JP2004180680A - アポトーシス関連蛋白質およびその用途 - Google Patents

アポトーシス関連蛋白質およびその用途 Download PDF

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Abstract

【課題】アポトーシスまたは炎症関連疾患の新規予防・治療剤の提供。
【解決手段】ヒト由来の特定なアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質の機能的ドメインを含む部分ペプチド；該蛋白質もしくは該部分ペプチドまたはそれを産生する細胞、および必要に応じてＡＳＫ１もしくはその部分ペプチドまたはそれを産生する細胞を用いることによる、ＡＳＫ１活性化調節物質、アポトーシスまたは炎症関連疾患予防・治療物質のスクリーニング方法およびそのためのキット；並びにヒト由来の特定なアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質の活性を調節する物質を含有する、アポトーシスまたは炎症性サイトカイン産生調節剤、アポトーシスまたは炎症関連疾患の予防・治療剤。
【選択図】なし

Description

本発明は、ＡＳＫ１と結合してこれを活性化する蛋白質の機能的フラグメント、並びに該蛋白質および該フラグメントの種々の用途、特に医薬用途に関する。
アポトーシスは、発生過程で不要となった細胞や異常細胞の除去、ホメオスターシス、傷害を受けた細胞を除去する生体防御反応の機能を担っており、その分子レベルでのメカニズムも次第に明らかになってきている。それら分子の異常や制御メカニズムの破綻はアポトーシスの生理的機能を障害し、様々な疾患の発症原因や増悪因子となる。例えば、アポトーシスが過度に抑制されれば、本来除去されるべき細胞が異常に増殖して腫瘍性疾患や自己免疫疾患などを誘発し、逆にアポトーシスが異常に亢進すると本来なくてはならない細胞が死に至って神経変性疾患などの原因となる。
Mitogen-activated protein（ＭＡＰ）キナーゼカスケードは物理化学的ストレスや腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）などの炎症性サイトカインによって活性化されたＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）が、ＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）、ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）を逐次活性化するシグナル伝達機構であり、細胞はこれらの刺激に応じて生存、増殖、分化、死（アポトーシス）などの表現型を示す。c-Jun N-terminal kinase（ＪＮＫ）およびp38 MAP kinase（ｐ３８）は、アポトーシスを誘導するシグナル伝達経路の一部を担うＭＡＰＫとして知られている（例えば、腓腹筋特許文献１参照）。さらには炎症性サイトカインの産生を誘導することにより炎症反応の惹起にも関与している。
ＪＮＫおよびｐ３８はＭＡＰＫＫであるＭＫＫ４／７およびＭＫＫ３／６によってそれぞれ活性化される。これらのＭＡＰＫＫはApoptosis signal-regulating kinase 1（ＡＳＫ１）と呼ばれる１つのＭＡＰＫＫＫによって活性化される（特許文献１、非特許文献２）。ＭＡＰＫＫＫはＡＳＫ１以外にも多数報告されているが、ＡＳＫ１は、ＪＮＫおよび／またはｐ３８の活性化を介したシグナル伝達を通じて、細胞にアポトーシスを誘導する能力を有することにより特徴づけられる。最近、ＡＳＫ１の活性化がケラチノサイトの分化やＰＣ１２細胞の神経突起伸張などの細胞分化にも関与することが示唆されており、ＡＳＫ１はアポトーシスに限らず細胞の運命のコントロールに重要な役割を果たしていることが明らかになってきている。さらには炎症性サイトカインの産生を誘導することによって、炎症反応の惹起にも関与することも明らかとなってきている。
このように、ＡＳＫ１は細胞の以後の運命を左右する重要な分子であるが故に、その活性化には様々な因子が関与し、複雑な制御を受けていると考えられる。これまでに、ＡＳＫ１の活性化にはＡＳＫ１同士のホモオリゴマー形成とそれに続く活性化ループ内にあるスレオニンのリン酸化が必須であることが報告されており、また該リン酸化は主にＡＳＫ１による自己リン酸化によっているが、別のキナーゼの存在も示唆されている（非特許文献３）。一方、protein phosphatase 5（ＰＰ５）はＨ２Ｏ２刺激下でＡＳＫ１に直接結合し、スレオニンを脱リン酸化することで活性化されたＡＳＫ１を不活性状態に戻すと考えられている（非特許文献４）。さらに、レドックス制御因子であるチオレドキシンは、酸化ストレスのないときにはＡＳＫ１のＮ末端側ドメインと恒常的に結合してＡＳＫ１の活性化インヒビターとして働いており、酸化ストレスを与えるとＡＳＫ１から離れ、それによりＡＳＫ１の活性化が起こること（非特許文献５）、ＴＮＦ−αによるＡＳＫ１活性化の際には、TNF receptor-associated factor 2（ＴＲＡＦ２）がＡＳＫ１のＣ末端側ドメインに結合することでＡＳＫ１の活性化が起こること（非特許文献６）、１４−３−３タンパク質はＣ末端側ドメインに結合することによりＡＳＫ１の活性化を阻害すること（非特許文献７）なども報告されている。
ＡＳＫ１ノックアウトマウスの細胞を小胞体ストレス誘発剤で処理すると、野生型マウスの細胞に比べてアポトーシスが有意に抑制されることから、ＡＳＫ１は小胞体ストレスによるアポトーシス誘導に密接に関連しており、従って、上記のチオレドキシンや１４−３−３蛋白質等のＡＳＫ１阻害物質や、ＡＳＫ１ドミナントネガティブ変異体、ＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチドなどは、神経変性疾患（例、ポリグルタミン病等）などの小胞体ストレス関連疾患の予防・治療に有効であることが示唆されている（特許文献２）。西頭らは、ポリグルタミン病における異常蛋白質の蓄積が小胞体ストレスを誘発し、その結果ストレスセンサー分子であるＩＲＥ１とＴＲＡＦ２、ＡＳＫ１が三者複合体を形成してＡＳＫ１が活性化され、ＪＮＫの活性化を介してアポトーシス（＝神経細胞死）が誘導されることを示した（非特許文献８）。
特開平１０−９３号公報 国際公開第０２／３８１７９号パンフレット 「サイエンス（Science）」，（米国），第２７０巻，ｐ．１３２６，１９９５年 「サイエンス（Science）」，（米国），第２７５巻，ｐ．９０−９４，１９９７年 「ジャーナル・オブ・セルーラー・フィジオロジー（Journal of Cellular Physiology）」，（米国），第１９１巻，ｐ．９５−１０４，２００２年 「エンボ・ジャーナル（EMBO Journal）」，（英国），第２０巻，ｐ．６０２８−６０３６，２００１年 「エンボ・ジャーナル（EMBO Journal）」，（英国），第１７巻，ｐ．２５９６−２６０６，１９９８年 「モレキュラー・セル（Molecular Cell）」，（米国），第２巻，ｐ．３８９−３９５，１９９８年 「プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ，ユーエスエー（Proceedings of National Academy of Sciencies, USA）」，（米国），第９６巻，ｐ．８５１１−８５１５，１９９９年 「ジーンズ・デベロップメント（Genes Development）」，第１６巻，ｐ．１３４５−１３５５，２００２年
上述のように、ＡＳＫ１の生理的重要性や疾患との関わりが次第に明らかになってきてはいるが、ＡＳＫ１の活性化制御とＡＳＫ１を介するアポトーシス誘導／炎症反応惹起のメカニズムについては、その複雑さもあって未だに不明な点が多く、さらなる研究の進展が望まれるところである。
したがって、本発明は、ＡＳＫ１の活性化機構とそれを介したアポトーシス誘導／炎症反応惹起のメカニズムに関する新規な知見を提供することを目的とする。即ち、本発明の第一の目的は、これまで知られていない新規なＡＳＫ１結合蛋白質を同定するとともに、該蛋白質によるＡＳＫ１活性化制御のしくみを明らかにすることである。また、本発明の別の目的は、該蛋白質とＡＳＫ１との相互作用に基づいて、ＡＳＫ１が関与する各種疾患に対する新規な予防・治療手段を提供することである。
本発明者等は、上記の目的を達成すべく、ヒトＡＳＫ１全長ｃＤＮＡをbaitとして、ヒト胎児脳由来の発現ライブラリーを酵母two-hybrid法によりスクリーニングした結果、ＰＧＲ１と命名された既知遺伝子にコードされる１２７アミノ酸からなる機能未知の蛋白質を、新たにＡＳＫ１結合蛋白質としてクローニングすることに成功し、ASK1 Binding Protein 1（以下、「ＡＢＰ１」と略記する）と命名した。さらに、本発明者等は、該蛋白質がＡＳＫ１と結合するのみでなく、ＡＳＫ１とその下流のＪＮＫおよびｐ３８を活性化するとともに、カスパーゼ依存性のアポトーシスを誘導することを見出した。本発明者等は、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
［１］ 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列の一部と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つＡＳＫ１を活性化し得るペプチドまたはその塩、
［２］ 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列中約６０アミノ酸以上からなる部分アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する上記［１］記載のペプチドまたはその塩、
［３］ 部分アミノ酸配列がＮ末端側の配列である上記［２］記載のペプチドまたはその塩、
［４］ 上記［１］記載のペプチドをコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチド、
［５］ 配列番号１または配列番号３に示される塩基配列の一部と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を含有する上記［４］記載のポリヌクレオチド、
［６］ 上記［４］記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
［７］ 上記［６］記載の組換えベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体、
［８］ 上記［７］記載の形質転換体を培養し、得られる培養物から上記［１］記載のペプチドまたはその塩を採取することを特徴とする該ペプチドまたはその塩の製造方法、
［９］ 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列の一部と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つＡＳＫ１を活性化しないか、もしくは不活性化し得るペプチドまたはその塩、
［１０］ 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列中約３５アミノ酸以下からなる部分アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する上記［９］記載のペプチドまたはその塩、
［１１］ 部分アミノ酸配列がＮ末端側の配列である上記［１０］記載のペプチドまたはその塩、
［１２］ 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは上記［１］記載のペプチド、またはその塩を含有してなるＡＳＫ１活性化促進剤、
［１３］ アポトーシス誘発剤である上記［１２］記載の剤、
［１４］ 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは上記［１］記載のペプチド、またはその塩を含有してなる医薬、
［１５］ アポトーシスを誘発することが予防・治療上有効な疾患の予防・治療剤である上記［１４］記載の医薬、
［１６］ 疾患が、癌、自己免疫疾患、ウイルス感染症、内分泌疾患、血液疾患、臓器過形成、血管形成術後再狭窄および癌切除術後の再発からなる群より選択される上記［１５］記載の医薬、
［１７］ 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは上記［１］記載のペプチドをコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを含有してなるＡＳＫ１活性化促進剤、
［１８］ アポトーシス誘発剤である上記［１７］記載の剤、
［１９］ 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは上記［１］記載のペプチドをコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
［２０］ アポトーシスを誘発することが予防・治療上有効な疾患の予防・治療剤である上記［１９］記載の医薬、
［２１］ 疾患が、癌、自己免疫疾患、ウイルス感染症、内分泌疾患、血液疾患、臓器過形成、血管形成術後再狭窄および癌切除術後の再発からなる群より選択される上記［２０］記載の医薬、
［２２］ 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする塩基配列もしくはその一部を含有するポリヌクレオチドを含有してなるアポトーシスまたは炎症関連疾患の診断薬、
［２３］ 疾患が、癌、自己免疫疾患、ウイルス感染症、内分泌疾患、血液疾患、臓器形成異常、血管形成術後再狭窄、癌切除術後の再発、移植臓器拒絶、移植片対宿主病、免疫不全、神経変性疾患、虚血性心疾患、放射線障害、紫外線障害、中毒性疾患、栄養障害、炎症性疾患、虚血性神経障害、糖尿病性神経障害、血管系疾患、呼吸器系疾患および軟骨疾患からなる群より選択される上記［２２］記載の診断薬、
［２４］ 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする塩基配列と相補的な塩基配列もしくはその一部を含有するポリヌクレオチドを含有してなるＡＳＫ１活性化阻害剤、
［２５］ アポトーシスまたは炎症性サイトカイン産生抑制剤である上記［２４］記載の剤、
［２６］ 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする塩基配列と相補的な塩基配列もしくはその一部を含有するポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
［２７］ アポトーシスまたは炎症を抑制することが予防・治療上有効な疾患の予防・治療剤である上記［２６］記載の医薬、
［２８］ 疾患が、ウイルス感染症、内分泌疾患、血液疾患、臓器形成不全、移植臓器拒絶、移植片対宿主病、免疫不全、神経変性疾患、虚血性心疾患、放射線障害、紫外線障害、中毒性疾患、栄養障害、炎症性疾患、虚血性神経障害、糖尿病性神経障害、血管系疾患、呼吸器系疾患および軟骨疾患からなる群より選択される上記［２７］記載の医薬、
［２９］ 配列番号５または配列番号６に示されるアミノ酸配列を特異的に認識し得ることを特徴とする、配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩に対する抗体、
［３０］ 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩に対する抗体を含有してなるアポトーシスまたは炎症関連疾患の診断薬、
［３１］ 疾患が、癌、自己免疫疾患、ウイルス感染症、内分泌疾患、血液疾患、臓器形成異常、血管形成術後再狭窄、癌切除術後の再発、移植臓器拒絶、移植片対宿主病、免疫不全、神経変性疾患、虚血性心疾患、放射線障害、紫外線障害、中毒性疾患、栄養障害、炎症性疾患、虚血性神経障害、糖尿病性神経障害、血管系疾患、呼吸器系疾患および軟骨疾患からなる群より選択される上記［３０］記載の診断薬、
［３２］ 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩に対する抗体を含有してなるＡＳＫ１活性化阻害剤、
［３３］ アポトーシスまたは炎症性サイトカイン産生抑制剤である上記［３２］記載の剤、
［３４］ 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩に対する抗体を含有してなる医薬、
［３５］ アポトーシスまたは炎症を抑制することが予防・治療上有効な疾患の予防・治療剤である上記［３４］記載の医薬、
［３６］ 疾患が、ウイルス感染症、内分泌疾患、血液疾患、臓器形成不全、移植臓器拒絶、移植片対宿主病、免疫不全、神経変性疾患、虚血性心疾患、放射線障害、紫外線障害、中毒性疾患、栄養障害、炎症性疾患、虚血性神経障害、糖尿病性神経障害、血管系疾患、呼吸器系疾患および軟骨疾患からなる群より選択される上記［３５］記載の医薬、
［３７］ 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは上記［１］記載のペプチドまたはその塩あるいはそれを産生する細胞を用いることを特徴とする、ＡＳＫ１活性化調節物質のスクリーニング方法、
［３８］ ＡＳＫ１もしくはＮ末端活性化制御ドメインを含むその部分ペプチドまたはその塩あるいはそれを産生する細胞をさらに用いることを特徴とする、上記［３７］記載の方法、
［３９］ 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは上記［１］記載のペプチドまたはその塩と、ＡＳＫ１もしくはＮ末端活性化制御ドメインを含むその部分ペプチドまたはその塩との結合性を測定することを特徴とする、上記［３８］記載の方法、
［４０］ 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは上記［１］記載のペプチドまたはその塩あるいはそれを産生する細胞を含んでなる、ＡＳＫ１活性化調節物質のスクリーニング用キット、
［４１］ さらに、ＡＳＫ１もしくはＮ末端活性化制御ドメインを含むその部分ペプチドまたはその塩あるいはそれを産生する細胞を含んでなる、上記［４０］記載のキット、
［４２］ ＡＳＫ１もしくはＮ末端活性化制御ドメインおよびキナーゼドメインを含むその部分ペプチドまたはその塩を産生する細胞におけるＡＳＫ１もしくは該部分ペプチドまたはその塩の活性化を、(1)配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは上記［１］記載のペプチドまたはその塩の存在下と、(2)配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは上記［１］記載のペプチドまたはその塩および被験物質の存在下で比較することを特徴とする、上記［３８］記載の方法、
［４３］ (1)配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは上記［１］記載のペプチドまたはその塩、および(2)ＡＳＫ１もしくはＮ末端活性化制御ドメインおよびキナーゼドメインを含むその部分ペプチドまたはその塩を産生する細胞におけるＡＳＫ１もしくは該部分ペプチドまたはその塩の活性化を、被験物質の存在下と非存在下で比較することを特徴とする上記［３８］記載の方法、
［４４］ 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは上記［１］記載のペプチドまたはその塩を産生する細胞における該蛋白質もしくは該ペプチドまたはその塩の発現を、被験物質の存在下と非存在下で比較することを特徴とする、ＡＳＫ１活性化調節物質のスクリーニング方法、
［４５］ 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする塩基配列もしくはその一部を含有するポリヌクレオチド、あるいは配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩に対する抗体を用いることを特徴とする、上記［４４］記載の方法、
［４６］ 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする塩基配列もしくはその一部を含有するポリヌクレオチド、あるいは配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩に対する抗体を含んでなるＡＳＫ１活性化調節物質のスクリーニング用キット、
［４７］ 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の発現または活性を増大させる物質を含有してなるアポトーシス誘発剤、
［４８］ 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の発現または活性を増大させる物質を含有してなる医薬、
［４９］ アポトーシスを誘発することが予防・治療上有効な疾患の予防・治療剤である上記［４８］記載の医薬、
［５０］ 疾患が、癌、自己免疫疾患、ウイルス感染症、内分泌疾患、血液疾患、臓器過形成、血管形成術後再狭窄および癌切除術後の再発からなる群より選択される上記［４９］記載の医薬、
［５１］ 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の発現または活性を減少させる物質を含有してなるアポトーシスまたは炎症性サイトカイン産生抑制剤、
［５２］ 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の発現または活性を減少させる物質を含有してなる医薬、
［５３］ アポトーシスまたは炎症を抑制することが予防・治療上有効な疾患の予防・治療剤である上記［５２］記載の医薬、および
［５４］ 疾患が、ウイルス感染症、内分泌疾患、血液疾患、臓器形成不全、移植臓器拒絶、移植片対宿主病、免疫不全、神経変性疾患、虚血性心疾患、放射線障害、紫外線障害、中毒性疾患、栄養障害、炎症性疾患、虚血性神経障害、糖尿病性神経障害、血管系疾患、呼吸器系疾患および軟骨疾患からなる群より選択される上記［５３］記載の医薬を提供する。
さらに、本発明は、
［５５］ ＡＳＫ１のＮ末端活性化制御ドメインを含み、且つキナーゼドメインを含まないＡＳＫ１部分ペプチドまたはその塩を含有してなる、配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の阻害剤、
［５６］ アポトーシスまたは炎症性サイトカイン産生抑制剤である上記［５５］記載の剤、
［５７］ ＡＳＫ１のＮ末端活性化制御ドメインを含み、且つキナーゼドメインを含まないＡＳＫ１部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬、
［５８］ アポトーシスまたは炎症を抑制することが予防・治療上有効な疾患の予防・治療剤である上記［５７］記載の医薬、
［５９］ 疾患が、ウイルス感染症、内分泌疾患、血液疾患、臓器形成不全、移植臓器拒絶、移植片対宿主病、免疫不全、神経変性疾患、虚血性心疾患、放射線障害、紫外線障害、中毒性疾患、栄養障害、炎症性疾患、虚血性神経障害、糖尿病性神経障害、血管系疾患、呼吸器系疾患および軟骨疾患からなる群より選択される上記［５８］記載の医薬、
［６０］ 上記［９］記載のペプチドまたはその塩を含有してなるＡＳＫ１活性化阻害剤、
［６１］ アポトーシスまたは炎症性サイトカイン産生抑制剤である上記［６０］記載の剤、
［６２］ 上記［９］記載のペプチドまたはその塩を含有してなる医薬、
［６３］ アポトーシスまたは炎症を抑制することが予防・治療上有効な疾患の予防・治療剤である上記［６２］記載の医薬、および
