビキチンは、ＨＡ−ユビキチンのような、タグ化ユビキチンであることができる。ユビキチンは、Ｋ４８ＲまたはＫ６３Ｒ変異体のような、リシンにおいて変異された変異体ユビキチンであることができる。使用可能なプラスミドの量は、ＮＩＫ、ＳＩＶＡおよびユビキチンプラスミドに対して、それぞれ約４μｇ、６μｇ、および８μｇである。細胞はＨｅＬａ細胞であることができる。トランスフェクション２４時間後、細胞を回収し、溶解し、抗−ＮＩＫ抗体で免疫沈降する。ウエスタンブロッティングを、ＮＩＫ上のユビキチン共役を検出するために抗−ＨＡで実施することが可能である。
ユビキチン化関連活性および／またはタンパク質分解活性を有するＳＩＶＡポリペプチドの同定のための細胞に基づく方法の１つにおいて、細胞中で、ＮＩＫを、ＳＩＶＡポリペプチドおよびＴＲＡ２ポリペプチドと共発現させることができる。使用可能なプラスミドの量は、ＳＩＶＡに関して、約０．５μｇ、１．５μｇおよび３．０μｇ、ＮＩＫおよびＴＲＡＦ２に関して、０．５μｇである。全細胞溶解物をトランスフェクションの３０時間後に調整し、ＮＩＫにおけるユビキチン共役物の検出、またはＮＩＫの分解の検出のために、抗−ＮＩＫでプローブ化した。
ユビキチン化関連活性を有するＳＩＶＡポリペプチドの同定のための細胞に基づく方法の１つにおいて、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞のような細胞に、ＦＬＡＧ−ＴＲＡＦ２、ＨＩＳ−ＳＩＶＡ２およびユビキチンをコードしているプラスミドをトランスフェクトする。トランスフェクション２４時間後、細胞を溶解し、ＦＬＡＧ−ＴＲＡＦ２に対する特異的抗体を用いて免疫沈降し、ウエスタンブロット解析して、ユビキチン化ＴＲＡＦ２を検出する。ＴＲＡＦ２リングフィンガー変異体（Ｃ３４Ａ）を、ＷＴ ＴＲＡＦ２の代わりに使用して、その自己ユビキチン化を防止することが可能である。ＴＲＡＦ２リングフィンガー変異体は、ＳＩＶＡ２に結合するその能力を維持した。
他の細胞に基づくアッセイにおいて、ＦＬＡＧ−ＣＤ７０での刺激、およびＳＩＶＡの過剰発現によってＣＤ２７レセプターに動員された、ユビキチン化ＴＲＡＦ２、および抗−ＦＬＡＧによる免疫沈降を使用することが可能である。ＳＩＶＡ２は、ＴＲＥＸ系およびＣＤ７０での刺激の前の１ｕＭドキシサイクリンでの誘導を用いることによって過剰発現することが可能である。
ＳＩＶＡポリペプチドによって誘導されたユビキチン化の細胞に基づくアッセイを、外来ユビキチンなしで、および限定はしないが、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞およびＲａｍｏｓ細胞を含む任意の種類の細胞で実施してよい。
インビトロユビキチン化アッセイを、たとえばＨＩＳ−ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２（たとえばＵｂｃ１３／Ｕｅｖ１ヘテロダイマー）、たとえばＧＳＴ−ＳＩＶＡ２またはＧＳＴ−ＳＩＶＡＣ７３Ａのような、ＧＳＴ様との融合タンパク質であることができる組換え体ＳＩＶＡポリペプチド、およびＦＬＡＧタグ化ＴＲＡＦ２であることができる組換え体ＴＲＡＦ２を含む反応液を利用することによって実施することが可能である。タンパク質は、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＡＴＰ、０．２ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ クエン酸ナトリウム、１０ｍＭ リン酸クレアチニン、０．２μｇ／ｍｌクレアチニンキナーゼおよび５μＭユビキチンアルデヒドを含む緩衝液中に存在させることができる。抗ＦＬＡＧまたは抗ＴＲＡＦ２を使用して、改変（ユビキチン化）ＴＲＡＦ２を検出することが可能である。
ＳＩＶＡは、カスパーゼ依存ミトコンドリア経路において細胞死を誘導する（Py et al., 2003）。誘導物質としてのアポトーシスにおいて推測される役割と一致して、ＳＩＶＡが、異なる細胞型において、ＵＶおよび酸化ストレスに対する応答でアップレギュレートされ、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３およびＥ２Ｆ１の直接転写標的である（Fortin et al., 2004）。アポトーシスの工程において、カスパーゼ−８が、ＮＩＫのようなタンパク質を開裂することが知られており、したがって、細胞生存および増殖においてきわめて重要な役割をはたすＮＦ−κＢを抑制する（Foehr et al., 2000）。同様に、高用量のＳＩＶＡ２も共発現したＮＩＫを分解し、この効果はプロテアソーム阻害によって犠牲にされる。本発明にしたがって、ＳＩＶＡ２も、ＮＩＫのＫ４８ユビキチン化を誘導することが分かったが、ＮＩＫにおけるＫ６７０残基の変異によって著しく減少された。共に、これらの観察は、古典的なユビキチン−プロテアソーム経路を介した、ＳＩＶＡ２によるＮＩＫの制御を指摘している（Glickman and Ciechanover, 2002）。興味深いことに、ＳＩＶＡ過剰発現に対する応答における、Ｋ４８ユビキチン化、およびＮＩＫの分解の双方が、ＳＩＶＡ２リングフィンガー領域の完全に非存在下においてでさえ、ならびに触媒的に不活性なＳＩＶＡリングフィンガー変異体で発生し、これは、ＳＩＶＡが、Ｋ４８ユビキチン化を誘導するための、ＮＩＫの直接Ｅ３ではないこと、およびＳＩＶＡが、ユビキチン化を仲介するために、タンデムで働くアクセサリーＥ３タンパク質を必要とし得ることを示す。ＳＩＶＡは、ＯＳＴＬと呼ばれる他のリングフィンガータンパク質に結合することが示された。ＯＳＴＬは、Ｂ−ボックス様リングフィンガーモチーフを含み、Ｂ細胞シグナル伝達および生存における役割を有することが前提となるので、Ｅ３アクセサリータンパク質であることができる（Fontanari Krause et al., 2003）。同様に、ＴＲＡＦ３もその分解を引き起こす、ＮＩＫの間接ユビキチン化酵素として報告された（Liao et al., 2004）。しかしながら、本発明にしたがって、ＴＲＡＦ３は、同様の効果で、野生型ＮＩＫおよびＮＩＫ Ｋ６７０Ａ変異体の双方を分解することが分かり、これは、ＳＩＶＡ２およびＴＲＡＦ３仲介ＮＩＫ分解に関与する分子メカニズムが異なることを示している。ＳＩＶＡ２およびＴＲＡＦ３は、ＮＩＫをユビキチン化するために、共動作して機能し得る。
驚くべきことに、ＮＩＫ分解を与えるＴＲＡＦ３の能力を査定する一方で、本発明にしたがって、ＮＩＫが、その細胞レベル、ユビキチン化、および分解の速度に影響を与える、ＴＲＡＦ３を調節することが分かった。このＴＲＡＦ３の調節は、ＴＲＡＦ３の完全分解とはならず、異なる低分子量形態のＴＲＡＦ３（ｄＴＲＡＦ３）の集積となる意味で、特異である。興味深いことに、ＳＩＶＡ１でなく、ＳＩＶＡ２が、ＴＲＡＦ３のこのＮＩＫ−誘導開裂を著しく増加させた。これは、ＳＩＶＡの２つのスプライス変異体間の機能的差違を示した最初の観察である。ＳＩＶＡ２とＴＲＡＦ３の直接結合が、弱くだけ発生したにも関わらず、野生型またはキナーゼ死ＮＩＫの存在が、その相互作用を著しく安定化させた。結合が、ＮＩＫのキナーゼ機能によって影響を受けないｐ１００−ＮＩＫ−ＩＫＫ１複合体の場合（Xiao et al., 2004）のように、ここで、ＮＩＫもＴＲＡＦ３とＳＩＶＡ２を連結するアダプタータンパク質の役割を果たすことが明らかである。これは、ＮＩＫとＳＩＶＡ２の共動作による、ＮＩＫ−ＳＩＶＡ２−ＴＲＡＦ３複合体の形成、ＴＲＡＦ３開裂およびユビキチン化が観察された最初である。
ユビキチン変異体の共発現による、ＴＲＡＦ３ユビキチン化の型をさらに調査することで、本発明にしたがって、ＴＲＡＦ３がＫ６３ユビキチン化を圧倒的に受けること、およびＳＩＶＡ２が、Ｋ６３ユビキチン化依存様式において、ｄＴＲＡＦ３を産出することが分かった。さらに、ＳＩＶＡ２のリングフィンガー変異もｄＴＲＡＦ３の産出を防止した。ＮＩＫ誘導およびＳＩＶＡ２誘導の双方のｄＴＲＡＦ３形成が、リポソームまたはカスパーゼ阻害によってではなく、プロテアソーム阻害によって防止された。ＳＩＶＡ２およびＮＩＫによるＤ３４７Ａ変異体ＴＲＡＦ３の処理（Lee et al., 2001）も本工程が、カスパーゼに依存しないことを示した。これは、ＴＲＡＦ３のプロテアソーム−依存処理におけるＫ６３ユビキチン化の関与を示している重要な発見である。ＳＩＶＡ２は、ＴＲＡＦ３のＫ６３ユビキチン化のためのＥ３であり得、ＴＲＡＦ３の処理において、ＮＩＫが、アダプターとして、またはキナーゼとして機能し得る。これらの知見は、ＳＩＶＡ２と協調可能な、ＮＩＫおよびＴＲＡＦ３の相互調節を示している。
ＴＲＡＦ３のリングフィンガーは、ＳＩＶＡ２によるＴＲＡＦ３のユビキチン化またはその後のｄＴＲＡＦ３の産生に貢献していないけれども、タンパク質の可溶性の誘導された変化に対して、主要なインパクトを有することが分かった。明らかに、リングフィンガー変異体ＴＲＡＦ３が、大量にユビキチン化され、トリトン不溶性コンパートメント中に留まるが、これは、ＴＲＡＦ３トラフィッキングにおけるリングフィンガーに関する役割を示している。
ＳＩＶＡがＴＲＡＦ３のユビキチン化を誘導することが可能であることが本発明にしたがって分かったので、（ｉ）ＳＩＶＡポリペプチドの存在下または非存在下で、ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２、ＴＲＡＦ３ポリペプチド、および任意にＥ３を含むポリペプチドを接触させること、（ii）ＳＩＶＡポリペプチドの存在下および非存在下で、ＴＲＡＦ３ポリペプチドのユビキチン化のレベルを測定すること、および（iii）ＳＩＶＡポリペプチドの存在下および非存在下におけるＴＲＡＦ３のユビキチン化のレベルを比較することを含み、ＳＩＶＡポリペプチドの存在下におけるＴＲＡＦ３のユビキチン化のレベルの増加が、ＳＩＶＡポリペプチドが、直接または間接ユビキチン化関連活性を有することを示す、直接または間接ユビキチン化関連活性を有するＳＩＶＡポリペプチドを同定するための方法が提供される。本発明の１つの実施形態において、ＮＩＫポリペプチドを段階（ｉ）において加えてよい。
本発明の１つの代表的な実施形態において、細胞に基づくアッセイを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のような細胞内へ共トランスフェクトした、ＴＲＡＦ３プラスミド、ＮＩＫプラスミドおよびユビキチンプラスミドを用いて実施する。使用可能なプラスミドの量は、ＴＲＡＦ３、ＮＩＫおよびユビキチンに関してそれぞれ、約３、４および４μｇであり、約４μｇの同一量のプラスミドを各タンパク質に対して使用することが可能である。細胞をトランスフェクション２４時間後に回収し、全溶解物を抗ＴＲＡＦ３抗体を用いるウエスタンブロッティングによって解析して、ユビキチン化ＴＲＡＦ３を表す改変ＴＲＡＦ３形態を確認する。
本発明の他の代表的な実施形態において、細胞に、ＨＩＳ−ＴＲＡＦ３、ＦＬＡＧ−ＳＩＶＡ２およびＨＡ−ユビキチン Ｋ４８Ｒをトランスフェクトし、溶解し、溶解物の抗ＨＩＳ免疫沈降物を、抗ＨＡ抗体を用いるウエスタンブロッティングにかける。使用可能なプラスミドの量は、ＨＩＳ−ＴＲＡＦ３、ＦＬＡＧ−ＳＩＶＡ２およびＨＡ−ユビキチンに関して、それぞれ６、６および４μｇ／ｍｌである。１つの他の実施形態において、溶解物を、抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降させて、ＳＩＶＡ２を沈殿させ、ウエスタンブロットにおいて、抗−ＴＲＡＦ３でプローブ化する。
さらなる態様において、本発明は、候補薬剤の存在下または非存在下で、以上の方法を実施することによって、ＮＩＫおよび／またはＴＲＡＦ３ポリペプチドにおけるＳＩＶＡポリペプチドの直接または間接ユビキチン化関連活性を調節可能な候補薬剤を同定するための方法を提供し、そこで、候補薬剤の存在下における、前記ＮＩＫおよび／またはＴＲＡＦ３ポリペプチドのユビキチン化のレベルの変化が、候補薬剤が、ＮＩＫおよび／またはＴＲＡＦ３ポリペプチドにおけるＳＩＶＡのユビキチン化関連活性を調節することが可能であることを示す。候補分子は小分子であることができる。
本発明によれば、ＳＩＶＡリングフィンガー変異体による、ＮＩＫおよびＮＩＫ Ｋ６７０Ａの分解の後、ＳＩＶＡ２中のリングフィンガー変異体が、そのリシン６７０変異によって達成されるＮＩＫの保護を無効にし、ＳＩＶＡ２リングフィンガー変異体とのその共発現に際して、ＮＩＫ Ｋ６７０Ａの効果的な分解という結果を生じることが見出された。１つの可能性のある説明は、双方がＳＩＶＡ２によって仲介された、２つの反対の型のＮＩＫのユビキチン化が存在することである。一時的インビボユビキチン化実験において、本発明にしたがって、ＳＩＶＡ２が、ＮＩＫのＫ４８およびＫ６３型のユビキチン化を促進すること、および、ＳＩＶＡ２ Ｎ−末端が、ＮＩＫのＫ４８ユビキチン化および分解に関与すること、が分かった。ＳＩＶＡ２ １−５８によってではなく、ＳＩＶＡ２によるＮＩＫのＫ６３ユビキチン化の、そして変異体ＳＩＶＡ２リングフィンガーの、ＮＩＫのユビキチン化を干渉する能力の、これらの２つの観察をつなぐと、リングフィンガーが、Ｋ６３ユビキチン化に関与する可能性が非常に高いようである。一貫して、ＮＩＫ Ｋ６７０ＡおよびＳＩＶＡ Ｃ７３Ａが一緒に発現した場合、ＮＩＫが、リシン６７０以外の部位での、Ｋ４８型のユビキチン化のみを有する。Ｋ６３ユビキチン化の安定化がない状態において、残りのＫ４８ユビキチン化が一般的であり、結果として、ＮＩＫの効果的な分解となる。言い換えれば、ＳＩＶＡ２中のリングフィンガー変異が、ＮＩＫ Ｋ６７０Ａ変異が、ＳＩＶＡ２によるＮＩＫ分解に対しても、保護効果を中和するようにみられる。ＮＩＫのＳＩＶＡ２誘導Ｋ６３ユビキチン化のさらなる確認が、ＳＩＶＡ２との共発現に際した、ＮＩＫ−Ｋ６３ユビキチン化上、変異体Ｕｂｃ１３、Ｋ６３特異的Ｅ２（Deng et al., 2002）、およびＣＹＬＤ、Ｋ６３特異的デユビキチナーゼ（Kovalenko et al., 2003）の阻害効果から得られた。ＳＩＶＡ２のインビトロ自己−Ｋ６３ユビキチン化もインビボおよびインビトロの双方で、リングフィンガー変異によって防止されたので、Ｋ６３ユビキチン化が、ＳＩＶＡ２のリングフィンガーの独占的な機能であるようである。
ＳＩＶＡは、非常に低いレベルで、基底部に発現し、ＳＩＶＡ抑制の弱い効果に関する１つの可能性は、ＳＩＶＡがその機能を、そのレベルのアップレギュレーションに際してのみ発揮するということであるとすることができる。適切に、ＳＩＶＡがストレス誘導タンパク質であること、および上昇したＳＩＶＡレベルが細胞死を引き起こすことが示された（Fortin et al., 2004; Henke et al., 2000; Padanilam et al., 1998）。これに沿って、構成的および誘導可能な発現の双方において、ＳＩＶＡ２が、ＣＤ２７およびＣＤ４０誘導ＮＦ−κＢ活性化を干渉した。このＮＩＫ−仲介の他のＮＦ−κＢ経路の阻害が、ＳＩＶＡ２の、ＮＩＫの分解を引き起こす能力をもっとも良好に反映しているようである。これに基づいて、ＳＩＶＡ２による生存促進の役割をダウンレギュレートすることが、ストレスの状態における後者のアポトーシス的役割に寄与すると推測したくなる。
ＳＩＶＡは少量な細胞タンパク質であり、通常非常に低いレベルで発現し、強力な生物学的効果を発揮することが可能である。ＮＩＫは、ＳＩＶＡを直接リン酸化することによって、ＳＩＶＡを安定化することにおいて、重要な役割を果たすようである。一貫して、キナーゼ不活性ＮＩＫが、ＳＩＶＡ２発現を安定化できない。キナーゼ不活性ＩＫＫ１またはＩＫＫ２いずれもが、インビトロキナーゼアッセイにおいて、ＮＩＫ誘導ＳＩＶＡ２リン酸化を干渉できず、これは、ＳＩＶＡ２が真の新規ＮＩＫ基質であることを示している。多くの細胞タンパク質のリン酸化が、そのユビキチン化を進める（Karin and Ben-Neriah, 2000）。ＮＩＫによるリン酸化は、ＳＩＶＡ２のユビキチン化機能に対する必要条件であることができる。
メカニズムにとらわれずに、活性化に際してＮＩＫがＳＩＶＡをリン酸化して、その安定化を導く、プログラムされた微調整系として見ることが可能なタンパク質改変および分解メカニズムの複合制御が本明細書で示されている。後者のＮＩＫが、その安定化−誘導Ｋ６３ユビキチン化のために、そしてＮＩＫ機能の阻害剤であるＴＲＡＦ３の開裂のために、ＳＩＶＡを利用する。一旦細胞がＮＩＫシグナル伝達の終結を必要とした場合、ＳＩＶＡがおそらく、ＮＦ−κＢ活性化の結果として合成された新規タンパク質と結合し、ＮＩＫ分解に影響を与える、Ｋ４８ユビキチン化複合体を形成する。おそらく、これが、ＮＩＫシグナル伝達を制限する自己制御ループとして働き、ストレスがさらにＳＩＶＡレベルをアップレギュレートする場合、生存経路を阻害し、アポトーシスを誘導するために機能する。これらの結果は、ＳＩＶＡが、反対の結果を有する、ＮＩＫユビキチン化において二重効果を有することを示している。ＮＩＫレベルの増強およびそれによる低用量のＳＩＶＡ２の共発現からの結果であるその機能が、よくＮＩＫレプレッサー、たとえばＴＲＡＦ３の抑制の結果であることができる。したがって、ＳＩＶＡ２は、インビボにおいて、ＴＲＡＦ３をユビキチン化し、分解し、結果としてＮＩＫレベルの上昇となる。
ＳＩＶＡ活性の正確な位置、すなわち膜、または細胞質内を同定することもその正確な機能を定義するためにきわめて重要である。それによってＳＩＶＡが同定されたＣＤ２７レセプターに加えて、２つの他の膜レセプターもＳＩＶＡに直接結合することが示された。これらの１つがＧＩＴＲ、Ｔ細胞において主に発現するＴＮＦＲファミリーメンバーであり、アポトーシスおよびＮＦ−κＢ活性化経路の双方に関与する（Spinicelli et al., 2002, Nocentini et al., 2005）。ＣＤ４は、ＳＩＶＡに結合すると言われている第三の膜レセプターであり、この結合が、カスパーゼ依存ミトコンドリア経路を介して、ＣＤ４＋ Ｔ細胞のアポトーシスを調節することが示される（Petit et al., 2004）。
ＳＩＶＡが、ＣＤ２７、ＧＩＴＲおよびＯＸ４０中のＴＲＡＦ２結合部位に結合することが示された（Spinicelli et al., 2002）けれども、これに関して現実の証拠は存在しなかった。これは、おそらく、ＮＩＫ、ＴＲＡＦ２の真実のアダプターが、一時的の発現においてＮＩＫを分解し、ＳＩＶＡ２が、ＴＲＡＦ２誘導分解からＮＩＫを保護したことが本明細書で分かったという事実によって、ＳＩＶＡの膜動員がとりわけ重要である。さらに、ＴＲＡＦ２が最近、他のＮＦ−κＢ経路のネガティブ調節物として働くことが示された（Grech et al., 2004）。ＮＩＫ、ＴＲＡＦ２相互作用タンパク質の機能が、他のＮＦ−κＢ経路にとってきわめて重大であるので、理論的に、ＴＲＡＦ２の、代替経路を阻害するこの新規の役割は、ＴＲＡＦ２によって誘導されたＮＩＫ分解による結果であり得る。ＳＩＶＡ２が、ＮＩＫを安定化することにおける外来レベルで任意の役割を果たすかどうかが、一旦、ＳＩＶＡ２がＴＲＡＦ２を介して、レセプター、たとえばＣＤ２７へ動員されるならば、興味をそそる疑問である。これにそって、ＣＤ２７レセプターに動員されたＴＲＡＦ２が、著しくユビキチン化されることが分かり、ＮＩＫを動員しないＴＮＦレセプターに対して動員されたＴＲＡＦ２から区別される。本明細書において、結果によって、変異体ＳＩＶＡ２Ｃ７３Ａではなく、ＳＩＶＡ２が直接、ＴＲＡＦ２ Ｋ６３ユビキチン化を誘導することが示されている。ＴＲＡＦ５は、ＴＲＡＦ２の近位の機能的および構造的相同体であると考えられており、これらは共に、ＮＦ−κＢ活性化に関与する（Chung et al., 2002）。ＴＲＡＦ２は、それほどではないにしろ、ＴＲＡＦ６に似ており、一方で、ＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ３とは有意に異なる。
本発明にしたがって、組換え体ＨＩＳ−ユビキチン−Ｋ６３のみ（Ｋ６３以外のユビキチン中の全てのリシンが、アルギニンに変異している組換え体ＨＩＳ−ユビキチン、ボストン バイオケム）（８μｇ）、Ｅ１（０．２μｇ）、Ｅ２（０．５μｇ）、および１−２μｇの組換え体ＧＳＴ−ＳＩＶＡまたはＦＬＡＧタグ化ＴＲＡＦ２を含むＧＳＴ−ＳＩＶＡＣ７３Ａを含む、５０μｌ反応溶液において実施したインビトロユビキチン化アッセイにおいて、ＦＬＡＧタグ化ＴＲＡＦ２が一時的に発現し、抗ＦＬＡＧ Ｍ２ ＳＩＶＡ２を用いて精製されたが、変異体ＳＩＶＡ２ Ｃ７３Ａが直接ＴＲＡＦ２のＫ６３ユビキチン化を誘導することが示された。一致して、Ｒａｍｏｓ細胞中のＳＩＶＡ−Ｃ末端を発現することが、Ｂ細胞中のＴＲＡＦ２欠損を摸倣し、したがって、ＳＩＶＡ−Ｃが、過剰なＴＲＡＦ２活性または発現に関連した、またはＴＲＡＦ２の阻害に応答する疾患において使用することが可能である。ｓｉＲＮＡによる細胞中のＳＩＶＡのサイレンシングを、ＴＲＡＦ２の活性または発現が減少した、またはＴＲＡＦ２の増強に応答する疾患で使用することが可能である。ＴＲＡＦ２はＳＩＶＡ２に結合し、結合は、ＳＩＶＡ２およびＳＩＶＡ２ １−８１においてのように、リングフィンガーが存在する時にのみ発生する。ＴＲＡＦ２リングフィンガー変異体は、ＳＩＶＡ２へ結合する能力を保持していた。ＳＩＶＡは、そのリングフィンガーの機能として、ＨＥＫ ２９３Ｔにおいて、ＴＲＡＦ２のＫ４８ユビキチン化を増強する。
本発明にしたがって、ＳＩＶＡ２は、Ｒａｍｏｓ細胞中、ＣＤ２７レセプターに動員されたＴＲＡＦ２のユビキチン化を制御することが示された。ＣＤ２７レセプターに動員されたＴＲＡＦ２ユビキチン化におけるＳＩＶＡのサイレンシングの効果を調査した。本目的のために、２９３−ＣＤ２７細胞を、ｐＳＵＰＥＲ ＳＩＶＡでトランスフェクトした。４８時間後、細胞を、ＦＬＡＧ−ＣＤ７０で処理して、ＴＲＡＦ２のＣＤ２７レセプターへの動員を誘導した。細胞を溶解し、ＣＤ２７レセプター複合体を、抗−ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫沈降した。ＴＲＡＦ２に結合したレセプターを、抗−ＴＲＡＦ２抗体でプローブ化した。ｐＳＵＰＥＲ ＳＩＶＡトランスフェクト細胞を、ＣＤ７０刺激に続く細胞質中のＴＲＡＦ２のレベルに関して、対照ｐＳＵＰＥＲトランスフェクト細胞と比較した。ＣＤ７０トリガー化が、結果として、ＳＩＶＡ依存様式でのＴＲＡＦ２の分解となった。
したがって、他の態様において、本発明は、（ｉ）ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２およびＳＩＶＡポリペプチドを、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ５またはＴＲＡＦ６ポリペプチドと接触させること、（ii）および前記ユビキチンが、前記ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ５またはＴＲＡＦ６に結合するかどうかを決定することを含み、前記ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ５またはＴＲＡＦ６ポリペプチドに結合した前記ユビキチンの検出が、前記ＳＩＶＡポリペプチドがユビキチン化関連活性を有することを示す、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ５またはＴＲＡＦ６におけるユビキチン化関連活性を誘導可能なＳＩＶＡポリペプチドを同定するための方法に関する。
