JP2004105167A - 新規タンパク質およびそのｄｎａ - Google Patents

Abstract

【課題】Ｋ^＋イオンの透過などの活性を有する新規タンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該タンパク質の活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法、該スクリーニング方法で得られる化合物などの提供。
【解決手段】特定の配列で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質は、例えば、消化器疾患、胸腺異常に伴う免疫疾患、膵臓疾患、糖尿病、生殖器疾患、中枢神経系疾患、循環器疾患、筋肉疾患または癌などの診断マーカー等として有用であり、該タンパク質を用いるスクリーニング法により得られる該タンパク質の活性を促進または阻害する化合物などは、例えば、上記疾患の予防・治療剤などとして使用することができる。
【選択図】　なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なＣａ^２＋依存性Ｋ^＋チャネルタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、該タンパク質の活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法、該スクリーニング方法で得られる化合物などを提供する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｋ^＋イオンを選択的に透過させる膜タンパクであるＫ^＋チャネルは、原核生物からヒトまで普遍的に存在し、非常に多くのファミリーからなる。生体内では、広範な組織に分布しており、細胞の静止膜電位形成、再分極、活動電位発生頻度の調節など重要な生理機能に密接に関わっている。
Ｋ^＋チャネルの構造は多様であり、６回膜貫通型、２回膜貫通型、１回膜貫通型などに加えて、これらの基本構造が２個連結した連結型のチャネル分子も存在する。
Ｃａ^２＋依存性Ｋ^＋チャネル（Ｋ_Ｃａ）は電位依存性Ｋ^＋チャネルとともに６回膜貫通型に属し、チャネルコンダクタンスに従ってさらにＢｉｇ−Ｋ（ＢＫ）、Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ−Ｋ（ＩＫ）およびＳｍａｌｌ−Ｋ（ＳＫ）の３つのファミリーに分類されている。ＢＫはコンダクタンスが１００−２２０ｐＳで、ｍａｘｉ−ＫまたはＳｌｏ（ショウジョウバエのＢｉｇ−Ｋが変異株Ｓｌｏｗｐｏｋｅの原因遺伝子であったことから）とも呼ばれ、ヒトＳｌｏは１９９４年にクローニングされている（Ｍｏｌ．　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．，　２７巻、１８９−１９３頁、１９９４年）。ＩＫおよびＳＫは、コンダクタンスがそれぞれ２０−８５ｐＳおよび２−２０ｐＳであり、ヒトＩＫ１（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９４巻、１１６５１−１１６５６頁、１９９７年）およびヒトＳＫ１（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７３巻、１７０９−１７１４頁、１９９６年）がクローニングされている。いずれのファミリーも、第５膜貫通領域と第６膜貫通領域との間にポア領域が存在し、また、細胞内に位置するＣ末端側部分でＣａ^２＋感受性を担っていると考えられている。このＣ末端側部分は機能発現のために不可欠で、この領域のスプライシングによってＣａ^２＋依存性の異なるチャネルが形成される。Ｋ_Ｃａでチャネル本体としての機能を果たすのはαサブユニットであるが、最近になって本チャネルにも電位依存性Ｋ^＋チャネルと同様βサブユニットの存在することが見出された（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ９３巻、９２００−９２０５頁、１９９６年）。βサブユニットは２つの膜貫通領域を持ち、Ｎ末端とＣ末端が細胞内に位置する構造をとると推定されており、αサブユニットに対し調節的な役割を担っていると考えられている。
Ｃａ^２＋依存性Ｋ^＋チャネルの生理機能としては、ヒトＳＫがドーパミン作動性中脳神経細胞に高発現していることから本神経細胞で何らかの機能を果たしているものと考えられており、また本神経細胞の機能不全が精神分裂病で観察されることから精神分裂病とヒトＳＫとの関連も指摘されている（Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，　２１巻、３４４３−３４５６頁、２００１年）。ヒトＩＫ１は、赤血球の体積調節との関連（Ｃｕｒｒｅｎｔ．　Ｏｐｉｎ．　Ｈｅｍａｔｏｌ．，　４巻、１２２−１２７頁、１９９７年）、および小腸のＣｌ⁻分泌の調節との関連（Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．，　９８巻、２０６６−２０７５頁、１９９６年）が報告されており、ＩＫ１阻害剤が分泌性下痢に対して緩和作用を持つことも知られている（Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．，　１００巻、３１１１−３１２０頁、１９９７年）。
ニワトリのＣａ^２＋依存性Ｋ^＋チャネルとしてｃＳｌａｃｋが報告されている（非特許文献１　Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＡＭ１８７７０）。
【非特許文献１】
Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＡＭ１８７７０
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
Ｋ_Ｃａは、細胞の膜電位と細胞内Ｃａ^２＋イオン濃度とを感知してＫ^＋イオンの透過を制御していると考えられているが、チャネルコンダクタンス、Ｃａ^２＋イオンの感受性やタンパクリン酸化酵素のようなチャネル活性調節因子に対する応答などが異なった多種の分子種が存在し、発現部位も多様である。Ｋ_Ｃａは、筋収縮、内分泌、腎でのＫ^＋イオンの透過、神経情報伝達など生体にとって重要な種々の機能を担っていると考えられている。しかし、各分子種とそれら機能との関係は不確定な部分が多く、それを解明することがＫ_Ｃａが関与する種々の疾患の治療薬開発につながる。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、新規なＣａ^２＋依存性Ｋ^＋チャネルタンパク質を見出した。該タンパク質を調節する方法としては、例えばＫ^＋イオンの透過阻害または促進、該タンパク質遺伝子の転写抑制による発現レベル低下、該タンパク質遺伝子のプロモーターの活性化、ｍＲＮＡの安定化による発現レベルの亢進などが考えられる。本発明者らは、これらの知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）　配列番号：１、配列番号：８、配列番号：１１または配列番号：１５で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩、
（２）　配列番号：１、配列番号：８、配列番号：１１または配列番号：１５で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質が、配列番号：１８、配列番号：２３または配列番号：２６で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質である上記（１）記載のタンパク質またはその塩、
（３）　配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩、
（４）　配列番号：８で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩、
（５）　配列番号：１１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩、
（６）　配列番号：１５で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩、
（７）　上記（１）記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
（８）　上記（１）記載のタンパク質または上記（７）記載の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（９）　ＤＮＡである上記（８）記載のポリヌクレオチド、
（１０）　配列番号：２、配列番号：９、配列番号：１２または配列番号：１６で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（１１）　配列番号：１９、配列番号：２４または配列番号：２７で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（１２）　上記（８）記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
（１３）　上記（１２）記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
（１４）　上記（１３）記載の形質転換体を培養し、上記（１）記載のタンパク質または上記（７）記載の部分ペプチドを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（７）記載の部分ペプチドまたはその塩の製造法、
（１５）　上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（７）記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬、
（１６）　上記（８）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
（１７）　上記（８）記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬、
（１８）　上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（７）記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（１９）　上記（１８）記載の抗体を含有してなる診断薬、
（２０）　上記（１８）記載の抗体を含有してなる医薬、
（２１）　上記（８）記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド、
（２２）　上記（２１）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
（２３）　上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（７）記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（７）記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２４）　上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（７）記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる、上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（７）記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（２５）　上記（２３）記載のスクリーニング方法または上記（２４）記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（７）記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩、
（２６）　上記（２５）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（２７）　上記（８）記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、上記（１）記載のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２８）　上記（８）記載のポリヌクレオチドを含有してなる、上記（１）記載のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（２９）　上記（２７）記載のスクリーニング方法または上記（２８）記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、上記（１）記載のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩、
（３０）　上記（２９）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（３１）　上記（１８）記載の抗体を用いることを特徴とする上記（１）記載のタンパク質の定量方法、
（３２）　上記（３１）記載の定量方法を用いることを特徴とする上記（１）記載のタンパク質の機能が関連する疾患の診断法、
（３３）　上記（１８）記載の抗体を用いることを特徴とする、上記（１）記載のタンパク質の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（３４）　上記（１８）記載の抗体を含有してなる、上記（１）記載のタンパク質の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（３５）　上記（３３）記載のスクリーニング方法または上記（３４）記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、上記（１）記載のタンパク質の発現を促進または阻害する化合物またはその塩、
（３６）　上記（３５）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（３７）　消化器疾患、生殖器疾患または呼吸器疾患の予防・治療剤である上記（１５）、（１６）、（２０）、（２２）、（２６）、（３０）または（３６）記載の医薬、
（３８）　消化器疾患、生殖器疾患または呼吸器疾患の診断薬である上記（１７）または（１９）記載の診断薬、
（３９）　哺乳動物に対して、上記（２５）、（２９）または（３５）記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする消化器疾患、生殖器疾患または呼吸器疾患の予防・治療方法、
（４０）　消化器疾患、生殖器疾患または呼吸器疾患の予防・治療剤を製造するための上記（２５）、（２９）または（３５）記載の化合物またはその塩の使用などを提供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
配列番号：１、配列番号：８、配列番号：１１または配列番号：１５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（以下、本発明のタンパク質または本発明で用いられるタンパク質と称することもある）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。
【０００７】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と例えば約７５％以上、好ましくは約８０％以上、好ましくは約８５％以上、好ましくは約９０％以上、好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号：８で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：８で表わされるアミノ酸配列と例えば約７５％以上、好ましくは約８０％以上、好ましくは約８５％以上、好ましくは約９０％以上、好ましくは約９５％以上、好ましくは約９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：８で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、配列番号：８で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。具体例としては、配列番号：１８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などが挙げられる。
配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１１で表わされるアミノ酸配列と例えば約７５％以上、好ましくは約７５％以上、好ましくは約８０％以上、好ましくは約８５％以上、好ましくは約９０％以上、好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。配列番号：１５で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１５で表わされるアミノ酸配列と例えば約８０％以上、好ましくは約８５％以上、好ましくは約９０％以上、好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：１５で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、配列番号：１５で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、Ｋ^＋イオンの透過などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの性質が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、Ｋ^＋イオンの透過が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
Ｋ^＋イオンの透過の測定は、公知の方法に準じて行うことが出来、例えば、Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｃｈａｎｎｅｌｓ　６巻、３３７−３５０頁、１９９９年に記載の方法またはそれに準じる方法に従って測定することができる。
【０００８】
また、本発明のタンパク質としては、例えば（１）（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜３００個程度、好ましくは１〜２００個程度、好ましくは１〜１５０個程度、好ましくは１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜３００個程度、好ましくは１〜２００個程度、好ましくは１〜１５０個程度、好ましくは１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜３００個程度、好ましくは１〜２００個程度、好ましくは１〜１５０個程度、好ましくは１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜３００個程度、好ましくは１〜２００個程度、好ましくは１〜１５０個程度、好ましくは１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテイン、
（２）（ｉ）配列番号：８で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜３００個程度、好ましくは１〜２００個程度、好ましくは１〜１５０個程度、好ましくは１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：８で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜３００個程度、好ましくは１〜２００個程度、好ましくは１〜１５０個程度、好ましくは１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：８で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜３００個程度、好ましくは１〜２００個程度、好ましくは１〜１５０個程度、好ましくは１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号：８で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜３００個程度、好ましくは１〜２００個程度、好ましくは１〜１５０個程度、好ましくは１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテイン、
（３）（ｉ）配列番号：１１で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜３００個程度、好ましくは１〜２００個程度、好ましくは１〜１５０個程度、好ましくは１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：１１で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜３００個程度、好ましくは１〜２００個程度、好ましくは１〜１５０個程度、好ましくは１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：１１で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜３００個程度、好ましくは１〜２００個程度、好ましくは１〜１５０個程度、好ましくは１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号：１１で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜３００個程度、好ましくは１〜２００個程度、好ましくは１〜１５０個程度、好ましくは１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテイン、
（４）（ｉ）配列番号：１５で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜２００個程度、好ましくは１〜１５０個程度、好ましくは１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：１５で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜２００個程度、好ましくは１〜１５０個程度、好ましくは１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：１５で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜２００個程度、好ましくは１〜１５０個程度、好ましくは１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号：１５で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜２００個程度、好ましくは１〜１５０個程度、好ましくは１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置は、とくに限定されない。
【０００９】
本明細書におけるタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、本発明のタンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ⁻）、アミド（−ＣＯＮＨ_２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ_１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ_３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ_６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ_１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ_１−２アルキル基などのＣ_７−１４アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明のタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明で用いられるタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のタンパク質には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ_１−６アルカノイルなどのＣ_１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ_１−６アルカノイル基などのＣ_１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明のタンパク質の具体例としては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：１５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：１８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などがあげられる。