［６４］ 疾患が、ウイルス感染症、内分泌疾患、血液疾患、臓器形成不全、移植臓器拒絶、移植片対宿主病、免疫不全、神経変性疾患、虚血性心疾患、放射線障害、紫外線障害、中毒性疾患、栄養障害、炎症性疾患、虚血性神経障害、糖尿病性神経障害、血管系疾患、呼吸器系疾患および軟骨疾患からなる群より選択される上記［６３］記載の医薬を提供する。
本発明のＡＢＰ１、それをコードするポリヌクレオチド等は、ＡＳＫ１カスケードを活性化することにより、細胞にアポトーシスを誘導したり、炎症性サイトカインの産生を誘導するなどの効果を奏する。一方、本発明のＡＢＰ１抑制薬（例えば、抗ＡＢＰ１抗体、ＡＢＰ１アンチセンスポリヌクレオチド等）は、ＡＢＰ１の発現もしくは活性を阻害することにより、ＡＳＫ１の活性化を阻害し、アポトーシスや炎症性サイトカインの産生を抑制するなどの効果を奏する。
本発明において用いられる蛋白質（以下、「本発明のＡＢＰ１」もしくは単に「ＡＢＰ１」という）は、配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質である。
本発明のＡＢＰ１は、温血動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）の細胞（例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来する蛋白質であってよく、また、化学合成もしくは無細胞翻訳系で合成された蛋白質であってもよい。あるいは上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを導入された形質転換体から産生された組換え蛋白質であってもよい。
配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と「実質的に同一のアミノ酸配列」としては、配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と「実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質」としては、例えば、前記の配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
「実質的に同質の活性」としては、例えば、ＡＳＫ１またはその下流に位置するキナーゼ群（例、MKK4/7、MKK3/6、JNK、p38など）の活性化促進活性、細胞のアポトーシス誘導活性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの性質が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、ＡＳＫ１カスケード活性化促進等の活性が同等であることが好ましいが、これらの活性の程度、蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい（例えば、活性については、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍の範囲内が挙げられる）。
ＡＳＫ１カスケード活性化促進活性の測定は、公知の方法、例えば、標識したリン酸基供与体を用いてＡＳＫ１またはその下流に位置するキナーゼ群（例、MKK4/7、MKK3/6、JNK、p38など）のリン酸化を検出すること等によって、また、アポトーシス誘導活性の測定は、細胞死誘導率の測定、細胞の形態学的観察、ＤＮＡ断片化の検出等によって行うことができる。
また、本発明のＡＢＰ１には、例えば、1) 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、2) 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、3) 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、4) 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または5) それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質などのいわゆるムテインも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置は、蛋白質の活性が保持される限り特に限定されない。
本発明のＡＢＰ１は、好ましくは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するヒトＡＢＰ１（ｈＡＢＰ１）または配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するマウスＡＢＰ１（ｍＡＢＰ１）、あるいは他の温血動物（例えば、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）におけるそのホモログである。ｈＡＢＰ１はＰＧＲ１と命名されたヒトＴ細胞由来の既知遺伝子（GenBank登録番号：AF116272）にコードされる１２７アミノ酸からなる蛋白質であるが、その機能に関する報告はこれまでになされていない。また、マウスＡＢＰ１はclone MNCb-1039と命名されたマウス脳由来のｃＤＮＡ（GenBank登録番号：AB041651）にコードされる１２５アミノ酸からなる蛋白質であるが、やはりその機能に関する報告はない。
本明細書に記載される蛋白質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をはじめとする、本発明のＡＢＰ１は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート(−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基；例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基；α−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
ＡＢＰ１がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のＡＢＰ１に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のＡＢＰ１には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
本発明は、上記したＡＢＰ１の部分アミノ酸配列を有するペプチドであり、且つＡＢＰ１と実質的に同質の活性を有するペプチドを提供する。ここで「実質的に同質の活性」とは上記と同意義を示す。また、「実質的に同質の活性」の測定は上記と同様にして行うことができる。本明細書においては、当該部分ペプチドを、以下「本発明の活性化ペプチド」と称することとする。
本発明の活性化ペプチドは、上記の性質を有する限り特に制限されないが、例えば、配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列中約６０アミノ酸以上、好ましくは約６０〜約１００アミノ酸、より好ましくは約６０〜約８０アミノ酸からなる部分アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドなどが挙げられる。該部分アミノ酸配列はＡＢＰ１のＮ末端側配列であっても、Ｃ末端側配列であってもよいし、内部配列であってもよい。あるいは、それらの部分配列同士の組み合わせであってもよい。
好ましくは、本発明の活性化ペプチドは、配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列のＮ末端側の約６０アミノ酸以上、より好ましくは約６０〜約１００アミノ酸、特に好ましくは約６０〜約８０アミノ酸の部分アミノ酸配列を含有する。
特に好ましい範囲においては、本発明の活性化ペプチドは、全長蛋白質よりもさらに高い活性（例、ＡＳＫ１カスケード活性化促進活性、アポトーシス誘導活性等）を示す場合がある。
一方、ＡＢＰ１の部分ペプチドの中には、ＡＢＰ１もしくは「本発明の活性化ペプチド」の（拮抗）阻害物質として機能し得るものが含まれる。かかる部分ペプチドとしては、ＡＳＫ１に対する結合活性を有するが、該キナーゼを活性化し得ないものが挙げられる。本明細書においては、当該部分ペプチドを以下「本発明の阻害ペプチド」と称することとする。
すなわち、本発明の阻害ペプチドは、配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列の一部と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つＡＳＫ１を活性しないか、もしくは不活性化し得るペプチドである。該阻害ペプチドとしては、例えば、配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列中約３５アミノ酸以下からなる部分アミノ酸配列、好ましくはＮ末端側の部分アミノ酸配列を含有するものが挙げられる。
本発明のＡＢＰ１の部分ペプチド（本発明の活性化ペプチドおよび本発明の阻害ペプチドの両者を包含する；以下、単に「本発明の部分ペプチド」と略記する場合がある）は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、ＡＢＰ１について前記したと同様のものが挙げられる。これらのペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明の部分ペプチドには、上記したＡＢＰ１と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したＧｌｎがピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明のＡＢＰ１またはその部分ペプチドの塩としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明のＡＢＰ１またはその塩は、前述した温血動物の細胞または組織から自体公知の蛋白質の精製方法によって調製することができる。具体的には、温血動物の組織または細胞をホモジナイズし、可溶性画分を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー等で分離精製することによって、ＡＢＰ１またはその塩を製造することができる。
本発明のＡＢＰ１もしくはその部分ペプチドまたはその塩（以下、「本発明のＡＢＰ１類」と包括的にいう場合がある）は、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。
ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。ＡＢＰ１を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とする蛋白質を製造することができる。
ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の1) 〜5) に記載された方法に従って行われる。
1) M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
2) SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
3) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
4) 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 蛋白質の化学IV、 205、(1977年)
5) 矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、広川書店
このようにして得られたＡＢＰ１類は、公知の精製法により単離・精製することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げられる。
上記方法で得られる蛋白質（ペプチド）が遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に蛋白質（ペプチド）が塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明のＡＢＰ１類の合成には、通常市販の蛋白質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、PAM樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆmocアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とする蛋白質もしくはペプチド（以下、「蛋白質等」と総称する場合もある）の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂から蛋白質等を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的の蛋白質等またはそのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、蛋白質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢt、ＨＯＯＢt)とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、対称酸無水物またはＨＯＢtエステルあるいはＨＯＯＢtエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒は、蛋白質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどのアミン類，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することができる。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢt）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
蛋白質等のアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（蛋白質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いた蛋白質等とＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去した蛋白質等とを製造し、この両蛋白質等を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護蛋白質等を精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗蛋白質等を得ることができる。この粗蛋白質等は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の蛋白質等のアミド体を得ることができる。
蛋白質等のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、蛋白質等のアミド体と同様にして、所望の蛋白質等のエステル体を得ることができる。
本発明の部分ペプチドまたはその塩は、ＡＢＰ１またはその塩を適当なペプチダーゼで切断することによっても製造することができる。
さらに、本発明のＡＢＰ１類は、ＡＢＰ１またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養し、得られる培養物からＡＢＰ１類を分離精製することによって製造することもできる。
本発明のＡＢＰ１またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、ヒトまたは他の温血動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）のあらゆる細胞（例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）や血球系の細胞、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など（特に、脳や脳の各部位）由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡなどが挙げられる。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞・組織よりtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、「ＲＴ-ＰＣＲ法」と略称する）によって増幅することもできる。
本発明のＡＢＰ１をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号１または配列番号３に示される塩基配列を含有するＤＮＡ、あるいは配列番号１または配列番号３に示される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性（例、ＡＳＫ１カスケード活性化促進活性、アポトーシス誘導活性など）を有する蛋白質をコードするＤＮＡなどが挙げられる。
配列番号１または配列番号３に示される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号１または配列番号３に示される塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、特に好ましくは約８０％以上、最も好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）第２版（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が好ましい。
本発明のＡＢＰ１をコードするＤＮＡは、好ましくは配列番号１に示される塩基配列を含有するｈＡＢＰ１ ＤＮＡまたは配列番号３に示される塩基配列を含有するｍＡＢＰ１ ＤＮＡ、あるいは他の温血動物（例えば、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）におけるそのホモログなどである。
本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡは、配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列の一部と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞・組織よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接ＲＴ-ＰＣＲ法によって増幅することもできる。
具体的には、本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、
（１）配列番号１または配列番号３に示される塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または
（２）配列番号１または配列番号３に示される塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、且つ
（2a）該ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を含む蛋白質と実質的に同質の活性（例、ＡＳＫ１カスケード活性化促進活性、アポトーシス誘導活性など）、または
（2b）該ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を含む蛋白質の活性を阻害する活性（例、ＡＳＫ１カスケード活性化阻害活性、アポトーシス抑制活性など）
を有するペプチドをコードするＤＮＡなどが用いられる。
配列番号１または配列番号３に示される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、該塩基配列中の対応する部分と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、最も好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどが用いられる。
本発明のＡＢＰ１またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡは、該蛋白質またはペプチドをコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当な発現ベクターに組み込んだＤＮＡを、本発明の蛋白質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを標識したものとハイブリダイゼーションすることによってクローニングすることができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）第２版（前述）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
ＤＮＡの塩基配列は、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変換することができる。
クローン化されたＤＮＡは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することができる。
本発明のＡＢＰ１またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡ発現ベクターは、例えば、ＡＢＰ１をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）；枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）；酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）；λファージなどのバクテリオファージ；レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルス；ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
例えば、宿主が動物細胞である場合、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが用いられる。なかでも、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが好ましい。
宿主がエシェリヒア属菌である場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが好ましい。
宿主がバチルス属菌である場合、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが好ましい。
宿主が酵母である場合、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用い、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によって選択することもできる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明の蛋白質のＮ端末側に付加してもよい。宿主がエシェリヒア属菌である場合、PhoＡ・シグナル配列、OmpＡ・シグナル配列などが；宿主がバチルス属菌である場合、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが；宿主が酵母である場合、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列などが；宿主が動物細胞である場合、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ用いられる。
