CN115991780A - 一种抗人血小板胶原蛋白受体gp-vi抗体或其抗原结合片段及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及一种抗人血小板胶原蛋白受体GP‑VI抗体或其抗原结合片段及其应用。本发明通过设计重组表达的单链可变区片段(scFv)或与人血清白蛋白的融合片段特异地抑制胶原蛋白对人血小板的激活和阻断人血小板在胶原蛋白覆盖的表面的附着。同时提供了包括scFv抗体衍生片段或与人血清白蛋白的融合重组蛋白的设计和规模化生产，以及其通过抑制血小板的激活来降低心肌缺血后造成的再灌损伤，由此可用于抗血栓和其它心脑血管疾病的治疗和预防，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体或其抗原结合片段及其应用

技术领域

本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及一种抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体或其抗原结合片段及其应用。

背景技术

本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

血小板在血管受损处的粘附和激活聚集，最终会导致血栓形成和出血停止，能够避免失血过度。这是正常人的生理保护机制之一。但是，在血管有病变的情况下，由血小板激活导致形成的血栓会阻塞血管，造成下游组织的缺血甚至坏死，发生如心肌梗死或脑卒中等。因此，抗血栓治疗在医学上有非常广泛的应用。例如用于由血管内皮损伤造成的血栓形成的预防，如冠脉扩张术中用药、心脏瓣膜置换术前和术中的用药，或与心肌梗死或脑栓塞引起的卒中后的溶栓疗法用药相结合等。

通常，血小板的激活聚集过程分为两个阶段。早期是它与一些激活因子特异结合的阶段，晚期时血小板内会产生一系列的连锁反应，从而导致共同通路的激活并形成不可逆血栓(图1)。目前，医学临床上使用的针对抗血小板激活因子的药物有很多，但其存在的问题也很多。例如阿斯匹林虽能够抑制血栓环素TXA₂的形成，但效果太慢；Clopidogrel(氯吡格雷)用于抑制血小板上的ADP受体，效果不能尽如人意，原因是ADP只是多种内源性血小板激活剂之一，而且是较弱的一种；抗TXA₂受体药会引起低血压的副作用；抗凝血酶肽不仅能够抗血栓形成，同时也抗血凝，这使其无法在医学临床中得到应用。有一种针对血小板激活晚期共同信号传递通路的阻断药物REOPRO(一种抗血小板GPIIbIIIa单克隆嵌合抗体)，它阻断血栓形成的效果较好，但它不能区分正常生理止血和病理情况下的血栓形成，因此在临床使用中很容易造成意想不到的内出血。尽管如此，在许多临床治疗中还不得不用它，尤其是进行冠脉扩张术时，因为现有技术中还没有更好的药物替代。

胶原蛋白与其在血小板表面的受体-胶原蛋白受体结合，是激活血小板最强的底物。胶原蛋白受体其中之一“糖蛋白-6”(GP-VI或GP6)只表达在血小板表面(图2)。当血管内皮受到损伤后，就会暴露出内皮下的胶原蛋白。血管内皮损伤和剥脱导致血管基底膜暴露的常见原因包括冠状动脉、颈动脉和颅动脉粥样硬化斑块的溃破或微手术剔除等。被暴露的胶原蛋白能通过与其受体结合激活血小板并导致血栓生成(thrombosis)和凝血(clotting)，形成阻断血流的局面，最终造成心肌缺血(心绞痛和心肌梗死)和脑血液循环障碍(脑卒中)等严重疾病。在抗TXA₂受体、抗ADP受体和抗凝血酶受体等药不能满足临床使用需求下，对抗血小板胶原蛋白受体抗体研究成为当今抗血小板药物的研究热点。

胶原蛋白具有分子大、凝聚后结构复杂的特征(胶原纤维)，小分子化学药物不能阻断它与其受体的结合和由此导致的血小板的激活和血栓形成。而单克隆抗体，由于与靶点亲和力强和特异性高、且由于分子量大而可起到有效的阻断作用，再加上人源化后不太容易引起中和性抗体的产生和造成副作用，因此被公认为是阻断胶原蛋白受体“糖蛋白-6”最佳的选择和被首先开发的对象。人们首先是对血小板胶原蛋白受体“糖蛋白-6”进行分子克隆，以此可以用来作为免疫靶点和下一步的单克隆抗体的筛选。经过多年的努力，现今，几家试验室已经研究得到了多个有阻断效应的单克隆抗体(Matsumoto et al.ThrombosisRes.119:319-329，2007。Masberg et al.JEM 197:41-49，2002。Lecut et al.J ThromHaemosta 1:2653-2662，2003。Moroi et al Throm Haemosta 89:996-1004，2003。Chen etal JBC 277:3011-3019，2002)。这些单克隆抗体不仅在多肽氨基酸的序列和亲和力不同，在胶原蛋白受体“糖蛋白-6”上结合(抗原上的识别)的位点也不一样。有两家试验室还获得了胶原蛋白受体“糖蛋白-6”基因敲除的小鼠(Kato et al.Blood 102:1701-1707，2003。Lockyer et al.Thrombosis Res.，118:371-380，2006)。无论是用单克隆抗体还是基因敲除的小鼠，体外(包括人和动物)和动物(包括猴子)体内的试验，都证实了胶原蛋白受体“糖蛋白-6”是很好抗血栓药物的靶点：既有效但又不引起出血时间延长(不同于REOPRO)；而且还证实单克隆抗体是有效的胶原蛋白受体“糖蛋白-6”的阻断剂。因此，通过阻断胶原蛋白受体“糖蛋白-6”而具有阻断胶原蛋白激活血小板的单克隆抗体有望成为具有广泛临床应用价值的抗血栓药。

现有技术中，产生单克隆抗体的方法是：先将抗原(如表达人胶原蛋白受体“糖蛋白-6”的细胞株或纯化的重组人胶原蛋白受体“糖蛋白-6”)注入小鼠体内进行免疫；然后从其脾脏提取出B淋巴细胞与浆细胞瘤细胞进行融合，得到杂交瘤(hybridoma)细胞；筛选后再从生存的杂交瘤单细胞珠中筛选出能分泌抗胶原蛋白受体“糖蛋白-6”的单株，最后通过对血小板激活的功能分析试验或用表达重组人胶原蛋白受体“糖蛋白-6”的细胞，找出对胶原蛋白受体“糖蛋白-6”有阻断作用和高亲合力的单克隆抗体和产生此抗体的杂交瘤细胞株。由于完整的抗胶原蛋白受体“糖蛋白-6”抗体或F(ab)₂双价片段会激活血小板(可能是因为这些双价的抗体或片段会将两个血小板表面的胶原蛋白受体“糖蛋白-6”带到一起近距离“交联”激活下游信号通道，进而激活血小板)，因此在临床应用中只能用Fab或scFv(单价的)来发展成阻断性药物。事实上，应用到临床前，还需要将这鼠源性单抗进行人源化改造，以使其蛋白序列尽量接近人源性抗体，最大可能地减少病人身体对注入的外源性蛋白药物引起的免疫中合反应。因此需要将单抗的核苷酸序列先从杂交瘤细胞中克隆出来，人源化后，再用重组蛋白表达的技术和哺乳细胞生产出来，最终经纯化和灭病毒后方可用于病人的治疗。整个过程所需应用的技术十分复杂，且制备成本高。

1987年，日本的Minoru Okuma教授从他的一个患有血小板减少性紫癜病人的血清中分离出有抗血小板功能的抗体(多克隆)(Sugiyama et al.，Blood 69:1712-20 1987。Moroi et al.，J.Clin.Invest.84:1440-45，1989。Ryo etal.，Am.J.Hematol.39:25-31，1992。Arai et al.，Brit.J.Haematol.89:124-130，1995)。利用此抗体，多家试验室不仅检测和证实了血小板膜上的分子量大小为62kDa的蛋白就是胶原蛋白受体“糖蛋白-6”，也证实了血小板在胶原蛋白表面的附着和胶原蛋白诱导的激活也可以被此抗体阻断(Nakamuraet al.J.Biol.Chem.273:4338-4344，1998)。因为这个多克隆抗体是从一病人血清中得到的，数量有限，也无法进行工业化生产，但这些研究结果明确提示，抗胶原蛋白受体“糖蛋白-6”的抗体可成为阻断胶原蛋白激活血小板的药物，还可用于预防血栓的形成。

