CN106906285A - Ankrd1作为舌鳞癌的诊治靶标 - Google Patents

Ankrd1作为舌鳞癌的诊治靶标 Download PDF

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Abstract

本发明公开了ANKRD1作为舌鳞癌的诊治靶标。据此可将ANKRD1用于开发诊断舌鳞癌的产品、开发治疗舌鳞癌的药物。本发明的研究成果为临床医师制定个性化治疗方案提供理论基础、并且能够为舌鳞癌药物的开发提供新的药物靶点。

Description

ANKRD1作为舌鳞癌的诊治靶标
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及ANKRD1基因在舌鳞癌的诊断、治疗中的用途。
背景技术
舌癌是口腔颌面部常见的恶性肿瘤之一，以鳞癌最为常见，居口腔癌之首。舌癌多发生于舌的中三分之一侧缘，恶性程度较高，局部浸润性强，常累及舌肌，使舌运动受限，影响讲话、进食以及吞咽功能。尽管在治疗方面取得了较大的进展，但是舌癌病人的存活率在过去近几十年内并没有明显的提高。
目前研究表明，吸烟、饮酒等化学因素、人乳头(状)瘤病毒(human papillomavirus，HPV)以及遗传因素改变与舌癌的发生发展密切相关。虽然研究者们已陆续发现近几十个瘤基因或抑瘤基因参与了舌癌的发生和发展，但到目前为止，舌癌发病的分子机制还未能明确，可能还存在其它肿瘤相关基因参与了舌癌的发病过程。因此，如果能寻找到舌癌特异性相关基因，这将有助于阐明舌癌发病的分子机制，也将为舌癌的诊断、治疗和预后提供分子靶标。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种通过检测ANKRD1基因或蛋白表达差异来诊断舌鳞癌的方法。
本发明的目的之二在于提供一种通过检测ANKRD1基因或蛋白表达差异来预测舌鳞癌预后的方法。
本发明的目的之三在于提供一种通过抑制ANKRD1基因或ANKRD1蛋白来治疗舌鳞癌的方法。
本发明的目的之四在于提供一种用于筛选治疗舌鳞癌的药物的方法。
本发明的目的之五在于提供一种用于治疗舌鳞癌的药物。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了检测ANKRD1基因或ANKRD1蛋白的产品在制备舌鳞癌诊断工具中的用途。
本发明还提供了检测ANKRD1基因或ANKRD1蛋白的产品在制备预测舌鳞癌预后工具中的用途。
进一步，所述检测ANKRD1基因或ANKRD1蛋白的产品包括检测ANKRD1基因或ANKRD1蛋白的表达水平的产品。所述产品包括能够结合ANKRD1基因的核酸或者能够结合ANKRD1蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测ANKRD1基因的表达水平；所述物质能够检测ANKRD1蛋白的表达水平。
本发明的检测ANKRD1基因的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该产品可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。
包含在上述产品中的核酸可以通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有期望核酸的基因，然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。
进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Amplification RefractoryMutation System，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。
上面所述的核酸包括扩增ANKRD1基因的引物，产品中包括的引物可以通过通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。
在本发明的具体实施方案中，所述核酸为QPCR实验中使用的扩增引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.1(正向序列)和SEQ ID NO.2(反向序列)所示。
上面所述的核酸还可包括探针，所述探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。
本发明的检测ANKRD1蛋白的产品可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以包括ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等。
本发明的检测ANKRD1蛋白的产品包括特异性结合ANKRD1蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)2、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。本发明的检测ANKRD1蛋白的产品可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。
抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的ANKRD1蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对ANKRD1蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。
标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用DMSO、缓冲剂、等准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH(DojindoLaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、碱性磷酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories)；过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2，B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH(DojindoLaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)555标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；及DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(Invitrogen Corporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。
作为依照本发明的检测产品的样品，可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样品不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。
在本发明的具体实施方案中，所述样品来自受试者的组织。
在本发明中，“预后”是指肿瘤患者在通过手术处理等抑制或缓解肿瘤生长后的过程或结果。在本说明书中，预后可以是通过手术处理抑制或缓解肿瘤生长后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20年或更久时的生机状态。预后可以通过检查生物标志物即ANKRD1蛋白或编码ANKRD1蛋白的基因来预测。预后预测可以这样进行：根据生物标志物的有或无，或者升高或降低，确定患者的预后是良好还是不良，或者确定良好预后或不良预后的概率。
在本发明中，“预后良好”是指在通过手术处理等为患者抑制或缓解肿瘤生长之后，患者长时期(例如3、5、6、7、8、9、10、15、20年或更长)没有危急状况。或者，预后好可以意指在这样长时间内存活、无转移、无复发、或无再发。例如，预后良好可以意指至少3年或尤其是至少5年存活，优选没有转移或复发。预后良好最优选的状态是长期无疾病的存活。如本文中所使用的，“预后良好”还可以包括任何这样的状态，其中可以发现疾病如转移，但是恶性低且不严重地影响生存能力。
在本发明中，“预后不良”是指患者在通过手术处理等抑制或缓解肿瘤生长后的短时期(例如1、2、3、4、5年或更短)内发生致命状况。或者，预后差是指在这样的短时期里死亡、转移、复发、或再发。例如，预后差可以意指至少3年或尤其至少5年内复发、转移、或死亡。
预测预后是指预测患者状况的过程或结果，并不意味着能以100％的准确度预测患者状况的过程或结果。预测预后是指确定某些过程或结果的可能性是否增加，而并不意味着通过与某些过程或结果不发生的情况比较来确定发生某些过程或结果的可能性。如本发明而言，本发明中ANKRD1基因或ANKRD1蛋白的水平升高的患者中，与不显示该特征的患者相比，更有可能观察到特定过程或结果。
进一步，所述检测ANKRD1基因或ANKRD1蛋白的产品可以是检测ANKRD1基因或ANKRD1蛋白的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。
本发明还提供了一种诊断舌鳞癌的工具，所述工具能够检测ANKRD1基因或ANKRD1蛋白的表达水平。所述工具包括能够结合ANKRD1基因的核酸或者能够结合ANKRD1蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测ANKRD1基因的表达水平；所述物质能够检测ANKRD1蛋白的表达水平。
进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。
进一步，所述诊断舌鳞癌的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断舌鳞癌的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知ANKRD1基因的异常与舌鳞癌相关也属于ANKRD1基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种预测舌鳞癌预后的工具，所述预测舌鳞癌预后工具包括能够结合ANKRD1基因的核酸或者能够结合ANKRD1蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测ANKRD1基因的mRNA水平；所述物质能够检测ANKRD1蛋白的表达水平。
