CN113621080A - 一种用于预防或治疗子痫前期及相关病症的药物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于预防或治疗子痫前期及相关病症的药物及其应用，更为具体的，本发明涉及CD39‑diannexin融合蛋白，所述融合蛋白通过对子痫前期促凝血小板产生的抑制，达到预防或治疗子痫前期及相关病症的效果。对临床中子痫前期的治疗策略具有重要价值和应用前景。

Description

一种用于预防或治疗子痫前期及相关病症的药物及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及预防或治疗子痫前期及相关病症的药物及其应用，特别是一种CD39-diannexin融合蛋白在制备预防或治疗子痫前期及其相关病症药物中的应用。
背景技术
子痫前期(pre-eclampsia,PE)以妊娠20周后新发的高血压(≥140/90mmHg)和蛋白尿(尿蛋白≥0.3g/24h)为特征，在妊娠中的发病率为2％-8％。PE可迅速进展至多器官功能衰竭的子痫，约12％产妇和15％新生儿死亡与之有关；而PE一旦进展，除终止妊娠外，目前尚无其他有效治疗措施，所以预防PE发生在临床具有更重要价值。小剂量阿司匹林(100-150mg/d)抗血小板治疗是目前唯一被证明具有PE预防作用的措施，但阿司匹林只能降低约15％PE发生风险，并且因为易导致产妇出血而在临床应用非常受限，所以目前临床急需安全有效的PE控制和监测手段。
但是，PE的病因和发病机制目前还不十分清楚，其病理生理过程普遍被认为分为两个阶段。第一阶段：在各种因素作用下，滋养细胞侵袭不足、子宫螺旋动脉重铸障碍，胎盘因供血不足缺氧和不规则的再灌注事件导致氧化和内质网应激；第二阶段，氧化应激等损伤导致合胞体结构凋亡、坏死，从绒毛间隙释放炎症因子、抗血管生成因子、促凝微粒等进入母体血液循环，诱发母体血栓炎症性反应。这种与正常妊娠相比，过度的炎症反应、止血系统紊乱进而累及多器官，出现高血压、心脏衰竭、肾功能不全、急性肝损伤等多器官功能障碍的PE临床表现和胎儿宫内生长受限。所以，具有抑制炎症和抗栓效应的药物被尝试用于PE预防和治疗。
Annexin A5是一种膜联蛋白，可与内皮细胞、滋养细胞和血小板膜表面暴露的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)结合形成二维晶格屏障结构。这种结构可以阻止凝血酶原复合物在细胞表面形成，发挥屏障抗凝保护作用；还可以减少细胞激活和凋亡，发挥炎症抑制作用。而通过重组DNA技术合成的Annexin A5同型二聚体Diannexin(以下简称DA)，具有与PS更高亲和性(约是Annexin A5的10倍)和更长半衰期(de Laat B,Wu XX,vanLummel M,Derksen RHWM,de Groot PG,Rand JH.Correlation betweenantiphospholipid antibodies that recognize domain I of beta 2-glycoprotein Iand a reduction in the anticoagulant activity of annexin A5.Blood.2007；109(4):1490-1494.)，在被用于控制与PE发病机制类似的器官移植后系统性炎症-高凝状态(移植器官缺血-再灌注损伤导致)时，显示了有效保护作用(Hashimoto K,Kim H,Oishi H,Chen M,Iskender I,Sakamoto J,Ohsumi A,Guan Z,Hwang D,Waddell TK,Cypel M,LiuM,Keshavjee S.Annexin V homodimer protects against ischemia reperfusion-induced acute lung injury in lung transplantation.The Journal of thoracic andcardiovascular surgery.2016；151(3):861-869)。
申请人在先前的研究中已经发现了DA对子痫前期及其相关病症具有预防或治疗作用，能够抑制母体的全身炎症反应，降低血压。然而单一的使用DA对于治疗子痫前期的效果有限，为了更好的应用于临床，迫切需要开发具有更优治疗效果的药物。