直接筛查抗GP-VI抗体是对血小板有亲和性的有核白细胞(B lymphocyte)进一步用反转录-多聚酶连锁放大反应(RT-PCR)与人免疫球蛋白IgG的重链和轻链的引子配合，克隆出抗GP-VI的单克隆抗体的轻链和重链可变区片段的序列。最后以单链的形式(scFv)在其它哺乳类细胞或酵母内表达分泌和纯化后，再经功能筛选后找到有阻断人GP-VI与胶原蛋白相结合的scFv。而且只对胶原蛋白引起的人的血小板富集血浆(platelets-richplasma或PRP)和全血的血小板激活有抑制作用，而对二磷酸腺苷(ADP)、U46619、肾上腺素(epinephrine)、花生四烯酸(ararchidonic acid)和凝血酶(thrombin，对洗过的血小板)等激活剂毫无作用。此scFv也同样抑制人血小板在胶原蛋白表面的附着。

由于scFv的分子量小，容易穿过细胞间隙而进入组织中，在血液循环中停留的时间(半衰期)非常短。为了克服这一缺点和增加血液中的浓度，需要设计与其它多肽如人血清白蛋白的融合蛋白。血清白蛋白是血浆中主要的蛋白成分。与血清白蛋白结合的融合蛋白不仅分子量增加了两倍，还增加了在水相中的溶解度避免形成聚集(已知聚集的抗GP-VI抗体片段Fab本身会造成血小板的激活)。在不影响抗体与GP-VI之间亲和力的情况下，利用其血清白蛋白占有的空间有可能增加抗体阻断血小板上的GP-VI与胶原蛋白纤维的结合，从而起到更有效的抗血小板激活和抗血栓形成的作用。

由动脉粥样硬化造成的急性心脑血管疾病一般都伴有血小板激活和血栓形成，进而导致血管堵塞。由于血管阻塞和长时间缺血和缺氧，下游的血管内皮受损脱落而导致血管基底层(胶原蛋白纤维)暴露。溶栓治疗后堵塞的血管重新通畅，大量血液和血小板进入下游的血管内。由于基底层的暴露，更多的血小板激活而造成进一步的心肌或脑损伤(即所谓的“再罐损伤“)。阻塞的冠状动脉可通过血管扩张术和/或溶栓治疗重新开放，导致先前缺血的肌肉再灌注。虽然再灌注对于挽救缺血肌肉至关重要，但再灌注本身可能会造成二次血小板激活和血栓形成对肌肉造成额外的损伤。理想情况下，心脏病发作的治疗包括尽量减少发作期间的心肌梗死。然而，由于通常很难预测心脏病发作的发生，因此不太可能进行预判性治疗。因此，血管扩张术和/或溶栓治疗，再结合减少再灌注损伤的治疗(例如，在救护车或急诊室中给予)可能更为实用。减少再灌注损伤的治疗可能会改善心脏病发作/缺血的恢复，并限制发生心力衰竭的可能性。减少心肌梗死的治疗有望挽救生命。还可以缩短住院时间，提高生活质量，降低高危患者的总体医疗成本。不幸的是，目前没有这种治疗方法。已经尝试了各种治疗，但似乎都失败了(见Downey和Cohen的评论，Prog CardiovascDis.，48:363-371，2006)。目前推荐使用阿司匹林、氯吡格雷和

等抗血栓干预措施来防止冠状动脉闭塞/再闭塞。然而，它们不能直接保护再灌注损伤。事实上，阿司匹林可能干扰某些内源性心脏保护途径，并可能增加梗死(Gross等人，《药理学实验杂志》，310:185-191，2004)。抗GP-VI抗体(Fab或scFv或scFv与血清白蛋白的融合蛋白)有望通过抑制再灌过程中暴露的血管内皮下的胶原蛋白造成的血小板激活，从而达到避免或降低再灌损伤的治疗效果。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的在于提供一种抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体或其抗原结合片段及其应用。本发明从获得单抗的基因序列设计或与人血清白蛋白序列多种排列组合，最终制备出有阻断效应的scFv或大分子融合蛋白，及其作为治疗和预防血栓性心脑血管疾病的药物的应用。

为了实现上述技术目的，本发明提供的技术方案如下：

本发明的第一个方面，提供一种抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体或其抗原结合片段，所述抗体其至少包含(a)靶向GP-VI的抗体元件，所述靶向GP-VI的抗体元件可以为抗GP-VI单链抗体(scFv)，其可以有效阻断GP-VI，所述抗GP-VI单链抗体至少包含3个重链可变区HV序列和3个轻链可变区LV序列，其氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:18-23所示的序列，或与SEQ ID NOs:18-23所示的序列具有≥80％序列同一性的序列，或与SEQ ID NOs:18-23所示的序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变的氨基酸序列。

所述抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体还可以包含：(b)人免疫球蛋白Fc区和/或人血清白蛋白(HSA)或其片段、结合血清白蛋白的结构域、聚乙二醇、聚乙二醇-脂质体复合体，或其组合。

需要说明的是，本发明的抗体的“抗原结合片段”是抗体的一部分，即对应于本发明的抗体的结构的一部分的分子，这些抗原结合片段也可以被称为抗体的功能片段，这种片段对所述抗原特别表现出相同或基本上相同的抗原结合特异性和亲和力。

本发明的第二个方面，提供一种多聚核苷酸，所述多聚核苷酸能够编码上述抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体或其抗原结合片段。

本发明的第三个方面，提供一种重组表达载体，其包含上述分离的多聚核苷酸。

本发明的第四个方面，提供一种宿主细胞，其包含上述表达载体，或包含了整合到宿主细胞基因组中的上述多聚核苷酸；或者，所述宿主细胞表达上述抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体或其抗原结合片段。

本发明的第五个方面，提供一种产生抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体或其抗原结合片段的方法，包括步骤：

(I)在适合产生抗体的条件下，培养上述宿主细胞，从而获得含所述抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体或其抗原结合片段的培养物；以及，

(II)从所述培养物中分离或回收所述抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体或其抗原结合片段。

本发明的第六个方面，提供一种重组多肽偶联物，其包括本发明所述的抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体或其抗原结合片段，以及偶联部分，其中，所述偶联部分为可检测的标记物、药物、毒素、细胞因子、病毒外壳蛋白或VLP等。

本发明的第七个方面，提供一种试剂盒，其包括上述抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体或其抗原结合片段，和/或上述偶联物；所述试剂盒可用于检测人血小板胶原蛋白受体GP-VI在样品中的存在或其浓度。

本发明的第八个方面，提供一种药物组合物，其包括上述抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体或其抗原结合片段，或者上述免疫偶联物。

本发明的第九个方面，提供上述抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体或其抗原结合片段、免疫偶联物或药物组合物在制备血栓性心脑血管疾病预防和/或治疗包括再灌注损伤的产品中的应用。

更具体的，所述产品至少具有如下功能：

(a)阻断人血小板胶原蛋白受体GP-VI；

(b)抑制血小板的激活、粘附聚集以及血栓形成；

(c)抑制再灌注损伤或梗死后再灌注损伤来减少梗死或减低对器官功能的不良影响。

本发明的第十个方面，提供一种预防和/或治疗血栓性心脑血管疾病的方法，所述方法包括：给所述对象施用上述抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体或其抗原结合片段、免疫偶联物或药物组合物。

上述一个或多个技术方案的有益技术效果：

上述技术方案通过设计重组表达的单链可变区片段(scFv)或与人血清白蛋白的融合片段特异地抑制胶原蛋白对人血小板的激活和阻断人血小板在胶原蛋白覆盖的表面的附着。同时提供了包括scFv抗体衍生片段或与人血清白蛋白的融合重组蛋白的设计和规模化生产，以及其通过抑制血小板的激活来降低心肌缺血或缺血后造成的再灌心脑组织损伤，由此可用于抗血栓和其它心脑血管疾病的治疗和预防，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1：血小板激活和血栓的形成示意图，表明GP-VI在血小板激活和血栓形成中起着极为重要的作用；

图2：血小板膜蛋白受体GP-VI的分子结构和与FcRgamma形成的二聚体功能结构；

图3：人工合成GP-VI HSA-scFv核苷酸双链后导入的质粒结构和位点；

图4：毕赤菌表达载体的结构和导入位点及走向；

图5：毕赤菌表达载体导入位点附近的碱基序列、插入位点和GP-VI scFv片段插入示意图；

图6：SDS-PAGE(考马斯克蓝染色)：重组蛋白表达和分子大小鉴定。最右端第16道是蛋白分子大小标准，其每个条带的大小分别标注在右侧。第1-7道为HSA-scFv(VH-VL)，第8-14道为HSA-scFv(VL-VH)，第15道为scFv(VH-VL)；