上記のようにして得られる「本発明のＡＢＰ１またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡ」を含有する形質転換体は、公知の方法に従い、該ＤＮＡを含有する発現ベクターで、宿主を形質転換することによって製造することができる。
ここで、発現ベクターとしては、前記したものが挙げられる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６０巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research），９巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology），１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞、Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合、昆虫細胞としては、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N 細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Vivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
エシェリヒア属菌は、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６９巻，２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１９８２)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
バチルス属菌は、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
酵母は、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７５巻，１９２９(１９７８)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
昆虫細胞および昆虫は、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）,6, 47-55(1988)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
動物細胞は、例えば、細胞工学別冊８ 新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って形質転換することができる。
形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
例えば、宿主がエシェリヒア属菌またはバチルス属菌である形質転換体を培養する場合、培養に使用される培地としては液体培地が好ましい。また、培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。ここで、炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖などが；窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質が；無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。また、培地には、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは、好ましくは約５〜８である。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Molecular Genetics），４３１−４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York １９７２〕が好ましい。必要により、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を培地に添加してもよい。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体の培養は、通常約１５〜４３℃で、約３〜２４時間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主がバチルス属菌である形質転換体の培養は、通常約３０〜４０℃で、約６〜２４時間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が酵母である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕などが挙げられる。培地のｐＨは、好ましくは約５〜８である。培養は、通常約２０℃〜３５℃で、約２４〜７２時間行なわれる。必要に応じて、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えばGrace's Insect Medium（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(1962)）に非働化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは約６．２〜６．４である。培養は、通常約２７℃で、約３〜５日間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The Journal of the American Medical Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは約６〜８である。培養は、通常約３０℃〜４０℃で、約１５〜６０時間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
以上のようにして、形質転換体の細胞内または細胞外に本発明のＡＢＰ１もしくはその部分ペプチドまたはその塩（ＡＢＰ１類）を生成させることができる。
前記形質転換体を培養して得られる培養物から、本発明のＡＢＰ１類を自体公知の方法に従って分離精製することができる。
例えば、本発明のＡＢＰ１類を培養菌体あるいは細胞から抽出する場合、培養物から公知の方法で集めた菌体あるいは細胞を適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した後、遠心分離やろ過により可溶性蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。該緩衝液は、尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤を含んでいてもよい。
このようにして得られた可溶性画分中に含まれる本発明のＡＢＰ１類の単離精製は、自体公知の方法に従って行うことができる。このような方法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法；などが用いられる。これらの方法は、適宜組み合わせることもできる。
かくして得られるＡＢＰ１類が遊離体である場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって、該遊離体を塩に変換することができ、ＡＢＰ１類が塩として得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、該塩を遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、形質転換体が産生するＡＢＰ１類を、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。該蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして得られる本発明のＡＢＰ１類の存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより確認することができる。
さらに、本発明のＡＢＰ１類は、上記のＡＢＰ１またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡに対応するＲＮＡを鋳型として、ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセートなどからなる無細胞蛋白質翻訳系を用いてインビトロ翻訳することによっても合成することができる。あるいは、さらにＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞転写／翻訳系を用いて、ＡＢＰ１またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを鋳型としても合成することができる。
本発明のＡＢＰ１またはその塩に対する抗体（以下、「本発明の抗体」と略記する場合がある）は、ＡＢＰ１またはその塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。ＡＢＰ１またはその塩に対する抗体は、本発明のＡＢＰ１類を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。抗原として用いられる本発明のＡＢＰ１類としては、上記のＡＢＰ１もしくはその部分ペプチドまたはその塩であればいずれのものを用いてもよい。
ＡＢＰ１またはその塩に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体は、例えば以下のようにして製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のＡＢＰ１類を、哺乳動物に対して、投与により抗体産生が可能な部位に、それ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与する。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
例えば、抗原で免疫された哺乳動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し、最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化蛋白質と抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行うことができる。融合操作は、既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (1975)〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの哺乳動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は、１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、例えば、抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法；抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識した蛋白質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法；などによりスクリーニングすることができる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。モノクローナル抗体の選別は、通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行うことができる。モノクローナル抗体の選別および育種用培地は、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。このような培地としては、例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行うことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
このようにして得られたモノクローナル抗体は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って分離精製することができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
ＡＢＰ１またはその塩に対するポリクローナル抗体は、自体公知の方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（ＡＢＰ１類）自体、あるいはそれとキャリアー蛋白質との複合体を作製し、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行い、該免疫動物から本発明の抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。また、哺乳動物以外にニワトリなども用いることができる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプリングさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤、例えばグルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、哺乳動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行われる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。
ＡＢＰ１の部分ペプチドを抗原として用いる場合、そのＡＢＰ１上の位置は特に限定されないが、例えば、各種温血動物間でよく保存された領域の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドが挙げられる。具体的には、ヒトおよびマウス間で完全に保存されている配列番号５または配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましく例示される。
本発明のＡＢＰ１をコードする塩基配列と相補的な塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド（以下、「本発明のアンチセンスポリヌクレオチド」と略記する場合がある）としては、ＡＢＰ１をコードする塩基配列と完全に相補的な塩基配列もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有し、ＡＢＰ１をコードするＲＮＡからの該蛋白質の翻訳を抑制する作用を有するものであればよい。「実質的に相補的な塩基配列」としては、ＡＢＰ１またはその部分ペプチドをコードする塩基配列と、該蛋白質を発現する細胞の生理学的条件下でハイブリダイズし得る塩基配列、より具体的には、ＡＢＰ１またはその部分ペプチドをコードする塩基配列の相補鎖との間で、オーバーラップする部分に関して約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、クローン化した、あるいは決定された本発明のポリヌクレオチドの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうしたポリヌクレオチドは、ＡＢＰ１をコードする遺伝子の複製または発現を阻害することができる。即ち、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、ＡＢＰ１をコードする遺伝子から転写されるＲＮＡとハイブリダイズすることができ、ｍＲＮＡの合成（プロセッシング）または機能（蛋白質への翻訳）を阻害することができる。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドの標的領域は、アンチセンスポリヌクレオチドがハイブリダイズすることにより、結果としてＡＢＰ１の翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、ＡＢＰ１をコードするＲＮＡの全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約１５塩基程度、長いものでｍＲＮＡまたは初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さや抗原性の問題を考慮すれば、約１５〜約３０塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいがそれに限定されない。具体的には、例えば、ＡＢＰ１をコードする遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、蛋白質コード領域、ＯＲＦ翻訳開始コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループが標的領域として選択しうるが、該遺伝子内部の如何なる領域も標的として選択しうる。例えば、該遺伝子のイントロン部分を標的領域とすることもまた好ましい。
さらに、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、ＡＢＰ１をコードするｍＲＮＡもしくは初期転写産物とハイブリダイズして蛋白質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡであるＡＢＰ１をコードする遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ＲＮＡの転写を阻害し得るものであってもよい。
アンチセンスポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているデオキシリボヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販の蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えば蛋白質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、プソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいてもよい。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンや脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてもよい。
アンチセンスポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンスポリヌクレオチドをより安定なものにする、アンチセンスポリヌクレオチドの細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンスポリヌクレオチドの毒性をより小さなものにする。こうした修飾は当該分野で数多く知られており、例えば J. Kawakami et al., Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395, 1992; S. T. Crooke et al. ed., Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993 などに開示がある。
アンチセンスポリヌクレオチドは、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していてよく、リポソーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
ＡＢＰ１をコードするｍＲＮＡもしくは遺伝子初期転写産物を、コード領域の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得るリボザイムもまた、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドに包含され得る。「リボザイム」とは核酸を切断する酵素活性を有するＲＮＡをいうが、最近では当該酵素活性部位の塩基配列を有するオリゴＤＮＡも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りＤＮＡをも包含する概念として用いるものとする。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性ＲＮＡに見られるセルフスプライシングＲＮＡがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約４０塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約１０塩基程度）をｍＲＮＡの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的ｍＲＮＡのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイムは、ＲＮＡのみを基質とするので、ゲノムＤＮＡを攻撃することがないというさらなる利点を有する。ＡＢＰ１をコードするｍＲＮＡが自身で二本鎖構造をとる場合には、ＲＮＡヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のＲＮＡモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(10): 5572-5577 (2001)］。さらに、リボザイムを、それをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、ｔＲＮＡを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)］。
ＡＢＰ１をコードするｍＲＮＡもしくは遺伝子初期転写産物のコード領域内の部分配列（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相補的な二本鎖オリゴＲＮＡ（small interfering RNA；ｓｉＲＮＡ）もまた、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドに包含され得る。短い二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入するとそのＲＮＡに相補的なｍＲＮＡが分解される、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、最近、この現象が哺乳動物細胞でも起こることが確認されたことから［Nature, 411(6836): 494-498 (2001)］、リボザイムの代替技術として注目されている。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムは、本発明の蛋白質をコードするｃＤＮＡ配列もしくはゲノミックＤＮＡ配列情報に基づいてｍＲＮＡもしくは初期転写産物の標的領域を決定し、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。ｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中で、例えば、約９０〜約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０〜約７０℃で約１〜約８時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、相補的なオリゴヌクレオチド鎖を交互にオーバーラップするように合成して、これらをアニーリングさせた後リガーゼでライゲーションすることにより、より長い二本鎖ポリヌクレオチドを調製することもできる。