本発明の１つの実施形態において、以下の反応液を調製する。反応液には、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６、５ｍＭ ＭａＣｌ２、２ｍＭ ＡＴＰ、０．２ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭリン酸クレアチニン、０．２μｇ／ｍｌクレアチニンキナーゼおよび５μＭユビキチンアルデヒドを含む緩衝液中、組換え体ＨＩＳ−ユビキチンまたは組換え体ＨＩＳ−ユビキチン−Ｋ６３のみ、Ｅ１、Ｅ２（Ｕｂｃ１３／Ｕｅｖ１ヘテロダイマー）（Ｅ１およびＥ２の双方を、ボストン バイオケム（Boston Biochem）より購入した）、およびＦＬＡＧタグ化ＴＲＡＦ２との組換え体ＧＳＴ−ＳＩＶＡまたはＧＳＴ−ＳＩＶＡ Ｃ７３Ａが含まれる。ＦＬＡＧタグ化ＴＲＡＦ２を、ｐｃＦＬＡＧ ＴＲＡＦ２をＨＫ ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトすることによって調製することが可能である。トランスフェクション２４時間後、細胞を溶解緩衝液を含む１％ Ｔｒｉｔｉｏｎ Ｘ１００中に溶解し、抗ＦＬＡＧ Ｍ２ビーズ（シグマ（Sigma））を用いて免疫沈降させる。免疫沈降したＴＲＡＦ２を、ＦＬＡＧペプチドで溶出し、マイクロコンカラム（ＭＷＣＯ３０００）を用いて濃縮し、インビトロユビキチン化反応で使用する。反応液を、３０℃で１時間インキュベートする。ＴＲＡＦ２を、抗−ＦＬＡＧ Ｍ２ビーズを用いて、４℃で４時間、免疫沈降する。免疫沈降物を、抗ＴＲＡＦ２（Ｈ２４９、サンタクルズ（Santacruz））抗体でのウエスタンブロッティングにかける。
さらなる態様において、本発明は、候補薬剤の存在下または非存在下で、以上の方法を実施することにより、候補薬剤が存在下における前記ＴＲＡＦ２のユビキチン化のレベルの変化が、その候補薬剤が、ＴＲＡＦ２ポリペプチドにおける、ユビキチン化関連活性を調節することが可能であることを示す、ＴＲＡＦ２ポリペプチドにおけるＳＩＶＡポリペプチドのユビキチン化関連活性を調節可能な候補薬剤を同定するための方法を提供する。候補分子は小分子であり得る。
興味深いことに、ＳＩＶＡタンパク質は、任意のＨｉｓ残基（ＣＳＳＣＶＲＡＶＤＧＫＡＶＣＧＱＣＥＲＡＬＣＧＱＣＶＲＴＣＷＧＣ、配列番号６）を欠く固有のボックス−Ｂ様リングフィンガーを有し、そのＣ−末端に亜鉛フィンガーを有する（Prasad et al., 1997）。他のＢ−ボックス含有タンパク質の特徴である、アミノ−末端リングフィンガーおよびカルボキシ−末端コイルド−コイルドメイン構造が、ＳＩＶＡ中では存在しない。かわりに、ＳＩＶＡのボックス−Ｂ様リングフィンガーが、カルボキシル末端中、Ｃｙｓ−リッチ領域を有する。ＳＩＶＡの亜鉛／リングフィンガー領域が、我々の注目をＣＤ２７シグナル伝達におけるＮＩＫの可能性ある関与に対して最初に指し示した、ＮＩＫ Ｃ−末端に結合することが、（２ハイブリッドスクリーニングによって調査された）本発明者らの発見である。現在までに、ＳＩＶＡのボックス−Ｂ様リングフィンガーにはなんの機能も帰属されておらず、ユビキチン研究が、シグナル領域で開拓されたここ十年間で、本発明にしたがって、ＳＩＶＡのボックス−Ｂ様リングフィンガーと関連すると発見された、強力なリングフィンガー「Ｅ３リガーゼ」活性が見落とされていたことは非常に驚くべきことである。
したがって、他の態様において、本発明は、（ｉ）ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２、配列番号６のＢ−ボックス様リングを有するポリペプチドまたはその相同体、および任意にＴＲＡＦ２を接触させること、（ii）および、前記ユビキチンが、Ｂ−ボックス様リングを有する前記ポリペプチドに、またはＴＲＡＦ２に連結するかどうかを検出することを含み、Ｂ−ボックス様リングを有する前記ポリペプチドへ、またはＴＲＡＦ２へ連結したユビキチンの検出が、Ｂ−ボックス様リングを有する前記ポリペプチドが、ユビキチン化関連活性を有することを示す、配列番号６のＢ−ボックス様リングを有するポリペプチドまたはその相同体のユビキチン化関連活性を試験する、または同定するための方法に関する。
２つ以上の構造は、起源を共有しているために似ている場合に、相同的であると言われる。タンパク質およびＤＮＡの間の相同性はしばしば、とりわけバイオインフォマティックスにおいて、配列類似性に基づいて結論づけられる。たとえば、一般的に、２つの遺伝子がほとんど同一のＤＮＡ配列を有する場合、それらが相同的である可能性が高い。タンパク質配列を、互いに相同的な配列の組である、配列ファミリーにクラスター化するための多くのアルゴリズムが存在している。配列の相同性は、オルソログおよびパラログという、２つの型であることができる。共通の先祖から由来する２つの異なる種における２つの類似遺伝子はオルソログである。相同的配列は、それらが種分化（speciation）事象によって分かれた場合にオルソログである。つまり、遺伝子がある種に存在し、そしてその種が２つの種に分岐し、ついで得られた種におけるこの遺伝子の分岐コピーがオルソログである。オルソログの第二の定義は、非常に類似の機能を有する２つの異なる種における任意の２つの遺伝子を描写する。相同的配列は、遺伝子複製事象によって分かれる場合、パラログである。器官中の遺伝子が複製されて、同一のゲノム中の２つの異なる部位を占領する場合、２つのコピーはパラログである。ミオグロビンおよびヘモグロビンをコードしている遺伝子が、古いパラログであると考えられる。
さらなる態様において、本発明は、候補薬剤の存在下または非存在下で、以上の方法を実施することにより、そこで、候補薬剤の存在下における、Ｂ−ボックス様リングを有する前記ポリペプチドの、またはＴＲＡＦ２ポリペプチドのユビキチン化のレベルの変化が、候補薬剤が、配列番号６のＢ−ボックス様リングを有するポリペプチドまたはその相同体のユビキチン化関連活性を調節することが可能であることを示す、前記ポリペプチドにおける、またはＴＲＡＦ２ポリペプチドにおける、配列番号６のＢ−ボックス様リングを有するポリペプチドまたはその相同体のユビキチン化関連活性を調節可能な候補薬剤を同定するための方法を提供する。候補分子は小分子であることができる。
配列番号６のＢ−ボックス様リングを有するポリペプチドまたはその相同体の例には、ＨＩＳを欠くＢ−ボックスリングフィンガーモチーフを有するポリペプチドが含まれる。
本発明の１つの実施形態において、Ｂ−ボックス様リングを有するポリペプチドは、ＳＩＶＡポリペプチドである。
ユビキチン化されたタンパク質またはポリペプチドは、本発明で例示したようなウエスタンブロットによって、または本技術分野で公知の任意の他のアッセイによって、検出することが可能である。
言及したように、ＳＩＶＡは通常は非常に低レベルで発現し、強力な生物学的効果を発揮可能な、マイナーな細胞タンパク質である。ＮＩＫは、ＳＩＶＡを安定化させることにおいて、重要な役割を果たすようである。同様に、高用量のＳＩＶＡ２もまた、共発現したＮＩＫを分解し、この効果は、プロテアソーム阻害によって低下した。本発明にしたがって、ＳＩＶＡ２はまた、ＮＩＫのＫ４８ユビキチン化を誘導することがわかり、ＮＩＫ中のＫ６７０残基の変異によって著しく減少した。一緒に考えると、これらの観察は、古典的なユビキチン−プロテアソーム経路を介した、ＳＩＶＡ２によるＮＩＫの調節を指摘している（Glickman and Ciechanover, 2002）。興味深いことに、ＳＩＶＡ過剰発現に対する応答での、Ｋ４８ユビキチン化とＮＩＫの分解両方が、ＳＩＶＡリングフィンガー領域が完全にない状態、ならびに触媒的に不活性なＳＩＶＡリングフィンガー変異体ででさえ発生し、これは、ＳＩＶＡが、Ｋ４８ユビキチン化を誘導するためのＮＩＫの直接Ｅ３ではない可能性を示す。ＳＩＶＡは、ユビキチン化を仲介するために、タンデムで働くアクセサリーＥ３を必要とし得る。ＳＩＶＡは、ＯＳＴＬと呼ばれる他のリングフィンガータンパク質に結合することが示された。ＯＳＴＬは、Ｂ−ボックス様リングフィンガーモチーフを含み、Ｂ細胞シグナル伝達および生存における役割を有することが前提となるので、Ｅ３アクセサリータンパク質であり得る（Fontanari Krause et al., 2003）。同様に、ＴＲＡＦ３もその分解を引き起こす、ＮＩＫの間接ユビキチン化酵素として報告された（Liao et al., 2004）。しかしながら、本発明にしたがって、ＴＲＡＦ３は、同様の効果で、野生型ＮＩＫおよびＮＩＫ Ｋ６７０Ａ変異体両方を分解することがわかり、これは、ＳＩＶＡ２およびＴＲＡＦ３仲介ＮＩＫ分解に関与する分子メカニズムが異なることを示している。ＳＩＶＡ２およびＴＲＡＦ３は、ＮＩＫをユビキチン化するために、共動作して機能し得る。
言及したように、本発明にしたがって、高濃度のＳＩＶＡが、ＳＩＶＡのｃ−末端がない状態でさえも、ＮＩＫ分解を誘導することがわかった。また、本発明にしたがって、ＳＩＶＡ１でなく、ＳＩＶＡ２が、ＴＲＡＦ３のＮＩＫ誘導開裂を著しく増補することがわかった。これは、ＳＩＶＡの２つのスプライス変異体間の機能的差違を示した最初の観察である。ＳＩＶＡ２とＴＲＡＦ３の直接結合が、弱くだけ発生したにも関わらず、野生型またはキナーゼ死ＮＩＫの存在が、その相互作用を著しく安定化させた。結合が、ＮＩＫのキナーゼ機能によって影響を受けないｐ１００−ＮＩＫ−ＩＫＫ１複合体の場合（Xiao et al., 2004）のように、ここで、ＮＩＫもＴＲＡＦ３とＳＩＶＡ２を連結するアダプタータンパク質の役割を果たすことが明らかである。これは、ＮＩＫとＳＩＶＡ２の共動作による、ＮＩＫ−ＳＩＶＡ２−ＴＲＡＦ３複合体の形成、ＴＲＡＦ３開裂およびユビキチン化が観察された最初である。
したがって、他の態様において、本発明は、ＳＩＶＡポリペプチドを、ＮＩＫおよび／またはＴＡＲＦ３ポリペプチドと接触させること、およびＮＩＫおよび／またはＴＲＡＦ３ポリペプチドの分解を検出することを含み、ＮＩＫおよび／またはＴＲＡＦ３の全または部分分解の検出が、前記ＳＩＶＡポリペプチドのタンパク質分解を誘導する能力を示す、タンパク質分解を誘導可能なＳＩＶＡポリペプチドを同定するための方法に関する。
方法は、インビトロで実施可能であり、または細胞に基づく方法であり得る。１つの代表的な実施形態において、以下の細胞に基づく方法が取り組まれる。細胞を、野生型ＮＩＫ（０．５μｇプラスミド）またはＮＩＫ Ｋ６７０Ａ変異体をコードしているプラスミドと、そして増加濃度のＳＩＶＡ２コードプラスミド（たとえば１．０、２．０および３．０μｇプラスミド）と、および／またはＴＲＡＦ３コードプラスミドと、共トランスフェクトする。トランスフェクション後、細胞を溶解し、ＮＩＫおよび／またはＴＲＡＦ３の分解を、特異的抗体を用いるウエスタンブロット解析によって検出する。アクチンをローディング対照として使用可能である。
さらなる態様において、本発明は、候補薬剤の存在下または非存在下で、上記方法を実施することによって、そこで、候補薬剤の存在下における、ＮＩＫおよび／またはＴＲＡＦ３の全または部分分解のレベルにおける変化が、候補薬剤が、ＳＩＶＡによるＮＩＫおよび／またはＴＲＡＦ３の全または部分分解を調節可能であることを示す、前記ＳＩＶＡポリペプチドのタンパク質分解を誘導する能力を調節可能な候補薬剤を同定するための方法を提供する。候補分子は小分子であり得る。
他の態様において、本発明は、候補薬剤の存在下または非存在下で、ＮＩＫ、ＴＲＡＦ３およびＳＩＶＡの複合体を形成させること、およびＮＩＫ、ＴＲＡＦ２およびＳＩＶＡポリペプチド結合を調節する候補薬剤の能力を検出すること、を含む、ＮＩＫ、ＴＲＡＦ３およびＳＩＶＡポリペプチドリングの複合体の結合を調節可能な薬剤の同定に関し、そこで、複合体形成を変化させることができる候補分子が、ＮＩＫ、ＴＲＡＦ３およびＳＩＶＡの結合を調節可能な薬剤である。たとえば、細胞に、ＮＩＫポリペプチドあり、またはなしで、ＳＩＶＡポリペプチドおよびＴＲＡＦポリペプチドをコードしているプラスミドそれぞれをトランスフェクトし、試験薬剤の存在下または非存在下で、インキュベートしてよい。トランスフェクション２４時間後、全溶解物を、ＳＩＶＡを沈殿させる抗体によって免疫沈降可能であり、免疫沈降物を、抗ＴＡＲＦ３でウエスタンブロットにてプローブ化可能である。ＳＩＶＡおよびＮＩＫによって仲介されるＴＲＡＦ−２の共沈殿を阻害または誘導可能な試験試薬は、前記ＮＩＫ−ＳＩＶＡ２−ＴＲＡＦ３複合体の形成を調節する薬剤である。この薬剤は、ＮＩＫ−ＳＩＶＡ２−ＴＲＡＦ３複合体のレベルを増加、または減少可能である。
さらなる態様において、本発明は、ＮＩＫ、ＴＡＲＦ３およびＳＩＶＡを含む三部分複合体を提供する。
本発明にしたがって、メカニズムにとらわれることなく、活性化の際にＮＩＫがＳＩＶＡ安定化を導くプログラムされた微調整系としてみられる、タンパク質改変および分解メカニズムの複合調節が示された。後者のＮＩＫは、その安定化誘導Ｋ６３ユビキチン化のため、およびＮＩＫ機能の阻害剤である、ＴＲＡＦ３を開裂するために、ＳＩＶＡを利用する。一旦細胞がＮＩＫシグナル伝達の終結を必要とした場合、ＳＩＶＡがおそらく、ＮＦ−κＢ活性化の結果として合成された新規タンパク質と結合し、ＮＩＫ分解に影響を与える、Ｋ４８ユビキチン化複合体を形成する。おそらく、これが、ＮＩＫシグナル伝達を制限する自己制御ループとして働き、ストレスがさらにＳＩＶＡレベルをアップレギュレートする場合、生存経路を阻害し、アポトーシスを誘導するために機能する。これらの結果は、ＳＩＶＡが、ＮＩＫユビキチン化において反対の結果を有する二重効果を有することを示している。ＮＩＫレベルの増強およびそれによる低用量のＳＩＶＡ２の共発現からの結果であるその機能が、よくＮＩＫレプレッサー、たとえばＴＲＡＦ３の抑制の結果であり得る。したがって、ＳＩＶＡ２は、インビボにて、ＴＲＡＦ３をユビキチン化し、分解し、結果としてＮＩＫレベルの上昇となる。
ＳＩＶＡ活性の実際の局所、すなわち膜で、または細胞質で、を同定することもその実際の機能を定義するためにきわめて重要である。それによってＳＩＶＡが同定されたＣＤ２７レセプターに加えて、２つの他の膜レセプターもＳＩＶＡに直接結合することを示した。これらの１つがＧＩＴＲ、Ｔ細胞にて主に発現するＴＮＦＲファミリーメンバーであり、アポトーシスおよびＮＦ−κＢ活性化経路の両方に関与する（Spinicelli et al., 2002, Nocentini et al., 2005）。ＣＤ４は、ＳＩＶＡに結合すると言われている第三の膜レセプターであり、この結合が、カスパーゼ依存ミトコンドリア経路を介して、ＣＤ４＋ Ｔ細胞のアポトーシスを調節することが示される（Petit et al., 2004）。
本発明によるこれらの発見に基づいて、ＳＩＶＡ基質である好ましい候補は、ＮＩＫ、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、そしておそらくＴＲＡＦ５およびＴＲＡＦ６である。ＳＩＶＡ、ＮＩＫ、ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ３の制御されない活性が、ウイルス感染の病因（ＴＲＡＦ２＆３、ＮＩＫ、ＳＩＶＡ）、化学療法の副作用（ＳＩＶＡ）、虚血再灌流の副作用（ＳＩＶＡ）、ＳＩＶＡのアップレギュレーションに関連した状態、ＮＩＫに依存した方法での他のＮＦ−κＢ経路の活性化に関連した自己免疫疾患（ＴＲＡＦ２＆３、ＳＩＶＡ）および制御されていないリンパ球活性に関連した疾患（ＮＩＫ、ＳＩＶＡ、ＴＲＡＦ２＆３）のような、特定の疾患、障害または症状に関連する。たとえば、ＴＲＡＦ２アップレギュレーション／活性化が、過剰な免疫活性化および炎症に関連する。ＮＩＫアップレギュレーション／活性化は、自己免疫状態および癌に関連する。ＴＲＡＦ３アップレギュレーション／活性化はおそらく免疫不全に関連する。ＳＩＶＡアップレギュレーション／活性化は、化学および放射療法副作用に、そして虚血および虚血再灌流に関連する。したがって、ＳＩＶＡポリペプチドの、または配列番号６のＢ−ボックス様リングを有するポリペプチド、またはその相同体の、ユビキチン化関連または分解関連活性の調節、すなわち活性化または阻害が、前記疾患、症状または障害を治療するため、または予防するために有益であり得る。
したがって、１つの態様において、本発明は、その病因または経過が、ＴＲＡＦ２、ＮＩＫ、ＴＲＡＦ３および／またはＳＩＶＡの活性および／またはレベルに関連する、疾患、障害または症状の治療または予防のための医薬の製造における、配列番号６中の配列またはその相同配列のＢボックス様リングを有するポリペプチドの、直接または間接ユビキチン化関連活性を調節可能な薬剤の使用を提供する。
本発明は、ＳＩＶＡ、ＳＩＶＡポリペプチドの、または配列番号６のＢ−ボックス様リングを有するポリペプチドまたはその相同体の、ユビキチン関連活性を調節可能な候補薬剤を同定するための特定の方法を提供する。
本発明の方法にて選別可能な試験薬剤または候補薬剤の例には、限定はしないが、小有機分子、ペプチド（たとえば抗体）、核酸、および天然の抽出物からの分子、炭化水素または任意の他の基質が含まれる。試験薬剤には、たとえばコンビナトリアル化学によって作製された、合成有機化合物が含まれる。試験した化合物は、コンビナトリアル化学を介してのみでなく、また他のハイスループット合成法によっても得てよい。自動化技術によって、選別可能である、分子のライブラリー、異なる化合物の大きなコレクションの迅速な合成が可能である。より大きな、またはより異なった化合物ライブラリーを産出することが、ライブラリー内の有用な薬物を発見する可能性を増加させる。ハイスループットスクリーニングのために、ロボットを使用して、数千の化合物による、ＳＩＶＡ仲介ユビキチン化および／またはタンパク質分解の阻害または活性化を試験することができる。
本発明にしたがって、ＳＩＶＡ−Ｃ末端を構成的に発現しているＲａｍｏｓ細胞が、Ｂ細胞中ＴＲＡＦ２欠損を摸倣することが示された。ＴＲＡＦ２欠損Ｂ細胞は、高レベルのｐ５２（構成的異なるＮＦ−κＢ）およびＴＲＡＦ３（Grech et al., 2004）を提示する。同様に、本発明にしたがって、ＳＩＶＡ Ｃ末端を安定に発現するように遺伝子工学的に改変したＲａｍｏｓ細胞が、高レベルのｐ５２ならびにＴＲＡＦ３を示し、ＴＲＡＦ２の発現の減少を示す。ＳＩＶＡｃ発現の結果である超ＮＦ−κＢ活性化が、結果として、細胞からのＮＦ−κＢ依存免疫調節物の発現の増強となり得る。
したがって、本発明は、免疫系の調節によって、または調節を介して、疾患、障害または症状を治療するための医薬の製造における、ＳＩＶＡｃ、ＳＩＶＡ １〜５８、ＳＩＶＡ １〜８１およびＳＩＶＡ２Ｃ７３ＡのようなＳＩＶＡポリペプチド、およびＳＩＶＡのユビキチン関連またはタンパク質分解関連活性を調節可能な薬剤の使用を提供する。
本発明にしたがって、ＳＩＶＡ２はまた、ＮＩＫのＫ４８ユビキチン化を誘導し、これがＮＩＫ中のＫ６７０残基の変異によって著しく減少されたことがわかった。したがって、そのようなＮＩＫの変異体を、免疫系の調節に応答する疾患、障害または症状を治療するための医薬の製造において使用可能である。
本発明はまた、免疫疾患、障害または症状および／またはその病因または経過が、過剰なＮＦ−κＢ発現または活性に関連した疾患、障害または症状、および／または炎症または癌のような、その病因または経過が、ＮＩＫの過剰な活性に関連する疾患、障害または症状の治療のための医薬の製造における、ＮＩＫ−ＳＩＶＡ２−ＴＲＡＦ３複合体の形成を調節可能な薬剤の使用を提供する。
他の態様において、本発明は、ＳＩＶＡ１およびＳＩＶＡ２を除く、Ｂ−ボックス様リングフィンガーおよび／または亜鉛フィンガーモチーフを含むＳＩＶＡポリペプチドのＣ−末端断片を含む単離ポリペプチドのような、単離ポリペプチドを提供する。本発明は、配列番号３にて列記したような、ＳＩＶＡ２のアミノ酸残基５８〜１１０、Ｚｎフィンガーモチーフ１〜８１（配列番号５）を欠くＳＩＶＡポリペプチドのＮ−末端断片、ＳＩＶＡのＮ−末端断片を含むポリペプチド、ＳＩＶＡ２ １〜５８（配列番号４）のＺｎフィンガーモチーフおよびＢ−ボックス様リングフィンガーを欠くポリペプチド、配列番号４、配列番号５からなるポリペプチド、リングフィンガーモチーフに局在するシステイン残基にて変異されたＳＩＶＡポリペプチドを含むポリペプチド、リシン残基６７０に関するＮＩＫ変異体、またはそれらの断片のような単離ポリペプチドを提供する。
本明細書で使用するところの語句「変異タンパク質（muteins）」は、本来のタンパク質と比較して、得られる産物の活性が、相当変化することなしに、タンパク質の天然に存在する成分の１つ以上のアミノ酸残基が、異なるアミノ酸残基によって置換される、または欠損される、または１つ以上のアミノ酸残基がタンパク質の本来の配列に加えられる、タンパク質の類似体を意味する。これらの変異タンパク質は、公知の合成によって、および／または部位特異的変異導入技術によって、またはそのために好適な任意の他の公知の技術によって、調製される。
本発明による変異タンパク質には、ストリンジェントな条件下で、本発明にしたがって、タンパク質をコードしている、ＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリッド形成する、ＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸によってコードされるタンパク質が含まれる。語句「ストリンジェントな条件」は、「ストリンジェント」として通常当業者に引用される、ハイブリッド形成および続く洗浄条件を意味する。Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、上記、Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，§§６．３および６．４（１９８７，１９９２）およびＳａｍｂｒｏｏｋ ら（Sambrook,J.C., Fritsch,E.F.,およびManiatis,T.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）を参照のこと。
限定なしに、ストリンジェントな条件の例には、たとえば２×ＳＳＣおよび０．５％ ＳＤＳ、５分間、２×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳ、１４分間、０．１×ＳＳＣおよび０．５％ ＳＤＳ、３７℃で３０−６０分間、ついで０．１×ＳＣＣおよび０．５％ ＳＤＳ、６８℃で３０〜６０分間中の研究下、ハイブリッドの計算Ｔｍの１２〜２０℃下の洗浄条件が含まれる。当業者は、ストリンジェントな条件もＤＮＡ配列、（１０〜４０塩基のような）オリゴヌクレオチドプローブ、または混合オリゴヌクレオチドプローブの長さに依存することを理解する。混合プローブを使用する場合、ＳＳＣの代わりに、塩化テトラメチルアンモニア（ＴＭＡＣ）を用いることが好ましい。Ａｕｓｕｂｅｌ上記を参照のこと。
任意のそのような変異タンパク質は好ましくは、ＳＩＶＡと本質的に同様の、またはよりよい活性を有するためのような、ＳＩＶＡのアミノ酸配列に十分に重複したアミノ酸の配列を有する。たとえば、ＳＩＶＡの１つの活性は、自己またはＴＲＡＦ２ユビキチン化を誘導する能力である。ＳＩＶＡおよびＴＲＡＦ２ユビキチン化を測定するためのアッセイが、以下の実施例にて記述されている。ＳＩＶＡの任意の活性は、以下の実施例にて記述されたＮＩＫまたはＴＲＡＦ３の直接または間接ユビキチン化を誘導することである。ＳＩＶＡのさらなる活性は、以下の実施例にて記述されたような、ＮＩＫおよび／またはＴＲＡＦ３（全または部分）の分解のような、タンパク質分解を誘導することである。ＳＩＶＡの言及された活性の１つのような、変異タンパク質が十分な活性を持ち得る限り、ＳＩＶＡの本質的に同様な活性をもつことが考慮可能である。したがって、任意の該変異タンパク質が、以下の実施例において、ＳＩＶＡに関して示されたような日常の実験の方法によって、本発明のＳＩＶＡと少なくとも本質的に同一の活性を有するかどうかを決定可能である。
好ましい実施形態において、任意のそのような変異タンパク質は、ＳＩＶＡのアミノ酸配列と、少なくとも４０％同一性または相同性を有する。より好ましくは、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、またはもっとも好ましくは、少なくとも９０％同一性または相同性を有する。
同一性は、配列を比較することによって決定する、２つ以上のポリペプチド配列、または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関連を反映する。一般的に、同一性は、比較される配列の長さにわたる、それぞれ２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の、実際のヌクレオチドからヌクレオチド、またはアミノ酸からアミノ酸の相関を意味する。