近年研究发现，血管内皮损伤后，活化血小板至少可分为两群：①一群通过糖蛋白(glycoprotein,GP)Ib-V-IX复合物与血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)黏附，迅速变形产生伪足，其膜表面整合素αIIbβ3激活，通过与纤维蛋白原结合聚集在栓子核心，故称为血小板聚集亚群，主要发挥止血、修复损伤的作用，；②还有一群通过GPVI与胶原结合，胞膜发生延伸，膨胀成气球样，其膜内层磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)大量外翻至表面，成为凝血酶原酶复合物组装界面，促进凝血酶正反馈大量生成，故称为血小板促凝亚群。该群血小板被认为是介导血栓炎症反应的重要细胞，可能在子痫前期的发生和进展中发挥重要作用。
已有研究发现，血小板结构性表达炎症小体。血小板被激活后，致密颗粒释放的三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)可激活血小板内炎症小体介导炎症反应。而细胞外核苷酸酶CD39可以水解细胞外嘌呤信号ATP，所以如果利用DA选择性结合血小板促凝亚群表面大量暴露的PS，同时在其周围聚集高浓度CD39水解血小板释放的ATP，应该可以靶向抑制血小板促凝亚群介导的血栓炎症反应，而并不影响血小板聚集亚群的止血修复功能，从而更有效的预防PE发生和进展，同时避免已有抗血小板药物(例如，阿司匹林)增加母体和胎儿潜在的出血风险的弊端。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够靶向抑制血小板促凝亚群形成，抑制血小板介导的炎症反应但不损害血小板聚集亚群止血功能的融合蛋白，从而预防或治疗子痫前期及其相关病症的药物。更为具体的，本发明提供如下技术方案：
本发明的第一个方面，提供一种CD39-diannexin融合蛋白及其构建和合成方法。优选的，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示。
在一种实施方式中，所述CD39-diannexin融合蛋白由以下方法构建和合成：
(1)构建CD39-diannexin融合蛋白真核表达载体
a)在CD39胞外域氨基酸序列的N端添加连接肽(GGGGS)3和Igk前导序列，进行密码子优化，并合成此基因；添加5’BamHI和3’AgeI，将CD39基因通过5’BamHI和3’AgeI克隆至真核表达载体pcDNATM3.1/myc-His C，制备重组质粒pcDNA3.1-CD39-His。
b)在Diannexin序列的N端添加一段Igk前导序列，优化并合成此基因,添加5’BamHI和3’AgeI；将Diannexin基因通过5’BamHI和3’AgeI克隆至真核表达载体pcDNATM3.1/myc-His C，制备重组质粒pcDNA3.1-Diannexin-His。
设计引物F1和R1，以pcDNA3.1-Diannexin-His为模板扩增片段P1(Diannexin)；设计引物F2和R2，以pcDNA3.1-CD39-His为模板扩增片段P2(CD39)；然后利用无缝连接技术将片段P1和P2连接形成片段P3(CD39-diannexin融合蛋白编码基因，如SEQ ID NO.1所示)，用BamHI和AgeI限制性内切酶进行双酶切后将片段P3克隆到pcDNATM3.1/myc-His C的BamHI和AgeI的酶切位点中，组成表达载体pcDNA3.1-CD39-diannexin-His。引物序列和蛋白融合方式如图1所示，构建完成的每种表达载体都要进行酶切鉴定和DNA序列测定。(2)表达及纯化CD39-diannexin融合蛋白
a)CD39-diannexin融合蛋白瞬时转染：将HEK293细胞接种于细胞培养瓶，37℃，5％CO2条件下培养24h。37℃下预热转染试剂10～20min，将pcDNA3.1-CD39-diannexin-His质粒与转染试剂混合后加入HEK293细胞中，置于培养箱中继续培养1-3天，离心后收取细胞并提取总蛋白，Western blot检测CD39-diannexin融合蛋白的表达。
