CN110423821A

CN110423821A - 口腔鳞状细胞癌恶性程度相关标志物及其应用

Info

Publication number: CN110423821A
Application number: CN201910884447.2A
Authority: CN
Inventors: 杨森; 郭丽娟
Original assignee: Suining Central Hospital
Current assignee: Suining Central Hospital
Priority date: 2018-09-19
Filing date: 2019-09-19
Publication date: 2019-11-08
Anticipated expiration: 2039-09-19
Also published as: CN110423821B; CN109055558A

Abstract

本发明公开了SIX4基因可作为评估口腔鳞状细胞癌恶化程度的分子标志物。本发明通过高通量测序和QPCR研究获知，SIX4基因在高分化的口腔鳞状细胞癌中的含量低于低分化的口腔鳞状细胞癌。根据上述研究成果，本发明还可以开发用于评估口腔鳞状细胞癌恶化程度的试剂盒，该试剂盒检测效果显著，可在临床上推广使用。

Description

口腔鳞状细胞癌恶性程度相关标志物及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体地，本发明涉及口腔鳞状细胞癌恶性程度相关标志物及其应用，更具体地，涉及SIX4作为口腔鳞状细胞癌恶性程度的分子标志物的应用。

背景技术

口腔鳞状细胞癌是全球最常见的十大癌症之一，是最常见的口腔肿瘤，占比约达90％以上，每年约有500000新增病例，且近年来仍呈上升趋势。口腔鳞状细胞癌不仅危及患者的生命，还影响其美观和外形，以及患者的咀嚼、语音、吞咽等生存质量。

口腔鳞状细胞癌的发生与很多因素有关系，往往是多种因素综合作用的结果。在临床工作中口腔癌定义为包括牙龈癌、舌癌、软硬愕癌、上下颌骨恶性肿瘤、口底癌、口咽癌、涎腺癌、唇癌、和上领窦癌以及发生于颌面部皮肤黏膜的癌症等。口腔癌的发生与以下几点有关：首先，留在扣去内的残根或锐利的牙尖、不合适的口腔修复体长期刺激口腔黏膜，产生慢性溃疡逐渐发展为癌症。其次，患者口腔卫生差，创造了较好的细菌或霉菌在口腔内滋生、繁殖的条件，从而有利于破坏口腔组织的亚硝胺及其前体的形成。另外口腔黏膜疾病，比如：白斑及扁平苔鲜等疾病使一些细胞处于增生状态，对致癌因素更加敏感，如此多种因素可能促进口腔癌的发生。核及各类有放射性的物质辐射对人与动物都有诱发癌症的作用。临床工作中常见的白血病和淋巴瘤放射治疗后的患者，由于放射的作用会引起口腔黏膜表皮样癌和唾液腺恶性肿瘤。现代都市生活中的空气污染也是口腔恶性肿瘤的致病因素，比如：大型重工业生产中排放的所煤烟污染及纺织工业中排放的有毒物质都是致癌因素。还有，维生素A缺乏可引起口腔黏膜上皮增厚、角化过度而与口腔癌的发生有关。人口统计学研究显示摄入维生素A低的国家口腔癌发病率高。也有认为与微量元素摄入不足有关，如食物含锌量低。锌是动物组织生长不可缺少的元素，锌缺乏可能导致黏膜上皮损伤，为口腔癌的发生创造了有利条件。在我国，口腔癌与吸烟也有很大的关系，吸烟的过程中，有害物质可以侵入口腔黏膜上皮，破坏上皮细胞功能，引起机体分子机构的变化而致病。

尽管目前有包括手术治疗、放化疗、生物治疗、基因靶向治疗等在内的综合序列治疗法，但是口腔鳞状细胞癌的长期治疗效果仍不理想。据文献报道，约有2/3的口腔鳞状细胞癌患者被诊断时已处于癌症晚期，而在过去的30年中，晚期口腔鳞状细胞癌的5年生存率只有40％～50％。此外，晚期患者经历手术、放疗和化疗等综合治疗后，面部外形严重破坏，生存质量明显降低。但是，对于早期的OSCC患者5年生存率高达85.4％，早期患者治疗后生存质量也显著提高。因此，口腔鳞状细胞癌的早期诊断对提高患者生存预后至关重要。特异性和敏感度高的标记物能对口腔鳞状细胞癌患者的早期诊断，治疗和预后判断提供很大的帮助。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过检测SIX4基因或蛋白表达差异来评估口腔鳞状细胞癌恶性程度的方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