実際の相関がない配列に関して、「パーセント同一性（percent identity）」を決定してよい。一般的に、比較すべき２つの配列を、配列間の最大相関を得るように並べる。これには、アライメントの程度を増強するために、１つまたは両方の配列いずれかに、「ギャップ」を挿入することが含まれ得る。パーセント同一性は、同一化、または著しく同様な長さの配列にとりわけ好適である、比較している配列のそれぞれの全長（グローバルアライメントと呼ばれる）、または不均等な長さの配列に対してより好適である、より短い、定義された長さにわたって（ローカルアリアメントと呼ばれる）決定してよい。
２つ以上の配列の同一性および相同性を比較するための方法が、本技術分野でよく知られている。したがってたとえば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，バージョン９．１（Devereux J et al 1984,Nucleic Acids Res.1984 Jan 11;12(1 Pt 1):387-95.）で入手可能なプログラム、たとえば、プログラムＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰを、２つのポリヌクレオチド間の％同一性、および２つのポリペプチド配列間の％相同性を決定するために使用してよい。ＢＥＳＴＦＩＴは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（J Theor Biol.1981 Jul 21;91(2):379-80およびJ Mol Biol.1981 Mar 25;147(1):195-7.1981）の「ローカル相同性」アルゴリズムを用い、２つの配列間の類似性の最適な単一領域を発見する。配列間の同一性および／または類似性を決定するための他のプログラムも本技術分野で公知であり、たとえば、ＢＬＡＳＴプログラムファミリー（www.ncbi.nlm.nih.govにてＮＣＢＩのホームページを通してアクセス可能、Altschul S F et al., 1990 J Mol Biol.1990 Oct 5;215(3):403-10, Proc Natl Acad Sci USA.1990 Jul;87(14):5509-13, Altschul SF et al, Nucleic Acids Res.1997 Sep 1;25(17):3389-402)およびFASTA(Pearson WR, Methods Enzymol.1990;183:63-98. Pearson J Mol Biol.1998 Feb 13;276(1):71-84）である。
本発明にしたがって使用可能なＳＩＶＡの変異タンパク質には、本明細書で示された教義およびガイドラインに基づいて、不必要な実験なしに、当業者によって日常的に得ることが可能な、置換ペプチドまたはポリペプチドとして、本質的に相当する配列の有限な組が含まれる。
本発明による変異タンパク質に対する好ましい変化は、「保存的（conservative）置換」として知られるものである。ＳＩＶＡの同類アミノ酸置換には、群のメンバー間の置換が、分子の生物学的機能を保存し得る十分に類似の生理化学的特性を有する群内の同義アミン酸が含まれ得る（Grantham Science. 1974 Sep 6;185(4154):862-4）。アミノ酸の挿入および欠失をまた、それらの機能を変化させないで、とりわけ挿入または欠失が、２、３個のアミノ酸、たとえば３０以下、好ましくは１０以下のみが関与する場合、そして機能的配座に重大であるアミノ酸、たとえばシステイン残基を除去または置換しない場合に、以上で定義した配列中で実施してよい。タンパク質および変異タンパク質は本発明の範囲内で生じる、こういった欠失および/または挿入により産出される。
ＳＩＶＡの変異タンパク質を得るため、本発明で使用するために使用可能なタンパク質内のアミノ酸置換の産出の例には、Ｍａｒｋらに付与された、米国特許第４，９５９，３１４号、第４，５８８，５８５号、および第４，７３７，４６２号、Ｋｏｔｈｓらに付与された、第５，１１６，９４３号、Ｎａｍｅｎらに付与された第４，９６５，１９５号、Ｃｈｏｎｇらに付与された第４，８７０，１１１号、およびＬｅｅらに付与された第５，０１７，６９１号にて示されたような任意の公知の方法、および米国特許第４，９０４，５８４号（Shaw et al）にて示されたリシン置換タンパク質が含まれる。
本発明の１つの実施形態において、ＳＩＶＡ変異タンパク質は、ＳＩＶＡのＢ−ボックス様リングフィンガーに局在するシステイン残基、好ましくはＳＩＶＡ２のシステイン残基７３にて変異されたものである。
本明細書で使用するところの「機能的誘導体（functional derivatives）」は、本技術分野で公知の方法によって、残基上の側鎖として発生する機能的基から調製してよく、Ｎ−またはＣ−末端基への添加である、ＳＩＶＡの誘導体、およびそれらの変異タンパク質をカバーし、それらが薬理学的に許容可能であるままである、すなわちＳＩＶＡと本質的に類似であるタンパク質の活性を破壊しない限り、本発明に含まれる。
「機能的誘導体」はまた、変化が、任意の従来の方法によって、ＳＩＶＡを構成しているアミノ酸の配列中に導入された、ＳＩＶＡを構成するマルチマーを含む。これらの変化には、ＳＩＶＡ分子の延長または切断、またはＳＩＶＡの１つ以上のアミノ酸の欠損または置換が含まれ得る。以上の変化のどれもが、ＳＩＶＡのユビキチン化および／または分解特性に影響を与え得ない。
これらの誘導体には、たとえば、抗原性部位をマスクし、体液中のＳＩＶＡの滞留を延長し得る、ポリエチレングリコール側鎖が含まれ得る。他の誘導体には、カルボキシ基の脂肪族エステル類、アンモニアと、または一級または二級アミンとの反応による、カルボキシル基のアミド類、アシル部位と形成されたアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−シル誘導体（たとえばアルカノイルまたはカルボキシルアロイル基）、またはアシル部位と形成された、遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体（たとえば、セリルまたはスレオニル残基）が含まれる。
本発明による「活性画分」は、たとえばＳＩＶＡの断片であり得る。語句断片は、分子の任意のサブセット、すなわちＳＩＶＡ８の望む生物学的活性を維持するより短いペプチドを意味する。断片は、ＳＩＶＡのいずれかの末端からアミノ酸を除去し、得られた断片を、マクロファージ中および／または局所炎症のモデルでのその活性に関して試験することによって簡単に調製し得る。ポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端いずれかから、一度に１アミノ酸を除去するためのプロテアーゼが公知であり、望む生物学的活性を維持する断片をそのように決定することには、日常の実験のみが含まれる。
本発明の１つの実施形態において、ＳＩＶＡ活性断片は、残基５８〜１１０（配列番号３）からなるｓＩＶＡ２の断片のような、Ｂ−ボックス様リングフィンガーおよび／または亜鉛フィンガーモチーフを含むＳＩＶＡポリペプチドのＣ−末端断片に相当するものである。他の実施形態において、ＳＩＶＡ活性画分は、残基１〜５８（配列番号４）から、または残基１〜８１（配列番号５）からのＳＩＶＡの断片のような、Ｚｎフィンガーモチーフ、Ｂ−ボックス様リングフィンガーまたは両方を欠いている、ＳＩＶＡのＮ−末端断片に相当するものである。
ＳＩＶＡの活性断片として、変異タンパク質およびその融合タンパク質として、本発明は、前記断片が、ＳＩＶＡに対して本質的に類似の活性を有するという条件で、単独、またはそれに連結した結合分子または残基、たとえば糖またはリン酸残基と一緒のタンパク質分子のポリペプチド鎖の任意の断片または前駆体、またはそれら自身によるタンパク質分子または糖残基の凝集物をカバーしている。
語句「融合タンパク質」は、たとえば体液中の滞留時間が延長され、他のタンパク質と融合した、ＳＩＶＡまたは変異タンパク質またはそれらの断片を含むポリペプチドを意味する。ＳＩＶＡはしたがって、たとえば免疫グロブリンまたはその断片に融合してよい。
ＳＩＶＡの「アイソフォーム（isoforms）」は、ＳＩＶＡ活性を持ち得るタンパク質またはその断片であり、選択的スプライシングによって産出され得る。
本明細書で使用するところの語句「円順列誘導体（circularly permuted derivatives）」は、直接的またはリンカーを介してのいずれかで、末端を互いに結合させ、環状分子を産出し、ついでその環状分子が、他の局所で開裂して、本来の分子中の末端とは異なる末端を有する新規の直線分子を産出する、直線分子を意味する。環状置換には、その構造が、環状化され、ついで開いた分子と等しい分子が含まれる。したがって、環状置換分子は、直線分子としてｄｅ ｎｏｖｏで合成してよく、環状化および開裂段階を経ない。円順列誘導体の調製は、国際特許第ＷＯ９５／２７７３２号にて記述されている。
他の態様において、本発明は、本発明によるポリペプチドをコードしている、配列番号７、配列番号８または配列番号９にて列記したもののような、単離ポリヌクレオチドを提供する。
哺乳動物細胞中の本発明のポリペプチドの発現が、ペプチドをコードしているＤＮＡ、プロモーター、任意にイントロン配列およびスプライシングドナー／アクセプターシグナルを含み、さらに任意に終結配列を含むベクター内に挿入することによって取り組まれてよい。これらの技術は、一般的に、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Chapter 16），Ｇｒｅｅｎｅ ＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓおよびＷｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク、ＮＹ、１９８７〜１９９５、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９にて記述されている。
上記プロモーター、イントロンおよび終結配列が、哺乳動物細胞中で動作可能である。プロモーターは好ましくは、上記ＲＳＶ、ＣＭＶまたはＭＰＳＶプロモーターのような強力なプロモーターである。プロモーターはまた、ＳＶ４０早期プロモーター（Everett,et al. 1983、およびそこでの参照）、またはベータ−アクチンプロモーターまたはＥＬＦ−１プロモーターのような細胞プロモーター（Tokushige,et al., 1997）でもあってよい。また、Ｅｄａｍａｔｓｕら、１９９７によって記述されたような、ｌａｃオペレーターおよびヒトＥＬＦ−１アルファプロモーター間のハイブリッド、Ａｋａｇｉら（１９９７）によって記述されたＣＭＶ−ベータ−アクチンハイブリッドプロモーター、またはオペレーター配列とＣＭＶプロモーター間のハイブリッド（Furth et al., 1994、およびそこでの参照）のようなハイブリッドプロモーターを、使用してよい。
完全配列として挿入され得る、すなわちスプライスドナーおよびアクセプター部位を含む、イントロン配列を、ポリペプチドのコーディング配列内に挿入し、発現することが望ましい。そのようなイントロン配列の挿入がＲＮＡ安定性を増強し、したがって望むポリペプチドの産出を増強する。原則としては、好適なイントロン配列を、イントロンを含む任意の遺伝子より選別してよく、代表的なイントロン配列はベータ−アクチンイントロン、ＳＶ４０イントロン、およびｐ５５ ＴＮＦレセプターイントロンである。
イントロン配列は、エンハンサー要素を含んでよく、上記プロモーターからの転写を増強し得る。
しばしば、イントロン配列はまた、組織特異的発現を達成する転写または翻訳制御配列を含む。したがって、組織特異的様式にて、本発明のポリペプチドを発現することが望ましい場合、そのようなイントロン配列を、有利に使用してよい。組織特異的エンハンサー要素を含むイントロンの例は、ヒト５−アミノレブリン酸シンターゼ２遺伝子のイントロン８中に局在した赤血球−特異的エンハンサー（Surinuya et al. 1998）であり、代表的なイントロン配列と一緒に、イントロン配列を用いる、タンパク質産出を増強する原理の議論が、Ｈｕａｎｇら、１９９０にて提供される。
転写終結配列およびポリアデニル化シグナルを、発現することが望ましいポリペプチドをコードしているＤＮＡの３’末端に加えてよい。そのような配列は、多くの、またはほとんどの遺伝子で見られ得る。有利に、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを使用可能である（Schek et al., 1992、およびそこでの参照）。
たとえば、望むポリペプチドをコードしている遺伝子の発現を駆動するためのＣＭＶプロモーターを含む、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（インビトロジェン）、およびＭＰＳＶプロモーターを含むｐＭＰＳＶＥＨのような、哺乳動物細胞内での本発明のポリペプチドの発現のためのベクターを使用可能である。
組換え体ポリペプチドを、そのようなポリペプチドをコードしているベクターをトランスフェクトした細菌または真核（たとえばＣＨＯ）培養宿主細胞中、またはトランスジェニック動物中いずれかで産出可能である。トランスジェニック動物を使用する場合、それらの乳中で均質ポリペプチドを産出することがとりわけ有利である。ウシ、ヒツジおよびヤギのような乳畜がしたがって代表的な宿主である。たとえば、そのすべてが参照によって本明細書に組み込まれている、国際公開第８８／００２３９号パンフレット、同第９０／０５１８８号パンフレット、同第９１／０２３１８号パンフレットおよび同第９２／１１７５７号パンフレット、および米国特許第４，８７３，１９１号、同第４，８７３，３１６号および同第５，３０４，４８９号を参照のこと。
ポリペプチドは、結果として、体液中の半減期が延長される「融合ポリペプチドまたはタンパク質」となる、高分子量ポリマーのような、半減期延長部位を含んでよい。たとえば、本発明によるポリペプチドを、たとえば免疫グロブリンのようなタンパク質に、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような高分子量ポリマーなどに融合させることができる。
本発明は、以上で定義したような本発明によるポリペプチド、またはその塩および／またはその誘導体および／またはその融合ポリペプチドに関連する。
語句「塩（saltes）」は本明細書で、本発明のペプチドのカルボキシル基の塩、およびアミノ基の酸添加塩両方を意味する。カルボキシル基の塩は、本技術分野で公知の方法によって形成されてよく、無機塩、たとえばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄または亜鉛塩など、およびたとえば、トリエタノールアミン、アルギニンまたはリシン、ピペリジン、プロカインなどのようなアミンと形成されたもののような有機塩基との塩が含まれる。酸添加塩には、たとえば、塩酸または硫酸のようなミネラル酸との塩、およびたとえば酢酸またはオキサル酸のような有機酸との塩が含まれる。もちろん、任意のそのような塩が、本発明のペプチドに対して、本質的に類似の活性を持たなければならない。
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードしているＤＮＡを含む発現ベクター、および前記ベクターを、昆虫細胞、酵母細胞、またはＨｅＬａ、ＨＥＫ ２９３ＴおよびＣＨＯ細胞のような乳動物細胞のような、原核または真核宿主細胞中に導入すること、および細胞を増殖させること、および産出されたタンパク質を単離すること、による、それらの産出の方法を提供する。
さらに、本発明は、ポリペプチドをコードしているウイルスベクターを提供する。
他の態様において、本発明は、配列番号６の配列またはその相同的配列のＢ−ボックス様リングを有するポリペプチドのユビキチン関連活性を調節可能な薬剤、および薬学的に許容され得る担体を含む、医薬組成物を提供する。
さらなる態様において、本発明は、配列番号６の配列またはその相同的配列のＢ−ボックス様リングを有するポリペプチドの活性によって仲介されたタンパク質分解を調節可能な薬剤、および薬学的に許容され得る担体を含む、医薬組成物を提供する。
本発明にしたがって、残基５８〜１１０（配列番号３）に広がるＳＩＶＡの断片のような、ＳＩＶＡのＣ−末端断片が、高濃度で、ＮＩＫおよびＣＤ２７誘導ＮＦ−κＢ活性化において、ドミナントネガティブな効果をもつことが示された。低濃度で、安定細胞株においては、ＮＦ−κＢ活性化における増強効果を示している。したがって、他のさらなる態様において、本発明は、Ｂ−ボックス様リングフィンガーおよび／または亜鉛フィンガーモチーフを含むＳＩＶＡのＣ−末端断片に相当するポリペプチド、および前記ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド（またはＤＮＡ）を提供する。
また、本来のＳＩＶＡのような、残基１〜５８（配列番号４）または１〜８１（配列番号５）に広がるＳＩＶＡの断片のような、ＳＩＶＡのＮ−末端断片が、ＮＩＫの分解を誘導可能であることがわかった。したがって、本発明の他の態様は、Ｚｎフィンガーモチーフ、Ｂ−ボックス様リングフィンガーモチーフまたは両方を欠いているＳＩＶＡポリペプチドのＮ−末端断片に相当するポリペプチドに、そして前記ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド（またはＤＮＡ）に関する。
本発明はまた、配列番号７、配列番号８および配列番号９にて列記したもののような、本発明のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに関する。
本発明のポリペプチドは、原核または真核発現系、細胞内、ペリプラズム中で産出されてよく、または培地内に分泌されてよい。本発明の産出されたポリペプチドを、可溶性または不溶性形態（封入体）中に回復してよい。本発明のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含むベクターを、原核または真核系中での前記ポリペプチドの発現のために使用してよい。ヒト成長ホルモンシグナルペプチドのような、本発明のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド（またはＤＮＡ）に融合した効果的なシグナルペプチドを、真核発現および分泌のために使用してよい。
本発明は、疾患、障害または症状の治療のための医薬の製造のための、配列番号３、配列番号４および配列番号５に示すような本発明のポリペプチド、または変異タンパク質、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体またはそれらの断片、またはそれらの塩、または本発明の前記ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを提供する。たとえば、ウイルス感染の病因、化学療法の副作用、虚血性再灌流の副作用、ＳＩＶＡのアップレギュレーションの状態、ＮＩＫに依存する方法における他のＮＦ−κＢ経路の活性化に関連した自己免疫疾患、および制御されていないリンパ球活性に関連した疾患のような、ＳＩＶＡ、ＮＩＫ、ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ３と関連した疾患、障害または症状の治療のためである。
これらのツールの治療的、または研究に関連した使用が、生きている有機体の細胞内へのそれらの導入を必要とする。本目的のために、ペプチド、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの膜透過性を改善することが望ましい。
脂肪親和性構造での誘導化を、膜透過性の増強したペプチドおよびタンパク質を作製することにおいて使用してよい。たとえば、以上で言及した公知の膜屈性ペプチドを、ペプチドまたはポリペプチドの配列に加えてよい。さらに、ペプチドまたはポリペプチドを、少なくとも１つの極性または荷電基によって置換される、以上で言及した炭化水素鎖のような部分的な脂肪親和性構造によって誘導化してよい。たとえば、ペプチドのラウロイル誘導体が、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉら、１９９１によって記述された。ペプチドおよびポリペプチドのさらなる改変には、Ｚａｃｈａｒｉａら、１９９１によって記述されたような、メチオニン残基の酸化が含まれ、それによってスルホキシド基が作製される。Ｚａｃｈａｒｉａおよびその共同研究者らはまた、比較的親水性のペプチド結合が、そのケトメチレンイソエステル（ＣＯＣＨ２）によって置換されるペプチドまたは誘導体も記述している。タンパク質およびペプチド化学の領域の当業者に公知のこれらの、そして他の改変が、膜透過性を増強する。
本発明のポリペプチドのような、治療的分子の細胞内伝達のための脂肪に基づく担体を使用するためのガイダンスが、本技術分野でよく知られている（Abra RM.et al., 2002. J.Liposome Res.12:1-3; Park JW., 2002. Breast Cancer Res.;4(3)95-9; Bendas G.,2001.BioDrugs 15:215-24; Maruyama K.,2000.Biol Pharm Bull.23:791-9; Hong K.et al.,1999.Ann NY Acad Sci.886:293-6; Margalit R.,1995.Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.12:233-61; Storm G and Crommelin DJ.,1997.Hybridoma 16:119-25; Park JW.et al.,1997.Adv Pharmacol.40:399-435）。
膜透過性を増強するための他の方法は、ペプチドまたはタンパク質の細胞取り込みを誘導するために、細胞表面上の、ウイルスレセプターのようなレセプターを使用することである。このメカニズムは、ウイルスによって非常に使用されており、特定の細胞表面分子に特異的に結合する。結合に際して、細胞が、その内部にウイルスを取り込む。細胞表面分子はウイルスレセプターと呼ばれる。たとえば、インテグリン分子ＣＡＲおよびＡｄＶは、アデノウイルスに対するウイルスレセプターとして記述されており、Ｈｅｍｍｉら、１９９８およびそこでの参照を参考のこと。ＣＤ４、ＧＰＲ１、ＧＰＲ１５およびＳＴＲＬ３３分子が、ＨＩＶＡのレセプター／共レセプターとして同定されており、Ｅｄｉｎｇｅｒら、１９９８およびそこでの参照を参考のこと。
したがって、ペプチド、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを、細胞表面レセプターに結合することが公知の分子に共役させることが、前記ペプチド、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの膜透過性を増強し得る。共役物を形成するために好適な基の例は、糖、ビタミン、ホルモン、サイトカイン、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク質、および類似分子である。Ｌｏｗら米国特許第５，１０８，９２１号は、ペプチド、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの膜透過性を増強する目的のための、これらの分子の使用、および前記共役物の調製を記述している。
Ｌｏｗおよびその共同研究者らはさらに、葉酸またはビオチンのような分子を使用して、これらの分子に対するレセプターの豊富な、そして非特異的発現のために、有機体中の多数の細胞に共役物を標的化するために使用してよいことを教示している。