【００１０】
本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドとしては、前記した本発明のタンパク質の部分ペプチドであって、好ましくは、前記した本発明のタンパク質と同様の性質を有するものであればいずれのものでもよい。
例えば、本発明で用いられるタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。
また、本発明で用いられる部分ペプチドは、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
本発明の部分ペプチドとしては、例えば配列番号：１で表されるアミノ酸配列において例えば第１〜６３番目、第８４〜１０３または第２７１〜１１１８番目のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：８で表されるアミノ酸配列において例えば第１〜６３番目、第８４〜１０３または第２７１〜１１１１番目のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列において例えば第１〜６３番目、第８４〜１０３または第２７１〜１０６１番目のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：１５で表されるアミノ酸配列において例えば第１〜６３番目、第８４〜１０３または第２７１〜７５９番目のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：１８で表されるアミノ酸配列において例えば第１〜６３番目、第８４〜１０３または第２７１〜１，１３５番目のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列において例えば第１〜６３番目、第８４〜１０３または第２７１〜１，１４２番目のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列において例えば第１〜６３番目、第８４〜１０３または第２７１〜１，１１１番目のアミノ酸配列を有するペプチドなどがあげられる。
【００１１】
また、本発明で用いられる部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ⁻）、アミド（−ＣＯＮＨ_２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
さらに、本発明で用いられる部分ペプチドには、前記した本発明で用いられるタンパク質と同様に、Ｃ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有しているもの、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明で用いられる部分ペプチドは抗体作成のための抗原としても用いることができる。たとえば、後述する本発明の抗体を調製する目的には、例えば配列番号：１で表されるアミノ酸配列において第２２〜３５番目、第８４〜１０３番目、第２８２〜３０２番目、第６５６〜６７３番目のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：８で表されるアミノ酸配列において第２２〜３５番目、第８４〜１０３番目、第２８２〜３０２番目または第６４９〜６６６番目のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列において第２２〜３５番目、第８４〜１０３番目、第２８２〜３０２番目または第５９９〜６１６番目のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：１５で表されるアミノ酸配列において第２２〜３５番目、第８４〜１０３番目、第２８２〜３０２番目または第６４９〜６６６番目のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：１８で表されるアミノ酸配列において第２２〜３５番目、第８４〜１０３番目、第２８２〜３０２番目または第６４９〜６６６番目のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列において第２２〜３５番目、第８４〜１０３番目、第２８２〜３０２番目または第６４９〜６６６番目のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列において第２２〜３５番目、第８４〜１０３番目、第２８２〜３０２番目または第６４９〜６６６番目のアミノ酸配列を有するペプチドなどがあげられる。
【００１２】
本発明のタンパク質または部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできるし、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００１３】
本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、またはそのアミド体の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００１４】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
【００１５】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ_１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ_２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００１６】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなリガンド作動性カチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
【００１７】
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部分ペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質または部分ペプチドとを製造し、これらのタンパク質またはペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質またはペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることができる。この粗タンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質またはペプチドのアミド体を得ることができる。
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、所望のタンパク質またはペプチドのエステル体を得ることができる。
【００１８】
本発明で用いられる部分ペプチドまたはそれらの塩は、公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明で用いられるタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明で用いられる部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（ａ）〜（ｅ）に記載された方法が挙げられる。
（ａ）Ｍ．　Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ　および　Ｍ．Ａ．　Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド・シンセシス　（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９６６年）
（ｂ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ・ペプチド（Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ），　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９６５年）
（ｃ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、　丸善（株）　（１９７５年）
（ｄ）矢島治明　および榊原俊平、生化学実験講座　１、　タンパク質の化学ＩＶ、　２０５、（１９７７年）
（ｅ）矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明で用いられる部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００１９】
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、前述した本発明のタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。好ましくはＤＮＡである。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりｔｏｔａｌＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、（１）（ｉ）配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｉｉ）配列番号：７で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：７で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（２）（ｉ）配列番号：９で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：９で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｉｉ）配列番号：１０で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：１０で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（３）（ｉ）配列番号：１２で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：１２で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｉｉ）配列番号：１３で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：１３で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（４）（ｉ）配列番号：１６で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：１６で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｉｉ）配列番号：１７で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：１７で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
【００２０】
配列番号：２または配列番号：７で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２または配列番号：７で表される塩基配列と例えば約５５％以上、好ましくは約６０％以上、好ましくは約６５％以上、好ましくは約７０％以上、好ましくは約７５％以上、好ましくは約８０％以上、好ましくは約８５％以上、好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：９または配列番号：１０で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：９または配列番号：１０で表される塩基配列と例えば約６５％以上、好ましくは約７０％以上、好ましくは約７５％以上、好ましくは約８０％以上、好ましくは約８５％以上、好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。具体的には、配列番号：１９で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、配列番号：２４で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、配列番号：２７で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが挙げられる。
配列番号：１２または配列番号：１３で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１２または配列番号：１３で表される塩基配列と例えば約６０％以上、好ましくは約６５％以上、好ましくは約７０％以上、好ましくは約７５％以上、好ましくは約８０％以上、好ましくは約８５％以上、好ましくは約９０％以上、、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：１６または配列番号：１７で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１６または配列番号：１７で表される塩基配列と例えば６０％以上、好ましくは約６５％以上、好ましくは約７０％以上、好ましくは約７５％以上、好ましくは約８０％以上、好ましくは約８５％以上、好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：７で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：９で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：１０で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１２で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：１３で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：１５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１６で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：１７で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：１８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１９で表される塩基配列を含有するＤＮＡまたは配列番号：２２で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２４で表される塩基配列を含有するＤＮＡまたは配列番号：２５で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２７で表される塩基配列を含有するＤＮＡまたは配列番号：２８で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２１】
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述した本発明で用いられる部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２または配列番号：７で表される塩基配列を有するＤＮＡの一部分を有するＤＮＡ、または配列番号：２または配列番号：７で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分を含有するＤＮＡ、配列番号：９または配列番号：１０で表される塩基配列を有するＤＮＡの一部分を有するＤＮＡ、または配列番号：９または配列番号：１０で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分を含有するＤＮＡ、配列番号：１２または配列番号：１３で表される塩基配列を有するＤＮＡの一部分を有するＤＮＡ、または配列番号：１２または配列番号：１３で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分を含有するＤＮＡ、配列番号：１６または配列番号：１７で表される塩基配列を有するＤＮＡの一部分を有するＤＮＡ、または配列番号：１６または配列番号：１７で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：１５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２または配列番号：１５で表される塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡ、配列番号：９または配列番号：１０で表される塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡ、配列番号：１２または配列番号：１３で表される塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡ、配列番号：１６または配列番号：１７で表される塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
【００２２】
本発明のタンパク質、部分ペプチド（以下、これらをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、Ｍｕｔａｎ^ＴＭ−ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍ（宝酒造（株））、Ｍｕｔａｎ^ＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ　ＰＣＲ法やＧａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたタンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のタンパク質の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
【００２３】
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００２４】
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ^ｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏ^ｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のタンパク質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
【００２５】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ），９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ），１２０巻，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９巻，４４０（１９５４）〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），９５巻，８７（１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス　セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ⁻，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス　ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア　パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＫＭ７１などが用いられる。
【００２６】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ　Ｆｉｖｅ^ＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ　ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ　ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ　Ｎ　細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，　Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィボ（Ｉｎ　Ｖｉｖｏ），１３，　２１３−２１７，（１９７７））などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３１５巻，５９２（１９８５）〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁻）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），６９巻，２１１０（１９７２）やジーン（Ｇｅｎｅ），１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なうことができる。
【００２７】
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　＆　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），１６８巻，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６，　４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８　新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なうことができる。このようにして、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００２８】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），４３１−４３３，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ，　Ｋ．　Ｌ．　ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），７７巻，４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｂｉｔｔｅｒ，　Ｇ．　Ａ．　ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，　Ｔ．Ｃ．Ｃ．，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５，７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２巻，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８巻，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ　１６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）１９９巻，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明のタンパク質を生成せしめることができる。