第一方面，本发明提供了检测SIX4基因或SIX4蛋白的产品在制备评估口腔鳞状细胞癌恶性程度的工具中的用途。

进一步，所述检测SIX4基因或SIX4蛋白的产品包括检测SIX4基因或SIX4蛋白的表达水平的产品。所述产品包括能够结合SIX4基因的核酸或者能够结合SIX4蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测SIX4基因的表达水平；所述物质能够检测SIX4蛋白的表达水平。

本发明的检测SIX4基因的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该产品可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。

包含在上述产品中的核酸可以通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有期望核酸的基因，然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。

进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Amplification RefractoryMutation System，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。

上面所述的核酸包括扩增SIX4基因的引物，产品中包括的引物可以通过通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。

在本发明的具体实施方案中，所述核酸为QPCR实验中使用的扩增引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.1(正向序列)和SEQ ID NO.2(反向序列)所示。

上面所述的核酸还可包括探针，所述探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。

本发明的检测SIX4蛋白的产品可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以包括ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等。

本发明的检测SIX4蛋白的产品包括特异性结合SIX4蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)₂、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。本发明的检测SIX4蛋白的产品可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。

抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的SIX4蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对SIX4蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。

标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用DMSO、缓冲剂、等准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH(DojindoLaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、碱性磷酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories)；过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2，B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH(DojindoLaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)555标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；及DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(Invitrogen Corporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。

进一步，所述检测SIX4基因或SIX4蛋白的产品可以是检测SIX4基因或SIX4蛋白的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。

利用前面所述的检测产品检测受试者样本中的SIX4基因或SIX4蛋白的表达水平；SIX4基因或SIX4蛋白的表达水平越高，表示口腔鳞状细胞癌恶性程度越高。

作为依照本发明的检测产品的样本，可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样本不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。

在本发明的具体实施方案中，所述样本来自受试者的组织。

本发明还提供了一种评估口腔鳞状细胞癌恶性程度的工具，所述工具能够检测受试者样本中SIX4基因或SIX4蛋白的表达水平。所述工具包括能够结合SIX4基因的核酸或者能够结合SIX4蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测SIX4基因的表达水平；所述物质能够检测SIX4蛋白的表达水平。

进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。

进一步，所述评估口腔鳞状细胞癌恶性程度的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的评估口腔鳞状细胞癌恶性程度的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比不同人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知SIX4基因的异常与口腔鳞状细胞癌恶性程度相关也属于SIX4基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。

本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗SIX4抗体或其片段所识别的氨基酸的数目没有特别限制，只要抗体能够结合SIX4即可。当抗体作为治疗药物时，优选的是它能够识别尽可能多的氨基酸，只要它能抑制SIX4功能。抗体或其片段识别的氨基酸的数目是至少一个，更优选至少三个。抗体的免疫球蛋白类别不受限制，可以是IgG、IgM、IgA、IgE、IgD或IgY。

本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗SIX4抗体的其他性质同前面所述。

进一步，所述受试者样本可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样本不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。在本发明的具体实施方案中，所述样本来自受试者的组织。

本发明还提供了一种评估口腔鳞状细胞癌恶性程度的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)获取待测口腔鳞状细胞癌患者的样品；

(2)检测样品中SIX4基因或蛋白的表达水平；

(3)将测得的SIX4基因或蛋白的表达水平与口腔鳞状细胞癌恶性程度关联起来。

(4)SIX4基因或蛋白的表达水平越高，代表待测口腔鳞状细胞癌患者的癌恶性程度越高。

本发明还提供了SIX4基因或SIX4蛋白在制备抑制口腔鳞状细胞癌增殖的药物中的应用。

本发明还提供了SIX4基因或SIX4蛋白在制备抑制口腔鳞状细胞癌迁移的药物中的应用。

本发明还提供了SIX4基因或SIX4蛋白在制备逆转口腔鳞状细胞癌恶性程度的药物中的应用。

本发明还提供了SIX4基因或SIX4蛋白在制备治疗口腔鳞状细胞癌的药物中的应用。

本发明中的“恶性程度”可以使用“分化程度”来表示。国际通用的肿瘤分级为：Ⅰ级(G1)，即分化良好者(称为“高分化”)，肿瘤细胞接近相应的正常发源组织，恶性程度低；Ⅲ级(G3)，分化较低的细胞(称为“低分化”)，肿瘤细胞与相应的正常发源组织区别大、分化差，为高度恶性；Ⅱ级(G2)，组织异型性介于Ⅰ级和Ⅲ级之间者，恶性程度居中。分化程度越高，代表恶性程度越小。