本発明のペプチド、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの膜透過性を増強するための、細胞表面タンパク質の上記使用も前記ポリペプチドまたは本発明のポリヌクレオチドを、特定の細胞型または組織に標的化することにおいて使用してよい。たとえば、癌細胞を標的化することが望ましい場合、これらの細胞の表面上により豊富に発現する細胞表面タンパク質を使用することが好ましい。例は、葉酸レセプター、ムチン抗体ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５ＢおよびＭＵＣ７、糖タンパク質抗原ＫＳＡ、癌胎児性抗原、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、およびヒト絨毛膜ゴナドトロピン−ベータである。上記Ｗａｎｇら、１９９８は、癌細胞を標的化するための葉酸の使用を教示しており、Ｚｈａｎｇら、１９９８は、種々の型の癌、および正常細胞における、相対的に豊富な上記それぞれの他の抗原を教示している。
本発明のポリペプチド、ペプチドまたはポリヌクレオチドはしたがって、上述共役技術を用いて、望むような特定の細胞型に対して標的化され得る。たとえば、リンパ球系統の細胞におけるＮＩＫの活性化を阻害することが望ましい場合、本発明のポリペプチド、ペプチドまたはポリヌクレオチド、それらの断片、本発明の変異タンパク質および誘導体を、たとえば、これらの細胞上で発現しているＭＨＣクラスＩＩ分子を用いることによって、そのような細胞にて標的化してよい。これは、前記ＭＨＣクラスＩＩ分子の定常領域に対して指向する、抗体、またはその抗原結合部位を、本発明のポリペプチドまたはペプチドに共役することによって達成してよい。さらに、種々のサイトカインおよび他の細胞コミュニケーション分子に対する多数の細胞表面レセプターが記述されてきており、これらの分子の多くが、より多い、またはより少ない組織−または細胞−型制限様式にて、発現する。したがって、Ｔ細胞のサブグループを標的化することが望ましい場合、ＣＤ４ Ｔ細胞表面分子を、本発明の共役物を産出するために使用してよい。ＣＤ４−結合分子は、その表面抗原ｇｐ４２が、ＣＤ４分子に特異的に結合可能である、ＨＩＶウイルスによって提供される。
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列を、ウイルスベクターの使用によって細胞内に導入してよい。この目的のための、ワクシニアベクターの使用が、Ｃｕｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙの１６章にて詳述されている。アデノウイルスベクターの使用が、Ｔｅｏｈら、１９９８，Ｎａｒｕｍｉら、１９９８、Ｐｅｄｅｒｓｏｎら、１９９８、Ｇｕａｎｇ−Ｌｉｎら、１９９８、およびそこでの参照、Ｎｉｓｈｉｄａら、１９９８、Ｓｃｈｗａｒｚｅｎｂｅｒｇｅｒら、１９９８、およびＣａｏら、１９９８によって記述された。アンチセンス配列のレトロウイルス伝達が、Ｄａｎｉｅｌら、１９９８によって記述された。
ベクターとしてウイルスを用いる場合、ウイルス表面タンパク質が一般的に、ウイルスを標的化するために使用される。上記アデノウイルスのような、多くのウイルスが、それらの向細胞性において非特異的であるので、細胞型または組織特異的プロモーターを用いることによって、さらなる特異性を与えることが望ましい。Ｇｒｉｓｃｅｌｌｉら、１９９８は、その伝達が、アデノウイルスによって仲介される遺伝子の心臓特異的標的化のための、心室特異的心臓ミオシン軽鎖２の使用を教授している。
または、ウイルスベクターを、その表面上にさらなるタンパク質を発現するように改変してよく、またはウイルスベクターの表面タンパク質を、望むペプチド配列を組み込むように変化させてよい。ウイルスベクターはしたがって、前記ベクターを標的化するために使用してよい、１つ以上のさらなるエピトープを発現するように改変してよい。たとえば、サイトカインエピトープ、ＭＨＣクラスＩＩ−結合ペプチド、またはホーミング分子から由来したエピトープを、本発明の教義にしたがって、ウイルスベクターを標的化するために使用してよい。
本発明は、本発明の１つ以上のポリペプチド、および／またはポリヌクレオチドまたはそれらの配列またはアンチセンスを有するベクターから選択される、１つ以上の活性基質を含む医薬組成物を包含する。本発明は、ＳＩＶＡ、ＴＲＡＦ２、ＮＩＫおよびＴＲＡＦ３をユビキチン化することに関与するＳＩＶＡポリペプチド領域中で、認識および結合可能な特異的抗体を含む医薬組成物を包含する。
「薬学的に許容され得る（pharmaceutically acceptable）」の定義は、活性成分の生物学的活性の効果を干渉しない、そして投与する宿主に対して毒性ではない、任意の担体を包含することを意味する。たとえば、非経口投与のために、活性タンパク質（類）を、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミンおよびリンガー溶液のようなビヒクル中、注射のためのユニット投与形態中で処方してよい。
本発明による医薬組成物の活性成分を、種々の方法にて個体に投与可能である。投与経路には、皮内、経皮（たとえば除放処方）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、頭蓋内、硬膜外、局所および鼻腔内経路が含まれる。任意の他の治療的に効果的な投与経路を、たとえば、上皮または内皮組織を介した吸収、またはインビボにて活性薬剤を発現し、分泌させる、活性薬剤をコードしているＤＮＡまたはＲＮＡ分子を（たとえばベクターを介して）投与する遺伝子治療によって、使用可能である。さらに、本発明によるポリペプチド（類）を、薬学的に許容され得る界面活性剤、賦形剤（excipients）、担体、希釈液およびビヒクル（vehicles）のような、生物学的に活性な薬剤の他の成分と一緒に投与可能である。
本発明は、疾患の治療のための医薬の製造におおける、ＳＩＶＡ、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３およびＮＩＫユビキチン化に関与するＳＩＶＡポリペプチド領域中で、認識および結合可能な特異的抗体の使用に関する。
本発明はまた、治療的に効果的な量の、ユビキチン化に関与するＳＩＶＡ中の領域を認識可能な特異的抗体の、必要としている患者への投与を含む、前記疾患の病因における、ＳＩＶＡ、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、および／またはＮＩＫのユビキチン化に関与している疾患の治療のための方法にも関する。
非経口（たとえば静脈内、皮下、筋肉内）投与のために、活性タンパク質（類）を、薬学的に許容され得る非経口ビヒクル（たとえば水、生理食塩水、デキストロース溶液）および等張性（たとえばマンニトール）または化学安定性（たとえば保存剤および緩衝液）を維持する添加物と一緒に、溶液、懸濁液、エマルジョンまたは凍結乾燥粉末として、処方可能である。処方を、通常使用される技術によって滅菌する。
本発明による活性ポリペプチド（類）のバイオアベイラビリティーもヒト体中の分子の半減期を増加させる共役手順を用いることによって、たとえば、ＰＣＴ特許明細書国際公開第９２／１３０９５号パンフレットにて記述されたような、分子をポリエチレングリコールに連結することによって、改善される。
「治療的に効果的な量」は、投与したときに、本発明の前記ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはウイルスが、疾患の予防または経過において、有益な効果を誘導することである。単一または多重用量として個体に投与した用量は、投与経路、患者の症状および特徴（性別、年齢、体重、健康およびサイズ）、症状の程度、同時治療、治療の頻度および望む効果を含む、種々の因子に依存して変化してよい。確立された投与範囲の調節および操作が、よく当業者の能力内である。
学術論文または要約、発行または未発行米国または海外特許明細書、付与された米国または海外特許または任意の他の参考文献を含む、本明細書で引用されたすべての参考文献は、引用された参考文献中で示されたすべてのデータ、表、図および文を含む、すべてが本明細書で参考文献によって組み込まれている。さらに、本明細書で引用された参考文献中に引用された参考文献の全内容もすべて参考文献によって組み込まれる。
公知の方法段階、従来の方法段階、公知の方法または従来の方法に対する参照は、本発明の任意の態様、記述または実施形態が、関連技術分野にて開示、教示または指摘される承認ではない。
本発明を記述しているが、代表的な方法によって提供され、本発明の制限であるとは意図しない以下の実施例に対する参照によって、より簡単に理解されるであろう。
材料および方法
試薬：ｍＣＤ７０、ｈＣＤ４０ＬおよびｈＢＬｙＳ／ＢＡＦＦを、相当する発現構造での、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔの大規模トランスフェクションによって産出した（以下を参照のこと）。Ｇ．Ａｄｏｌｆ博士、べーリンガー インスティテュート（Boehringer Institute）、ウイーン、オーストリアから提供を受けたＴＮＦを、１００ｎｇ／ｍｌの濃度にて、細胞に適用した。ＭＧ１３２およびラクタシスチンは、カルビオケム（Calbiochem）から購入し、Ｇ４１８はライフ テクノロジーズ（Life Technologies）、ゼオシンはインビボジェン（Invivogen）から、およびブラスチシジン、プロマイシンおよびポナステロンはインビトロジェンから購入した。組換え体ＴＲＡＩＬは、アレキシス（Alexis）から購入した。組換え体ＨＩＳ−ユビキチンＫ４８のみ、ＨＩＳ−ユビキチンＫ６３のみ、ヒトＥ１、Ｕｂｃ１３−Ｕｅｖ１ヘテロダイマーは、ボストン バイオケムから得た。ユビキチンアルデヒドはＡ．Ｇ．サイエンティフィック（A.G.Scientific）からであった。
抗体：抗−ｐ５２抗体は、アップステート バイオテクノロジーズ（Upstate Biotechnologies）から購入し、ｐ６５、ｐ５２、ｐ５０、ＲｅｌＢ、ＴＲＡＦ２、ＩＫＫ１（Ｍ２８０＆Ｈ７４４）、ＳＩＶＡ、ＴＲＡＦ３、ＮＩＫ（Ｈ−２４８）は、サンタ クルズ バイオテクノロジー（Santaq Cruz Biotechnology）から、抗−ＨＩＳ、抗−ＦＬＡＧ、抗−ＦＬＡＧ Ｍ２−ビーズ、および抗−ｂアクチンはシグマから、抗−ユビキチンおよび抗−ＧＳＴはコバンス（Covance）から、抗−ＧＦＰはロッシュから、抗−ＩκＢαはトランスダクション ラボラトリーズ（Transduction Laboratories）から購入した。抗−ＮＩＫモノクローナル抗体ＮＩＫ−８１は、マウスを、ＮＩＫキナーゼドメイン内の配列（ＣＲＬＧＲＧＳＦＧＥＶＨＲＭＥＤＫ−アミノ酸４０５〜４２０ 配列番号３４）に相当するＫＬＨ−共役ペプチドで免疫化することによって作製した。抗−ＮＩＫ、抗−ＨＡおよび抗−ｍｙｃ（クローン−９Ｅ１０）モノクローナル抗体は、それらの相当するペプチドが共役したアフィニティカラム上で、マウス腹水液から精製した。
Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫由来のヒトＢリンパ芽、Ｒａｍｏｓ、ＲａｊｉおよびＢＪＡＢを、ＲＰＭＩ培地中で培養した。すべての接着細胞ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨｅＬａおよびＭＥＦを、ダルベッコ改変イーグル培地中で培養した。両方の培養培地に、１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを含めた。
Ｃ−末端ＴＡＰタグを含むＮＩＫを安定に発現しているＢＪＡＢ細胞（Rigaut et al., 1999）を、エレクトロポレートした細胞のＧ４１８、１ｍｇ／ｍｌによって作製した。ＳＩＶＡ２を、レトロウイルス形質転換、続いて１ｍｇ／ｍｌプロマイシンでの選別によって、ＢＪＡＢ ＮＩＫ安定細胞株内に導入した。ｍｙｃでＮ−末端でタグ化したＮＩＫ（ｍｙｃ−ＮＩＫ）を安定に発現しているＲａｍｏｓ細胞を、アマクサ（Amaxa）ヌクレオフェクター器具を用いるヌクレオフェクション、および１ｍｇ／ｍｌプロマイシンを用いる選別によって作製した。ＨＩＳ−ＳＩＶＡ２を安定に発現しているＲａｍｏｓ細胞およびＲａｍｏｓ ｍｙｃＮＩＫ。
ＳＩＶＡ２を発現しているエクジソン誘導可能２９３細胞株を、製造者説明書（インビトロジェン（Invitrogen））にしたがって作製し、後でｍｙｃＮＩＫおよびｍｙｃＮＩＫＫ６７０Ａを、レトロウイルス形質導入および１ｍｇ／ｍｌプロマイシンでの選別によって、これらの細胞内に導入した。
発現ベクター：ｍＣＤ７０、ｈＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインのためのｃＤＮＡｓを、ＥＳＴｓからＰＣＲ−増幅し、改変ロイシンジッパーおよびＦＬＡＧタグ（Fanslow et al., 1994）との融合で、ｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン）内にクローン化した。ｐＣＳ３ＭＴＮＩＫおよびｐＣＳ３ＭＴ−ＮＩＫ ＫＫ４２９，４３０ＡＡ、野生型および６つのｍｙｃタグにＮ−末端で融合した「キナーゼ−死」のためのＮＩＫ発現ベクターは、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｋｒａｃｈｔ博士、ドイツから得た。ｐＥＧＦＰはクロンテック（Clontech）から購入した。マウスａｌｙ変異（Ｇ８５６Ｒ）のものに相当する変異（Ｇ８６０Ｒ）を含むヒトＮＩＫ（Shinkura et al., 1999）、および記述したすべての他の点変異を、部位特異的変異形成キット（ストラタジーン（Stratagene））で作製した。モノユビキチン化を査定するためのユビキチンプラスミド（ＵｂＫＫＫＫ １１，２９，４８，６３ ＲＲＲＲ）は、Ｙｏｓｅｆ Ｙａｒｄｅｎ教授、ワイズマン インスティチュート オブ サイエンス（Weizmann Institute of Sciences）、イスラエルによって親切にも提供された。Ｃ−末端ｍｙｃタグを有する、プロテアソームサブユニットＣ８を、ＰＣＲによって産出し、ｐｃＤＮＡ３ベクター（インビトロジェン）内にクローン化した。
Ｎ−末端６ｍｙｃタグを有するＮＩＫ−ｐＣＳ３ＭＴＮＩＫ、ａｌｙ ＮＩＫ、キナーゼ死ＮＩＫ、ＮＩＫ Ｋ６７０Ａを、製造者のプロトコール（ストラタジーン）を用いて、ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを用いる部位特異的変異導入によって、ｐＣＳ３ＭＴＮＩＫから産出した。
ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ、配列番号３５）にＮ−末端融合したＮＩＫを発現するためのベクターを、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｋｒａｃｈｔ博士、ドイツより得た。
酵母ツー−ハイブリッドスクリーニング：スクリーニングのために使用した系は、ＭａｔｃｈｍａｋｅｒバージョンＩＩＩ（クロンテック）であった。プレイは、ａ−ゲルアッセイに加えて、高度にストリンジェントな四重脱落（ＱＤＯ）選別を提供する、前形質転換ヒト骨髄ライブラリー（カタログ番号ＨＹ４０５３ＡＨ）であった。ＬＥＵ、ＴＲＰ、ＨＩＳおよびＡＤＥなしのプレート上で増殖しているクローンを、通常よりさらにより特異的である、ａ−ゲルアッセイ、しばしば漏出、ｂ−ゲルアッセイによって再確認する。陽性クローンのプラスミドを、以下のように調製した。単一クローンを、ＱＤＯ液体ブロス中に接種させ、３７℃で一晩増殖させた。細胞を１０，０００ｇにてペレット化し、２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１％ ＳＤＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、および１ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液２００μｌ中に再懸濁させた。溶解物を、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）２００μｌおよび０．３ｇの６００ミクロン酸洗浄ガラスビーズ（シグマ）を加えた後に２分間ボルテックスした。上清を、１２，０００ｇでの遠心によって回収し、ＤＮＡを酢酸ナトリウム／エタノール沈殿法（Sambrook et al., 1989）によって沈殿させた。プラスミドからのコードされた挿入物を、ライブラリーベクターｐＡＣＴ２に対して特異的なプライマーでのＰＣＲによって増幅させた。個々のクローンのさらなる生物化学解析のために、アンプリコンを直接、Ｎ−末端ＨＩＳタグ化哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン）内にクローン化した。
組換え体タンパク質の発現：ＧＳＴ融合タンパク質の細菌発現のために、ＩκＢα １−５４、ＳＩＶＡ２およびＳＩＶＡ２ Ｃ７３Ａを、ｐＧＥＸベクター内にクローン化し、製造業者プロトコール（GST Gene Fusion System、3rd ed、ファルマシア バイオテック（Pharmacia Biotech））にしたがって、ＢＬ−２１細胞中で発現させた。誘導は、１ｍＭ ＩＰＴＧにて、０．６のＯＤ６００にて実施した。不溶性タンパク質および封入体の形成を避けるために、細菌培養液を、３７℃のかわりに２５℃で増殖させた。
ＨＩＳ−ＮＩＫ ３３８〜９４７を、すでに記述したように、本発明者らの研究室にて、昆虫細胞中、バキュロウイルスを用いて発現させた。
ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ：部位特異的変異導入および種々のｃＤＮＡｓを増幅するためのＰＣＲｓを、製造業者の説明書（ストラタジーン）にしたがって、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼを用いて実施した。すべてのＲＴ−ＰＣＲｓを、製造業者のプロトコール（インビトロジェン）にしたがって、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩを用いて実施した。
プラスミドトランスフェクション、免疫ブロッティング、および免疫沈降：
プラスミドトランスフェクションを、以下の方法の１つによって実施した。
ａ．リン酸カルシウム沈殿法（Sambrook et al., 1989）
ｂ．アマクサ ヌクレオフェクション（アマクサ バイオシステムズ（Amaxa biosystems））
ｃ．Ｇｅｎｅポーター（ジーン セラピー システムズ（Gene therapy systems））
ｄ．リポフェクタミン２０００（インビトロジェン）
ｅ．通常のエレクトロポレーションを以下のように実施した。
細胞（１０×１０6／エレクトロポレーション）を一度洗浄し、２５μｇのプラスミドを含む、４００μｌの血清を含まない培地中で再懸濁させた。ＤＮＡと混合した細胞を、０．４ｃｍギャップキュベット内に移し、１０分間氷中でインキュベートした。エレクトロポレーションを、ＢＩＯＲＡＤ Ｇｅｎｅｐｕｌｓｅｒ中、０．２４ＫＶ、９６０μＦで実施し、時間定数を４０まで最適化した。パルス後、細胞を氷中に５分間維持し、後に増殖培地中に移した。
免疫ブロッティングおよび免疫沈降を、記述された（Ramakrishnan et al., 2004）ように実施した。典型的に、１．５×１０6 ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を１０ｃｍプレートにまいた。インキュベーションンの２４時間の後、培養液を、空のベクターを添加することによって、プレートあたり１５μｇの総ＤＮＡ濃度を維持しながら、それぞれのプラスミドでトランスフェクトした。
典型的に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９０−ｍｍプレート上にまき（１．５×１０6細胞／プレート）、リン酸カルシウム沈殿法（Sambrook et al., 1989）を使用して、１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地、１０ｍｌ中、総量１０μｇＤＮＡを用いて一日後に、トランスフェクトした。コトランスフェクションのために、試験したタンパク質をコードしているプラスミドの１：１混合液を使用した。トランスフェクション２４時間後に、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で一回リンスし、１’完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（ロッシュ モレキュラー バイオケミカルズ（Roche Molecular Biochemicals）を含んだ、１ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ）中で溶解した。先に洗浄した溶解物を、タンパク質−Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ（アマシャム バイオサイエンセズ（Amersham biosciences）に先に吸着した２μｇの抗−ｍｙｃまたは抗−ＨＩＳ抗体と一緒に、４℃で２時間インキュベートした。ついでビーズを溶解緩衝液でリンスし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、タンパク質をニトロセルロース膜に移し、示した抗体でプローブ化した。抗体を、製造業者の説明書にしたがって、増強化学発光（ＥＣＬ）ウエスタンブロッティング検出システム（アマシャム）を用いて、ホースラディッシュ ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−共役二次抗体で視覚化した。
細胞の溶解物を調製するために、典型的に、細胞をトランスフェクション２４時間で回収し、ついで、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶解緩衝液［１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ｃｌ（ｐＨ７．６）および１×完全プロテアーゼ阻害剤（ロッシュ）］中で溶解した。すべての免疫沈降を、特異的な抗体およびタンパク質Ｇセファロースビーズ（アマシャム ファルマシア（Amersham Pharmacia））との、４℃で４時間のインキュベーションによって実施した。
溶解条件は、核および細胞質抽出物を調節する場合で異なる（Schreiber et al., 1989）。
インビトロキナーゼアッセイ：トランスフェクトした、内因性タンパク質のキナーゼアッセイを、記述された（Ramakrishnan et al., 2004）ように実施した。
ルシフェラーゼアッセイ：細胞を６−ウェルプレートにまいた（ＨＥＫ ２９３Ｔ ２０００００、ＨｅＬａ １０００００、ＭＥＦ １０００００細胞／ウェル）。ＨＥＫ ２９３ＴおよびＨｅＬａ細胞を、リン酸カルシウム沈殿法によってトランスフェクトし、ＭＥＦｓを、リポソームに基づく試薬（ジーン テラピー システムズ（Gene therapy systems））でトランスフェクトした。ＨＩＶ−ＬＴＲ（ヒト免疫不全ウイルス末端反復配列）ＮＦ−κＢプロモーターの制御下、ルシフェラーゼｃＤＮＡを、レポータープラスミドとして使用した。２４時間後、細胞を記述された（Fred M.Ausubel, 1996）ように溶解緩衝液、１２０μｌ中で溶解し、１０−２０μｌ溶解物をルシフェラーゼアッセイのために使用した。
ｓｉＲＮＡおよびレンチウイルス形質転換：ｓｉＲＮＡの安定および一時的発現、およびレンチウイルス形質転換を、記述された（Ramakrishnan et al., 2004）ように実施した。
ＳＩＶＡ１およびＳＩＶＡ２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列および断片。
Figure 0005086273
Figure 0005086273
位置指定突然変異誘発に関するオリゴヌクレオチド配列およびＲＮＡ干渉によるタンパク質合成の抑制に関するオリゴヌクレオチド配列：マウスａｌｙ変異（Ｇ８６０Ｒ）の変異に対応する変異を有するヒトＮＩＫが以下の配列を用いて作製された。
Figure 0005086273
使用されたＮＩＫ ｓｉＲＮＡに非相補的となるよう変更された配列を有するＮＩＫが、以下の配列をプライマーとして用いて作製された。
Figure 0005086273
