CN108866181A - Mboat1基因在子痫前期中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分子标志物在制备诊断及治疗子痫前期药物中的应用，涉及MBOAT1基因在子痫前期中的应用，通过检测受试者胎盘组织中MBOAT1基因及其表达产物的含量可以判断受试者是否患有子痫前期或者诊断受试者是否存在患有子痫前期的风险。另外，本发明通过研究体外培养的胎盘滋养层细胞的增殖指标证明MBOAT1基因可作为治疗子痫前期的药物靶点。

Description

MBOAT1基因在子痫前期中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种分子标志物在制备诊断及治疗子痫前期药物中的应用，更具体地涉及MBOAT1基因在子痫前期中的应用。

背景技术

妊娠期高血压疾病(Hypertensive disorder complicating pregnancy，HDCP)是妊娠期常见的合并症之一，是指妊娠20周以后出现的一过性高血压(收缩压≥140mm Hg(18.7k Pa)和/或舒张压≥90mm Hg(12.0k Pa))、水肿、蛋白尿等临床症状，分娩后即随之消失的疾病，其基本病理生理变化是全身小血管痉挛，全身各系统各脏器灌流减少，对母儿造成危害，甚至导致母儿死亡。HDCP依据williams产科学可细分为妊娠高血压、子痫前期(轻度、重度)、子痫、慢性高血压合并子痫前期、妊娠合并慢性高血压等亚型。子痫前期(preeclampsia，PE)是该疾病最常见的类型，是指在妊娠高血压的基础上伴有头痛、头晕、眼花、上腹不适、恶心等症状，预示子痫即将发生的阶段。据流行病学研究统计，子痫前期在世界范围的发病率是2.6％-7.6％，而我国发病率偏高，为9.4％，子痫前期妇女如果再次生育会面临同样甚至更大的风险，可导致各种严重的母儿并发症。迄今为止，子痫前期的病因及病理机制尚未完全阐明，临床上至今未找到理想的能够彻底治愈该病的方法，目前最彻底的治疗方法就是提前终止妊娠，对母儿造成极大危害。因此，子痫前期病因及病理机制的探讨一直是产科学研究的重要课题，其发病机制是多因素的，且目前尚不十分明确。现多数学者认为子痫前期的发生、发展的原因和过程可能与以下几种因素和学说相关：免疫失衡机制，胎盘浅着床，血管内皮细胞损伤和胎盘滋养细胞缺血，胰岛素抵抗，钙平衡失调，遗传因素、营养缺乏等。许多子痫前期患者在临床症状出现以前，胎盘的形态与功能方面的改变就己经出现，并且临床上大部分子痫前期患者在胎盘娩出后其临床症状和体征很快就随之消失；这均表明了胎盘在子痫前期疾病的发生发展过程中可能起到了关键作用。基础研究表明，子痫前期的发病机制可归纳为胎盘浅着床和全身血管内皮细胞的激活两个阶段；第一阶段的胎盘血液灌注减少，产生过多的活性氧，造成氧化应激，导致孕妇血管内皮细胞损伤，从而引发第二阶段全身血管内皮细胞的病理性损伤。全身血管内皮损伤和系统性炎症反应又加重了机体的氧化应激失衡，最终导致了子痫前期的一系列临床症状和体征。

目前，子痫前期己成为全球医生所面临的棘手的问题。正确的选择治疗方案，可减少因胎儿不成熟所导致的围产儿死亡，同时避免孕妇发生终末脏器不可逆的损害；从而有效降低孕产妇死亡率、围生儿死亡率及病残率。子痫前期的发病机制，至今尚不清楚。但是主要的几种假说大都将发病机制归结于妊娠早期胎盘形成过程中功能的受损。多种研究表明，子痫前期患者胎盘螺旋动脉腔狭窄、闭锁，诱发大量毒性因子、炎症介质，以及胎盘微血栓的形成；最终导致胎盘血流灌注量的减少，引发一系列妊娠期高血压疾病的症状。综合考虑众多学说，我们希望能够找到可用于子痫前期的诊断和治疗的分子标志物。这种探索的意义在于：对于子痫前期的预测、早期诊断、临床治疗、疗效评估；对于预测子痫前期病情进展、预后以及新生儿的预后都有重要价值。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，本发明的目的在于提供一种可用于子痫前期诊断的分子标志物。使用基因标志物来诊断子痫前期具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能确诊，提高治愈率。