【００２９】
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００^ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００３０】
かくして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精製後に適当なタンパク修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。タンパク修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のタンパク質の存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより測定することができる。
【００３１】
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体は、本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩（以下、抗体の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）に対する抗体は、本発明のタンパク質を抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質は、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６、４９５　（１９７５）　〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
【００３２】
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ　１６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００３３】
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
【００３４】
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質抗原）自体、あるいはそれとキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００３５】
本発明のタンパク質または部分ペプチドをコードするＤＮＡ（以下、アンチセンスヌクレオチドの説明においては、これらのＤＮＡを本発明のＤＮＡと略記する場合がある）の塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスヌクレオチドとしては、本発明のＤＮＡの塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスヌクレオチドであってもよいが、アンチセンスＤＮＡが好ましい。
本発明のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、本発明のタンパク質のＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスヌクレオチドが好適である。
具体的には、（１）配列番号：２または配列番号：７で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスヌクレオチド、好ましくは例えば、配列番号：２または配列番号：７で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスヌクレオチド、
（２）配列番号：９または配列番号：１０で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスヌクレオチド、好ましくは例えば、配列番号：９または配列番号：１０で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスヌクレオチド、
（３）配列番号：１２または配列番号：１３で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスヌクレオチド、好ましくは例えば、配列番号：１２または配列番号：１３で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスヌクレオチド、
（４）配列番号：１６または配列番号：１７で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスヌクレオチド、好ましくは例えば、配列番号：１６または配列番号：１７で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスヌクレオチド、
（５）配列番号：１９または配列番号：２２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスヌクレオチド、好ましくは例えば、配列番号：１９または配列番号：２２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスヌクレオチド、
（６）配列番号：２４または配列番号：２５で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスヌクレオチド、好ましくは例えば、配列番号：２４または配列番号：２５で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスヌクレオチド、
（７）配列番号：２７または配列番号：２８で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスヌクレオチド、好ましくは例えば、配列番号：２７または配列番号：２８で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスヌクレオチドなどが挙げられる。
アンチセンスヌクレオチドは通常、１０〜４０個程度、好ましくは１５〜３０個程度の塩基から構成される。
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスＤＮＡを構成する各ヌクレオチドのりん酸残基（ホスフェート）は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾りん酸残基に置換されていてもよい。これらのアンチセンスヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
本発明に従えば、本発明のタンパク質遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）を、クローン化した、あるいは決定されたタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。かかるポリヌクレオチド（核酸）は、本発明のタンパク質遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいは本発明のタンパク質関連ＲＮＡとの相互作用を介して本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節・制御することができる。本発明のタンパク質関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、および本発明のタンパク質関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外で本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とペプチド（タンパク質）との間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド（タンパク質）のアミノ酸を通常指している。タンパク質遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、タンパク質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係は、対象物とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、「アンチセンス」であるということができる。アンチセンス・ポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレート化合物（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
【００３６】
本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうした修飾は当該分野で数多く知られており、例えば　Ｊ．　Ｋａｗａｋａｍｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｈａｒｍ　Ｔｅｃｈ　Ｊａｐａｎ，　Ｖｏｌ．　８，　ｐｐ．２４７，　１９９２；　Ｖｏｌ．　８，　ｐｐ．３９５，　１９９２；　Ｓ．　Ｔ．　Ｃｒｏｏｋｅ　ｅｔ　ａｌ．　ｅｄ．，　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，　１９９３　などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいは本発明のタンパク質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸は公知の各種の方法で細胞に適用できる。
【００３７】
以下に、本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩（以下、本発明のタンパク質と略記する場合がある）、本発明のタンパク質または部分ペプチドをコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）、本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）、および本発明のＤＮＡのアンチセンスヌクレオチド（以下、本発明のアンチセンスヌクレオチドと略記する場合がある）の用途を説明する。
本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物もしくはその塩を含有する医薬は、例えば、Ｋ^＋イオンの透過を抑制することで、例えば、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、下痢、逆流性食道炎、十二指腸炎など）、生殖器疾患（例、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、卵巣嚢腫など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、喘息など）、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病（統合失調症）、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、糖尿病、高血圧症、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群、動脈硬化、狭心症など）、膵臓疾患（例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など）、肝臓疾患（例、肝硬変など）、腎疾患（例、腎不全、尿毒症など）、癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫、精巣腫瘍、食道癌、筋肉腫など）などの予防・治療剤として使用することができる。好ましくは、消化器疾患、生殖器疾患、呼吸器疾患などの予防・治療剤である。
一方、本発明のタンパク質の活性を促進する化合物もしくはその塩を含有する医薬は、例えば、Ｋ^＋イオンの透過を促進することで、例えば、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、下痢、逆流性食道炎、十二指腸炎など）、生殖器疾患（例、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、卵巣嚢腫など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、喘息など）、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病（統合失調症）、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、糖尿病、高血圧症、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群、動脈硬化、狭心症など）、膵臓疾患（例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など）、肝臓疾患（例、肝硬変など）、腎疾患（例、腎不全、尿毒症など）、癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫、精巣腫瘍、食道癌、筋肉腫など）などの予防・治療剤として使用することができる。好ましくは、消化器疾患、生殖器疾患、呼吸器疾患などの予防・治療剤である。
【００３８】
〔１〕本発明のタンパク質が関与する各種疾病の予防・治療剤
本発明のタンパク質は、Ｋ^＋イオンの透過活性（例、細胞の膜電位または細胞内Ｃａ^２＋イオン濃度を感知し、Ｋ^＋イオンの透過を調節する活性）などを有し、細胞の興奮の制御などに重要な役割を果たしている。
したがって、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡに異常があったり、欠損している場合あるいは本発明のタンパク質の発現量が減少している場合には、例えば、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、下痢、逆流性食道炎、十二指腸炎など）、生殖器疾患（例、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、卵巣嚢腫など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、喘息など）、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病（統合失調症）、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、糖尿病、高血圧症、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群、動脈硬化、狭心症など）、膵臓疾患（例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など）、肝臓疾患（例、肝硬変など）、腎疾患（例、腎不全、尿毒症など）、癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫、精巣腫瘍、食道癌、筋肉腫など）などの種々の疾患が発症する。
したがって、本発明のタンパク質および本発明のＤＮＡは、例えば、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、下痢、逆流性食道炎、十二指腸炎など）、生殖器疾患（例、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、卵巣嚢腫など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、喘息など）、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病（統合失調症）、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、糖尿病、高血圧症、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群、動脈硬化、狭心症など）、膵臓疾患（例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など）、肝臓疾患（例、肝硬変など）、腎疾患（例、腎不全、尿毒症など）、癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫、精巣腫瘍、食道癌、筋肉腫など）などの予防・治療剤などの医薬として使用することができる。
例えば、生体内において本発明のタンパク質が減少あるいは欠損しているために、Ｋ^＋イオンの透過が十分に、あるいは正常に発揮されない患者がいる場合に、（イ）本発明のＤＮＡを該患者に投与し、生体内で本発明のタンパク質を発現させることによって、（ロ）細胞に本発明のＤＮＡを挿入し、本発明のタンパク質を発現させた後に、該細胞を患者に移植することによって、または（ハ）本発明のタンパク質を該患者に投与することなどによって、該患者における本発明のタンパク質の役割を十分に、あるいは正常に発揮させることができる。
本発明のＤＮＡを上記の予防・治療剤として使用する場合は、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノウィルスアソシエーテッドウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは温血動物に投与することができる。本発明のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
本発明のタンパク質を上記の予防・治療剤として使用する場合は、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
【００３９】
本発明のタンパク質は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明のタンパク質等を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０^ＴＭ、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
本発明のＤＮＡが挿入されたベクターも上記と同様に製剤化され、通常、非経口的に使用される。
【００４０】
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、温血動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。
本発明のタンパク質等の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、過敏性腸症候群の治療目的で本発明のタンパク質等を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該タンパク質等を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該タンパク質等の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、過敏性腸症候群の治療目的で本発明のタンパク質等を注射剤の形で成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該タンパク質等を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを患部に注射することにより投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００４１】
〔２〕疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
本発明は、（１）本発明のタンパク質を用いることを特徴とする本発明のタンパク質の活性（例えば、Ｋ^＋イオンの透過など）を促進または阻害する化合物またはその塩（以下、それぞれ促進剤、阻害剤と略記する場合がある）のスクリーニング方法を提供する。より具体的には、例えば、
（２）（ｉ）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞のＫ^＋イオンの透過（活性）と（ｉｉ）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物のＫ^＋イオンの透過（活性）の比較を行なうことを特徴とする促進剤または阻害剤のスクリーニング方法を提供する。
具体的には、上記スクリーニング方法においては、例えば、（ｉ）と（ｉｉ）の場合において、Ｋ^＋イオンの透過に伴う膜電位の変化を蛍光色素で測定し、Ｋ^＋イオンの透過の指標として比較することを特徴とするものである。
【００４２】
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記のスクリーニング方法を実施するには、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適したバッファーに浮遊して調製する。バッファーには、ｐＨ約４〜１０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッファー、ほう酸バッファーなどの、本発明のタンパク質のＫ^＋イオンの透過（活性）を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された宿主（形質転換体）が用いられる。宿主としては、例えば、ＣＨＯ細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明のタンパク質を細胞膜上に発現させた形質転換体が好ましく用いられる。
【００４３】
本発明のタンパク質のＫ^＋イオンの透過は、公知の方法、例えば、Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｃｈａｎｎｅｌｓ　６巻、３３７−３５０頁、１９９９年に記載の方法あるいはそれに準じる方法に従って測定することができる。
例えば、上記（ｉｉ）の場合におけるＫ^＋イオンの透過を、上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を本発明のタンパク質の活性を促進する化合物またはその塩として選択することができる。
また、例えば、上記（ｉｉ）の場合におけるＫ^＋イオンの透過を、上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害（または抑制）する試験化合物を本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
また、本発明のタンパク質遺伝子のプロモーター下流に分泌型アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼなどの遺伝子を挿入し、上記の各種細胞に発現させ、該細胞に上記試験化合物を接触させた場合における酵素活性を賦活化または阻害する化合物またはその塩を探索することによって本発明のタンパク質の発現を促進または抑制（すなわち、本発明のタンパク質の活性を促進または阻害）する化合物またはその塩をスクリーニングすることができる。
【００４４】
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
本発明は、（３）本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする本発明のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩（以下、それぞれ促進剤、阻害剤と略記する場合がある）のスクリーニング方法を提供し、より具体的には、例えば、
（４）（ｉｉｉ）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合と（ｉｖ）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物を培養した場合との比較を行うことを特徴とする促進剤または阻害剤のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法においては、例えば、（ｉｉｉ）と（ｉｖ）の場合における、本発明のタンパク質遺伝子の発現量（具体的には、本発明のタンパク質量または前記タンパク質をコードするｍＲＮＡ量）を測定して、比較する。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記のスクリーニング方法を実施するには、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適したバッファーに浮遊して調製する。バッファーには、ｐＨ約４〜１０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッファー、ほう酸バッファーなどの、本発明のタンパク質のＫ^＋イオンの透過を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された宿主（形質転換体）が用いられる。宿主としては、例えば、ＣＨＯ細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明のタンパク質を細胞膜上に発現させた形質転換体が好ましく用いられる。