ＡＢＰ１または本発明の活性化ペプチドは、ＡＳＫ１と結合してこれを活性化することから、ＡＳＫ１キナーゼカスケードを介したアポトーシス誘導を促進し得る。従って、1) ＡＢＰ１または本発明の活性化ペプチド、2) ＡＢＰ１または本発明の活性化ペプチドをコードするポリヌクレオチド、3) ＡＢＰ１をコードする塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド、4) 本発明の抗体、5) 本発明のアンチセンスポリヌクレオチド、6) 本発明の阻害ペプチドは以下の用途を有する。
（１）ＡＳＫ１活性化促進剤・アポトーシス誘発剤
ＡＢＰ１はＡＳＫ１と結合してこれを活性化することにより、ＡＳＫ１キナーゼカスケードを介したアポトーシス誘導を促進する機能を有する。従って、細胞にＡＢＰ１もしくは本発明の活性化ペプチドまたはその塩を添加したり、ＡＢＰ１または本発明の活性化ペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入して発現させ、細胞内のＡＢＰ１量を増加させることにより、該細胞内ＡＳＫ１の活性化を促進したり、該細胞にアポトーシスを誘導したりすることができ、例えば、アポトーシス研究用試薬として用いることができる。
ＡＢＰ１もしくは本発明の活性化ペプチドまたはその塩を上記のＡＳＫ１活性化促進剤、アポトーシス誘発剤として使用する場合、水もしくは適当な緩衝液（例、リン酸緩衝液、ＰＢＳ、トリス塩酸緩衝液など）中に適当な濃度となるように溶解することにより調製することができる。また、必要に応じて、通常使用される保存剤、安定剤、還元剤、等張化剤等を配合させてもよい。
一方、ＡＢＰ１または本発明の活性化ペプチドをコードするポリヌクレオチドを上記のＡＳＫ１活性化促進剤、アポトーシス誘発剤として使用する場合は、該ポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、上記の形質転換法（例、リポソーム法、エレクトロポレーション法など）を用いて細胞に導入することができる。
（２）アポトーシス抑制が関連する疾患の予防・治療剤
上記のように、ＡＢＰ１はＡＳＫ１を活性化して細胞にアポトーシスを誘導する機能を有するので、生体内においてＡＢＰ１またはそれをコードする核酸（例、遺伝子、ｍＲＮＡ等）に異常があったり、これを欠損している場合、あるいはその発現量が異常に減少している場合、さらには、他の何らかの要因で細胞のアポトーシス誘導が過度に抑制されている場合、例えば、癌、自己免疫疾患、ウイルス感染症、内分泌疾患、血液疾患、臓器過形成などの種々の疾病を発症する。
したがって、ＡＢＰ１の減少もしくは他の要因により不要な細胞や異常細胞のアポトーシスによる除去が期待できない患者がいる場合に、a）ＡＢＰ１もしくは本発明の活性化ペプチドまたはその塩を該患者に投与してＡＢＰ１の量を補充したり、b）（i）ＡＢＰ１または本発明の活性化ペプチドをコードするＤＮＡを該患者に投与して標的細胞内で発現させることによって、あるいは（ii）単離した標的細胞にＡＢＰ１または本発明の活性化ペプチドをコードするＤＮＡを導入し発現させた後に、該細胞を該患者に移植することなどによって、患者の体内におけるＡＢＰ１の量を増加させ、異常細胞や不要となった細胞にＡＳＫ１カスケードを介するアポトーシスを誘導することができる。
したがって、a）ＡＢＰ１もしくは本発明の活性化ペプチドまたはその塩、あるいはb）ＡＢＰ１または本発明の活性化ペプチドをコードするポリヌクレオチドを、アポトーシスを誘発することが予防・治療上有効な疾患、例えば、癌（例、白血病、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、メラノーマ、骨髄腫、骨肉腫、脳腫瘍等）、自己免疫疾患（例、全身性エリテマトーデス、強皮症、慢性関節リウマチ、シェーグレン症候群、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、乾癬、潰瘍性大腸炎、特発性血小板減少性紫斑病、クローン病、糸球体腎炎等）、ウイルス感染症（例、出血熱、Ｔ細胞白血病、カポジ肉腫、伝染性単核症、リンパ腫、上咽頭癌、子宮頚癌、皮膚癌、肝炎、肝癌等）、内分泌疾患（例、ホルモン過剰症、サイトカイン過剰症等）、血液疾患（例、血球増加症、Ｂ細胞リンパ腫、多血症等）、臓器過形成（例、半陰陽、停留睾丸、奇形腫、腎芽細胞癌、多発性嚢胞腎、心・大動脈奇形、合指症等）、血管形成術後再狭窄、癌切除術後の再発などの予防・治療剤として使用することができる。
ＡＢＰ１もしくは本発明の活性化ペプチドまたはその塩を上記予防・治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
一方、ＡＢＰ１または本発明の活性化ペプチドをコードするポリヌクレオチドを上記予防・治療剤として使用する場合は、該ポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って製剤化することができる。該ポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することができる。
例えば、a）ＡＢＰ１もしくは本発明の活性化ペプチドまたはその塩、あるいはb）ＡＢＰ１または本発明の活性化ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、a）ＡＢＰ１もしくは本発明の活性化ペプチドまたはその塩、あるいはb）ＡＢＰ１または本発明の活性化ペプチドをコードするポリヌクレオチドを、生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の温血動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー、トリなど）に対して投与することができる。
ＡＢＰ１または本発明の活性化ペプチドの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
ＡＢＰ１または本発明の活性化ペプチドをコードするポリヌクレオチドの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
（３）遺伝子診断剤
ＡＢＰ１をコードする塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド（以下、「本発明のセンスポリヌクレオチド」という）および本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、プローブとして使用することにより、ヒトまたは他の温血動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー、トリなど）におけるＡＢＰ１をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡの損傷もしくは突然変異やｍＲＮＡのスプライシング異常あるいは発現低下、あるいは該ＤＮＡの増幅やｍＲＮＡの発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。ＡＢＰ１をコードする塩基配列の一部を含有するポリヌクレオチドは、プローブとして必要な長さ（例えば、約１５塩基以上）を有する限り特に制限されず、また、ＡＢＰ１の部分ペプチドをコードしている（即ち、in frameである）必要もない。
本発明のセンスまたはアンチセンスポリヌクレオチドを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーション、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、アレル特異的ＰＣＲ、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法、ＤＧＧＥ法、ＲＮａｓｅプロテクション法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法などにより実施することができる。
例えば、被検温血動物の細胞から抽出したＲＮＡ画分についてのノーザンハイブリダイゼーションや定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果、ＡＢＰ１の発現低下が検出された場合や、ＲＮＡ画分もしくはゲノミックＤＮＡ画分についてＰＣＲ−ＳＳＣＰ法を実施した結果、ＡＢＰ１遺伝子の突然変異が検出された場合は、アポトーシスまたは炎症性サイトカイン産生抑制が関連する疾患、例えば、癌（例、白血病、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、メラノーマ、骨髄腫、骨肉腫、脳腫瘍等）、自己免疫疾患（例、全身性エリテマトーデス、強皮症、慢性関節リウマチ、シェーグレン症候群、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、乾癬、潰瘍性大腸炎、特発性血小板減少性紫斑病、クローン病、糸球体腎炎等）、ウイルス感染症（例、出血熱、Ｔ細胞白血病、カポジ肉腫、伝染性単核症、リンパ腫、上咽頭癌、子宮頚癌、皮膚癌、肝炎、肝癌等）、内分泌疾患（例、ホルモン過剰症、サイトカイン過剰症等）、血液疾患（例、血球増加症、Ｂ細胞リンパ腫、多血症等）、臓器過形成（例、半陰陽、停留睾丸、奇形腫、腎芽細胞癌、多発性嚢胞腎、心・大動脈奇形、合指症等）、血管形成術後再狭窄、癌切除術後の再発などの疾患に罹患しているか、あるいは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
一方、ノーザンハイブリダイゼーションや定量的ＲＴ−ＰＣＲによりＡＢＰ１の発現過多が検出された場合は、アポトーシス亢進または炎症が関連する疾患、例えば、ウイルス感染症（例、ＡＩＤＳ、インフルエンザ、不明熱等）、内分泌疾患（例、ホルモン欠乏症、サイトカイン欠乏症等）、血液疾患（例、血球減少症、腎性貧血等）、臓器形成不全（例、甲状腺萎縮、口蓋裂等）、移植臓器拒絶、移植片対宿主病、免疫不全、神経変性疾患（例、ポリグルタミン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、小脳変性症等）、虚血性心疾患（例、狭心症、心筋梗塞等）、放射線障害、紫外線障害（例、日焼け等）、中毒性疾患（例、重金属による腎尿細管細胞傷害、アルコールによる肝細胞傷害等）、栄養障害（例、ビタミン、微量元素欠乏による胸腺の萎縮等）、炎症性疾患（例、急性膵炎、関節炎、歯周病、大腸炎等）、虚血性神経障害、糖尿病性神経障害、血管系疾患（例、動脈硬化等）、呼吸器系疾患（例、間質性肺炎、肺繊維症等）、軟骨疾患（例、変形性関節炎等）などの疾患に罹患しているか、あるいは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
（４）本発明の抗体を用いる診断方法
本発明の抗体は、ＡＢＰ１を特異的に認識することができるので、被検液中のＡＢＰ１の検出に使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化されたＡＢＰ１とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたＡＢＰ１の割合を測定することを特徴とする被検液中のＡＢＰ１またはその塩の定量法、および
（ii）被検液と、担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された別の本発明の抗体とを、同時あるいは連続的に反応させた後、不溶化担体上の標識剤の量（活性）を測定することを特徴とする被検液中のＡＢＰ１またはその塩の定量法を提供する。
上記（ii）の定量法においては、２種の抗体はＡＢＰ１の異なる部分を認識するものであることが望ましい。例えば、一方の抗体がＡＢＰ１のＮ端部（例、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する部分など）を認識する抗体であれば、他方の抗体としてＡＢＰ１のＣ端部（例、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する部分など）と反応するものを用いることができる。
また、ＡＢＰ１に対するモノクローナル抗体を用いてＡＢＰ１の定量を行うことができるほか、組織染色等による検出を行うこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')２、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いるＡＢＰ１またはその塩の定量法は、特に制限されるべきものではなく、被検液中の抗原量（例えば、ＡＢＰ１量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−（ストレプト）アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、物理吸着を用いてもよく、また通常蛋白質あるいは酵素等を不溶化・固定化するのに用いられる化学結合を用いてもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明の抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明の抗体を反応させ（２次反応）た後、不溶化担体上の標識剤の量（活性）を測定することにより被検液中のＡＢＰ１量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序で行っても、また、同時に行ってもよいし、時間をずらして行ってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相化抗体あるいは標識化抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
サンドイッチ法によるＡＢＰ１の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明の抗体は、ＡＢＰ１の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。例えば、上述のように、２次反応で用いられる抗体が、ＡＢＰ１のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体としては、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
本発明の抗体は、サンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどにも用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原(Ｆ)と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、ポリエチレングリコールや前記抗体（１次抗体）に対する２次抗体などを用いてＢ／Ｆ分離を行う液相法、および、１次抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは１次抗体は可溶性のものを用い、２次抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてＡＢＰ１の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D : Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E : Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I : Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、ＡＢＰ１またはその塩を感度よく定量することができる。
したがって、被検温血動物由来の生体試料（例、血液、血漿、尿、生検等）を被検体とし、本発明の抗体を用いて該検体中のＡＢＰ１またはその塩の濃度を定量することによって、ＡＢＰ１濃度の減少が検出された場合、アポトーシス抑制が関連する疾患、例えば、癌（例、白血病、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、メラノーマ、骨髄腫、骨肉腫、脳腫瘍等）、自己免疫疾患（例、全身性エリテマトーデス、強皮症、慢性関節リウマチ、シェーグレン症候群、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、乾癬、潰瘍性大腸炎、特発性血小板減少性紫斑病、クローン病、糸球体腎炎等）、ウイルス感染症（例、出血熱、Ｔ細胞白血病、カポジ肉腫、伝染性単核症、リンパ腫、上咽頭癌、子宮頚癌、皮膚癌、肝炎、肝癌等）、内分泌疾患（例、ホルモン過剰症、サイトカイン過剰症等）、血液疾患（例、血球増加症、Ｂ細胞リンパ腫、多血症等）、臓器過形成（例、半陰陽、停留睾丸、奇形腫、腎芽細胞癌、多発性嚢胞腎、心・大動脈奇形、合指症等）、血管形成術後再狭窄、癌切除術後の再発などの疾患に罹患しているか、あるいは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
一方、ＡＢＰ１濃度の増加が検出された場合には、アポトーシス亢進または炎症が関連する疾患、例えば、ウイルス感染症（例、ＡＩＤＳ、インフルエンザ、不明熱等）、内分泌疾患（例、ホルモン欠乏症、サイトカイン欠乏症等）、血液疾患（例、血球減少症、腎性貧血等）、臓器形成不全（例、甲状腺萎縮、口蓋裂等）、移植臓器拒絶、移植片対宿主病、免疫不全、神経変性疾患（例、ポリグルタミン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、小脳変性症等）、虚血性心疾患（例、狭心症、心筋梗塞等）、放射線障害、紫外線障害（例、日焼け等）中毒性疾患（例、重金属による腎尿細管細胞傷害、アルコールによる肝細胞傷害等）、栄養障害（例、ビタミン、微量元素欠乏による胸腺の萎縮等）、炎症性疾患（例、急性膵炎、関節炎、歯周病、大腸炎等）、虚血性神経障害、糖尿病性神経障害、血管系疾患（例、動脈硬化等）、呼吸器系疾患（例、間質性肺炎、肺繊維症等）、軟骨疾患（例、変形性関節炎等）などの疾患に罹患しているか、あるいは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
（５）ＡＳＫ１活性化阻害剤・アポトーシス抑制剤
本発明の抗体は、ＡＢＰ１と特異的に結合することにより、ＡＢＰ１のＡＳＫ１への結合を阻害し、ＡＳＫ１活性化およびアポトーシス／炎症性サイトカイン産生誘導促進作用を不活性化（すなわち、中和）することができる。一方、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドはＡＢＰ１の発現を阻害して、該蛋白質の産生量を減少させるので、結果的にＡＢＰ１によるＡＳＫ１活性化およびアポトーシス／炎症性サイトカイン産生誘導促進作用を低減させることができる。
したがって、細胞に本発明の抗体を添加してＡＢＰ１を不活性化したり、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを細胞に導入して細胞内のＡＢＰ１量を減少させることにより、該細胞内におけるＡＳＫ１の活性化を阻害したり、該細胞のアポトーシス／炎症性サイトカイン産生を抑制したりすることができ、例えば、アポトーシス、炎症反応研究用の試薬として用いることができる。
本発明の抗体を上記のＡＳＫ１活性化阻害剤、アポトーシス／炎症性サイトカイン産生抑制剤として使用する場合、水もしくは適当な緩衝液（例、リン酸緩衝液、ＰＢＳ、トリス塩酸緩衝液など）中に適当な濃度となるように溶解することにより調製することができる。また、必要に応じて、通常使用される保存剤、安定剤、還元剤、等張化剤等を配合させてもよい。
一方、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを上記のＡＳＫ１活性化阻害剤、アポトーシス抑制剤として使用する場合は、該ポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、上記の形質転換法（例、リポソーム法、エレクトロポレーション法など）を用いて細胞に導入することができる。
（６）アポトーシス亢進または炎症が関連する疾患の予防・治療剤
上記のように、ＡＢＰ１はＡＳＫ１を活性化して細胞にアポトーシスを誘導したり、炎症を惹起する機能を有するので、生体内においてＡＢＰ１またはそれをコードする核酸（例、遺伝子、ｍＲＮＡ等）に異常がある（高活性変異体の出現）場合、あるいはその発現量が異常に増加している場合、さらには、他の何らかの要因で細胞のアポトーシス誘導または炎症性サイトカイン産生が異常亢進している場合、例えば、ウイルス感染症、内分泌疾患、血液疾患、臓器形成不全、移植臓器拒絶、移植片対宿主病、免疫不全、神経変性疾患、虚血性心疾患、放射線障害、紫外線障害、中毒性疾患、栄養障害、炎症、虚血性神経障害（脳虚血）、糖尿病性末梢神経障害、血管系疾患、呼吸器系疾患、軟骨疾患などの種々の疾病を発症する。
したがって、ＡＢＰ１の増加等により生体にとって必要な細胞までがアポトーシスによって失われている、あるいは炎症性疾患を発病している患者がいる場合に、a）本発明の抗体を該患者に投与してＡＢＰ１を不活性化したり、b）（i）本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを該患者に投与して標的細胞内に導入する（および発現させる）ことによって、あるいは（ii）単離した標的細胞に本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを導入し発現させた後に、該細胞を該患者に移植することなどによって、患者の体内におけるＡＢＰ１の量を減少させ、本来必要な細胞のアポトーシス死や炎症反応を抑制することができる。
したがって、a）本発明の抗体またはb）本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを、アポトーシスまたは炎症を抑制することが予防・治療上有効な疾患、例えばＡＢＰ１の過剰発現などに起因する疾患、具体的には、ウイルス感染症（例、ＡＩＤＳ、インフルエンザ、不明熱等）、内分泌疾患（例、ホルモン欠乏症、サイトカイン欠乏症等）、血液疾患（例、血球減少症、腎性貧血等）、臓器形成不全（例、甲状腺萎縮、口蓋裂等）、移植臓器拒絶、移植片対宿主病、免疫不全、神経変性疾患（例、ポリグルタミン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、小脳変性症等）、虚血性心疾患（例、狭心症、心筋梗塞等）、放射線障害、紫外線障害（例、日焼け等）中毒性疾患（例、重金属による腎尿細管細胞傷害、アルコールによる肝細胞傷害等）、栄養障害（例、ビタミン、微量元素欠乏による胸腺の萎縮等）、炎症性疾患（例、急性膵炎、関節炎、歯周病、大腸炎等）、虚血性神経障害、糖尿病性神経障害、血管系疾患（例、動脈硬化等）、呼吸器系疾患（例、間質性肺炎、肺繊維症等）、軟骨疾患（例、変形性関節炎等）などの疾患の予防・治療剤として用いることができる。