本发明的“SIX4基因”可在NCBI数据库中查找到其相关序列：NC_000014.9(60709538..60724321,complement)。

本发明的优点和有益效果：

本发明的发现了一种评估口腔鳞状细胞癌恶性程度的分子标志物，使用该分子标志物从G2口腔鳞状细胞癌患者中区分出G1口腔鳞状细胞癌患者，从G3口腔鳞状细胞癌患者中区分出G2口腔鳞状细胞癌患者。

附图说明

图1显示利用QPCR检测SIX4基因在不同分级口腔鳞状细胞癌患者中表达差异的统计图；

图2显示利用QPCR检测SIX4表达抑制程度的统计图；

图3显示利用CCK-8方法检测SIX4对口腔鳞状细胞癌细胞增殖影响的生长曲线图。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与口腔鳞状细胞癌恶性程度相关的分子标志物

1、临床研究对象：

选取医院口腔科颌面外科手术切除的口腔鳞状细胞癌组织15例(所有患者均未在术前放化疗)，其中高分化(III级，G3)患者6例，中分化(II级，G2)患者4例，低分化(I级，G1)患者5例(由两名经验丰富的病理科医师确诊，确定所有癌组织的病理分级)。

纳入标准：(1)术前均未行化疗或放疗等治疗；(2)术后病理证实为OSCC。

排除标准：(1)复发患者；(2)未同期行颈淋巴结清扫术；(3)未经病理证实。

2、组织RNA提取

(1)组织研磨：首先将少量液氮预冷放入一个研钵，将准备好的组织约100毫克放入其中，取出保存于-80度超低温冰箱的组织，放入研钵后加入少量液氮，边研边加液氮以防止液氮挥发，关键是在研磨时确保组织是低温下操作，这样可以防止RNA降解，将组织研磨成粉末状，加入1ml TrizoL将Trizol和组织粉末一起研磨到液体状，将液体吸到已预冷的无RNA酶的1.5m1 EP管中，将其放置在冰上5min。

(2)液相分离：将EP管中加入0.2m1新的三氯甲坑，盖紧瓶盖将其混匀；置于冰上5min，开始12000rpm的转速离心15min后将离心液体小心吸取无色上清液(约600μ1)到另一1.5m1EP管(无RNA酶)中。将EP管中加入异丙醇500μ1，轻摇15秒混匀，将其静置冰上10分钟后，以12000rpm离心10分钟，带离心液体沉淀后观察在管底的RNA白色沉淀物。

(3)RNA洗涤：将离心好的液体弃去其上清，加入1m1 75％乙醇，旋涡混合器上充分洗涤沉淀，以7500rpm在40℃情况下离心5分钟。

(4)RNA溶解：将离心好的液体弃去上清，在干燥的空气中沉淀RNA3分钟，干燥后加入20μ1无Rnase去离子水溶解沉淀将其吹打混匀后，分装，-80度贮存备用。

3、RNA的鉴定和定量

对总RNA的完整性进行检测

将以上实验的提取的总RNA与上样缓冲液按5:1混合，在1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳实验，将电压设置为3-5v/cm。待观察到上样缓冲液中的溴酚蓝迁出一定距离后停止电泳。电泳结束后将凝胶移至紫外凝胶成像仪下，在300nm紫外光线照射下进行观察并且照相，我们可以观察到RNA的电泳带28s，18s，5s清晰无降解。

4、总RNA纯度的鉴定和定量分析

将鉴定合格的总RNA用无菌的去离子水溶解液稀释适当倍数，将其放置在在紫外分光光度仪上进行检测，检测的结果显示：260nm和280nm两个波长的吸光度(OD₂₆₀和OD₂₈₀)。大量研究表面当RNA分析检测位于OD₂₆₀/OD₂₈₀。在1.7-1.8以上，证明RNA没有被污染，达到进行下一步实验的条件。

5、片段化RNA

Illumina平台是针对短序列片段进行测序，mRNA平均长度可能达几kb，因此需要对其进行随机打断。利用金属离子，可以将RNA随机断裂成200bp左右的小片段。