本発明のタンパク質量の測定は、公知の方法、例えば、本発明のタンパク質を認識する抗体を用いて、細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、ウェスタン解析、ＥＬＩＳＡ法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
本発明のタンパク質遺伝子の発現量は、公知の方法、例えば、ノーザンブロッティングやＲｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ解析システム（ＡＢＩ社製、ＴａｑＭａｎ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）などの方法あるいはそれに準じる方法にしたがって測定することができる。
例えば、上記（ｉｖ）の場合における本発明のタンパク質遺伝子の発現量を、上記（ｉｉｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を本発明のタンパク質遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩として選択することができる。
例えば、上記（ｉｖ）の場合における本発明のタンパク質遺伝子の発現量を、上記（ｉｉｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害する試験化合物を本発明のタンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
さらに、本発明の抗体は、本発明のタンパク質の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
本発明は、（５）本発明の抗体を用いることを特徴とする本発明のタンパク質の発現を促進または阻害する化合物またはその塩（以下、それぞれ促進剤、阻害剤と略記する場合がある）のスクリーニング方法を提供し、より具体的には、例えば、
（６）（ｖ）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合と（ｖｉ）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物を培養した場合との比較を行うことを特徴とする促進剤または阻害剤のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法においては、例えば、本発明の抗体を用いて（ｖ）と（ｖｉ）の場合における、本発明のタンパク質の発現量（具体的には、本発明のタンパク質量）を測定（例、本発明のタンパク質の発現を検出、本発明のタンパク質の発現量を定量等）して、比較する。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記のスクリーニング方法を実施するには、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適したバッファーに浮遊して調製する。バッファーには、ｐＨ約４〜１０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッファー、ほう酸バッファーなどの、本発明のタンパク質のＫ^＋イオンの透過を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された宿主（形質転換体）が用いられる。宿主としては、例えば、ＣＨＯ細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明のタンパク質を細胞膜上に発現させた形質転換体が好ましく用いられる。
本発明のタンパク質量の測定は、公知の方法、例えば、本発明のタンパク質を認識する抗体を用いて、細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、ウェスタン解析、ＥＬＩＳＡ法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
例えば、上記（ｖｉ）の場合における本発明のタンパク質の発現量を、上記（ｖ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を本発明のタンパク質の発現を促進する化合物またはその塩として選択することができる。
例えば、上記（ｖｉ）の場合における本発明のタンパク質の発現量を、上記（ｖ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害する試験化合物を本発明のタンパク質の発現を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
【００４５】
本発明のスクリーニング用キットは、本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、または本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドを産生する能力を有する細胞を含有するものである。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物またはその塩であり、本発明のタンパク質の活性（例、Ｋ^＋イオンの透過など）を促進または阻害する化合物またはその塩である。
該化合物の塩としては、前記した本発明のタンパク質の塩と同様のものが用いられる。
本発明のタンパク質の活性を促進する化合物またはその塩は、例えば、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、下痢、逆流性食道炎、十二指腸炎など）、生殖器疾患（例、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、卵巣嚢腫など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、喘息など）、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病（統合失調症）、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、糖尿病、高血圧症、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群、動脈硬化、狭心症など）、膵臓疾患（例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など）、肝臓疾患（例、肝硬変など）、腎疾患（例、腎不全、尿毒症など）、癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫、精巣腫瘍、食道癌、筋肉腫など）などの予防・治療剤などの医薬として有用である。
また、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩は、例えば、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、下痢、逆流性食道炎、十二指腸炎など）、生殖器疾患（例、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、卵巣嚢腫など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、喘息など）、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病（統合失調症）、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、糖尿病、高血圧症、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群、動脈硬化、狭心症など）、膵臓疾患（例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など）、肝臓疾患（例、肝硬変など）、腎疾患（例、腎不全、尿毒症など）、癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫、精巣腫瘍、食道癌、筋肉腫など）などの予防・治療剤などの医薬として有用である。
本発明のタンパク質遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩は、例えば、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、下痢、逆流性食道炎、十二指腸炎など）、生殖器疾患（例、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、卵巣嚢腫など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、喘息など）、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病（統合失調症）、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、糖尿病、高血圧症、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群、動脈硬化、狭心症など）、膵臓疾患（例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など）、肝臓疾患（例、肝硬変など）、腎疾患（例、腎不全、尿毒症など）、癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫、精巣腫瘍、食道癌、筋肉腫など）などの予防・治療剤などの医薬として有用である。
また、本発明のタンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩は、例えば、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、下痢、逆流性食道炎、十二指腸炎など）、生殖器疾患（例、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、卵巣嚢腫など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、喘息など）、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病（統合失調症）、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、糖尿病、高血圧症、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群、動脈硬化、狭心症など）、膵臓疾患（例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など）、肝臓疾患（例、肝硬変など）、腎疾患（例、腎不全、尿毒症など）、癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫、精巣腫瘍、食道癌、筋肉腫など）などの予防・治療剤などの医薬として有用である。
本発明のタンパク質の発現を促進する化合物またはその塩は、例えば、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、下痢、逆流性食道炎、十二指腸炎など）、生殖器疾患（例、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、卵巣嚢腫など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、喘息など）、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病（統合失調症）、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、糖尿病、高血圧症、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群、動脈硬化、狭心症など）、膵臓疾患（例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など）、肝臓疾患（例、肝硬変など）、腎疾患（例、腎不全、尿毒症など）、癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫、精巣腫瘍、食道癌、筋肉腫など）などの予防・治療剤などの医薬として有用である。
また、本発明のタンパク質の発現を阻害する化合物またはその塩は、例えば、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、下痢、逆流性食道炎、十二指腸炎など）、生殖器疾患（例、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、卵巣嚢腫など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、喘息など）、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病（統合失調症）、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、糖尿病、高血圧症、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群、動脈硬化、狭心症など）、膵臓疾患（例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など）、肝臓疾患（例、肝硬変など）、腎疾患（例、腎不全、尿毒症など）、癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫、精巣腫瘍、食道癌、筋肉腫など）などの予防・治療剤などの医薬として有用である。
【００４６】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上述の予防・治療剤として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。例えば、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、過敏性腸症候群の治療の目的で本発明のタンパク質の活性を促進する化合物またはその塩を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物またはその塩を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物またはその塩の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、過敏性腸症候群の治療の目的で本発明のタンパク質の活性を促進する化合物またはその塩を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物またはその塩を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００４７】
〔３〕本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の定量
本発明の抗体は、本発明のタンパク質を特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のタンパク質の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明のタンパク質とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法、および
（ｉｉ）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法を提供する。
上記（ｉｉ）の定量法においては、一方の抗体が本発明のタンパク質のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のタンパク質のＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。
【００４８】
また、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と称する場合がある）を用いて本発明のタンパク質の定量を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）_２　、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、タンパク質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔^１２５Ｉ〕、〔^１３１Ｉ〕、〔^３Ｈ〕、〔^１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
【００４９】
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のタンパク質量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発明のタンパク質の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のタンパク質のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
【００５０】
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原（Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
【００５１】
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江　寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江　寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」　Ｖｏｌ．　７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ａ））、同書　Ｖｏｌ．　７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｂ））、　同書　Ｖｏｌ．　７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｃ））、　同書　Ｖｏｌ．　８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、　同書　Ｖｏｌ．　９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｍｅｔｈｏｄｓ））、　同書　Ｖｏｌ．　１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明のタンパク質を感度良く定量することができる。
さらには、本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質の濃度を定量することによって、本発明のタンパク質の濃度の減少が検出された場合、例えば消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、下痢、逆流性食道炎、十二指腸炎など）、生殖器疾患（例、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、卵巣嚢腫など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、喘息など）、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病（統合失調症）、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、糖尿病、高血圧症、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群、動脈硬化、狭心症など）、膵臓疾患（例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など）、肝臓疾患（例、肝硬変など）、腎疾患（例、腎不全、尿毒症など）、癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫、精巣腫瘍、食道癌、筋肉腫など）などが発症している可能性が高いと診断することが出来る。また、本発明のタンパク質の濃度の上昇が検出された場合、例えば消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、下痢、逆流性食道炎、十二指腸炎など）、生殖器疾患（例、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、卵巣嚢腫など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、喘息など）、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病（統合失調症）、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、糖尿病、高血圧症、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群、動脈硬化、狭心症など）、膵臓疾患（例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など）、肝臓疾患（例、肝硬変など）、腎疾患（例、腎不全、尿毒症など）、癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫、精巣腫瘍、食道癌、筋肉腫など）などの可能性が高いと診断することが出来る。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタンパク質を検出するために使用することができる。また、本発明のタンパク質を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のタンパク質の検出、被検細胞内における本発明のタンパク質の挙動の分析などのために使用することができる。
【００５２】
〔４〕遺伝子診断剤
本発明のＤＮＡは、例えば、プローブとして使用することにより、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）における本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。
本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションにより発現増加が検出された場合、例えば消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、下痢、逆流性食道炎、十二指腸炎など）、生殖器疾患（例、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、卵巣嚢腫など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、喘息など）、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病（統合失調症）、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、糖尿病、高血圧症、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群、動脈硬化、狭心症など）、膵臓疾患（例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など）、肝臓疾患（例、肝硬変など）、腎疾患（例、腎不全、尿毒症など）、癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫、精巣腫瘍、食道癌、筋肉腫など）などである可能性が高いと診断することが出来る。反対に、発現低下が検出された場合やＰＣＲ−ＳＳＣＰ法によりＤＮＡの突然変異が検出された場合は、例えば、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、下痢、逆流性食道炎、十二指腸炎など）、生殖器疾患（例、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、卵巣嚢腫など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、喘息など）、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病（統合失調症）、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、糖尿病、高血圧症、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群、動脈硬化、狭心症など）、膵臓疾患（例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など）、肝臓疾患（例、肝硬変など）、腎疾患（例、腎不全、尿毒症など）、癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫、精巣腫瘍、食道癌、筋肉腫など）などである可能性が高いと診断することができる。