图7：GP-VI与胶原蛋白的粘附结合阻抑试验。a,第一条Fab(OM-2，鼠源抗GP-VI单克隆抗体Fab，浓度每毫升3微克)作为有效阳性对照；B1-1是阴性对照；B1-2至4和8至10是HSA-scFv(I)(VH-VL)，显示出阻断效应；B1-5至7是HSA-scFv(II)(VL-VH)无效；B2-9和2-13是scFv(I)(VH-VL)。所有表达的上清经过1：100稀释，稀释采用的是粘附结合阻抑试验的结合液(0.2％ BSA in 1mM EDTA-PBS，pH 7.4)。b,浓度梯度抑制试验，scFv(I)(VH-VL)和HSA-scFv(I)(VH-VL)呈现与稀释度相平行的抑制效应，OM-2(鼠源抗GP-VI单克隆抗体Fab浓度每毫升3微克)作为阳性对照；

图8：显示了野生型和GP-VI基因敲除小鼠心肌梗死面积的比较。缺血30分钟和再灌注24小时后，GP-VI基因敲除小鼠的心肌梗死明显小于野生型小鼠。每个开放圆代表单个小鼠的梗死面积，闭合圆代表组平均值±SD。数据采用t检验进行分析，p<0.05具有统计学意义；

图9：a，显示了缺血和再灌注后野生型和GP-VI基因敲除小鼠心肌中P-selectin表达的比较。显示了来自心内膜和心肌中部的代表性荧光图像。GP-VI基因敲除小鼠心肌中的P-selectin表达如绿色所示(或黑白图中亮白色所示)减少(暗背景荧光是由于心肌自身荧光所致)。在野生型小鼠的5个心脏和GPVI基因敲除小鼠的5个心脏中分别获得了类似的结果。b，显示了高P-selectin表达区域的定量。GP-VI基因敲除(KO)小鼠的P-selectin水平显著低于野生型(WT)小鼠(n＝5)，表明GP-VI在诱导血小板活化和心肌聚集中起重要作用；

图10：显示了由于缺血后再灌注，野生型小鼠心脏中的胶原暴露。左侧图像显示了缺血30分钟后再灌注15分钟的心脏的代表性切片。绿色(或黑白图中的亮白色)代表暴露的胶原蛋白(暗背景荧光是由于心肌自身荧光)。另外3只动物也获得了类似的结果。右侧图像显示了暴露于缺血30分钟但没有随后再灌注的心脏的代表性切片。没有明显的绿色荧光(或黑白图中没有明亮的白色)，表明没有暴露胶原蛋白。从另外2只动物身上获得了类似的结果。总之，这些数据表明内皮损伤发生在再灌注过程中；

图11：a显示了重组抗GP-VI HAS-scFv(I)(VH-VL)对猴子的梗死减少作用。该图显示了危险区与梗死区的散点图，并为每个指定治疗组绘制了回归线。对照组猴子的梗死与危险区的大小呈线性相关。由于所有数据点均低于对照组的回归线(p<0.05)，使用重组融合抗体片段单剂量或双剂量治疗的猴子减少了心肌梗死。此外，单剂量或双剂量治疗的猴子的减少情况相似，表明其保护作用发生在再灌注期间。梗死数据采用方差分析(ANOVA)进行分析。图b显示抗体对猴子血液中血小板聚集的抑制作用。在给药(2mg/kg)之前(给药前)和之后(给药后4小时)，从猴子中提取血样。使用全血聚集仪在体外试验中测定胶原诱导的血小板聚集。b显示了胶原诱导血小板聚集的测量结果。在接受重组抗体融合片段的动物的全血中，胶原诱导的血小板聚集被完全抑制。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。

术语“抗体”或“免疫球蛋白”在本文中无论是指重链抗体还是指常规四链抗体，均用作一般术语以包括全长抗体、其单个的链以及其所有部分、结构域或片段(包括但不限于抗原结合结构域或片段，分别例如VHH结构域或VH/VL结构域)。此外，本文所用的术语“序列”(如在“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“单一可变结构域序列”、“VHH序列”或“蛋白序列”等的术语中)一般应理解为既包括相关氨基酸序列，又包括编码所述序列的核酸序列或核苷酸序列，除非本文需要更限定的解释。

术语(多肽或蛋白的)“结构域”是指折叠蛋白结构，其能够独立于蛋白的其余部分维持其三级结构。一般而言，结构域负责蛋白的单个的功能性质，且在许多情况下可添加、移除或转移至其他蛋白而不损失蛋白的其余部分和/或结构域的功能。

术语“单链抗体scFv”，是由抗体重链可变区和轻链可变区直接连接或通过连接片段(linker)连接而成。scFv能较好地保留其对抗原的亲和活性，并具有分子量小、穿透力强和抗原性弱等特点。

两个多肽序列之间的“序列一致性(sequence identity)”指示序列之间相同氨基酸的百分比。“序列一致性”指示相同氨基酸取代的氨基酸的百分比。用于评价氨基酸或核苷酸之间的序列一致性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，氨基酸序列一致性通常使用序列分析软件来测量。例如，可使用NCBI数据库的BLAST程序来确定相同性。

药剂的“有效量”指引起接受其施用的细胞或组织中的生理学变化所必需的量。

药剂例如药物组合物的“治疗有效量”指在必需的剂量和时间段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。治疗有效量的药剂例如消除、降低、延迟、最小化或预防疾病的不良效果。

“个体”或“受试者”可以是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，驯养的动物(例如母牛、羊、猫、犬和马)、灵长类(例如人和非人灵长类如猴)、家兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。优选地，所述个体或受试者是人。

术语“药物组合物”指其形式使得其中含有的活性成分的生物学活性有效，且不含对会接受该组合物施用的受试者有不可接受的毒性的其他成分的制剂。

术语“治疗/预防”指试图改变治疗个体中疾病的自然进程，并且可以是为了预防或在临床病理学的过程期间实施的临床干预。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓解症状、降低疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病的形成或延缓病症的进展。

本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体或其抗原结合片段，所述抗体其至少包含(a)靶向GP-VI的抗体元件，所述靶向GP-VI的抗体元件可以为抗GP-VI单链抗体(scFv)，其可以有效阻断GP-VI，所述抗GP-VI单链抗体至少包含3个重链可变区HV序列和3个轻链可变区LV序列，其氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:18-23所示的序列，或与SEQ ID NOs:18-23所示的序列具有≥80％(优选如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％，进一步优选如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的序列，或与SEQ ID NOs:18-23所示的序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列。

多肽氨基酸多肽序列具体如下所示：

HV region 1：DYYLS(SEQ ID NO.18)

HV region 2：WISTGDGNTRYPQKFQG(SEQ ID NO.19)

HV region 3：SADIYFRYFDV(SEQ ID NO.20)

LV region 1：RASQGISSYLA(SEQ ID NO.21)

LV region 2：NASILQS(SEQ ID NO.22)

LV region 3：QHFWTAPFN(SEQ ID NO.23)

在结构上，可以将重链可变区的N端与轻链可变区的C端直接相连或通过连接片段(linker)连接，也可以将轻链可变区的N端与重链可变区的C端直接相连或通过连接片段(linker)连接。所述连接片段优选选自由丙氨酸和/或丝氨酸和/或甘氨酸组成的多肽链，连接肽的长度优选为3～30个氨基酸，具有一定弹性及蛋白酶抗性。

本发明的抗体的“抗原结合片段”是抗体的一部分，即对应于本发明的抗体的结构的一部分的分子，这些抗原结合片段也可以被称为抗体的功能片段，这种片段对所述抗原特别表现出相同或基本上相同的抗原结合特异性和亲合力。

所述抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体可以独立地包含1个或多个(如1-3个)靶向GP-VI的抗体元件；较佳的，其可以独立地包含1或2个靶向GP-VI的抗体元件。

所述抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体还可以包含：(b)人免疫球蛋白Fc区和/或血清白蛋白或其片段、结合血清白蛋白的结构域、聚乙二醇、聚乙二醇-脂质体复合体，或其组合；

进一步的，所述抗体中可以包含1个或多个(如1-3个)人免疫球蛋白Fc区和/或血清白蛋白(如人源的HSA)或其片段、结合血清白蛋白的结构域(如抗血清白蛋白抗体，包括纳米抗体)、聚乙二醇、聚乙二醇-脂质体复合体，或其组合。

所述抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体中，所述(a)和(b)可以直接连接或通过连接片段(linker)连接；所述连接片段优选选自由丙氨酸和/或丝氨酸和/或甘氨酸组成的多肽链，连接肽的长度优选为3～30个氨基酸。