ＮＩＫのＮ−およびＣ−末端におけるＴＲＡＦ２結合モチーフが、以下のオリゴにより変異された。
Figure 0005086273
以下のｓｉＲＮＡ配列が、ｐＳＵＰＥＲベクターに導入された（スペーサーとして配列ttcaagagaを有する）。
Figure 0005086273
Figure 0005086273
ＲＮＡｉノックアウト。ヘアピンｓｉＲＮＡを、先に記述された（Brummelkamp et al., 2002）ように、ｐＳＵＰＥＲベクターを用いて発現させた。簡単に記すと、二本鎖オリゴヌクレオチドを、ヒトＳＩＶＡオープンリーディングフレームアンチセンス鎖中の領域に相当するフォワードおよびリバース配列を含むように設計した。２つのオリゴヌクレオチドをアニールし、Ｈ１ ＲＮＡプロモーターの制御下、発現のためにｐＳＵＰＥＲベクター内にクローン化した（Brummelkamp et al., 2002）。５倍過剰までのこのｐＳＵＰＥＲ−ＳＩＶＧＡの一過性トランスフェクションを、以上で記述したように実施した。
（Lois et al., 2002によって先に記述されたような）レンチウイルスベクターを、Ｒａｍｏｓ細胞中で構成的に、ｐＳＵＰＥＲ−ＳＩＶＡを発現するために使用した。典型的に、Ｈ１プロモーター（Brummelkamp et al., 2002）およびＳＩＶＡ ＲＮＡｉを含むカセットを、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（両方ニュー イングランド バイオラボズ（New England Biolabs）より）を用いてｐＳＵＰＥＲベクターより切り出し、粘着性末端を、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（ニュー イングランド バイオラボズ）を用いてブラント化し、ブラント化した断片を、ＧＦＰ−発現ＦＵＧＷレンチウイルスベクター（Lois et al., 2002）のブラント化したＰａｃＩ内に挿入した。形質転換細胞を、ＧＦＰ発現のためにＦＡＣＳによってソートした（FACS Vantage、ベクトン−ディッキンソン（Becton-Dickinson））。ソートした細胞が、数ヶ月間、ＧＦＰの発現およびＳＩＶＡの欠如を示した。
インビトロ自己ユビキチン化：典型的に、インビトロユビキチン化アッセイを、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＡＴＰ、０．２ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ クエン酸ナトリウム、１０ｍＭリン酸クレアチニン、０．２μｇ／ｍｌクレアチニンキナーゼおよび５μＭユビキチンアルデヒドを含む緩衝液中、Ｋ６３を除くユビキチン中のすべてのリシンがアルギニンに変異された、組換え体ＨＩＳ−ユビキチン（ボストン バイオケム）（８μｇ）、Ｅ１（０．２μｇ）、Ｅ２（０．５μｇ）および１−２μｇの組換え体ＧＳＴ−ＳＩＶＡまたはＧＳＴ−ＳＩＶＡＣ７３Ａを用いる組換え体を含む５０μｌ反応容量中で実施した。反応液を３０℃で１時間インキュベートした。反応を、Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液の添加によって終結するか、または２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび完全プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む緩衝液で１ｍｌまで希釈した。ＳＩＶＡを、タンパク質Ｇビーズに吸着した抗−ＧＳＴ抗体を用いて、４℃で４時間免疫沈降させた。免疫沈降物を、示した抗体でのウエスタンブロッティングにかけた。
ウイルス接種材料の調製。フェニックス−アンホ細胞（９ｃｍプレート中に播いた１．５×１０6細胞）（Ｇａｒｙ Ｎｏｌａｎ教授、スタンフォード大学から提供）を、ｐＢＡＢＥプロＳＩＶＡ２ベクター（２０μｇ／プレート）でのリン酸カルシウム法によってトランスフェクトし、トランスフェクション４８時間後に、ウイルスを含む条件培地を回収した。５ｍｌのウイルスを含む培地を、ＢＪＡＢ細胞（２０×１０6細胞）を含むＲＰＭＩ培地、４５ｍｌに加え、２日後、細胞をプロマイシン（ＳＩＧＭＡ ｐ７２５５）含有培地（５００ｎｇ／ｍｌ）中の４日間の選別にかけた。４日後、プロマイシン濃度を増加させ（１μｇ／ｍｌ）、細胞を培養条件中で増殖させた。
ＳＩＶＡｃを構成性に発現しているＲａｍｏｓ細胞。（ｐＳＩＶＡｃで構成性にトランスフェクトした）ＳＩＶＡ−ｃを発現しているＢ−リンパ芽細胞クローンを単離し、増殖させた。ＳＩＶＡｃを発現している細胞クローンを得るために使用した発現ベクターが、Ｈｉｓタグ化ＳＩＶＡｃ（Ｈｉｓ−タグが、ＳＩＶＡｃのＣ−末端に融合する）を産出する。ＳＩＶＡ−ｃを発現しているＲＡＭＯＳ Ｂ−リンパ芽細胞クローンを以下のように調製した。Ｂ−リンパ芽細胞を、ＳＩＶＡｃまたは対照ベクターｐＣ ＨＩＳでのヌクレオフェクション（アマクサ バイオシステムズ）によってトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後、細胞を３０日間、１０００ｎｇ／ｍｌネオマイシン（Ｇ４１８、ギブコ ＢＲＬ（Gibco ＢＲＬ）１１８１１−０３１）を含む培地中で選別した。選別後、単一細胞クローンを、ＳＩＶＡ−ｃの発現をモニタするために、抗−ＨＩＳを用いるウエスタンブロッティングによって解析した。陽性選別クローンを増殖させ、実験のために使用した。
実施例１
ＮＩＫは、ＣＤ２７と結合したアダプタータンパク質である、ＳＩＶＡに結合する
ベイトとしてＮＩＫを用いて、ヒト骨髄ツー−ハイブリッドライブラリーをスクリーニングして、ＮＩＫが、ＳＩＶＡのＣ−末端断片に結合することがわかった（図１Ａを参照のこと）。ＴＲＡＦ２へのＮＩＫ−結合の場合（Malinin et al., 1997）においてのように、ＳＩＶＡ断片が、ＮＩＫのＣ−末端部分に結合することがわかり、この結合は、おそらくＮＩＫのＮ−末端部分の、そのＣ−末端に結合する傾向のため、全長ＮＩＫタンパク質（図１Ａ）で観察されたものよりも強く、したがって他のタンパク質へのその結合を防止する（Xiao and Sun, 2000）。
哺乳動物細胞中で、ＮＩＫがＳＩＶＡに結合可能かどうかを試験するために、ＮＩＫを、一時的にトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中で２つの既知のＳＩＶＡスプライス変異体である（Yoon et al., 1999）、ＳＩＶＡ１またはＳＩＶＡ２いずれかとともに発現させた。図１Ｂおよび１Ｃで示したように、ＮＩＫは、トランスフェクトした細胞の溶解物からのＳＩＶＡの両方のスプライス変異体と双方向で共免疫沈降した。
興味深いことに、トランスフェクト細胞中のＳＩＶＡ１およびＳＩＶＡ２の細胞レベルが、ＮＩＫの共発現によって増加し、明らかにその結合ＮＩＫ分子によるＳＩＶＡの安定化を反映している。この組の実験にて適用したＳＩＶＡ ｃＤＮＡの特定の容量にて、ＮＩＫの発現もＳＩＶＡの２つのスプライス変異体のいずれかの共発現によって増強された。そのような増強は、ＮＩＫとの、ＧＦＰまたはＩＫＫ１の共発現に際しては観察されなかった（図１Ｂ、ＣおよびＤ）。明白に、ａｌｙ ＮＩＫとの共発現に際して、２つのＳＩＶＡアイソフォームが、効果において差を示した。ＳＩＶＡ１およびａｌｙ ＮＩＫ両方が、それらの共発現に際して安定化し、相互作用した一方で、ＳＩＶＡ２は、共発現したａｌｙ ＮＩＫを安定化せず、またａｌｙ ＮＩＫによって安定化したＳＩＶＡ２でなかった。この安定化の欠如によって、ａｌｙ ＮＩＫのＳＩＶＡ２への結合は査定できなかった（図１ＢおよびＣ）。
インビトロにて、ＮＩＫおよびＳＩＶＡの相互作用を要約するために、ＧＳＴタグ化ＳＩＶＡ２を細菌中に発現させ、ＮＩＫのＮ−末端欠損変異体（ＮＩＫ ３３８〜９４７）をバキュロウイルス中に発現させた。２つのタンパク質の共インキュベーションと、続くＮＩＫの免疫沈降によって、ＳＩＶＡ２を特異的に破壊し、したがって、インビボでのそれらの相互作用が直接的であることが再確認された（図１Ｅ）。
さらに、内因性ＳＩＶＡ２もＣＤ７０リガンド処理後、Ｒａｍｏｓ細胞中に安定に発現したＮＩＫと相互作用することもわかった（図１Ｆ）。同様に、ＮＩＫを安定して発現しており、ＳＩＶＡ２でレトロウイルス的に形質転換したＢＪＡＢ細胞中で、これらの２つのタンパク質が、他のＴＮＦファミリーリガンドであるＴＲＡＩＬとのではなく、ＣＤ４０リガンドでの長期処理後に相互作用した（図１Ｇ〜Ｈ）。反対に、ＳＩＶＡ１とＮＩＫの相互作用は、２つのタンパク質を発現している安定細胞株にて観察されなかった（図示せず）。
ＳＩＶＡのＣＤ２７およびＧＩＴＲレセプターとの相互作用を扱っている先のレポートは、ＳＩＶＡが２つのレセプター中のＴＲＡＦ２結合ドメインへ結合することを示している（Spinicelli et al., 2002）。ＮＩＫはまたＴＲＡＦ−結合タンパク質でもあるので、ＳＩＶＡおよびＴＲＡＦ２が、ＮＩＫに競争的に結合すると推測することができる。しかしながら、ＮＩＫ ＮおよびＣ末端中のＴＲＡＦ２結合ドメインが変化したＮＩＫの２つの変異体バージョンが、野生型ＮＩＫと同様の効果で、ＳＩＶＡに結合した（図１）。ＳＩＶＡはまた、ＮＩＫ機能に影響を与え得るようにみえる。単独で発現した場合、ＳＩＶＡ１およびＳＩＶＡ２が、ＮＦ−κＢのわずかな活性化のみを引き起こした。しかしながら、ＳＩＶＡの両方のスプライス変異体は、ＮＩＫ ａｌｙ変異体によるＮＦ−κＢの活性化においてなんの効果も持たなかった一方で、共発現したＮＩＫによるＮＦ−κＢの活性化を有意に増強した（図１Ｊ）。
実施例２
リングフィンガー様モチーフおよび亜鉛フィンガー様モチーフを含むＳＩＶＡ中のドメインが、ＮＩＫに結合するために重要であり、ＮＩＫ機能のＳＩＶＡ−誘導改変に関与する
Ｓｉｖａは、そのＣ−末端中にリング／亜鉛フィンガー相同システインリッチ領域を含む（図２Ａ）。これまでに、この「Ｂ−ボックス様リング」ドメインになんの機能も割り当てられてこなかった。ＳＩＶＡ２のＢ−ボックス様リング中のＮＩＫ結合ドメインを定義するための欠損解析によって、末端亜鉛フィンガー様ドメインが主要なＮＩＫ結合領域であることが示された（図２Ｂ）。実施、ＳＩＶＡのＮ−末端部分（アミノ酸１〜５７、図２Ａ）を欠く、切断ＳＩＶＡ（ＳＩＶＡ−Ｃ）へのＮＩＫの直接結合が、一過性にトランスフェクトした細胞で検出された（図２Ｆ）。これにそって、レポーター遺伝子アッセイによって、一旦亜鉛フィンガードメインが欠損されたならば、ＳＩＶＡ２が、ＮＩＫ誘導ＮＦ−κＢ活性化を強化する能力を欠く（図２Ｃ）。この切断結合ドメインの発現が、競合阻害剤として、作用し、ＮＩＫに結合し、ＮＩＫ機能を防止する可能性を試験するために、ＳＩＶＡ−Ｃ末端をＮＩＫとともに細胞内に発現させた。興味深いことに、全長ＳＩＶＡ２と同じように、低濃度でのＳＩＶＡ−Ｃ末端もまた、ＮＩＫ誘導ＮＦ−κＢ活性化における効果を増強することを示した（図２Ｄ）。この阻害効果もおそらくＮＩＫに結合し、ＮＩＫ機能を防止することによって、過剰発現ＳＩＶＡ−ＣがまたＣＤ２７誘導ＮＦ−κＢ活性化を落とすので、より生理学的に意味のある状態にても観察された（Ramakrishnan et al., 2004）（図２Ｅ）。一貫して、低レベルのＳＩＶＡ−Ｃを構成性に発現しているＲａｍｏｓ細胞株の安定クローンが、ｐ５２の基底レベルの上昇を示し（図２Ｆ）、ｐ１００処理の増強を引き起こしているＮＩＫ機能の活性化による可能性が最も高い。
実施例３
ＳＩＶＡは、ＮＩＫのポリユビキチン化を促進する。
ＮＩＫは、ユビキチンとの共発現に際して、ユビキチン化を受ける（図３Ａ）。ＮＩＫ発現細胞の、プロテアソーム阻害剤への暴露が、結果として、ポリユビキチン化ＮＩＫの集積となる（図３Ｂ）。種々のユビキチン変異タンパク質を使用することで、ＮＩＫが、Ｋ４８およびＫ６３ポリユビキチン鎖両方に共役可能であることがわかった（図３Ｃ）。驚くべきことに、ＮＩＫはまた、そのリシンがアルギニンに置換されたユビキチン変異タンパク質（Ｋ１１、２９、４８、６３Ｒ）との共発現に際して、モノユビキチン化を示した（図３Ｄ）。モノユビキチン化と一致して、ＮＩＫ配列の手動スキャニングによって、ユビキチン相互作用モチーフ（Ubiquitin Interacting Motif）［ＵＩＭ、潜在的ユビキチン結合配列（Hofmann and Falquet, 2001）］の存在が示された。ＳＩＶＡ２の添加が、ＮＩＫユビキチンのＫ４８およびＫ６３両方の型を増強し（図３Ｅ、３Ａおよび３Ｂ）、一方で、ＮＩＫのモノユビキチン化にインパクトはもたない（図３Ｄ）。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞中のＮＩＫおよびＳＩＶＡの単なる共発現が、内因性ユビキチンでのＮＩＫのポリユビキチン化の発生を引き起こした（図３Ｆ）。興味深いことに、内因性ポリユビキチン鎖に共役したＮＩＫに相当するＮＩＫの高分子量形態もＣＤ２７活性化の後、タグ化ＮＩＫを発現しているＲａｍｏｓ（図３Ｇ）およびＨＥＫ ２９３Ｔ（図３Ｈ）細胞株中でも見られた。ＳＩＶＡ２のＮＩＫへの動員と並んで、この発見は、ＣＤ２７機能におけるＳＩＶＡ２のＮＩＫへの潜在的関与と一致する（Prasad et al., 1997）。ＳＩＶＡ１はまたＮＩＫのユビキチン化を誘導するが、ＳＩＶＡ２と比べてより小さな程度である（図３Ｆ）。リングフィンガーモチーフは、ユビキチン化酵素の触媒活性に対して重要であるので、ＳＩＶＡ２のリングフィンガー−様ドメイン中の保存システイン残基を、ＮＩＫユビキチン化におけるその結果を研究するために、変異導入した（ＳＩＶＡ２ Ｃ７３Ａ）。リングフィンガー変異体ＳＩＶＡ２が、反応の特異性をさらに確認する、ＮＩＫをユビキチン化する能力の劇的な減少を示した（図３Ｆ）。
実施例４
ＳＩＶＡ２は、ＮＦ−κＢ活性化活性をネガティブに制御し、ＮＩＫ分解を与えるその能力をもっとも反映している
ＳＩＶＡは、アポトーシス促進分子であり、カスパーゼ依存ミトコンドリア系における細胞死を誘導する。アポトーシスにおけるその鍵となる役割と一致して、ＳＩＶＡは、異なる細胞型において、ＵＶおよび酸化ストレスに対する応答でアップレギュレートされ、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３およびＥ２Ｆ１の直接転写標的である（Fortin et al., 2004）。アポトーシスの工程において、カスパーゼ８が、ＮＦ−κＢ経路を抑制するために、ＮＩＫのようなタンパク質を開裂することが知られており、その経路は、細胞生存および増殖において重大な役割を果たす（Foeher et al., 2000）。ＮＩＫ誘導ＮＦ−κＢ活性化の効果を査定する一方で、低用量で刺激効果を有する一方、高用量にてＳＩＶＡ２は、ＮＩＫ誘導ＮＦ−κＢ活性化を完全に抑制した（図４Ａ）。これは、細胞中のＮＩＫの発現レベルによく相関し、高濃度のＳＩＶＡ２が存在する場合に、ＮＩＫのレベルが劇的に減少した（図４Ｂ、最初の３レーン）。ＳＩＶＡ２が、一時的発現において、ＮＩＫのＫ４８ユビキチン化を増加させるので、ＳＩＶＡ２が、ＮＩＫのＫ４８ユビキチン化を誘導し、そのプロテアソーム分解を導くことが仮定される。一貫して、ＭＧ１３２またはラクタシスチン（Lactacystin）でのプロテアソーム阻害が、ＮＩＫをＳＩＶＡ誘導分解から効果的に保護した（図４Ｂ）。他の分解の方法の可能性を除いて、パン カスパーゼｐ３５バキュロウイルス阻害剤の発現またはリソソーム阻害剤での処理は、ＮＩＫをＳＩＶＡ２−誘導分解から保護しなかった（図示せず）。過剰発現ＳＩＶＡ２もＨＥＫ ２９３Ｔ細胞中で安定に発現したＮＩＫを分解した（図４Ｃ）。反対に、ＳＩＶＡ１２は、ＮＩＫの分解を与える能力を示さなかった（図示せず）。次に、ＳＩＶＡ２の２つの欠損変異体、亜鉛フィンガーのないもの、およびリングおよび亜鉛フィンガー両方のないもの、をＮＩＫを分解するそれらの能力に関して試験した。興味深いことに、全長タンパク質のように、両方の欠損変異体が、ＮＩＫ分解を誘導可能であることがわかった（図４Ｄ）。リングおよび亜鉛フィンガーを欠いている、ＳＩＶＡ２ １〜５８もＮＩＫの分解を与え、この断片もＮＩＫのＫ４８ユビキチン化を誘導可能であるかどうかを試験することに引きつけた。実際、ＮＩＫの分解を与えるその能力に一致して、ＮＩＫ結合が不能であることを通してでさえ、ＳＩＶＡ２ Ｎ−末端が、ＮＩＫの特異的Ｋ４８ユビキチン化を誘導する（図４Ｅ）。この発見によって、ＳＩＶＡが、ＮＩＫ誘導Ｋ４８ユビキチン化の直接Ｅ３ではないが、他のアクセサリー因子を必要とするユビキチン化複合体の一部であることが示された。同様に、ＴＲＡＦ３はまた、その分解を引き起こす、間接ユビキチン化酵素として報告された（Liao et al., 2004）。
実施例５
ＮＩＫの６７０位でのリシン残基が、ＳＩＶＡ２によるその分解に関与するＫ４８ユビキチン化の部位である
連続欠損解析によって、ＮＩＫ中の短い領域、アミノ酸６４０〜７２０が、潜在的ユビキチン化可能領域として定義された（図５Ａ）。この領域は、３個の保存されたリシン残基を有し、これらのリシンの１つの、アラニンへの変異、Ｋ６７０Ａは、野生型ＮＩＫ（図５Ｂ、左パネル）と比較して、ＮＩＫのＫ４８ユビキチン化をとりわけ減少させる（図５Ｂ、右パネル）。Ｋ４８ユビキチン化がプロテアソーム分解に関するマーカーであり、ＳＩＶＡ２が、ＮＩＫのユビキチン化およびプロテアソーム分解を誘導したことがわかったので、ＳＩＶＡ２によるＮＩＫ Ｋ６７０Ａの分解を、査定した。実際に、ＮＩＫの残基６７０でのリシン置換が、ＮＩＫをＳＩＶＡ誘導分解から劇的に保護したことがわかった（図５Ｃ）。しかしながら、より高い濃度のＳＩＶＡ２と、培養時間の延長で、ＮＩＫ Ｋ６７０Ａレベルが細胞内で落ち始めた。これは、リシン６７０が、その分解を導くＳＩＶＡ２によるＮＩＫのＫ４８ユビキチン化に必須であるが、関与する唯一の残基ではないことを証明している。リシン６７０はおそらく、ＮＩＫが分解するように感作しているＳＩＶＡ２による、Ｋ４８ユビキチン化を受けている最初の残基として働く。先にＴＲＡＦ３過剰発現が、ＮＩＫ分解を引き起こすことが報告された（Liao et al., 2004）。ＳＩＶＡ２およびＴＲＡＦ３の、ＮＩＫ Ｋ６７０Ａの分解を与える能力を比較した一方で、リシン６７０変異が、ＮＩＫを、ＴＲＡＦ３−誘導分解からではなく、ＳＩＶＡ２−誘導からのみ、保護する事がわかった（図５Ｄ）。したがって、ＮＩＫは、ＳＩＶＡ２に対する、およびＴＲＡＦ３に対する応答両方で分解されるが、２つの工程に関与する分子機構は異なる。
次に、ＳＩＶＡリングフィンガー変異（ＳＩＶＡ２ Ｃ７３Ａ）が、ＮＩＫをユビキチン化するその能力を著しく減少させることが観察されたので、ＮＩＫ分解におけるこの変異ＳＩＶＡ２の発現の結果を試験した。野生型と同様に、リングフィンガー変異体ＳＩＶＡ２もまた、ＮＩＫおよびａｌｙ ＮＩＫを分解した。思いがけなく、野生型とは異なり、ＳＩＶＡ２ Ｃ７３Ａは、共発現したＮＩＫ Ｋ６７０Ａを効果的に分解した（図５Ｅ）。
異なるユビキチン変異体での一過性の発現によって、自己による、リングフィンガー領域、ＳＩＶＡ−Ｃが、Ｋ６３ユビキチン化を受け、ＮＩＫと共沈殿させる事がわかった（図５Ｆ）。しかしながら、全長ＳＩＶＡとは異なり、ＳＩＶＡ−Ｃが、ＮＩＫのＫ６３ユビキチン化を与えることができないことがわかった（図５Ｅ）。
実施例６
ＳＩＶＡ２は、Ｋ６３ユビキチン化を引き起こすＥ３リガーゼであり、そのリングフィンガーがこの機能を仲介する
Ｅ３ｓは、ユビキチン化反応の選択性および効果を決定するユビキチン−タンパク質リガーゼである。ほとんどすべての公知のＥ３ｓが、ユビキチン化反応に関与するために、リングフィンガーまたはＨＥＣＴドメインいずれかを利用する（Hofmann and Pickart, 2001）。ＳＩＶＡ２リングフィンガーが実際に、ＮＩＫのＫ６３ユビキチン化に関与し、Ｋ６３連結作を介してのみポリユビキチン化を許容する、ユビキチン変異体Ｋ４８Ｒが、ＮＩＫとともに細胞中で発現した。予想されたように、ＳＩＶＡ２添加が、ＮＩＫのＫ６３ポリユビキチン化を著しく促進し、ＳＩＶＡ２中のリングフィンガー変異がこの能力を防止し、これは、リングフィンガーの機能として、Ｋ６３ユビキチン化を示している。先に、本発明者らのツー ハイブリッド スクリーニングにおいて、ＮＩＫ Ｃ−末端によって釣ったプレイの１つが、ユビキチン共役酵素、Ｕｂｃ１３であった。このＥ２が補因子、Ｕｅｖ１と一緒に、タンパク質のＫ６３ユビキチン化を特異的に仲介した（Hofmann and Pickart, 2001）。ＳＩＶＡ２誘導ＮＩＫ Ｋ６３ユビキチン化におけるＵｂｃｌ３の関与を試験するため、およびその特異性を再確認するために、触媒的に不活性なＵｂｃ１３（Ｃ８７Ａ）を過剰発現させて、この工程を防止した（Deng et al., 2000）。一貫して、Ｕｂｃ１３ Ｃ８７Ａが、ＳＩＶＡ２誘導ＮＩＫ Ｋ６３ユビキチン化を防止した（図６Ａ）。
ＣＹＬＤは、ユビキチン鎖に連結したＫ６３を標的化する、脱ユビキチン化酵素である（Kovalenko et al., 2003）。ＣＹＬＤの共発現が、ＮＩＫ上のＳＩＶＡ２誘導ユビキチンを簡単に脱共役させ、これは、ＮＩＵＫの特異的Ｋ６３ユビキチン化に関するさらなる証拠を提供する（図６Ｂ）。
観察されたインビボユビキチン化に加えて、インビトロでのＮＩＫ Ｋ６３ユビキチン化を試験した。残念ながら、これらの系中で調製されたタンパク質の不溶性および不活性のために、細菌または昆虫細胞いずれかから、組換え体ＮＩＫを得ることは不可能であった。したがって、本発明者らは、哺乳動物細胞から、またはインビトロ転写および翻訳ウサギ網状赤血球溶解物系から、過剰発現し精製したＮＩＫを使用することを決定した。両方の方法によって調製したＮＩＫは、Ｅ３の添加なしで、Ｅ１およびＥ２とともにインキュベートした場合に、Ｋ６３ユビキチン化の飽和を示し、そのインビトロユビキチン化のためにＥ３として働く、ＳＩＶＡ２の能力の解析を妨害する。この発見によって、ほ乳動物系にて発現したＮＩＫが、熱心に結合し、Ｅ３リガーゼ（類）を停止させ、そのインビトロでのユビキチン化に影響を与える。この知見は、哺乳動物系において発現されるＮＩＫは、インビトロでそのユビキチン化をもたらすＥ３リガーゼに強く結合し、停止させるということを示す。またあるいは、ＮＩＫそれ自身がＥ３リガーゼ活性を有するということを示す。次に、バキュロウイルス系を使用して、昆虫細胞中で、３３７ Ｎ−末端アミノ酸を欠く切断ＮＩＫを発現した。この切断ＮＩＫ（３３８〜９４７）は、全長ＮＩＫよりもより可溶性であり、インビトロユビキチン化実験に適用した。ＮＩＫ３３８〜９４７は、ＳＩＶＡ２の存在下または非存在下においてユビキチン化を示さなかった。これは、この切断ＮＩＫの、工程に関与する不能性による可能性がある。または、ＮＩＫ Ｎ−末端が、Ｋ６３ユビキチン化を受けている領域であることが示され得る。
ＳＩＶＡ２がＮＩＫを安定化するように働くという考えと一致するようにみえる１つのさらなる発見が、ＴＲＡＦ２、ＮＩＫおよびＳＩＶＡ２をＨｅＬａ細胞中に共発現した実験で得られた。ＴＲＡＦ２がＮＩＫ分解を誘導した。先に示したように、低用量でのＳＩＶＡ２が、ＮＩＫの量および機能を増加させた。加えて、図６Ｃで示したように、低用量ＳＩＶＡ２が、ＴＲＡＦ２誘導分解から、ＮＩＫを安定化／保護した。
明らかに、細菌発現組換え体ＳＩＶＡ２それ自身が、Ｅ１およびＥ２（Ｕｂｃｌ３／ＵｅｖＩ）を加えたインビトロユビキチン化反応中で自己−Ｋ６３ユビキチン化されることが見出され、これは、強力なＥ３リガーゼとして、自己−ユビキチン化を誘導可能であることを確立している（図６Ｄ）。
実施例７
細胞中の誘導可能ＳＩＶＡ２発現がＮＩＫ機能を緩衝する発見の、生理学的重要性の探索