b)Ni-IDA亲和层析纯化：提前用50mM Tris(pH 8.0)，300mM NaCl，50mMImidazole组成的缓冲液平衡Ni-IDA亲和层析柱。细胞转染成功后，收集细胞培养上清，4℃，12000rpm/min离心10min，留取上清，过滤后上样，用含不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析检测。
本发明的第二个方面，提供一种预防或治疗子痫前期及其相关病症的药物，其中所述药物的活性成分包括CD39-diannexin融合蛋白。
在一种实施方式中，所述的预防或治疗子痫前期及其相关病症的药物为注射制剂或口服制剂。
本发明的第三个方面，提供一种CD39-diannexin融合蛋白在制备预防或治疗子痫前期的药物中的应用。
本发明的第四个方面，提供一种CD39-diannexin融合蛋白用于制备抑制子痫前期促凝血小板产生的药物中的应用。
本发明的第五个方面，提供一种CD39-diannexin融合蛋白在制备降低子痫前期的炎症水平的药物中的应用。
本发明的技术方案可获得如下有益的技术效果：
1.本发明创造性的构建了CD39-diannexin融合蛋白，该融合蛋白可通过diannexin基团靶向与血小板促凝亚群表面大量暴露的PS结合，在其周围高浓度聚集CD39活性基团迅速水解血小板释放的ATP，通过抑制血小板表面凝血酶大量生成和细胞内炎症小体活化，达到预防PE发生和进展的作用；
2.相对于diannexin单体，本发明所构建的CD39-diannexin融合蛋白，由于该融合蛋白不与血小板聚集亚群结合，因此避免了在预防或治疗子痫前期及其相关病症的同时影响血小板的止血修复功能，即不会增加母体和胎儿在用药时潜在的出血风险。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1 pcDNA3.1-CD39-diannexin-His表达载体构建(Igk-leader：Igk前导序列；BamHI和AgeI：限制性内切酶；G4S：连接肽；P1：Diannexin；P2：CD39；P3：CD39-diannexin融合蛋白；F1和R1及F2和R2：引物)
图2 CD39-diannexin融合蛋白的SDS-PAGE条带图:NR：非还原性SDS-PAGE；R：还原性SDS-PAGE，均无明显杂带；
图3扫描电镜下血小板形态特征:(a)扫描电镜下静息血小板，表面平整光滑；(b)扫描电镜下聚集亚群血小板，向四周伸出大量伪足；(c)扫描电镜下促凝亚群血小板，自身向四周发生延伸并且膨胀；
图4利用流式细胞术构建促凝血小板检测方法:(a)FSC-SSC图中血小板所在位置为P1门内；(b)SSC-CD41a图中CD41a阳性血小板所在位置为P2门内；(c)CD62P-GSAO图中促凝血小板所在位置为Q2区域；
图5健康育龄女性、健康妊娠女性和子痫前期孕妇促凝血小板的生成水平:
(a)健康育龄女性全血在静息条件下检测促凝血小板；(b)健康妊娠女性在静息条件下检测促凝血小板；(c)子痫前期孕妇在静息条件下检测促凝血小板；(d)健康育龄女性全血在激活条件下检测促凝血小板；(e)健康妊娠女性全血在激活条件下检测促凝血小板；(f)子痫前期孕妇全血在激活条件下检测促凝血小板；(g)三组研究对象在静息时促凝血小板的水平，子痫前期孕妇促凝血小板水平显著高于健康育龄女性和健康妊娠女性；(h)三组研究对象在激活后促凝血小板水平，子痫前期孕妇促凝血小板水平显著高于健康育龄女性和健康妊娠女性。健康育龄女性组：n＝15，健康妊娠女性组：n＝19，子痫前期组：n＝15；paired t test，*P<0.05，***P<0.001，#P>0.05；
图6两种脂质微球的直径，均约500nm。PS：磷脂酰丝氨酸；PC：磷脂酰胆碱；
图7激光扫描共聚焦显微镜验证CD39-diannexin只与PS脂质微球结合：(a)PS微球经CD39-diannexin和anti-his的荧光抗体处理后，微球表面可见绿色荧光；(b)PC微球经CD39-diannexin和anti-his的荧光抗体处理后，微球表面未见荧光信号；(c)PS微球仅经过anti-his的荧光抗体处理，微球表面未见荧光，排除非特异性的荧光结合；