进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。
进一步，所述预测舌鳞癌预后的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断舌鳞癌的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知ANKRD1基因的异常与舌鳞癌相关也属于ANKRD1基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗ANKRD1抗体或其片段所识别的氨基酸的数目没有特别限制，只要抗体能够结合ANKRD1即可。
本发明还提供了一种诊断舌鳞癌或预测舌鳞癌预后的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)获取受试者的样品；
(2)检测受试者样品中ANKRD1基因或蛋白的表达水平；
(3)将测得的ANKRD1基因或蛋白的表达水平与受试者的患病与否关联起来。
(4)与对照相比，ANKRD1基因或蛋白的表达水平升高，则该受试者被诊断为舌鳞癌，或该受试者被确定为预后不良。
本发明还提供了ANKRD1基因和/或其表达产物的抑制剂在制备治疗舌鳞癌的药物中的应用。所述抑制剂包括抑制ANKRD1基因表达的试剂、和/或抑制ANKRD1基因表达产物的试剂。
进一步，所述抑制ANKRD1基因表达的试剂包括抑制基因转录的试剂、抑制基因翻译的试剂；所述抑制ANKRD1基因表达产物的试剂包括抑制ANKRD1基因mRNA的试剂、抑制ANKRD1蛋白的试剂。所述抑制ANKRD1基因mRNA的试剂包括抑制mRNA稳定性的试剂、抑制mRNA翻译活性的试剂。所述抑制ANKRD1蛋白的试剂包括抑制ANKRD1蛋白稳定性的试剂、抑制ANKRD1蛋白活性的试剂、抑制ANKRD1蛋白功能的试剂。
进一步，抑制ANKRD1基因mRNA的试剂包括针对ANKRD1基因mRNA的双链核糖核酸；抑制ANKRD1蛋白功能的试剂包括ANKRD1抗原蛋白的肿瘤疫苗、抑制ANKRD1蛋白功能的抗体。所述抗体可以是多克隆抗体，或是单克隆抗体。
在本发明的具体实施方案中，所述针对ANKRD1基因mRNA的双链核糖核酸是siRNA。为了确保ANKRD1基因能够被高效剔除或沉默，根据ANKRD1基因的mRNA序列设计了siRNA特异性片段。siRNA的设计根据已发表的通用设计原则(Elbashir et.al 2001，Schwarzet.al 2003，Khvorova et.al 2003，Reynolds et.al 2004，Hsieh et.al 2004，Ui-Teiet.al 2004)，通过在线工具完成设计，该在线工具为：siRNASelectionProgram ofWhitehead Institute(BingbingYuan et.al 2004，http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/)和BLOCK-iTTM RNAi Designer ofINVITROGEN(winner of the 2004 Frost&Sullivan Excellence in Research Award，https://rnaidesigner.invitrogen.com/sirna/)。为了进一步提高siRNA片断的有效性，综合两个在线设计工具的优点来设计用于筛选的siRNA片断。最后，通过同源性比对(NCBI BLAST)来过滤siRNA序列，以提高siRNA片断的特异性并减少RNAi干扰的脱靶效应。
优选地，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供了一种用于治疗舌鳞癌的药物组合物，所述药物组合物包括上面所述的ANKRD1基因和/或其表达产物的抑制剂。
本发明的药物组合物还包括药学上可接受的载体，其中该载体可为赋形剂、稀释剂、增稠剂、填充剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、油脂或非油脂的基剂、表面活性剂、悬浮剂、胶凝剂、辅助剂、防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、着色剂或香料其中之一或两者以上的混合。
本发明的药物组合物可用于制造治疗舌鳞癌的药剂。
本发明的药物组合物首选应用于哺乳动物，其中该哺乳动物优选为人类病患。
本发明的药物组合物可例如以口服、注射等方式给予至该人类病患体内。
本发明的药物组合物还可与其他治疗舌鳞癌的药物联用，多种药物联合使用可以大大提到治疗的成功率。
本发明还提供了一种肿瘤药物的筛选方法，可以通过在对癌细胞添加测试药物后或在对肿瘤模型动物施用测试药物后的某个时期测量ANKRD1基因或者ANKRD1蛋白的表达水平来测定肿瘤药物改善肿瘤预后的效果。更具体地说，当ANKRD1基因或者ANKRD1蛋白的表达水平在添加或施用测试药物后降低或者恢复正常水平时，可选择该药物作为改善肿瘤预后的治疗药物。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了ANKRD1基因表达与舌鳞癌相关，通过检测受试者组织中ANKRD1的表达，可以判断受试者是否患有舌鳞癌、或者判断受试者是否存在患有舌鳞癌的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