在结构上，可以将所述(a)的C端直接(或通过连接片段)连接于所述(b)的N端，或者所述(b)的C端直接(或通过连接片段)连接于所述(a)的N端。

本发明又一具体实施方式中，提供一种多聚核苷酸，所述多聚核苷酸能够编码上述抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体或其抗原结合片段。

本发明又一具体实施方式中，提供一种重组表达载体，其包含上述分离的多聚核苷酸。

具体的，所述重组表达载体是由上述多聚核苷酸与表达载体进行有效连接获得，所述表达载体可以选自：DNA、RNA、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移系统、或其组合；优选地，所述表达载体包括病毒载体，如慢病毒、腺病毒、AAV病毒、逆转录病毒、或其组合。

本发明又一具体实施方式中，提供一种宿主细胞，其包含上述表达载体，或包含了整合到宿主细胞基因组中的上述多聚核苷酸；或者，所述宿主细胞表达上述抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体或其抗原结合片段。

所述宿主细胞包括原核生物和真核生物来源的细胞。其中，原核生物优选大肠杆菌，真核生物包括酵母(毕赤酵母)、植物(或细胞)、昆虫(或细胞)和哺乳动物(或细胞)，其中哺乳动物细胞包括CHO、NS0、HEK293、PERC6等，优选CHO细胞。

本发明又一具体实施方式中，提供一种产生抗人血小板胶原蛋白受体GPVI抗体或其抗原结合片段的方法，包括步骤：

(I)在适合产生抗体的条件下，培养上述宿主细胞，从而获得含所述抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体或其抗原结合片段的培养物；以及，

(II)从所述培养物中分离或回收所述抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体或其抗原结合片段。

本发明又一具体实施方式中，提供一种重组多肽偶联物，其包括本发明所述的抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体或其抗原结合片段，以及偶联部分，其中，所述偶联部分为可检测的标记物、药物、毒素、细胞因子、病毒外壳蛋白或VLP等。

其中，所述可检测的标记物包括放射性同位素、荧光物质、化学发光物质、有色物质或酶。

所述药物可以为细胞毒性药物，如抗微管蛋白药物、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。

所述毒素可以为耳他汀类、金霉素、类美坦西醇、篦麻毒素、溴化乙锭、丝裂霉素、白喉毒素、相思豆毒素、白树毒素、迈托毒素、局限曲菌素、酚霉素、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、卡奇霉素、糖皮质激素等。

所述重组多肽偶联物含有多价(如二价)的如本发明所述的抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体。所述多价是指在所述重组多肽偶联物的氨基酸序列中包含多个重复的如本发明所述的抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体。

本发明又一具体实施方式中，提供一种试剂盒，其包括上述抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体或其抗原结合片段，和/或上述偶联物；所述试剂盒可用于检测人血小板胶原蛋白受体GP-VI在样品中的存在或其浓度。

优选地，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别上述抗体；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记物，例如放射性同位素、荧光物质、化学发光物质、有色物质或酶。

本发明又一具体实施方式中，提供一种药物组合物，其包括上述抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体或其抗原结合片段，或者上述重组多肽偶联物。

所述药物组合物还可以包含至少一种药物非活性成分。

所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。

所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。

本发明的又一具体实施方式中，所述载体、赋形剂及稀释剂包括但不限于有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯等。

本发明的又一具体实施方式中，本发明的药物组合物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如血小板、靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。

本发明又一具体实施方式中，提供上述抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体或其抗原结合片段、重组多肽偶联物或药物组合物在制备血栓性心脑血管疾病预防和/或治疗的产品中的应用。

更具体的，所述产品至少具有如下功能：

(a)阻断人血小板胶原蛋白受体GP-VI；

(b)抑制血小板的激活、粘附聚集以及血栓形成；

(c)抑制再灌注损伤或梗死后再灌注损伤来减少梗死或减低对器官功能的不良影响。

本发明又一具体实施方式中，提供一种预防和/或治疗血栓性心脑血管疾病的方法，所述方法包括：给所述对象施用上述抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体或其抗原结合片段、重组多肽偶联物或药物组合物。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。

实施例

1.用正常人的血小板作为胶原蛋白受体“糖蛋白-6”的抗原来源(免疫原)，用血小板减少性紫癜病人(缺乏血小板胶原蛋白受体“糖蛋白-6”)作为免疫受体，制备得到病人表达抗GP-VI抗体的B淋巴细胞，并由此提取核苷酸：

(1)筛选病人：与医院血液病科室合作，对患有血小板减少性紫癜的病人在征得病人本人和家属同意后，选用枸橼酸钠作为抗凝剂抽血15毫升，通过低速离心获得上清(富含血小板血浆platelets-rich plasma或PRP，具体方法参照Sun，B et al.J.CardiovascularPharmacol.40:557-585，2002)。取400微升所得上清放到血小板聚集仪上37摄氏度预热，再用10或20微摩尔(μM)二磷酸腺苷(ADP)确证此病人的血小板可以在搅拌(每分钟1千转)状态下发生聚集。然后加入马跟腱的一型纤维化的胶原蛋白(1到2微克/毫升)来诱发血小板发生聚集。没有反应的病人，进一步确认是否有过输血史。接下来筛查病人血内是否有自身抗胶原蛋白受体“糖蛋白-6”抗体。所用的方法也是用血小板聚集，因为完整的抗胶原蛋白受体“糖蛋白-6”抗体或F(ab)₂片段可通过受体交联而引发血小板激活。将病人的血清(200微升)加入到预热的正常人(对胶原蛋白发生聚集反应的)的富含血小板血浆PRP内。观察在一小时内是否引起血小板聚集。利用此方法筛查到血小板对胶原蛋白无反应的病人。利用富含血小板血浆做胶原蛋白、二磷酸腺苷(ADP)、U46619(血栓环素TXA₂受体激活剂)、花生四烯酸(ararchidonic acid或AA)激发的聚集试验，检测结果见表1。由该表可以看出该病人的血小板对胶原蛋白的刺激无反应，但对其它激活剂反应正常。病人的血清可以引起轻度的他人的血小板激活和聚集(因为病人曾有输血史，由此产生了抗胶原蛋白受体“糖蛋白-6”的自身抗体)。进一步用病人的血小板进行蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE)加以分离和检测(Western blotting)，证实病人的血小板上完全不表达胶原蛋白受体“糖蛋白-6”(即没有62kDa的蛋白带)。

表1

激活剂	血小板聚集率(占透光的％)	试验次数
			1μg/mL胶原蛋白	1.3+/-0.1	3
10μM二磷酸腺苷	75.4+/-4.4	3
			3μM U46619	85.2+/-5.6	3
400μM花生四烯酸	77.8+/-3.9	3

(2)分离病人表达抗胶原蛋白受体“糖蛋白-6”抗体的B淋巴细胞：经病人同意，对其常规治疗输入正常人(即血小板上表达胶原蛋白受体“糖蛋白-6”)的血液200毫升的一周后抽取该病人50毫升血，离心后将血浆和红细胞交界面的白细胞收留，用磷酸缓冲生理盐水(pH 7.4)清洗并再次离心后，将离下的细胞悬浮在5毫升磷酸缓冲生理盐水中。同时，将盖玻片(20毫米x 20毫米)用70％酒精和蒸馏水清洗、烘干。将300毫升正常人的富含血小板血浆均匀滴在此玻璃盖片上，在室温下孵育一小时，让血小板附着(玻璃本身就能激活血小板使其在玻璃表面附着)。用磷酸缓冲生理盐水冲洗后，放入特制的罐流室(其制作方法见参考文献Sun B，et al.J.Physiol.1996，495:65-82)的底部，然后夹紧密封。与罐流泵连接后，开始用磷酸缓冲生理盐水排除气泡，然后换成上述准备的白细胞悬浮液开始缓慢罐流(流速约每分0.1毫升)；再用2毫升的磷酸缓冲生理盐水以同样的速度加以冲洗。最后，将取出的盖玻片轻轻浸到磷酸缓冲生理盐水内并立即拿出。最后将附着的细胞(即该病人的B淋巴细胞)吹打后收集在0.5毫升的磷酸缓冲生理盐水中，分装到96孔的PCR板上。离心后将细胞溶解和提取核苷酸(total RNA)。