图8激光扫描共聚焦显微镜验证CD39-diannexin与血小板表面暴露的PS结合:(a)激活血小板经CD39-diannexin和anti-his的荧光抗体处理后，表面可见强绿色荧光；(b)静息血小板经CD39-diannexin和anti-his的荧光抗体处理后，表面可见弱荧光信号；(c)激活血小板仅经过anti-his的荧光抗体处理，表面未见荧光，排除非特异性荧光结合；(d)定量分析血小板细胞膜的荧光强度显示激活组的荧光强度显著高于对照组，t test，**P<0.01；
图9 CD39-diannexin融合蛋白水解ATP的能力验证：PS：磷脂酰丝氨酸；PC：磷脂酰胆碱；
图10激光扫描共聚焦显微镜验证CD39-diannexin可以抑制血小板表面凝血酶生成：注：(a)对照组血小板表面凝血酶生成与底物反应后发出强荧光；(b)加入CsA干预后，血小板表面凝血酶生成减弱，表现为与底物反应后发出的荧光信号弱；(c)加入CD39-diannexin融合蛋白干预后，血小板表面凝血酶生成减弱，表现为与底物反应后发出的荧光信号弱；(d)定量分析血小板细胞膜的荧光强度显示对照组的荧光强度显著高于CsA干预组和CD39-DA干预组，t test，**P<0.01，#P>0.05；
图11血小板内Ca2+强度随时间变化的时间-荧光曲线：(a)静息组血小板内Ca2+强度随时间变化，在10min内血小板内Ca2+强度保持不变；(b)激活组(在1min时加入Ca2+和胶原以及凝血酶激活)在1min后血小板内部Ca2+浓度显著升高；(c)CsA干预组(加入CsA预孵育10min)在1min时加入Ca2+和胶原以及凝血酶激活，该组血小板Ca2+浓度未出现显著升高的趋势；(d)CD39-diannexin干预组(加入CD39-diannexin预孵育10min)在1min时加入Ca2+和胶原以及凝血酶激活，该组血小板Ca2+浓度未出现显著升高的趋势；
图12促凝血小板内Ca2+浓度情况：(a)对照组促凝血小板内Ca2+情况，P3区域代表Ca2+阳性的促凝血小板；(b)激活组促凝血小板内Ca2+情况，P3区域代表Ca2+阳性的促凝血小板；(c)CsA干预组促凝血小板内Ca2+情况，P3区域代表Ca2+阳性的促凝血小板；(d)CD39-diannexin干预组促凝血小板内Ca2+情况，P3区域代表Ca2+阳性的促凝血小板；(e)对各组促凝血小板内Ca2+阳性的促凝血小板进行统计分析，结果显示CsA干预组和CD39-diannexin干预组Ca2+阳性的促凝血小板数量均显著低于对照组和激活组，说明CsA和CD39-diannexin均可以抑制促凝血小板内Ca2+水平；*P<0.05，**P<0.01，#P>0.05；
图13流式细胞术检测CD39-DA对促凝血小板水平的抑制效应：三组研究对象在静息、激活、CsA干预以及CD39-DA干预时的促凝血小板水平：(a)健康育龄女性在CsA以及CD39-DA干预时促凝血小板水平显著低于激活组，且CD39-DA干预组促凝血小板水平显著低于CsA干预组；(b)健康妊娠女性在CsA以及CD39-DA干预时促凝血小板水平显著低于激活组，且CD39-DA干预组促凝血小板水平显著低于CsA干预组；(c)子痫前期孕妇在CsA以及CD39-DA干预时促凝血小板水平显著低于激活组，且CD39-DA干预组促凝血小板水平显著低于CsA干预组，说明CsA及CD39-DA能够抑制促凝血小板的水平。健康育龄女性组：n＝20，健康妊娠女性组：n＝20，子痫前期组：n＝12；paired t test，*P<0.05，***P<0.001。
图14 CD39-DA不影响凝血因子激活和血小板的聚集止血能力：(a)在新鲜全血中加入不同浓度CD39-DA均不影响反映凝血因子活性的R值长度；(b)在新鲜全血中加入不同浓度CD39-DA均不影响反映血小板聚集能力的MA值的大小。n＝6,#P>0.05。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1 CD39-diannexin融合蛋白的构建与合成
1构建CD39-diannexin融合蛋白真核表达载体
1)在CD39胞外域氨基酸序列的N端添加连接肽(GGGGS)3和Igk前导序列，进行密码子优化，并合成此基因；添加5’BamHI和3’AgeI，将CD39基因通过5’BamHI和3’AgeI克隆至真核表达载体pcDNATM3.1/myc-His C，制备重组质粒pcDNA3.1-CD39-His。