6、反转合成cDNA

在逆转录酶的作用下，利用随机引物，以mRNA为模板反转合成一链cDNA，进行二链合成时，dNTPs试剂中用dUTP代替dTTP，使cDNA第二链中碱基包含A/U/C/G。

7、连接adaptor

双链的cDNA结构为粘性末端，加入End Repair Mix将其补成平末端，随后在3’末端加上一个A碱基，用于连接Y字形的接头。

8、UNG酶消化cDNA二链

在PCR扩增前，用UNG酶将cDNA第二链消化，从而使文库中仅包含cDNA第一链。

9、Illumina x-ten上机测序

Illumina x-ten测序平台，进行2*150bp测序。

10、生物信息学分析

测序数据获得以后的rawdata分析过程如下所示：

(1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉N大于10％的reads；

(2)tophat比对到参考基因组上。所用的参考基因组版本为GRCh38.p7，fasta和gff文件下载自NCBI；

(3)cuffquant定量mRNA的表达量并标准化输出；

(4)在R环境下用DEGseq包比较对照组跟疾病组mRNA的表达差异。显著差异mRNA筛选条件：p-value<0.05。

11、结果

用以上标准筛选得到差异表达基因278个，其中表达上调的基因175个，表达下调的基因有103个。

实施例2 QPCR验证候选基因与口腔鳞状细胞癌恶性程度的关系

基于前期高通量测序的结果，根据P value的大小，我们选择SIX4基因进行验证。

1、研究对象：

选取医院口腔科颌面外科手术切除的口腔鳞状细胞癌组织90例(所有患者均未在术前放化疗)，其中高分化(G3)患者30例，中分化(G2)患者30例，低分化(G1)患者30例(由两名经验丰富的病理科医师确诊，确定所有癌组织的病理分级)。纳入标准和排除标准同实施例1。

2、RNA提取、检测

按照实施例1的方法进行。

3、逆转录

用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mmol/L dNTP，0.1mmol/l DTT，30μmmol/l Oligo dT,200U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。

4、QPCR扩增检验

采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μM/μl)1μl，反向引物(5μM/μl)1μl，模板cDNA 2.0μl，无酶水8.5μl；扩增SIX4基因的正向序列5’-GGTAATATCTCAGTAAGC-3’(SEQ ID NO.1)，反向序列5’-TATTAGGAACCGTGTATA-3’(SEQID NO.2)；管家基因优选GAPDH，扩增该基因的正向引物序列为5’-ATGTTCCAATATGATTCCA-3’(SEQ ID NO.3)，反向引物序列为5’-GATTTCCATTGATGACAAG-3’(SEQ ID NO.4)。各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃5min，(95℃15s，48℃55s)*43个循环。以SYBR

Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、结果

结果显示，30例G3口腔鳞状细胞癌患者中有29例患者的SIX4基因表达高于30例G2口腔鳞状细胞癌患者的平均值；30例G2口腔鳞状细胞癌患者有27例患者的SIX4基因表达高于30例G1口腔鳞状细胞癌患者的平均值。统计结果如图1所示，随着癌组织分化程度越低，SIX4基因表达越高(*P<0.05)，即SIX4基因表达与癌组织恶性程度成显著正相关，SIX4基因表达越高，则代表癌组织恶性程度越强。

利用ROC曲线分析显示，SIX4区分G3和G2时，其AUC值是0.972；SIX4区分G2和G1时，其AUC值是0.941，详细信息如表1和表2所示。

表1 SIX4区分G3和G2的诊断效能评价

表2 SIX4区分G2和G1的诊断效能评价

实施例3 SIX4基因影响口腔鳞状细胞癌增殖和迁移

1、细胞培养

口腔鳞状细胞癌细胞系HN6细胞用高糖DMEM完全培养液培养(含链霉素-青霉素、10％胎牛血清)。实验使用对数生长期细胞进行，培养条件为37℃，5％CO₂，>95％饱和湿度。

2、细胞转染

采用转染试剂脂质体和含抗生素的无血清成分的高糖DMEM溶液，转染体系为250μl，将5*10⁴个HN6细胞种植于24孔板中，于37℃，5％CO₂培养箱过夜培养；将稀释后的LipofectamineTM 2000室温放置5min后与稀释的siRNA混合并室温放置20min形成转染复合物。将上述混匀的转染复合物体加到培养的细胞液中(同时设置无关siRNA作为对照)，置37℃，5％CO2培养箱培养5-7小时后，加含等体积的10％FBS和含抗生素的高糖DMEM继续培养48小时后利用QPCR检测siRNA的干扰能力，步骤基本同实施例2。