2.用RT-PCR放大和克隆抗体cDNA的重链和轻链可变区：

根据人的IgG的cDNA的保守区的核苷酸序列，设计出针对重链和轻链保守区的两对degenerate引物。采用Invitrogen的单细胞RT-PCR试剂盒，然后经过两轮45圈的PCR和RACE-PCR放大，将最终产物克隆到Invitrogen的TA克隆载体质粒内。转染细菌后，先用TA克隆载体质粒上克隆位点两边的引物和colony-PCR筛选出有片段插入的转染菌株。小规模提纯含有克隆片段的质粒后对预料到的大小的片段做DNA测序和分析。经过三轮的筛选，最后通过DNA测序得到重链和轻链可变区的全部序列，包括以上所述的重链可变区和轻链可变区的序列。

3.制备重组单克隆抗人血小板胶原蛋白受体“糖蛋白-6”的抗体HSA-scFv融合片段：

人血清白蛋白序列来源于GenBank:CAA23754.1-serum albumin[Homo sapiens]，它由609个氨基酸组成(SEQ ID NO.1)，包括分泌信号肽(pre)和前肽(pro)。人血清白蛋白表达分泌出来后，信号肽(aa1-18)和前肽(aa19-24)被切除，人血清白蛋白成熟肽是585个氨基酸(aa25-609)。

若用毕赤酵母菌(Pichia pastoris)来表达和生产，人血清白蛋白与抗G-VI6抗体融合蛋白的抗体部分是抗GP-VI的单链抗体(GP-VIscFv)，由人源化的抗GP-VI单克隆抗体的重链及其轻链的可变区(VH、VL)和一链接VH、VL的链接肽组成。GP-VIscFv(I)的结构是VH-链接肽-VL(SEQ ID NO.2)，链接肽是:TSGSGKPGSGEGSTKG。GP-VIscFv(II)的结构是VL-链接肽-VH(SEQ ID NO.3)，链接肽为:GSTSGSGKPGSGEGSTKG。GP-VIscFv(I)和(II)通过一短链接肽(GSGGS)链接到含有信号肽和前肽的人血清白蛋白的C端，构成了preproHSA-GP-VI(I)，SEQ IDNO.4和preproHSA-GP-VI(II)，SEQ ID NO.5。根据毕赤酵母偏爱密码子，将preproHSA-GP-VI(I)和preproHSA-GP-VI(II)氨基酸序列分别反向翻译成核苷酸序列。在对反向翻译后的序列进一歩优化和清除影响基因稳定的序列后，再在5’端和3’端分別外加TTC GAA ACC序列(Sfu I内切酶及核糖体结位点)和TAA GAA TTC序列(终止密码子及EcoRI内切酶位点)，以构成表达人血清白蛋白与抗GP6抗体融合蛋白的核酸序列，nHSA-GP-VI(I)(SEQ IDNO.6)和nHSA-GP-VI(II)(SEQ ID NO.7)。

表达人血清白蛋白与抗GP-VI抗体融合蛋白的核酸序列是委托金斯瑞(GenScript)公司人工合成的。该公司在基因合成后，把整个序列插入pUC57质粒的Eco Rv位点，再通过细菌E.coli扩增从而获得pUC57-nHSA-GP-VI(I)和(II)质粒(图3)。

人血清白蛋白与抗GP-VI抗体融合蛋白表达质粒构建：pUC57-nHSA-GP-VI(I)和(II)质粒经过Sfu I和Eco RI双酶切后，将表达人血清白蛋白-抗GP-VI抗体融合蛋白的核酸序列，nHSA-GP-VI(I)(SEQ ID NO.6)和nHSA-GP-VI(II)(SEQ ID NO.7)分离出来并插入毕赤酵母菌表达载体pYL(His)相应的酶切位点，构成了表达质粒pYL(His)-nHSA-GP-VI(I)和(II).pYL(His)是通过改造pPIC9质粒(Invitrogen/Thermo Fisher)而来。与pPIC9相比，pYL(His)去掉了3’AOX1 DNA片段以确保表达基因在毕赤酵母基因组上插入所要插入的位点，并使在毕赤酵母基因转移后得到的克隆都是mut+(methanol utilization)表型，同时也去掉了质粒序列里的另一个Sfu I酶切位点。

链接到被Sfu I和Eco RI双酶切过的pYL(His)后，nHSA-GP-VI(I)和nHSA-GP-VI(II)的5’端前是AOX1(alcohol oxidase)转录启动子，3’端后是终止子(AOX1transcription termination region，TT)(图4和图5)。在毕赤酵母宿主细胞内转录、翻译后分泌出来的蛋白序列分别是：pHSA-GP-VI(I)，SEQ ID NO.8和pHSA-GP-VI(II)，SEQIDNO.9。将表达质粒pYL(His)-nHSA-GP-VI(I)和(II)通过细菌E.coli进行扩增后，再进行质粒的分离纯化，获得大量的质粒DNA。

毕赤酵母的转化：毕赤酵母是一种甲基营养酵母，能够以甲醇代谢作为其唯一的碳源。甲醇代谢的第一步是通过醇氧化酶(alcohol oxidase)的作用将甲醇氧化成甲醛。毕赤酵母菌有两种醇氧化酶，分别由AOX1和AOX2基因编码，其中AOX1基因产物占细胞中醇氧化酶活性的主要部分。AOX1基因在甲醇的严格调控和诱导下高量表达，通常可达到可溶蛋白总量的30％以上。因此在毕赤酵母表达系统里，AOX1启动子被用于驱动外源基因的表达。

我们选用了毕赤酵母菌株GS115作为表达菌株。GS115是一营养缺陷型菌株，它的组氨酸脱氢酶基因(HIS4)有一突变，使它不能合成组氨酸。因此，在基因转化前，GS115不能在没有组氨酸的基本培养基上生长。被转化后，表达质粒所携带的野生HIS4基因与宿主的突变型his4互补，恢复成组氨酸合成功能，使之能在缺失组氨酸的选择培养基上生长。

毕赤酵母的转化过程如图4所示。表达质粒pYL(His)-nHSA-GP-VI(I)和(II)经StuI酶切后变成线状的DNA，然后通过电转移进入毕赤酵母GS115的细胞核内。在细胞核内，线状的pYL(His)-nHSA-GP-VI(I)和(II)DNA通过同源重组(homologous recombination)与宿主细胞基因组整合，插入其His4位点。

菌株(克隆)筛选：电转化成功的GS115酵母，由于pYL(His)-nHSA-GP-VI与基因组的整合，使之能在缺失组氨酸的培养基上生长。因此在电转化之后，将GS115酵母细胞涂在酵母组安基酸缺陷型合成琼脂培养基(Yeast Synthetic Drop-out Agar Medium withoutHistidine)上培养。在摄氏30度的温度下培养3至4天后，从培养基平板上挑出单个酵母菌落(克隆)并分别划线在酵母组氨酸缺陷型合成琼脂培养基平板上，再在30摄氏度的温度下培养3至4天，以清除没被转化的GS115酵母细胞的污染。经两次选择培养筛选后，把挑选出来的酵母菌落细胞接种到液体培养基里培养，然后甲醇诱导表达，以确立人血清白蛋白与抗GP-VI抗体融合蛋白的表达菌株。

诱导表达与检测:在毕赤酵母细胞内，AOX1基因的表达是受严格调控的，在甲醇的诱导下高量表达，但在葡萄糖存在的条件被完全抑制。因此为了避免作为碳源的萄葡糖带来的抑制作用，在诱导表达前，将酵母细胞置于含有甘油的生长培养基里生长，然后再放在含有甲醇的诱导培养里生长、表达AOX1基因启动子驱动的蛋白。

生长培养配方(体积百分含量，高压灭菌):

酵母膏(yeast extract)1％

蛋白胨(peptone)2％

甘油(Glycerol)1％

诱导表达培养基配方(体积百分含量，高压灭菌):

酵母膏(yeast extract)1％

蛋白胨(peptone)2％

100mM potassium phosphate，pH 7.0

酵母氮源(YNB)1.34％

生物素(biotin)1.34％

无水甲醇(Methanol)0.5％

用接种环将酵母细胞从在组氨酸缺陷型合成琼脂培养基平板上生长的酵母菌落分别转移至3毫升的生长培养里，在30℃摇床(200rpm)培养24小时，然后室温(23℃)下离心(3000x g)10分钟，去除培养液，再将酵母细胞重悬在1.5毫升诱导表达培养基里，25℃摇床培养48小时，并分别在诱导培养12，24，36小时时补加为培养基体积0.5％的甲醇。甲醇诱导表达48小时后，离心(3000x g)10分钟，收集液体培养基(上清液)，并加入乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，至终浓度5mM，然后置4℃下保存。