【００５３】
〔５〕アンチセンスヌクレオチドを含有する医薬
本発明のＤＮＡに相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑制することができる本発明のアンチセンスヌクレオチドは低毒性であり、生体内における本発明のタンパク質または本発明のＤＮＡの機能（例、Ｋ^＋イオンの透過）を抑制することができるので、例えば、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、下痢、逆流性食道炎、十二指腸炎など）、生殖器疾患（例、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、卵巣嚢腫など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、喘息など）、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病（統合失調症）、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、糖尿病、高血圧症、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群、動脈硬化、狭心症など）、膵臓疾患（例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など）、肝臓疾患（例、肝硬変など）、腎疾患（例、腎不全、尿毒症など）、癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫、精巣腫瘍、食道癌、筋肉腫など）などの予防・治療剤として使用することができる。好ましくは、消化器疾患、生殖器疾患、呼吸器疾患などの予防・治療剤である。
上記アンチセンスヌクレオチドを上記の予防・治療剤として使用する場合、公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。
例えば、該アンチセンスヌクレオチドを用いる場合、該アンチセンスヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。該アンチセンスヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
該アンチセンスヌクレオチドの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、過敏性腸症候群の治療の目的で本発明のアンチセンスヌクレオチドを大腸に局所投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ）においては、一日につき該アンチセンスヌクレオチドを約０．１〜１００ｍｇ投与する。
さらに、該アンチセンスヌクレオチドは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
【００５４】
さらに、本発明は、
（ｉ）本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部とそれに相補的なＲＮＡを含有する二重鎖ＲＮＡ、
（ｉｉ）前記二重鎖ＲＮＡを含有してなる医薬、
（ｉｉｉ）本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部を含有するリボザイム、
（ｉｖ）前記リボザイムを含有してなる医薬、
（ｖ）前記リボザイムをコードする遺伝子（ＤＮＡ）を含有する発現ベクターなども提供する。
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、二重鎖ＲＮＡ、リボザイムなども、本発明のＤＮＡから転写されるＲＮＡを破壊またはその機能を抑制することができ、生体内における本発明で用いられるタンパク質または本発明で用いられるＤＮＡの機能を抑制することができるので、例えば、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、下痢、逆流性食道炎、十二指腸炎など）、生殖器疾患（例、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、卵巣嚢腫など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、喘息など）、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病（統合失調症）、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、糖尿病、高血圧症、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群、動脈硬化、狭心症など）、膵臓疾患（例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など）、肝臓疾患（例、肝硬変など）、腎疾患（例、腎不全、尿毒症など）、癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫、精巣腫瘍、食道癌、筋肉腫など）などの予防・治療剤として使用することができる。好ましくは、消化器疾患、生殖器疾患、呼吸器疾患などの予防・治療剤である。
二重鎖ＲＮＡは、公知の方法（例、Ｎａｔｕｒｅ，　４１１巻，　４９４頁，　２００１年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
リボザイムは、公知の方法（例、ＴＲＥＮＤＳ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，　７巻，　２２１頁，　２００１年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、公知のリボザイムの配列の一部を本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部に置換することによって製造することができる。本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得るコンセンサス配列ＮＵＸ（式中、Ｎはすべての塩基を、ＸはＧ以外の塩基を示す）の近傍の配列などが挙げられる。
上記の二重鎖ＲＮＡまたはリボザイムを上記予防・治療剤として使用する場合、アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、投与することができる。また、前記（ｖ）の発現ベクターは、公知の遺伝子治療法などと同様に用い、上記予防・治療剤として使用する。
〔６〕本発明の抗体を含有する医薬
本発明のタンパク質の活性を中和する作用を有する本発明の抗体は、例えば、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、下痢、逆流性食道炎、十二指腸炎など）、生殖器疾患（例、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、卵巣嚢腫など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、喘息など）、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病（統合失調症）、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、糖尿病、高血圧症、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群、動脈硬化、狭心症など）、膵臓疾患（例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など）、肝臓疾患（例、肝硬変など）、腎疾患（例、腎不全、尿毒症など）、癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫、精巣腫瘍、食道癌、筋肉腫など）などの予防・治療剤として使用することができる。好ましくは消化器疾患、生殖器疾患、呼吸器疾患などの予防・治療剤である。
本発明の抗体を含有する上記疾患の治療・予防剤は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、静脈注射等）に投与することができる。投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の過敏性腸症候群の予防・治療のために使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記抗体またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与（例、静脈注射）に適する剤形として提供される。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
【００５５】
〔７〕本発明のＤＮＡを有する動物の作出
本発明は、外来性の本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（２）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１）記載の動物、
（３）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである上記（２）記載の動物、および
（４）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターなどを提供する。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ導入動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを導入することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ導入方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを導入し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ導入動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ_１系統，ＢＤＦ_１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ_１系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
【００５６】
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のタンパク質を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に導入するにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを導入する場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ導入哺乳動物を作出することができる。
【００５７】
本発明のタンパク質の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、（ｉ）ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、（ｉｉ）各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、ＤＮＡ導入哺乳動物において目的とするｍＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネターなどが用いられる。
【００５８】
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なポリペプチドの翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は導入動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの導入は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ導入後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
本発明の外来性正常ＤＮＡを導入した非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの導入は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ導入後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
【００５９】
本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明のタンパク質の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ導入動物を用いて、本発明のタンパク質の機能亢進症や、本発明のタンパク質が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを導入した哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク質に関連する疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原料として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの導入は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
【００６０】
本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ導入動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質による正常タンパク質の機能阻害（ｄｏｍｉｎａｎｔ　ｎｅｇａｔｉｖｅ作用）を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来異常ＤＮＡを導入した哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク質またはその機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ導入動物のその他の利用可能性として、例えば、
（ｉ）組織培養のための細胞源としての使用、
（ｉｉ）本発明のＤＮＡ導入動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析する、またはＤＮＡにより発現されたポリペプチド組織を分析することによる、本発明のタンパク質により特異的に発現あるいは活性化するタンパク質との関連性についての解析、
（ｉｉｉ）ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
（ｉｖ）上記（ｉｉｉ）記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
（ｖ）本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、本発明のＤＮＡ導入動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症などを含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のＤＮＡ導入動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したＤＮＡ導入細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明のタンパク質産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のＤＮＡ導入動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症を含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ導入動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明のタンパク質が関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
【００６１】
〔８〕ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された上記（１）記載の胚幹細胞、
（３）ネオマイシン耐性である上記（１）記載の胚幹細胞、
（４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１）記載の胚幹細胞、
（５）ゲッ歯動物がマウスである上記（４）記載の胚幹細胞、
（６）本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（７）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる上記（６）記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（６）記載の非ヒト哺乳動物、
（９）ゲッ歯動物がマウスである上記（８）記載の非ヒト哺乳動物、および
（１０）上記（７）記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、あるいは該ＤＮＡがコードしている本発明のタンパク質の活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のタンパク質の発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
【００６２】
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ｐｏｌｙＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なｍＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
【００６３】
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知のＥｖａｎｓとＫａｕｆｍａｎの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ_１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ_１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ_１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３．５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０^６個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
【００６４】
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１−１００００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０．００１〜０．５％トリプシン／０．１〜５ｍＭ　ＥＤＴＡ、好ましくは約０．１％トリプシン／１ｍＭ　ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１〜３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔Ｍ．　Ｊ．　Ｅｖａｎｓ及びＭ．　Ｈ．　Ｋａｕｆｍａｎ，　ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２９２巻、１５４頁、１９８１年；Ｇ．　Ｒ．　Ｍａｒｔｉｎ　プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．）第７８巻、７６３４頁、１９８１年；Ｔ．　Ｃ．　Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ　ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第８７巻、２７頁、１９８５年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明のタンパク質の細胞生物学的検討において有用である。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
【００６５】
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体であり、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のタンパク質により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のタンパク質の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
【００６６】
〔８ａ〕本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
【００６７】
例えば、過敏性腸症候群に対して予防・治療効果を有する化合物をスクリーニングする場合、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の拘束ストレスに対する排便量変化を経時的に測定する。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のタンパク質の欠損や損傷などによって引き起こされる疾患に対して予防・治療効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な予防・治療剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
【００６８】
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたはその他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の過敏性腸症候群の患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、該化合物を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）の過敏性腸症候群の患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００６９】
〔８ｂ〕本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
【００７０】
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明のタンパク質の発現する組織で、本発明のタンパク質の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のタンパク質の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のタンパク質欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