最初に、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）アプローチによる、その発現を抑制することによってＳＩＶＡ機能を研究することが試みられた。いくつかのｓｉＲＮＡを設計し、ｐＳＵＰＥＲベクター（Brummelkamp et al., 2002）内にクローン化し、ＨＥＫ ２９３Ｔ中にて、それらのＳＩＶＡメッセージを減少させる能力に関して試験した。ＲＴ−ＰＣＲによって、２つの最適なサプレッサー、ｐＳＵＰＥＲ−ＮＣ３およびｐＳＵＰＥＲ−２７５（図７Ａ）が、さらなる実験のために選別された。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞中のＣＤ２７誘導ＮＦ−κＢレポーター遺伝子活性化に関する、ｐＳＵＰＥＲ−ＮＣ３の一時的発現が、ルシフェラーゼ活性の２倍の増加を示した（図７Ｂ）。ＳＩＶＡが、ＮＩＫのダウンレギュレーションを誘導可能であるという発見を考慮して、この発見が、ＳＩＶＡレベルを減少させることが、ＮＩＫレベルの上昇を介して、ＣＤ２７−誘導シグナル伝達を促進することをほのめかし得る。次に、ＳＩＶＡ欠損細胞株を作成することが試みられた。この目的のために、ＳＩＶＡ特異的ｓｉＲＮＡを発現しているレンチウイルスを記述された（Lois et al., 2002）ように調製し、異なる細胞株を形質転換した。ＳＩＶＡの完全な抑制は、このアプローチで、Ｒａｍｏｓ、ＲＡＪＩまたはＢＪＡＢ細胞においては観察されなかった。ＳＩＶＡレベルのおよそ７５％の減少が達成されたＲａｍｏｓ細胞中で、ＣＤ２７シグナル伝達を試験することにおいて（図７Ｃ）、対照細胞と比較して、ｐ５２およびｐ６５の核への転位において、軽微な差異しか発見されなかった（図７Ｄ）。ＮＩＫレベルおよび機能の増加を示している、ＣＤ７０刺激後のＳＩＶＡ発現細胞の核内のｐ５２およびｐ６５のわずかに上昇したレベルが、見られた。しかしながら、これらのわずかな差違が、信頼可能な結論を導くのに十分である。
ＳＩＶＡは、ストレス誘導タンパク質である（Fortin et al., 2004; Henke et al., 2000; Padanilam et al., 1998）。したがって、その抑制の効果に追跡することによってではなく、ＳＩＶＡのレベルの上昇の効果を研究することによって、ＳＩＶＡの生理学的役割を評価することがより妥当であり、実現可能である。この方向において、最初に、細胞中のＳＩＶＡ２の安定発現の結果を試験した。繰り返しの試みにおいて、ＳＩＶＡ２が、短時間においてのみ細胞中で構成性に発現し、その後発現が失われた。この確率の後早期に、ＳＩＶＡ２を構成性に発現している３つの異なるＲａｍｏｓ細胞クローンを試験して、これらの細胞が、ＩκＢαの減少した基底レベルを発現することがわかり、ＣＤ７０刺激の後、ｐ１００処理の減少および核へのｐ５２およびｐ６５転位の減少を示した（図７Ｅ）。ＮＦ−κＢ活性化におけるＳＩＶＡ２アップレギュレーションの効果のさらなる連結のために、ＳＩＶＡ２に対する誘導可能な発現系を開発することが決定された。これを達成するために、エクジソン誘導可能２９３Ｔ Ｅｃｒ細胞（インビトロジェン）を、誘導可能ＦＬＡＧ−ＳＩＶＡ２およびＣＤ２７、および両方を発現しているクローンでトランスフェクトし、導入したタンパク質を、薬物耐性に関する選別によって同定した。ＳＩＶＡ２発現を、これらをラクタシスチン、プロテアソーム阻害剤に暴露した場合にのみ、これらの細胞の誘導後に検出可能でありこれは、ＳＩＶＡ２が、高い回転率を有する短命タンパク質であることを示しており、その合成後すぐに分解を受けている。この条件下、ＳＩＶＡ２は、インデューサーの適用３時間ほどで、細胞中に集積した。同様に、プロテアソーム阻害剤によるＳＩＶＡ２発現の過度のユビキチン化および増強も一時的発現試験にて観察された（図７Ｆ）。ＳＩＶＡ２を構成性に発現している細胞中で実施した実験を要約すると、ＳＩＶＡ２発現の誘導が、結果として核ｐ５２の、またＣＤ７０によるＲｅｌＢ誘導の減少となることが一貫してわかり、これは、ＮＩＫ機能の混乱を指摘している。しかしながら、ＳＩＶＡ２を構成的に発現しているＲａｍｏｓ細胞クローンとは異なり、誘導可能に発現したＳＩＶＡ２は、２９３細胞中のＣＤ７０誘導ｐ６５核転位に有意に影響を与えはしなかった（図７Ｇ）。
次に、ＨＥＫ ２９３Ｔ内のＣＤ７０誘導によって仲介されたｐ５２およびｐ６５の核転位におけるＳＩＶＡサイレンシングの効果を調査した。本目的のために、レトロウイルス形質転換ＮＩＫを発現しているＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を、リン酸カルシウム沈殿法によって、ｐＳＵＰＥＲ ＳＩＶＡまたはｐＳＵＰＥＲ空ベクター、スクランブル非六位的配列をコードしているｐＳＵＰＥＲベクターおよび対照としてＧＦＰ配列に対するｓｉＲＮＡをコードしているｐＳＵＰＥＲベクターをトランスフェクトした。ｐＳＵＰＥＲ ＳＩＶＡまたはｐＳＵＰＥＲ対照ベクターをトランスフェクトした細胞を、ＣＤ７０発現培地にて８時間処理するか、または未処理のままとし、核および細胞質抽出物を調製し、ＮＩＫ、ｐ１００、ｐ５２およびｐ６５の検出のための適切な特異的抗体でのウエスタンブロッティングによって解析した。アクチン特異的抗体を、内部標準として、アクチンを検出するために使用した。結果は、ＳＩＶＡのサイレンシングが、細胞質中のＮＩＫ、および核中のｐ５２のレベルを上昇させる（図７Ｈ）。
実施例８
ＭＩＫは直接ＳＩＶＡ２をリン酸化し、その安定化を引き起こす
ＮＩＫとの共発現に際して、ＳＩＶＡタンパク質レベルにおける増加を考慮するメカニズムを研究するために、この調節が、ＮＩＫのキナーゼ機能に関与するかどうかを調査した。インビトロキナーゼアッセイを用いて、ＮＩＫが簡単にＳＩＶＡ２をリン酸化することがわかり、これは、ＳＩＶＡ２が、ＮＩＫの生理学的基質であり得ることを示している。ＳＩＶＡは以前に、Ｙ３４でのＡＲＧキナーゼによってチロシンリン酸化を受けることが報告された（Cao et al., 2001a）。しかしながら、本明細書において、ＳＩＶＡ２のＮＩＫ−誘導リン酸化が、Ｙ３４Ｆ変異によって影響を受けないことが示されている。また、キナーゼ−死ＮＩＫで、ＳＩＶＡ２のリン酸化は観察されなかった（図８Ａ）。これらの実験において、ＳＩＶＡ２の発現を確認するために、細胞の全溶解物を解析する一方で、ＮＩＫが共発現したＳＩＶＡ２を著しく安定化する一方、キナーゼ−死ＮＩＫが、この能力を完全に欠くことがわかり、ＳＩＶＡ２安定化における、ＮＩＫによるＳＩＶＡ２リン酸化の役割を示している（図８Ｂ）。ＮＩＫ−誘導ＳＩＶＡ２リン酸化が、直接の事象であるのか、またはＮＩＫの下流キナーゼによって仲介されるものであるのかを決定するために、キナーゼ−不活性ＩＫＫ１またはＩＫＫ２がそれを干渉可能かどうかを試験した。ＮＩＫがＩＫＫ１を介して効果を発揮する場合、ＮＦ−κＢ ｐ１００のリン酸化とは異なり（Senftleben et al., 2001）、ＩＫＫ１またはＩＫＫ２の変異体のいずれもが、ＮＩＫによるＳＩＶＡ２リン酸化における任意の有意な効果を持たなかった。これらの初期発見によって、ＳＩＶＡ２リン酸化が、ＳＩＶＡ２でのＮＩＫ誘導の直接の結果であり得ることが示される（図８Ｃ）。
実施例９
ＳＩＶＡ１でなく、ＳＩＶＡ２が、ＮＩＫ誘導ユビキチン化およびＴＲＡＦ３の開裂を促進する
ユビキチン仲介分解を含む、ネガティブ調節物としてＴＲＡＦ３は機能する（Liao et al., 2004）。これにそって、ＴＲＡＦ３の過剰発現は、ＮＩＫ誘導ＮＦ−κＢレポーター活性を抑制する。ＴＲＡＦ３はまた、低レベルで、ＳＩＶＡ２の共発現によって与えられるＮＩＫ機能の増強効果を抑制した（図９Ａ）。
これらの実験の経過において、ＮＩＫがまたＴＲＡＦ３を調節し、そのユビキチン化および分解に影響を与えることが驚くべきことにわかった。内因性ユビキチンの存在において、ＮＩＫは、ＴＲＡＦ３ユビキチン化を劇的に増幅し、還元ゲル中で、多重ＴＲＡＦ３バンドパターンを産出した。ユビキチンまたはＮＩＫのみの添加もいくらかの程度まで、ＴＲＡＦ３を調節した。注意深い解析によって、ユビキチン化に加えて、ＴＲＡＦ３の（Ｎ末端ＨＩＳタグを維持しているような）Ｎ−末端ドメイン低分子量バンド（ｄＴＲＡＦ３）が、主要な開裂産物として現れた（図９Ｂ）。
次に、ＮＩＫ誘導ユビキチン化およびＴＲＡＦ３の開裂におけるＳＩＶＡタンパク質の効果を試験した。ユビキチン発現のみがＴＲＡＦ３に影響を与えたので、本実験を、バックグラウンドを制限するために、内因性ユビキチンなしで実施した。本セットアップにおいて、ＮＩＫのみが、ＴＲＡＦ３のほんの少しの改変を引き起こした。しかしながら、ＴＲＡＦ３のＮＩＫ誘導改変における、ＳＩＶＡ１およびＳＩＶＡ２の明確な差動効果が検出された。ＳＩＶＡ１は、ＮＩＫによって誘導されたものにわたって、ＴＲＡＦ３における効果を持たなかった。一方で、ＳＩＶＡ２は、ＴＲＡＦ３ユビキチン化および開裂を有意に増加させた（図９Ｃ）。（Ｋ４８およびＫ６３変異体ユビキチンとの一過性共発現による）ＴＲＡＦ３のユビキチンの種類のさらなる解析に際して、ＴＲＡＦ３のポリユビキチン化の主要な種類が、Ｋ６３連結であり、一方で、Ｋ４８連結ユビキチン化は最小であったことがわかった（図９Ｄ）。興味深いことに、ＴＲＡＦ３、ＳＩＶＡ２およびＫ６３連結鎖を形成することが可能なユビキチン変異体の共発現が、結果としてＴＲＡＦ３のユビキチン化および開裂となり、トランスフェクトＮＩＫの非存在下でさえ、ｄＴＲＡＦ３断片を産出する。野生型ＳＩＶＡ２の、リングフィンガー変異体ＳＩＶＡ２での置換が、ｄＴＲＡＦ３産出を完全に廃止し、これは、工程における、ＳＩＶＡ２リングフィンガーに対する重大な役割を示している。プロテアソーム阻害もＳＩＶＡ２−誘導ｄＴＲＡＦ３形成を阻害することもわかり、これは、工程がＫ６３ユビキチン化およびプロテアソーム−依存であることを示している（図９Ｅ）。一貫して、リソソーム阻害は、ＳＩＶＡ２またはＮＩＫに対する応答いずれかで、ＴＲＡＦ３の開裂を防止しなかった（図示せず）。先のレポートが、カスパーゼによるＴＲＡＦ３の同様の開裂を示し、Ｎ−末端ＴＲＡＦ３断片を産出した（Lee et al., 2001）。しかしながら、ＴＲＡＦ３中のカスパーゼ−開裂部位におけるアスパラギン酸残基のアラニンへの変異（ＴＲＡＦ３ Ｄ３４７Ａ）は、ＳＩＶＡ２に対するその開裂を防止しなかった（図９Ｅ）。同様に、ＴＲＡＦ３のＮＩＫ−誘導開裂はまた、Ｄ３４７Ａ変異によって防止されず、しかし増強されたように見え、これは、ＮＩＫ−およびＳＩＶＡ２−誘導ＴＲＡＦ３開裂が、異なるメカニズム、もっともあり得るのはプロテアソーム処理によって発生したことを示している。リングフィンガー変異体ＴＲＡＦ３はまた、野生型ＴＲＡＦ３のような同様の程度まで、ＮＩＫによって開裂された（図９Ｆ）。驚くべきことに、ＮＩＫまたはＳＩＶＡ２いずれか、およびＫ６３連結鎖を形成するために可能なユビキチン変異体の存在下で、劇的なユビキチン化を示し、トリトン不溶性画分内にほとんど存在した（図９Ｇ）。
次に、ＮＩＫ、ＳＩＶＡ２およびＴＲＡＦ３が独立して完全に機能するかどうかを理解するために、本発明者らは、一過性にこれらのタンパク質を発現している細胞からの共沈殿実験を実施した。実際、三部分複合体が存在し、これはＮＩＫキナーゼ機能に依存しなかった。内因性ＮＩＫの非存在下で、ＴＲＡＦ３およびＳＩＶＡ２の弱い相互作用のみが観察され、おそらく内因性ＮＩＫによって仲介された。結合がＮＩＫのキナーゼ機能によって影響を受けない、ｐ１００−ＮＩＫ−ＩＫＫ１複合体の場合（Xiao et al., 2004）、ここでまたＮＩＫが、ＴＲＡＦ３とＳＩＶＡ２を連結しているアダプタータンパク質の役割を果たす（図９Ｈ）。
実施例１０
ＨｅＬａおよびＲａｍｏｓ細胞中のＳＩＶＡ２の誘導が、結果としてＮＦ−κＢのさらなる活性化となる
ＮＦ−κＢの代替活性化におけるＳＩＶＡ２の効果を試験するために、クローン化遺伝子のテトラサイクリン（またはドキシ−ドキシサイクリン、テトラサイクリン類似体）誘導可能発現を可能にする、ＴＲＥＣクローニング系を用いた。ＳＩＶＡ２遺伝子を、ＴＲＥＸ系中にクローン化し、ＨｅＬａ細胞内に安定に導入した。細胞は、誘導可能なＳＩＶＡ２発現を示し（データは図示せず）、さらに、ＳＩＶＡ２発現が誘導されなかった場合、細胞は、通常ＮＦ−κＢ活性化に関して、ＬＩＧＨＴリガンドに応答する。
テトラサイクリン誘導可能ＳＩＶＡ２を発現可能なＨｅＬａ ＴＲＥＸ細胞を、ＬＩＧＨＴ濃縮培地にて、８時間、ＮＦ−κＢを活性化するために処理した。ＬＩＧＨＴ処理に続いて、細胞を溶解し、細胞質および核画分に画分化し、核画分を、抗−ｐ５２、ＲｅｌＢまたはｐ６５特異的抗体でプローブしたウエスタンブロット解析にかけた。ＬＩＧＨＴが、ＨｅＬａ細胞中で、ｐ５２およびｐ６５核転位両方を誘導したことがわかった。ＬＩＧＨＴ−仲介ＮＦ−κＢ活性化におけるＳＩＶＡ２の誘導の効果を研究した。得られた結果は、ＳＩＶＡ２の短時間誘導が、増強ＬＩＧＨＴ−仲介ｐ５２およびｐ６５核転位を増強し、一方で、ＳＩＶＡ２の長時間誘導が、ｐ５２およびｐ６５両方のＬＩＧＨＴ−仲介核転位を干渉したことを示している（図１０Ａ）。
ＳＩＶＡ２遺伝子を、２９３−ｅｃｒ細胞（インビトロジェン）系中にクローン化した。この系は、ＳＩＶＡ２のエクジソン（または類似体ポナステロン）−仲介誘導可能発現を可能にする。クローン化したＳＩＶＡ２遺伝子を含む２９３−ｅｃｒ細胞を、ＣＤ２７を構成性に発現するように遺伝子工学的に改変した。これらの細胞を、０および８時間、ＣＤ７０で処理し、代替ＮＦ−κＢ経路の活性化を誘導した。処理の後、細胞を溶解し、細胞質および核画分に画分化し、抗ＮＩＫ、ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ３ ｐ１００およびｐ５２抗体でプローブしたウエスタンブロット解析にかけた。結果は、ＣＤ７０誘導の最後の時間での、短時間のＳＩＶＡ２の誘導が、ＴＲＡＦ２／３のレベルを減少させ、ＮＩＫおよびｐ１００処理のレベルを増加させ、結果として、核ｐ５２レベルの増加となった。ＣＤ７０処理にそって８時間の、ＳＩＶＡ２の長時間の誘導が、ＮＩＫおよび核ｐ５２のレベルを減少させた（図１０Ｂ）。これらの結果は、２９３細胞内で、ＳＩＶＡが、ＮＩＫおよびＮＩＫ仲介ＮＦ−κＢ活性化における、陽性および陰性制御効果両方を有することを示している。
テトラサイクリン誘導可能ＳＩＶＡ２または変異体ＳＩＶＡ２Ｃ７３Ａを発現可能なＴＲＥＸ系を有するＲａｍｏｓ細胞を、ＣＤ７０で処理して、ＮＦ−κＢを活性化し、ＣＤ７０誘導ＮＦ−κＢ活性化におけるＳＩＶＡ２の効果を研究した。本目的のために、Ｒａｍｏｓ細胞を、ＣＤ７０で０、０．３または８時間処理し、長時間（８時間）、短時間（１時間）、ＳＩＶＡ２または変異体ＳＩＶＡ２Ｃ７３Ａを発現するように誘導するか、または誘導しなかった。図で示したように、ＳＩＶＡの誘導での８時間リガンド処理、ドキシサイクリンをリガンドと一緒に適用した。ＳＩＶＡの１時間誘導のために、ドキシサイクリンを、８時間リガンド処理の最後の１時間で加えた。短時間ＣＤ７０処理の場合に、ドキシサイクリンを８時間、または１時間加え、リガンドを最後の０．３時間適用した。次に、細胞を溶解し、核および細胞質抽出物に画分化し、抗−ＩκＢα、ｐ６５、ｐ１００およびｐ５２特異的抗体でプローブ化したウエスタンブロットにかけた。得られた結果が、野生型ＳＩＶＡ２の誘導が、ＣＤ７０誘導ＩκＢα分解およびｐ６５の核への転位を防止したことを示している（図１０Ｃ）。反対に、リングフィンガー変異体ＳＩＶＡは、ＣＤ７０誘導ＩκＢα分解を防止せず、ｐ６５の核転位を増強した。ＳＩＶＡ２誘導もリングフィンガー依存様式で、ＣＤ７０誘導ｐ５２核転位を防止した。したがって、ＨＥＫ ２９３ＴおよびＨｅＬａのような接着細胞とは異なり、リンパ球にて、短時間ＳＩＶＡ誘導は、ＮＦ−κＢ活性化を増強せず、これは、非−リンパ球およびリンパ球細胞におけるＳＩＶＡの活性の様式が異なることを示している。
テトラサイクリン誘導可能ＳＩＶＡ２または変異体ＳＩＶＡ２ Ｃ７３Ａを発現可能なＲａｍｏｓ ＴＲＥＸ細胞を、ＴＮＦで処理し、ＳＩＶＡ２またはＳＩＶＡ２ Ｃ７３Ａ誘導のＴＮＦ誘導ｐ６５の核への転位における効果を研究した。本目的のために、Ｒａｍｏｓ細胞をＴＮＦにて０、０．３および４時間処理し、ＳＩＶＡ２または変異体ＳＩＶＡ２Ｃ７３Ａを発現するように、長時間（４時間）または短時間（１時間）誘導し、または以上で記述したように、誘導なしでおいた。細胞を溶解し、核および細胞質抽出物に画分化し、抗−ｐ６５特異的抗体でプローブ化したウエスタンブロット解析にかけた。得られた結果が、野生型ＳＩＶＡ２の誘導が、ＴＮＦ誘導ｐ６５の核への転位を防止したことを示している（図１０Ｄ）。反対に、ＳＩＶＡのリングフィンガー変異体の誘導が、ＴＮＦ誘導ＩκＢα分解を誘導し、ｐ６５の核転位を増強した。
したがって、ＳＩＶＡ２上昇は、Ｒａｍｏｓ細胞中のＴＮＦ誘導ＮＦ−κＢ活性化を抑制する。
実施例１２
ＳＩＶＡ２によるＴＲＡＦ２のインビトロユビキチン化。
インビトロユビキチン化アッセイを、組換え体ＨＩＳ−ユビキチン−Ｋ６５のみ（Ｋ６３を除くユビキチン中のすべてのリシンがアルギニンに変異された、組換え体ＨＩＳ−ユビキチン、ボストン バイオケム）（８μｇ）、Ｅ１（０．２μｇ）、Ｅ２（０．５μｇ）、および１〜２μｇの、ＦＬＡＧタグ化ＴＲＡＦ２ｔｐｍｐ組換え体ＧＳＴ−ＳＩＶＡまたはＧＳＴ−ＳＩＶＡＣ７３Ａを含む、５０μｌ反応容量中で実施した。ＦＬＡＧタグ化ＴＲＡＦ２を一過性に発現させ、抗ＦＬＡＧ Ｍ２ビーズ（シグマ）を用いて精製し、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６、５ｍＭ ＭａＣｌ２、２ｍＭ ＡＴＰ、０．２ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭリン酸クレアチニン、０．２μｇ／ｍｌクレアチニンキナーゼおよび５μＭユビキチンアルデヒドを含む緩衝液中、ＦＬＡＧペプチドを用いて溶出した。反応液を３０℃で１時間インキュベートした。反応液を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび完全プロテアーゼ阻害カクテルを含む緩衝液で１ｍｌまで希釈した。ＴＲＡＦ２を、４℃で４時間、抗−ＦＬＡＧ Ｍ２ビーズを用いて免疫沈降させた。免疫沈降物を、抗ＴＲＡＦ２（Ｈ２４９、サンタクルズ）抗体でのウエスタンブロッティングにかけた。図１１Ａ中の結果が、変異体ＳＩＶＡ２Ｃ７３Ａではなく、ＳＩＶＡ２が直接、ＴＲＡＦ２のＫ６３ユビキチン化を誘導することを示している。
実施例１３
ＳＩＶＡ−Ｃ末端を構成性に発現しているＲａｍｏｓ細胞が、Ｂ細胞中ＴＲＡＦ２欠損を摸倣する。
ＴＲＡＦ２欠損Ｂ細胞は、高レベルのｐ５２（構成性代替ＮＦ−κＢ）およびＴＲＡＦ３（Grech et al.,2004）を提示している。同様に、ＳＩＶＡ Ｃ末端を安定に発現するように遺伝子工学的に改変したＲａｍｏｓ細胞が、高レベルのｐ５２ならびにＴＲＡＦ３、およびＴＲＡＦ２の発現の現象を示している（図１１Ｂ）。ＳＩＶＡｃ発現からの結果である、超ＮＦ−κＢ活性化が、結果として、細胞からのＮＦ−κＢ依存免疫調節物の発現の増強となり得る。
実施例１４
ＴＲＡＦ２のＳＩＶＡ２へのインビトロ結合
ＴＲＡＦ２がＳＩＶＡ２に結合するかどうかを調査するために、ＦＬＡＧタグ化ＴＲＡＦ２を、抗−ＦＬＡＧ Ｍ２ビーズを用いて、トランスフェクトした１９３Ｔ細胞から免疫沈降した。ＴＲＡＦ２を、ＦＬＡＧペプチドを用いて、ビーズより溶出した。溶出したＦＬＡＧタグ化ＴＲＡＦ２を、組換え体（細菌発現）ＧＳＴタグ化ＳＩＶＡ２またはＧＳＴタグ化リングフィンガー変異体ＳＩＶＡ２とともに、５０μｌ緩衝液（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ＤＴＴ）の容量中、３０℃で１時間インキュベートした。次に、結合混合液を、１ｍｌまで希釈して、以下の成分−３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ＤＴＴ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００および１ｍＭ ＥＤＴＡを実現した。免疫沈降を、ＴＲＡＦ２に対して抗−ＦＬＡＧで実施し、ウエスタンブロッティング解析を、抗ＳＩＶＡにて実施して、共沈殿しているＳＩＶＡを検出した。結果が、ＴＲＡＦ２が、インビトロで直接ＳＩＶＡ２に結合すること、およびＳＩＶＡのリングフィンガーが、本結合に対して重要であること、を示している（図１１Ｃ）。後者は、以下の実験で確認した。リン酸カルシウム法によって、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を、１２ｕｇのＨＩＳ−ＳＩＶＡ２、またはリングフィンガーを欠いているＳＩＶＡ２（ＳＩＶＡ２ １〜５８およびＳＩＶＡ １〜８１）およびＦＬＡＧ−ＴＲＡＦ２の欠損で共トランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後、細胞を回収し、溶解緩衝液を含む１％ Ｔｒｉｔｏｎ中で溶解した。ＴＲＡＦ２を、抗ＦＬＡＧ−Ｍ２ビーズを用いて免疫沈降し、共沈殿したＳＩＶＡ２を、抗ＨＩＳ抗体を用いたウエスタンブロッティングによってプローブ化した。図１１Ｄ中の全溶解物が、タンパク質の発現レベルを示している。得られた結果が、リングフィンガーがない場合（ＳＩＶＡ２ １〜５８）、ＴＲＡＦ２と共沈殿せず、リングフィンガーが存在する場合（本来のＳＩＶＡ２およびＳＩＶＡ２ １〜８１）のみ共沈殿することを示している。これらの結果により、ＳＩＶＡ２中のリングフィンガーが、ＴＲＡＦ２およびＳＩＶＡ２の結合のために必要であることが確認された（図１１Ｄ）。
実施例１５
ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞中のＳＩＶＡの過剰発現が、ＴＲＡＦ２のＫ４８ユビキチン化を増強する
ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を、４μｇのＦＬＡＧ−ＴＲＡＦ２、６ｕｇのＨＩＳ−ＳＩＶＡ２および６μｇのユビキチン変異体プラスミドで、リン酸カルシウム法によってトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後、細胞を１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を含む緩衝液中で溶解し、免疫沈降し、特異的抗体を用いてウエスタンブロット解析した。ＴＲＡＦ２リングフィンガー変異体（Ｃ３４Ａ）を使用して、その自己ユビキチン化を防止した。ＴＲＡＦ２中のリングフィンガー変異は、自己Ｋ６３ユビキチン化のみを防止した。ＳＩＶＡ２は、そのリングフィンガーの機能として、ＴＲＡＦ２のＫ４８ユビキチン化を増強した。ＴＲＡＦ２リングフィンガー変異体が、ＳＩＶＡ２に結合するその能力を維持した（図１１Ｅ）。
実施例１６
ＳＩＶＡ２は、Ｒａｍｏｓ細胞中、ＣＤ２７レセプターに動員されたＴＲＡＦ２のユビキチン化を調節する
ＣＤ２７レセプターへのＴＲＡＦ２動員を、ＦＬＡＧ−ＣＤ７０での刺激によって誘導し、このレセプターへ動員されたＴＲＡＦ２を、時間点あたり１００×１０6細胞から、ＦＬＡＧ−ＣＤ７０を介して、抗ＦＬＡＧを用いて免疫沈降した。ＳＩＶＡ２を２時間、ＣＤ７０での刺激の前に、１μＭドキシサイクリンで誘導した。ＣＤ２７レセプターへのＩＫＫ１動員は、ＳＩＶＡ誘導によって影響を受けなかった。ドキシサイクリン誘導後に発現した総ＳＩＶＡ２の量を下部パネルにて示している。
ＳＩＶＡ２誘導は、Ｒａｍｏｓ細胞中、リング依存様式にて、レセプター複合体中、ユビキチン化ＴＲＡＦ２を増加させる（図１１Ｆ）。
ＣＤ２７へ動員されたＴＲＡＦ２ユビキチン化中のＳＩＶＡのサイレンシングの効果を調査した。本目的のために、２９３−ＣＤ２８細胞を、リン酸カルシウム法によって、３μｇのｐＳＵＰＥＲ ＳＩＶＡ（２ｕｇ ｐＳＵＰＥＲ２７５＋１ｕｇ ｐＳＵＰＥＲ ＮＣ３）で、６ウェルプレート中でトランスフェクトした。４８時間後、細胞を、０、１５、３０および６０分間、ＦＬＡＧ−ＣＤ７０発現培地で処理し、ＴＲＡＦ２のＣＤ２７レセプターへの動員を誘導した。細胞を溶解し、ＣＤ２７レセプター複合体を、抗−ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫沈降した。レセプター結合ＴＲＡＦ２を、抗−ＴＲＡＦ２（サンタクルズ Ｈ２４９）抗体でプローブ化した。リガンドを介して沈殿したＣＤ２７レセプターおよびＩＫＫ１を、下部パネルで示している。Ｂ.ｐＳＵＰＥＲ ＳＩＶＡトランスフェクト細胞を、ＣＤ７０刺激に続く細胞質中のＴＲＡＦ２のレベルに関して、対照ｐＳＵＰＥＲトランスフェクト細胞と比較した。ＣＤ７０トリガー化が、結果として、ＳＩＶＡ依存様式にて、ＴＲＡＦ２の分解となる。ＳＩＶＡは、ＣＤ２７レセプターへの最初のＴＲＡＦ２動員を促進し、これは、ＣＤ２７刺激に続くＴＲＡＦ２分解のために必要である。
Figure 0005086273