毕赤酵母表达抗GP-VI单链抗体(scFv)：为了利用毕赤酵母菌分泌表达GP-VIscFv，在scFv的N端需加上一个分泌信号肽或将scFv序列融合到表达载体所带的信号肽后面(C端)。我们选择了将GP-VIscFv融合到表达载体pYL(His)所带的酵母菌α交配因子信号肽和前肽(alpha-factor prepro)的后面，把带有GP6scFv的DNA片段插入载体质粒的XhoI和EcoR I(如图5所示)。GP-VIscFv的DNA序列是以人血清白蛋白-抗GP-VI抗体融合蛋白的表达质粒pYL(His)-nHSA-GP-VI(I)和(II)为模板，通过PCR扩增而得到的。和HSA-GP-VIscFv(I)和(II)对应，GP-VIscFv(l)的结构是VH-链接肽-VL，而GP-VIscFv(lI)则是是VL-链接肽-VH排列。

PCR扩增GP-VIscFv(l)所用的引物是：5’GP-VIscFv(I)，SEQ ID NO.10和3’GP-VIscFv(I)，SEQ ID NO.11；而扩增GP-VIscFv(lI)的引物是:5’GP-VIscFv(II)，SEQ IDNO.12和3’GP-VIscFv(II)，SEQ ID NO.13。两对引物中的3’引物(SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.13)是反向补码(reverse complement)序列，分别来源于nHSA-GP-VI(I)，SEQ ID NO.6和nHSA-GP-VI(II)，SEQ ID NO.7两个序列3’端的33个碱基和外加两个用来保护末端EcoRI酶切位点的碱基。两个5’端引物(SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.12)均由GP-VIscFv的5’序列和外加序列组成:GP-VIscFv的5’序列分别取自于nHSA-GP-VI(I)，SEQ ID NO.6序列的碱基位置1852到1876和SEQ ID NO.7nHSA-GP-VI(II)序列的1852到1877片段。两个5‘引物的外加序列均为：GCCGCTCGAGAAGAGAGCT。它包括Xho I酶切位点CTCGAG和它下游的AAGAGAGCT序列。下游序列部分编码赖氨酸(Lys)，精氨酸(Arg)和丙氨酸(Ala)。这两个碱性氨基酸(Lys和Arg)是信号肽前肽切割位点，而Ala是用来提高切割效率。与信号肽前肽分割后，Ala会留在GP6scFv的N端，因此表达分泌出来后，在GP-VIscFv(I)和(II)的N端均有一个附加的Ala。Xho I酶切位点前面的四个碱基GCCG是用来保护Xho I酶切位点和提高酶切效率的。PCR扩增后GP-VIscFv(I)和(II)的DNA序列分别列为：SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15。表达分泌后，最终的重组scFv蛋白质序列分别是pGP-VIscFv(I)，SEQ ID NO.16和pGP-VIscFv(II)，SEQ ID NO.17。

样品制备：在检测生物活性之前，先将甲醇诱导表达后的培养液经过

离心过滤器(Millipore公司)处理，以去掉培养液里分子量小于30Kd的成分，并置换样品换缓冲溶液。用移液器将0.5ml甲醇诱导表达后的培养液分别移入

离心过滤器，4℃离心(14000x g)15-20分种，去除滤出液。再在过滤器内加入含0.1％ BSA，0.02％tween-20和1mM EDTA磷酸缓冲溶液(PBS)，离心清洗两次。最后再在过滤器内加入清洗缓冲溶液至250ml体积并置于4℃保存。甲醇诱导后的培养液通过SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析来检测抗GP-VI抗体scFv、人血清白蛋白与抗GP-VI抗体融合蛋白pHSA-GP-VI(I)和pHSA-GP-VI(II)表达(图6)。

若用哺乳细胞如DG44 CHO细胞来表达和生产重组蛋白，将克隆到的基因片段以下列方式进行连接起来。Kozak(GCCACC)序列加在蛋白合成起始信号ATG前，将单克隆抗体赫赛丁(Herceptin)的分泌信号序列(GAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCCGGCAGCACCGGC)加在重链可变区或人血清白蛋白之前，轻链和重链可变区之间加上一16个Ser和Gly组成的肽链(SGGGGSGGGSGGGSGG)，肽链最后加8个组氨酸用于重组蛋白scFv的纯化，在表达单位最后加上蛋白合成中止信号TAA。先将上面的序列进行核苷酸序列优化，然后用化学合成的方法合成全部的序列。将此完整的序列用分子生物学的方法插入到表达载体质粒CMV启动子的下游。传染CHO细胞并进行有限稀释筛选单株，最后扩增收集无血清细胞培养基上清并通过SDS-PAGE获得高表达单株。小批量培养获得的上清可用Nick亲合柱纯化出重组的scFv或融合蛋白片段。

4.对所得产品进行功能检测：

抗体片段的阻断GP-VI的功能用富含血小板血浆(PRP)和全血的血小板聚集试验进行检测。另外，用洗过的血小板在胶原蛋白表面附着试验进一步验证其阻断的效应。

(1)通过功能试验筛选确认有阻断人胶原蛋白受体“糖蛋白-6”与胶原蛋白相结合(人工粘附试验)的scFv或融合蛋白高表达株并确定有效构架(VH-VL或VL-VH)(图7a和7b)。

(2)富含血小板血浆(PRP)血小板聚集试验：在征得献血者同意后，选用枸橼酸钠作为抗凝剂抽血30毫升。通过低速离心获得上清(富含血小板血浆，具体方法可参照文献Sun，B et al.J.Cardiovascular Pharmacol.40:557-585，2002)。然后取400微升放到血小板聚集仪上37摄氏度预热两分钟。首先用马跟腱的一型胶原蛋白(1到2维克/毫升)来诱发血小板发生聚集，确证此供血者的血小板可以在搅拌(每分钟1千转)状态下发生聚集，并用此聚集的程度(透光度)作为无抑制剂作用的基线。其它的试验，先将抗体片段与PRP孵育两分钟后，再加入胶原蛋白进行刺激。对于有抑制作用的抗体片段，进一步用10微摩尔(μM)二磷酸腺苷(ADP)、3微摩尔U46619和400微摩尔花生四烯酸检测抗体片段是否有抑制作用。此抗体scFv片段的检测结果见表2，由表2可以看出，此scFv片段选择性地抑制由胶原蛋白引起的血小板聚集，而且其抑制作用与抗体片段的浓度成正比。但对其它激活剂引起的血小板聚集无任何作用。

表2

激活剂(抗GP-VI片段浓度)	血小板聚集率(占对照的％)	标准偏差	试验次数
				1μg/mL胶原蛋白(0.1μg/mL	90.3	3.8	3
1μg/mL胶原蛋白(0.3μg/mL	73.2	4.4	3
				1μg/mL胶原蛋白(1μg/mL)	45.5	4.5	3
1μg/mL胶原蛋白(3μg/mL)	25.8	4.6	3
				1μg/mL胶原蛋白(10μg/mL)	9.1	4.7	3
10μM二磷酸腺苷(10μg/mL)	98.4	8.6	3
				3μMU46619(10μg/mL)	99.5	4.7	3
400μMAA(10μg/mL)	101.3	3.3	3

(3)全血血小板聚集试验：在征得献血者同意后，选用肝素作为抗凝剂抽血10毫升。取500微升血和500微升Tyrode-HEPES缓冲液放到专用聚集测试管内，然后放血小板聚集仪上37摄氏度预热5分钟。首先用马的一型胶原蛋白(1到2维克/毫升)来诱发血小板发生聚集，确证此供血者的血小板可以在搅拌(每分钟1千转)状态下发生聚集(电阻增大)，并用此聚集的程度作为无抑制剂作用的基线。其它的试验，先将抗体片段与PRP孵育两分钟后，再加入胶原蛋白进行刺激。对于有抑制作用的抗体片段，进一步用3微摩尔(μM)U46619检测抗体片段是否有抑制作用。其中，该抗体的检测结果见表3，由表3可以看出：此HSA-scFv(VH-VL)片段选择性的抑制由胶原蛋白引起的血小板聚集，而且其抑制作用与抗体片段的浓度成正比。但对激活剂U46619引起的血小板聚集无任何作用。

表3

激活剂(抗GP-VI片段浓度)	血小板聚集率(占对照的％)	标准偏差	试验次数
				1μg/mL胶原蛋白(1μg/mL)	55.5	4.5	3
1μg/mL胶原蛋白(10μg/mL)	11.5	2.5	3
				3μM U46619(10μg/mL)	99.4	3.9	3

(4)血小板附着试验(本试验的详细步骤可参阅文献Tandon，NN etal.Br.J.Haematol.89:124-130，1995)。在征得献血者同意后，选用枸橼酸钠作为抗凝剂抽血30毫升。通过低速离心获得上清(富含血小板血浆)。然后收取PRP到一15毫升的离心管内准备洗过的血小板。加入前列腺素E1(0.8微克/4毫升PRP)和枸橼酸缓冲液(pH6.0，100微升/5毫升PRP)后，离心2400转/分共20分钟。将离下的血小板用枸橼酸缓冲液冲洗一遍后，最后混悬在1毫升Tyrode-HEPES缓冲液内。试验前一天，将96孔板用每孔100微升胶原蛋白(1维克/毫升)孵育在4摄氏度过夜。经Tyrode-HEPES缓冲液洗过后，加上血小板悬浮液(4x10⁸/毫升)，同时或事先加上抗体片段或等量缓冲液作为无抑制剂对照。一小时后，将没有附着的血小板洗掉后，将附着的血小板用Triton-X100溶解。最后用显色反应来检测血小板释放出的LDH，以此来定量附着的血小板和计算出抗体片段的抑制效应。该抗体的检测结果见表4，由表4可以看出：HSA-scFv(VH-VL)片段选择性的抑制由胶原蛋白引起的血小板附着，而且其抑制作用与抗体片段的浓度成正比。但非特异性的抗体对胶原蛋白引起的血小板附着无任何抑制作用。

表4

阻断剂	血小板附着率(占对照的％)	标准偏差	试验次数
				抗GP-VI片段(0.1μg/mL)	16.4	2.5	3
抗GP-VI片段(0.3μg/mL)	12.1	3.4	3
				抗GP-VI片段(1μg/mL)	5.1	2.5	3
抗GP-VI片段(3μg/mL)	2.2	2.5	3
				抗GP-VI片段(10μg/mL)	0.3	1.9	3
非特异性IgG(10μg/mL)	96.3	5.6	3

5.小鼠试验显示GP-VI敲除对心肌有保护作用

年龄匹配的野生型和GP-VI基因敲除小鼠用1-1.5％异氟醚麻醉，通过气管插管，并连接到压力控制呼吸器。用补充有100％氧气(体积比4:1)的室内空气对动物进行通风。在开始手术之前，给小鼠注射庆大霉素(0.7mg/kg IM)。用连接数字温度计的直肠探头仔细监测体温，并在整个实验过程中使用加热垫和加热灯将体温保持在37至37.5℃之间。在初步研究中，将导管插入颈动脉以测量血压和分析血气。这是为了确保小鼠能够使用这些实验程序维持生理血液动力学。

借助解剖显微镜，通过左胸切口打开胸腔。使用锥形针将8-0尼龙缝线(Ethicon，Inc.，Johnson&Johnson Co.，Somerville，NJ)穿过左前降支冠状动脉下方，距离左耳廓尖端2-3mm，缝线末端穿过塑料管。冠状动脉闭塞是通过将缝线拉到导管上引起的。冠状动脉闭塞和再灌注的成功表现通过缺血期间的目测检查(即，注意到在拉动缝线时远端心肌中出现淡红色，并且由于通缩后充血而恢复亮红色)和再灌注后的消退来验证。缺血持续30分钟。解除闭塞后，用缝合线分层闭合胸部。注射一定剂量的酮芬(2.5mg/kg，IM)。在获得自主呼吸后，将小鼠从呼吸机中取出，并将其置于具有富氧空气的温度/湿度控制装置中。小鼠获得正常姿势能力后，将其放回笼中24小时。

研究结束时(第二天)，给予小鼠肝素(1U/g IP)，随后用戊巴比妥钠(100mg/kgIP)麻醉。心脏被切除，并通过主动脉插管(23号针)使用Langendorf装置灌注Krebs-Henseleit溶液。为了描绘闭塞然后再灌注的区域(风险区域)，将冠状动脉系在先前闭塞的部位，并用1％的荧光颗粒溶液(直径1-10μm，Duke Scientific，Palo Alto，CA)在生理盐水(1ml，3分钟)中灌注主动脉根部。该程序的结果是，先前闭塞的冠状动脉(危险区域)供应的左心室(LV)部分在紫外线下没有荧光，而左心室(LV)的其余部分被染成深蓝色。心脏冷冻20分钟，然后切成5-7个横切面。为了描绘存活心肌梗死，将心脏切片在磷酸盐缓冲液(pH7.4，37℃)中的1％氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液中培养20分钟。然后将切片固定在10％中性缓冲甲醛中，24小时后拍照。追踪梗死、缺血再灌注(危险区)和非缺血区域的边界。相应的面积通过计算机测面积法测量，并根据这些测量结果计算梗死面积占危险面积的百分比。

野生型和GP-VI基因敲除小鼠的风险区域大小相似(分别为0.020±0.004cm³和0.022±0.005cm³)。野生型小鼠的梗死面积(梗死面积)平均为危险面积的45±18％。GP-VI基因敲除小鼠的梗死面积(梗死面积)明显较小，平均占危险面积的22±8％。这些数据汇总在图8中。

6.GP-VI基因敲除的小鼠心肌内的P-selectin表达减少

血小板的活化通过储存在血小板中的P-selectin(选择素)的表达来确定alpha-颗粒，在活化后可迅速转移到血小板表面。用免疫组织学检测P-选择素的表达。

小鼠体内心脏缺血/再灌注：如实施前例所述进行小鼠心脏缺血和再灌注。GP-VI基因敲除和野生型小鼠接受30分钟的左前降支冠状动脉(LAD)闭塞，然后再灌注15分钟。LAD再灌注15min后，取出心脏，用DPBS清洗，然后切成两个短轴部分，立即放入4％多聚甲醛和0.1M磷酸盐缓冲液中固定组织。2小时后，将组织转移到25％蔗糖中过夜。

P-选择素的免疫荧光检测：第2天，将心脏组织切成20μm横截面，并让其干燥约30分钟。每张载玻片上的切片用PAP笔环环绕，并让其干燥约10分钟。载玻片在0.01M PBS-0.1％Triton(PBST)中冲洗，并在室温下与正常驴血清(10％NDS，PBST)孵育30-60分钟。使用兔抗小鼠P-选择素多克隆抗体(Chemicon International)检测P-选择素，并使用FITC抗兔IgG(Jackson免疫研究实验室)进行可视化。

荧光图像：使用蔡司共焦显微镜(LSM510)或传统荧光显微镜获得荧光图像。荧光激发波长为488nm，检测波长为540nm。缺血30分钟和再灌注15分钟后，在野生型小鼠的心肌(心内膜和心肌中部)中检测到高水平的P-选择素(图9a)。GP-VI基因敲除小鼠心肌中P-选择素的表达明显减少。为了定量表达水平，测定缺血区域内具有强绿色荧光的区域的大小。数据显示，与野生型小鼠相比，GP-VI基因敲除小鼠心脏中P-选择素表达区域的总面积显著减小(图9b)。

7.再灌时的血管内皮损伤

在具有健康血管系统的正常心脏中，紧密的内皮阻止血管壁细胞外基质中的胶原蛋白接触循环血液成分。如果内皮细胞受损脱落，例如在缺血和再灌注期间，内皮下胶原可能会暴露。由于GP-VI选择性地与胶原结合，GPVI被用于在体内研究内皮再灌注损伤。为此，用FITC(sGP-VI-FITC)标记重组sGPVI，并将sGP-VI-FITC静脉注射到小鼠体内。注射的sGP-VI-FITC与因内皮损伤而暴露的胶原结合。sGP-VI-FITC与暴露的胶原结合的水平可以在荧光显微镜下进行组织学测定，并提供内皮损伤的测量方法。

在心肌缺血开始前10分钟(30分钟)，向野生型小鼠注射sGP-VI FITC(2mg/kg)。在一些动物中，缺血后再灌注(15分钟)。在接受再灌注的心脏中，观察到血管系统的显著标记(图10)，表明内皮细胞的显著损伤以及随后胶原暴露于循环血液成分中。相反，在未进行再灌注的心脏中，未观察到sGP-VI FITC标记血管系统(图10)。这些数据表明缺血心脏组织再灌注导致内皮损伤。

8.抗GP-VI抗体对缺血再灌的心肌有保护作用

使用来自中国的食蟹猴，体重2.0-2.5kg。一只被选为实验对象的猴子被禁食过夜，并用氯胺酮(10mg/kg IM)镇静。此外，注射阿托品(0.05mg/kg IM)。将静脉导管插入腿部静脉。戊巴比妥钠(静脉注射10-15mg/kg)用于麻醉，并在整个实验过程中给予额外剂量。通过颈部中线切口暴露气管，并引入气管插管。用小动物呼吸器和40％O₂/60％N₂混合气体对动物进行通风。颈动脉插管用于测量血压和采集动脉血样。然后在第四肋间进行左胸切口，暴露心脏。偶尔可见左冠状动脉前降支，但通常被上覆的脂肪遮挡。在尽可能靠近动脉起点的室间沟中，将针上的2-0缝线盲穿在血管束下方。缝合线的末端穿过一段短的聚乙烯导管，形成一个圈套。当圈套拔出10秒时，通过观察发绀和心脏前壁收缩停止，然后当圈套释放时，组织充血和收缩恢复，证实圈套成功。将导管插入左心耳进行微球注射。附加ECG导联测量心率和QRS形态。用加热垫把猴子加热到38度(直肠测量)。

在完成手术准备和平衡至少20分钟后，记录基线心率、血压和ECG，并闭塞冠状动脉90分钟。连续监测ECG、心率和血压，每分钟记录5分钟，10分钟，然后每10分钟一次，直到阻塞结束。在闭塞期结束时，释放圈套并重新灌注冠状动脉。再次，每分钟记录心电图、心率和血压，持续5分钟，10分钟，然后每10分钟记录一次，直到4小时再灌注期结束。如果出现心室颤动，则使用电除颤器将心律转换为窦性心律。

再灌注4小时后，取出心脏，并将其悬挂在灌注装置上的主动脉根部。将生理盐水逆行灌注以冲洗冠状动脉和心脏的血液，然后在再次阻断冠状动脉后将2-9μm绿色荧光微球(Microgenics Corp.，Freemont，CA)添加到灌流液中。因此，荧光微球只进入冠状动脉未闭灌注的心肌，危险区(或危险区)被划分为不含荧光微球的心肌区域。将心脏放在干冰上冷冻，然后垂直于其长轴切成2-3毫米的薄片。切片在1％三苯基四氮唑氯化物(TTC)(GFSChemicals，Powell，OH)中孵育，加热至37℃保存8-10分钟，然后放入10％福尔马林中保存组织，增强TTC染色和未染色组织的颜色对比度。TTC染色的正常灌注组织具有完整的NADH，储存砖红色，而释放并清除该辅因子的梗死组织未染色，心肌内出血呈白色或黑色。切片被压缩在相隔2毫米的塑料板之间。在塑料覆盖层上追踪紫外线照射下确定的危险区和白光照射下确定的梗死区的大小。面积通过面积测量法测量，体积通过面积乘以2mm计算。

对照组动物接受冠状动脉闭塞(90分钟)和再灌注(4小时)，没用抗GP-VI抗体。在其中一个抗GP-VI抗体治疗组中，动物接受两剂量的重组融合HSA-scFv(I)片段(各2mg/kg)，第一剂量在缺血前10分钟给药，第二剂量在再灌注前给药。由于免疫荧光数据(见图8-10)支持GP-VI在再灌注期间的作用，在第二个抗GP-VI抗体治疗组中，动物在再灌注前接受单剂量抗体(2mg/kg)。通过方差分析对心肌梗死进行分析。

梗死面积与危险区面积而非百分比图绘制。这是因为对照动物的梗死面积/危险区面积图没有经过原点。当梗死面积与危险区面积对比时，重组融合scFv片段(双剂量或单剂量)显示出显著的心脏保护作用，回归线向右移动(图11a)。这一变化表明，在相同的危险区大小下，抗体治疗的猴子梗死面积较小。在接受双剂量或单剂量抗体治疗的猴子中，保护程度相似，这与血小板-胶原相互作用通过GP-VI诱导再灌注损伤和抑制这种相互作用提供心脏保护的概念一致。

为了研究抗体是否抑制这些猴子的血小板活化，在给药前后抽取血样。然后使用全血聚集仪(Chronolog Corporation，PA)测定体外胶原诱导的血小板聚集。血液用生理盐水1:1(v/v)稀释，在胶原(0.5μg/mL；Horm，Nycomed，Germany)引发聚集之前，在37℃下在聚集仪中培养5-10分钟。随着血样中电极阻抗的增加，对聚集进行了10分钟的监测(Aggrolink v 4.75，Chronolog)。

图11b显示了给药前(pre-dosing)和给药后4小时(4hrs post dosing)采集的血样中胶原蛋白诱导全血血小板聚集的代表性测量结果。数据表明，再灌注前给予猴子重组融合HSA-scFv(I)片段(2mg/kg)完全抑制胶原蛋白诱导的血小板聚集，如同体外试验所测。以0.4mg/kg剂量给药显示出类似的抑制作用(数据未显示)。

本发明未尽事宜为公知技术。

Claims (10)

1.一种抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体其至少包含靶向GP-VI的抗体元件，所述靶向GP-VI的抗体元件为抗GP-VI单链抗体，所述抗GP-VI单链抗体至少包含3个重链可变区HV序列和3个轻链可变区LV序列，其氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:18-23所示的序列，或与SEQ ID NOs:18-23所示的序列具有≥80％序列同一性的序列，或与SEQ ID NOs:18-23所示的序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变的氨基酸序列。

2.一种抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体其至少包含(a)靶向GP-VI的抗体元件，所述靶向GP-VI的抗体元件为抗GP-VI单链抗体，所述抗GP-VI单链抗体至少包含3个重链可变区HV序列和3个轻链可变区LV序列，其氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:18-23所示的序列，或与SEQ ID NOs:18-23所示的序列具有≥80％序列同一性的序列，或与SEQ ID NOs:18-23所示的序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变的氨基酸序列；所述抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体还包含：(b)人免疫球蛋白Fc区和/或血清白蛋白或其片段、结合血清白蛋白的结构域、聚乙二醇、聚乙二醇-脂质体复合体，或其组合；

进一步的，所述抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体中，所述(a)和(b)直接连接或通过连接片段连接；所述连接片段优选选自由丙氨酸和/或丝氨酸和/或甘氨酸组成的多肽链，连接肽的长度为3～30个氨基酸；

在结构上，将所述(a)的C端直接(或通过连接片段)连接于所述(b)的N端，或者所述(b)的C端直接(或通过连接片段)连接于所述(a)的N端。

3.一种多聚核苷酸，其特征在于，所述多聚核苷酸编码权利要求1或2所述抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体或其抗原结合片段。

4.一种重组表达载体，其特征在于，其包含权利要求3所述多聚核苷酸。

5.一种宿主细胞，其特征在于，其包含权利要求4所述重组表达载体，或包含了整合到宿主细胞基因组中的权利要求3所述多聚核苷酸；或者，所述宿主细胞表达权利要求1或2所述抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体或其抗原结合片段。

6.一种产生抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体或其抗原结合片段的方法，其特征在于，包括步骤：

(I)在适合产生抗体的条件下，培养上述宿主细胞，从而获得含所述抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体或其抗原结合片段的培养物；以及，

(II)从所述培养物中分离或回收所述抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体或其抗原结合片段。

7.一种重组多肽偶联物，其特征在于，其包括权利要求1或2所述抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体或其抗原结合片段，以及偶联部分，其中，所述偶联部分为可检测的标记物、药物、毒素、细胞因子、病毒外壳蛋白或VLP。

8.一种试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1或2所述抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体或其抗原结合片段，和/或权利要求7所述重组多肽偶联物；所述试剂盒用于检测人血小板胶原蛋白受体GP-VI在样品中的存在或其浓度。

9.一种药物组合物，其特征在于，其包括权利要求1或2所述抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体或其抗原结合片段，或者权利要求7所述重组多肽偶联物。

10.权利要求1或2所述抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体或其抗原结合片段、权利要求7所述重组多肽偶联物或权利要求9所述药物组合物在制备抑制血小板激活以及粘附聚集和抑制血栓形成(抗血栓)产品中的应用；

进一步的，所述产品至少具有如下功能：

(a)阻断人血小板胶原蛋白受体GP-VI；

(b)抑制血小板的激活、粘附聚集以及血栓形成，或；

权利要求1或2所述抗人血小板胶原蛋白受体GP-VI抗体或其抗原结合片段、权利要求7所述重组多肽偶联物或权利要求9所述药物组合物在制备缺血或缺血后再灌注损伤产品中的应用；

进一步的，所述产品至少具有如下功能：

(a)阻断人血小板胶原蛋白受体GP-VI；

(b)抑制血小板的激活、粘附聚集以及血栓形成；

(c)抑制再灌注损伤或避免或减少再灌注损伤造成的梗死。

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