【００７１】
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、本発明のタンパク質の発現を促進し、該タンパク質の機能を促進することができるので、例えば、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、下痢、逆流性食道炎、十二指腸炎など）、生殖器疾患（例、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、卵巣嚢腫など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、喘息など）、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病（統合失調症）、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、糖尿病、高血圧症、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群、動脈硬化、狭心症など）、膵臓疾患（例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など）、肝臓疾患（例、肝硬変など）、腎疾患（例、腎不全、尿毒症など）、癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫、精巣腫瘍、食道癌、筋肉腫など）などの予防・治療剤などの医薬として有用である。
【００７２】
また、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のタンパク質の発現を阻害し、該タンパク質の機能を阻害することができるので、例えば、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、下痢、逆流性食道炎、十二指腸炎など）、生殖器疾患（例、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、卵巣嚢腫など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、喘息など）、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病（統合失調症）、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、糖尿病、高血圧症、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群、動脈硬化、狭心症など）、膵臓疾患（例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など）、肝臓疾患（例、肝硬変など）、腎疾患（例、腎不全、尿毒症など）、癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫、精巣腫瘍、食道癌、筋肉腫など）などの予防・治療剤などの医薬として有用である。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたはその他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の過敏性腸症候群患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）の過敏性腸症候群患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００７３】
一方、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の過敏性腸症候群患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）の過敏性腸症候群患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、本発明のタンパク質のプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子導入動物）を作出すれば、特異的にそのポリペプチドを合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明のタンパク質そのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
【００７４】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ　　　　　：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ　　　　：相補的デオキシリボ核酸
Ａ　　　　　　：アデニン
Ｔ　　　　　　：チミン
Ｇ　　　　　　：グアニン
Ｃ　　　　　　：シトシン
ＲＮＡ　　　　　：リボ核酸
ｍＲＮＡ　　　　：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ　　　　：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ　　　　：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ　　　　：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ　　　　：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ　　　　　：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ　　　　：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ　　　　　：ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇｌｙ　　：グリシン
Ａｌａ　　：アラニン
Ｖａｌ　　：バリン
Ｌｅｕ　　：ロイシン
Ｉｌｅ　　：イソロイシン
Ｓｅｒ　　：セリン
Ｔｈｒ　　：スレオニン
Ｃｙｓ　　：システイン
Ｍｅｔ　　：メチオニン
Ｇｌｕ　　：グルタミン酸
Ａｓｐ　　：アスパラギン酸
Ｌｙｓ　　：リジン
Ａｒｇ　　：アルギニン
Ｈｉｓ　　：ヒスチジン
Ｐｈｅ　　：フェニルアラニン
Ｔｙｒ　　：チロシン
Ｔｒｐ　　：トリプトファン
Ｐｒｏ　　：プロリン
Ａｓｎ　　：アスパラギン
Ｇｌｎ　　：グルタミン
ｐＧｌｕ：ピログルタミン酸
【００７５】
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｍｅ　　　　　　：メチル基
Ｅｔ　　　　　　：エチル基
Ｂｕ　　　　　　：ブチル基
Ｐｈ　　　　　　：フェニル基
ＴＣ　　　　　　：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
Ｔｏｓ　　　　　：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ　　　　　：ホルミル
Ｂｚｌ　　　　　：ベンジル
Ｃｌ_２−Ｂｚｌ　　　　　：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ　　　　　：ベンジルオキシメチル
Ｚ　　　　　　　：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ　　　　：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ　　　　：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ　　　　　：ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＮＰ　　　　　：ジニトロフェニル
Ｔｒｔ　　　　　：トリチル
Ｂｕｍ　　　　　：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ　　　　：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ　　　　：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ　　　：３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ　　　　：１−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド
ＤＣＣ　　　　　：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
【００７６】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
実施例１で取得したヒトＴＣＨ２０４バリアント１タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するヒトＴＣＨ２０４バリアント１タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
実施例１および実施例２で用いられた合成ＤＮＡプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：４〕
実施例１および実施例２で用いられた合成ＤＮＡプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
実施例１、実施例２および実施例４で用いられた合成ＤＮＡプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕
実施例１、実施例２および実施例４で用いられた合成ＤＮＡプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕
実施例１で取得したプラスミドに挿入されているヒトＴＣＨ２０４バリアント１をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：８〕
実施例２で取得したヒトＴＣＨ２０４バリアント２タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：９〕
配列番号：８で表されるアミノ酸配列を有するヒトＴＣＨ２０４バリアント２タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕
実施例２で取得したプラスミドに挿入されているヒトＴＣＨ２０４バリアント２をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕
実施例３で取得したヒトＴＣＨ２０４バリアント３タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１２〕
配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を有するヒトＴＣＨ２０４バリアント３タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３〕
実施例３で取得したプラスミドに挿入されているヒトＴＣＨ２０４バリアント３の塩基配列を示す。
〔配列番号：１４〕
実施例４で用いられた合成ＤＮＡプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１５〕
実施例４で取得したヒトＴＣＨ２０４バリアント４タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１６〕
配列番号：１５で表されるアミノ酸配列を有するヒトＴＣＨ２０４バリアント４タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１７〕
実施例４で取得したプラスミドに挿入されているヒトＴＣＨ２０４バリアント４の塩基配列を示す。
〔配列番号：１８〕
実施例５で取得したマウスＴＣＨ２０４バリアント６タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１９〕
配列番号：１８で表されるアミノ酸配列を有するマウスＴＣＨ２０４バリアント６タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２０〕
実施例５で用いられたプライマーＦ０２の塩基配列を示す。
〔配列番号：２１〕
実施例５で用いられたプライマーＲ０２の塩基配列を示す。
〔配列番号：２２〕
実施例５で取得したプラスミドに挿入されているマウスＴＣＨ２０４バリアント６の塩基配列を示す。
〔配列番号：２３〕
実施例６で取得したマウスＴＣＨ２０４バリアント５タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２４〕
配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を有するマウスＴＣＨ２０４バリアント５タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２５〕
実施例６で取得したプラスミドに挿入されているマウスＴＣＨ２０４バリアント５の塩基配列を示す。
〔配列番号：２６〕
実施例７で取得したマウスＴＣＨ２０４バリアント２タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２７〕
配列番号：２６で表されるアミノ酸配列を有するマウスＴＣＨ２０４バリアント２タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２８〕
実施例７で取得したプラスミドに挿入されているマウスＴＣＨ２０４バリアント２の塩基配列を示す。
〔配列番号：２９〕
実施例８で用いられた合成ＤＮＡプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３０〕
実施例８で用いられた合成ＤＮＡプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３１〕
実施例８で用いられたＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ用合成ＤＮＡプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号：３２〕
実施例８で用いられた合成ＤＮＡプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３３〕
実施例８で用いられたＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ用合成ＤＮＡプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号：３４〕
実施例８で用いられた合成ＤＮＡプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３５〕
実施例８で用いられたＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ用合成ＤＮＡプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号：３６〕
実施例８で用いられた合成ＤＮＡプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３７〕
実施例８で用いられた合成ＤＮＡプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３８〕
実施例８で用いられたＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ用合成ＤＮＡプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号：３９〕
実施例８で用いられた合成ＤＮＡプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：４０〕
実施例８で用いられた合成ＤＮＡプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：４１〕
実施例８で用いられたＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ用合成ＤＮＡプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号：４２〕
実施例８で用いられた合成ＤＮＡプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：４３〕
実施例８で用いられた合成ＤＮＡプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：４４〕
実施例８で用いられたＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ用合成ＤＮＡプローブの塩基配列を示す。
【００７７】
後述の実施例１で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＯＰＯ１０／ｐＣＲＩＩ−ＴＣＨ２０４Ｖ１は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＯＰ１０／ｐＣＲＩＩ−ＴＣＨ２０４Ｖ１として、２００２年５月２７日から日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０５３として、２００２年５月１４日から日本国大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号の財団法人　発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ　１６７９４として寄託されている。
後述の実施例２で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＯＰＯ１０／ｐＣＲＩＩ−ＴＣＨ２０４Ｖ２は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＯＰ１０／ｐＣＲＩＩ−ＴＣＨ２０４Ｖ２として、２００２年５月２７日から日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０５４として、２００２年５月１４日から日本国大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号の財団法人　発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ　１６７９５として寄託されている。
後述の実施例５で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＯＰＯ１０／ｐＣＲＩＩ−ｍＴＣＨ２０４Ｖ６は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＯＰ１０／ｐＣＲＩＩ−ｍＴＣＨ２０４Ｖ６として、２００２年７月１６日から日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８１１９として寄託されている。
【実施例】
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ）に記載されている方法に従った。
【００７８】
実施例１
ヒトＴＣＨ２０４バリアント１遺伝子ｃＤＮＡのクローニング
以下の合成ＤＮＡプライマーを用い、ヒト肺由来のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法による増幅を行った。反応液の組成は、ヒト肺Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（クロンテック社製）２．０μｌ、２種の合成ＤＮＡプライマー（配列番号：３および配列番号：４）各２μＭ、０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）０．１２５μｌおよび酵素に付属のＰｙｒｏｂｅｓｔバッファーで、総液量は２０μｌとした。増幅のためのサイクルはサーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９４℃・５分間の加熱の後、９４℃・２０秒、７２℃・５分間のサイクルを５回、次いで９４℃・２０秒、７０℃・５分間のサイクルを５回、さらに９４℃・２０秒、６８℃・５分間のサイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で５分間保温した。次にＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅの蒸留水で５０倍希釈したＰＣＲ反応液５μｌ、合成ＤＮＡプライマー（配列番号：５および配列番号：６）各２μＭ、０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）０．３１３μｌおよび酵素に付属のＰｙｒｏｂｅｓｔバッファーで、総液量は５０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９４℃・５分間の加熱の後、９４℃・２０秒、７２℃・５分間のサイクルを５回、次いで９４℃・２０秒、７０℃・５分間のサイクルを５回、さらに９４℃・２０秒、６８℃・５分間のサイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で５分間保温した。増幅したＤＮＡを１．５％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約３．５ｋｂのバンドの部分をカミソリで切出し、ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて回収した。このＤＮＡを、ＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ　Ｄｕａｌ　Ｐｒｏｍｏｔｅｒ（インビトロジェン社製）のプロトコールに従ってｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクターへ、クローニングした。これを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ（インビトロジェン社製）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをカナマイシンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天に塗布し、白色を呈するクローンのみを滅菌した爪楊枝を用いて分離して形質転換体を得た。個々のクローンをカナマイシンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（キアゲン社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。塩基配列決定のための反応は、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｒｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行い、挿入されているｃＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサーＡＢＩ　ＰＰＩＳＭ　３１００アナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて解読した。
取得したプラスミドには３，５１７個の塩基配列が挿入されており（配列番号：７）、このｃＤＮＡ断片には１，１１８個のアミノ酸配列（配列番号：１）をコードするＯＲＦが存在した（配列番号：２）。配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質を、ヒトＴＣＨ２０４バリアント１タンパク質と命名した。上記ｃＤＮＡ断片（配列番号：７）を含むプラスミドを有する形質転換体を、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＴＯＰＯ１０／ｐＣＲＩＩ−ＴＣＨ２０４Ｖ１と命名した。
配列番号：２で表される塩基配列の２９１６番目はＡであるが、後述の実施例２、３および４で取得されたヒトＴＣＨ２０４の別種バリアントの対応する部位の塩基はＧであった。この塩基置換はＳＮＰによって生じたものであると考えられる。なお、この塩基は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の９７２番目のＧｌｎをコードするが、ＡからＧへの置換はアミノ酸置換を伴わない。