本発明の抗体を上記予防・治療剤として使用する場合、前記したＡＢＰ１もしくは本発明の活性化ペプチドまたはその塩を含有する医薬と同様にして製剤化することができる。また、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを上記予防・治療剤として使用する場合、前記したＡＢＰ１または本発明の活性化ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する医薬と同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の温血動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー、トリなど）に対して投与することができる。
本発明の抗体の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、ポリグルタミン病患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、ポリグルタミン病患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、ポリグルタミン病患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、ポリグルタミン病患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
（７）本発明の阻害ペプチドの用途
上記のように、本発明の阻害ペプチドはＡＢＰ１の（拮抗）阻害物質として機能し得る、すなわち、ＡＳＫ１に結合し得るがそれを活性しないか、もしくは不活性化し得るので、本発明の抗体と同様に、ＡＳＫ１活性化阻害剤、アポトーシス／炎症性サイトカイン産生抑制剤、あるいはアポトーシス亢進または炎症が関連する疾患の予防・治療剤に用いることができる。
本発明の阻害ペプチドをＡＳＫ１活性化阻害・アポトーシスまたは炎症性サイトカイン産生抑制剤として使用する場合、前記したＡＢＰ１もしくは本発明の活性化ペプチドまたはその塩を含有するＡＳＫ１活性化促進・アポトーシス誘発剤と同様にして試薬調製することができる。また、本発明の阻害ペプチドを上記予防・治療剤として使用する場合、前記したＡＢＰ１もしくは本発明の活性化ペプチドまたはその塩を含有する医薬と同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の温血動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー、トリなど）に対して投与することができる。
本発明の阻害ペプチドの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、ポリグルタミン病患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、ポリグルタミン病患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
（８）リン酸化活性を有しないＡＳＫ１部分ペプチドまたはその塩の用途
後記実施例において実証される通り、ＡＳＫ１のＡＢＰ１との結合に関与する部位はＮ末端側の活性化制御ドメインであることから、該活性化制御ドメインを有するが、カスケードの下流に位置するＭＡＰＫＫの活性化を担うキナーゼドメインを欠失したＡＳＫ１の部分ペプチドは、ＡＳＫ１の（拮抗）阻害物質として機能し得る。すなわち、該ペプチドはＡＢＰ１に結合し得るがそれによって活性化され得ないので、細胞に内在するＡＳＫ１とＡＢＰ１との結合およびそれによるＡＳＫ１の活性化を競合的に阻害し得る。したがって、該部分ペプチドは、ＡＢＰ１阻害剤、アポトーシスまたは炎症性サイトカイン産生抑制剤、あるいはアポトーシス亢進または炎症が関連する疾患の予防・治療剤に用いることができる。
ＡＳＫ１のキナーゼドメインとしては、例えばヒトＡＳＫ１の場合、前記特許文献１（特開平１０−９３）の配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号６７８〜９３６で示されるアミノ酸配列が挙げられる。従って、Ｎ末端側の活性化制御ドメインを有し、且つキナーゼドメインを欠失したＡＳＫ１の部分ペプチド（以下、「本発明のＡＳＫ１部分ペプチド」と略記する場合がある）としては、上記ヒトＡＳＫ１のアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜６７７で示されるアミノ酸配列の全部もしくは一部（以下、包括的に「ＡＳＫ１−Ｎ配列」と称する）と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つＡＢＰ１との結合能を有するペプチドが挙げられる。ここで「実質的に同一のアミノ酸配列」としては、上記ヒトＡＳＫ１のアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜６７７で示されるアミノ酸配列の全部もしくは一部と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
また、本発明のＡＳＫ１部分ペプチドには、例えば、1) ＡＳＫ１−Ｎ配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、2) ＡＳＫ１−Ｎ配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、3) ＡＳＫ１−Ｎ配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、4) ＡＳＫ１−Ｎ配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または5) それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する変異ペプチドも含まれる。
本発明のＡＳＫ１部分ペプチドは、上記のＡＢＰ１の部分ペプチドと同様の方法により調製することができる。
本発明のＡＳＫ１部分ペプチドをＡＢＰ１阻害剤、特にアポトーシスまたは炎症性サイトカイン産生抑制剤として使用する場合、前記したＡＢＰ１もしくは本発明の活性化ペプチドまたはその塩を含有するＡＳＫ１活性化促進・アポトーシス誘発剤と同様にして試薬調製することができる。また、本発明のＡＳＫ１部分ペプチドを上記予防・治療剤として使用する場合、前記したＡＢＰ１もしくは本発明の活性化ペプチドまたはその塩を含有する医薬と同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の温血動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー、トリなど）に対して投与することができる。
本発明のＡＳＫ１部分ペプチドの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、ポリグルタミン病患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、ポリグルタミン病患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
（９）ＡＳＫ１活性化調節物質のスクリーニング
本発明はまた、ＡＢＰ１もしくは本発明の活性化ペプチドまたはその塩あるいはそれを産生する細胞を用いることによる、ＡＳＫ１活性化調節物質のスクリーニング方法を提供する。該スクリーニング方法は、（Ａ）ＡＢＰ１とＡＳＫ１の結合性を利用する方法、（Ｂ）ＡＳＫ１の活性化を指標とする方法および（Ｃ）ＡＢＰ１の発現量を指標とする方法に大別される。（Ａ）および（Ｂ）の方法においては、ＡＳＫ１もしくはＡＢＰ１との結合性を保持するその部分ペプチド（即ち、少なくともＮ末端活性化制御ドメインを含む部分ペプチド）またはその塩あるいはそれを産生する細胞がさらに用いられる。
（Ａ）ＡＢＰ１とＡＳＫ１の結合性を利用するスクリーニング方法
ＡＢＰ１はＡＳＫ１と結合してこれを活性化することができるので、ＡＢＰ１または本発明の活性化ペプチドとＡＳＫ１またはＮ末端側活性化制御ドメインを含むその部分ペプチドを用いたバインディングアッセイ系を構築することによって、ＡＢＰ１または本発明の活性化ペプチドと同様の作用を有する化合物のスクリーニングや、ＡＢＰ１または本発明の活性化ペプチドの作用を阻害する化合物のスクリーニングを行うことができる。すなわち、本発明は、ＡＢＰ１または本発明の活性化ペプチドとＡＳＫ１またはＮ末端側活性化制御ドメインを含むその部分ペプチドを用いるＡＳＫ１活性化調節物質のスクリーニング方法を提供する。
より具体的には、本発明は、
（ａ）（１）ＡＳＫ１またはＮ末端側活性化制御ドメインを含むその部分ペプチドに、ＡＢＰ１または本発明の活性化ペプチドを接触させた場合と（２）ＡＳＫ１またはＮ末端側活性化制御ドメインを含むその部分ペプチドに、ＡＢＰ１または本発明の活性化ペプチドおよび被検物質を接触させた場合との、ＡＳＫ１またはＮ末端側活性化制御ドメインを含むその部分ペプチドとＡＢＰ１または本発明の活性化ペプチドとの結合量の比較を行うことを特徴とするＡＳＫ１活性化調節物質のスクリーニング方法、
（ｂ）（１）ＡＳＫ１またはＮ末端側活性化制御ドメインを含むその部分ペプチドを産生する細胞に、ＡＢＰ１または本発明の活性化ペプチドを接触させた場合と（２）ＡＳＫ１またはＮ末端側活性化制御ドメインを含むその部分ペプチドを産生する細胞に、ＡＢＰ１または本発明の活性化ペプチドおよび被検物質を接触させた場合との、ＡＳＫ１またはＮ末端側活性化制御ドメインを含むその部分ペプチドとＡＢＰ１または本発明の活性化ペプチドとの結合量の比較を行うことを特徴とするＡＳＫ１活性化調節物質のスクリーニング方法、および
（ｃ）ＡＳＫ１またはＮ末端側活性化制御ドメインを含むその部分ペプチドおよびＡＢＰ１または本発明の活性化ペプチドを産生し、且つ両者が結合した場合にレポーター遺伝子の転写が活性化される細胞における該レポーター遺伝子の発現量を、被検物質の存在下と非存在下とで比較することを特徴とするＡＳＫ１活性化調節物質のスクリーニング方法を提供する。
上記（ａ）または（ｂ）のスクリーニング方法において用いられるＡＳＫ１は、ヒトまたは他の温血動物の細胞から自体公知の方法（例えば、ＡＢＰ１について上記したと同様の方法）を用いて単離精製することができる。Ｎ末端側活性化制御ドメインを含むＡＳＫ１の部分ペプチドは、上記したＮ末端側活性化制御ドメインのアミノ酸配列を有する限り特に制限されず、キナーゼドメインやＣ末端側アミノ酸配列の一部を含んでいてもよい。該部分ペプチドはＡＳＫ１を適当な蛋白質分解酵素を用いて消化することにより得ることができる。また、ＡＳＫ１およびＮ末端側活性化制御ドメインを含むその部分ペプチドは、自体公知の遺伝子工学的手法に従ってそれをコードするＤＮＡをクローニングした後、前記したＡＢＰ１の発現方法に従って組換え生産することもできる。
ＡＢＰ１および本発明の活性化ペプチド（以下、単にＡＢＰ１という場合がある）は、上記の方法に従って調製することができる。
ＡＳＫ１を産生する細胞としては、それを発現するヒトまたは他の温血動物細胞であれば特に制限はないが、例えば、HeLa細胞、HEK293細胞等が挙げられる。また、ＡＳＫ１またはＮ末端側活性化制御ドメインを含むその部分ペプチド（以下、単にＡＳＫ１という場合がある）を産生する細胞としては、上記の遺伝子工学的手法により作製された形質転換体が例示される。
被検物質としては、例えば蛋白質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これらの物質は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。
結合量の測定は、例えば、標識した抗ＡＢＰ１抗体および抗ＡＳＫ１抗体を用いたウェスタンブロット解析、ＡＢＰ１またはＡＳＫ１のいずれかを標識（例えば、〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３５Ｓ〕などで）しての結合アッセイやゲルシフトアッセイ、あるいは表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などにより行うことができる。
上記のスクリーニング方法において、ＡＳＫ１と結合してＡＢＰ１とＡＳＫ１との結合を阻害する化合物をＡＳＫ１活性化調節物質として選択することができる。
本スクリーニング方法において、ＡＢＰ１とＡＳＫ１との反応は、通常約３７℃で数時間程度行うことができる。
例えば、標識ＡＢＰ１を用いた結合アッセイにより上記のスクリーニング方法を実施するには、まず、ＡＳＫ１またはそれを産生する細胞をスクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりＡＳＫ１標品を調製する。バッファーは、ｐＨ約４〜１０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどの、ＡＢＰ１とＡＳＫ１との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０ＴＭ（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによるＡＢＰ１やＡＳＫ１の分解を抑える目的で、ＰＭＳＦ、ロイペプチン、バシトラシン、アプロチニン、Ｅ−６４（タンパク質研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。
一方、細胞が固定化細胞の場合、培養器に固定化させたまま、つまり細胞を生育させた状態で、あるいはグルタルアルデヒドやパラホルムアルデヒドで固定した細胞を用いて、ＡＢＰ１とＡＳＫ１を結合させることができる。この場合、該緩衝液は培地やハンクス液などが用いられる。
そして、０.０１ｍｌ〜１０ｍｌの該ＡＳＫ１標品に、一定量（例えば、２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌの場合、約１００００ｃｐｍ〜１００００００ｃｐｍ）の標識したＡＢＰ１（例えば、〔１２５Ｉ〕で標識したＡＢＰ１）を添加し、同時に１０−４Ｍ〜１０−１０Ｍの被検物質を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識のＡＢＰ１を加えた反応チューブも用意する。反応は０℃〜５０℃、望ましくは４℃〜３７℃で２０分〜２４時間、望ましくは３０分〜３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過（ＡＳＫ１産生細胞を用いる場合）またはＢ／Ｆ分離（精製ＡＳＫ１を用いる場合）し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙または固相に残存する放射活性（例えば、〔１２５Ｉ〕の量）を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで測定する。拮抗する物質がない場合のカウント(Ｂ０)から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ０−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が、例えばカウント（Ｂ０−ＮＳＢ）の５０％以下になる被検物質をＡＳＫ１活性化調節物質として選択することができる。
本発明のスクリーニング用キットは、ＡＢＰ１、好ましくはさらにＡＳＫ１またはそれを産生する細胞を含有するものである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては次のものが挙げられるが、これに限定されるものではない。
〔スクリーニング用試薬〕
1) 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
2) ＡＳＫ１標品
HeLa細胞またはHEK293細胞を１２穴プレートに５×１０５個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ２、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
3) 標識したＡＢＰ１標品
ＡＢＰ１を〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３５Ｓ〕などで標識したもの。
4) ＡＢＰ１標準液
ＡＢＰ１を０.１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで０.１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存したもの。
〔測定法〕
1) １２穴組織培養用プレートにて培養したＡＳＫ１産生細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
2) １０−３〜１０−１０Ｍの被検物質溶液を５μｌ加えた後、５ｎＭの標識したＡＢＰ１を５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには被検物質のかわりに１０−４ＭのＡＢＰ１を５μｌ加えておく。
3) 反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞に結合した標識ＡＢＰ１を０．５ｍｌの０.２Ｎ ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
4) 液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding（ＰＭＢ）を次式（数１）で求める。なお、〔１２５Ｉ〕で標識されている場合は、液体シンチレーターと混合することなしに直接ガンマーカウンターで測定できる。
〔数１〕
ＰＭＢ＝１００×（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ０−ＮＳＢ）
ＰＭＢ：Percent Maximum Binding
Ｂ ：検体を加えた時の結合量
ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量）
Ｂ０ ：最大結合量
上記（ｃ）のスクリーニング法において用いられる細胞としては、（１）ＡＳＫ１またはＮ末端側活性化制御ドメインを含むその部分ペプチドと転写因子（例えば、GAL4、VP16等）のＤＮＡ結合ドメインもしくは転写活性化ドメインのいずれか一方との融合蛋白質をコードするＤＮＡ、（２）ＡＢＰ１または本発明の活性化ペプチドと転写因子の他方のドメインとの融合蛋白質をコードするＤＮＡ、および（３）該転写因子により活性化されるプロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含有する細胞、好ましくは酵母細胞、哺乳動物細胞等が挙げられる。レポーター遺伝子としては、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子、ペルオキシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、グリーンフルオレセントプロテイン（ＧＦＰ）遺伝子などが挙げられる。
本スクリーニング方法において、上記の細胞を、使用する宿主細胞に適合した培養条件下で数時間〜１日程度培養した後、細胞抽出液または上清液を得て、常法によりレポーター遺伝子の検出を行う。
上記のスクリーニング方法において、レポーター遺伝子の発現を阻害する化合物をＡＳＫ１活性化調節物質として選択することができる。
（Ｂ）ＡＳＫ１の活性化を指標とするスクリーニング方法
ＡＢＰ１とＡＳＫ１との相互作用に及ぼす被検物質の効果をＡＳＫ１の活性化を測定することにより調べれば、該物質がＡＳＫ１の活性化を阻害するか、あるいは促進するかを直接評価することができる。すなわち、本発明は、ＡＳＫ１またはＮ末端側活性化制御ドメインおよびキナーゼドメインを含むその部分ペプチドを産生する細胞における該蛋白質もしくは該ペプチドの活性化を、（１）ＡＢＰ１または本発明の活性化ペプチドの存在下と、（２）ＡＢＰ１または本発明の活性化ペプチドおよび被検物質の存在下とで、測定・比較することによるＡＳＫ１活性化調節物質のスクリーニング方法を提供する。
本スクリーニング法において、ＡＳＫ１またはＮ末端側活性化制御ドメインおよびキナーゼドメインを含むその部分ペプチドを産生する細胞（以下、単にＡＳＫ１産生細胞という場合がある）としては、ＡＳＫ１を内因的に産生する細胞（例、HeLa細胞、HEK293細胞等）や、ＡＳＫ１またはＮ末端側活性化制御ドメインおよびキナーゼドメインを含むその部分ペプチドをコードするＤＮＡを導入された動物細胞などが挙げられる。Ｎ末端側活性化制御ドメインおよびキナーゼドメインを含むＡＳＫ１の部分ペプチドとしては、前記特許文献１（特開平１０−９３）の配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号１〜９３６で示されるアミノ酸配列の全部もしくは一部（以下、包括的に「ＡＳＫ１−ＮＫ配列」と称する）と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つＡＢＰ１と結合することにより活性化され得るペプチドが挙げられる。ここで「実質的に同一のアミノ酸配列」としては、上記ヒトＡＳＫ１−ＮＫ配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
また、上記部分ペプチドには、例えば、1) ＡＳＫ１−ＮＫ配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、2) ＡＳＫ１−ＮＫ配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、3) ＡＳＫ１−ＮＫ配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、4) ＡＳＫ１−ＮＫ配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または5) それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する変異ペプチドも含まれる。
ＡＢＰ１または本発明の活性化ペプチド（以下、単にＡＢＰ１という場合がある）は外部から細胞に添加してもよいし、あるいはＡＳＫ１産生細胞自体が産生するものであってもよい。後者の場合、ＡＢＰ１は内因的に産生されてもよいし、ＡＳＫ１産生細胞を宿主として上記ＡＢＰ１の発現方法に従って遺伝子工学的に作製された形質転換体であってもよい。
被検物質としては、例えば蛋白質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これらの物質は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。
ＡＳＫ１の活性化は、ＡＳＫ１の自己リン酸化、ＡＳＫ１カスケードの下流に位置するキナーゼ（例えば、MKK4/7、MKK3/6、JNK、p38等）やＡＳＫ１の基質となり得る他の蛋白質もしくは合成ペプチドのリン酸化、細胞死誘導率などを測定することにより評価することができる。
具体的には、まずＡＳＫ１産生細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行うにあたっては、前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、被検物質（細胞がＡＢＰ１を産生しない場合はさらにＡＢＰ１）などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物や現象をそれぞれの方法に従って定量する。
ＡＳＫ１や他の蛋白質もしくはペプチドのリン酸化の検出は、リン酸化蛋白質（ペプチド）特異的抗体を用いたウェスタンブロット解析や、基質蛋白質（ペプチド）における［32Ｐ］標識ＡＴＰの取込みをゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーにより検出する等の方法により行うことができる。
