CN113430260A - Sap作为牙周炎诊断标志物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医疗领域，具体而言，涉及SAP作为牙周炎诊断标志物的应用。本发明的发明人意外地发现，SAP在牙周炎的发生发展中起到重要作用。发明人利用SAP基因修饰小鼠、流式细胞术和转录组测序深入研究了SAP对牙周炎的作用和分子机制，进而发现，重度牙周炎患者牙龈局部SAP表达上调；SAP敲除小鼠建立牙周炎模型后，通过调控牙龈局部巨噬细胞向M1型极化，增强了破骨细胞活性，上调了炎性因子IL‑1β、IL‑6和TNF‑α的表达，明显加重了牙周炎的发展；测序结果发现SAP敲除后上调了Wnt/β‑catenin信号通路的抑制因子Sost、Dkk1的表达，可能与巨噬细胞和成骨细胞的相互作用有关。

Description

SAP作为牙周炎诊断标志物的应用
技术领域
本发明涉及生物医疗领域，具体而言，涉及SAP作为牙周炎诊断标志物的应用。
背景技术
牙周炎是由局部刺激因素和全身因素共同作用下的针对牙周支持组织(牙槽骨、牙周膜、牙龈和牙骨质)的慢性免疫炎性反应，临床表现为牙龈出血、牙周袋形成、牙槽骨吸收、牙齿松动和移位，最终导致牙齿脱落，严重影响患者美观、咀嚼、发音等各项生理功能，降低患者生存质量。牙周炎不仅会导致牙齿的脱落，同时还与动脉粥样硬化、类风湿性关节炎和糖尿病等全身性疾病息息相关，是一个亟需解决的重大的公共卫生问题。目前临床上牙周炎的治疗主要是在抗生素辅助下的，以机械清除、手术、激光等手段针对局部因素进行的对症治疗。由于治疗的疗程长，程序繁琐，患者难以坚持，临床治疗效果欠佳。因此，寻找出基于牙周炎的全身易感因素，能客观精准地判断牙周炎病理进程的生物标记物，从而揭示牙周炎发病的分子免疫机制，实现对牙周炎的早诊断和早干预具有重要的临床诊疗意义。
目前临床上对牙周炎的诊断主要由临床医生对患者进行专科的检查，如检查牙齿的牙周袋深度、附着丧失、松动度、牙龈状态等和通过影响学检查牙槽骨的吸收程度。这些检查方法具有较大的主观性，而且只能诊断已经发生牙周炎的患者，而对于牙周炎的潜在患者并不能进行早期的诊断和早期干预。特别是侵袭性的牙周炎患者，早期很难通过临床检查被诊断，当被临床诊断为侵袭性牙周炎时通常已是牙周炎晚期，无法保留患牙，从而对患者的美观、发音和咀嚼功能以及生活质量造成影响。
发明内容
本发明的第一方面涉及用于检测牙龈SAP(Serum amyloid P component，血清淀粉样P物质)表达量的检测剂在制备诊断牙周炎的试剂盒中的应用。
可选的，如上所述的应用，所述检测剂于转录水平对SAP表达量进行检测。
可选的，如上所述的应用，所述检测剂用于执行如下方法中的至少一种：
PCR法、共振光散射法和生物质谱法。
可选的，如上所述的应用，所述PCR法为实时荧光定量PCR和/或数字PCR。
可选的，如上所述的应用，所述试剂盒还含有探针、dNTP、DNA聚合酶、双链特异性荧光染料、内参引物以及水中的一种或多种。
可选的，如上所述的应用，所述检测剂于翻译水平对SAP表达量进行检测。
可选的，如上所述的应用，所述检测剂用于执行如下任一种方法：
生物质谱法、电泳法、色谱法、酶联免疫吸附试验、免疫荧光法、免疫化学发光法、免疫比浊法、免疫印迹法以及斑点印迹。
可选的，如上所述的应用，所述检测剂为抗体。
可选的，如上所述的应用，所述检测剂所检测的样本为牙龈组织。
本发明的第二方面涉及SAP表达量降低的非人动物在制备牙周炎非人动物模型中的应用。
本发明的第三方面涉及SAP表达量降低的非人动物在鉴别和/或测试药物中的用途；
所述药物用于预防和/或治疗的适应症为牙周炎和/或治疗与牙周炎相关的并发症。
SAP是正五聚体家族的一员，是一种主要由肝脏合成的血浆蛋白，在免疫调节和炎症性疾病中发挥作用，但目前尚无SAP在牙周炎中作用的报道。
本发明的发明人意外地发现，SAP在牙周炎的发生发展中起到重要作用。发明人利用SAP基因修饰小鼠、流式细胞术和转录组测序深入研究了SAP对牙周炎的作用和分子机制，进而发现，重度牙周炎患者牙龈局部SAP表达上调；SAP敲除小鼠建立牙周炎模型后，通过调控牙龈局部巨噬细胞向M1型极化，增强了破骨细胞活性，上调了炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达，明显加重了牙周炎的发展；测序结果发现SAP敲除后上调了Wnt/β-catenin信号通路的抑制因子Sost、Dkk1的表达，可能与巨噬细胞和成骨细胞的相互作用有关。这些结果说明SAP表达过高或过低都会促进牙周炎的发展，有鉴于此，SAP有望成为判断牙周炎病理进程的新型生物标记物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中人与小鼠组织中SAP的ELISA检测结果；(A)：正常人与重度牙周炎患者牙龈局部SAP的表达水平，n＝20；(B)：C57小鼠正常组和牙周炎组牙龈局部SAP的表达水平，n＝6；(C)：C57小鼠正常组和牙周炎组血清中SAP的表达水平，n＝6；(D)：C57小鼠正常组和牙周炎组肝脏中SAP的表达水平，n＝6。
图2为本发明一个实施例中小鼠上颌骨Micro-CT三维重建；(A)：各组小鼠具有代表性的上颌骨Micro-CT三维重建图；(B)：各组小鼠釉牙骨质界至牙槽嵴顶的距离统计结果，n＝6；其中***P<0.001,“n”表示样本量，“Lig”表示丝线结扎的牙周炎组，“Ctrl”表示对照组。