Ｂｌａｓｔ　Ｐ〔ヌクレイック　アシッド　リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．）第２５巻、３３８９頁、１９９７年〕を用いてＯＷＬに対してホモロジー検索を行ったところ、ヒトＴＣＨ２０４バリアント１タンパク質は、ニワトリのカルシウム依存性カリウムチャネルｃＳｌａｃｋ（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃：ＡＡＭ１８７７０）と７４．２％、ラットのカルシウム依存性カリウムチャネルＳｌａｃｋ（Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、第１巻、４６２頁、１９９８年、Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃：ＡＡＣ８３３５０）と６５．７％、ヒトのカリウムチャネルサブユニットタンパクＫＩＡＡ１４２２（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃：ＣＡＤ１３２４２）と６３．２％の相同性をそれぞれ示した。
また、疎水性解析ソフトによる解析およびＳｌａｃｋ、ＫＩＡＡ１４２２とのアミノ酸配列の比較（図１〜図３）から、ヒトＴＣＨ２０４バリアント１タンパク質は、６回膜貫通型で第５、第６膜貫通領域間にポア領域をもつ構造を有すると推定される。
以上から、ヒトＴＣＨ２０４バリアント１タンパク質をコードするｃＤＮＡはカルシウム依存性カリウムチャネルに属する新規遺伝子であると考えられる。カルシウム依存性カリウムチャネルはチャネルコンダクタンスによってＢｉｇ−Ｋ（コンダクタンス：１００−２２０ｐＳ）、Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ−Ｋ（コンダクタンス：２０−８５ｐＳ）、およびＳｍａｌｌ−Ｋ（コンダクタンス：２−２０ｐＳ）の３種に分類されている。ヒトＴＣＨ２０４バリアント１タンパク質は各ファミリーの代表的な分子との相同性を、〔表１〕に示す。表１において、ＢＫはＢｉｇ−Ｋを、ＩＫはＩｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ−Ｋを、ＳＫはＳｍａｌｌ−Ｋをそれぞれ示す。

【００７９】
実施例２
ヒトＴＣＨ２０４バリアント２遺伝子ｃＤＮＡのクローニング
以下の合成ＤＮＡプライマーを用い、ヒト精巣由来のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法による増幅を行った。反応液の組成は、ヒト精巣Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（クロンテック社製）２．０μｌ、２種の合成ＤＮＡプライマー（配列番号：３および配列番号：４）各２μＭ、０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）０．１２５μｌおよび酵素に付属のＰｙｒｏｂｅｓｔバッファーで、総液量は２０μｌとした。増幅のためのサイクルはサーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９４℃・５分間の加熱の後、９４℃・２０秒、６７℃・３０秒、７２℃・５分間のサイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃で５分間保温した。次にＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅの蒸留水で５０倍希釈したＰＣＲ反応液２μｌ、合成ＤＮＡプライマー（配列番号：５および配列番号：６）各２μＭ、０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）０．１２５μｌおよび酵素に付属のＰｙｒｏｂｅｓｔバッファーで、総液量は２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９４℃・５分間の加熱の後、９４℃・２０秒、６８℃・３０秒、７２℃・５分間のサイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃で５分間保温した。増幅したＤＮＡを１．５％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約３．５ｋｂのバンドの部分をカミソリで切出し、ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて回収した。このＤＮＡを、ＴＯＰＯＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ　Ｄｕａｌ　Ｐｒｏｍｏｔｅｒ（インビトロジェン社製）のプロトコールに従ってｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクターへクローニングした。これを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ（インビトロジェン社製）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをカナマイシンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天に塗布し、白色を呈するクローンのみを滅菌した爪楊枝を用いて分離して形質転換体を得た。個々のクローンをカナマイシンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（キアゲン社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。塩基配列決定のための反応は、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｒｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行い、挿入されているｃＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサーＡＢＩ　ＰＰＩＳＭ　３１００アナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて解読した。
取得したプラスミドには３，４９６個の塩基配列が挿入されており（配列番号：１０）、このｃＤＮＡ断片には１，１１１個のアミノ酸配列（配列番号：８）をコードするＯＲＦが存在した（配列番号：９）。配列番号：８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質を、ヒトＴＣＨ２０４バリアント２タンパク質と命名した。上記ｃＤＮＡ断片（配列番号：１０）を含むプラスミドを有する形質転換体を、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＴＯＰＯ１０／ｐＣＲＩＩ−ＴＣＨ２０４Ｖ２と命名した。
【００８０】
実施例３
ヒトＴＣＨ２０４バリアント３遺伝子ｃＤＮＡのクローニング
実施例２のヒトＴＣＨ２０４バリアント２遺伝子を取得するために使用したＰＣＲ産物と同じＤＮＡで形質転換した大腸菌クローンのなかの一部に本バリアントを保持するものが存在した。
取得したプラスミドは３，３４６個の塩基配列が挿入されており（配列番号：１３）、このｃＤＮＡ断片には１，０６１個のアミノ酸配列（配列番号：１１）をコードするＯＲＦが存在した（配列番号：１２）。配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質を、ヒトＴＣＨ２０４バリアント３タンパク質と命名した。上記ｃＤＮＡ断片（配列番号：１３）を含むプラスミドを有する形質転換体を、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＴＯＰＯ１０／ｐＣＲＩＩ−ＴＣＨ２０４Ｖ３と命名した。
【００８１】
実施例４
ヒトＴＣＨ２０４バリアント４遺伝子ｃＤＮＡのクローニング
以下の合成ＤＮＡプライマーを用い、ヒト精巣由来のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法による増幅を行った。反応液の組成は、ヒト精巣Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（クロンテック社製）２．０μｌ、２種の合成ＤＮＡプライマー（配列番号：５および配列番号：６）各２μＭ、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）０．１２５μｌおよび酵素に付属のＰｙｒｏｂｅｓｔバッファーで、総液量は２０μｌとした。増幅のためのサイクルはサーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９４℃・５分間の加熱の後、９４℃・１０秒、７２℃・７分間のサイクルを５回、次いで９４℃・１０秒、７０℃・７分間のサイクルを５回、さらに９４℃・１０秒、６８℃・７分間のサイクルを２５回繰り返し、最後に６８℃で１０分間保温した。次にＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅの蒸留水で５０倍希釈したＰＣＲ反応液２μｌ、合成ＤＮＡプライマー（配列番号：１４および配列番号：６）各２μＭ、０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）０．１２５μｌおよび酵素に付属のＰｙｒｏｂｅｓｔバッファーで、総液量は２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９４℃・５分間の加熱の後、９４℃・１０秒、７２℃・７分間のサイクルを５回、次いで９４℃・１０秒、７０℃・７分間のサイクルを５回、さらに９４℃・１０秒、６８℃・７分間のサイクルを２５回繰り返し、最後に７２℃で５分間保温した。増幅したＤＮＡを１．５％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約２．５ｋｂのバンドの部分をカミソリで切出し、ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて回収した。このＤＮＡを、ＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ　Ｄｕａｌ　Ｐｒｏｍｏｔｅｒ（インビトロジェン社製）のプロトコールに従ってｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクターへ、クローニングした。これを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ（インビトロジェン社製）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをカナマイシンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天に塗布し、白色を呈するクローンのみを滅菌した爪楊枝を用いて分離して形質転換体を得た。個々のクローンをカナマイシンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（キアゲン社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。塩基配列決定のための反応は、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｒｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行い、挿入されているｃＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサーＡＢＩ　ＰＰＩＳＭ　３１００アナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて解読した。
取得したプラスミドには２，５７６個の塩基配列が挿入されており（配列番号：１７）、このｃＤＮＡ断片には７５９個のアミノ酸配列（配列番号：１５）をコードするＯＲＦが存在した（配列番号：１６）。配列番号：１５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質を、ヒトＴＣＨ２０４バリアント４タンパク質と命名した。上記ｃＤＮＡ断片（配列番号：１７）を含むプラスミドを有する形質転換体を、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＴＯＰＯ１０／ｐＣＲＩＩ−ＴＣＨ２０４Ｖ４と命名した。
ヒトＴＣＨ２０４バリアント１タンパク質、ヒトＴＣＨ２０４バリアント２タンパク質、ヒトＴＣＨ２０４バリアント３タンパク質およびヒトＴＣＨ２０４バリアント４タンパク質の各アミノ酸配列を図４〜図６に示す。
【００８２】
実施例５
マウスＴＣＨ２０４バリアント６遺伝子ｃＤＮＡのクローニング
以下の合成ＤＮＡプライマーを用い、マウス脳由来のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法による増幅を行った。反応液の組成は、マウス脳Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（クロンテック社製）２．０μｌ、合成ＤＮＡプライマー（配列番号：２０および配列番号：２１）各２μＭ、０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）０．１２５μｌおよび酵素に付属のＰｙｒｏｂｅｓｔバッファーで、総液量は２０μｌとした。増幅のためのサイクルはサーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９４℃・５分間の加熱の後、９４℃・２０秒、６８℃・３０秒、７２℃・５分間のサイクルを４０回繰り返し、最後に７２℃で１０分間保温した。増幅したＤＮＡを１．５％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約３．５ｋｂのバンドの部分をカミソリで切出し、ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて回収した。このＤＮＡを、ＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ　Ｄｕａｌ　Ｐｒｏｍｏｔｅｒ（インビトロジェン社製）のプロトコールに従ってｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクターへクローニングした。これを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＴＯＰＯ１０　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ（インビトロジェン社製）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをカナマイシンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天に塗布し、白色を呈するクローンのみを滅菌した爪楊枝を用いて分離して形質転換体を得た。個々のクローンをカナマイシンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（キアゲン社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。塩基配列決定のための反応は、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｒｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行い、挿入されているｃＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサーＡＢＩ　ＰＰＩＳＭ　３１００アナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて解読した。取得したプラスミドには３，４９８個の塩基配列が挿入されており（配列番号：２２）、該ｃＤＮＡ断片には１，１３５個のアミノ酸配列（配列番号：１８）をコードするＯＲＦが存在した（配列番号：１９）。該アミノ酸配列を含有するタンパク質を、マウスＴＣＨ２０４バリアント６タンパク質と命名し、また、該ｃＤＮＡ断片を含むプラスミドを有する形質転換体を、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＴＯＰＯ１０／ｐＣＲＩＩ−ｍＴＣＨ２０４Ｖ６と命名した。
Ｂｌａｓｔ　Ｐ〔ヌクレイック　アシッド　リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．）第２５巻、３３８９頁、１９９７年〕を用いてＯＷＬに対してホモロジー検索を行ったところ、マウスＴＣＨ２０４バリアント６タンパク質はヒトＴＣＨ２０４バリアント１とは９６．４％の相同性を、ヒトのカルシウム依存性カリウムチャネルＳｌｏ４（ＷＯ　０２／４０６４９号公報記載）とは９７．５％の相同性を示した。また疎水性解析ソフトによる解析およびヒトＴＣＨ２０４、Ｓｌｏ４とのアミノ酸配列の比較から、該タンパク質は６回膜貫通型で、第５、第６膜貫通領域間に膜挿入領域をもつ構造を有すると推定された（図７〜９）。
以上から、マウスＴＣＨ２０４バリアント６タンパク質をコードするｃＤＮＡはカルシウム依存性カリウムチャネルに属する新規遺伝子であると考えられた。
カルシウム依存性カリウムチャネルはチャネルコンダクタンスによってＢｉｇ−Ｋ（コンダクタンス：１００−２２０ｐＳ）、Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ−Ｋ（コンダクタンス：２０−８５ｐＳ）、Ｓｍａｌｌ−Ｋ（コンダクタンス：２−２０ｐＳ）の３種に分類されているが、マウスＴＣＨ２０４バリアント６タンパク質とマウスの各ファミリーの代表的な分子との相同性を〔表２〕に示す。表２において、ＢＫはＢｉｇ−Ｋを、ＩＫはＩｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ−Ｋを、ＳＫはＳｍａｌｌ−Ｋをそれぞれ示す。

【００８３】
実施例６
マウスＴＣＨ２０４バリアント５遺伝子ｃＤＮＡのクローニング
実施例５で取得したＰＣＲ産物で形質転換した大腸菌クローンのなかの一部に、本バリアントを保持するものが存在した。取得したプラスミドは３，５２３個の塩基配列が挿入されており（配列番号：２５）、該ｃＤＮＡ断片には１，１４２個のアミノ酸配列（配列番号：２３）をコードするＯＲＦが存在した（配列番号：２４）。該アミノ酸配列を含有するタンパク質を、マウスＴＣＨ２０４バリアント５タンパク質と命名し、また、該ｃＤＮＡ断片を含むプラスミドを有する形質転換体を、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＣＲＩＩ−ｍＴＣＨ２０４Ｖ５と命名した。
【００８４】
実施例７
マウスＴＣＨ２０４バリアント２遺伝子ｃＤＮＡのクローニング
実施例５で取得したＰＣＲ産物で形質転換した大腸菌クローンのなかの一部に、本バリアントを保持するものが存在した。取得したプラスミドは３，４３０個の塩基配列が挿入されており（配列番号：２８）、該ｃＤＮＡ断片には１，１１１個のアミノ酸配列（配列番号：２６）をコードするＯＲＦが存在した（配列番号：２７）。該アミノ酸配列を含有するタンパク質を、マウスＴＣＨ２０４バリアント２タンパク質と命名し、また、該ｃＤＮＡ断片を含むプラスミドを有する形質転換体を、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＣＲＩＩ−ｍＴＣＨ２０４Ｖ２と命名した。
配列番号：２７で表される塩基配列の２，５４８番目はＣ、２，７４５番目はＡ、２，９４３番目はＡであるが、前述の実施例５、６で取得されたマウスＴＣＨ２０４の別種バリアントの対応する部位の塩基は各々Ｔ、Ｇ、Ｇであった。この塩基置換はＳＮＰによって生じたものであると考えられる。なお、これらの塩基置換はいずれもアミノ酸置換を伴わない。
【００８５】
実施例８
ヒトＴＣＨ２０４各バリアント遺伝子産物の組織分布の解析
ヒトＴＣＨ２０４各バリアント遺伝子配列から、各バリアント遺伝子の発現量を分別定量できるようプライマーおよびプローブ配列を以下のように設計した。
ヒトＴＣＨ２０４バリアント１に対しては配列番号：２９および配列番号：３０の合成ＤＮＡプライマーと、配列番号：３１のＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ用合成ＤＮＡプローブを、ヒトＴＣＨ２０４バリアント２に対しては配列番号：３２および配列番号：３０の合成ＤＮＡプライマーと、配列番号：３３のＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ用合成ＤＮＡプローブを、ヒトＴＣＨ２０４バリアント３に対しては配列番号：３２および配列番号：３４の合成ＤＮＡプライマーと、配列番号：３５のＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ用合成ＤＮＡプローブを、ヒトＴＣＨ２０４バリアント４に対しては配列番号：３６および配列番号：３７の合成ＤＮＡプライマーと、配列番号：３８のＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ用合成ＤＮＡプローブを、ヒトＴＣＨ２０４バリアント５に対しては配列番号：３９および配列番号：４０の合成ＤＮＡプライマーと、配列番号：４１のＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ用合成ＤＮＡプローブを、ヒトＴＣＨ２０４バリアント６に対しては配列番号：４２および配列番号：４３の合成ＤＮＡプライマーと、配列番号：４４のＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ用合成ＤＮＡプローブをそれぞれ設計した。
なお、ヒトＴＣＨ２０４バリアント５は、ＷＯ　０２／０５５７０１号公報でＰｏｔａｓｓｉｕｍ　Ｃｈａｎｎｅｌ　５４４１４として開示されている配列を示し、また、ヒトＴＣＨ２０４バリアント６は、ＷＯ　０２／４０４６９号公報でヒトＳｌｏ４として開示されている配列を示す。これらの配列は、ヒトＴＣＨ２０４バリアント１、バリアント２、バリアント３、バリアント４のいずれとも９５％以上の相同性を示すが配列は一致しなかった。
各ヒトＴＣＨ２０４バリアントの全長アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むプラスミドＤＮＡを標準ＤＮＡとして、特定のバリアントを定量するために設計したプライマーおよびプローブで目的としたバリアントのみを定量できるか調べたところ、ヒトＴＣＨ２０４バリアント１、ヒトＴＣＨ２０４バリアント３、ヒトＴＣＨ２０４バリアント４、ヒトＴＣＨ２０４バリアント５およびヒトＴＣＨ２０４バリアント６のプライマーおよびプローブでは、目的としたバリアントのみが定量されたが、ヒトＴＣＨ２０４バリアント２のプライマーおよびプローブでは、ヒトＴＣＨ２０４バリアント２以外に、ヒトＴＣＨ２０４バリアント１、ヒトＴＣＨ２０４バリアント４、ヒトＴＣＨ２０４バリアント５およびヒトＴＣＨ２０４バリアント６が定量されてしまうことがわかった。しかしながら、ヒトＴＣＨ２０４バリアント２と他のヒトＴＣＨ２０４バリアントの遺伝子配列の関係上、ヒトＴＣＨ２０４バリアント１、ヒトＴＣＨ２０４バリアント４、ヒトＴＣＨ２０４バリアント５およびヒトＴＣＨ２０４バリアント６の混同は避けられなかった。このため、ヒトＴＣＨ２０４バリアント２は、ヒトＴＣＨ２０４バリアント１、ヒトＴＣＨ２０４バリアント４、ヒトＴＣＨ２０４バリアント５およびヒトＴＣＨ２０４バリアント６の発現量を含めて定量を行い、その定量結果から、ヒトＴＣＨ２０４バリアント１、ヒトＴＣＨ２０４バリアント４、ヒトＴＣＨ２０４バリアント５およびヒトＴＣＨ２０４バリアント６のそれぞれの定量結果を差し引くことで、ヒトＴＣＨ２０４バリアント２の発現量を推定することにした。
ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍによる定量反応のための組成は、ヒト各種組織由来ｃＤＮＡ（クロンテック社製、Ｈｕｍａｎ　ＭＴＣ　ｐａｎｅｌ　Ｉ，　ＩＩ）０．８μｌ、ＴａｑＭａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社製）１０μｌ、各ヒトＴＣＨ２０４バリアント定量用に設計した合成ＤＮＡプライマー各０．２μＭおよび各ヒトＴＣＨ２０４バリアント定量用に設計したＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ用合成ＤＮＡプローブ０．２μＭで、総液量を２０ｕｌとした。各ｃＤＮＡでのグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）定量のための組成は、ヒト各種組織由来ｃＤＮＡ（クロンテック社製、Ｈｕｍａｎ　ＭＴＣ　ｐａｎｅｌ　Ｉ，　ＩＩ）０．８μｌ、ＴａｑＭａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社製）１０μｌ、ＧＡＰＤＨ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　４０２８６９（アプライドバイオシステムズ社製）付属の合成ＤＮＡプライマー各０．２μＭおよび同キット付属のＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ用合成ＤＮＡプローブ０．１μＭで、総液量は２０μｌとした。反応は、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７９００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、５０℃・２分間、９５℃・１０分間の保温の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分間のサイクルを４０回繰り返し、反応と同時に定量を行った。測定に使用したヒト各種組織由来ｃＤＮＡを〔表３〕に示す。

結果を図１３〜１８に示す。
結果は、各ｃＤＮＡ試料中での各ヒトＴＣＨ２０４バリアント遺伝子のＧＡＤＰＨ遺伝子発現量に対する相対的発現量、すなわち単位ｃＤＮＡ液量あたりの各ヒトＴＣＨ２０４バリアント遺伝子の発現量（コピー数／μｌ）を同単位液量あたりのＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量（コピー数／μｌ）で除した値として表した。
ヒトＴＣＨ２０４バリアント１は、卵巣、精巣にわずかに発現していた。
ヒトＴＣＨ２０４バリアント２定量系では、肺、小腸、卵巣、精巣、前立腺で発現が検出された。先述したようにヒトＴＣＨ２０４バリアント２はヒトＴＣＨ２０４バリアント１、ヒトＴＣＨ２０４バリアント４、ヒトＴＣＨ２０４バリアント５およびヒトＴＣＨ２０４バリアント６の発現量を含めて定量されるので、これらバリアントの発現量を差し引いてヒトＴＣＨ２０４バリアント２の発現量を推定しなければならない。この処理を行うと、肺、卵巣、精巣で検出された発現の大部分はヒトＴＣＨ２０４バリアント２に由来すると推定された。
ヒトＴＣＨ２０４バリアント３は、精巣以外の組織では発現が検出されず、精巣での発現もわずかであった。
ヒトＴＣＨ２０４バリアント４は、ヒトＴＣＨ２０４バリアント３と同様、精巣以外の組織では発現が検出されず精巣での発現もわずかであった。
ヒトＴＣＨ２０４バリアント５は、小腸、脾臓、卵巣、前立腺で発現が検出された。
ヒトＴＣＨ２０４バリアント６は、小腸・卵巣でわずかに発現が検出された。
【００８６】
実施例９
ヒトＴＣＨ２０４バリアント２遺伝子産物の電気生理学的特性
ヒトＴＣＨ２０４バリアント２がイオンチャネルを形成するか否かを決定するために、パッチクランプ法を用いて膜電位固定によるホールセル記録を実施した。
Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ　（ＡＭＡＸＡ社）を用いて、ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に組み込んだヒトＴＣＨ２０４バリアント２をＣＨＯ−Ｋ１細胞に一過性発現（７例）させ、２４ないし４８時間後に測定実験を実施した。対照にはベクターのみを導入した細胞（５例）を用いた。パッチ用電極には、ガラス管（ＧＣ１５０−１０、ハーバード・クラーク社）を用いチップ抵抗が５−１０メガオームになるよう加工した。充填液、細胞外液の組成は、文献（Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１巻、４６２−４６９頁、１９９８年）記載に従い、充填液は、ＫＣｌ　３２．５ｍＭ、Ｋ・ｇｌｕｃｏｎａｔｅ　９７．５ｍＭ、ＣａＣｌ_２　０．１ｍＭ、ＨＥＰＥＳ　１０ｍＭ（ＫＯＨでｐＨ７．２に調製）、細胞外液は、ＮａＣｌ　１４０ｍＭ、ＫＣｌ　３．０ｍＭ、ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ　１　．０ｍＭ、Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ　２９ｍＭ、ＨＥＰＥＳ　２５ｍＭ、ｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ　１μＭ（ＮａＯＨでｐＨ７．４に調製）とした。ホールセル記録は、パッチ用増幅器Ａｘｏｐａｔｃｈ　２００Ｂ（Ａｘｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いて保持膜電位を−８０ｍＶに固定し、２ｋＨｚのフィルタをかけてＡ／Ｄ変換器（Ｄｉｇｉｄａｔａ１３２０Ａ、Ａｘｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を介して５ｋＨｚでサンプリングした。これらの記録およびデータ処理はすべてｐＣＬＡＭＰ　８ソフトウェア（Ａｘｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）上で行った。安定的に記録されたヒトＴＣＨ２０４バリアント２導入細胞に、２０ｍＶ毎のステップパルスを３００ミリ秒間−１００ｍＶから＋１００ｍＶまで２秒間隔で与えたところ、対照細胞に比べて外向き整流成分をもつ電位依存的な電流の発生が認められた。結果を図１９に示す。この電流の平衡電位は細胞外液のＫ^＋イオン濃度に対して依存性を示した。これらの成績から、ヒトＴＣＨ２０４バリアント２タンパク質は、イオンチャネル、おそらくはＫ^＋イオンに選択的な電位依存性イオンチャネルを形成することが示された。
【００８７】
【発明の効果】
本発明のタンパク質、ポリヌクレオチドおよび抗体などは、例えば、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、下痢、逆流性食道炎、十二指腸炎など）、生殖器疾患（例、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、卵巣嚢腫など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、喘息など）、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病（統合失調症）、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、糖尿病、高血圧症、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群、動脈硬化、狭心症など）、膵臓疾患（例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など）、肝臓疾患（例、肝硬変など）、腎疾患（例、腎不全、尿毒症など）、癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫、精巣腫瘍、食道癌、筋肉腫など）などの診断マーカー等として有用である。該タンパク質、ポリヌクレオチドまたは抗体などを用いるスクリーニング法により得られる該タンパク質の活性を促進または阻害する化合物は、該タンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物、該タンパク質の発現を促進または阻害する化合物などは、例えば、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、下痢、逆流性食道炎、十二指腸炎など）、生殖器疾患（例、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、卵巣嚢腫など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、喘息など）、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病（統合失調症）、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、糖尿病、高血圧症、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群、動脈硬化、狭心症など）、膵臓疾患（例、膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など）、肝臓疾患（例、肝硬変など）、腎疾患（例、腎不全、尿毒症など）、癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫、精巣腫瘍、食道癌、筋肉腫など）などの予防・治療剤などとして使用することができる。好ましくは、消化器疾患、生殖器疾患、呼吸器疾患などの予防・治療剤である。
【００８８】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトＴＣＨ２０４バリアント１タンパク質、ＫＩＡＡ１４２２およびＳｌａｃｋのアミノ酸配列の比較を表す図である。図中、ＴＣＨ２０４Ｖ１は配列番号：１で表されるアミノ酸配列を示す。Ｓ１〜Ｓ６は膜貫通領域を、Ｐはポア領域を示す。□はＴＣＨ２０４Ｖ１に一致するアミノ酸を示す。（図２へ続く）
【図２】ヒトＴＣＨ２０４バリアント１タンパク質、ＫＩＡＡ１４２２およびＳｌａｃｋのアミノ酸配列の比較を表す図である。図中、ＴＣＨ２０４Ｖ１は配列番号：１で表されるアミノ酸配列を示す。Ｓ１〜Ｓ６は膜貫通領域を、Ｐはポア領域を示す。□はＴＣＨ２０４Ｖ１に一致するアミノ酸を示す。（図１の続き、図３へ続く）
【図３】ヒトＴＣＨ２０４バリアント１タンパク質、ＫＩＡＡ１４２２およびＳｌａｃｋのアミノ酸配列の比較を表す図である。図中、ＴＣＨ２０４Ｖ１は配列番号：１で表されるアミノ酸配列を示す。Ｓ１〜Ｓ６は膜貫通領域を、Ｐはポア領域を示す。□はＴＣＨ２０４Ｖ１に一致するアミノ酸を示す。（図２の続き）
【図４】ヒトＴＣＨ２０４バリアント１、ヒトＴＣＨ２０４バリアント２、ヒトＴＣＨ２０４バリアント３およびヒトＴＣＨ２０４バリアント４のアミノ酸配列の比較を示す図である。図中、ＴＣＨ２０４Ｖ１は配列番号：１、ＴＣＨ２０４Ｖ２は配列番号：８、ＴＣＨ２０４Ｖ３は配列番号：１１、およびＴＣＨ２０４Ｖ４は配列番号：１５で表されるアミノ酸配列をそれぞれ示す。Ｓ１〜Ｓ６は膜貫通領域を、Ｐはポア領域を示す。□はＴＣＨ２０４Ｖ１に一致するアミノ酸を示す。（図５へ続く）
【図５】ヒトＴＣＨ２０４バリアント１、ヒトＴＣＨ２０４バリアント２、ヒトＴＣＨ２０４バリアント３およびヒトＴＣＨ２０４バリアント４のアミノ酸配列の比較を示す図である。図中、ＴＣＨ２０４Ｖ１は配列番号：１、ＴＣＨ２０４Ｖ２は配列番号：８、ＴＣＨ２０４Ｖ３は配列番号：１１、およびＴＣＨ２０４Ｖ４は配列番号：１５で表されるアミノ酸配列をそれぞれ示す。Ｓ１〜Ｓ６は膜貫通領域を、Ｐはポア領域を示す。□はＴＣＨ２０４Ｖ１に一致するアミノ酸を示す。（図４の続き、図６へ続く）
【図６】ヒトＴＣＨ２０４バリアント１、ヒトＴＣＨ２０４バリアント２、ヒトＴＣＨ２０４バリアント３およびヒトＴＣＨ２０４バリアント４のアミノ酸配列の比較を示す図である。図中、ＴＣＨ２０４Ｖ１は配列番号：１、ＴＣＨ２０４Ｖ２は配列番号：８、ＴＣＨ２０４Ｖ３は配列番号：１１、およびＴＣＨ２０４Ｖ４は配列番号：１５で表されるアミノ酸配列をそれぞれ示す。Ｓ１〜Ｓ６は膜貫通領域を、Ｐはポア領域を示す。□はＴＣＨ２０４Ｖ１に一致するアミノ酸を示す。（図５の続き）
【図７】マウスＴＣＨ２０４バリアント６タンパク質、ヒトＴＣＨ２０４バリアント１タンパク質およびヒトＳｌｏ４タンパク質のアミノ酸配列の比較を表す図である。図中、ｍＴＣＨ２０４Ｖ６は配列番号：１８で表されるアミノ酸配列を、ｈＴＣＨ２０４Ｖ１は配列番号：１で表されるアミノ酸配列を、ＷＯ０２４０６４９．４はＳｌｏ４アミノ酸配列を示す。Ｓ１〜Ｓ６は膜貫通領域を、Ｐはポア領域を示す。□はｍＴＣＨ２０４Ｖ６に一致するアミノ酸を示す。（図８へ続く）
【図８】マウスＴＣＨ２０４バリアント６タンパク質、ヒトＴＣＨ２０４バリアント１タンパク質およびヒトＳｌｏ４タンパク質のアミノ酸配列の比較を表す図である。図中、ｍＴＣＨ２０４Ｖ６は配列番号：１８で表されるアミノ酸配列を、ｈＴＣＨ２０４Ｖ１は配列番号：１で表されるアミノ酸配列を、ＷＯ０２４０６４９．４はＳｌｏ４アミノ酸配列を示す。Ｓ１〜Ｓ６は膜貫通領域を、Ｐはポア領域を示す。□はｍＴＣＨ２０４Ｖ６に一致するアミノ酸を示す。（図７の続き、図９へ続く）
【図９】マウスＴＣＨ２０４バリアント６タンパク質、ヒトＴＣＨ２０４バリアント１タンパク質およびヒトＳｌｏ４タンパク質のアミノ酸配列の比較を表す図である。図中、ｍＴＣＨ２０４Ｖ６は配列番号：１８で表されるアミノ酸配列を、ｈＴＣＨ２０４Ｖ１は配列番号：１で表されるアミノ酸配列を、ＷＯ０２４０６４９．４はＳｌｏ４アミノ酸配列を示す。Ｓ１〜Ｓ６は膜貫通領域を、Ｐはポア領域を示す。□はｍＴＣＨ２０４Ｖ６に一致するアミノ酸を示す。（図８の続き）
【図１０】マウスＴＣＨ２０４バリアント６、マウスＴＣＨ２０４バリアント５およびマウスＴＣＨ２０４バリアント２のアミノ酸配列の比較を示す図である。図中、ｍＴＣＨ２０４Ｖ６は配列番号：１８で表されるアミノ酸配列を、ｍＴＣＨ２０４Ｖ５は配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を、ｍＴＣＨ２０４Ｖ２は配列番号：２６で表されるアミノ酸配列を示す。Ｓ１〜Ｓ６は膜貫通領域を、Ｐはポア領域を示す。□はｍＴＣＨ２０４Ｖ６に一致するアミノ酸を示す。（図１１へ続く）
【図１１】マウスＴＣＨ２０４バリアント６、マウスＴＣＨ２０４バリアント５およびマウスＴＣＨ２０４バリアント２のアミノ酸配列の比較を示す図である。図中、ｍＴＣＨ２０４Ｖ６は配列番号：１８で表されるアミノ酸配列を、ｍＴＣＨ２０４Ｖ５は配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を、ｍＴＣＨ２０４Ｖ２は配列番号：２６で表されるアミノ酸配列を示す。Ｓ１〜Ｓ６は膜貫通領域を、Ｐはポア領域を示す。□はｍＴＣＨ２０４Ｖ６に一致するアミノ酸を示す。（図１０の続き、図１２へ続く）
【図１２】マウスＴＣＨ２０４バリアント６、マウスＴＣＨ２０４バリアント５およびマウスＴＣＨ２０４バリアント２のアミノ酸配列の比較を示す図である。図中、ｍＴＣＨ２０４Ｖ６は配列番号：１８で表されるアミノ酸配列を、ｍＴＣＨ２０４Ｖ５は配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を、ｍＴＣＨ２０４Ｖ２は配列番号：２６で表されるアミノ酸配列を示す。Ｓ１〜Ｓ６は膜貫通領域を、Ｐはポア領域を示す。□はｍＴＣＨ２０４Ｖ６に一致するアミノ酸を示す。（図１１の続き）
【図１３】各種ヒト正常組織由来ｃＤＮＡにおけるヒトＴＣＨ２０４バリアント１遺伝子の発現量を表す図である。縦軸の相対的発現量は、各ｃＤＮＡ試料単位液量あたりのヒトＴＣＨ２０４バリアント１遺伝子発現量（コピー数／μｌ）を同単位液量あたりのＧＡＤＰＨ遺伝子発現量（コピー数／μｌ）で除した値を１００倍した値を示す。
【図１４】各種ヒト正常組織由来ｃＤＮＡにおけるヒトＴＣＨ２０４バリアント２遺伝子定量系での発現量測定結果を表す図である。縦軸の相対的発現量は、各ｃＤＮＡ試料単位液量あたりのヒトＴＣＨ２０４バリアント２遺伝子発現量（コピー数／μｌ）を同単位液量あたりのＧＡＤＰＨ遺伝子発現量（コピー数／μｌ）で除した値を１００倍した値を示す。
【図１５】各種ヒト正常組織由来ｃＤＮＡにおけるヒトＴＣＨ２０４バリアント３遺伝子の発現量を表す図である。縦軸の相対的発現量は、各ｃＤＮＡ試料単位液量あたりのヒトＴＣＨ２０４バリアント３遺伝子発現量（コピー数／μｌ）を同単位液量あたりのＧＡＤＰＨ遺伝子発現量（コピー数／μｌ）で除した値を１００倍した値を示す。
【図１６】各種ヒト正常組織由来ｃＤＮＡにおけるヒトＴＣＨ２０４バリアント４遺伝子の発現量を表す図である。縦軸の相対的発現量は、各ｃＤＮＡ試料単位液量あたりのヒトＴＣＨ２０４バリアント４遺伝子発現量（コピー数／μｌ）を同単位液量あたりのＧＡＤＰＨ遺伝子発現量（コピー数／μｌ）で除した値を１００倍した値を示す。
【図１７】各種ヒト正常組織由来ｃＤＮＡにおけるヒトＴＣＨ２０４バリアント５遺伝子の発現量を表す図である。縦軸の相対的発現量は、各ｃＤＮＡ試料単位液量あたりのヒトＴＣＨ２０４バリアント５遺伝子発現量（コピー数／μｌ）を同単位液量あたりのＧＡＤＰＨ遺伝子発現量（コピー数／μｌ）で除した値を１００倍した値を示す。
【図１８】各種ヒト正常組織由来ｃＤＮＡにおけるヒトＴＣＨ２０４バリアント６遺伝子の発現量を表す図である。縦軸の相対的発現量は、各ｃＤＮＡ試料単位液量あたりのヒトＴＣＨ２０４バリアント６遺伝子発現量（コピー数／μｌ）を同単位液量あたりのＧＡＤＰＨ遺伝子発現量（コピー数／μｌ）で除した値を１００倍した値を示す。
【図１９】ＴＣＨ２０４バリアント２をＣＨＯ−Ｋ１細胞に一過性発現させたときの電流−電位曲線を示す図である。保持膜電位は−８０ｍＶに固定した。●はヒトＴＣＨ２０４バリアント２ベクターを導入した細胞（７例）、〇はベクターのみを導入した細胞（５例）の平均値を示す。

Claims (40)

1. 配列番号：１、配列番号：８、配列番号：１１または配列番号：１５で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩。
2. 配列番号：１、配列番号：８、配列番号：１１または配列番号：１５で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質が、配列番号：１８、配列番号：２３または配列番号：２６で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質である請求項１記載のタンパク質またはその塩。
3. 配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩。
4. 配列番号：８で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩。
5. 配列番号：１１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩。
6. 配列番号：１５で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩。
7. 請求項１記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩。
8. 請求項１記載のタンパク質または請求項７記載の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
9. ＤＮＡである請求項８記載のポリヌクレオチド。
10. 配列番号：２、配列番号：９、配列番号：１２または配列番号：１６で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド。
11. 配列番号：１９、配列番号：２４または配列番号：２７で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド。
12. 請求項８記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
13. 請求項１２記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
14. 請求項１３記載の形質転換体を培養し、請求項１記載のタンパク質または請求項７記載の部分ペプチドを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする請求項１記載のタンパク質もしくは請求項７記載の部分ペプチドまたはその塩の製造法。
15. 請求項１記載のタンパク質もしくは請求項７記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬。
16. 請求項８記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
17. 請求項８記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬。
18. 請求項１記載のタンパク質もしくは請求項７記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体。
19. 請求項１８記載の抗体を含有してなる診断薬。
20. 請求項１８記載の抗体を含有してなる医薬。
21. 請求項８記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド。
22. 請求項２１記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
23. 請求項１記載のタンパク質もしくは請求項７記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、請求項１記載のタンパク質もしくは請求項７記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
24. 請求項１記載のタンパク質もしくは請求項７記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる、請求項１記載のタンパク質もしくは請求項７記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
25. 請求項２３記載のスクリーニング方法または請求項２４記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、請求項１記載のタンパク質もしくは請求項７記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩。
26. 請求項２５記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
27. 請求項８記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、請求項１記載のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
28. 請求項８記載のポリヌクレオチドを含有してなる、請求項１記載のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
29. 請求項２７記載のスクリーニング方法または請求項２８記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、請求項１記載のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩。
30. 請求項２９記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
31. 請求項１８記載の抗体を用いることを特徴とする請求項１記載のタンパク質の定量方法。
32. 請求項３１記載の定量方法を用いることを特徴とする請求項１記載のタンパク質の機能が関連する疾患の診断法。
33. 請求項１８記載の抗体を用いることを特徴とする、請求項１記載のタンパク質の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
34. 請求項１８記載の抗体を含有してなる、請求項１記載のタンパク質の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
35. 請求項３３記載のスクリーニング方法または請求項３４記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、請求項１記載のタンパク質の発現を促進または阻害する化合物またはその塩。
36. 請求項３５記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
37. 消化器疾患、生殖器疾患または呼吸器疾患の予防・治療剤である請求項１５、請求項１６、請求項２０、請求項２２、請求項２６、請求項３０または請求項３６記載の医薬。
38. 消化器疾患、生殖器疾患または呼吸器疾患の診断薬である請求項１７または請求項１９記載の診断薬。
39. 哺乳動物に対して、請求項２５、請求項２９または請求項３５記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする消化器疾患、生殖器疾患または呼吸器疾患の予防・治療方法。
40. 消化器疾患、生殖器疾患または呼吸器疾患の予防・治療剤を製造するための請求項２５、請求項２９または請求項３５記載の化合物またはその塩の使用。

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