細胞死アッセイは、ＡＢＰ１の発現を確認できる系（例えば、ＡＢＰ１と蛍光蛋白質との融合蛋白質をコードするＤＮＡを導入した細胞、あるいは選択マーカー遺伝子をさらに含むＡＢＰ１発現ベクターを導入した細胞）において、プレートからの剥離や形態学的観察（例、膜のブレッビング、断片化等）などを指標として、全ＡＢＰ１発現細胞中の死細胞の割合を算出することにより行うことができる。
上記のスクリーニング方法において、ＡＳＫ１産生細胞に被検物質を添加した際にＡＳＫ１が活性化された場合、該物質をＡＳＫ１活性化促進物質として選択することができる。一方、被検物質を添加した際にＡＳＫ１が不活性化された場合、該物質をＡＳＫ１活性化阻害物質として選択することができる。
（Ｃ）ＡＢＰ１の発現量を変化させる物質のスクリーニング方法
本発明のセンスおよびアンチセンスポリヌクレオチドをプローブとして用いることにより、あるいは本発明の抗体を用いることにより、ＡＢＰ１の発現量を変化させる物質をスクリーニングすることができる。
すなわち、本発明は、例えば、（ｉ）非ヒト哺乳動物のa）血液、b）特定の臓器、c）臓器から単離した組織もしくは細胞、または（ii）形質転換体等に含まれるＡＢＰ１のｍＲＮＡ量またはＡＢＰ１蛋白質量を測定することによる、ＡＢＰ１の発現量を変化させる物質、従ってＡＳＫ１活性化調節物質のスクリーニング方法を提供する。
例えば、ＡＢＰ１のｍＲＮＡ量または蛋白質量の測定は具体的には以下のようにして行う。
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して、薬剤（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、Ｆａｓ、抗癌剤など）あるいは物理化学的ストレス（例えば、ＵＶ、活性酸素、虚血など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓など）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。
得られた細胞に含まれるＡＢＰ１のｍＲＮＡは、例えば、通常の方法により細胞等からｍＲＮＡを抽出し、例えば、ＲＴ−ＰＣＲなどの手法を用いることにより定量することができ、あるいは自体公知のノザンブロット解析により定量することもできる。一方、ＡＢＰ１蛋白質量は、通常の方法により細胞等から蛋白質を抽出し、例えば、標識した抗ＡＢＰ１抗体を用いたウェスタンブロット解析により定量することができる。
（ii）ＡＢＰ１または本発明の活性化ペプチドを発現する形質転換体を上記の方法に従って作製し、該形質転換体に含まれるＡＢＰ１または本発明の活性化ペプチド、あるいはそのｍＲＮＡを同様にして定量、解析することができる。
ＡＢＰ１の発現量を変化させる化合物のスクリーニングは、
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、薬剤あるいは物理化学的ストレスなどを与える一定時間前（３０分前〜２４時間前、好ましくは３０分前〜１２時間前、より好ましくは１時間前〜６時間前）もしくは一定時間後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、または薬剤あるいは物理化学的ストレスと同時に被検物質を投与し、投与後一定時間経過後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、細胞に含まれるＡＢＰ１のｍＲＮＡ量、または蛋白質量を定量、解析することにより行うことができ、
（ii）形質転換体を常法に従い培養する際に被検物質を培地中に混合させ、一定時間培養後（１日後〜７日後、好ましくは１日後〜３日後、より好ましくは２日後〜３日後）、該形質転換体に含まれるＡＢＰ１または本発明の活性化ペプチドのｍＲＮＡ量または蛋白質量を定量、解析することにより行うことができる。
被検物質としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら物質は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。
上記のスクリーニング法において、ＡＢＰ１の発現量を増加させる物質をＡＳＫ１活性化促進物質、ＡＢＰ１の発現量を減少させる物質をＡＳＫ１活性化阻害物質として選択することができる。
上記（Ａ）〜（Ｃ）のスクリーニング方法を用いて得られるＡＢＰ１またはその塩の発現または活性を増大させる物質（＝ＡＳＫ１活性化促進物質（以下、本明細書においては同義で用いる））は、ＡＳＫ１カスケードによるシグナル伝達を活性化して細胞にアポトーシスを誘導し得る。従って、細胞にＡＳＫ１活性化促進物質を添加することにより、該細胞にアポトーシスを誘導することができ、例えば、アポトーシス研究用の試薬として用いることができる。
ＡＳＫ１活性化促進物質をアポトーシス誘発剤として使用する場合、水もしくは適当な緩衝液（例、リン酸緩衝液、ＰＢＳ、トリス塩酸緩衝液など）中に適当な濃度となるように溶解することにより調製することができる。また、必要に応じて、通常使用される保存剤、安定剤、還元剤、等張化剤等を配合させてもよい。
上記のように、ＡＳＫ１活性化促進物質は細胞にアポトーシスを誘導する機能を有するので、ＡＢＰ１の減少もしくは他の要因により不要な細胞や異常細胞のアポトーシスによる除去が期待できない患者がいる場合に、ＡＳＫ１活性化促進物質を該患者に投与してＡＳＫ１を活性化することによって、患者の体内における異常細胞や不要となった細胞にＡＳＫ１カスケードを介するアポトーシスを誘導することができる。
したがって、ＡＳＫ１活性化促進物質を、アポトーシスを誘発することが予防・治療上有効な疾患、例えば、癌（例、白血病、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、メラノーマ、骨髄腫、骨肉腫、脳腫瘍等）、自己免疫疾患（例、全身性エリテマトーデス、強皮症、慢性関節リウマチ、シェーグレン症候群、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、乾癬、潰瘍性大腸炎、特発性血小板減少性紫斑病、クローン病、糸球体腎炎等）、ウイルス感染症（例、出血熱、Ｔ細胞白血病、カポジ肉腫、伝染性単核症、リンパ腫、上咽頭癌、子宮頚癌、皮膚癌、肝炎、肝癌等）、内分泌疾患（例、ホルモン過剰症、サイトカイン過剰症等）、血液疾患（例、血球増加症、Ｂ細胞リンパ腫、多血症等）、臓器過形成（例、半陰陽、停留睾丸、奇形腫、腎芽細胞癌、多発性嚢胞腎、心・大動脈奇形、合指症等）、血管形成術後再狭窄、癌切除術後の再発などの予防・治療剤として使用することができる。
ＡＳＫ１活性化阻害物質を上記予防・治療剤として使用する場合、前記したＡＢＰ１もしくは本発明の活性化ペプチドまたはその塩を含有する医薬と同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の温血動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー、トリなど）に対して投与することができる。
ＡＳＫ１活性化促進物質の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
一方、上記（Ａ）〜（Ｃ）のスクリーニング方法を用いて得られるＡＢＰ１またはその塩の発現または活性を減少させる物質（＝ＡＳＫ１活性化阻害物質（以下、本明細書においては同義で用いる））は、ＡＳＫ１カスケードによるシグナル伝達を阻害して細胞のアポトーシスや炎症性サイトカインの産生を抑制し得る。従って、細胞にＡＳＫ１活性化阻害物質を添加することにより、該細胞のアポトーシス／炎症性サイトカイン産生を抑制することができ、例えば、アポトーシス、炎症反応などの研究用試薬として用いることができる。
ＡＳＫ１活性化阻害物質をアポトーシスまたは炎症性サイトカイン産生抑制剤として使用する場合、水もしくは適当な緩衝液（例、リン酸緩衝液、ＰＢＳ、トリス塩酸緩衝液など）中に適当な濃度となるように溶解することにより調製することができる。また、必要に応じて、通常使用される保存剤、安定剤、還元剤、等張化剤等を配合させてもよい。
上記のように、ＡＳＫ１活性化阻害物質は細胞のアポトーシスや炎症性サイトカインの産生を抑制する機能を有するので、ＡＢＰ１の増加等により生体にとって必要な細胞までがアポトーシスによって失われている、あるいは炎症性疾患を発病している患者がいる場合に、ＡＳＫ１活性化阻害物質を該患者に投与してＡＳＫ１の活性化を阻害することにより、本来必要な細胞のアポトーシス死や炎症反応を抑制することができる。
したがって、ＡＳＫ１活性化阻害物質を、アポトーシスまたは炎症を抑制することが予防・治療上有効な疾患、例えば、ウイルス感染症（例、ＡＩＤＳ、インフルエンザ、不明熱等）、内分泌疾患（例、ホルモン欠乏症、サイトカイン欠乏症等）、血液疾患（例、血球減少症、腎性貧血等）、臓器形成不全（例、甲状腺萎縮、口蓋裂等）、移植臓器拒絶、移植片対宿主病、免疫不全、神経変性疾患（例、ポリグルタミン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、小脳変性症等）、虚血性心疾患（例、狭心症、心筋梗塞等）、放射線障害、紫外線障害（例、日焼け等）中毒性疾患（例、重金属による腎尿細管細胞傷害、アルコールによる肝細胞傷害等）、栄養障害（例、ビタミン、微量元素欠乏による胸腺の萎縮等）、炎症性疾患（例、急性膵炎、関節炎、歯周病、大腸炎等）、虚血性神経障害、糖尿病性神経障害、血管系疾患（例、動脈硬化等）、呼吸器系疾患（例、間質性肺炎、肺繊維症等）、軟骨疾患（例、変形性関節炎等）などの疾患の予防・治療剤として用いることができる。
ＡＳＫ１活性化阻害物質を上記予防・治療剤として使用する場合、前記したＡＢＰ１もしくは本発明の活性化ペプチドまたはその塩を含有する医薬と同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の温血動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー、トリなど）に対して投与することができる。
ＡＳＫ１活性化阻害物質の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、ポリグルタミン病患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、ポリグルタミン病患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
（１０）ＡＢＰ１をコードするＤＮＡを導入した動物およびその用途
本発明は、ＡＢＰ１をコードする外来性のＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物の新規用途を提供する。
本発明で使用される非ヒト哺乳動物は、
〔１〕本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
〔２〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔１〕記載の動物、
〔３〕ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第〔２〕記載の動物である。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病態動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ１系統，ＢＤＦ１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有しているＡＢＰ１をコードするＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出されたＡＢＰ１をコードするＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元のＡＢＰ１をコードするＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常なＡＢＰ１を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常なＡＢＰ１の機能を抑制する異常ＡＢＰ１を発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明の外来性ＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、ヒトＡＢＰ１をコードするＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高いＡＢＰ１のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、ヒトＡＢＰ１をコードするＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによってＡＢＰ１をコードするＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。
ＡＢＰ１の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行うプロモーターとしては、例えば、1) ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、2) 各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ペプチド鎖延長因子1α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするｍＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネターなどが用いられる。
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５'上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３'下流 に連結することも目的により可能である。
正常なＡＢＰ１の翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞等由来のＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なＡＢＰ１の翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
本発明の外来性正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的にＡＢＰ１の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、ＡＢＰ１の機能亢進症や、ＡＢＰ１が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行うことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、ＡＢＰ１の増加症状を有することから、ＡＢＰ１の機能亢進に関連する疾患、例えば、ウイルス感染症（例、ＡＩＤＳ、インフルエンザ、不明熱等）、内分泌疾患（例、ホルモン欠乏症、サイトカイン欠乏症等）、血液疾患（例、血球減少症、腎性貧血等）、臓器形成不全（例、甲状腺萎縮、口蓋裂等）、移植臓器拒絶、移植片対宿主病、免疫不全、神経変性疾患（例、ポリグルタミン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、小脳変性症等）、虚血性心疾患（例、狭心症、心筋梗塞等）、放射線障害、紫外線障害（例、日焼け等）中毒性疾患（例、重金属による腎尿細管細胞傷害、アルコールによる肝細胞傷害等）、栄養障害（例、ビタミン、微量元素欠乏による胸腺の萎縮等）、炎症性疾患（例、急性膵炎、関節炎、歯周病、大腸炎等）、虚血性神経障害、糖尿病性神経障害、血管系疾患（例、動脈硬化等）、呼吸器系疾患（例、間質性肺炎、肺繊維症等）、軟骨疾患（例、変形性関節炎等）などの疾患に対する予防・治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原料として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性異常ＤＮＡを有することを意味する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的にＡＢＰ１の機能不活性型不応症（例えば、癌（例、白血病、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、メラノーマ、骨髄腫、骨肉腫、脳腫瘍等）、自己免疫疾患（例、全身性エリテマトーデス、強皮症、慢性関節リウマチ、シェーグレン症候群、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、乾癬、潰瘍性大腸炎、特発性血小板減少性紫斑病、クローン病、糸球体腎炎等）、ウイルス感染症（例、出血熱、Ｔ細胞白血病、カポジ肉腫、伝染性単核症、リンパ腫、上咽頭癌、子宮頚癌、皮膚癌、肝炎、肝癌等）、内分泌疾患（例、ホルモン過剰症、サイトカイン過剰症等）、血液疾患（例、血球増加症、Ｂ細胞リンパ腫、多血症等）、臓器過形成（例、半陰陽、停留睾丸、奇形腫、腎芽細胞癌、多発性嚢胞腎、心・大動脈奇形、合指症等）など）となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、ＡＢＰ１の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、ＡＢＰ１の機能不活性型不応症における異常ＡＢＰ１による正常ＡＢＰ１の機能阻害（dominant negative作用）を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、異常ＡＢＰ１の増加症状を有することから、ＡＢＰ１の機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、ＡＢＰ１の機能不活性型不応症を含む、ＡＢＰ１に関連する疾患の予防・治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患予防・治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、ＡＢＰ１が関連する疾患の遺伝子治療法を検討、開発することが可能である。
（１１）ノックアウト動物
本発明で用いられるＡＢＰ１ ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物胚幹細胞およびＡＢＰ１ ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、
〔１〕ＡＢＰ１をコードするＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
〔２〕該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第〔１〕項記載の胚幹細胞、
〔３〕ネオマイシン耐性である第〔１〕項記載の胚幹細胞、
〔４〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔１〕項記載の胚幹細胞、
〔５〕ゲッ歯動物がマウスである第〔４〕項記載の胚幹細胞、
〔６〕ＡＢＰ１をコードするＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
〔７〕該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子がＡＢＰ１をコードするＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる第〔６〕項記載の非ヒト哺乳動物、
〔８〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔６〕項記載の非ヒト哺乳動物、
〔９〕ゲッ歯動物がマウスである第〔８〕項記載の非ヒト哺乳動物である。
ＡＢＰ１をコードするＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有するＡＢＰ１ ＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、該ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしているＡＢＰ１の活性を実質的に喪失させることにより、該ＤＮＡが実質的にＡＢＰ１の発現能を有しない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
ＡＢＰ１をコードするＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
ＡＢＰ１をコードするＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有するＡＢＰ１ ＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、polyＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なｍＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞についてＡＢＰ１ ＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用したＡＢＰ１ ＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等によりＡＢＰ１をコードするＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知のEvansとKaufmanの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３.５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行うことが望ましい。
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０６個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１−１００００U/ml）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１−０.５％トリプシン／０.１−５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１〜３日毎に行うが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー（Nature）第292巻、154頁、1981年；G. R. Martin プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschman ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおけるＡＢＰ１の細胞生物学的検討において有用である。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターのＡＢＰ１ ＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上のＡＢＰ１ ＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、ＡＢＰ１をコードするＤＮＡをノックアウトさせることができる。