图3为本发明一个实施例中小鼠牙周组织H&E和TRAP染色；(A)：C57小鼠和SAP-KO小鼠牙周炎时牙周组织的代表性组织学图像，第一行是苏木素-伊红染色(比例尺:200μm)，第二行是TRAP染色(比例尺:100μm)，n＝6；(B)：由苏木素-伊红染色图测量釉牙骨质界至牙槽嵴顶的距离的统计结果；(C)：TRAP阳性细胞统计结果，n＝6；其中*P<0.05，“n”代表样本量，“B”代表牙槽骨，“R”代表牙根，“红色虚线”代表釉牙骨质界，“黑色虚线”代表牙槽嵴顶，“黑色箭头”所指是TRAP阳性细胞，“Lig”表示丝线结扎的牙周炎组。
图4为本发明一个实施例中小鼠牙龈组织免疫组化染色；(A)：C57小鼠和SAP-KO小鼠牙周炎时牙龈组织的代表性组织学图像，第一行是两组CD34阳性细胞的表达，第二行是两组CD45阳性细胞的表达(比例尺为50μm)；(B)：微血管密度的统计结果，n＝6；(C)：CD45阳性细胞数量统计结果n＝6；**P<0.01，“ns”表示无统计学差异，“n”表示样本量，“红色箭头”所指的是微血管，“黑色箭头”所指为CD45阳性细胞，“Lig”表示丝线结扎的牙周炎组。
图5为本发明一个实施例中小鼠牙周组织炎性因子的表达；(A)&(B)&(C)：分别是IL-1β、IL-6和TNF-α相对表达水平，通过RT-qPCR检测，n＝4；(D)&(E)&(F)：分别是IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白的表达水平，通过ELISA检测，n＝6；**P<0.01，***P<0.001，“n”表示样本量，“Lig”表示丝线结扎的牙周炎组。
图6为本发明一个实施例中小鼠牙龈组织F4/80免疫组化结果；(A)：C57小鼠和SAP-KO小鼠牙周炎时牙龈组织F4/80免疫组化结果的代表性图像(比例尺为50μm)；(B)：F4/80阳性细胞统计结果，n＝4；其中*P<0.05，“n”表示样本量，“Lig”表示丝线结扎的牙周炎组，“红色箭头”所指为巨噬细胞。
图7为本发明一个实施例中流式细胞术检测小鼠牙周炎时牙龈局部巨噬细胞的变化；(A)：C57牙周炎小鼠流式细胞术检测结果；(B)：SAP-KO牙周炎小鼠流式细胞术检测结果；(C)：两组小鼠M0型巨噬细胞数量统计结果，n＝6；(D)：两组小鼠M1型巨噬细胞数量统计结果，n＝6；(E)：两组小鼠M2型巨噬细胞数量统计结果，n＝6；(F)：两组小鼠M1型和M2型巨噬细胞比值，n＝6；*P<0.05，**P<0.01，“n”表示样本量，“Lig”表示丝线结扎的牙周炎组。
图8A～图8D为本发明一个实施例中转录组测序结果。图8A：差异基因热图；图8B差异基因变化情况，相比C57牙周炎小鼠，SAP-KO牙周炎小鼠有53个基因上调，92个基因下调；图8C：下调的差异基因通路富集情况；图8D：上调的差异基因通路富集情况。
图9为本发明一个实施例中Wnt信号通路差异基因。(A)：Wnt信号通路差异基因热图；(B)：Wnt信号通路差异基因的mRNA相对表达水平，n＝3；(C)&(D)：分别是Sost和Dkk1的mRNA相对表达水平，n＝6；*P<0.05，**P<0.01，“n”表示样本量，“Lig”表示丝线结扎的牙周炎组。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明涉及用于检测牙龈SAP表达量的检测剂在制备诊断牙周炎的试剂盒中的应用。
本发明发现了一种新的牙周炎标志物：SAP。
在本发明中，SAP单独出现时可同时指代其mRNA和蛋白。
本文使用的术语“标志物”或“生化标志物”指要用作分析患者实验样品的靶标的分子。本领域技术人员公知对某分子表达量的检测可从转录或翻译水平进行，因此，这样的分子靶标的实例是mRNA或蛋白。如本领域技术人员显而易见的，mRNA的检测不应当解释为限于上述基因直接转录得到的特定mRNA序列，例如，作为替代性的mRNA变体、短链或前-mRNA处理的结果。变体的核苷酸序列与对应的标志物序列具有95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性；短链则只要能代表全长mRNA本身的特异性序列都可胜任。显然地，mRNA水平的检测也可通过检测cDNA以进行。在本发明中用作标志物的蛋白预期包括所述蛋白的天然存在的变体以及所述蛋白或所述变体的片段，特别是免疫学上可检测的片段。免疫学上可检测的片段优选地包含所述标志物多肽的至少5、6、7、8、9、10、11、12、15或20个连续氨基酸。本领域的技术人员可认识到，由细胞释放的蛋白或存在于胞外基质中的蛋白可能受到损害(例如，在炎症过程中)，且可被降解或切割成这样的片段。某些标志物以无活性形式合成，其可以随后通过蛋白酶解来激活。如熟练的技术人员将明白的，蛋白或其片段也可以作为复合物的部分而存在。这样的复合物也可以用作本发明意义上的标志物。另外，或在替代方案中，标志物多肽或其变体可以携带翻译后修饰。翻译后修饰的非限制性实例是糖基化、酰化和/或磷酸化。
在一些实施方式中，所述检测剂于转录水平对SAP表达量进行检测。
在一些实施方式中，所述检测剂用于执行如下方法中的至少一种：
PCR法、共振光散射法和生物质谱法。
在一些实施方式中，所述PCR法为实时荧光定量PCR和/或数字PCR。
在一些实施方式中，所述试剂盒还含有探针、dNTP、DNA聚合酶、双链特异性荧光染料、内参引物以及水中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述双链特异性荧光染料定量选自溴化乙锭、SYBR Green、PicoGreen、RiboGreen中的任一种。
在一些实施方式中，所述水通常为核酸和/或无核酸酶的水。水可以为蒸馏水(Distilled Water)、去离子水(Deionized Water)或反渗水(Reverse osmosis Water)。
在一些实施方式中，所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4 DNA聚合酶、Klenow片段中的任一种。
内参引物即为用于检测参考标准品的引物，还可以理解为进一步包括mRNA测量标准化所需的样本和/或试剂。例如，RNA测量可通过一种或多种“持家”mRNA作为标准化的基准，这对于本领域技术人员是熟悉的。
在一些实施方式中，所述检测剂于翻译水平对SAP表达量进行检测。
在一些实施方式中，所述检测剂用于执行如下任一种方法：
生物质谱法、电泳法、色谱法、酶联免疫吸附试验、免疫荧光法、免疫化学发光法、免疫比浊法、免疫印迹法以及斑点印迹。
翻译水平的检测剂通常是特异性地检测SAP蛋白的试剂，例如，特异性结合SAP蛋白的凝集素、特异性结合SAP蛋白的适配体或特异性结合SAP蛋白的抗体及抗体片段。特异性的结合剂对其相应的靶分子具有至少107l/mol的亲和力。特异性的结合剂优选对其靶分子具有108l/mol、或更优选109l/mol的亲和力。技术人员将理解，使用术语“特异性的”表示，样品中存在的其它生物分子不与SAP蛋白的检测剂发生显著的结合。
在一些实施方式中，所述检测剂为抗体。
在一些实施方式中，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
在一些实施方式中，所述检测剂所检测的样本为牙龈组织。
根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种用于牙周炎的诊断、辅助诊断或预后分析的方法，所述方法包括：使用如上所述的检测剂/试剂盒测量巨噬细胞中SAP的含量。
SAP含量升高或者降低通常是显著性的，确定受试者和健康群体对照组/受试者的初始状态(baseline)相比，是否具有显著性的差异可用本领域公知的统计学方法进行，并使用置信区间和/或p值进行确认。在一些实施方案中，置信区间可以为90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％并且p值可以为0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001或0.0001。
受试者通常为哺乳动物，优选为灵长类动物，再优选为人。
根据本发明的再一方面，还涉及巨噬细胞中SAP表达量降低的非人动物在制备牙周炎非人动物模型中的应用。
SAP表达量降低的非人动物可通过本领域常规的基因沉默技术制备得到，这对本领域技术人员是熟悉的。例如，Cre-LoxP、TALEN、CRISPR等技术介导的基因敲除，miRNA，siRNA等介导的干扰基因表达的技术等。
非人动物通常是哺乳动物，优选啮齿动物，再优选小鼠(Mus musculus)。
小鼠品系可以选择BALB/c、C57BL、C3H/He、昆明小鼠、ICR、NIH、CFW、LACA、nude小鼠或Scid小鼠等，优选C57BL小鼠。
根据本发明的再一方面，本发明还涉及如上所述方法得到的动物在鉴别和/或测试药物中的用途；
所述药物用于预防和/或治疗的适应症为牙周炎和/或治疗与牙周炎相关的并发症。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1
一、实验材料
1.主要实验材料
二甲苯；无水乙醇；苏木素染色液；伊红染色液；％盐酸乙醇；中性树胶；4％多聚甲醛固定液；水合氯醛；EDTA脱钙液；柠檬酸、柠檬酸钠；PBS；BSA；甲醇；30％过氧化氢；异氟烷；总RNA提取试剂盒；PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser；
Figure BDA0002945667200000081
Premix Ex TaqTM；DEPC水；牛血清白蛋白；anti-CD34兔单克隆抗体；anti-CD45兔单克隆抗体；anti-SAP兔单克隆抗体；羊抗兔IgG多克隆抗体；DAB显色液；人SAP ELISA试剂盒；小鼠SAP ELISA试剂盒；小鼠IL-1β、IL-6、TNF-αELISA试剂盒；抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)试剂盒；防脱载玻片；手术刀柄；11号刀片；蚊式血管钳；1.5mL一次性注射器；5mL一次性注射器；眼科剪；线剪；5-0慕斯线；生理盐水；2mL一次采血管；EP管；1.5mL、2mL、15mL、50mL离心管；小鼠固定台；耳钉打孔器；称量纸。
2.主要实验仪器
4℃冰箱；-20℃冰箱；-80℃冰箱；超净工作台；荧光正置显微镜；高速低温离心机；台式高速离心机；普通PCR仪；荧光定量PCR仪；电泳仪；凝胶成像系统；制冰机；干燥箱；石蜡切片机；石蜡包埋机；组织自动脱水机；多功能酶标仪；灭菌蒸汽高压锅；摇床；磁力搅拌器；纯水仪；超微量紫外分光光度计；高速低温离心机；荧光正置显微镜；流式细胞仪；NanoDrop2000；Illumina Hiseq X-Ten。
3.主要引物
GAPDH
F:GTGAAGGTCGGTGTGAACGG
R:TCCTGGAAGATGGTGATGGG
IL-1β
F:GAAATGCCACCTTTTGACAGTG
R:TGGATGCTCTCATCAGGACAG
IL-6
F:CTGCAAGAGACTTCCATCCAG
R:AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG
TNF-α
F:TGTCTCAGCCTCTTCTCATT
R:TGATCTGAGTGTGAGGGTCT
4.组织样本
正常人和牙周炎患者牙龈组织样本各20例，来自2018年6月～2019年12月在广州医科大学附属口腔医院就诊的患者。正常组的样本来自无牙周炎症、存在第三磨牙需拔除者，在拔除第三磨牙后修整牙龈，利用眼科剪取一2mm×2mm大小的牙龈样本。牙周炎组的样本来自重度牙周炎患者，炎症处于进展期，牙齿无保留价值，在拔除患牙后修整牙龈，利用眼科剪取一2mm×2mm大小的牙龈样本。所有实验参与者在采样前均被告知样本采集的用途，并签署知情同意书。本研究通过了广州医科大学附属口腔医院伦理委员会的审核。
正常组纳入标准：
(1)年龄18～55岁；(2)牙周健康，无炎症情况；(3)存在第三磨牙需要拔除；(4)无其他系统性疾病；(5)一个月内无用药史；
牙周炎组纳入标准
(1)年龄18～55岁；(2)临床诊断为重度牙周炎，牙齿无保留价值；(3)牙周炎未行治疗，处于疾病进展期；(4)无其他系统性疾病；(5)一个月内无用药史；
5.实验动物
40只SAP基因敲除(SAP-KO)小鼠：SPF级，雄性，6周～8周龄，体重18～22g，由广东药科大学血管生物学研究所馈赠，背景为C57BL/6J。SAP-KO小鼠分为正常组与牙周炎组，每组各20只。
40只C57小鼠：SPF级，雄性，6周～8周龄，正常C57BL/6J小鼠，体重18～22g，购于广东省医学实验动物中心(许可证号：SCXK(粤)2018-0002)。C57小鼠为正常组与牙周炎组，每组各20只。
饲养条件：本实验所用动物均饲养于广州医科大学动物实验中心的SPF级动物房，每笼6只小鼠，温度控制在18℃～29℃，湿度控制在50％～60％，12h/12h昼夜交替，噪音<50dB，小鼠可自由进食、进水。每周更换2～3次饮用水，每周更换一次垫料。
饮用水：为高压灭菌后的蒸馏水，每周更换2～3次。
饲料：常规饲料，购买于广东省医学实验动物中心。
垫料：玉米芯垫料，使用前需高压灭菌，购买于广东省医学实验动物中心。
二、实验方法
1.酶联免疫吸附试验
1.1组织样本：
1)将组织样本在冰冷的PBS中冲洗，以彻底除去多余的血液，并称重。
2)将组织切成小块，倒入匀浆玻璃管中，按照组织重量加入适量ELISA试剂盒配套的裂解缓冲液，然后手工匀浆。
3)将所得悬浮液用超声细胞破碎仪超声处理，直至溶液澄清。
4)然后，将匀浆以10000×g离心5分钟，收集上清液并按照ELISA试剂盒相应步骤进行检测。
1.2血清样本
1)将血样收集到一次性采血管中(不含抗凝剂)，4℃冰箱静置过夜。
2)以1000×g离心20分钟，吸取上清液，即为血清，然后按照ELISA试剂盒相应步骤进行检测。
1.3牙周炎模型的建立
1)将小鼠放入装着异氟烷棉球的密封盒子5s，气体麻醉起效后称重。
2)根据小鼠重量腹腔注射4％水合氯醛(0.1mL/g)，观察小鼠麻醉情况。
3)麻醉起效后，通过胶带将小鼠固定在操作板上，并用丝线勾住小鼠上颌切牙，将小鼠口腔打开。
4)利用眼科镊和蚊式血管钳将5-0慕斯线压入小鼠左侧上颌第二磨牙牙颈部，确保慕斯线可以围绕牙齿自由转动后，在牙齿颈部腭侧打三重结，对侧不作任何处理视为对照组。
5)术后注意保暖，密切关注小鼠状态，麻醉过后，小鼠清醒即可放回笼子正常饲养。
1.4 Micro-CT扫描
1)建立牙周炎模型7天后通过吸入过量异氟烷处死小鼠。
2)利用剪刀取小鼠双侧上颌骨组织，生理盐水冲洗后立刻放入4％多聚甲醛固定液中固定24h。固定液体积应为组织体积的10倍以上。
3)组织固定完成后放入Micro-CT扫描仪进行扫描。参数设置：电压60kV,电流100μA，使用Al 0.5mm挡板，扫描层厚10μm。
4)扫描完成后，利用系统配套的NRecon和CTvox软件进行三维重建，利用Dataviewer软件分析上颌骨断层图像，截取上颌磨牙的近远中向矢状面，测量牙齿腭侧釉牙骨质界至牙槽嵴顶的距离。第一磨牙测量远中腭沟和远中尖两个位置，第二磨牙测量近中尖、远中尖和中央沟三个位置，第三磨牙测牙尖一个位置，一共测量6个位置，每个位置重复测量3次。所有测量结果的平均值作为该样本的牙槽骨吸收值。
1.5石蜡切片的制备
1)脱钙：将上颌骨组织从固定液中取出，用流动水冲洗干净后放入新的容器中，加入至少10倍体积的EDTA脱钙液进行脱钙处理，脱钙液每5天更换一次，一共脱钙处理4周。
2)冲洗：将脱钙完成的上颌骨组织放入石蜡包埋盒子，标记后用流动水冲洗30min，去除脱钙液。
3)脱水：将上颌骨组织放入组织自动脱水机进行脱水处理，脱水程序为依次将组织放入50％乙醇(90min)，70％乙醇(90min)，85％乙醇(90min)，95％乙醇(90min)，无水乙醇Ⅰ(60min)，无水乙醇Ⅱ(60min)。
4)透明：将脱水后的组织依次放入无水乙醇和二甲苯1:1的混合液(60min)，二甲苯Ⅰ(60min)，二甲苯Ⅱ(60min)。
5)浸蜡：将组织依次放入二甲苯+石蜡(1:1)中(120min)，石蜡Ⅰ(60min)，石蜡Ⅱ(60min)。
6)包埋：所有操作在石蜡包埋机上完成。将浸蜡后的组织置于不锈钢包埋底模中，并用镊子调整组织的位置，使上颌骨所有的磨牙都位于同一个平面上，加入包埋蜡，盖上包埋盒子，置于冷冻机上冷却固定。
7)切片：将冷却的石蜡块从不锈钢包埋底模中取出，固定在石蜡切片机上，修整蜡块后，手动切3μm厚度的连续切片。
8)贴片：将蜡带小心平铺在冷水中，使用防脱载玻片捞起，在放入50℃水浴箱中，蜡带展开后捞起，做好标记。
1.6苏木素伊红染色(H&E染色)
1)烤片：将载玻片放置于65℃干燥箱烤片20min。
2)脱水：将玻片依次放入二甲苯Ⅰ(15min)，二甲苯Ⅱ(20min)。
3)复水：将玻片依次放入无水乙醇Ⅰ(5min)，无水乙醇Ⅱ(5min)，95％乙醇(5min)，90乙醇(5min)，80％乙醇(5min)，流动水冲洗5min后晾干。
4)细胞核染色：将玻片放入苏木素中5min，流动水冲洗15min，1％盐酸乙醇分化20s，流动水冲洗10s后晾干。
5)细胞质染色：将玻片放入伊红染色液中3min，流动水冲洗30s。
6)脱水：将玻片依次放入80％乙醇(30s)，90％乙醇(2min)，95％乙醇(2min)，无水乙醇Ⅰ(5min)，无水乙醇Ⅱ(5min)。
7)透明：将玻片依次放入二甲苯Ⅰ(5min)，二甲苯Ⅱ(5min)。
8)封固：玻片晾干后，滴加适量中性树脂，缓慢盖上盖玻片，注意不要有气泡，室温下晾干。
1.7免疫组化
1)烤片：将载玻片放置于65℃干燥箱烤片20min。
2)脱蜡：将玻片依次放入二甲苯Ⅰ(15min)，二甲苯Ⅱ(20min)，无水乙醇Ⅰ(5min)，无水乙醇Ⅱ(5min)，95％乙醇(5min)，90乙醇(5min)，80％乙醇(5min)。PBS冲洗3次，每次5min。
3)抗原修复：将玻片浸泡在装有柠檬酸钠抗原修复液的盒子中，然后放入煮沸的高压锅中，高压高温处理10min后取出，室温静置，待修复液冷却至室温。PBS冲洗3次，每次5min。
4)去除内源性过氧化物酶：将玻片浸泡在装有3％H2O2甲醇溶液的盒子中，放入37℃干燥箱中处理30min。PBS冲洗3次，每次5min。
5)封闭：将玻片放在湿盒中，防止玻片干燥，滴加适量10％山羊血清，室温孵育30min。
6)孵育一抗：用滤纸吸掉部分山羊血清，滴加适量稀释后的一抗，将湿盒放在4℃冰箱孵育过夜。一抗孵育完成后，PBS冲洗3次，每次5min。
7)孵育二抗：滴加适量稀释后的二抗，湿盒内孵育60min。二抗孵育完成后，PBS冲洗3次，每次5min。
8)显色：滴加适量DAB显色液，于显微镜下观察，待显色满意即可中止显色。PBS冲洗3次，每次5min。
9)苏木素复染：将玻片置于苏木素染液中2min，流动水充分冲洗，1％盐酸乙醇分化2s，流动水充分冲洗。
10)脱水、透明：将玻片依次放入80％乙醇(30s)，90％乙醇(2min)，95％乙醇(2min)，无水乙醇Ⅰ(5min)，无水乙醇Ⅱ(5min)，二甲苯Ⅰ(5min)，二甲苯Ⅱ(5min)。
11)封固：玻片晾干后，滴加适量中性树脂，缓慢盖上盖玻片，注意不要有气泡，室温下晾干。
1.8 TRAP染色
根据制造商的说明，使用抗酒石酸酸性磷酸酶试剂盒对上颌骨石蜡切片进行染色，并在显微镜下观察牙槽骨边缘的TRAP染色阳性细胞，进行拍摄和计数。
1.9组织总RNA的提取
1)研钵加入适量液氮预冷，将组织样本加入研钵中，加入0.7mL裂解液(LysisBuffer与β-巯基乙醇1:1混合而成)，利用研磨杵将组织充分研磨后，将液体转移到2mL EP管中，再加入0.3mL无菌PBS冲洗研钵，将冲洗液也转移到EP管中。
2)将EP管中的悬液反复涡旋振荡，然后4℃，12000g，离心2min，吸取上清液，再将上清液按照同样的条件在离心一次，吸取上清液至EP管中。
3)将EP管中收集的上清液等比例添加70％乙醇，涡旋振荡至液体清澈。
4)将EP管中的液体加入吸附柱中，4℃，12000g，离心2min，弃流出液。
5)加入700μL Wash Buffer I至吸附柱中，4℃，12000g，离心2min，弃流出液。
6)加入500μL Wash Buffer II至吸附柱中，4℃，12000g，离心2min，弃流出液，重复一次该操作。
7)吸附柱放入离心机中，4℃，12000g，空甩2min，更换吸附柱的收集管。
8)加入10μL RNase-Free ddH2O，室温静置1min，4℃，12000g，离心2min，流出液即为RNA溶液。
9)取1μL RNA，利用超微量分光光度计测量并记录RNA浓度、A260/280值和A260/230值。
1.10 RNA逆转录
严格按照RNA逆转录试剂盒(Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser,TAKARA)进行。所有操作均在冰上进行。
1)去除基因组DNA，按以下反应体系配制混合液：
表1去除基因组DNA反应体系
Figure BDA0002945667200000141
反应条件：42℃2min，4℃∞。
(2)反转录反应，按以下反应体系配制混合液：
表2反转录反应体系
Figure BDA0002945667200000142
反应条件：37℃15min，85℃2s，4℃∞。
1.11实时荧光定量PCR反应
按照TAKARA公司的试剂盒SYBR Premix Ex TaqⅡ说明书配制反应液。DNA模板使用前稀释5倍，引物配制成100μM母液储存在-20℃，使用前需稀释成10μM的工作液。内参为GAPDH。
表3实时荧光定量PCR反应体系
Figure BDA0002945667200000151
该PCR为25μL的反应体系，每个样本设置3个复孔。反应条件为两步法。第一步：预变性，95℃30s，1个循环；第二步：扩增反应，95℃5s，60℃30s，共40个循环。PCR反应结束后，记录Ct值，并计算-2-ΔΔCt值作为样本mRNA的相对表达量。ΔCt＝Ct(样本)-Ct(内参)，ΔΔCt＝ΔCt(实验组)-ΔCt(对照组)。
实时荧光定量PCR所用引物由Primer 5软件设计，并经过Pubmed-Blast验证，委托上海生工生物工程有限公司合成。
表4引物列表
Figure BDA0002945667200000152
1.12流式细胞术
1.12.1组织单细胞悬液的制备
1)将组织剪碎至1～2mm3大小。
2)将组织放入灭菌研钵中，加入适量生理盐水，充分研磨。
3)将研磨液转移至15ml离心管中，加入适量消化液，置于摇床上室温消化30分钟。
4)加入1640培养基终止消化，收集细胞悬液，用300目尼龙网过滤，400g，4℃离心5min，弃上清。
5)加入2ml1640培养基重悬，300目尼龙网过滤，400g，4℃离心5min，弃上清。
1.12.2活死染料滴定
按照Zombie NIRTM Fixable Viability Kit说明书进行操作：
1)将100μL DMSO加入一瓶Zombie NIRTM染料中混匀，直至完全溶解，以1:1000的比例用PBS稀释Zombie NIRTM染料。
2)将分离好的单细胞悬液用PBS洗涤后计数。
3)用PBS稀释的Zombie NIRTM染料重悬，使细胞的浓度达到1×107个/mL。
4)室温避光孵育30min。
1.12.3细胞表面标记及上机
1)将上述活死染料滴定操作后的悬液加入2ml PBS洗液洗涤一次，置于流式管中。
2)向流式管中分别加入FITC-CD11b抗体1μL，PE-F4/80抗体1.5μL，Percp-CY5.5-CD16/32抗体5μL，PE-F4/80同型抗体1.5μL，涡旋振荡2s。
3)室温避光孵育25～30min。
4)向流式管内加入1mL染色缓冲液，400g室温离心5min，弃上清，涡旋振荡2s。
5)细胞通透和固定：加入500μL Fixation溶液，混匀细胞，室温避光放置20min。
6)500g室温离心5min，弃上清，涡旋振荡2s。
7)加入1mL 1×Perm/Wash溶液，500g室温离心5min，弃上清，涡旋振荡2s。
8)重复步骤(6)
9)向流式管内加入Apc-CD206抗体、Apc-CD206同型抗体各2.5μL，涡旋振荡2s。
10)4℃避光孵育30min。
11)加入1mL 1×Perm/Wash溶液洗涤细胞，500g室温离心5min，弃上清，涡旋振荡2s。
12)重复步骤(10)
13)染色缓冲液150μL重悬。
14)流式细胞仪上机检测。
1.13转录组测序
样本RNA的提取，cDNA文库的制备和生物学信息分析均委托上海元莘生物医药科技有限公司完成。
1.13.1 RNA的提取
1)按照制造商提供的操作手册，使用Trizol试剂分离和纯化样品的总RNA。
2)使用NanoDrop 2000定量每个样品的RNA量和纯度。Agilent 2100检测RIN值，要求RIN值不小于7.0。单次建库要求RNA总量≥25μg，浓度≥200ng/μL，OD260/280介于1.8～2.2之间。
1.13.2 cDNA文库的建立
1)利用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA。
2)在85℃下，用二价阳离子将富集的RNA切成小片段。
3)在逆转录酶的作用下，将裂解的RNA片段逆转录以合成一链cDNA，然后进行第二链合成，形成稳定的双链结构。
4)双链的cDNA结构为粘性末端，加入End Repair Mix将其补成平末端，随后在3'末端加上一个A碱基，准备将其连接至索引的衔接子。
5)每个衔接子包含一个T碱基突出端，用于将衔接子与A尾片段化DNA连接。将单索引或双索引衔接子连接至片段，并使用AMPureXP微珠进行大小选择。
6)对U碱基标记的第二链DNA进行不耐热的UDG酶处理后，在以下条件下通过PCR扩增连接的产物：98℃初始变性30min，98℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s的14个循环；然后在72℃下最后延伸5min。最终cDNA文库的平均插入片段大小为350bp(±50bp)。
7)最后，按照供应商推荐的方案在Illumina Hiseq X-Ten上进行了配对末端测序。
1.13.3生物信息学分析
1)首先，使用Cutadapt除去包含接头污染，低质量碱基和未确定碱基的读数。然后使用FastQC验证序列质量。
2)使用Hisat2将读取结果映射到Ensemble92中的小鼠基因组GRCm38。使用StringTie组装每个样品的映射读段。
3)将所有样本的转录组合并起来，使用perl脚本重建一个完整的转录组。最终转录组生成后，实验StringTie和ballgown被用来估计所有转录本的表达水平。
4)用R package edgeR分析，其中log2(倍数变化)>1或log2(倍数变化)<-1，并具有统计学意义(fdr<0.05)，被认为是差异表达的mRNA。
5)传统的单一富集分析方法被用于GO术语和途径的富集分析。富集P值的计算是通过Fisher的精确检验进行的。
三、实验结果
1、ELISA结果(图1)显示，相比正常人，重度牙周炎患者牙龈局部SAP表达水平明显升高(P<0.001)。
2、相比正常组，C57小鼠牙周炎组牙龈局部SAP表达上调(P<0.01)，而血清和肝脏中的表达没有统计学差异(图1)。
3、Micro-CT结果显示(图2)，与C57小鼠相比，SAP-KO小鼠牙周炎时釉牙骨质界至牙槽嵴顶的距离显著增加(P<0.001)。
4、H&E染色和TRAP染色结果(图3)显示，与C57小鼠相比，SAP-KO小鼠牙周炎时牙槽骨破坏更严重，破骨细胞数量增多(P<0.05)。
5、免疫组化结果显示(图4)，与C57小鼠相比，SAP-KO小鼠牙周炎时牙龈局部炎性新生微血管数量显著增加(P<0.01)，白细胞的数量也增多，但没有统计学差异。
6、RT-qPCR和ELISA结果显示(图5)，与C57小鼠相比，SAP-KO小鼠牙周炎时牙龈局部炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α升高(P<0.01)。
7、免疫组化结果显示(图6)SAP-KO小鼠牙周炎时牙龈局部巨噬细胞总数比C57小鼠升高(P<0.05)，流式细胞术的结果显示(图7)SAP-KO小鼠牙龈局部巨噬细胞总数增多，且向M1表型极化(P<0.05)。
8、转录组测序结果显示(图8A～D)，与C57牙周炎小鼠相比，SAP-KO牙周炎小鼠牙周组织中Wnt/β-catenin信号通路的抑制因子Sost和Dkk1显著上调，RT-qPCR结果显示了同样的结果(图9)(P<0.01)。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (11)

1.用于检测牙龈SAP表达量的检测剂在制备诊断牙周炎的试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测剂于转录水平对SAP表达量进行检测。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测剂用于执行如下方法中的至少一种：
PCR法、共振光散射法和生物质谱法。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述PCR法为实时荧光定量PCR和/或数字PCR。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还含有探针、dNTP、DNA聚合酶、双链特异性荧光染料、内参引物以及水中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测剂于翻译水平对SAP表达量进行检测。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测剂用于执行如下任一种方法：
生物质谱法、电泳法、色谱法、酶联免疫吸附试验、免疫荧光法、免疫化学发光法、免疫比浊法、免疫印迹法以及斑点印迹。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述检测剂为抗体。
9.根据权利要求1～8任一项所述的应用，其特征在于，所述检测剂所检测的样本为牙龈组织。
10.SAP表达量降低的非人动物在制备牙周炎非人动物模型中的应用。
11.SAP表达量降低的非人动物在鉴别和/或测试药物中的用途；
所述药物用于预防和/或治疗的适应症为牙周炎和/或治疗与牙周炎相关的并发症。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115078735A (zh) * 2022-06-24 2022-09-20 广州医科大学附属口腔医院 牙周炎诊断试剂盒和应用

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004180680A (ja) * 2002-11-22 2004-07-02 Takeda Chem Ind Ltd アポトーシス関連蛋白質およびその用途
WO2009018342A1 (en) * 2007-07-30 2009-02-05 The Regents Of The University Of Michigan Multi-analyte analysis of saliva biomarkers as predictors of periodontal and peri-implant disease
US20090326069A1 (en) * 2008-06-30 2009-12-31 Bltn, Llc Azelaic acid ester compositions and methods for diagnosing and treating tissue conditions using azelaic acid ester compositions and proteinaceous biomarkers
KR20110118762A (ko) * 2011-10-19 2011-11-01 경북대학교 산학협력단 인간치주인대 세포의 광물화-관련 유전자 및 치주질환 예방 또는 치료용 조성물
EP3284477A1 (en) * 2016-08-16 2018-02-21 Credentis AG Composition comprising self-assembling peptides for use in treatment of gingivitis, periodontitis and/or peri-implantitis
US20180320217A1 (en) * 2017-05-04 2018-11-08 The Procter & Gamble Company Methods for sampling and measuring oral lavage proteins
CN108929903A (zh) * 2018-04-23 2018-12-04 东莞市第五人民医院(东莞市太平人民医院) 用于慢性牙周炎筛查、诊断、疗效评价的标志物及试剂盒
CN111630390A (zh) * 2018-01-16 2020-09-04 皇家飞利浦有限公司 牙周疾病诊断方法、用途和试剂盒
CN112194726A (zh) * 2020-09-02 2021-01-08 沣潮医药科技（上海）有限公司 用于病理性蛋白聚集物清除的嵌合抗原受体及其应用

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004180680A (ja) * 2002-11-22 2004-07-02 Takeda Chem Ind Ltd アポトーシス関連蛋白質およびその用途
WO2009018342A1 (en) * 2007-07-30 2009-02-05 The Regents Of The University Of Michigan Multi-analyte analysis of saliva biomarkers as predictors of periodontal and peri-implant disease
US20090326069A1 (en) * 2008-06-30 2009-12-31 Bltn, Llc Azelaic acid ester compositions and methods for diagnosing and treating tissue conditions using azelaic acid ester compositions and proteinaceous biomarkers
KR20110118762A (ko) * 2011-10-19 2011-11-01 경북대학교 산학협력단 인간치주인대 세포의 광물화-관련 유전자 및 치주질환 예방 또는 치료용 조성물
EP3284477A1 (en) * 2016-08-16 2018-02-21 Credentis AG Composition comprising self-assembling peptides for use in treatment of gingivitis, periodontitis and/or peri-implantitis
US20180320217A1 (en) * 2017-05-04 2018-11-08 The Procter & Gamble Company Methods for sampling and measuring oral lavage proteins
CN111630390A (zh) * 2018-01-16 2020-09-04 皇家飞利浦有限公司 牙周疾病诊断方法、用途和试剂盒
CN108929903A (zh) * 2018-04-23 2018-12-04 东莞市第五人民医院(东莞市太平人民医院) 用于慢性牙周炎筛查、诊断、疗效评价的标志物及试剂盒
CN112194726A (zh) * 2020-09-02 2021-01-08 沣潮医药科技（上海）有限公司 用于病理性蛋白聚集物清除的嵌合抗原受体及其应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
L. L. SHORT等: "Association of amyloid P protein with pathology in periodontal tissues", 《JOURNAL OF ORAL PATHOLOGY & MEDICINE》 *
余挺等: "牙周炎对肥胖小鼠内脏重量和系数的影响", 《华西口腔医学杂志》 *
余挺等: "高脂软饲料增加肥胖复合牙周炎小鼠模型丝线松脱率的研究", 《口腔医学》 *
梁栋梁等: "SAP介导SOST/DKK1的表达参与巨噬细胞的极化促进牙周炎进展", 《第十四届全国口腔病理学术会议》 *
王洲等: "牙周炎对动脉粥样硬化影响的动物实验研究", 《华西口腔医学杂志》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115078735A (zh) * 2022-06-24 2022-09-20 广州医科大学附属口腔医院 牙周炎诊断试剂盒和应用

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