在基因水平上进行口腔癌的早期诊断已经成为了口腔癌领域的发展趋势，申请号为：201611136247.1、201511009921.5、201511009794.9、201610245087.8、201610277716.5、201511009921.5、201610798012.2专利文献均披露了可以用于口腔癌或者舌鳞癌诊断的基因标志物，本发明发现了一种新的分子标记物-ANKRD1基因，能够实现舌鳞癌的早期诊断，从而降低舌鳞癌的死亡率。
附图说明
图1显示利用RT-PCR检测ANKRD1基因在舌鳞癌组织与正常组织中的表达差异图；
图2显示利用Western blot检测ANKRD1蛋白在舌鳞癌组织与正常组织中的表达差异图；
图3显示利用Western blot检测siRNA对ANKRD1基因表达的抑制效果图；
图4显示ANKRD1基因表达对舌鳞癌细胞增殖的影响图；
图5显示ANKRD1基因表达对舌鳞癌细胞迁移的影响图；
图6显示ANKRD1基因表达对舌鳞癌细胞成瘤的影响图。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 ANKRD1基因的差异表达
1、实验材料
5例舌鳞癌组织标本取自口腔颌面外科手术病人，其中，高分化鳞癌2例，中分化鳞癌2例，低分化鳞癌1例；包括男性2例，女性3例。同时，选取每一例癌组织癌肿周围>5cm处正常组织为自身对照。所有患者就诊前均未经过化疗、放疗、生物治疗及其它针对肿瘤的治疗。取材后一部分组织立即放入液氮中储存备用。
2、RNA提取、cDNA合成
Trizol RNA试剂(Invitrogen公司)抽提总RNA，经紫外分光光度计(ND-1000,NanoDrop公司)和琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA；按照Qiagen公司说明书,经RNeasy MinEluteCleanup Kit纯化得到mRNA；mRNA经Poly-A RNA Controlkit(Affymetrix公司)反转录合成双链cDNA，并纯化；
3、生物素标记cRNA杂交
以cDNA为模板,应用MessageAmpTM II-Biotin Arna Amplification Kit(Ambion公司)体外转录合成生物素标记cRNA，纯化后按Affymetrix公司的真核生物表达谱单轮芯片扩增程序加入5×片段化缓冲液得到大小分布在35～200nt的片段化cRNA；靶标制备完成后,应用真核生物Hybridization Control Kit(Affymetrix公司)配制杂交液,注入杂交液的芯片平衡放置于杂交炉中,45℃,60r/min旋转杂交16h(Hybridization Oven 640,Affymetrix公司)，然后在Affymetrix公司提供的洗涤工作站中(Fluidics Station 450，Affymetrix公司)完成芯片的清洗染色；
4、扫描和分析
应用 Scanner 3000(Affymetrix公司)扫描仪扫描图像。扫描图像首先用 Operating Software Version1.4(GCOS 1.4,Affymetrix公司)软件进行图像到信号值的转换,转换成原始数据文件。然后使用软件dChip 2006中的invariant setNormalization方法和Model-base ExpressionIndex模型对GCOS输出结果进行进一步的数据分析。根据在各芯片中检测到的P值，当数据集的检测值Call值(Absolute Call,AbsCall)为不存在A(Absent)或者临界值M(Marginal)时,被视为不表达,只有Abs Call值为存在P(present)的数据集才被用于进一步的分析。
5、组织差异表达基因的筛选
差异表达基因的筛选利用Significant Analysis of Microarray Software(SAM)算法进行。
6、结果
芯片共筛选出859个差异表达基因。与正常组织相比，舌鳞癌组织中表达上调的基因为517个，表达下调的基因为342个。
实施例2 差异表达基因在大样本中的验证
1、研究对象
按照实施例1的方法收集舌鳞癌组织标本45例，正常组织标本50例。
2、RNA提取和cDNA合成
按照实施例1的方法进行RNA提取和cDNA合成。
3、RT-PCR
引物是由引物设计软件Primer 5.0设计，大连宝生物公司与上海英骏公司合成。ANKRD1基因及内参基因所用引物序列如下：
ANKRD1基因引物序列
5’-AGACAGAGAAGGAGATAC-3’(SEQ ID NO.1)，
5’-GCCATACATAATCAGGAG-3’(SEQ ID NO.2)；
GAPDH基因引物序列
5’-AAGGTCGGAGTCAACGGATTTG-3’(SEQ ID NO.3)，
5’-CCATGGGTGGAATCATATTGGAA-3’(SEQ ID NO.4)。