上海吉玛制药技术有限公司设计合成针对SIX4基因的siRNA(siR-SIX4)和无关siRNA对照(siR-Ctrl)，具体序列如下：

siR-SIX4：

5’-UUAAGAUAGCUGUUAGAGCAATT-3’(SEQ ID NO.5)；

5’-GCUCUAACAGCUAUCUUAAUGTT-3’(SEQ ID NO.6)；

siR-Ctrl：

5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’(SEQ ID NO.7)；

5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’(SEQ ID NO.8)。

结果如图2所示，siR-SIX4能显著干扰SIX4表达，表达抑制率达70％以上，差异具有统计学意义(P<0.05)。

3、细胞增殖检测

CCK-8法检测HN6细胞增殖：分别收集处于对数生长期的HN6细胞以1000个/孔接种于96孔板中，放置于培养箱中常规培养，待细胞融合度达到70％时，按照以上步骤进行siRNA干扰，分别在干扰后24h、48h、72h每孔中加入10μl CCK-8试剂，并于培养箱中放置3h后，用酶标仪测定其在450nm波长处的吸光度值(A₄₅₀值)。

结果如图3所示，抑制SIX4表达显著抑制癌细胞增殖，两组之间差异具有统计学意义(P<0.05)。

4、细胞迁移检测

Transwell迁移实验：将转染24小时后的HN6细胞消化、重悬后置于15ml离心管中，细胞离心后用DMEM培养基重悬细胞并计数，将细胞悬液浓度稀释至1×10⁶个/ml；于Transwell小室下层加入600μl完全培养基，在Transwell小室上层加入200μl细胞悬液。培养箱中常规培养48h后4％多聚甲醛固定30min，l％结晶紫染液染30min，蒸馏水洗净，用PBS浸泡后的小棉签轻轻擦去Transwell小室上层内侧的细胞，风干后显微镜下观察穿过膜的细胞，并选取每个Transwell小室的上下左右中随机5个视野，计算每视野中的细胞数，统计，实验重复三次。

结果显示：转染siR-SIX4细胞组迁移到下室的细胞数为226±19个，而对照组(转染siR-Ctrl)迁移到下室的细胞数为546±32个。上述结果表明，抑制SIX4表达显著抑制癌细胞迁移。

通过口腔鳞状癌细胞增殖和迁移的实验结果可以看出，SIX4低表达可以降低口腔鳞状细胞癌的恶性程度。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 遂宁市中心医院

<120> 口腔鳞状细胞癌恶性程度相关标志物及其应用

<150> 201811091017.7

<151> 2018-09-19

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggtaatatct cagtaagc 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tattaggaac cgtgtata 18

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgttccaat atgattcca 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatttccatt gatgacaag 19

<210> 5

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

uuaagauagc uguuagagca att 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcucuaacag cuaucuuaau gtt 23

<210> 7

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

uucuccgaac gugucacgut t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acgugacacg uucggagaat t 21

Claims

1.检测SIX4基因或SIX4蛋白的产品在制备评估口腔鳞状细胞癌恶性程度的工具中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测SIX4基因或SIX4蛋白的产品包括检测SIX4基因或SIX4蛋白的表达水平的产品。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，利用所述产品检测受试者样本中的SIX4基因或SIX4蛋白的表达水平；SIX4基因或SIX4蛋白的表达水平越高，代表口腔鳞状细胞癌恶性程度越高。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述受试者样本的来源是组织。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括能够结合SIX4基因的核酸或者能够结合SIX4蛋白的物质；所述核酸能够检测SIX4基因的表达水平；所述物质能够检测SIX4蛋白的表达水平。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩增SIX4基因的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

7.SIX4基因或SIX4蛋白在制备抑制口腔鳞状细胞癌增殖的药物中的应用。

8.SIX4基因或SIX4蛋白在制备抑制口腔鳞状细胞癌迁移的药物中的应用。

9.SIX4基因或SIX4蛋白在制备逆转口腔鳞状细胞癌恶性程度的药物中的应用。

10.SIX4基因或SIX4蛋白在制备治疗口腔鳞状细胞癌的药物中的应用。