ＡＢＰ１をコードするＤＮＡがノックアウトされた細胞は、ＡＢＰ１ ＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来のＡＢＰ１ ＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、ＡＢＰ１をコードするＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常なＡＢＰ１遺伝子座をもつ細胞と人為的に変異したＡＢＰ１ ＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異したＡＢＰ１ ＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えたＡＢＰ１ ＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、ＡＢＰ１のヘテロ発現不全個体であり、ＡＢＰ１のヘテロ発現不全個体同士を交配し、それらの産仔からＡＢＰ１のホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えによりＡＢＰ１ ＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにしてＡＢＰ１ ＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行うことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
ＡＢＰ１ ＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、ＡＢＰ１により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、ＡＢＰ１の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
（１１ａ）ＡＢＰ１ ＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、ＡＢＰ１ ＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病、例えば、癌（例、白血病、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、メラノーマ、骨髄腫、骨肉腫、脳腫瘍等）、自己免疫疾患（例、全身性エリテマトーデス、強皮症、慢性関節リウマチ、シェーグレン症候群、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、乾癬、潰瘍性大腸炎、特発性血小板減少性紫斑病、クローン病、糸球体腎炎等）、炎症（例、関節炎、腎炎等）、ウイルス感染症（例、出血熱、Ｔ細胞白血病、カポジ肉腫、伝染性単核症、リンパ腫、上咽頭癌、子宮頚癌、皮膚癌、肝炎、肝癌等）、内分泌疾患（例、ホルモン過剰症、サイトカイン過剰症等）、血液疾患（例、血球増加症、Ｂ細胞リンパ腫、多血症等）、臓器過形成（例、半陰陽、停留睾丸、奇形腫、腎芽細胞癌、多発性嚢胞腎、心・大動脈奇形、合指症等）などに対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、ＡＢＰ１ ＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
該スクリーニング方法において、試験動物（例えば、担癌動物など）に試験化合物を投与した場合、例えば、該試験動物の症状が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上改善した場合、該試験化合物を上記の疾患に対して治療・予防効果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、ＡＢＰ１の欠損や損傷などによって引き起こされる上記疾患に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記したＡＢＰ１または本発明の活性化ペプチドを含有する医薬と同様にして製造し、使用することができる。
（１１ｂ）ＡＢＰ１ ＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物をスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とするＡＢＰ１ ＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、ＡＢＰ１ ＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子がＡＢＰ１ ＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
ＡＢＰ１ ＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子がＡＢＰ１ ＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、ＡＢＰ１をコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、ＡＢＰ１の発現する組織で、ＡＢＰ１の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便にＡＢＰ１の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、ＡＢＰ１欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、ＡＢＰ１ ＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
ＡＢＰ１ ＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、ＡＢＰ１の発現を促進し、ＡＢＰ１の機能を促進することができるので、例えば、ＡＢＰ１の機能不全に関連する疾患の予防・治療剤などの医薬として使用することができる。具体的には、該化合物は、例えば、癌（例、白血病、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、メラノーマ、骨髄腫、骨肉腫、脳腫瘍等）、自己免疫疾患（例、全身性エリテマトーデス、強皮症、慢性関節リウマチ、シェーグレン症候群、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、乾癬、潰瘍性大腸炎、特発性血小板減少性紫斑病、クローン病、糸球体腎炎等）、ウイルス感染症（例、出血熱、Ｔ細胞白血病、カポジ肉腫、伝染性単核症、リンパ腫、上咽頭癌、子宮頚癌、皮膚癌、肝炎、肝癌等）、内分泌疾患（例、ホルモン過剰症、サイトカイン過剰症等）、血液疾患（例、血球増加症、Ｂ細胞リンパ腫、多血症等）、臓器過形成（例、半陰陽、停留睾丸、奇形腫、腎芽細胞癌、多発性嚢胞腎、心・大動脈奇形、合指症等）、血管形成術後再狭窄、癌切除術後の再発などの予防・治療剤などの低毒性で安全な医薬として使用することができる。
一方、ＡＢＰ１ ＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、ＡＢＰ１の発現を阻害し、ＡＢＰ１の機能を阻害することができるので、例えば、ＡＢＰ１の発現過多に関連する疾患などの予防・治療剤などの医薬として有用である。具体的には、該化合物は、例えば、ウイルス感染症（例、ＡＩＤＳ、インフルエンザ、不明熱等）、内分泌疾患（例、ホルモン欠乏症、サイトカイン欠乏症等）、血液疾患（例、血球減少症、腎性貧血等）、臓器形成不全（例、甲状腺萎縮、口蓋裂等）、移植臓器拒絶、移植片対宿主病、免疫不全、神経変性疾患（例、ポリグルタミン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、小脳変性症等）、虚血性心疾患（例、狭心症、心筋梗塞等）、放射線障害、紫外線障害（例、日焼け等）中毒性疾患（例、重金属による腎尿細管細胞傷害、アルコールによる肝細胞傷害等）、栄養障害（例、ビタミン、微量元素欠乏による胸腺の萎縮等）、炎症性疾患（例、急性膵炎、関節炎、歯周病、大腸炎等）、虚血性神経障害、糖尿病性神経障害、血管系疾患（例、動脈硬化等）、呼吸器系疾患（例、間質性肺炎、肺繊維症等）、軟骨疾患（例、変形性関節炎等）などの疾患の予防・治療剤などの低毒性で安全な医薬として使用することができる。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記したＡＢＰ１または本発明の活性化ペプチドを含有する医薬と同様にして製造し、使用することができる。
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、ＡＢＰ１ ＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、ＡＢＰ１ ＤＮＡの発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、ＡＢＰ１遺伝子のプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々の蛋白質をコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作製すれば、組織および／または時期特異的に該蛋白質を合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、ＡＢＰ１そのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ ：アデニン
Ｔ ：チミン
Ｇ ：グアニン
Ｃ ：シトシン
ＲＮＡ ：リボ核酸
ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇｌｙ ：グリシン
Ａｌａ ：アラニン
Ｖａｌ ：バリン
Ｌｅｕ ：ロイシン
Ｉｌｅ ：イソロイシン
Ｓｅｒ ：セリン
Ｔｈｒ ：スレオニン
Ｃｙｓ ：システイン
Ｍｅｔ ：メチオニン
Ｇｌｕ ：グルタミン酸
Ａｓｐ ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ ：リジン
Ａｒｇ ：アルギニン
Ｈｉｓ ：ヒスチジン
Ｐｈｅ ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ ：チロシン
Ｔｒｐ ：トリプトファン
Ｐｒｏ ：プロリン
Ａｓｎ ：アスパラギン
Ｇｌｎ ：グルタミン
ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸
＊ ：終止コドンに対応する
Ｍｅ ：メチル基
Ｅｔ ：エチル基
Ｂｕ ：ブチル基
Ｐｈ ：フェニル基
ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記
する。
Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ ：ホルミル
Ｂｚｌ ：ベンジル
Ｃl2Ｂｚｌ ：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル
Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＮＰ ：ジニトロフェノール
Ｔｒｔ ：トリチル
Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−
１,２,３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド
ＤＣＣ ：Ｎ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド
本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
［配列番号１］
ヒトＡＢＰ１ ｃＤＮＡのアミノ酸コード領域の塩基配列を示す。
［配列番号２］
ヒトＡＢＰ１のアミノ酸配列を示す。
［配列番号３］
マウスＡＢＰ１ ｃＤＮＡのアミノ酸コード領域の塩基配列を示す。
［配列番号４］
マウスＡＢＰ１のアミノ酸配列を示す。
［配列番号５］
抗ＡＢＰ１抗体（ＥＬＡ抗体）作製用の抗原として用いたペプチドのアミノ酸配列を示す。
［配列番号６］
抗ＡＢＰ１抗体（ＬＶＲ抗体）作製用の抗原として用いたペプチドのアミノ酸配列を示す。
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲はそれらによって何ら限定されるものではない。
ＡＢＰ１ ｃＤＮＡのクローニング
ＡＳＫ１結合タンパク質を同定するために、baitとしてヒトＡＳＫ１のキナーゼドメイン内のＡＴＰ結合部位（７０９位）のリシン（Ｋ）をアルギニン（Ｒ）に置換したASK1-KRを用い、ヒト胎児脳由来の発現ライブラリーをpreyとして、Brentのシステム［Zervosら，セル（Cell），第72巻，p.223-232，1993；Gyurisら，セル（Cell），第75巻，p.791-803，1993］を用いた酵母two-hybrid法にてスクリーニングした。その結果、約１２００個の陽性クローンが得られた。そのうちの１つは、得られた塩基配列に基づいてデータベース検索を行うと、“ＰＧＲ１”と命名された遺伝子の蛋白質コード領域の一部（アミノ酸にすると３５〜１２７位に相当する部分）であった。この遺伝子がコードしている蛋白質は１２７アミノ酸からなるが、データベース上の情報は遺伝子の構造に関するもののみで、機能に関する報告はなかった。そこでこの遺伝子の蛋白質をコードしているｃＤＮＡ全長をＰＣＲ法によりクローニングした。この蛋白質はＡＳＫ１結合蛋白質として同定されたことから、ASK1 binding protein 1（ＡＢＰ１）と命名した。ホモロジー検索により、ＡＢＰ１にはマウスなどの哺乳類に類似分子が存在することが判明したが、ハエや線虫などには高い相同性を持つ分子は見いだせなかった。また、モチーフ検索やドメイン検索を行っても、既存のモチーフ、機能ドメインなどは存在しなかった。図１にヒトとマウスのＡＢＰ１アミノ酸配列のアラインメントを示す。
ＡＢＰ１ ｍＲＮＡの発現分布
Multiple Tissue Northern Blot（CLONTECH）のMouse（#7762-1）およびMouse Embryo（#7763-1）を使用し、ヒトＡＢＰ１ ｃＤＮＡの全長をプローブとして、上記製品の使用書に従ってノザンブロットを行った。その結果、ＡＢＰ１のｍＲＮＡの長さは約１．７ｋｂであり、組織全体にユビキタスに発現していた（図２Ａ）。また、マウス胎児ブロットでもＡＢＰ１のｍＲＮＡは胎生７日という比較的早期から発現が認められ、胎生経過中に大きな変化は見られなかった（図２Ｂ）。
種々の動物細胞におけるＡＢＰ１蛋白質の産生
次に、ＡＢＰ１に対するウサギのポリクローナル抗体を作製した。ＡＢＰ１ ｃＤＮＡの塩基配列から得られたアミノ酸配列情報をもとに、ＡＢＰ１特異的ペプチド（配列番号５および配列番号６）を抗原とするペプチド抗体を２種類作り、それぞれをＥＬＡ抗体、ＬＶＲ抗体と命名した。抗体はどちらも抗原ペプチドによるアフィニティーを利用して精製したものを使用した。
HeLa細胞とHEK293細胞は、高濃度グルコース（４．５ｍｇ／ｍｌ）を含むダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；SIGMA）を培養液とし、５％ＣＯ２存在下に培養した。培養液には１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）と１００単位／ｍｌペニシリンを添加した。ブタ大動脈内皮（ＰＡＥ）細胞培養はＦ１２培養液（Invitrogen）に１０％ＦＢＳ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００単位／ｍｌペニシリンを添加して培養した。
各細胞は溶解バッファー［１５０ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＥＤＴＡ，１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１％ デオキシコレート，１．５％ アプロチニン，１ｍＭ ＰＭＳＦ］を用いて溶解し、溶解液を遠心して上清をとり、ＳＤＳサンプルバッファー［１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８），０．０１％ ブロモフェノールブルー，３６％ グリセロール，４％ ＳＤＳ］を添加してＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。ゲルから蛋白質をＰＶＤＦ膜に転写し、５％ スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ［１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（ｐＨ８．０），０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０］で室温、３時間のブロッキングを行った後に、各抗体と反応させた。検出はECL system（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて行った。
HEK293細胞の培養細胞抽出液をＥＬＡ抗体およびＬＶＲ抗体を用いてイムノブロット解析すると、両抗体で同定されるバンドが約１７ｋＤａに認められた。このバンドの検出位置は２つの抗体で完全に一致していた。また、HEK293細胞にタグの付加されていないＡＢＰ１を発現するプラスミド［ＰＣＲにて得たＡＢＰ１ ｃＤＮＡをpcDNA3（Invitrogen, Inc.）にサブクローニングして作製］を遺伝子導入して［FuGENE6（Roche Diagnostics K.K）を使用書の通りに用いて行った］ＡＢＰ１蛋白質を過剰発現させると、プラスミド量依存的に検出強度が増加した（図３）。一次抗体処理の際に抗原ペプチドを添加することによるペプチドブロックを行うとこのバンドは消失した。
このことから、これらの抗体はＡＢＰ１を認識しており、内在性のＡＢＰ１蛋白質を検出することができた。HeLa細胞やPAE細胞においても同様の結果が得られた。
ＡＢＰ１とＡＳＫ１との細胞内相互作用
Ｆｌａｇ−ＡＢＰ１およびＭｙｃ−ＡＳＫ１の２つの融合蛋白質をHEK293細胞で共発現させた。細胞は溶解バッファー（上述）を用いて溶解し、溶解液を遠心後上清をとり、抗Ｆｌａｇ抗体（Clone M2；SIGMA）と反応後、Protein A-sepharose4B（Zymed Laboratories）を加えて３０分間インキュベーションし、溶解バッファーで３回洗浄してから、ＳＤＳサンプルバッファー（上述）を添加し、以下イムノブロッティング法と同様の手順で、両蛋白質の結合を確認した(図４Ａ)。抗体は、抗Ｆｌａｇ抗体（上述）、抗Ｍｙｃ抗体（Clone 9E10, Calbiochem）を用いた。この結合はＡＳＫ１の活性化因子であるＨ２Ｏ２処理により増強した。次に、ＣＦＰ−ＡＢＰ１およびＭｙｃ−ＡＳＫ１プラスミドを同じくHEK293細胞に共発現させ、抗Ｆｌａｇ抗体により免疫沈降させた場合にも、両者の結合が確認できた（図４Ｂ）。抗体は、抗Ｆｌａｇ抗体（上述）、抗ＧＦＰ抗体（Medical & Biological Laboratories CO.）を用いた。この結合もＨ２Ｏ２処理により増強した。このことから、哺乳類細胞内でもＡＢＰ１とＡＳＫ１が結合し、その結合はＨ２Ｏ２処理で増強することが判明した。
ＡＢＰ１に対するＡＳＫ１の結合部位の同定
図５Ａに示すＨＡタグ付きの各種ＡＳＫ１欠損変異体とＡＢＰ１との結合を、実施例３と同様にＦｌａｇ−ＡＢＰ１との共発現後に、抗Ｆｌａｇ抗体による免疫沈降法にて検索した。抗体は、抗ＨＡ抗体（Clone 3F10, Roche Diagnostics K.K）、抗Ｆｌａｇ抗体（Clone M2, SIGMA）を用いた。ＡＳＫ１の発現ベクターはSaitohら（上述）に記載されたものを使用した。その結果、ＡＢＰ１は、ＡＳＫ１−ＮＴ、ＡＳＫ１−ΔＣとは共沈したが、ＡＳＫ１−ΔＮ、ＡＳＫ１−Ｋとは共沈を示さなかった（図５Ｂ）。これにより、ＡＢＰ１はＡＳＫ１のＮ末端ドメインに結合することが判明した。
ＡＢＰ１による細胞死誘導
（１）ＡＢＰ１の細胞内局在や機能を調べるため、HeLa細胞に免疫沈降実験でも使用したＡＢＰ１のＮ末端にＣＦＰを融合させたタンパク質を発現するＣＦＰ−ＡＢＰ１プラスミド［ＰＣＲにて得たＡＢＰ１ ｃＤＮＡを、pECFP-C1（Clontech）にサブクローニングして作製］を遺伝子導入［FuGENE6（Roche Diagnostics K.K）を使用書の通りに用いて行った］により一過性に発現させて、ＣＦＰの蛍光を蛍光顕微鏡で経時的に観察した。蛍光顕微鏡下にＣＦＰの蛍光を示す細胞（５００個）のうち、細胞がプレートから剥がれたり、膜のブレッビング（blebbing）や断片化などの細胞死の形態を示すものの割合を計算した。ＣＦＰ陽性細胞につき計算した。
その結果、ＣＦＰ−ＡＢＰ１融合蛋白質による蛍光は、ＣＦＰ蛋白質のみを発現させた場合と同様に、細胞質と核の両方を含む細胞全体に存在していた。さらに観察を続けると、遺伝子導入後２４時間頃からＣＦＰ−ＡＢＰ１融合蛋白質を発現している細胞は、培養プレートから剥がれたり、膜のブレッビングを認めるなど細胞死の所見を次々と示すようになった（図６Ａ）。この細胞死を定量化すると、遺伝子導入後３６時間には、ＣＦＰ−ＡＢＰ１融合蛋白質を発現している細胞の約７０％にまで達した（図６Ｂ）。ＣＦＰ蛋白質を単独で発現させてもこのような現象はみられなかった。また、細胞内局在や細胞死誘導は、ＡＢＰ１のＣ末端にＣＦＰを融合させた蛋白質を発現させても同様であった。
このことから、ＡＢＰ１は細胞死誘導能を有する蛋白質であると考えられた。
（２）ＡＢＰ１による細胞死のメカニズムを明らかにする目的で、PAE細胞にテトラサイクリン依存的にＡＢＰ１を発現誘導できる細胞系（PAE-ABP1細胞）を確立した。PAE-ABP1細胞の作製は、Takedaらの方法（J. Biol. Chem., 275, 9805-9813, 2000）を一部改変して行った。Ｍｙｃタグを付加したＡＢＰ１ ｃＤＮＡ全長をpTet-Splice-neoベクターにサブクローニングし、これとpTet-tTAk-hygプラスミドを、Takedaらの方法とは異なりPAE細胞に同時に遺伝子導入し、５００ｎｇ／ｍｌ テトラサイクリン(Sigma)、４００単位／ｍｌ ハイグロマイシンＢ（Wako）、２４０ｍｇ／ｍｌ ネオマイシン（Geneticin, Life Technologies, Inc.）を添加した培養液中で培養して選択をかけ、生き残ってコロニー形成した細胞をPAE-ABP1細胞とした。細胞の維持培養は前述のPAE細胞維持用の培養液に、５００ｎｇ／ｍｌ テトラサイクリン、２００単位／ｍｌ ハイグロマイシンＢ、３０ｍｇ／ｍｌ ネオマイシンを添加して行った。
このPAE-ABP1細胞はテトラサイクリン存在下で培養するとＡＢＰ１を発現しないが、テトラサイクリン非存在下におくことで約６時間後にはイムノブロット解析でＭｙｃタグ付きのＡＢＰ１蛋白質の発現を確認できるようになり、以後安定してＡＢＰ１の発現が認められる。抗Ｍｙｃ抗体（Clone 9E10, Calbiochem）による免疫染色を行うと、ほとんどの細胞に安定してＭｙｃ−ＡＢＰ１の発現を認めた。この細胞をテトラサイクリン除去下で培養すると、HeLa細胞にＡＢＰ１蛋白質を一過性に発現させたときと同様に、ＡＢＰ１蛋白質の発現に伴って細胞死が誘導された（図７Ａ）。全細胞中の死細胞の割合（顕微鏡下に全細胞のうち細胞死の形態を示す細胞の割合を計算した。結果は３視野の平均値で示した）を定量すると、テトラサイクリン除去後４８時間で約５５％に達した（図７Ｂ）。この実験系においてもＡＢＰ１は細胞死を誘導することが確認できた。