取1μl cDNA产物进行PCR扩增，反应条件为：95℃变性，5min；95℃30s,58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物扩增后于1％琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察，VDS凝胶成像仪上照相。利用凝胶图像分析软件Bandleader分析得出ANKRD1基因和GAPDHPCR产物条带吸收光度值，然后计算ANKRD1基因和GAPDH吸收光度值的相对比值，用以表示目的基因的相对表达强度。
4、细胞总蛋白的提取
按照EpiQuik全细胞提取试剂盒的说明书进行蛋白提取的操作。
5、Western blot检测
总蛋白用Brandford法定量，取适量与样品缓冲液混合煮沸5min，冷却5min；取30pg蛋白上样到制备好的15％聚丙烯酰胺凝胶，进行电泳，开始设为80V恒压，看见Marker后增加至120V；将电泳后的胶取出，使用Bio.Rad半干转印系统于100V转移50min；转膜完毕后，用1xPBS洗一次，浸入封闭液，40℃过夜；倒掉封闭液，加入Western洗涤液洗涤5-10min，加入一抗摇床室温杂交2h；按照适当比例用Western二抗稀释液稀释于封闭缓冲液中，孵育60min；洗膜液洗3次，每次10min；使用ECL试剂显影、定影检测蛋白表达。
6、统计学处理
将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，将ANKRD1蛋白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
7、结果
结果如图1和图2所示，与正常组织相比，舌鳞癌组织中ANKRD1的表达水平显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例3 ANKRD1基因的表达对舌鳞癌细胞增殖能力的测定
1、干扰ANKRD1基因表达
1.1 siRNA合成
根据ANKRD1基因的mRNA序列设计并合成siRNA序列siRNA-ANKRD1：
正义链为5’-ACAAACAUCUGGAUUGUUCUU-3’(SEQ ID NO.5)；
反义链为5’-GAACAAUCCAGAUGUUUGUGA-3’(SEQ ID NO.6)，
以上siRNA序列与阴性对照siRNA序列(siRNA-NC)(阴性对照组siRNA与ANKRD1基因的序列无同源性)均由上海吉玛制药技术有限公司提供。
1.2 舌鳞癌细胞的培养与转染
人舌鳞癌细胞株HN4培养于含10％FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养基中。所有细胞放在含5％CO2的37℃细胞培养箱中。转染前24h将细胞以2×105/孔接种于6孔板，加入DMEM/F12培养基，贴壁过夜，待细胞汇合达80-90％时进行转染。转染前更换为不含血清的DMEM/F12培养基。用250μl DMEM/F12稀释siRNA(终浓度为33nM)，轻轻吹吸3-5次混匀。轻轻颠倒混匀转染试剂，用250μl DMEM/F12培养基稀释5μl脂质体2000，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置5min。混合转染试剂和siRNA稀释液，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置20min。将转染复合物加入到6孔细胞板中，前后轻摇细胞板混合均匀。细胞板置于37℃、5％CO2培养箱中培养。转染6h换含血清的DMEM/F12培养基。
1.3 Western blot实验检测siRNA-ANKRD1的干扰效率
步骤同实施例2。
结果如图3所示，与转染siRNA-NC组相比，转染siRNA-ANKRD1的细胞中ANKRD1蛋白的含量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。
2、MTT实验分析细胞增殖活性
将已经转染siRNA的细胞24h后接种于96孔板，1×103个/孔，分别在24、48、72、96h时间点加入20μL MTT(5mg/mL)溶液，每组设置6个复孔；孵育箱培养4h后，小心吸去培养液，每孔再加入150μL DMSO；酶标仪检测590nm处吸光度值，实验重复三次。
3、实验结果
结果如图4所示，与转染siRNA-NC组相比，转染siRNA-ANKRD1组细胞增殖缓慢，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述实验结果表明，ANKRD1基因表达促进了舌鳞癌细胞的增殖。
实施例4 ANKRD1基因的表达对舌鳞癌细胞迁移和侵袭能力的测定
1、细胞迁移实验
将已经转染siRNA的细胞24h后用胰酶消化吹打并充分重悬为单细胞悬液后，细胞计数板计数，将细胞数稀释至5×106个/mL，接种于6孔板中，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养，待细胞长成单层后弃去培养液，用灭菌枪头在6孔培养板底部单层细胞的中央划出一划痕，洗去死细胞，无血清培养液培养，分别于0、24、48h拍照计数，实验重复3次。
2、细胞侵袭实验