2)在Diannexin序列的N端添加一段Igk前导序列，优化并合成此基因,添加5’BamHI和3’AgeI；将Diannexin基因通过5’BamHI和3’AgeI克隆至真核表达载体pcDNATM3.1/myc-His C，制备重组质粒pcDNA3.1-Diannexin-His。
3)设计引物F1和R1，以pcDNA3.1-Diannexin-His为模板扩增片段P1(Diannexin)；设计引物F2和R2，以pcDNA3.1-CD39-His为模板扩增片段P2(CD39)；然后利用无缝连接技术将片段P1和P2连接形成片段P3(CD39-diannexin融合蛋白编码基因，如SEQ ID NO.1所示)，用BamHI和AgeI限制性内切酶进行双酶切后将片段P3克隆到pcDNATM3.1/myc-His C的BamHI和AgeI的酶切位点中，组成表达载体pcDNA3.1-CD39-diannexin-His。引物序列和蛋白融合方式如图1所示，构建完成的每种表达载体都要进行酶切鉴定和DNA序列测定。所用引物序列如下表1：
表1
Figure BDA0003252364310000071
注：小写字母表示酶切位点
2表达及纯化CD39-diannexin融合蛋白
1)CD39-diannexin融合蛋白瞬时转染：将HEK293细胞接种于细胞培养瓶，37℃，5％CO2条件下培养24h。37℃下预热转染试剂10～20min，将pcDNA3.1-CD39-diannexin-His质粒与转染试剂混合后加入HEK293细胞中，置于培养箱中继续培养1-3天，离心后收取细胞并提取总蛋白，Western blot检测CD39-diannexin融合蛋白的表达。
2)Ni-IDA亲和层析纯化：提前用50mM Tris(pH 8.0)，300mM NaCl，50mMImidazole组成的缓冲液平衡Ni-IDA亲和层析柱。细胞转染成功后，收集细胞培养上清，4℃，12000rpm/min离心10min，留取上清，过滤后上样，用含不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析检测。
检测结果：
CD39-diannexin融合蛋白理论分子量(kDa)为125.71，浓度为0.5mg/ml，纯度为86.2％，含his标签。CD39-diannexin融合蛋白的SDS-PAGE条带如图2所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2血小板激活后形成不同亚群
为了观察血小板的不同形态特征，首先在共聚焦小皿上包被胶原(浓度：20μg/ml)并置于4℃冰箱过夜；第二天弃去胶原，加入5％人血清白蛋白在4℃封闭30min，弃去多余液体。
收集健康育龄女性3.2％枸橼酸钠抗凝的全血，在室温条件下离心获得富含血小板血浆(platelet rich plasma,PRP)，再次离心获得血小板，调整血小板悬液浓度为2×106/ml；将血小板悬液加入包被有胶原的共聚焦小皿内，在37℃孵育60min；加入PBS缓冲液，在摇床上润洗5min，重复此操作3次，最终弃去多余液体；加入2.5％多聚甲醛固定1小时，随后用PBS润洗3次。在进行扫描电镜观察前经过一系列脱水程序使标本呈干燥状态于镜下观察血小板形态。如图3所示,在扫描电镜下，至少能观察到三种不同形态的血小板:第一种为静息血小板，表面平整光滑；第二种为聚集亚群血小板，向四周伸出大量伪足；第三种为促凝亚群血小板，自身向四周发生延伸并且膨胀。
实施例3子痫前期患者血小板激活转变成促凝血小板的比例变化
3.1研究对象入选
在北京大学第三医院入选健康育龄女性12例、健康妊娠女性19例，子痫前期(preeclampsia，PE)孕妇15例，入选标准和排除标准见下表2。
表2研究对象入排标准
Figure BDA0003252364310000081
Figure BDA0003252364310000091
3.2通过流式细胞术构建促凝血小板检测方法
(1)用3.2％枸橼酸钠的抗凝管经肘中静脉采集3ml静脉全血，颠倒混匀，立即对新鲜全血进行处理。
(2)取6支1.5ml离心管，分别标记1-6号数字(分别作为同型对照管、CD41a单阳管、CD62P单阳管、GSAO单阳管、静息组、激活组)，向其中加入15μl抗凝全血，再加入GPRP(终浓度：2.5mM)，向1-4、6号管中加入胶原(终浓度：15μg/ml)，凝血酶(终浓度：2u/ml)。
(3)向1-6号管中分别各加入荧光标记抗体，按如表3所示方式加入。
表3各组荧光抗体加入方式
序号 抗体
1 3ul PE Cy7 isotype+3ul PE isotype+3ul GSCA(GSAO的同型对照)
2 3ul PE Cy7 CD41a
3 3ul PE CD62P
4 1ul GSAO
5 3ul PE Cy7 CD41a+3ul PE CD62P+1ul GSAO
6 3ul PE Cy7 CD41a+3ul PE CD62P+1ul GSAO
(4)最终向各组中加入PBS，调整体系体积为100μl，在室温孵育15min。
(5)加入1ml PBS进行洗涤；在室温，3000rpm条件下，离心5min，弃上清，加入500μlPBS重悬，上机检测。
通过1-4号管调节FSC、SSC以及各个荧光通道的阈值、电压以及荧光信号间的补偿，首先通过FSC-SSC圈出血小板大致所在位置，[图4(a)，P1门]，其次通过SSC-CD41a圈出CD41a阳性血小板位置，后续分析均基于CD41a阳性血小板进行[图4(b)，P2门]；CD62P和GSAO荧光通道的阴性和阳性细胞分界通过同型对照管位置进行界定[图4(c)，Q2区域内为促凝血小板]。
3.3子痫前期孕妇促凝血小板水平显著高于健康育龄女性和健康妊娠女性
健康育龄女性、健康妊娠女性和子痫前期孕妇各组入选研究对象的促凝血小板生成水平检测结果见图5和表4。
表4三组研究对象在静息和激活条件下促凝血小板水平比较
Figure BDA0003252364310000101
注：健康育龄女性组：n＝15，健康妊娠女性组：n＝19，子痫前期组：n＝15
检测结果表明：三组研究对象在静息时促凝血小板的水平：子痫前期孕妇促凝血小板水平显著高于健康育龄女性和健康妊娠女性；三组研究对象在激活后促凝血小板水平：子痫前期孕妇促凝血小板水平显著高于健康育龄女性和健康妊娠女性。
实施例4 CD39-diannexin对子痫前期患者的治疗作用
4.1 CD39-diannexin融合蛋白可特异的与磷脂酰丝氨酸膜表面结合
为验证CD39-diannexin能与磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)膜特异性结合，制备表面仅含PS的脂质微球和表面仅含PC的脂质微球(阴性对照)，透射电镜观察两种脂质微球的直径，均约500nm，形状无明显差异，如图6所示。
两种脂质微球分别与CD39-diannexin孵育，随后加入anti-his标签的荧光抗体与CD39-diannexin结合染色，在激光扫描共聚焦显微镜下观察两种脂质微球表面的荧光染色情况，结果显示：PS脂质微球表面可见绿色荧光，见图7(a)，PC脂质微球表面未见绿色荧光，见图7(b)，且anti-his标签的荧光抗体未与脂质微球非特异性结合，见图7(c)。证明CD39-diannexin特异的只与PS结合，而不与PC结合。
4.2 CD39-diannexin融合蛋白可与血小板表面暴露的PS结合
用钙酶素A23187处理人富血小板血浆，血小板细胞膜内侧的PS会外翻暴露于表面，可被CD39-diannexin识别并结合，结果如图8(a)，激活血小板表面存在强绿色荧光；而对照静息血小板由于离心、洗涤等机械刺激可能存在少量激活，所以表现弱荧光信号如图8(b)，证明CD39-diannexin融合蛋白可以与血小板表面暴露的PS结合。两组各选取8-10个视野，明场计数100个血小板，分析各组血小板细胞膜的荧光强度，结果如图8(c)，激活组的血小板细胞膜的荧光强度显著高于对照组(t test,P<0.01)。证明CD39-diannexin融合蛋白可以与血小板表面暴露的PS结合。
4.3 CD39-diannexin融合蛋白具有水解ATP的活性
将CD39-diannexin分别与PS脂质微球和PC脂质微球孵育，洗涤后各分为高、低两个浓度组，分别加入至同样浓度的ATP标准液中，检测ATP标准液被水解后剩余的ATP浓度(腺苷三磷酸双磷酸酶为阳性对照)。检测结果见图9和表5，可见：CD39-diannexin高、低浓度组和PS脂质微球高、低浓度组都可以明显水解ATP，而PC脂质微球组都不能水解ATP，表示CD39-diannexin融合蛋白本身具有ATP水解活性，并且与PS脂质微球特异结合后仍然具有ATP水解活性。
表5 CD39-diannexin融合蛋白水解ATP实验
Figure BDA0003252364310000111
注：*P<0.05；#P>0.05。
4.4 CD39-diannexin可以抑制血小板表面凝血酶生成
促凝血小板的外表面暴露大量的PS，成为凝血酶原酶复合物组装界面，可以促进凝血酶正反馈大量生成，随后纤维蛋白原覆盖其上形成纤维蛋白，最终形成牢固栓子。
收集健康育龄女性的3.2％枸橼酸钠抗凝的全血，在室温条件下离心获得PPR，调整PRP浓度为2×106/ml；将PRP加入包被有胶原(浓度：20μg/ml)的共聚焦小皿内，在室温条件下孵育15min；弃去多余液体，仅剩余薄薄一层液体即为固定于共聚焦小皿内胶原上的血小板；加入组织因子(浓度：5pmol/L)和凝血酶底物Z-Gly-Gly-Arg-AMC(浓度：450μmol/L)启动凝血反应，5min后在共聚焦镜下寻找血小板视野并记录荧光强度，在明场分别计数各组100个血小板，分析平均荧光强度，各组镜下凝血酶生成情况及定量分析结果如图10所示——激光扫描共聚焦显微镜验证CD39-diannexin可以抑制血小板表面凝血酶过度生成，而过度的凝血酶生成会导致高凝，是促进血栓发生的主要原因之一。
4.5 CD39-diannexin可以抑制血小板Ca2+内流
当血小板受到激活时，Ca2+内流，当达到线粒体通透性转换孔(mitochondrialpermeability transition pore,mPTP)开放阈值时，mPTP开放可触发持续更高水平胞浆Ca2+浓度，激活钙蛋白酶。因此，抑制Ca2+的内流或许可以抑制促凝血小板的生成。环孢霉素(cyclosporin，CsA)被证实可以抑制mPTP组装，阻碍促凝亚群形成，因此将其做为阳性对照分析CD39-diannexin是否也具有抑制Ca2+内流的效果。
选取健康育龄女性3.2％枸橼酸钠抗凝全血，将血样分成四组，分别为对照组、激活组、CsA干预组和CD39-diannexin干预组，运用流式细胞技术分析并记录血小板内部Ca2+强度随时间变化的趋势，实验结果如图11所示：(a)静息组血小板内Ca2+强度随时间变化，在10min内血小板内Ca2+强度保持不变；(b)激活组(在1min时加入Ca2+和胶原以及凝血酶激活)在1min后血小板内部Ca2+浓度显著升高；(c)CsA干预组(加入CsA预孵育10min)在1min时加入Ca2+和胶原以及凝血酶激活，该组血小板Ca2+浓度未出现显著升高的趋势；(d)CD39-diannexin干预组(加入CD39-diannexin预孵育10min)在1min时加入Ca2+和胶原以及凝血酶激活，该组血小板Ca2+浓度未出现显著升高的趋势。
为针对性验证促凝血小板内部Ca2+浓度变化情况，选取健康育龄女性3.2％枸橼酸钠抗凝全血，将血样分成四组，分别为对照组、激活组、CsA干预组和CD39-diannexin干预组，各组均收集5,000个促凝血小板，运用流式细胞技术分析收集的促凝血小板内部Ca2+浓度，结果如图12所示，结果显示：CsA干预组和CD39-diannexin干预组Ca2+阳性的促凝血小板数量均显著低于对照组和激活组，说明CsA和CD39-diannexin均可以抑制促凝血小板内Ca2+水平；*P<0.05，**P<0.01，#P>0.05
4.6 CD39-diannexin可以抑制子痫前期患者促凝血小板生成水平
为验证CD39-diannexin是否可以抑制子痫前期患者的促凝血小板生成水平，另外收集一组研究对象(健康妊娠女性：n＝20；健康妊娠女性：n＝20；子痫前期孕妇：n＝12)按照如下方式制备洗涤的血小板：
(1)用3.2％枸橼酸钠的抗凝管经肘中静脉采集3ml静脉全血，颠倒混匀，立即对新鲜全血进行处理；
(2)在室温，230g条件下，离心7min，获取上层即为PRP；PRP在室温，300g条件下离心5min，弃上清获取沉淀血小板部分；加入PBS缓冲液洗涤2次，在室温，300g条件下离心5min，即得到洗涤后的血小板悬液，调整血小板悬液浓度为1×107/ml；
(3)取8支1.5ml离心管，分别标记1-6号数字(分别作为同型对照管、CD41a单阳管、CD62P单阳管、GSAO单阳管、静息组、激活组、CsA干预组、CD39-DA干预组)，向其中加入100μl的血小板悬液，再加入GPRP(终浓度：2.5mM)，向7、8号管中分别加入CsA(终浓度：10μM)和CD39-DA(终浓度：200nM)室温孵育20min，向1-4、6-8号管中加入胶原(终浓度：15μg/ml)，凝血酶(终浓度：2u/ml)，各组加入PBS缓冲液调整体系体积，各组在室温孵育20min；
(4)向1-8号管中加入PBS缓冲液洗涤，在室温，300g条件下离心5min，收集沉淀，用于检测促凝血小板。
(5)向1-8号管获得的血小板中加入PBS重悬，按照下表6方式加入荧光抗体，在室温避光孵育20min
(6)向1-8号管中加入1ml PBS洗涤血小板，在室温300g条件下离心5min，弃上清，获得沉淀即为血小板，加入500ul PBS重悬，上机检测。
表6各组荧光抗体加入方式
序号 抗体
1 3ul PE Cy7 isotype+3ul PE isotype+3ul GSCA(GSAO的同型对照)
2 3ul PE Cy7 CD41a
3 3ul PE CD62P
4 1ul GSAO
5 3ul PE Cy7 CD41a+3ul PE CD62P+1ul GSAO
6 3ul PE Cy7 CD41a+3ul PE CD62P+1ul GSAO
7 3ul PE Cy7 CD41a+3ul PE CD62P+1ul GSAO
8 3ul PE Cy7 CD41a+3ul PE CD62P+1ul GSAO
结果如图13所示：三组研究对象在静息、激活、CsA干预以及CD39-DA干预时的促凝血小板水平：(a)健康育龄女性在CsA以及CD39-DA干预时促凝血小板水平显著低于激活组，且CD39-DA干预组促凝血小板水平显著低于CsA干预组；(b)健康妊娠女性在CsA以及CD39-DA干预时促凝血小板水平显著低于激活组，且CD39-DA干预组促凝血小板水平显著低于CsA干预组；(c)子痫前期孕妇在CsA以及CD39-DA干预时促凝血小板水平显著低于激活组，且CD39-DA干预组促凝血小板水平显著低于CsA干预组，说明CsA及CD39-DA能够抑制促凝血小板的水平。健康育龄女性组：n＝20，健康妊娠女性组：n＝20，子痫前期组：n＝12；paired ttest，*P<0.05，***P<0.001。
4.7 CD39-diannexin不影响凝血因子激活和血小板聚集的止血能力
招募健康志愿者6人，用3.2％枸橼酸钠的抗凝管经肘中静脉采集9ml静脉全血，颠倒混匀。不同剂量CD39-DA加入2ml全血中，制备成终浓度分别为50nM,100nM和200nM的样本,37℃温浴30min，取500μl全血在血栓弹力图仪(Haemoscope，美国)进行检测，记录全血凝固过程的全貌。
结果如图14所示，不同浓度CD39-DA不影响凝血因子激活和血小板的聚集止血能力：(a)在新鲜全血中加入不同浓度CD39-DA均不影响反映凝血因子活性的R值长度；(b)在新鲜全血中加入不同浓度CD39-DA均不影响反映血小板聚集能力的MA值的大小。n＝6,#P>0.05。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (6)

1.一种CD39-diannexin融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.:2所示。
2.一种用于预防或治疗子痫前期及其相关病症的药物，其特征在于，所述药物的活性成分为权利要求1所述的CD39-diannexin融合蛋白。
3.根据权利要求2所述的一种用于预防或治疗子痫前期及其相关病症的药物，其特征在于，所述药物为注射制剂或口服制剂。
4.根据权利要求1所述的CD39-diannexin融合蛋白在制备预防或治疗子痫前期的药物中的应用。
5.根据权利要求1所述的CD39-diannexin融合蛋白在制备用于抑制子痫前期促凝血小板产生的药物中的应用。
6.根据权利要求1所述的CD39-diannexin融合蛋白在制备降低子痫前期的炎症水平的药物中的应用。
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