（３）上記（１）および（２）のＡＢＰ１による細胞死の形態学的特徴である膜のブレッビングや細胞断片化などはアポトーシスの際にみられることが多い。そこで、PAE-ABP1細胞における細胞死がアポトーシスかどうかを、ＤＮＡ断片化の有無で検討した。
PAE-ABP1細胞（２×１０６個）を２００ｍｌの溶解バッファー［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００］で溶解した。溶解液を遠心して上清をとり、０．２ｍｇ／ｍｌのプロテインＫで４２℃，１時間処理した。次に、ＤＮＡをフェノール−クロロフォルム抽出法とエタノール沈殿法で精製し、これを０．２ｍｇ／ｍｌ リボヌクレアーゼＡを含むＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再度溶解して、２％アガロースゲルで電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色して泳動パターンを撮影した。
その結果、PAE-ABP1細胞は、顕微鏡で観察した際の細胞死出現の時期と一致して、ＡＢＰ１蛋白質発現に伴ってＤＮＡラダーを形成した（図８）。このことから、ＡＢＰ１による細胞死は、ＤＮＡ断片化を伴ういわゆるアポトーシスであることがわかった。このことは、PAE-ABP1細胞のＴＵＮＥＬ染色でも確認できた。
（４）アポトーシスの際のＤＮＡ断片化は、通常はカスパーゼの活性化に引き続いて起こる。そこで、PAE-ABP1細胞を用いてＡＢＰ１蛋白質発現誘導時におけるカスパーゼ−３活性測定を行った。測定は、CPP32/caspase-3 fluorometric protease assay kit（MBL）を用いて、合成蛍光ペプチドDEVD-7-amino-4-trifluoromethyl coumarine（ＡＦＣ）を基質として行った。遊離したＡＦＣは蛍光分光光度計を用いて、励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長５３０ｎｍにて蛍光強度を測定した。各サンプルについて２回測定した。結果はテトラサイクリンを除去していない時の値を１とする相対値で示した。
その結果、細胞死と前後してカスパーゼ−３活性は上昇していた（図９Ａ）。ＡＢＰ１による細胞死がカスパーゼ依存性であるかを検討するために、同じPAE-ABP1細胞を用いて、テトラサイクリン除去と同時にカスパーゼ阻害剤であるzVAD-fmk（Peptide Institute, Inc.）で処理すると、テトラサイクリン除去後１８時間という早い時間帯では細胞死がほとんど抑えられた（図９Ｂ）。これにより、ＡＢＰ１による細胞死はカスパーゼ依存性アポトーシスであると結論した。
ＡＢＰ１の細胞死誘導領域の同定
前述の通り、ＡＢＰ１は既存のアポトーシス関連因子の機能ドメインを持たない。そこで、ＡＢＰ１によるアポトーシスに必要なドメインを調べるため、図１０Ａに示す各種ＡＢＰ１欠損変異体とＣＦＰとの融合蛋白質を発現するプラスミドを作り、実施例６（１）と同様にHeLa細胞に発現させて細胞死の有無を検討した。ＡＢＰ１の発現ベクターは、PCRにて得たＡＢＰ１ ｃＤＮＡあるいはＡＢＰ１欠損変異体ｃＤＮＡAを、pECFP-C1（Clontech）にサブクローニングして作製した。各プラスミドの細胞への遺伝子導入は、FuGENE6（Roche Diagnostics K.K）を使用書の通りに用いて行った。
その結果、ΔＣ(1-72)は野生型よりむしろ強い細胞死誘導能を示すが、Ｎ末端を欠損させて行くにつれて、ΔＮ(34-127)、ΔＮ(65-127)と細胞死誘導能は低下していた（図１０Ｂ）。このことから、細胞死誘導能に関してはＡＢＰ１のＮ末端側が重要であると考えられた。
ＡＢＰ１のＡＳＫ１シグナル伝達系への影響
PAE-ABP1細胞を用いてＡＢＰ１発現誘導時のＪＮＫとｐ３８の活性化をそれぞれの抗リン酸化蛋白質抗体を用いて検討した。抗体は、抗リン酸化ＪＮＫ抗体（Cell Signaling）、抗リン酸化ｐ３８抗体（Cell Signaling）、抗リン酸化ＡＳＫ１抗体（Tobiumeら，EMBO Rep., 2, 222−228, 2001）を使用した。細胞は、実施例４と同様に溶解バッファー（上述）を用いて溶解し、溶解液を遠心後上清をとり、抗Ｍｙｃ抗体（Clone 9E10, Calbiochem）と反応後、Protein A-sepharose4B（Zymed Laboratories）を加えて３０分間インキュベーションし、溶解バッファーで３回洗浄してから、ＳＤＳサンプルバッファー（上述）を添加し、以下イムノブロッティング法と同様の手順で行った。
テトラサイクリン除去により、ＡＢＰ１蛋白質の発現に伴う細胞死が著明になるのに先んじて、１２時間後にはＪＮＫとｐ３８の活性化が認められ、これが以後も持続していた（図１１Ａ）。そこで、ＡＳＫ１の活性化を同じくPAE-ABP1細胞を用いて検討したところ、ＪＮＫとｐ３８と同様に、テトラサイクリン除去後１２時間でＡＳＫ１の活性化も認められた（図１１Ｂ）。このことから、ＡＢＰ１の過剰発現によりＡＳＫ１シグナル伝達系が活性化されると考えられた。
本発明のＡＢＰ１は、ＡＳＫ１カスケードを活性化して細胞にアポトーシスを誘導したり、炎症性サイトカインの産生を誘導する作用を有する。従って、本発明のＡＢＰ１、それをコードするポリヌクレオチド等は、細胞にアポトーシスを誘導することにより予防・治療効果が期待できる疾患の予防・治療剤として有用である。一方、本発明のＡＢＰ１抑制薬（例えば、抗ＡＢＰ１抗体、ＡＢＰ１アンチセンスポリヌクレオチド等）は、アポトーシスや炎症性サイトカインの産生を抑制するので、アポトーシスを抑制することにより予防・治療効果が期待できる疾患、あるいは炎症性疾患の予防・治療剤として有用である。さらに、本発明のＡＢＰ１およびＡＳＫ１を用いることにより、アポトーシスまたは炎症関連疾患の新規予防・治療薬のスクリーニング手段が提供される。
ヒト（上列）およびマウス（下列）のＡＢＰ１アミノ酸配列のアラインメントを示す図である。本発明の２種の抗体（ＥＬＡ抗体およびＬＶＲ抗体）作製のための抗原ペプチドとして用いた部分配列をボックスで示している。 マウス組織におけるＡＢＰ１ ｍＲＮＡ発現の組織分布（Ａ）およびマウス胎仔組織におけるＡＢＰ１ ｍＲＮＡ発現の経日変化（Ｂ）を示す図である。 HEK293細胞にタグの付加されていないＡＢＰ１を発現するプラスミドを遺伝子導入してＡＢＰ１蛋白質を過剰発現させた場合の、プラスミド量依存的な検出強度の増加を示す図である。遺伝子導入２４時間後に細胞を回収し、各細胞抽出液を２つに分けてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＥＬＡ抗体およびＬＶＲ抗体でイムノブロット（ＩＢ）を行った。ABP1-pcDNA3（−）は非形質転換HEK293細胞を示し、また、勾配は左から右へプラスミド量が増加していることを示す。 ＡＢＰ１とＡＳＫ１の結合試験の結果を示す図である。（Ａ）HEK293細胞にＦｌａｇ−ＡＢＰ１、Ｍｙｃ−ＡＳＫ１プラスミドを遺伝子導入し、２４時間後に細胞を回収して、抗Ｆｌａｇ抗体で免疫沈降後、抗Ｍｙｃ抗体でイムノブロット解析を行った。（Ｂ）HEK293細胞にＦｌａｇ−ＡＳＫ１、ＣＦＰ−ＡＢＰ１プラスミドを遺伝子導入し、２４時間後に細胞を回収して、抗Ｆｌａｇ抗体で免疫沈降後、抗ＧＦＰ抗体でイムノブロット解析を行った。尚、ＣＦＰはＧＦＰの変異体で、抗ＧＦＰ抗体により認識可能である。（Ａ）、（Ｂ）とも右側の２レーンでは、Ｈ２Ｏ２処理（０．５ｍＭ，１時間）も行った。下段は免疫沈降する前の各細胞溶解液の一部を別に泳動したものである。ＩＰは免疫沈降、ＩＢはイムノブロットを表す。 ＡＳＫ１欠損変異体の模式図（Ａ）およびＡＢＰ１とＡＳＫ１欠損変異体との結合試験の結果を示す図（Ｂ）である。（Ａ）ＡＳＫ１欠損変異体を含む各プラスミドには、それぞれＮ末端側にＨＡタグを付加してある。アミノ酸番号６７８〜９３６（斜線部）はキナーゼドメインを示す。（Ｂ）下段は免疫沈降する前の各細胞溶解液の一部を別に泳動したものである。ＩＰは免疫沈降、ＩＢはイムノブロットを表す。 HeLa細胞におけるＡＢＰ１による細胞死誘導を示す図である。（Ａ）HeLa細胞にＣＦＰまたはＣＦＰ−ＡＢＰ１プラスミドを遺伝子導入後３６時間の蛍光顕微鏡像（上段）および同じ視野の微分干渉像（下段）を示す。（Ｂ）遺伝子導入３６時間後における細胞死の割合（％）を示す。 PAE-ABP1細胞におけるＡＢＰ１による細胞死誘導を示す図である。（Ａ）PAE-ABP1細胞をテトラサイクリン（Ｔｅｔ）存在下（＋）、非存在下（−）に培養後３６時間の位相差顕微鏡像を示す。（Ｂ）テトラサイクリン存在下での培養（０ｈ）、テトラサイクリン除去２４時間および４８後における細胞死の割合（％）を示す。 PAE-ABP1細胞におけるＡＢＰ１による細胞死誘導（ＤＮＡ断片化）を示す図である。PAE-ABP1細胞をテトラサイクリン除去後、それぞれの時間でのＤＮＡ断片化をアガロースゲル電気泳動により調べた(上段)。両端は分子量マーカーを示し（Ｍ）、右端にはサイズを示してある。下段は各細胞におけるＭｙｃ−ＡＢＰ１蛋白質発現を抗Ｍｙｃ抗体によるイムノブロット解析で確認したものである。 ＡＢＰ１による細胞死のカスパーゼ依存性を示す図である。（Ａ）PAE-ABP1細胞をテトラサイクリン除去下に培養し、０，１２，２４，３６時間後にカスパーゼ−３活性を測定した。結果はテトラサイクリンを除去していない時の値を１とする相対値で示した。（Ｂ）PAE-ABP1細胞をテトラサイクリン除去するのと同時にｚＶＡＤ−ｆｍｋ（５０μＭ）で処理し、死細胞の割合（％）を定量化した。ただし細胞死のアッセイはテトラサイクリン除去後１８時間で行った。Ｔｅｔはテトラサイクリンを表す。 ＡＢＰ１欠損変異体による細胞死誘導を示す図である。（Ａ）ＡＢＰ１欠損変異体の模式図を示す。それぞれ野生型と同様にＮ末端側にＣＦＰタグを付加した。（Ｂ）ＡＢＰ１欠損変異体を導入した細胞における遺伝子導入３６時間後における細胞死の割合（％）を示す。 ＡＢＰ１によるＡＳＫ１、ＪＮＫ、ｐ３８の活性化を示す図である。（Ａ）PAE-ABP1細胞をテトラサイクリン除去して培養し、内在性ＪＮＫおよびｐ３８の活性化を各抗リン酸化蛋白質抗体によるイムノブロット解析にて行った。（Ｂ）PAE-ABP1細胞をテトラサイクリン除去下で培養し、内在性ＡＳＫ１の活性化を抗リン酸化蛋白質抗体によるイムノブロット解析にて検討した。ＩＢはイムノブロットを表す。
［配列番号５］
抗ＡＢＰ１抗体を作製するための抗原として機能すべく設計されたオリゴペプチド。
［配列番号６］
抗ＡＢＰ１抗体を作製するための抗原として機能すべく設計されたオリゴペプチド。

Claims (54)

  1. 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列の一部と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つＡＳＫ１を活性化し得るペプチドまたはその塩。
  2. 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列中約６０アミノ酸以上からなる部分アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する請求項１記載のペプチドまたはその塩。
  3. 部分アミノ酸配列がＮ末端側の配列である請求項２記載のペプチドまたはその塩。
  4. 請求項１記載のペプチドをコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
  5. 配列番号１または配列番号３に示される塩基配列の一部と同一もしくは実質的に同一の塩基配列を含有する請求項４記載のポリヌクレオチド。
  6. 請求項４記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
  7. 請求項６記載の組換えベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体。
  8. 請求項７記載の形質転換体を培養し、得られる培養物から請求項１記載のペプチドまたはその塩を採取することを特徴とする該ペプチドまたはその塩の製造方法。
  9. 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列の一部と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つＡＳＫ１を活性化しないか、もしくは不活性化し得るペプチドまたはその塩。
  10. 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列中約３５アミノ酸以下からなる部分アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する請求項９記載のペプチドまたはその塩。
  11. 部分アミノ酸配列がＮ末端側の配列である請求項１０記載のペプチドまたはその塩。
  12. 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは請求項１記載のペプチド、またはその塩を含有してなるＡＳＫ１活性化促進剤。
  13. アポトーシス誘発剤である請求項１２記載の剤。
  14. 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは請求項１記載のペプチド、またはその塩を含有してなる医薬。
  15. アポトーシスを誘発することが予防・治療上有効な疾患の予防・治療剤である請求項１４記載の医薬。
  16. 疾患が、癌、自己免疫疾患、ウイルス感染症、内分泌疾患、血液疾患、臓器過形成、血管形成術後再狭窄および癌切除術後の再発からなる群より選択される請求項１５記載の医薬。
  17. 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは請求項１記載のペプチドをコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを含有してなるＡＳＫ１活性化促進剤。
  18. アポトーシス誘発剤である請求項１７記載の剤。
  19. 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは請求項１記載のペプチドをコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
  20. アポトーシスを誘発することが予防・治療上有効な疾患の予防・治療剤である請求項１９記載の医薬。
  21. 疾患が、癌、自己免疫疾患、ウイルス感染症、内分泌疾患、血液疾患、臓器過形成、血管形成術後再狭窄および癌切除術後の再発からなる群より選択される請求項２０記載の医薬。
  22. 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする塩基配列もしくはその一部を含有するポリヌクレオチドを含有してなるアポトーシスまたは炎症関連疾患の診断薬。
  23. 疾患が、癌、自己免疫疾患、ウイルス感染症、内分泌疾患、血液疾患、臓器形成異常、血管形成術後再狭窄、癌切除術後の再発、移植臓器拒絶、移植片対宿主病、免疫不全、神経変性疾患、虚血性心疾患、放射線障害、紫外線障害、中毒性疾患、栄養障害、炎症性疾患、虚血性神経障害、糖尿病性神経障害、血管系疾患、呼吸器系疾患および軟骨疾患からなる群より選択される請求項２２記載の診断薬。
  24. 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする塩基配列と相補的な塩基配列もしくはその一部を含有するポリヌクレオチドを含有してなるＡＳＫ１活性化阻害剤。
  25. アポトーシスまたは炎症性サイトカイン産生抑制剤である請求項２４記載の剤。
  26. 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする塩基配列と相補的な塩基配列もしくはその一部を含有するポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
  27. アポトーシスまたは炎症を抑制することが予防・治療上有効な疾患の予防・治療剤である請求項２６記載の医薬。
  28. 疾患が、ウイルス感染症、内分泌疾患、血液疾患、臓器形成不全、移植臓器拒絶、移植片対宿主病、免疫不全、神経変性疾患、虚血性心疾患、放射線障害、紫外線障害、中毒性疾患、栄養障害、炎症性疾患、虚血性神経障害、糖尿病性神経障害、血管系疾患、呼吸器系疾患および軟骨疾患からなる群より選択される請求項２７記載の医薬。
  29. 配列番号５または配列番号６に示されるアミノ酸配列を特異的に認識し得ることを特徴とする、配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩に対する抗体。
  30. 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩に対する抗体を含有してなるアポトーシスまたは炎症関連疾患の診断薬。
  31. 疾患が、癌、自己免疫疾患、ウイルス感染症、内分泌疾患、血液疾患、臓器形成異常、血管形成術後再狭窄、癌切除術後の再発、移植臓器拒絶、移植片対宿主病、免疫不全、神経変性疾患、虚血性心疾患、放射線障害、紫外線障害、中毒性疾患、栄養障害、炎症性疾患、虚血性神経障害、糖尿病性神経障害、血管系疾患、呼吸器系疾患および軟骨疾患からなる群より選択される請求項３０記載の診断薬。
  32. 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩に対する抗体を含有してなるＡＳＫ１活性化阻害剤。
  33. アポトーシスまたは炎症性サイトカイン産生抑制剤である請求項３２記載の剤。
  34. 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩に対する抗体を含有してなる医薬。
  35. アポトーシスまたは炎症を抑制することが予防・治療上有効な疾患の予防・治療剤である請求項３４記載の医薬。
  36. 疾患が、ウイルス感染症、内分泌疾患、血液疾患、臓器形成不全、移植臓器拒絶、移植片対宿主病、免疫不全、神経変性疾患、虚血性心疾患、放射線障害、紫外線障害、中毒性疾患、栄養障害、炎症性疾患、虚血性神経障害、糖尿病性神経障害、血管系疾患、呼吸器系疾患および軟骨疾患からなる群より選択される請求項３５記載の医薬。
  37. 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは請求項１記載のペプチドまたはその塩あるいはそれを産生する細胞を用いることを特徴とする、ＡＳＫ１活性化調節物質のスクリーニング方法。
  38. ＡＳＫ１もしくはＮ末端活性化制御ドメインを含むその部分ペプチドまたはその塩あるいはそれを産生する細胞をさらに用いることを特徴とする、請求項３７記載の方法。
  39. 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは請求項１記載のペプチドまたはその塩と、ＡＳＫ１もしくはＮ末端活性化制御ドメインを含むその部分ペプチドまたはその塩との結合性を測定することを特徴とする、請求項３８記載の方法。
  40. 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは請求項１記載のペプチドまたはその塩あるいはそれを産生する細胞を含んでなる、ＡＳＫ１活性化調節物質のスクリーニング用キット。
  41. さらに、ＡＳＫ１もしくはＮ末端活性化制御ドメインを含むその部分ペプチドまたはその塩あるいはそれを産生する細胞を含んでなる、請求項４０記載のキット。
  42. ＡＳＫ１もしくはＮ末端活性化制御ドメインおよびキナーゼドメインを含むその部分ペプチドまたはその塩を産生する細胞におけるＡＳＫ１もしくは該部分ペプチドまたはその塩の活性化を、(1)配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは請求項１記載のペプチドまたはその塩の存在下と、(2)配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは請求項１記載のペプチドまたはその塩および被験物質の存在下で比較することを特徴とする、請求項３８記載の方法。
  43. (1)配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは請求項１記載のペプチドまたはその塩、および(2)ＡＳＫ１もしくはＮ末端活性化制御ドメインおよびキナーゼドメインを含むその部分ペプチドまたはその塩を産生する細胞におけるＡＳＫ１もしくは該部分ペプチドまたはその塩の活性化を、被験物質の存在下と非存在下で比較することを特徴とする請求項３８記載の方法。
  44. 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは請求項１記載のペプチドまたはその塩を産生する細胞における該蛋白質もしくは該ペプチドまたはその塩の発現を、被験物質の存在下と非存在下で比較することを特徴とする、ＡＳＫ１活性化調節物質のスクリーニング方法。
  45. 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする塩基配列もしくはその一部を含有するポリヌクレオチド、あるいは配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩に対する抗体を用いることを特徴とする、請求項４４記載の方法。
  46. 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする塩基配列もしくはその一部を含有するポリヌクレオチド、あるいは配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩に対する抗体を含んでなるＡＳＫ１活性化調節物質のスクリーニング用キット。
  47. 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の発現または活性を増大させる物質を含有してなるアポトーシス誘発剤。
  48. 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の発現または活性を増大させる物質を含有してなる医薬。
  49. アポトーシスを誘発することが予防・治療上有効な疾患の予防・治療剤である請求項４８記載の医薬。
  50. 疾患が、癌、自己免疫疾患、ウイルス感染症、内分泌疾患、血液疾患、臓器過形成、血管形成術後再狭窄および癌切除術後の再発からなる群より選択される請求項４９記載の医薬。
  51. 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の発現または活性を減少させる物質を含有してなるアポトーシスまたは炎症性サイトカイン産生抑制剤。
  52. 配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の発現または活性を減少させる物質を含有してなる医薬。
  53. アポトーシスまたは炎症を抑制することが予防・治療上有効な疾患の予防・治療剤である請求項５２記載の医薬。
  54. 疾患が、ウイルス感染症、内分泌疾患、血液疾患、臓器形成不全、移植臓器拒絶、移植片対宿主病、免疫不全、神経変性疾患、虚血性心疾患、放射線障害、紫外線障害、中毒性疾患、栄養障害、炎症性疾患、虚血性神経障害、糖尿病性神経障害、血管系疾患、呼吸器系疾患および軟骨疾患からなる群より選択される請求項５３記載の医薬。
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