Figure 0005086273

Figure 0005086273

Figure 0005086273

Figure 0005086273

Figure 0005086273

Figure 0005086273
Ａ〜Ｊは、ＳＩＶＡがインビボおよびインビトロの双方で、ＮＩＫに結合し、その機能を調節することを示している。Ａ．酵母２ハイブリッド試験におけるＮＩＫのＳＩＶＡへの結合。ＮＩＫおよびそのＮ−末端切断変異体（ＮＩＫ６２４〜９４７）の、ＳＩＶＡのＣ−末端部分（ＳＩＶＡ１ポリペプチド中、アミノ酸１２３〜１７５、またはＳＩＶＡ２中５８〜１１０）、またはＴＲＡＦ２への結合を、形質転換ＳＦＹ５２６中で査定した。「＋＋」および「＋」は、それぞれアッセイの開始後１時間および３時間以内での、強力な色の発色を示し、「−」は、２４時間以内に発色がないことを示す。Ｂ．ＳＩＶＡとのＮＩＫ（またはａｌｙマウスにおいて見られるものに相当するミスセンス変異を導入したＮＩＫ）の共免疫沈降、およびＣ．一時的にトランスフェクトしたＨＥＫ ２９３Ｔ細胞からのＮＩＫとのＳＩＶＡの共免疫沈降。Ｄ．共発現したＳＩＶＡによる、トランスフェクトしたＮＩＫの発現の増強。ＮＩＫ、ＳＩＶＡ、ＩＫＫ１およびＧＦＰを、１：１比でトランスフェクトし、全溶解物を、トランスフェクト２４時間後、ウエスタンブロットで解析した。Ｅ．ＮＩＫおよびＳＩＶＡ２のインビトロ結合。細菌が発現したＧＳＴ−ＳＩＶＡ２、およびバキュロウイルスが発現したＮ−末端を有するＮＩＫを混合し、３０℃で３０分間インキュベートした。抗−ＮＩＫ免疫沈降物を、抗−ＳＩＶＡでのウエスタンブロットによって解析した。Ｆ．ＣＤ７０が、ＮＩＫとのＳＩＶＡ２の結合を促進する。ｍｙｃ−タグ化ＮＩＫを構成的に発現しているＲａｍｏｓ細胞を、２０分間ＣＤ７０で処理し、続いて、ＮＩＫの免疫沈降、およびＳＩＶＡのＮＩＫとの結合のウエスタン解析をした。ＣＤ７０を発現しているＨＥＫ ２９３Ｔ細胞の培養上清を、全ての試験で細胞を処理するために、５０％希釈で使用した。Ｇ．ＣＤ４０Ｌトリガーが、ＳＩＶＡ２とのＮＩＫの結合を促進する。トランスフェクトしたＮＩＫを構成的に発現しているヒトＢＪＡＢリンパ芽細胞に、ＳＩＶＡ２およびプロマイシン耐性選別マーカーを発現しているレトロウイルスベクターで感染させた。細胞のプロマイシン耐性プールを、ＣＤ４０Ｌで、指定された時間点の間活性化した。またはＨ．ＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）。ＮＩＫを免疫沈降し、共免疫沈降したＳＩＶＡを、ウエスタンブロットによって解析した。ＣＤ４０Ｌ処理のために、細胞を、ＣＤ４０Ｌを発現しているＨＥＫ ２９３Ｔ細胞の培養上清中に再懸濁した。Ｉ．ＨｅＬａ細胞中の、ＮＩＫおよびそのＴＲＡＦ２結合ドメイン変異体の共発現。（ＮＩＫ３０４*−アミノ酸３３２〜３３５、ＳＶＡＡに対するＳＶＥＥ変異、およびＮＩＫ７０４*−アミノ酸７０２〜７０５、ＰＡＡＡに対するＰＡＥＥ変異）。ＳＩＶＡ２共沈殿に関するウエスタンブロッティングによって解析した抗−ＮＩＫ免疫沈降物（左−４レーン）およびＳＩＶＡ２発現レベルを示している全溶解物（右−４レーン）。Ｊ．共発現したＳＩＶＡによる、ＮＩＫ−仲介ＮＦ−κＢ活性化の増強。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞中のＮＦ−κＢルシフェラーゼの発現における、単独、またはＳＩＶＡ１またはＳＩＶＡ２と一緒の、ＮＩＫの過剰発現の効果を、トランスフェクションの２４時間後に査定した。ａｌｙ ＮＩＫの発現が、まさに同様に有意なＮＦ−κＢ活性化となることに注意。しかしながら、ＳＩＶＡはこの活性化を増強しない。示したデータは、それぞれの試験を三重で行った、２つの実験において得られたものの平均である。 Ａ〜Ｆは、ＳＩＶＡのリング／亜鉛フィンガー領域がＮＩＫの機能の調節に関与することを示している。Ａ．実験で使用した、ＳＩＶＡ２の、および欠損変異体の構造のダイアグラム的表現。Ｂ．ｍｙｃタグ化ＮＩＫおよびＨＩＳタグ化ＳＩＶＡ２、およびその２つのＣ−末端欠損変異体を、ＨＥＫ ２９３Ｔに発現させ、続いて、示したように、ＮＩＫの免疫沈降、およびウエスタンブロット解析を実施した。Ｃ．単独、またはＳＩＶＡ２およびその欠損変異体と一緒の、ＮＩＫの過剰発現の、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞中のＮＦ−κＢルシフェラーゼの発現における効果を、トランスフェクション２４時間後に査定した。Ｄ．ＳＩＶＡ−Ｃ発現の、ＮＩＫおよびａｌｙＮＩＫ誘導ＮＦ−κＢ活性化における効果、およびＥ．ＳＩＶＡ−Ｃ発現の、ＣＤ２７トランスフェクトＨＥＫ ２９３Ｔ細胞中の、ＣＤ７０誘導ＮＦ−κＢ活性化における効果。示したデータは、それぞれの試験を三重で行った、２つの実験で得られたものの平均である。Ｆ．ＳＩＶＡ−Ｃ末端を、ＲＡＭＯＳ Ｂ−リンパ芽細胞において構成的に発現させた。Ｈｉｓタグ化ＳＩＶＡ２のウエスタンブロット検出（下パネル）。核抽出物を、抗−ｐ５２抗体でプローブ化した（上パネル）。 Ａ〜Ｈは、ＮＩＫのユビキチン化が、ＳＩＶＡ２によって仲介されることを示している。Ａ．ＮＩＫおよびユビキチンをコードしているプラスミドを、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞内に、１：３の比でトランスフェクトした。２４時間後、溶解物を調製し、抗−ＮＩＫ抗体で免疫沈降し、ウエスタンブロッティングによって解析した。Ｂ．ＨｅＬａ細胞に、ＮＩＫをトランスフェクトし、２４時間トランスフェクションの最後の４時間、プロテアゾーム阻害剤ＭＧ１３２（２５μＭ）に暴露した。ＤＭＳＯを希釈液対照として使用し、全溶解物を、抗−ＮＩＫを用いるウエスタンブロッティングによって解析した。Ｃ．ＮＩＫを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中、１：３の比で、ユビキチン変異体と共発現させた。免疫沈降ＮＩＫを、抗−ユビキチン抗体でのウエスタンブロッティングによって解析した。Ｄ．ＮＩＫまたはＮＩＫ Ｋ６７０Ａの、ＳＩＶＡ２、およびＨｅＬａ細胞中のポリユビキチン化を削除するために、４つのリシンをアルギニンによって置換したユビキチンとの共トランスフェクト。全細胞溶解物を、抗−ＮＩＫウエスタンブロッティングによって解析した。Ｅ．ＮＩＫの、ＳＩＶＡ２、およびＫ６３ポリユビキチン鎖を形成不可能な、ＨＡタグ化ユビキチン変異体プラスミドの共トランスフェクション。抗−ＮＩＫ免疫沈降物を、抗−ＨＡウエスタンブロッティングによって解析し、Ｋ４８結合ポリユビキチン鎖をモニタした。Ｆ．ＮＩＫを、ＳＩＶＡ１、ＳＩＶＡ２またはリングフィンガーが変異導入された（Ｃ７３Ａ）ＳＩＶＡ２と、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞中で一時的に過剰発現させた。ＮＩＫを細胞溶解物から免疫沈降させ、ＮＩＫに対するユビキチン共役物に対してプローブ化し（上パネル）、ＳＩＶＡタンパク質の共沈殿のためにプローブ化した（下パネル）。Ｇ．レトロウイルス的に形質転換したＮＩＫを発現している、Ｒｏｍａｓ細胞を、ＣＤ７０で処理した。免疫沈降したＮＩＫを、抗−ＮＩＫ抗体を用いるウエスタンブロッティングによって解析した。Ｈ．ＣＤ２７レセプターおよびＮＩＫを安定に発現しているＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を、ＣＤ７０で処理した。免疫沈降したＮＩＫを、抗−ユビキチン抗体を用いるウエスタンブロッティングによって解析して、ＮＩＫユビキチン化をモニターした。 Ａ〜Ｅは、ＳＩＶＡ２によるＮＩＫの陰性制御を示している。Ａ．ＮＩＫ ０．５μｇおよび示した比でのＳＩＶＡ２を、ＮＦ−κＢレセプタールシフェラーゼとともに、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞中に一時的に発現させた。２４時間後、細胞を溶解し、それらのルシフェラーゼ活性を、蛍光で検出した。結果は、３回の独立実験の１つからの二重の平均を表している。Ｂ．ＳＩＶＡ２（１．５μｇおよび３μｇプラスミド）があるか、またはなしで、ＮＩＫ（０．５μｇプラスミド）をＨｅＬａ細胞中に一時的に発現させた。３０時間のインキュベーションのなかの最後の６時間、細胞をプロテアソーム阻害剤、ラクタシスチン ２０μＭまたはＭＧ１３２ ５０μＭで処理し、全溶解物をウエスタンブロッティングによって解析した。Ｃ．ＳＩＶＡ２プラスミド（１．５μｇおよび３μｇ）を、安定にＮＩＫを発現しているＨＥＫ ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクションの３０時間後、全溶解物を、ＮＩＫおよびＳＩＶＡ２レベルに関して、ウエスタンブロッティングによって解析した。Ｄ．ＳＩＶＡ２の２つの欠損変異体を、１：３および１：６比でＮＩＫ（０．５μｇ）と共トランスフェクトした。溶解物中のＮＩＫレベルを、トランスフェクト３０時間後に査定した。下パネルは、ローディング対照としてのアクチンを示している。Ｅ．ＮＩＫプラスミド（４μｇ）を、ＨｅＬａ細胞中、ＳＩＶＡ １〜５８またはＳＩＶＡ−Ｃプラスミド（８μｇ）、およびＨＡ−ユビキチンＫ４８ＲまたはＫ６３Ｒ変異体プラスミド（６μｇ）と共トランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後、細胞を回収し、溶解し、抗−ＮＩＫ抗体で免疫沈降した。ウエスタンブロッティングを、ＮＩＫ上のユビキチン共役物の検出のために、抗−ＨＡで実施した。 Ａ〜Ｆは、ＮＩＫ中のリシン残基６７０の変異が、ＳＩＶＡ２によるダウンレギュレーションからＮＩＫを保護することを示している。Ａ．種々のＮＩＫ欠損のユビキチン化の程度を示している表。Ｂ．野生型ＮＩＫ（左パネル）と比較して、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞中の、ＮＩＫ Ｋ６７０Ａの、ユビキチンＫ４８ＲおよびＫ６３Ｒ変異体との共発現（右パネル）。免疫沈降したＮＩＫを、抗−ユビキチン抗体によって解析した。Ｃ．ＳＩＶＡ２の増加濃度（１．０、２．０および３．０μｇプラスミド）による、およびＤ．トランスフェクトしたＨｅＬａ細胞中のＴＲＡＦ３による、ＮＩＫ Ｋ６７０Ａ変異体と比較した、野生型ＮＩＫ（０．５μｇプラスミド）の分解。Ｅ．トランスフェクトしたＨｅＬａ細胞中の、ＳＩＶＡ２ Ｃ７３Ａによる、野生型ＮＩＫ、ａｌｙ ＮＩＫおよびＮＩＫ Ｋ６７０Ａの分解。Ｃ、ＤおよびＥ中の下パネルは、ローディング対照としてのアクチンを示している。Ｆ．ＮＩＫとのＳＩＶＡ−Ｃの共沈殿およびそのユビキチン化（図４Ｅにおいてと同様の条件）。 Ａ〜Ｄは、ＳＩＶＡ２がＥ３リガーゼであることを示している。ＳＩＶＡ２誘導ＮＩＫのＫ６３ユビキチン化が、Ａ．不活性化変異体Ｕｂｃ１３（Ｃ８７Ａ）によって触媒的に、Ｂ．ＣＹＬＤ過剰発現によって、阻害される。示したプラスミドを、ＨｅＬａ細胞中に共トランスフェクトし、細胞溶解物を、トランスフェクション後２４時間で調製した。抗−ＮＩＫ免疫沈降物を、抗−ＨＡでのウエスタンブロッティングでプローブして、ユビキチン化を検出し、全溶解物を抗−ＮＩＫで検出した。Ｃ．ＮＩＫ（０．５μｇプラスミド）を、示したように、ＳＩＶＡ２（１．５μｇおよび３．０μｇプラスミド）、およびＴＴＲＡＦ２（０．５μｇプラスミド）と共発現させた。全細胞溶解物を、トランスフェクション後３０時間で調製し、抗−ＮＩＫおよび抗−ＩＫＫ１でプローブ化した。Ｄ．ＧＳＴ−ＳＩＶＡ２を、インビトロユビキチン化アッセイ中、Ｅ１（２００ｎｇ／５０μｌ）およびＥ２、Ｕｂｃ１３／Ｕｅｖ１（５００ｎｇ／５０μｌ）、酵素とともにインキュベートした。３７℃で１時間後、試料を抗−ＧＳＴ抗体で免疫沈降させた。ＩＰおよび全溶解物の双方を、抗−ＳＩＶＡを用いるウエスタンブロッティングによって解析した。 Ａ〜Ｈは、ＳＩＶＡのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションが、ＮＩＫの機能を干渉することを示している。Ａ．ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞中、ＳＩＶＡを抑制する、種々のｐＳＵＰＥＲ−ｓｉＲＮＡｓの効果を試験するためのＲＴ−ＰＣＲ。６ウェルプレートに、２００，０００細胞／ウェルをまき、リポフェクタミン２０００試薬（インビトロジェン）によって、種々のｐＳＵＰＥＲ−ｓｉＲＮＡｓでトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクションの４８時間後に回収し、ＲＮＡをＴＲＩＺＯＬ（インビトロジェン）試薬を用いて抽出した。下部パネルは、定量のための対照としての、ＧＡＰＤＨを示している。Ｂ．ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＣＤ２７またはｐ５５ ＴＮＦＲおよびｐ３５（ＴＮＦＲ誘導死から細胞を保護するためのパン カスパーゼ阻害剤）、ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーター、およびｐＳＵＰＥＲ−ＳＩＶＡ ｓｉＲＮＡｓ ＮＳ３と共トランスフェクトした。２６時間後、ＣＤ２７トランスフェクト細胞を、４時間ＣＤ７０で処理し、続いて、ルシフェラーゼ活性ならびにｐ５２産出の査定を行った。Ｃ．Ｈ１プロモーター下、ｓｉＲＮＡ ＮＣ３をコードしているレンチウイルスベクターで形質導入したＲａｍｏｓ細胞中のＳＩＶＡ ｍＲＮＡレベル。Ｄ．ＣＤ７０が、ＳＩＶＡ発現がｓｉＲＮＡ ＳＩＶＡのレンチウイルス形質導入によって抑制されたＲａｍｏｓ細胞中の、ＮＦ−κＢ核転位を誘導した。Ｅ．ＳＩＶＡ２を構成性に発現しているＲａｍｏｓ細胞（１×１０6／時間点）、およびベクター対照細胞を、示した時間点の間、ＣＤ７０またはＴＮＦで処理した。細胞質および核抽出物を、示した抗体を用いて解析した。Ｆ．ＨｅＬａ細胞からの一時的に発現したＦＬＡＧ−ＳＩＶＡ２の免疫沈降。ＭＧ１３２を、２４時間のトランスフェクションの最後の４時間、２５μＭで適用した。Ｇ．ＣＤ２７レセプターおよびエクジソン誘導可能ＳＩＶＡ２を、エクジソンレプレッサーで、２９３細胞にて安定に発現させた。６ウェルプレートに、２００，０００細胞／ウェルを撒き、ＳＩＶＡ２を、１０μＭエクジソン類似体、ポナステロンで誘導した。ＣＤ７０を、１２時間、または１２時間の誘導の最後の２０分間、誘導物質とともに適用した。細胞を回収し、核および細胞質抽出物を調製し、ウエスタンブロッティングによって解析した。Ｈ．ＣＤ７０で処理した２９３−Ｄ２７細胞中のＮＩＫによって仲介されたｐ５２およびｐ６５の核転位における、ＳＩＶＡサイレンシングの効果を示している。レトロウイルス的に形質導入したＮＩＫを発現している、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に、ｐＳＵＰＥＲ ＳＩＶＡまたは対照としてｐＳＵＰＥＲからベクターを、ＣＤ７０発現培地において８時間トランスフェクトし、または未処理のままとし、細胞および細胞質抽出物を調製し、ＮＩＫ、ｐ１００、ｐ５２およびｐ５６の検出のための、適切な特異的抗体でのウエスタンブロッティングによって解析した。アクチン特異的抗体を用いて、内部標準として検出した。結果が、ＳＩＶＡのサイレンシングが、細胞質におけるＮＩＫのレベル、および核におけるｐ５２のレベルを上昇させることを示している。 Ａ〜Ｃは、ＳＩＶＡ２が、ＮＩＫの基質であり得ることを示している。Ａ．ｍｙｃ−ＮＩＫ、ＨＩＳ−ＳＩＶＡ２およびそれらの変異体を、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞中、示したように共発現させ、つづいて、ＳＩＶＡの免疫沈降およびインビトロキナーゼ反応を実施した。Ｂ．ＳＩＶＡ２を、ＨｅＬａ細胞中、野生型またはキナーゼ不活性化ＮＩＫと共発現させた。トランスフェクション２４時間後、全溶解物を、ＳＩＶＡ発現に関して解析した。下部パネルは、ローディング対照としてアクチンを示している。Ｃ．インビトロキナーゼアッセイ（上パネル）。ＮＩＫ（６μｇプラスミド）およびキナーゼ死ＩＫＫ１またはＩＫＫ２（各６μｇプラスミド）を、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞中、ＦＬＡＧ−ＳＩＶＡ２（８μｇプラスミド）と共発現させた。トランスフェクション２４時間後、抗−ＦＬＡＧ免疫沈降を、溶解物より実施し、キナーゼアッセイを実施した。全溶解物を、トランスフェクトしたタンパク質の発現レベルを確認するために、示した抗体を用いるウエスタンブロッティングによって解析した（下部パネル）。 Ａ〜Ｈは、ＴＲＡＦ３ユビキチン化および開裂が、ＳＩＶＡ２と一緒に動作可能にＮＩＫによって仲介されたことを示している。Ａ．ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２０００００細胞／ウェル）を、６ウェルプレート中にまき、２４時間後、図において示したように、以下のプラスミドでトランスフェクトした。ｍｙｃ ＮＩＫ ０．２μｇ、ＦＬＡＧ−ＳＩＶＡ２ ０．３μｇ、ＨＩＳ−ＴＲＡＦ３ ０．３μｇおよびＨＩＶ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ １．０μｇ。２４時間後、細胞を溶解し、それらのルシフェラーゼ活性を蛍光で測定した。結果は、２つの独立した実験の１つからの、二重の平均を示している。Ｂ．ＴＲＡＦ３プラスミド（３．０μｇ）、ＮＩＫプラスミド（４．０μｇ）およびユビキチンプラスミド（４．０μｇ）を、９ｃｍプレート中、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（１．５×１０6細胞／プレート）内に共トランスフェクトした。細胞をトランスフェクト２４時間後に回収し、全溶解物を、抗−ＴＲＡＦＤ３抗体を用いるウエスタンブロッティングによって解析した。矢印は、改変ＴＲＡＦ３形態を示している。Ｃ．９ｃｍ中にまいたＨＥＫ２９３Ｔ（１．５×１０6細胞／プレート）を、それぞれ４．０μｇの示したプラスミドでトランスフェクトした。細胞をトランスフェクト２４時間後に回収し、全溶解物を、抗ＴＲＡＦ３ウエスタンブロッティングによって解析した。Ｄ．ＨＩＳ−ＴＲＡＦ３（４．０μｇ）、ＦＬＡＧ−ＳＩＶＡ２（６．０μｇ）、およびＨＡ−ユビキチンＫ４８Ｒ（６．０μｇ）を、Ｂでのようにトランスフェクトし、抗ＨＩＳ免疫沈降物を、抗ＨＡ抗体を用いるウエスタンブロッティングにかけた。Ｅ．トランスフェクションを、Ｄでのように実施した。レーン４において、４．０μｇのＰ３５プラスミドをまた共トランスフェクトした。レーン５を、トランスフェクションに続く２８時間のインキュベーションのうちの８時間、２５μＭのＭＧ１３２で処理した。ＦおよびＧ．トランスフェクションをＣでのように実施し、トランスフェクション２８時間後、細胞を回収し、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００含有緩衝液中で、氷中２０分間、溶解させた。溶解物を１００００ｇで遠心し、上清をトリトン可溶性画分として回収した。ペレットを試料緩衝液中に再懸濁させ、煮沸させ、トリトン不溶性画分を得た。Ｈ．トランスフェクションをＣでのように実施し、溶解物を、抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降して、ＳＩＶＡ２を沈降させ、抗−ＴＲＡＦ３でプローブ化した。 Ａ〜Ｄは、ＨＥＫ ２９３Ｔ、ＨｅＬａおよびＲａｍｏｓ細胞中のＮＦ−κＢのリガンド活性化におけるＳＩＶＡ２の効果を示している。Ａ．テトラサイクリン（またはドキシサイクリン）誘導可能ＳＩＶＡ２を発現可能なＨｅＬａ ＴＲＥＸ細胞を、ＬＩＧＨＴ濃縮培地において、ＮＦ−κＢを活性化するために８時間処理した。ＬＩＧＨＴ治療後、細胞を溶解し、核画分を単離して、抗−ｐ５２、ＲｅｌＢまたはｐ６５特異的抗体でプローブ化したウエスタンブロット解析にかけた。ＬＩＧＨＴは、ＨｅＬａ細胞中のｐ５２およびｐ６５核転位の双方を誘導した。ＳＩＶＡ２の短時間の誘導が、ＬＩＧＨＴ−仲介ｐ５２およびｐ６５核転位を増強し、一方でＳＩＶＡ２の長時間の誘導が、ｐ５２およびｐ６５の双方のＬＩＧＨＴ−仲介核転位を干渉した。Ｂ．ｐＩＮＤベクター中にクローン化したＳＩＶＡ２ ｃＤＮＡを、２９３−ｅｃｒ細胞（インビトロジェン）系中に安定に発現させた。この系により、クローン化ＳＩＶＡ２のエクジソン（または類似ポナステロン）−仲介誘導可能発現が可能となる。これらの細胞を、ＣＤ７０で８時間処理して、他のＮＦ−κＢ経路の活性化を誘導するか、または未処理のままとした。処理後、細胞を溶解し、細胞質画分および核画分に画分化し、抗ＮＩＫ、ＴＲＡＦＤ２、ＴＲＡＤ３ ｐ１００およびｐ５２抗体でプローブ化したウエスタンブロット解析にかけた。ＣＤ７０誘導の最後の時間での、短時間でのＳＩＶＡ２の誘導が、ＴＲＡＦ２／３のレベルを減少させ、ＮＩＫおよびｐ１００処理のレベルを減少させ、結果として、核ｐ５２のレベルが増加した。ＣＤ７０処理にそった８時間の、長時間でのＳＩＶＡ２の誘導は、ＮＩＫおよび核ｐ５２のレベルを減少させた。Ｃ．テトラサイクリン（またはドキシサイクリン）誘導可能ＳＩＶＡ２または変異体ＳＩＶＡ２Ｃ７３Ａを発現可能なＴＲＥＸ系を有するＲａｍｏｓ細胞を、０、０．３または８時間、ＣＤ７０で処理し、ＣＤ７０誘導ＮＦ−κＢ活性化における、長時間（８時間）、短時間（１時間）でのＳＩＶＡ２または変異体ＳＩＶＡ２Ｃ７３Ａの誘導の効果を調査した。図において示したように、ＳＩＶＡの誘導でのリガンドの８時間処理に関して、ドキシサイクリンをリガンドとともに適用した。ＳＩＶＡの１時間処理に関して、ドキシサイクリンを、８時間リガンド処理の最後の１時間で加えた。短時間ＣＤ７０処理の場合、ドキシサイクリンを８時間、または１時間加え、リガンドを最後の０．３時間適用した。示したように処理および誘導した細胞を溶解し、核および細胞質抽出物に画分化し、これらの画分を、抗−ＩκＢα、ｐ６５、ｐ１００およびｐ５２特異的抗体でプローブしたウエスタンブロットにかけた。野生型ＳＩＶＡ２の誘導は、ＣＤ７０誘導ＩκＢα分解および核へのｐ６５転位を防止した。リングフィンガー変異体ＳＩＶＡの誘導は、ＣＤ７０誘導ＩκＢα分化を防止せず、ｐ６５の核転位を増強させた。ＳＩＶＡ２誘導はまた、リングフィンガー依存様式で、ＣＤ７０誘導ｐ５２核転位を防止した。Ｄ．テトラサイクリン誘導可能ＳＩＶＡ２または変異体ＳＩＶＡ２Ｃ７３Ａを発現可能なＲａｍｏｓ ＴＲＥＸ細胞を、ＴＮＦで０、０．３および４時間処理し、長時間（４時間）または短時間（１時間）ＳＩＶＡ２またはＳＩＶＡ２Ｃ７３Ａ誘導の、核へのＴＮＦ誘導ｐ６５転位における効果を上記したように調査した。処理に続いて細胞を溶解し、核および細胞質抽出物に画分化し、抗−ｐ６５特異的抗体でプローブしたウエスタンブロットにかけた。野生型ＳＩＶＡ２の誘導が、核へのＴＮＦ誘導ｐ６５転位を防止した。ＳＩＶＡのリングフィンガー変異体の誘導は、ＴＮＦ誘導ｐ６５の核転位を防止しなかった。 Ａは、ＳＩＶＡ２によるＴＲＡＦ２のインビトロユビキチン化を示している。インビトロユビキチン化アッセイを、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６、５ｍＭ ＭａＣｌ２、２ｍＭ ＡＴＰ、０．２ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭリン酸クレアチニン、０．２μｇ／ｍｌクレアチニンキナーゼおよび５μＭユビキチンアルデヒドを含む緩衝液中、組換え体ＨＩＳ−ユビキチン−Ｋ６３のみ、Ｅ１、Ｅ２（Ｕｂｃ１３／Ｕｅｖ１ヘテロダイマー）（Ｅ１およびＥ２の双方を、ボストン バイオケムより購入した）、およびＦＬＡＧタグ化ＴＲＡＦ２との組換え体ＧＳＴ−ＳＩＶＡまたはＧＳＴ−ＳＩＶＡＣ７３Ａを含む反応液中で実施した。ＦＬＡＧタグ化ＴＲＡＦ２を、ｐｃＦＬＡＧ ＴＲＡＦ２をＨＫ ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトすることによって調製した。トランスフェクション２４時間後、細胞を溶解緩衝液を含む１％ Ｔｒｉｔｉｏｎ Ｘ１００中に溶解し、抗ＦＬＡＧ Ｍ２ビーズ（シグマ）を用いて免疫沈降させた。免疫沈降したＴＲＡＦ２を、ＦＬＡＧペプチドで溶出し、マイクロコンカラム（ＭＷＣＯ３０００）を用いて濃縮し、インビトロユビキチン化反応で使用した。反応液を、３０℃で１時間インキュベートした。ＴＲＡＦ２を、抗−ＦＬＡＧ Ｍ２ビーズを用いて、４℃で４時間、免疫沈降した。免疫沈降物を、抗ＴＲＡＦ２（Ｈ２４９、サンタクルズ）抗体でのウエスタンブロッティングにかけた。Ｂ．は、ＳＩＶＡ Ｃ末端を安定して発現するように遺伝子工学的に改変したＲａｍｏｓ細胞が、高レベルのｐ５２ならびにＴＲＡＦ３、およびＴＲＡＦ２の発現の減少を提示することを示している。Ｃ．は、ＴＲＡＦ２がＳＩＶＡ２に結合することを示している。ＦＬＡＧタグ化ＴＲＡＦ２を、組換え体（細菌発現）ＧＳＴタグ化ＳＩＶＡ２またはＧＳＴタグ化リングフィンガー変異体ＳＩＶＡ２とともに、３０℃で１時間インキュベートした。つぎに、免疫沈降を、ＴＲＡＦ２に対して抗−ＦＬＡＧで実施して、ウエスタンブロッティング解析を抗ＳＩＶＡにおいて実施して、共沈殿しているＳＩＶＡを検出した。組換え体ＧＳＴタグ化細菌発現ＳＩＶＡ２が、ウエスタンブロットで２つのバンドとして発現した。ＳＩＶＡ２中のリングフィンガー変異体が、結果としてＴＲＡＦ２に対する異なる結合親和力となる、配座変化を引き起こし得る。これは、ＴＲＡＦ２がＳＩＶＡ２リングフィンガーに結合することが分かった、図１１Ｄでの観察と同様である。Ｄ．は、ＳＩＶＡのリングフィンガーが、ＴＲＡＦ２への結合のために重要であることを示している。ＨＥＫ９３Ｔ細胞を、ＨＩＳ−ＳＩＶＡ２、またはＳＩＶＡ２の欠損、リングフィンガーを欠いているＳＩＶＡ２ １〜５８またはＳＩＶＡ １〜８１をコードしているプラスミド、およびＦＬＡＧ−ＴＲＡＦ２をコードしているプラスミドと共トランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後、細胞を回収して、溶解した。ＴＲＡＦ２を、抗ＦＬＡＧ−Ｍ２ビーズを用いて免疫沈降し、共沈殿したＳＩＶＡ２を、抗ＨＩＳ抗体を用いてウエスタンブロッティングによってプローブした。総溶解が、タンパク質の発現レベルを示している。ＳＩＶＡは、リングフィンガーがない場合（ＳＩＶＡ２ １〜５８）、ＴＲＡＦ２と共沈殿せず、リングフィンガーが存在する場合（本来のＳＩＶＡ２およびＳＩＶＡ２ １〜８１）が存在する場合のみ共沈殿した。Ｅ．は、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞中のＳＩＶＡの過剰発現が、ＴＲＡＦ２のＫ４８ユビキチン化を増強することを示している。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を、ＦＬＡＧ−ＴＲＡＦ２、ＨＩＳ−ＳＩＶＡ２およびユビキチン変異体をコードしているプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後、細胞を溶解し、免疫沈降して、特定的な抗体を用いてウエスタンブロット解析した。ＴＲＡＦ２リングフィンガー変異体（Ｃ３４Ａ）を使用して、その自己ユビキチン化を防止した。ＴＲＡＦ２中のリングフィンガー変異体が、自己Ｋ６３ユビキチン化のみを防止した。ＳＩＶＡ２過剰発現が、そのリングフィンガーの機能として、ＴＲＡＦ２のＫ４８ユビキチン化を増強した。ＴＲＡＦ２リングフィンガー変異体は、ＳＩＶＡ２に結合するその能力を維持した。Ｆ．は、ＳＩＶＡ２が、Ｒａｍｏｓ細胞中、ＣＤ２７レセプターに動員されたＴＲＡＦ２のユビキチン化を制御することを示している。ＴＲＡＦ２のＣＤ２７レセプターへの動員は、ＦＬＡＧ−ＣＤ７０での刺激によって誘導され、レセプターへ動員されたＴＲＡＦ２を、抗−ＦＬＡＧを用いて、免疫沈降した。ＳＩＶＡ２を、ＣＤ７０の刺激の前に、１ｕＭドキシサイクリンで２時間誘導した。ＣＤ２７レセプターへのＩＫＫ１動員は、ＳＩＶＡ誘導によって影響を受けなかった。ドキシサイクリン誘導後に発現した総ＳＩＶＡ２の量を、下部パネルにおいて示している。ＳＩＶＡ２誘導が、Ｒａｍｏｓ細胞中、リング依存様式において、レセプター複合体中のユビキチン化ＴＲＡＦ２を増加させる。Ｇ．は、ＣＤ２７レセプターへ動員されたＴＲＡＦ２のユビキチン化における、ＳＩＶＡのサイレンシングの効果を示している。２９３−ＣＤ２７細胞に、ｐＳＵＰＥＲ ＳＩＶＡをトランスフェクトし、４８時間後、０、１５、３０および６０分間、ＦＬＡＧ−ＣＤ７０発現培地で処理し、溶解し、ＣＤ２７レセプター複合体を、抗−ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫沈降した。レセプター結合ＴＲＡＦ２を、抗−ＴＲＡＦ２抗体でプローブ化した。リガンドを通して沈殿した、ＣＤ２７レセプターおよびＩＫＫ１が下部パネルで示されている。Ｈ．は、ＳＩＶＡのサイレンシングが、ＣＤ２７刺激に続くＴＲＡＦ２分解のために必要である、ＣＤ２７レセプターへの初期ＴＲＡＦ２動員を促進することを示しており、ｐＳＵＰＥＲ ＳＩＶＡトランスフェクト細胞を、ＣＤ７０刺激に続く細胞質中のＴＲＡＦ２のレベルに関して、対照ｐＳＵＰＥＲトランスフェクト細胞と比較した。ＣＤ７０トリガー化は結果として、ＳＩＶＡ依存様式で、ＴＲＡＦ２の分解となる。