采用DMEM/F12将Matrigel稀释(1∶6)，加入至Transwell小室上室，100μL/孔，细胞孵育箱放置2h，在下室加入1mL含10％PBS的DMEM培养基，在上室加入1×106个/ml的转染siRNA的细胞悬液200μL，常规培养24h后，取出Transwell小室，用棉签轻柔擦去上室的Matrigel，PBS小心冲洗，多聚甲醛固定，结晶紫染色，再用PBS洗去多余的结晶紫染液，晾干，光学显微镜下观察并拍照，实验重复3次。
3、实验结果
迁移实验：如图5所示，与转染siRNA-NC组相比，转染siRNA-ANKRD1组细胞迁移数少，差异具有统计学意义(P<0.05)。
侵袭实验：在结晶紫染色后正置显微镜下计数穿膜细胞数，发现转染siRNA-NC组穿膜细胞数为(65±5)个，转染siRNA-ANKRD1组穿膜细胞数(21±2)。
实施例5 ANKRD1基因的表达对舌鳞癌细胞成瘤能力的测定
平板克隆实验
取已经转染siRNA的单层培养细胞，用胰酶消化并吹打成单个细胞，计数，使细胞在含10％FBS的DMEM/F12培养液中稀释至1000个/mL并接种于培养皿中，轻轻摇动使细胞均匀，放入孵箱2～3周。经常观察，当培养皿中出现镜下可见的30～50个细胞的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4％的多聚甲醛固定15min。去除固定液，加适量的结晶紫染色10～30min，再用流水洗净，空气干燥。显微镜下计数＞30个细胞的克隆数，计算克隆形成率，克隆形成率(％)＝克隆数/接种细胞数×100％。
结果如图6所示，与转染siRNA-NC组相比，转染siRNA-ANKRD1组细胞克隆形成率明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京泱深生物信息技术有限公司
<120> ANKRD1作为舌鳞癌的诊治靶标
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agacagagaa ggagatac 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gccatacata atcaggag 18
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aaggtcggag tcaacggatt tg 22
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccatgggtgg aatcatattg gaa 23
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 5
acaaacaucu ggauuguucu u 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 6
gaacaaucca gauguuugug a 21

Claims (10)

1.检测ANKRD1基因或ANKRD1蛋白的产品在制备诊断舌鳞癌或预测舌鳞癌预后的工具中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测ANKRD1基因或ANKRD1蛋白的产品包括检测ANKRD1基因或ANKRD1蛋白的表达水平的产品。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述产品包括能够结合ANKRD1基因的核酸或者能够结合ANKRD1蛋白的物质；所述核酸能够检测ANKRD1基因的表达水平；所述物质能够检测ANKRD1蛋白的表达水平。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩增ANKRD1基因的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
5.一种诊断舌鳞癌或预测舌鳞癌预后的工具，其特征在于，所述工具包括能够检测ANKRD1基因或ANKRD1蛋白的表达水平的工具。
6.根据权利要求5所述的工具，其特征在于，所述工具包括能够结合ANKRD1基因的核酸或者能够结合ANKRD1蛋白的物质；所述核酸能够检测ANKRD1基因的表达水平；所述物质能够检测ANKRD1蛋白的表达水平。
7.根据权利要求6所述的工具，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩增ANKRD1基因的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
8.ANKRD1基因和/或其表达产物的抑制剂在制备治疗舌鳞癌的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抑制剂包括抑制ANKRD1基因表达的试剂、和/或抑制ANKRD1基因表达产物的试剂。
10.一种用于治疗舌鳞癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求8或9所述的抑制剂。
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CN109907735A (zh) * 2019-04-25 2019-06-21 北京峰云视觉技术有限公司 一种多光谱舌象采集设备

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