根据本发明的一个方面，本发明提供了检测MBOAT1基因表达的产品在制备诊断子痫前期的制剂中的应用。

进一步，所述检测MBOAT1基因表达的产品包括检测MBOAT1基因mRNA水平的产品、和/或检测MBOAT1蛋白水平的产品。

进一步，所述检测MBOAT1基因表达的产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测MBOAT1基因及其表达产物的表达水平以诊断子痫前期的产品。

进一步，所述用RT-PCR诊断子痫前期的产品至少包括一对特异扩增MBOAT1基因的引物；所述用实时定量PCR诊断子痫前期的产品至少包括一对特异扩增MBOAT1基因的引物；所述用免疫检测诊断子痫前期的产品包括：与MBOAT1蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断子痫前期的产品包括：与MBOAT1基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断子痫前期的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与MBOAT1蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与MBOAT1基因的核酸序列杂交的探针。

所述实时定量PCR诊断子痫前期的产品至少包括的一对特异扩增MBOAT1基因的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

所述检测MBOAT1基因表达的产品可以是检测MBOAT1基因表达的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。

所述诊断子痫前期的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断子痫前期的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知MBOAT1基因的异常与子痫前期相关也属于MBOAT1基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种诊断子痫前期的产品，所述产品包括检测MBOAT1基因表达的试剂；所述试剂包括检测MBOAT1基因mRNA的引物和/或探针、检测MBOAT1蛋白的抗体。

所述产品包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。

其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测MBOAT1基因转录水平的针对MBOAT1基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的MBOAT1蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括MBOAT1基因在内的多个基因(例如，子痫前期相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括MBOAT1蛋白在内的多个蛋白质(例如与子痫前期相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与子痫前期相关的标志物同时检测，可大大提高子痫前期的诊断准确率。

其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测MBOAT1基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括MBOAT1蛋白的特异性抗体。

进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测MBOAT1基因表达水平过程中所需的试剂。

优选地，所述试剂包括针对MBOAT1基因的引物和/或探针。根据MBOAT1基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测MBOAT1基因表达水平的引物和探针。

所述试纸包括检测MBOAT1基因表达的试剂。

所述高通量测序平台包括检测MBOAT1基因表达的试剂。

与MBOAT1基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。

所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

进一步，所述MBOAT1蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述MBOAT1蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与MBOAT1蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。

在本发明的具体实施方案中，所述检测MBOAT1基因mRNA的引物包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对。

本发明还提供了MBOAT1基因和/或其表达产物在制备治疗子痫前期的药物中的应用。

进一步，所述药物包括MBOAT1基因或其表达产物的促进剂。所述促进剂包括促进MBOAT1基因表达的成分、促进MBOAT1基因表达产物稳定性的成分、促进MBOAT1基因表达产物活性的成分。

进一步，所述促进MBOAT1基因表达的成分包括促进基因转录的试剂、促进基因翻译的试剂、促进MBOAT1蛋白含量的试剂。

具体地，所述促进MBOAT1基因表达的成分包括：含有MBOAT1基因的试剂、携带MBOAT1基因的载体或宿主细胞所形成的试剂、含有MBOAT1蛋白质的试剂。

本发明的促进剂一方面可以用于补充内源性的MBOAT1蛋白的缺失或不足，通过提高MBOAT1蛋白的表达，从而治疗因MBOAT1蛋白缺乏导致的子痫前期；另一方面可以用于促进MBOAT1蛋白的活性或者功能，从而治疗子痫前期。

本发明所述携带基因的载体是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。

根据本发明的又一个方面，本发明还提供了一种用于治疗子痫前期的药物，所述药物包括上面所述的MBOAT1基因和/或其表达产物的促进剂。

进一步，本发明的药物还包括药学上可接受的载体，这类载体包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇等。

本发明的药物导入组织或者细胞的方式可以分为体外或者体内的方式。体外方式包括将含有MBOAT1基因的药物或者含有MBOAT1蛋白质的药物导入细胞中，再将细胞移植或回输到体内。体内方式包括直接将含有MBOAT1基因的药物或者含有MBOAT1蛋白质的药物注入体内组织中。

本发明的药物还可与其他治疗子痫前期的药物联用，多种药物联合使用可以大大提到治疗的成功率。

在本发明的上下文中，“MBOAT1基因”包括MBOAT1基因以及MBOAT1基因的任何功能等同物的多核苷酸。MBOAT1基因(Chromosome 6，NC_000006.12(20099684..20212464))可在国际公共核酸序列数据库GeneBank中查询到相关序列。

在本发明的上下文中，MBOAT1基因表达产物包括MBOAT1的mRNA，MBOAT1蛋白。MBOAT1蛋白包括MBOAT1全蛋白或其部分肽。所述部分肽含有与子痫前期相关的功能域。

“MBOAT1蛋白”包括MBOAT1蛋白以及MBOAT1蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括MBOAT1蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与MBOAT1的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。

通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是MBOAT1蛋白的融合蛋白。对于与MBOAT1蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留MBOAT1蛋白的生物学活性即可。

在本发明的上下文中，“诊断子痫前期”既包括判断受试者是否已经患有子痫前期、也包括判断受试者是否存在患子痫前期的风险。

在本发明的上下文中，“治疗”从疾病的状态变化来分，可以包括疾病的缓解、疾病的完全治愈、另外，还包括疾病的预防。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了MBOAT1基因表达与子痫前期相关，通过检测受试者胚胎组织中MBOAT1的表达，可以判断受试者是否患有子痫前期、或者判断受试者是否存在患有子痫前期的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

本发明发现了一种可以诊断子痫前期的分子标志物，该分子标志物可以区分正常人和子痫前期患者。

本发明发现了一种可以治疗子痫前期的药物，减少经济负担。

附图说明

图1是利用QPCR检测MBOAT1基因在子痫前期患者胚胎组织中的表达情况；

图2是利用Western blot检测MBOAT1蛋白在子痫前期患者胚胎组织中的表达情况；

图3是利用QPCR在转录水平上检测MBOAT1基因的过表达情况的影响图；

图4是利用Western blot在蛋白水平上检测MBOAT1蛋白的过表达情况的影响图；

图5显示MTT法检测MBOAT1对细胞增殖活性的影响图；

图6A显示利用transwell小室检测MBOAT1基因对细胞迁移的影响图；

图6B显示利用transwell小室检测MBOAT1基因对细胞侵袭的影响图。

具体实施方式

实施例1筛选子痫前期患者的胎盘组织中异常表达基因

1、样品收集

各收集43例子痫前期孕妇和正常孕妇的胎盘组织，生理盐水漂洗2次，去除水分后分装于冻存管内，-80℃保存备用。

胎盘组织排除多胎妊娠、传染性疾病、化学药物依赖、孕妇吸烟、胎儿先天畸形及其他妊娠合并症及并发症，所有纳入的研究对象均于收集标本前签署知情同意书。上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。每组各取6例标本进行基因表达谱的检测分析，进行差异表达基因的筛选，并在各组全部43例标本中进行验证实验。

2、RNA样品的制备

利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒提取胚胎组织中的总RNA，具体步骤参考说明书。

3、RNA样品的质量分析

将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量5μg，浓度≥200ng/μl，OD260/280介于1.8～2.2之间。

4、去除rRNA

使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA。

5、构建cDNA文库

利用Illumina TruseqTM RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建，具体操作按说明书进行。

6、上机测序

使用Illumina X-Ten测序平台对cDNA文库进行测序，具体操作按说明书进行。

7、高通量转录组测序数据分析

对测序结果进行生物信息学分析，利用TopHat v1.3.1进行RNA-seq读段定位，通过Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度，利用cuffdiff检测差异表达，当p值<0.05时，认为基因显著差异表达。

8、结果

RNA-seq结果显示，与正常孕妇的胎盘组织相比，MBOAT1基因在子痫前期胎盘组织中的表达量显著下调，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

实施例2 QPCR测序验证MBOAT1基因的差异表达

1、对MBOAT1基因差异表达进行大样本QPCR验证。

2、RNA提取

利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒提取胚胎组织中的总RNA，具体步骤参考说明书。

3、逆转录：

1)加入dNTP mixture1μl，Oligo dT primer 1μl，总RNA 2μg，加Rnase FreeddH₂O使总体积至10μl，在PCR仪上进行变性、退火反应，65℃，5min，反应完成后置于4℃。

2)构建20μl反应体系，继续加入5×Primer Script Buffer 4μl，RNaseInhibitor 0.5μl，Prime Script RTase 0.5μl，RNase Free dd H₂O 5.0μl，在PCR仪上按下列条件进行反转录反应：42℃15～30min，95℃5min，反应完成之后，置于冰上。

3)水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min，-20℃储存备用。

4、QPCR检测MBOAT1的表达水平

1)引物设计

根据Genebank中MBOAT1基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由博迈德生物公司合成。具体引物序列如下：

MBOAT1基因：

正向引物为5’-GCTTATGGATGCTATATGTC-3’(SEQ ID NO.1)；

反向引物为5’-AGGATGCTAATCAGTCTC-3’(SEQ ID NO.2)。

管家基因GAPDH的引物序列为：

正向引物：5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQ ID NO.3)

反向引物：5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.4)

2)PCR反应体系：正向引物和反向引物各1μl，SYBR Green PCR master mix10μl，cDNA 1μl，ddH₂O 7μl。

3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃10s，60℃30s，72℃15s)×40个循环，65℃～95℃，温度升高速度0.5℃/5s。在Bio-Rad iQ5荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、统计学方法

以GAPDH为内参，计算子痫前期胎盘组织与正常胎盘组织中MBOAT1荧光定量RT-PCR的实验结果，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，以P<0.05具有统计学差异。

6、结果

结果如图1所示，与正常孕妇相比，子痫前期孕妇中MBOAT1基因表达显著下调，差异具有统计学意义(P<0.05)。

胚胎组织中的阳性检出率＝下调表达例数/总检测例数×100％＝40/43×100％＝93.0％，提示检测胚胎组织中MBOAT1的表达水平可以用于子痫前期的辅助诊断。

实施例3 Western blot检测MBOAT1蛋白的表达水平

1、蛋白样品制备

按照EpiQuik组织/细胞总蛋白提取试剂盒的说明书进行蛋白提取的操作。

2、电泳

以β-actin为内参。50μg总蛋白经SDS-PAGE分后，电转移至PVDF膜，用含5％脱脂奶粉的1×TBST室温轻摇封闭1h；分别加入MBOAT1单抗和β-actin单抗，4℃过夜；1×TBST洗膜4次，加入二抗，室温孵育1h；1×TBST洗膜4次后，置于Super Signal化学发光试剂中反应2min，暗室中使X光片曝光，常规方法显影定影。

3、统计学处理

将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，将MBOAT1蛋白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

4、结果

统计结果如图2所示，与正常孕妇胎盘组织相比，子痫前期患者胎盘组织中MBOAT1蛋白水平显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

实施例4 MBOAT1基因过表达

1、MBOAT1基因表达载体的构建

根据MBOAT1基因的编码序列设计扩增引物。从cDNA文库(clontech公司)中扩增全长的MBOAT1基因的编码序列，上述cDNA序列经限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切后插入到经限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切的真核细胞表达载体pcDNA3.1中，连接获得的重组载体pcDNA3.1-MBOAT1用于后续实验。

2、胚胎组织细胞体外培养

将无菌获取的子痫前期的胚胎组织用PBS清洗后，用无菌手术剪刀反复剪切成约1mm x 1mm x 1mm的组织块，加入胶原酶II(0.5mg/ml)37℃、消化2h后，经200目纱网过滤，离心去上清后，将细胞重悬于DMEM培养液，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱内培养。每隔2天换液一次，待细胞生长至90％接触时进行传代，用PBS清洗后加入0.25％-EDTA胰蛋白酶消化使细胞从瓶壁上分离下来，用含胎牛血清的DMEM培养液终止胰酶消化反应，1000g离心2min，弃上清，用新配置的培养液重悬，以1:3～1:4比例传代，24小时后细胞进入对数生长期更换培养液，并根据实验要求给予不同的干预。

3、转染

将制备的胚胎细胞分为两组，分别为对照组(转染pcDNA3.1空载体)、和MBOAT1过表达组(转染pcDNA3.1-MBOAT1)。使用脂质体2000进行载体的转染，具体转染方法按照说明书的指示进行。pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1-MBOAT1的工作浓度均为0.5μg/ml。

4、QPCR检测

4.1提取细胞总RNA利用常规方法进行操作。

4.2逆转录和QPCR步骤同实施例2。

4.3结果

如图3所示，与转染pcDNA3.1空载体的细胞相比，转染pcDNA3.1-MBOAT1的细胞中MBOAT1的mRNA水平显著上调，差异具有统计学意义(P<0.05)

5、Western检测

5.1细胞总蛋白的提取

取对数期生长良好的胚胎细胞进行细胞总蛋白的提取，按照EpiQuik全细胞提取试剂盒的说明书进行蛋白提取的操作。

5.2Western blot检测

步骤同实施例3。

5.3结果

如图4所示，与转染pcDNA3.1空载体的细胞相比，转染pcDNA3.1-MBOAT1的细胞中MBOAT1的蛋白水平显著上调，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例5 MTT法检测胎盘滋养层细胞增殖活性

1、细胞转染后24h，0.25％胰蛋白酶消化，培养基重悬后计数，稀释细胞悬液，按每孔调整浓度控制在10⁴个/ml；

2、按每孔150μl将细胞接种至96孔板，复设5个平行孔；

3、分别于转染1～6天时，弃掉各孔培养基，加入MTT培养液100μl(0.5mg/ml)继续培养5h。弃去MTT培养液，每孔加入150μl DMSO溶解MTT还原物甲瓒，摇床上震荡10min，使结晶物充分溶解，酶联免疫仪检测450nm处吸光度值；

4、统计每天的细胞吸光度值，得到的数值用曲线图表示。

结果如图5所示，与转染pcDNA3.1空载体的细胞相比，转染pcDNA3.1-MBOAT1的细胞增殖速度明显缓慢。

实施例6细胞迁移实验

1、两组细胞转染后24h，常规消化、离心，用含有10g/L的无血清DMEM培养液重悬，调整细胞浓度为1×10⁵/ml；

2、取200μ1的细胞悬液接种至不铺Matrigel胶的Transwell小室上室中；

3、在24孔板下室加1ml含10％胎牛血清的DMEM培养液，将Transwell小室置于24孔板孔内，避免培养液与小室之间形成气泡；37℃，5％CO₂，常规培养48h；

4、取出小室，PBS淋洗，棉签小心擦净小室上室面的细胞，下室面用甲醇固定15min，1％结晶紫染色5min；200倍倒置显微镜下随机选取10个视野，计数穿过微孔膜下层的细胞数，取平均值，每组3个小室，重复3次。

结果如图6A所示，与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-MBOAT1组的穿膜细胞数显著减少，说明改变MBOAT1的表达水平可以改变子痫前期细胞的迁移能力，提示MBOAT1参与子痫前期细胞的转移过程。

实施例7 Transwell细胞体外侵袭实验

转染24h后收集不同组别的细胞，重悬于培养液中，使细胞终浓度为106/ml，吸取100μl细胞悬液加入Transwell小室中。应用Transwell小室方法观察MBOAT1基因过表达对细胞侵袭性的影响。

1、将Matrigel放入4℃融化，准备冰盒(冰浴环境)。Matrigel用RPIM-1640稀释后使用，终浓度为1mg/ml。

2、取出预冷的Transwell小室放入24孔板中，向每个Transwell小室膜上均匀加入稀释好的Matrigel胶50μ1，37℃，细胞培养箱放置3～4h使胶凝聚。

3、收集对数生长期的细胞，重悬于培养液中，终浓度为10⁶/ml，轻轻加100μ1细胞悬液入小室。

4、24孔板中加入600μ1含20％血清的培养基，37℃、5％CO₂孵箱内孵育36h。

5、棉签轻轻地擦净Transwell孔内Matrigel胶和细胞，用甲醛固定小室底端的细胞，室温放置25min，取出小室后晾干。

6、0.4％结晶紫染色10min，生理盐水快速洗涤三次，甩干后显微镜下观察，随机选择八个不同的视野照相并计数，统计结果并分析。

7、数据处理

用SPSS18.0软件对数据进行统计学分析。计量资料用均数±标准差表示。多个样本均数比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

8、结果

结果如图6B所示，pcDNA3.1组、pcDNA3.1-MBOAT1组细胞在Transwell小室中培养后，pcDNA3.1-MBOAT1组细胞膜下室面的细胞数下降，说明MBOAT1基因影响胎盘滋养层细胞的浸润，提示MBOAT1可作为潜在靶标应用于子痫前期孕妇的治疗。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 北京泱深生物信息技术有限公司

<120> MBOAT1基因在子痫前期中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcttatggat gctatatgtc 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aggatgctaa tcagtctc 18

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctctggtaaa gtggatattg t 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtggaatca tattggaaca 20

Claims (10)

1.检测MBOAT1基因表达的产品在制备诊断子痫前期的制剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测MBOAT1基因表达以诊断子痫前期的产品。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用RT-PCR诊断子痫前期的产品至少包括一对特异扩增MBOAT1基因的引物；所述用实时定量PCR诊断子痫前期的产品至少包括一对特异扩增MBOAT1基因的引物；所述用免疫检测诊断子痫前期的产品包括：与MBOAT1蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断子痫前期的产品包括：与MBOAT1基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断子痫前期的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；优选地，蛋白芯片包括与MBOAT1蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与MBOAT1基因的核酸序列杂交的探针。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断子痫前期的产品至少包括的一对特异扩增MBOAT1基因的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

5.一种诊断子痫前期的产品，其特征在于，所述产品包括检测MBOAT1基因表达的试剂；所述试剂包括检测MBOAT1基因mRNA的引物和/或探针、检测MBOAT1蛋白的抗体。

6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述检测MBOAT1基因mRNA的引物包括SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对。

7.MBOAT1基因和/或其表达产物在制备治疗子痫前期的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物包括促进MBOAT1基因表达的成分、促进MBOAT1基因表达产物稳定性的成分、促进MBOAT1基因表达产物活性的成分。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，促进MBOAT1基因表达的成分包括含有MBOAT1基因的试剂、携带MBOAT1基因的载体或宿主细胞所形成的试剂、含有MBOAT1蛋白质的试剂。

10.一种权利要求7-9中任一项所述的药物。