Claims (22)

  1. ユビキチン化関連活性を有する、配列番号６のＢ−ボックス様リングを有するポリペプチドの同定方法であって、（ｉ）ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２および配列番号６のＢ−ボックス様リングを有するポリペプチドを含むポリペプチドを接触させること、（ii）ユビキチンの前記Ｂ−ボックス様リングを有するポリペプチドへの結合を測定することを含み、前記Ｂ−ボックス様リングを有するポリペプチドに結合したユビキチンの検出が、前記Ｂ−ボックス様リングを有するポリペプチドが、ユビキチン化関連活性を有することを示す方法。
  2. 配列番号６のＢ−ボックス様リングを有するポリペプチドがＳＩＶＡポリペプチドである請求項１記載の方法。
  3. 前記方法が、Ｋ６３ユビキチン化関連活性を有することが可能なＳＩＶＡポリペプチドの同定のためである請求項２記載の方法。
  4. 直接または間接ユビキチン化関連活性を有するＳＩＶＡポリペプチドの同定方法であって、（ｉ）ＳＩＶＡポリペプチドの存在下または非存在下で、ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２、ＴＲＡＦ２ポリペプチド、および任意にＥ３を含むポリペプチドを接触させること、（ii）ＳＩＶＡポリペプチドの存在下または非存在下で、ＴＲＡＦ２ポリペプチドのユビキチン化のレベルを測定すること、および（iii）ＳＩＶＡポリペプチドの存在下および非存在下におけるＴＲＡＦ２のユビキチン化のレベルを比較することを含み、ＳＩＶＡポリペプチドの存在下における、ＴＲＡＦ２のユビキチン化のレベルの増加が、ＳＩＶＡポリペプチドが直接または間接ユビキチン化関連活性を有することを示す方法。
  5. ＳＩＶＡポリペプチドのＫ４８ユビキチン化関連活性を試験する請求項４記載の方法。
  6. 前記ＳＩＶＡポリペプチドが、ＳＩＶＡ２からなる請求項４または５記載の方法。
  7. 配列番号６のＢ−ボックス様リングを有するポリペプチドのユビキチン化関連活性を調節可能な薬剤の同定方法であって、（ｉ）Ｂ−ボックス様リングを有するポリペプチドによって仲介される、Ｂ−ボックス様リングを有する前記ポリペプチドのユビキチン化を可能にする条件下、候補薬剤の存在下または非存在下で、ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２、配列番号６のＢ−ボックス様リングを有するポリペプチドを含むポリペプチドを接触させること、（ii）前記候補薬剤の存在下または非存在下で、Ｂ−ボックス様リングを有する前記ポリペプチドのユビキチン化のレベルを測定すること、および（iii）前記候補薬剤の存在下および非存在下におけるユビキチン化のレベルを比較することを含み、前記候補薬剤の存在下における、Ｂ−ボックス様リングポリペプチドを有するポリペプチドのユビキチン化のレベルの変化が、候補薬剤が、Ｂ−ボックス様リングを有する前記ポリペプチドのユビキチン化関連活性を調節可能であることを示す方法。
  8. 配列番号６のＢ−ボックス様リングを有するポリペプチドがＳＩＶＡポリペプチドである請求項７記載の方法。
  9. 前記ユビキチンが、Ｋ４８にて変異したユビキチンである請求項２または８記載の方法。
  10. ポリペプチドの接触が細胞内でまたはインビトロで行われる請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. ユビキチン化を、ウエスタンブロット解析によって検出する請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記候補薬剤が、小有機分子、ペプチド、核酸、天然抽出物からの分子、および合成有機化合物から選択される請求項７または８記載の方法。
  13. 配列番号６に示す配列のＢボックスからなる単離ポリペプチド。
  14. Ｂ−ボックス様リングフィンガーおよび／または亜鉛フィンガーモチーフを含むＳＩＶＡポリペプチドのＣ−末端断片からなる単離ポリペプチドであって、該断片が配列番号３に示すＳＩＶＡ２のアミノ酸残基５８〜１１０である単離ポリペプチド。
  15. 請求項１３または１４記載のポリペプチドをコードしている単離ポリヌクレオチド。
  16. 配列番号７、配列番号８および配列番号９から選択される配列を含む請求項１５記載の単離ポリヌクレオチド。
  17. 請求項１５または１６記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  18. 請求項１７記載のベクターを含む宿主細胞。
  19. 請求項１８記載の宿主細胞を増殖させ、産出されたポリペプチドを単離することを含む請求項１３または１４記載のポリペプチドの製造方法。
  20. Ｅ１、Ｅ２、ユビキチン、およびＳＩＶＡポリペプチドを含むタンパク質基質のユビキチン化のために有用なキット。
  21. 前記タンパク質基質が、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＮＩＫおよびＳＩＶＡから選択される請求項２０記載のキット。
  22. 請求項１７記載のベクター、請求項１３または１４記載のポリペプチドまたはその塩、または請求項１５または１６記載のポリヌクレオチドおよび薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
JP2008549987A 2006-01-12 2007-01-11 Ｓｉｖａユビキチン化および／または分解関連活性ならびにそのモジュレーター Expired - Fee Related JP5086273B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IL173104A IL173104A0 (en) 2006-01-12 2006-01-12 Siva and ubiquintination
IL173104 2006-01-12
PCT/IL2007/000050 WO2007080593A2 (en) 2006-01-12 2007-01-11 Siva ubiquitination and/or degradation-related activity and modulators thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2009523023A JP2009523023A (ja) 2009-06-18
JP5086273B2 true JP5086273B2 (ja) 2012-11-28

Family

ID=38008295

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2008549987A Expired - Fee Related JP5086273B2 (ja) 2006-01-12 2007-01-11 Ｓｉｖａユビキチン化および／または分解関連活性ならびにそのモジュレーター

Country Status (9)

Country Link
US (1) US8273545B2 (ja)
EP (1) EP1977239B1 (ja)
JP (1) JP5086273B2 (ja)
AT (1) ATE529742T1 (ja)
AU (1) AU2007205694B2 (ja)
CA (1) CA2637412A1 (ja)
ES (1) ES2373986T3 (ja)
IL (2) IL173104A0 (ja)
WO (1) WO2007080593A2 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL189408A0 (en) * 2008-02-10 2009-02-11 Yeda Res & Dev Siva3, its preparation and pharmaceutical compositions containing it
IL189405A0 (en) * 2008-02-10 2008-12-29 Yeda Res & Dev Stabilization of siva2
EP2551670A1 (en) * 2011-07-27 2013-01-30 Merck Patent GmbH NIK inhibitors cell-based assay
US10709434B2 (en) * 2013-07-09 2020-07-14 Globus Medical, Inc. Surgical access systems and methods

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
GB8615942D0 (en) 1986-06-30 1986-08-06 Animal & Food Research Council Peptide production
EP0279582A3 (en) 1987-02-17 1989-10-18 Pharming B.V. Dna sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
GB8826446D0 (en) 1988-11-11 1988-12-14 Agricultural & Food Res Peptide production
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5073964A (en) 1989-08-04 1991-12-17 Aware, Inc. Signal processing device and method
DE69232310T2 (de) 1991-01-11 2002-08-14 American Red Cross Washington Expression von aktivem menschlichem Protein C im Milchdrüsengewebe transgener Tiere
EP0567566B2 (en) 1991-01-18 2007-07-04 Amgen Inc., Methods for treating tumor necrosis factor mediated diseases
UA71889C2 (uk) * 1996-04-02 2005-01-17 Йєда Рісерч Енд Дівелопмент Ко. Лтд. Модулятори зв'язаного з рецептором tnf фактора (traf), їх одержання та застосування
US6010853A (en) * 1997-05-29 2000-01-04 Dana-Farber Cancer Institute Siva genes, novel genes involved in CD27-mediated apoptosis
US5843721A (en) * 1997-07-03 1998-12-01 Tularik Inc. Nucleic acids encoding human NIK protein
WO2005043119A2 (en) * 2003-10-28 2005-05-12 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the identification of anti-poxvirus agents
WO2005051423A2 (en) * 2003-11-30 2005-06-09 Yeda Research And Development Co. Ltd Methods and agents for immune modulation and methods for identifying immune modulators

Also Published As

Publication number Publication date
US20100204091A1 (en) 2010-08-12
US8273545B2 (en) 2012-09-25
ATE529742T1 (de) 2011-11-15
IL192414A (en) 2013-07-31
IL192414A0 (en) 2008-12-29
WO2007080593A2 (en) 2007-07-19
AU2007205694B2 (en) 2013-06-06
EP1977239B1 (en) 2011-10-19
WO2007080593A3 (en) 2007-11-15
AU2007205694A1 (en) 2007-07-19
CA2637412A1 (en) 2007-07-19
EP1977239A2 (en) 2008-10-08
IL173104A0 (en) 2006-06-11
ES2373986T3 (es) 2012-02-10
JP2009523023A (ja) 2009-06-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2872701A1 (en) Methods and agents for screening for compounds capable of modulating vegf expression
Zhao et al. A novel E3 ubiquitin ligase TRAC-1 positively regulates T cell activation
JP5086273B2 (ja) Ｓｉｖａユビキチン化および／または分解関連活性ならびにそのモジュレーター
US7371835B2 (en) p53-dependent apoptosis-inducing protein and method of screening for apoptosis regulator
Mattock et al. Inhibition of cell proliferation by the PCNA-binding region of p21 expressed as a GFP miniprotein
JP5774313B2 (ja) Ｓｉｖａ２の安定化
US20130330738A1 (en) Sumoylation Control Agent and Uses Thereof
JPH11509085A (ja) インターロイキン−１レセプター関連プロテインキナーゼ及び検定
WO2020165570A1 (en) Methods relating to disrupting the binding of af9 partner proteins to af9 and/or enl
JP2004350672A (ja) 新規ｇ−タンパク質及びその利用
US7901906B2 (en) Targeting of MKRN1 for identifying cancer treatment agents
WO2006109091A2 (en) Sensitisation of cancer cells to dna replication inhibitors
US8377433B2 (en) SIVA 3, its preparation and use
US7078478B2 (en) Inhibition of the proliferation of cells of the multiple myeloma
EP3003352B1 (en) Protein involved in dna replication, and modulation of its activity
Class et al. Patent application title: SIVA 3, ITS PREPARATION AND USE Inventors: David Wallach (Rehovot, IL) Parameswaran Ramakrishnan (Trivandrum, IN) Andrei Kovalenko (Rehovot, IL) Assignees: YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT CO. LTD.
JP2000135100A (ja) 抗ウイルス剤を同定するためのアッセイ法
Jeffries THE ROLE OF NUCLEAR LOCALIZATION AND N ic-PROTEIN COMPLEX FORMATION IN NOTCH INDUCED NEOPLASIA

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20091225

RD03 Notification of appointment of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423

Effective date: 20100617

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20100617

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20120515

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20120815

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20120904

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20120906

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150914

Year of fee payment: 3

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees