JPH05504053A - ヒトＣ３ｂ／Ｃ４ｂレセプター（ＣＲ１） - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １４、請求項５記載の核酸ベクターからなる細胞からなる組換え細胞。

１５、請求項８記載の核酸ベクターからなる細胞からなる組換え細胞。

＋６．請求項１Ｏ記載の核酸ベクターからなる細胞からなる組換え細胞。

１７、細菌からなる請求項１２．１３または１４記載の組換え細胞。　− １８、ＮＲＲＬに寄託されておりそして受託番号Ｂ−１８３５５を育するエシェ リヒア・コリ。

１９、実質的に第１図に示される配列のヌクレオチド番号２８から１５３３まで からなる核酸配列。

２０、実質的に膜貫通領域を含有しないタンパク質を特徴とする請求項１９記載 の核酸配列。

２１、前記タンパク質がそれを発現する細胞により分泌される、請求項２０記載 の核酸配列。

２２、前記タンパク質がインビトロで、好中球酸化的バースト、補体仲介溶血、 またはＣ３ａおよびＣ５ａ産生を阻害する能力により検出される機能を有する請 求項２１記載の核酸配列。

２３、ＤＮＡ配列からなる請求項１９．２０または２１記載の核酸配列。

２４、ＲＮＡ配列からなる請求項１９．２０または２１記載の核酸配列。

２５、請求項１９または２０記載の配列からなる組換え２６、請求項２１または ２２記載の配列からなる組換え核酸ベクター。

２７　請求項】９記載の配列からなる組換え発現ベクタ２８、請求項２０記載の 配列からなる組換え発現ベクタ２９、請求項２１記載の配列からなる組換え発現 ベクタ３０　、　ｐＢｓｃＲｌｃ　５ｐＢｓｃＲＩｓ　ＳｐＢＭ−ＣＲｌｃ、　 ｐＢｓｃＲ１ｃ／ｌ）ＴＣ３ｇｐｔおよび　ｐＢｓｃＲ１ｓ／ｐＴＣ３ｇｐｔか らなる群から選択される請求項２８記載の組換え発現ベクター。

３１　、　ｐＴ−ＣＲｌｃｌ、　ｐＴ−ＣＲｌｃ２、ｐＴ−ＣＲｌｃ３、ｐＴ− ＣＲｌｃ４およびｐＴ−ＣＲｌｃ５からなる群から選択される請求項２８記載の 組換え発現ベクター。

３２、ＡＴＣＣに寄託されておりそして受託番号ＣＲＬ　１００５２を有する、 プラスミドｐＢｓｃＲＩｃ／ｐＴＣ５ｇｐｔからなる組換えＤＮＡベクター。

３３、請求項Ｉ９．２０または２１記載の配列からなる組換え細胞。

３４　細菌からなる請求項３３記載の組換え細胞。

３５、請求項２５記載のベクターからなる細胞からなる組換え細胞。

３６、請求項２６記載のベクターからなる細胞からなる組換え細胞。

３７、請求項２７記載のベクターからなる細胞からなる組換え細胞。

３８　請求項２８記載のベクターからなる細胞からなる組換え細胞。

３９、請求項２９記載のベクターからなる細胞からなる組換え細胞。

４０、ＡＴＣＣに寄託されておりそして受託番号ＣＲＬ　１００５２を有する、 プラスミドｐＢｓｃＲ１ｃ／ｐＴＣ３ｇｐｔを担持するチャイニーズハムスター 卵巣細胞ＤＵＸ　Ｂｌｌ　０４１、実質的に第１図に示されるアミノ酸配列から なるタンパク質。

４２、Ｃ３ｂと結合しうろことを特徴とする請求項４１記載のタンパク質のフラ グメント。

４３、Ｃ４ｂと結合しうることを特徴とする請求項４１記載のタンパク質のフラ グメント。

４４、Ｃ３１）およびＣ４ｂと結合しうることを特徴とする請求項４１記載のタ ンパク質のフラグメント。

４５、ファクターＩコファクター活性を存する請求項４１記載のタンパク質のフ ラグメント。

４６、Ｃ３コンバーターゼ活性を阻害しつる請求項４１記載のタンパク質のフラ グメント。

４７、Ｃ５コンバーターゼ活性を阻害しうる請求項４１記載のタンパク質のフラ グメント。

４８、グリコジル化されている請求項４１記載のタンパク質または２４個のアミ ノ酸を含有するそのフラグメント。

４９、グリコジル化されていない請求項４１記載のタンパク質。

５０、細胞表面タンパク質として発現される請求項４１記載のタンパク質。

５１、第１図に示されるヌクレオチドの番号２８から１５３３まてにより実質的 にコードされるアミノ酸配列を含有するタンパク質。

５２、請求項５１記載のタンパク質をコードする核酸配列。

５３、実質的に膜貫通ドメインを含有しない請求項５Ｉ記載のタンパク質。

５４、それを発現した細胞により分泌される、請求項５３記載のタンパク質。

５５、実質的に膜貫通領域を含有しないＣＲ１分子。

５６、それを発現した細胞により分泌される、請求項５５記載のＣＲ１分子。

５７、グリコジル化されていない請求項５５記載のＣＲ１分子。

５８、グリコジル化されている請求項５５記載のＣＲ１分子。

５９、インビトロで、好中球酸化的バースト、補体仲介溶血、またはＣ３ａおよ びＣ５ａ産生を阻害する能力により検出される機能を有する請求項５５記載のＣ Ｒ１分子。

６０　、　ｐＢｓｃＲｌｃ　、　ｐＢｓｃＲｌｓ　、　ｐＢＭ−ＣＲ１ｃＳｐＢ ｓｃＲ１ｃ／ｇＴｃｓｇｐｔおよび　１）ＢＳＣＲＩｓ／ｐＴＣ３ｇｐｔからな る群から選択される核酸ベクターによりコードされる請求項５５記載のＣＲ１分 子。

６１、　ｐＴ−ＣＲｌｃｌ、　ｐＴ−ＣＲｌｃ２、ｐＴ−ＣＲｌｃ３、ｐＴ−Ｃ ＲＩＣ４およびｐＴ−ＣＲｌｃ５からなる群から選択される核酸ベクターにより コードされる請求項５５記載のＣＲ１分子。

６２、ＡＴＣＣに寄託されておりそして受託番号ＣＲＬ　１００５２を育する、 プラスミドｐＢｓｃＲ１ｃ／ｐＴＣ５ｇｐｔを担持するチャイニーズハムスター 卵巣細胞ＤＵＸ　Ｂｌｌにより発現される、請求項５５記載のＣＲ１分子。

６３、請求項４１記載のタンパク質をその表面に発現する組換え細胞。

６４、請求項４２．４３または４５記載のタンパク質を発現する組換え細胞。

６５、請求項５１記載のタンパク質を発現する組換え細胞。

６６、請求項５５記載のタンパク質を発現する組換え細胞。

６７、請求項５６記載のタンパク質を発現する組換え細胞。

６８．２４個のアミノ酸からなる請求項３６記載のタンパク質の、細胞により分 泌されるフラグメントを発現する組換え細胞。

８９．　（ａ）ＣＲＩタンパク質またはそのフラグメントからなる試料を得： （ｂ）該試料をカチオン交換高圧液体クロマトグラフィーにかけ；そして （Ｃ）該高圧液体クロマトグラフィーカラムからタンパク質またはそのフラグメ ントを溶離する、ことを含んでなるＣＲＩタンパク質またはそのフラグメントの 精製法。

７０、工程（ｃ）の後に （ｄ）前記タンパク質またはそのフラグメントをアニオン交換高圧液体クロマト グラフィーにがけ：そして（ｅ）工程（ｄ）の高圧液体クロマトグラフィーカラ ムからタンパク質またはそのフラグメントを溶離する、ことをさらに含んでなる 、請求項６９記載の方法。

７１、ＣＲ１タンパク質またはそのフラグメントが実質的に膜貫通ドメインを含 有しない請求項６９または７゜記載の方法。

７２、　（ａ）ＣＲ１分子が分泌されるような様式で、培養中の細胞において、 実質的に膜貫通ドメインを含有しないＣＲ１分子を発現させ； （ｂ）ＣＲ＋分子からなる細胞培養液の試料を得；（Ｃ）該試料をカチオン交換 高圧液体クロマトグラフィーにかけ；そして （ｄ）該高圧液体クロマトグラフィーカラムからＣＲ１分子を溶離する、 ことを含んでなるＣＲ１分子の精製法。

７３、工程（ｃ）の後に （ｄ）前記分子をアニオン交換高圧液体クロマトグラフィーにかけ；そして （ｅ）工程（ｄ）の高圧液体クロマトグラフィーカラムから該分子を溶離する、 ことをさらに含んでなる請求項７２記載の方法。

７４、請求項１２記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。

７５、請求項１３記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。

７６、請求項１４記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。

７７、請求項１５記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。

７８、請求項３３記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。

７９、請求項３４記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。

８０、請求項３５記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。

８１　請求項３６記載の細胞を増殖させることを含んてなるＣＲ１分子の製法。

８２、請求項３７記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。

８３、請求項３８記載の細胞を増殖させることを含んてなるＣＲ１分子の製法。

８４、請求項３９記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。

８５、請求項４０記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。

８６、請求項４１記載のタンパク質または２４個のアミノ酸からなるそのフラグ メントを患者に投与することを含んでなる、免疫障害または望ましからぬかまた は不適当な補体活性が関わる障害を育する患者の治療法。

８７、請求項４２または４３記載のフラグメントを患者に投与することを含んて なる、免疫障害または望ましからぬかまたは不適当な補体活性か関わる障害を有 する患者の治療法。

８８　請求項４５記載のフラグメントを患者に投与することを含んでなる、免疫 障害または望ましからぬかまたは不適当な補体活性が関わる障害を有する患者の 治療法。

８９、請求項５１，５３または５４記載のフラグメントを投与することを含んで なる、免疫障害または望ましからぬかまたは不適当な補体活性か関わる障害を有 する患者の治療法。

９０、請求項５５記載の分子を患者に投与することを含んでなる、免疫障害また は望ましからぬかまたは不適当な補体活性が関わる障害を有する患者の治療法。

９１、請求項５６記載の分子を患者に投与することを含んでなる、免疫障害また は望ましからぬかまたは不適当な補体活性が関わる障害を育する患者の治療法。

９２、請求項５９記載の分子を患者に投与することを含んでなる、免疫障害また は望ましからぬかまたは不適当な補体活性が関わる障害を有する患者の治療法。

９３　請求項６２記載の分子を患者に投与することを含んでなる、免疫障害また は望ましからぬかまたは不適当な補体活性が関わる障害を育する患者の治療法。

９４、請求項４１記載のタンパク質または２４個のアミノ酸からなるそのフラグ メントを患者に投与することを含んでなる、心筋梗塞に起因する患者の損傷を治 療または予防する方法。

９５、請求項５５記載の分子を患者に投与することを含んでなる、心筋梗塞に起 因する患者の損傷を治療または予防する方法。

９６、請求項５６記載の分子を患者に投与することを含んでなる、心筋梗塞に起 因する患者の損傷を治療または予防する方法。

９７、請求項５９記載の分子を患者に投与することを含んでなる、心筋梗塞に起 因する患者の損傷を治療または予防する方法。

９８、請求項６ｏまたは６１記載の分子を患者に投与することを含んでなる、心 筋梗塞に起因する患者の損傷を治療または予防する方法。

９９、請求項６２記載の分子を患者に投与することを含んでなる、心筋梗塞に起 因する患者の損傷を治療または予防する方法。

１００、請求項４１記載のタンパク質または２４個のアミノ酸からなるそのフラ グメントを患者に投与することを含んでなる、炎症に起因する患者の損傷を治療 または予防する方法。

１０１、請求項５５記載の分子を患者に投与することを含んでなる、炎症に起因 する患者の損傷を治療または予防する方法。

１０２、　請求項５６記載の分子を患者に投与することを含んでなる、炎症に起 因する患者の損傷を治療または予防する方法。

１０３、　請求項５９記載の分子を患者に投与することを含んでなる、炎症に起 因する患者の損傷を治療または予防する方法。

】０４．請求項６０または６１記載の分子を患者に投与することを含んでなる、 炎症に起因する患者の損傷を治療または予防する方法。

Ｉ０５．請求項６２記載の分子を患者に投与することを含んでなる、炎症に起因 する患者の損傷を治療または予防する方法。

１０６、　請求項４２．４３または４４記載のフラグメントを含んてなる分子。

１０７、　請求項４５．４６または４７記載のフラグメントを含んてなる分子。

１０８、請求項５５．５６または５９記載のフラグメントを含んでなる分子。

１０９、　請求項６０．６１または６２記載のフラグメントを含んでなる分子。

１１０、請求項４２．４３または４５記載の効果的量のタンパク質またはフラグ メントおよび医薬的に許容される担体を含んてなる、医薬組成物。

１１１、請求項５５．５６または５９記載の効果的量のタンパク質またはフラグ メントおよび医薬的に許容される担体を含んでなる、医薬組成物。

１１２、請求項６０．６■または６２記載の効果的量のタンパク質またはフラグ メントおよび医薬的に許容される担体を含んでなる、医薬組成物。

１１３、ヒトまたは動物に効果的量の可溶性ＣＲＩタンパク質および効果的量の 血栓溶解剤を投与することを含んでなる、ヒトおよび動物の血栓症状を治療する 方法。

１１４、可溶性ＣＲＩタンパク質および血栓溶解剤を同時に投与する、請求項１ １３記載の方法。

１１５、ＣＲ１タンパク質かｐＢｓｃＲｌｃ、　ｐＢｓｃＲｌｓ、　ｐＢＭ−Ｃ Ｒｌｃ。

ｐＢｓｃＲ１ｃ／ｐＴｃｓｇｌ）ｔおよびｐＢＳＣＲ１ｓ／ｐＴｃｓｇｌｌｔか ら成るグループから選ばれる核酸ベクターによりコードされている、請求項１１ ３記載の方法。

１１６、、血栓溶解剤がプラスミノーゲンアクチベーターである、請求項１１３ 記載の方法。

１１７、血栓溶解剤が組織プラスミノーゲンアクチベーターまたはその突然変異 タンパク質、１本鎖ウロキナーゼ、２本鎖ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼお よびハイブリッドタンパク質か除去可能なブロック基で場合によりブロックされ る線維製溶解活性に必須の触媒部位を存するように、ハイブリッドタンパク質の 鎖の少なくとも１本か線維素溶解活性プロテアーゼ由来である、異なる２本鎖プ ロテアーゼの１鎖に結合された２本鎖プロテアーゼの１鎖を含んでなる線維製溶 解活性ハイブリッドタンパク質から成るグループから選ばれる、請求項１１３記 載の方法。

１１８、血栓溶解剤は線維製溶解活性に必須の触媒部位か、加水分解の偽似１次 速度定数が等張水性培地ｐＨ７，４，３７°Ｃてｔｏ−＠／秒−１０−’／秒の 範囲であるような速度で加水分解により除去しうる基によりブロックされる、可 逆的にブロックされたインビボ線維素溶解性酵素である、請求項１１３記載の方 法。

１１９、血栓溶解剤かアニフィル化ストレプトキナーゼプラスミノーゲンアクチ ベーター複合体（ＡＰＳＡＣ）である、請求項１１３記載の方法。

１２０、医薬的に許容される担体または賦形剤と共に可溶性ＣＲＩタンパク質お よび血栓溶解剤を含んでなる、医薬組成物。

Ｉ２１．血栓溶解剤がアニフィル化ストレプトキナーゼプラスミノーゲンアクチ ベーター複合体（ＡＰＳＡＣ）である、請求項１２０記載の医薬組成物。

Ｉ２２．可溶性ＣＲＩタンパク質がＡＴＣＣに寄託されておりそして受託番号Ｃ ＲＬ　１００５２を存する、プラスミドｐＢＳＣＲ１ｃ／ｐＴｃｓｇｌ）ｔを担 持するチャイニーズハムスター卵巣細胞ＤＵＸ　Ｂｌｌにより発現される、請求 項１２０記載の医薬組成物。

１２３、実質的に第１図に示されるアミノ酸配列の部分を含んでなる分子てあっ て、その部分がＣ３ｂに結合する能力により特徴づけられ、ＬＨＲ−Ｂ配列の少 なくとも２コピーを含んでなる分子。

１２４、患者か人間以外の動物である請求項８６記載の方法。

１２５、患者か人間以外の動物である請求項９ｏ記載の方法。

１２６、患者が人間以外の動物である請求項９４記載の方法。

１２７、患者か人間以外の動物である請求項９５記載の方法。

１２８、患者が人間以外の動物である請求項１００記載の方法。

１２９、患者が人間以外の動物である請求項１０１記載の方法。

明細書 ヒトＣ３ｂ／Ｃ４ｂ　［／　セブター（ＣＲＩ）米国法典３５、＠　２０２（Ｃ ）の規定に従って、アメリカ合衆国政府がこの発明について権利を有することを ここに承認する。この発明の基金の一部はＮＩＨから拠出本発明は、Ｃ３ｂ／Ｃ ４ｂレセプター（ＣＲＩ）遺伝子およびそのコードされたタンパク質に関する。

また本発明はＣＲＩ核酸配列およびその７ｏヌクレオチドを含んでなるフラグメ ントおよびそれらからコードされたペプチドまたは２４アミノ酸を含んでなるタ ンパク質にも関する。

また本発明はＣＲＩタンパク質およびそのフラグメントの発現も提供する。ＣＲ Ｉ核酸およびタンパク質は補体機能および種々の炎症性および免疫障害にかかわ る障害の診断または治療に用途を有する。

２、発明の背景 ２、ｌ、補体組織 補体組織はヒト正常血清におけるグロブリンの約１０％を構成する一グループの タンパク質である（）ｆｏｏｄ。

Ｌ、　Ｅ、　、ら、１９８４．　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　２ｄ　Ｅｄ、、　Ｔ ｈｅ　Ｂｅｎｊａｍｉｎ／ＣｕＣｕｍｍ１ｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、 　Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ。

ｐ、　３３９）。補体（Ｃ）は免疫およびアレルギー反応の介在において、重要 な役割を果す（Ｒａｐｐ、　Ｈ，、Ｊ、およびＢｏｒｓｏｓ。

Ｔ、１９７０．　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂａ５ｉｓ　ｏｆ　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎ ｔ　Ａｃｔｉｏｎ。

Ａｐｐｌｅｔｏｎ−Ｃｅｎｔｕｒｙ−Ｃｒｏｆｔｓ　（Ｍｅｒｅｄｉｔｈ）、Ｎ ｅｒ　Ｙｏｒｋ）。

補体構成物の活性化は、補体依存疾患と関連した炎症を介在する化学走性的ペプ チドを包含するーグループのファクターの生成に導く。補体カスケードの連続的 活性化は抗原−抗体複合体を伴う主経路経由にてまたは特定の細胞壁多糖の認識 を伴う副経路により起る。

活性化した補体タンパク質により介在される機能は、標的細胞の溶解、化学走性 、オプソニン作用、脈管および他の平滑筋細胞の刺激およびマスト細胞の脱顆粒 反応、小血管の透過性の増大、白血球遊走の支配、およびＢリンパ細胞およびマ クロファージの活性化のような機能的異常を包含する（Ｅｉｓｅｎ、　Ｈ，Ｎ、 、　１９７４゜１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　Ｈａｒｐｅｒ　＆　Ｒｏｗ　Ｐｕｂｌ ｉｓｈｅｒｓ、　Ｉｎｃ、　Ｈａｇｅｒｓ−ｔｏｗｎ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ、　 ｐ、５１２）。

タンパク質分解カスケードの段階期に、生物学的に活性のあるペプチドフラグメ ント、アナフィラトキシンＣ３ａ、Ｃ４ａ、およびＣ５ａ　（ＷＨＯ５ｃｉｅｎ ｔｉｆｉｃ　Ｇｒｏｕｐ。

１９７７、　ＷＨＯＴｅｃｈ、　Ｒｅｐ、　Ｓｅｒ、　６０６：５およびそこに 引用した参考文献を参照）は第３　（Ｃ３）、第４　（Ｃ４）、および第５　（ Ｃ５）の本来備わっている補体構成物から放出される（Ｈｕｇｌｉ、　Ｔ、Ｅ、 、　１９８１．　ＣＲＣＣｒ１ｔ、　Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎ＋ｏ１．１：３２１： 　Ｂｕｌｔ、　Ｈ，およびＨｅｒｍａｎ、　Ａ、Ｇ、、　１９８３．　Ａｇｅｎ ｔｓＡｃｔｉｏｎｓ　１３　：　４０５）。

２　、２．　Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター（ＣＲＩ）ＣＲＩと命名する、ヒト Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂレセプターは、赤血球、単球／マクロファージ、顆粒細胞、Ｂ細 胞、いくつかのＴ細胞、膵臓濾胞性樹状細胞および糸球体足細胞に存在する（Ｆ ｅａｒｏｎ、　Ｄ、Ｔ、、　１９８０．　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、１５２：　 （２０、Ｗｉｌｓｏｎ、Ｊ、Ｇ、、ら、１９８３．　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３ １：６８４；Ｒｅｙｎｅｓ、　Ｍ、、ら、１９８５．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３５ ：２６８７；　Ｇｅ１ｆａｎｄ。

Ｍ、　Ｃ，、ら、１９７６、Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、　Ｍｅｄ、２９５：１０；　Ｋ ａｚａｔｃｈ−ｋｉｎｅ、　Ｍ、Ｄ、、ら、１９８２．　Ｃ１１ｎ、ｒｍｍｕｎ ｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ。

２７：１７０）。ＣＲＩはＣ３ｂ、　Ｃ４ｂおよび１ｃ３ｂに特異的に結合する レセプターの可溶化形態はリガンド結合機能および膜関連ＣＲＩと同じ分子量を 有する血しょう中に見い出される（Ｙｏｏｎ、　Ｓ、Ｈ，およびＦｅａｒｏｎ、 　Ｄ、Ｔ、、　１９８５．　Ｊ。

ｒｍｍｕｎｏＬ　１３４：３３３２）。ＣＲＩは免疫複合体および他の補体活性 化因子に共有的に付着しているＣ３ｂおよびＣ４ｂに結合し、これらの相互作用 の帰結はレセプターを担持している細胞型に依存する（Ｆｅａｒｏｎ、　Ｄ、Ｔ 、およびＷｏｎｇ、ｗ、ｗ、＋　１９８３．　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ 、１：２４３）　ｏ　赤血球ＣＲＩは肝臓に輸送するために免疫複合体に結合す る　（Ｃｏｒｎａｃｏｆｆ、Ｊ、Ｂ、、ら、１９８３．　Ｊ、Ｃ１１ｎ、Ｉｎｖ ｅｓｔ。

７１：２３６；　Ｍｅｄｏｆ、　Ｍ、Ｅ、、ら、１９８２．　Ｊ、ＥＸＩ）、　 Ｍｅｄ、１５６：１７３９）。好中球および半球のＣＲＩは表面をおおわれたく ぼみを通して吸着的細胞内取り込みか（Ｆｅａｒｏｎ、　Ｄ。

Ｔ、、ら、１９８１．　Ｊ、Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、１５３：１６１５；　Ａｂｒａ ｈａｍｓｏｎ。

Ｄ、　Ｒ，およびＦｅａｒｏｎ、　Ｄ、Ｔ、、　１９８３．　Ｌａｂ、　Ｉｎｖ ｅｓｔ、　４８：１６２）またはホルボールエステル、化学走性ペプチド、また はフィブロネクチンおよびラミニンのような細胞外マトリックス中に存在するタ ンパク質によるレセプターの活性化の後食作用により（Ｎｅｗｍａｎ、　Ｓ、Ｌ 、、ら、１９８０、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１２５：　２２３６；　Ｗｒｉ ｇｈｔ、　Ｓ、Ｄ、および５ｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ、　Ｓ、Ｃ，、１９８２，Ｊ 、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１５６：１１４９；Ｗｒｉｇｈｔ、Ｓ、Ｄ、、ら、１ ９８３．　Ｊ、ＥＸｐ、　Ｍｅｄ、１５８：１３３８）結合複合体は内在化する 。ＣＲＩのリン酸化は食作用機能を獲得する役割を存する（Ｃｈａｎｇｅｌｉａ ｎ、　Ｐ、Ｓ、およびＦｅａｒｏｎ、　Ｄ、Ｔ、、１９８６．　Ｊ、　Ｅｘｐ、 　Ｍｅｄ、１６３：１０１）　。これらの細胞をＣＲＩに対する抗体で処理する ことによりポークライードマイトジェンの最適に近い投与量に対する細胞の反応 を強化するが、Ｂリンパ細胞におよぼすＣＲＩの機能は、はとんど定義づけられ ていない（Ｄａｈａ。

Ｍ、　Ｒ，、ら、１９８３．　ｒｍｍｕｎｏｂｉｏｌ、１６４：２２７　（Ａｂ ｓｔｒ、））。

濾胞性樹状細胞上のＣＲＩは抗原提示の役割に有用である　（Ｋｌａｕｓ、　Ｇ 、　Ｇ、　Ｂ、　、ら、１９８０．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｒｅｖ、５３：３）。

またＣＲＩは主経路および副経路のＣ３／Ｃ５コンパ−チーズを阻止し、ファク ターＩによるＣ３ｂおよびＣ４ｂの切断のためのコーファクターとして作用する 。このことはＣＲＩか、レセプターとしての役割の他に補体調節機能をも有する ことを示す（Ｆｅａｒｏｎ、　Ｄ、Ｔ、、　１９７９．　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７６：５８６７；　ｌ１ｄ ａ、　Ｋ、およびＮｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ、Ｖ、、１９８１．　Ｊ、ＥＸＩ）、 Ｍｅｄ、１５３：１１３８）。

補体活性化の副経路において二分子複合体Ｃ３ｂ、　ＢｂはＣ３活性酵素（コン パ−チーズ）である。ＣＲＩ（および高濃度て、ファクターＨ）はＣ３ｂに結合 し、またＣ３ｂ、Ｂｂの解離も促進する。さらにＣ３ｂ、　ＣＲＩ（およびＣ３ ｂ。

Ｈ）の形成はＣ３ｂをファクターＩによる不可逆的タンパク質分解不活性化の作 用を受けやすくする、その結果不活性のＣ３ｂ（ｉＣ３ｂ）の形成となる。補体 活性化の主経路において、複合体Ｃ４ｂ、　２ａはＣ３コンパ−チーズである。

ＣＲＩ（および高濃度で、Ｃ４結合タンパク質、Ｃ４ｂｐ）はＣ４ｂに結合し、 またＣ４ｂ、　２ａの解離も促進する。結合は、Ｃ４ｂをファクターエによる、 不可逆的タンパク質分解不活性化の作用を受けやすくなり、Ｃ４ｃおよびＣ４ｄ （不活性の補体タンパク質）に切断される。

ＣＲＩは単一のポリペプチド鎖て構成される糖タンパク質である。ＣＲＩの４種 のアロタイプ形態か知られており、増大量〜４０．０００−５０．０００ダルト ン分子量の差がある。２種の最もよくある形態はＦおよびＳアロタイプて、Ａお よびＳアロタイプとも呼ばれ、分子量をそれぞれ２５０．０００および２９０． ０００ダルトン有し、（Ｄｙｋｍａｎ。

Ｔ、　Ｒ，、ら、１９８３．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、 Ｓ、Ａ。

８０　：　１６９８；　Ｗｏｎｇ、Ｗ、Ｗ、、　ら、　１９８３．　Ｊ、Ｃｌ１ ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、７２　：　６８５）　２種のまれな形態は分子量２１０．０ ００および〉２９０、０００ダルトンを有する（Ｄｙｋｍａｎ、　Ｔ、Ｒ，、ら 、１９８４゜Ｊ、ＥＸＩ）、Ｍｅｄ、１５９：６９１；　Ｄｙｋｍａｎ、Ｔ、Ｒ ，、ら、１９８５．　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３４：１７８７）。これらの相異は、グリコジル化の状態 というよりむしろ、ＣＲＩのポリペプチド鎖における変異体を明らかに示してい る。なぜなら、それらは精製されたレセプタータンパク質をエンドグリコシダー ゼＦて処理することによりなくすことはできず、（Ｗｏｎｇ、　Ｗ、Ｗ、、ら、 １９８３．　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、７２：６８５）それらは、レセプタ ーアロタイプをチュニカマイシン（ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ）の存在下で生合成 されるのか観察されたからである（Ｌｕｂｌｉｎ、　０９Ｍ、、ら、１９８６． 　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

２６１：５７３６）。４種のＣＲＩアロタイプの全ては、Ｃ３ｂ結合機能を有す る（Ｄｙｋｍａｎ、　Ｔ、Ｒ，、ら、１９８３．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８０：１６９８；　Ｗｏｎｇ、　Ｗ、Ｗ、 、ら、１９８３゜Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｕｎｖｅａｔ、７２：６８５；　Ｄｙｋｍａｎ 、Ｔ、Ｒ，、ら、　１９８４゜Ｊ、Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、１５９　：　６９１；　 Ｄｙｋｍａｎ　Ｔ、Ｒ，、ら、１９８５．　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３４：１７８７）。

ＣＲＩ　ｃＤＮＡの２つの非重複制限フラグメントは高い緊縮条件の下でクロス ハイブリダイズすることを示した（Ｗｏｎｇ、　Ｗ、Ｗ、、ら、１９８５．　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ。

Ａ、　８２ニア７１１）。また両ｃＤＮＡプローブはゲノムＤＮＡの多数の制限 フラグメントにもハイブリッド形成し、大部分のフラグメントは両プローブに共 通である（上記著者）。ＣＲＩ内の反復コード配列の存在は配列比較により確認 された（Ｋｌｉｃｋｓｔｅｉｎ、　Ｌ、Ｂ、、ら、１９８５．　Ｃｏｍｐｌｅｍ ｅｎｔ２：４４　（Ａｂｓｔｒ、））。さらに、ＣＲＩ遺伝子は、いくつかのゲ ノム制限フラグメントに対し、コード配列を欠くゲノムプローブがクロスハイブ リダイゼーションを示したことにより反復的に中に入った配列を有することを示 す（Ｗｏｎｇ、　Ｗ、Ｗ、、ら、１９８６．　Ｊ、　Ｅｘｐ、　１６４：１５３ １）　。さらに、大きなＳアロタイプを有する個人からのＤＮＡは、Ｆアロタイ プを有する個人からのＤＮＡと比較した場合、このゲノムプローブにハイブリッ ド形成する他の制限フラグメントを有した。このことはゲノム配列の重複は高分 子量ＣＲＩ対立遺伝子との関連において起ることを示す（上記著者）。

ＣＲＩは補体レセプター２型（ＣＲ２）との相同性を育することを示す（Ｗｅｉ ｓ、　Ｊ、Ｊ、、　ら、１９８６．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８３：５６３９−５６４３）。

２．３．ヒトの疾患におけるＣＲＩの異常全身性紅斑性狼癒（ＳＬＥ）を有する 患者の赤血球上のＣＲ１発現の減少は、日本（Ｍｉｙａｋａｗａら、１９８１． 　Ｌａｎｃｅｔ２：４９３−４９７；　Ｍｉｎｏｔａら、１９８４．　Ａｒｔｈ ｒ、Ｒｈｅｕｍ、２７：１３２９−１３３５）、アメリカ合衆国（Ｉｉｄａら、 １９８２．　Ｊ、　ＥＸｐ、　Ｍｅｄ。

１５５：１４２７−１４３８；　Ｗｉｌｓｏｎら、１９８２．　Ｎ、Ｅｎｇｌ、 　Ｍｅｄ、　３０７：９８１−９８６）およびヨーロッパ（Ｗａｌｐｏｒｔら、 １９８５．　Ｃ１１ｎ。

Ｅｘｐ、ｒｍｍｕｎｏｌ、５９：５４７；　Ｊｏｕｖｉｎら、１９８６．　Ｃｏ ｍｐｌｅｍｅｎｔ３：８８−９６；　Ｈｏｌｍｅら、１９８６．　Ｃｌ１ｎ、Ｅ ｘｐ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、６３：４ｌ−４８）を包含する、いくつかの地理上の地 域から調査員らにより報告されている。ひとグループとしてとらえると、患者は 細胞当りのレセプターの平均数は正常な人々のそれの５０−６０％である。初期 の報告では、赤血球上のＣＲＩの数は、疾患活動度とは逆に変化する、すなわち 、ＳＬＨの最もひどい徴候の期間中は最も低い数で、高い数は同じ患者の寛解期 中に観察されたことに注目している　（ｒｉｄａら、１９８２．　Ｊ、　Ｅｘｐ 、　Ｍｅｄ、１５５：１４２７−１４３８）。またＣＲＩＯ数は免疫複合体の血 清中レベル、Ｃ３ｄの血清中レベル、および補体活性性免疫複合体の取り入れ、 および“無害な傍観者”として赤血球上に置かれていることを、おそらく示して いる赤血球結合Ｃ３ｄｇの量と逆相関関係することが知られている（Ｒｏｓｓら 、１９８５．　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３５：２００５−２０１４；　Ｈｏｌｍ ｅら、１９８６．　Ｃ１１ｎ、Ｅｘｐ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、６３：４１−４８；　 Ｗａｌｐｏｒｔら、　１９８５．　Ｃｌ１ｎ、　ＥｘＩ）、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、 　５９：５４７）。赤血球上にＣＲＩを欠＜　ＳＬＥを有する、ひとりの患者は ＣＲＩに対する自己抗体を存することか見い出された（Ｗｉ　１ｓｏｎら、１９ ８５、　、Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、７６：１８２−１９０）。抗ＣＲ Ｉ抗体の力価の減少と患者の臨床状態の改善およびレセプター異常の部分的後退 と偶然一致する。抗ＣＲＩ抗体は他の２人のＳＬＥ患者に検出されている（Ｃｏ ｏｋら、１９８６．　Ｃｌ１ｎ。

［ｍｍｕｎｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ、３８：１３５−１３８）　ｏ最近 、活動期ＳＬＥおよび溶血性貧血の状態において赤血球ＣＲＩの後天的に失なわ れることか輸血赤血球のレセプターか早く失なわれることを観察することにより 示された（Ｗａｌｐｏｒｔら、１９８７．　Ｃ１１ｎ、ＥＸｐ、［ｍｍＵｎｏｔ 、６９：５０１−５０７）。

また赤血球からＣＲＩを相対的に失うことは、ヒト免疫不全ウィルス（Ｈｍ感染 を有する患者（Ｔａｕｓｋ、　Ｆ、Ａ、。

ら、１９８６．　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　７８：９７７−９８２）お よびらい腫らいを有する患者にも観察される（Ｔａｕｓｋ、　Ｆ、Ａ、、ら、１ ９８５、　Ｊ、Ｉｎｖｅｓｔ、　Ｄｅｒｍａｔ、　８５：５８ｓ−６１ｓ）。

ＳＬＨの補体レセプター発現異常は赤血球ＣＲＩに限定されない。ＳＬＥ患者の 好中球の全細胞ＣＲＩおよびＢリンパ細胞の原形質膜ＣＲＩの相対的に欠乏する ことが起ることが見られる（Ｗｉ　１ｓｏｎら、１９８６．　Ａｒｔｈｒ、　Ｒ ｈｅｕｍ。

２９　ニア３９−７４７）。

５ＬＥＩＶ型腎炎を有する患者の中には、検出できるＣＲＩ抗原の全てが足細胞 から失なわれているが、一方ＳＬＥ腎炎のややひどくない種類および膜増殖性糸 球性腎炎■型および■型を包含する増殖性腎炎の非ＳＬＥ種においては、糸球体 足細胞上のＣＲ１発現は正常とは相異しない（Ｋａｚａｔｃｈｋｉｎｅら、１９ ８２．　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ。

６９：９００−９１２；　Ｅｍａｎｃｉｐａｔｏｒ　ら、１９８３．　Ｃｌ１ｎ 、［ｍｍｕｎｏｌ。

Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ、　２７：１７０−１７５）　Ｏしかしながら、５Ｌ ＥＩＶ型腎炎を育する患者は、腎臓狼癒または全く腎炎のない他の型を有するＳ ＬＥ患者よりも赤血球ＣＲＩの数が少なくはない（Ｊｏｕｖｉｎら、１９８６． 　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　３：８８−９６）。

インビボにおける補体活性化は好中球の原形質膜のＣＲ１発現をアップレギュレ ートする　（Ｌｅｅ、Ｊ、、ら、１９８４、　Ｃｌ１ｎ、　Ｅｘｐ、ｒｍｍｕｎ ｏｌ、５６：２０５−２１４；　Ｍｏｏｒｅ、　Ｆ、Ｄ、。

Ｊｒ、、ら、１９８６．　Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、３１４：９４８−９５３ ）。

補体活性化もまた、炎症をともなう疾患状態に関連している。腸の炎症であるク ローン病は、単核性および多形核性の白血球のリンパ様浸潤により特徴づけられ る。クローン病疾患の空腸体液中の補体Ｃ４濃度か正常な対照に比へて増加した ことが最近わかった（Ａｈｒｅｎｓｔｅｄｔら、１９９０．　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ 、Ｊ、　Ｍｅｄ、３２２：１３４５−９）炎症において補体系と関連している他 の病状は熱傷害（やけど、凍傷）　（Ｇｅｌｆａ＋司ら、１９８２．　Ｊ、　Ｃ ｌ１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、　７０：１１７０；　Ｄｅｍｌｉｎｇら、１９８９．　Ｓｕｒｇ ｅｒｙ　１０６：５２−９）、血液透析（Ｄｅｐｐｉｓｃｈら、１９９０．　Ｋ ｉｄｎｅｙ　Ｉｎ５ｔ、３７６９６−７０６：　Ｋｏｊｉｍａら、、　１９８９ ．　Ｎ１ｐｐｏｎ　Ｊｅｎｚｏ　Ｇａｋｋａｉ　５ｈｉ３１　：９ｌ−７）、心 肺バイパスのポンプ後症候群（Ｃｈｅｎｏｗｅｔｈら、　１９８１．　Ｃｏｍｐ ｌｅｍｅｎｔ　Ｉｎｆｌａｍｍ、　３：１５２−１６５；　Ｃｈｅｎｏｗｅｔｈ ら５．１９８６．　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　３：１５２−１６５＋　Ｓａｌａｍ ａら、＋９８８゜Ｎ１゜Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３１８：４０８−１４） を包含する。補体および白血球の両方は成人呼吸障害症候群の病理発生に関連し ５ていると報告されている（７ｉ１ｏｗら、１９９０．　Ｃｌ１ｎ。

Ｅｘｐ、Ｉｍｍｕｎｏ）、　７９：ｌ５ｌ−５７；　Ｌａｎｇｌｏｉｓら、１９ ８９．　ＨｅａｒｔＬｕｎｇ１８・７ｌ−８４）。補体系の活性化は敗血症にお いては致命的合併症への発展に関係していることが示唆され（Ｈａｃｋら、１９ ８９．　Ａｍ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　８６：２Ｏ−２６）免疫複合体誘導血管炎（ Ｃｏｃｈｒａｎｅ、　１９８４．　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　ＳｅｍｉｎａｒＩｍｍｕ ｎｏｐａｔｈｏｌ、　７：２６３）、糸球体腎炎（Ｃｏｕｓｅｒら、１９８５゜ Ｋｉｄｎｅｙ　ｒｎｓｔ、　２９：８７９）、溶血性貧血（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ 　＆Ｆｒａｎｋ、　１９７２．　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　５１：５ ７５）　、重症筋無力症（Ｌｅｎｎｏｎら、１９７８．　Ｊ、　ＥＸｌｌ、　Ｍ ｅｄ、１４７：９７３゜Ｂｉｅｓｅｃｋｅｒ　＆　Ｇｏｍｅｚ、　１９８９．　 Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４２：２６５４）、２型コラ一ゲン誘導関節炎（Ｗ ａｔｓｏｎ　＆　Ｔｏｗｎｅｓ、　１９８５゜Ｊ、　ＥＸＩ）、　Ｍｅｄ、　１ ６２：１８７８）および経験性アレルギー神経炎（Ｆｅａｓｂｙら、１９８７． 　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　４１９：９７）のような自己免疫疾患の動物モデルに おける組織傷害を生じる。

補体系は、また超急性同種組織移植および異種組織移植拒絶にも関係している（ Ｋｎｅｃｈｔｌｅら、１９８５．　Ｊ、　ＨｅａｒｔＴｒａｎｓｐｌａｎｔ　４ （５）：５４１：　Ｇｕｔｔｍａｎ、　１９７４．　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａ− ｔｉｎｎ　１７：３８３；　Ａｄａｃｈｉら、１９８７．　Ｔｒａｎｓ、Ｐｒｏ ｃ、１９（１）：１１４５）。組換え１１゜−２ての免疫療法中の補体活性化は ［Ｌ−２治療から観察されるひどい毒性および副作用を生じるよってある（Ｔｈ ｉｊＳら、１９９０．　Ｊ、　ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４４：２４１９）。

補体はまた免疫複合体に関係する疾患においても役割を果たしている。免疫複合 体はりウマチ性関節炎またはＳＬＥ、　ＡＩＤＳのような血液原性悪性（Ｔａｙ ｌｅｒら、１９８３゜Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ、２６：７３６−４４； 　１ｎａｄａ　ら、　＋９８６．　ＡＩＤＳＲｅｓｅａｒｃｈ　２：２３５−２ ４７）および自己抗体および／または補体活性化に関係する不全を包含するかこ れらに限定されない多くの病理状態に見い出される（Ｒｏｓｓら、１９８５、　 Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３５：２００５−１４）。Ｉｎａｄａらは、赤血球Ｃ ＲＩは自己免疫患者の循環している免疫複合体の除去に機能的役割を存し、それ により体組織内に免疫複合体の沈着を阻害する（Ｉｎａｄａら、１９８９．　Ａ ｎｎ、　Ｒｈｅｕｍ。

Ｄｉｓ　４：２８７）。ＣＲＩ活性の低下はＡＲＣおよびＡＩＤＳ患者において 臨床疾患状態と関連している（Ｉｎａｄａら、１９８６゜ＡＩＤＳ　Ｒｅｓ、　 ２：２３５）。

３、発明の要約 本発明は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂレセプター（ＣＲＩ）遺伝子およびそのコードされた タンパク質に関する。また本発明はＣＲＩ核酸配列およびそれの７０ヌクレオチ ドを含んでなるフラグメントおよびそれらからコードされたペプチドまたは２４ アミノ酸を含んでなるタンパク質にも関する。本発明はＣＲＩタンパク質および そのフラグメントの発現をさらに提供する。本発明の遺伝子およびタンパク質は 補体機能および種々の免疫組織および炎症性障害にかかわる障害の診断または治 療に用途を有する。

下記の実施例の項に詳記しているように本発明の詳細な実施態様において、完全 な長さのＣＲＩ　ｃＤＮＡおよびそのフラグメントのクローニング、ヌクレオチ ド配列および推定アミノ酸配列を記載している。ＣＲＩタンパク質およびそのフ ラグメントの発現もまた記載されている。Ｃ３ｂおよび／またはＣ４ｂに対する 結合部位を含み、ファクターエコーファクター機能を示すＣＲＩタンパク質およ びそのフラグメントの発現が得られる。

また下記の実施例中に記載しているのは、可溶性ＣＲ１分子の産出および精製で あり、この分子は炎症性反応の治療および心筋梗塞の大きさの減少および再潅流 Ａｄ２ＭＬＰ＝アデノウィルス２後期プロモーターＣ＝補体 Ｃ３（ｍａ）＝メチルアミン処理Ｃ３ Ｃ４ｂｐ　＝　Ｃ４結合タンパク質 ＣＭＶ　＝サイトロメガロウイルス ＣＲ１＝補体レセプター１型、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂレセプターＣＲ２＝補体レセプタ ー２型 ＤＣＦＤＡ　＝ジクロロフルオレセインダイアセチイトＨＰＬＣ＝高速液体クロ マトグラフィー１Ｃ３ｂ　＝不活性化Ｃ３ｂ ＬＨＲ＝長い相同性反復 ｍＡｂ　＝モノクローナル抗体 ＰＡＧＥ　＝ポリアクリルアミドゲル電気泳動ＲＰＡＲ＝逆受身アルサス反復 ＳＣＲ＝短いコンセンサス反復 ５ｃＲ１＝可溶性ＣＲＩ分子 ４、図面の説明 第１図、全ＣＲＩコード領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。この配列はク ローンλＴ１０９、ｌのオクタマー　ＥｃｏＲ［リンカ−に続く第１番目のヌク レオチドで始まる。この配列のヌクレオチド番号１５３１は第３図に示される配 列のヌクレオチド番号１の５°側の第１番目のヌクレオチドである。ｍＲＮＡに 相当するストランドか示されており、推定アミノ酸配列か下に示されている。

ヌクレオチド番号２８−１４７によりコードされる推定のシグナル配列をブラケ ットに入れである。

第２図、ヒトＣＲＩ　ｃＤＮＡの５．５　Ｋｂの制限地図。黒い棒線はｃＤＮＡ を示し、制限部位はＨ，ＨｉｎｄＩＩＩ；　Ｂ、　ＢａｍＨＩ；Ｒ，ＥｃｏＲ［ ；　Ｐ、　ＰｓｔＩ　；　Ａ、　Ａｐａｌ；　Ｓ、　５ａｃＩ；　Ｇ、　Ｂｇｌ ｌｌＫ、　Ｋｐｎｌである。その配列か由来するｃＤＮＡクローンを地図の下に 示す。矢印はジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法による配列分 析の方向および程度を示す。ｃＤＮＡクローンは制限地図および重複する配列の 同一性に基づき方向づけだ。

第３図、ヒトＣＲＩ　ｃＤＮＡの５．５　Ｋｂのヌクレオチド配列。

ｍＲＮＡに相当するストランドが示されており、そして塩基番号１　（第１図の 塩基番号１５３２に相当）は最も５゛側クローンのＥｃｏＲＩリンカ−の後の第 １番目の塩基である。終止コドンには下線が付しである。ボックス中の１１０ｂ ｌ）配列はヌクレオチド１４７と１４８の間に見られ（矢印）、そして介在配列 の一部分であると考えられている。

第４図、ヒトＣＲＩ　ｃＤＮＡの５．５Ｋｂのヌクレオチド配列のドツト　マト リックス分析。ドツトは９０ｂｐのうち少なくとも４０ｂｐの一致か存在する場 合にプロットした。

正方形を対角線に二等分している黒い線はそれ自身との配列の同一性を示す。同 一性の線から１．３５および２．７Ｋｂにある２本の付加的な平行した黒い線は それぞれ１．３５Ｋｂの２つの直接縦列した長い相同反復（ＬＨＲ＞である。２ つのＬＨＲの間にある６個のより細い点線は〜０．２Ｋｂの短いコンセンサス反 復に相当する。この短いコンセンサス反復（ＳＣＲ）は長い相同反復を０．４　 Ｋｂこえている。

第５図、ヒトＣＲＩの推定アミノ酸配列。各残基を１文字コードで示す（Ｌｅｈ ｎｉｎｇｅｒ、　Ａ、Ｌ、　１９７５．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ−ｓｔｒｙ、　２ｎ ｄ　Ｅｄ、、　Ｗｏｒｔｈ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　ｆｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙ ｏｒｋ。

１）、　７２）。長い相同反復中の残基はそれらの相同性を示すために整列させ である。ＬＨＲ−Ｂ中のすべての残基か示されており、そしてＬＨＲ−Ｃおよび ＬＨＲ−Ｄの残基はそれかＬＨＲ−８の残基と異なる個所のみ示されている。ヒ トロバジ−プロフィルは推定膜貫通領域を示すためにタンパク質のＣ０ＯＨ末端 の下に並べである。疎水性配列の直後の４つの陽性荷電した残基部分の上にライ ンを付しである。表皮成長因子レセプター中のプロティンキナーゼＣ燐酸化部位 と６７％の相同性を有する６アミノ酸配列には下線が付しである。ＣＲＩタンパ ク質の概略図を配列の上に示す。（ＴＭ）膜貫通領域、（Ｃｙｔ）ｍ脂質内領域 、（３’　ＵＴ）３’非非翻訳列。

第６図、　（Ａ）　ＣＩ？ＩのＳＣＲの整列。反復部はＮｔ（２末端からＣ０Ｏ Ｈ末端の方へ１−２３と番号付けしである。整列を最大限に合致させるためにス ペースを設けである。ボックスは不変残基を表わしそして垂直矢印はアミノ酸保 存部分を示す。残基または保存置換かＳＣＲの少くとも半分に存在する場合に、 その残基は保存されていると見なされる。水平矢印はやはりＣＲＩゲノムクロー ン２−３８から配列されそして１つのエキソンによりコードされるＳＣＲを示す 。（Ｂ）ゲノムクローンλ２−３８の制限地図、配列法、および部分配列を示す 。制限部位は、（Ｂ）ＢａｍＨＩ、　（Ｓ）Ｓａｃｌ、　（Ｅ）ＥｃｏＲＶ、　 （Ｋ）Ｋｌｌｎｒ、　（Ｐ）Ｐｓｔｒである。

水平矢印はエキソンーイントロン境界を示す。

第７図、この構造を有することが知られているタンパク質のＳＣＲのコンセンサ ス配列の整列。整列を最大限に合致させるためにスペースを導入した。残基が存 在する場合は他のタンパク質の少くとも半分てそれか保存されているものである １個または２個のＳＣＲを有するタンパク質を除き、残基は第５図で保存されて いると見なされる。ＣＲ２およびＣ２ｂの下線部分はこれらのタンパク質に関し この領域では何らの配列情報も刊行されていないことを示す。ボックスは不変半 シスチンを示す。配列の右方向の番号はコンセンサス配列を生成させるのに用い られるＳＣＩ？の番号を示す。コンセンサス配列を決定するのに用いられる配列 データに関するタンパク質略語および参照は次のとおりである：（ＣＲＩ）補体 レセプタータイプ１．（Ｈ）ファクターＨ（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ、Ｔ、、ら、 　１９８６．　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３６：３４０７）。

（Ｃ４ｂｐ）　Ｃ４結合タンパク質（Ｃｈｕｎｇ、　Ｌ、Ｐ、、ら、１９８５゜ Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　２３０：１３３）、　（ＣＲ２）補体レセプタータイ プ２　（Ｗｅｉｓ、Ｊ、Ｊ、、ら、１９８６．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、　８３：５６３９）、　（Ｂａ）ファクターＢのタンパク分解フラ グメント（Ｍｏｒｌｅｙ、　Ｂ、Ｊ、およびＣａｍｐｂｅｌｌ、　Ｒ，Ｄ、。

１９８４、　ＥＭＢＯＪ、　３：１５３）、　（Ｃ２ｂ）　Ｃ２のタンパク分解 フラグメント（Ｇａｇｎｏｎ、Ｊ、、１９８４．　Ｐｈ１ｌｏｓ、　Ｔｒａｎｓ 、　Ｒ，Ｓｏｃ。

Ｌｏｎｄ、　Ｂｉｏｌ、　Ｓｃｉ、　３０６：３０１）、　（Ｃｂ）　ＣＩのγ サブユニット（Ｌｅｙｔｕｓ、Ｓ、Ｐ、、ら、１９８６．　８ｉｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ　２５：４８５５）。

（ＸｒｌＩｂ）ファクターＸｒｌｌのｂサブユニット（Ｉｃｈｉｎｏｓｅ。

Ａ、、ら、１９８６．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５：４６３３）、（β２ ＧＰｌ）β２糖タンパク質Ｉ　（Ｌａｚｉｅｒ、　Ｊ、、ら、１９８４．　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８１：３６４０）、　（Ｈａｐ）　ハプ トグロビン（Ｋｕｒｏｓｋｙ、　Ａ、、ら、１９８０．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ。

Ｓ、Ａ、　７７：３３８８）、　（ＩＬ−２−Ｒ）インターロイキン−２レセプ ター（Ｌｅｏｎａｒｄ、　Ｗ、Ｊ、、ら、１９８５．　５ｃｉｅｎｃｅ　２３０ ：６３３）。

星印は不完全配列が入手しうることを示す。

第８図、ヒトＣＲＩ配列について提案された構造の概略図。Ｃ０ＯＨ末端細胞質 内領域か脂質二重層の右側にある。３０ＳＣＲは細胞質膜の細胞外に直線状に並 べられている。カッコはＬＨＲを示す。挿入図はトリプルループ構造を示すため に１個のＳＣＲを拡大して示す。

第９図、ヒトＣＲＩをコードするプラスミドｐＢＳＡＢＣＤの挿入物の制限地図 。コード配列を含有する領域の輪郭を示すボックス内には、ＣＲＩ構築物を形成 するために連結された８個のｃＤＮＡクローンの９個のフラグメントが存在する 。ブラケットはそれぞれＬ）ＩＲ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ１および−Ｄを示す。ボック スの下の線は新たに単離された５°ｃＤＮＡクローンの位置を示す。制限部位は 、Ａ。

Ａｐａｌ、　Ｂ、　ＢａｍＨＩ；　Ｇ、　Ｂｇｌｌｌ；　Ｈ，Ｈｉｎｄ（ＩＩ； 　Ｋ、　Ｋｐｎに　Ｍ。

ＢｓｐＭＩＩ；　Ｐ、　Ｐｓｔｌ；　Ｒ，ＥｃｏＲＩ；およびＳ、　５ａｃｌで ある。

第１０図、ＬＨＲ−Ａの７個のＳＣＲをコードする５’　ｃＤＮＡクローンの推 定アミノ酸配列、およびこの配列とＬＨＲ−８、−Ｃ１および−Ｄの相当するＳ ＣＲとの整列。各ＳＣＲ中に保存されている４個のシスティンに下線を付しであ る。

ＬＨＲ−Ｂ、−Ｃおよび−Ｄの残基はそれかＬＨＲ−Ａのそれと異なる個所のみ 示す。

第１１図７発現プラスミドｐｉＡＢＣＤおよびｐＭＴＡＢＣＤの制限地図。Ｐｍ ＭｔおよびＰＣいはそれぞれマウスメタロチオネインおよびサイトメガロウィル ス極初期プロモーターを示す。

第１２図、それぞれｐｉＡＢＣＤ　（パネルａおよびｂ）およびＣ０Ｍ８ベクタ ーのみ（パネルＣおよびＤ）てトランスフェクションさせ、そしてＹＺｌモノク ローナル抗−ＣＲＩ抗体およびフルオレセイン標識ヤギ抗−マウスＦ（ａｂ’　 ）＝て間接的に染色したＣＯ３細胞の位相差（パネルａおよびＣ）および免疫蛍 光（パネルｂおよびｄ）顕微鏡写真である。

第１３図９組換えＣＲＩを発現するＣＯ８細胞によるＣ３ｂ−およびＣ４ｂ−結 合の分析。ｐｉＡＢＣＤ　（パネルａおよびＣ）またはＣＤＭ　８ベクターのみ （パネルｂおよびｄ）でトランスフェクションさせたＣＯ８細胞をＥＡＣ４ｂ（ ｌｉｍ）、３ｂ　（パネルａおよびｂ）またはＥＡＣ４ｂ　（パネルＣおよびｄ ）とインキュベーションしそして位相差顕微鏡によりロゼツト形成について検査 した。

第１４図、トランスフェクションされたＣＯ３細胞により発現された組換えＣＲ Ｉの５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分析。ＣＤＭ　８ベクターのみ（レーンｌおよび４ ）およびｐｉＡＢＣＤ　（レーン２および５）でそれぞれトランスフェクション したＣＯ３細胞、およびＣＲＩのＦおよびＳアロタイプを有する個体からの赤血 球（レーン３および６）を１２５１で表面標識した。細胞の界面活性剤による溶 解物を続いてセファロースＵＰＣＩＯ（レーン１−３）およびセファロース−Ｙ ＺＩ（レーン４−６）で免疫吸着させそして溶出物を非還元条件下の５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより分析した。

第１５図、免疫固定化された組換えＣＲＩの存在下におけるファクターＩによる ’　２’　Ｉ−Ｃ３（ｍａ）切断。＋２５１−Ｃ３（ｍａ）の複製試料を、ファ クターＨの存在下におけるファクターＩ　（レーンｌ）、ＣＤＭ８ベクターのみ でトランスフェクションさせたＣＯ３細胞の溶解物とブレインキュベートしたセ ファロース−ＵＰＣＩＯ（レーン２）　、１）ｉＡＢＣＤ−トランスフェクショ ンＣＯ８細胞の溶解物とブレインキュベートしたセファロース−ＵＰＣＩＯ（レ ーン３）、ＣＤＭ８−）ランスフェクションＣＯ８細胞の溶解物とブレインキュ ベートしたセファロース−ＹＺＩ（レーン４）、およびｐｉＡＢＣＤ−）ランス フエクションＣＯ３細胞の溶解物とブレインキュベートしたセファロース−ＹＺ Ｉの６μｌ　（レーン５）、１２μ！　（レーン６）および２５μ！（レーン７ ）て処理した。１２Ｓｌ−標識Ｃ３（ｍａ）の試料もファクターＩの非存在下に 、ｐｉＡＢＣＤ−トランスフェクションＣＯ３細胞の溶解物とブレインキュベー トしたセファロース−ＹＺＩ　２５μ！で処理した（レーン８）。還元後、’　 ”　’　Ｉ　−Ｃ３（ｍａ）を５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィー により分析した。

第１６図、ＣＲＩ欠失突然変異体をコードするｃＤＮＡ構築物。４つのＬＨＲを コードするｃＤＮＡセグメントの位置を欠失突然変異体の調製に用いられた制限 部位が示しである全長ｐｉＡＢＣＤ構築物の上方にブラケットで示す。各突然変 異体中に残存するｃＤＮＡ制限フラグメントを黒い線で示す。制限部位はＡ、　 Ａｐａｌ；　Ｂ、　Ｂｓｍ１；　Ｅ、　ＢｓｔＥＩＩ；およびＰ、　Ｐｓｔｌで ある。

第１７図、ＣＲ１の組換え欠失変異体とＣＲＩの野生型ＦおよびＳアロタイプと の比較。赤血球（レーン１および７）、およびＣＤＭ　８ベクターのみ（レーン ２および８　）　、ｐｉＡＢＣＤ　（レーン３および９　）　、ｐｉＢＣＤ（レ ーン４および１０）、ｐｉＣＤ　（レーン５および１１）およびｐｉＤ　（レー ン６および１２）でそれぞれトランスフェクションさせたＣＯ３細胞を１２１で 表面標識したものの界面活性剤による溶解物をセファロース−ＵＰＣＩＯ抗−レ バン抗体（レーン１−６）、セファロース−ＹＺＩ抗−ＣＲＩモノクローナル抗 体（レーン７−１１）およびウサギ抗−ＣＲ１抗体およびセファロ−スープロチ インＡ（レーン１２）でそれぞれ免疫沈降させた。溶出物を還元条件下の５ＤＳ −ＰＡＧＥおよびオートラジオブラフイーにかけた。

第１８図、全長ＣＲＩおよび欠失変異体を発現するＣＯ８細胞の存在下における ファクターＩによる”　’　Ｉ−Ｃ３（ｍａ）の切断。＋　ｔ　ｓ　１−０１− ０３（の複製試料をファクターＩの非存在下（レーン１−６）または存在下（レ ーン？−１２）に、それぞれＣＤＭ　８ベクターのみ（レーンｌおよび７）、ｐ ｉＡＢＣＤ　（レーン２および８）　、ｐｉＡＤ　（レーン３および９）　、ｐ ｉＢＤ　（レーン４および１０）　、ｐｉｃＩ）　（レーン５および１１）、お よびｐｉＤ（レーン６および１２）てトランスフェクションしたＣＯ３細胞とイ ンキュベートした。

’　２５１−Ｃ３（ｍａ）の試料もそれぞれファクターＨおよびファクター■（ レーン１３）とおよびファクター■のみ（レーン１４）とインキュベートした。

還元後、’　２５１−Ｃ３（ｍａ）を５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラ フィーにより分析した。

第１９図、ＣＲ１の各ＬＨＲ，およびＣ３ｂおよびＣ４ｂのレセプターの特異性 を決定する予想部位を含有するＳＣＲ型の模式図。これらの二次的な結合特異性 をカッコで示す。

第２０図、可溶性ＣＲＩ　ＤＮＡ構築物中に残存するＤＮＡ領域を示す概略図。

全長ＣＲＩ　ｃＤＮＡ領域を図面の上方のボックスにより示す。

第２１図５発現ベクターのｐＴＣＳシリーズ中の主要エレメントを示す概略図。

第２２フ０ ニル化部位はマウスＩｇカッパ配列から（ＮＢＲＦヌクレイツクデータベースア クセツション＃にｃｍｓＳｂｐ　１３０６−１７１４）　、Ａｄ２　ＭＬＰおよ び三分節系領域はＡｄ２配列から（ＮＢＲＦヌクレイツクデータベースアクセツ ション＃Ｇｄａｄ２、ｂｐ　５７９０−６０６９）；　ＳＶ４０初期プロモータ ーはＳ■４０ゲノムから（ＮＢＲＦヌクレイツクデータベースアクセツション＃ ＧＳＶ４０Ｗ）得られた。ｇｐｔ遺伝子、アンピシリン遺伝子および複製の細菌 性起点はベクターｐＳＶ２ｇｐｔから（ＡＴＣＣアクセツション隘３７１４５） 得た。

第２３図．抗体アフィニティ精製５ｃＲ１の４−２０％５ＤＳ−ＰＡＧＥ．非還 元（レーンＩ，　２．　３）および還元（レーン４，５．６）条件下。レーン１ ．３二分子量マーカー、レーン３．５：細胞培養上清出発物質；レーン４。

６：抗体アフィニティクロマトグラフィーにより精製した５ｃＲ１。

第２４図．カチオン交換ＨＰＬＣ溶離プロフィル。溶離されたタンパク質を２８ ０ｎｍでの吸光度（Ｙ軸）により監視した。フロースルー（０−１００分）およ び溶出５ｃＲ１（１５０−１６５分）の吸光度はいずれも目盛外であった。

Ｘ軸は溶離時間（分）を表わす。

第２５図．カチオンおよびアニオン交換ＨＰＬＣ精製５ｃＲ１の４−２０％グラ ジェント５ＤＳ−ＰＡＧＥ．　５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルは非還元条件下 に行われた。レーン１，バイオリアクター上清の一部分；レーン２．カチオンＨ ＰＬＣ出発緩衝液で透析したバイオリアクター上清の一部分；レーン３，カチオ ン交換）ＩＰＬＣカラムからの５ｃＲ１溶出ピークの一部分；レーン４，カチオ ン交換ＨＰＬＣカラムからの５ｃＲ１ピークをアニオンＨＰＬＣの出発緩衝液で 透析した一部分：レーン５および６，アニオンＨＰＬＣから溶離された５ｃＲ１ の２つの異なるフラクションの一部分。

第２６図．ヒト好中球における酸素バーストのＣ５ａ誘導。Ｃ５ａ誘導酵素バー ストに続き、ＤＣＦＤＡが酸化されそして明る（蛍光を発した。フローサイトメ トリーにより測定した蛍光強度をＸ軸にそして細胞の数をＹ軸に示す。パネルａ 、細胞のプロフィルおよびゲート；パネルｂ、Ｃ５ａ添加０分後；パネルｃ、１ 分後：パネルｄ、２分後；パネルｅ、３分後；パネルｆ、４分後；パネルｇ、２ ０分後。このＤＣＦＤＡアッセイによりＣ５ａか高感度で示される。

第２７図、　ｓｃｌ？Ｉの存在下におけるヒト補体の活性化によりＤＣＦＣＤＡ アッセイにおいてＣ５ａ活性の低下か示される。パネルａ、未刺激細胞；パネル ｂ、高度の蛍光を示す５ｃＲ１を含まない対照；パネルＣ１蛍光強度の７５％低 下を示す５ｃＲ１の存在下におけるＤＣＦＤＡアッセイ。Ｙ軸は細胞数でありそ してＸ軸は蛍光強度である。

第２８図、ヒト血清における古典的経路Ｃ５ａおよびＣ３ａ産生の５ｃＲ１によ る阻害。同様のプロフィルが抗体アフィニティ精製またはＨＰＬＣ精製５ｃＲ１ で観察された。

第２９図１組換え５ｃＲ１による補体仲介溶血の阻害。同様のプロフィルか抗体 アフィニティ精製またはＨＰＬＣ精製５ｃＲ１て観察された。

第３０図、　５ｃＲ１−ｆｉ置（左）　オよび未処ｒｉｔ＜右）ラットのＲＰＡ Ｒの肉眼的形態。（ａ）両ラットともオバルブミンの静脈注射に続き５ｃＲ１（ 左ラット）またはＰＢＳ（右ラット）と、生のままの抗−オバルブミン（左部分 ）；％希釈抗−オバルブミン（中央部分）またはウサギＩｇＧ（右部分）の混合 物の皮肉注射を受けた。注射は二通りずつ行い、上方および下方の列で同じ結果 か得られた。５ｃＲ１を与えられたラットは目で見える変化をほとんど示さなか ったが、未処置ラットはＲＰＡＲの完全な徴候を生じた。（ｂ）　（ａ）からの 皮膚バイオプシーの皮膚表面。未処置ラット（右）からのバイオプシーは明らか に見ることのできる病変を示したか、５ｃＲ１処置ラツト（左）からのバイオプ シーは正常な形態を示した。

第３１図、５ｃＲ１処置（ａ）および未処置（ｂ）ラットの皮膚バイオプシーの 光学顕微鏡写真。（ａ）多形核および単核細胞の血管周囲の蓄積が観察されるが 、好中球の広範な浸潤も赤血球の遊出も見られなかった。（ｂ）多形核細胞の広 範な浸潤および赤血球の遊出か確認された。

第３２図　αおよびβクリアランス相の二重相を示すラットおよびモンキーの血 液から注射した５ｃＲＩのクリアランス。

第３３図　ＣＲＩ　ｃＤＮＡおよびイントロンプローブがＦ又はＦ゛アロタイプ 発現する個体からのＤＮＡのＥｃｏＲＶ消化物にハイブリダイズされるサザンプ ロットのオートラジオグラフィー。λＤＮＡのＨｉｎｄｎ［フラグメントの位置 は左側のキロベースで示される。Ｆ′特異性フラグメントの位置は単一矢印によ り示される。

第３４図　ＣＲＩのＦ対立遺伝子のＥｃｏＲＶ制限地図。白いボックスはエクソ ンの位置を示し、点線のボックスはイントロンプローブのハイブリダイゼーシヨ ンの部位を示す。ＬＨＲ−Ｂおよび−Ｃ上のブラケットは欠失かありえる２領域 を示す。ＶはＥｃｏＲＶ部位を示す。

第３５図　種々の形態の組換えｒｃＲｌへのｃＤＮＡインサート。示されている 制限部位はＡ、　ＡｐａＬ　Ｉ　；　Ｂ、　ＢａｍＨ［；Ｃ，５ａｃｌ：　Ｈ， ＨｉｎｄＩＩＩ：　Ｌ、　Ｂｇｌｌ；　Ｐ、　Ｐｓｔｌ；　Ｒ，ＥｃｏＲＩ　； 　ａｎｄ　Ｓ、　Ｓｍａ　Ｉである。上部の概略図はＣＲＩタンパク質を示し、 同一の配列を有するＳＣＲは同じパターンで満たされている。

第３６図　ＹＺ−１−セファローズ吸収により精製された組換えｓｃＦ？Ｉの非 還元条件下のクーマシープルー染色された５ＤＳ−ＰＡＧＥ、各レーンはｐａｓ ｅｃＡＢＢｃＤ　（レーン１）、ｐａｓｅｃＡＢＣＤ　（レーン２）、またはｐ ａｓｅｃＡＣＤ　（レーン３）でトランスフェクトされたＣＯ３細胞の培養上清 から精製された組換え５ｃＲ１１０μｇを含有する。Ｍｒママ−−の位置は右に ＫＤで示されている。

第３７図　組換え５ｃＲ２の補因子活性。Ｃ３ｂのα゛鎖の切断はｐａｓｅｃＡ ＢＢｃＤ、　ｐａｓｅｃＡＢＣＤ、またはｐａｓｅｃＡｃＤでトランスフェクト されたＣＯ３細胞由来の組換え５ＣＲＩの漸増量の存在下で測定された。

第３８図　組換え５ｃＲ１による赤血球の１２’ｒ−Ｃ３ｂダイマー取込み阻害 。赤血球結合リガンドはＣ３ｂダイマー、Ｃ３ｂモノマー、およびｐａｓｅｃＡ ＢＢｃＤ、　１）ａｓｅｃＡＢｃＤ、またはｐａＳｅｃＡｃＤてトランスフェク トされたＣＯ８細胞由来の組換え５ｃＲ１の漸増濃度の存在下で測定された。

第３９図　ＣＲＩ変異種をコードする種々のプラスミドでトランスフェクトされ たＣＯ３細胞から精製された組換え５ｃＲＩによる副経路（Ａ）および主経路（ Ｂ）Ｃ３コンバーターゼの阻害。

第４０図　ＣＲＩ変異種をコードする種々のプラスミドでトランスフェクトされ たＣＯ３細胞から精製された組換え５ｃＲ１により副経路（Ａ）および主経路（ Ｂ）Ｃ５コンバーターゼの阻害。

５、発明の詳細な説明 本発明はＣ３ｂ／Ｃ４ｂレセプター（ＣＲＩ）遺伝子およびそれがコードするタ ンパク質に関する。本発明はまた、ＣＲＩ核酸配列および７０ヌクレオチドを含 有するそのフラグメントおよびそれらかコードする２４アミノ酸を含有するペプ チドまたはタンパク質にも関する。本発明はさらに、ＣＲＩタンパク質およびそ のフラグメントの発現をも提供するものである。かかるＣＲＩ配列およびタンパ ク質は炎症または免疫系の障害および補体活性が関わる障害の診断および治療に 価値がある。

詳細な態様においては、本発明は可溶性ＣＲ１分子およびその発現、精製および 用途に関する。ここで用いられる「可溶性ＣＲ１分子」なる用語は、天然型ＣＲ Ｉタンパク質と対照的に、細胞表面に膜タンパク質として発現されないＣＲＩタ ンパク質の部分を意味しよう。特定の例としては、膜貫通領域を実質的に含有し ないＣＲ１分子か可溶性ＣＲ１分子である。好ましい態様においては、可溶性Ｃ Ｒ１分子はそれらを発現する細胞により分泌される。

下記実施例の項で詳述される本発明の詳細な態様においては、全長ＣＲＩ　ｃＤ ＮＡおよびそのフラグメントのクローニングおよび完全なヌクレオチドおよび推 定アミノ酸配列、およびそれらがコードするＣＲＩ産物の発現か記載される。Ｃ ３ｂおよび／またはＣ４ｂの結合部位を有し、そしてファクターエコファクター 活性を阻害するＣＲＩおよびそのフラグメントの発現も記載される。本発明はさ らに、可溶性で、先端の切れたＣＲ１分子の産生および精製によっても説明する 。詳細な実施例においては、かかる分子は炎症の低下、および心筋梗塞規模の低 下および再潅流損傷の防止に治療上町用であることが示される。

５．１．　ＣＲＩ遺伝子の単離 ＣＲＩ遺伝子の全コード配列およびその推定アミノ酸配列は第１図に示す。任意 のヒト細胞はＣＲＩ遺伝子の分子クローニングの核酸源として役立つ可能性かあ る。

ＣＲＩ遺伝子の単離は、ＣＲＩ関連構造または性質、例えばＣ３ｂまたはＣ４ｂ または免疫複合体の結合、食作用修飾、免疫刺激または増殖、および補体の調節 を示すタンパク質をコードするこれらのＤＮＡ配列の単離を必要とする。ＤＮＡ は、当業上知られている標準的手法、クローン化ＤＮＡ（例えばＤＮＡ“ライブ ラリー”）から、化学的合成により、ｃＤＮＡクローニングにより、または所望 のヒト細胞から精製されたゲノムＤＮＡまたはそのフラグメントのクローニング により得られる（例えばＭａｎｉａｔｉｓら、１９８２．　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ 　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ；　Ｇｌｏｖｅｒ、　Ｄ、Ｍ、　（ｌｉｄ）、　１９８５．　 ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、　ＭＲ Ｌ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｌｔｄ、、　０ｘｆｏｒｄ。

Ｕ、に、、　Ｖｏｌ、　１．　ＩＦ、参照）。ＣＲＩ遺伝子のｃＤＮＡクローニ ングの核酸源として役立つ細胞は、単球／マクロファージ、顆粒細胞、Ｂ細胞、 Ｔ細胞、牌臓毛包性樹状細胞および腎糸球体足細胞を包含するかそれらに限定さ れない。ゲノムＤＮＡに由来するクローンはコード領域の他に調節およびイント ロンＤＮＡ　Ｍ域を含有しつる。

ｃＤＮＡに由来するクローンはエクソン配列のみを含有しよう。その起源か何で あろうと、ＣＲＩ遺伝子は遺伝子増殖のための適当なベクター内に分子的にクロ ーン化されるべきである。

ゲノムＤＮＡからの遺伝子の分子クローニングに於ては、ＤＮＡフラグメントか 生成され、その一部が所望のＣＲＩ遺伝子をコードしているであろう。ＤＮＡを 種々の制限酵素を用いて特定の部位で切断することかできる。

あるいはまた、ＤＮＡをフラグメントにするためにそのＤＮアーゼをマンガン存 在下で用いることかでき、また例えば音波処理によるように、物理的にＤＮＡを 切断することもできる。次に、アガロースおよびポリアクリルアミドゲル電気泳 動およびカラムクロマトグラフィーを包含するかそれらに限定されない標準的技 法により、線状ＤＮＡフラグメントを分子量に従って分離することかできる。

ひとたびＤＮＡフラグメントか生成されると、ＣＲＩ遺伝子を含有する特定のＤ ＮＡフラグメントを多数の方法で同定することかできる。例えばある量のＣＩ？ １遺伝子またはその特異的なＲＮＡ、またはそのフラグメントか利用可能で、そ れを精製し標識化することができれば、生成したＤＮＡフラグメントを標識化プ ローブとの核酸ハイブリダイゼーションにより選抜することかできる（Ｂｅｎｔ ｏｎ、　Ｗ、およびＤａｖｊｓ、　Ｒ，，１９７７、５ｃｉｅｎｃｅ　１９６： １８０；　Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ、　Ｍ、およびＨｏｇｎｅｓｓ、　Ｄ、　１９７ ５．　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７２：３９６１）。プロー ブと実質的に相同のこれらＤＮＡフラグメントはハイブリダイズするであろう。

もし精製ＣＲＩ特異的プローブか利用できない場合は、最初の選択方法として、 ＣＲＩに富む核酸フラクションをプローブとして用いることかできる。

−例として、繊維芽細胞により発現されたメツセージを取り去ったＢ細胞ｃＤＮ Ａであるプローブを用いることかできる。制限酵素消化およびもし利用できれば 既知の制限地図にしたがって予想されるものとのフラグメントの大きさの比較に より適当なフラグメントを同定することも可能である。最初の選択の後に、以下 に記載されるように、遺伝子の性質、または発現された産物の物理的、化学的ま たは免疫学的性質に基づいて、さらに選択を行うことができる。

また、ＣＲＩ遺伝子は、核酸ハイブリダイゼーションによるｍＲＮＡの選択とそ れに続くインビトロ翻訳により同定することもできる。この方法に於ては、ハイ ブリッド形成により相補性ｍＲＮＡを単離するのにフラグメントか用いられる。

このようなりＮＡフラグメントは利用可能な精製ＣＲＩ　ＤＮＡ、またはＣＲＩ 配列に富むＤＮＡであることができる。単離されたｍＲＮＡのインビトロ翻訳産 物の免疫沈降分析または機能アッセイ（例えば、Ｃ３ｂまたはＣ４ｂ結合、また は食作用または免疫刺激の促進、または補体調節等に関して）によりｍＲＮＡが 同定され、従ってＣＲＩ配列を含有する相補性ＤＮＡフラグメントが同定される 。さらに、細胞から単離されたポリゾームを、ＣＲＩ特異的な固定化抗体に吸着 させることによって特異的なｍＲＮＡを選択できる。（吸着されたポリゾームか ら）選択されたｍＲＮＡを鋳型として用いて、放射性標識ＣＲＩ　ｃＤＮＡを合 成することかできる。次いて、放射性標識ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡをプローブと して使って、ＣＲＩＤＮＡフラグメントを他のゲノムＤＮＡフラグメントの中か ら同定する二とがてきる。

ＣＲＩゲノムＤＮＡを単離する以外の方法には、遺伝子配列自体を既知配列から 化学的に合成すること、またはＣＲＩ遺伝子をコードするｍＲＮＡに対するｃＤ ＮＡを作成することが包含されるがこれに限定されるわけてはない。

例えば、上記記載のようにＣＲＩ遺伝子のｃＤＮＡクローニングのためのＲＮＡ を、単球／マクロファージ、顆粒細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、および足細 胞を包含するかそれに限定されない細胞から単離することかできる。好ましい実 施態様において、扁桃腺細胞はｃＤＮＡクローニングのｍＲＮＡの起源として役 立つ（下記、６．１゜２項参照）他の方法も可能でありそしてそれは本発明の範 囲内である。

次に同定および単離された遺伝子を適当なりローニングベクターに挿入すること ができる。当業上知られた多数のベクター宿主系を用いることかできる。使用可 能なベクターにはプラスミドまたは修飾されたウィルスか包含されるかそれらに 限定されるわけではない。

しかしベクター系は使用される宿主細胞と適合しなければならない。このような ベクターには、ラムダ誘導体のようなバクテリオファージ、またはＰＢＲ３２２ またはｐＵｃプラスミドまたはＣＤＭ　８プラスミド（Ｓｅｅｄ、　Ｂ、、　１ ９８７、　Ｎａｔｕｒｅ　３２９：８４０−８４２）または誘導体のようなプラ スミドか包含されるかそれらに限定されるわけてはない。形質転換、トランスフ ェクション、感染、エレクトロポレーションなどによって、組換え分子を宿主細 胞に導入することができる。

別法では、「ショットガンＪ法で適当なりローニングベクターに挿入後、ＣＲＩ 遺伝子を同定および単離することかできる。クローニングベクターへの挿入の前 に、例えば、分子量による分画によってＣＲＩ遺伝子を増強することができる。

ＣＲＩ遺伝子を、適当な宿主細胞の形質転換、トランスフェクション、または感 染に使用できるクローニングベクターに挿入すると、その結果多コピーの遺伝子 配列か生成される。詳細な実施態様に於ては、クローニングベクターとして哺乳 動物宿主細胞中で発現を達成するのに使用できるＣＤＭ８ベクターを用いること かできる。例えば相補性付着末端を有するクローニングベクターにＤＮＡフラグ メントを連結することによって、クローニングベクターへの挿入を行うことがで きる。

しかしながら、もしＤＮＡをフラグメントに切断するのに用いられた相補性制限 部位かクローニングベクターに存在しない場合は、ＤＮＡ分子の末端を酵素的に 修飾することができる。このような修飾には、一本鎖ＤＮＡ末端をさらに消化す るかまたは一本鎖末端を充填することによって平滑末端を生成させることが包含 され、かくしてこれら末端か平滑末端として連結できる。あるいはまた、ＤＮＡ 末端へのヌクレオチド配列（リンカ−）の結合によって任意の所望の部位をつく り出すことかできる。これらの連結されたリンカ−は制限エンドヌクレアーゼ認 識配列をコードする特異的な化学合成オリゴヌクレオチドからなることかできる 。別法では、切断したベクターおよびＣＲＩ遺伝子をホモポリメリックティリン グによって修飾することかできる。

クローン化されたＣＲＩ遺伝子は、ＤＮＡそれ自体の性質または、代わりにその コードするタンパク質の物理的、免疫学的、または機能的性質に基づく多くの方 法で同定することかできる。例えば、ＤＮＡそれ自体は、標識化プローブに対す るプラークまたはコロニー核酸ハイブリダイゼーションによって検出できる（Ｂ ｅｎｔｏｎ。

Ｗ、およびＤａｖｉｓ、　Ｒ，、１９７７、５ｃｉｅｎｃｅ　１９６：１８０； 　Ｇｒｕｎｓ−ｔｅｉｎ、　Ｍ、および）（ｏｇｎｅｓｓ、　Ｄ、、　１９７５ ．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ、ｄ。

Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７２：３９６１）。また、その発現された産物の性質 に基づくアッセイによってＣＲＩ遺伝子の存在を検出することもてきる。例えば 、ＣＲＩについて知られているのと同様のまたは同一の、電気泳動ての移動、等 電点電気泳動での挙動、タンパク分解的消化地図、Ｃ３ｂおよび／またはＣ４ｂ および／または免疫複合体結合活性、補体調節活性、食作用または免疫刺激にお よぼす作用、または抗原性を有するタンパク質を生産するｃＤＮＡクローン、ま たは適合するｍＲＮＡをハイブリッド選択するＤＮＡクローンを選択することが できる。ＣＲＩに対する抗体か使用てきれば、ＥＬＩＳＡ（エンザイムリンクト イムノソルベントアッセイ）型の方法で、標識化抗体の推定ＣＲＩ合成りローン への結合によって、ＣＲＩタンパク質を同定できる。

詳細な実施態様に於ては、単離されたＣＲＩ遺伝子、ｃＤＮＡ、または合成りＮ Ａ配列を組み込んだ組換えＤＮＡ分子を用いて宿主細胞を形質転換することによ って、多コピーの遺伝子を生成させることができる。従って、その形質転換体を 増殖させ、形質転換体から組換えＤＮＡ分子を単離し、そして必要ならば単離さ れた組換え体ＤＮＡから挿入遺伝子を回収することによって、遺伝子を大量に得 ることができる。

特定の実施態様に於ては、サイトメガロウィルスのプロモーターの制御下で大規 模発現させるにはＣＤＭ８ベクターのＣＲＩ　ｃＤＮＡクローンを、Ｃ０５（サ ル腎臓）細胞にトランスフェクションさせることができる（下記６．１゜８項参 照）。

究極の目的か、ワクシニアウィルスまたはアデノウィルスのようなウィルス発現 ベクターに遺伝子を挿入することであるならば、ＣＲＩ遺伝子を組み込んだ組換 えＤＮＡ分子を、その遺伝子の側面かウィルス配列で挟まれるように修飾でき、 それによってウィルスに感染した細胞中でゲノムての組換えか可能となってその 結果遺伝子をウィルスゲノム中に挿入することができる。

ＣＲＩ　ＤＮＡ−含有クローンを同定、増殖、および収穫した後、下記５．４． １項に記載されたようにしてそのＤＮＡ挿入物を特性決定することかできる。

ＣＲＩ遺伝子の遺伝子構造か判明すると、本発明に於て最適に利用するためにそ の構造を操作することか可能である。例えば、タンパク質の発現を増加させるた めに、もともと備わっているプロモーターに加えて、またはその代わりにプロモ ーターＤＮＡをＣＲＩコード配列の５°側に連結することができる。ＣＲＩ欠失 変異株を発現する発現ベクターもＣＲＩ配列の特定のフラグメントの発現を提供 するために作られる（下記実施例の項参照）。特別の実施態様においては、所要 のＣ３ｂおよび／またはＣ４ｂ結合機能（下記９項参照）、例えばＣ４ｂ結合の ための＋、ｍ−ＡまたはＣ３ｂ結合のためのＬＨＲ−Ｃを示すＣＲＩタンパク質 のフラグメントをコードする欠失変異株を構築できる。好ましい実施態様におい ては、膜横断領域の欠失を有するＣＲ１分子をコードする発現ベクターは可溶性 ＣＲ１分子を産生ずるのに使用できる（下記実施例１１−１４項参照）。多くの 操作が可能であり、そしてそれらは本発明の範囲内である。

５．２．ＣＲ１遺伝子の発現 ＣＲＩタンパク質（第１図）またはその一部分をコードするヌクレオチド配列を 適当な発現ベクター、すなわち挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻 訳に必要なエレメントを含有するベクター中に挿入することかできる。必要な転 写および翻訳シグナルはもともとのＣＲＩ遺伝子および／またはその隣接領域か ら供給されることもてきる。種々の宿主ベクター系かタンパク質コード配列を発 現させるのに利用できる。これらには、ウィルス（例えば、ワクシニアウィルス 、アデノウィルスなど）感染哺乳類細胞系；ウィルス（例えばバキュロウィルス ）感染昆虫細胞系；酵母ベクターを含有する酵母のような微生物、またはバクチ リオフＴ−ジＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡで形質転換され た細菌、が包含されるがそれらに限定されるわけではない。これらのベクターの 発現エレメントはその強度および特異性が変動する。使用される宿主−ベクター 系に応じて、多数の適当な転写および翻訳エレメントの任意の一つを用いること ができる。

例えば、哺乳類細胞系でクローニングする場合は、哺乳類細胞ゲノムから単離さ れたプロモーターまたは哺乳類細胞中で増殖するウィルス例えばアデノウィルス 、シミアンウィルス４０、サイトメガロウィルスから単離されたプロモーターを 使用することができる。挿入配列の転写を引き起こすためには、組換えＤＮＡま たは合成技法によって作成されたプロモーターを用いることもてきる。

また挿入されたタンパク質コード配列を効率的に翻訳するには特異的な開始シグ ナルも必要である。これらのシグナルにはＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列か包 含される。それ自身の開始コドンおよび隣接配列を包含する完全なＣＲＩ遺伝子 を適当な発現ベクターに挿入する場合は、翻訳制御シグナルを更に加える必要は ない。しかしながら、ＣＲＩコード配列の一部分のみが挿入される場合には、Ａ ＴＧ開始コドンを含む外来翻訳制御シグナルか付与されねばならない。さらに挿 入物全体の翻訳を保証するには開始コドンはタンパク質コード配列と読み枠か一 致しなければならない。このような外来翻訳制御シグナルおよび開始コドンは天 然および合成両方の種々な起源のものであることができる。

適当な転写／翻訳制御シグナルおよびタンパク質コード配列からなるキメラ遺伝 子を含有する発現ベクターを構築するには、ＤＮＡフラグメントのベクターへの 挿入に関して既に述べた任意の方法を用いることかできる。このような方法には インビトロ組換えＤＮＡおよび合成技法、およびインビボ組換え（遺伝的組換え ）か包含されうる。

特別の実施態様において、可溶性ＣＲ１分子を発現する。かかる可溶性分子は、 ＣＲＩ膜横断領域をコードするＤＮＡ配列を欠失する組換えＤＮＡ技法の使用に より産生できる（下記１１−１４項参照）。下記に示す様に、可溶性ＣＲ１分子 を発現する能力は、ＣＲＩ核酸配列のいかなる遺伝子的改変にも限定されない。

すなわちＣＲＩ膜横断領域のかなりの部分をコードする核酸配列を欠失するかぎ り、可溶性ＣＲＩ構築物は得られる。

ＣＲＩ遺伝子挿入物を含有する発現ベクターは３つの一般的な方法によって確認 することかできる。すなわち（ａ）　ＤＮＡ−ＤＮＡ　ハイブリダイゼーション 、（ｂ）ｒｖ−カー」遺伝子機能の存在または非存在、および（Ｃ）挿入配列の 発現。最初の方法に於ては、発現ベクター中に挿入された外来遺伝子の存在は挿 入されたＣＲＩ遺伝子と相同の配列を含有するプローブを用いるＤＮＡ　−ＤＮ Ａハイブリダイゼーションによって検出できる。第２の方法に於ては、組換えベ クター／宿主系はベクターへの外来遺伝子の挿入によって引き起こされた特定の 「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、形質 転換表現型、バキュロウィルスに於ける閉塞体形成）の有無に基づいて確認およ び選択することができる。例えば、もしＣＲＩ遺伝子がベクターのマーカー遺伝 子配列内に挿入されるならば、ＣＲＩ挿入物を含有する組換え体はマーカー遺伝 子機能の欠如によって確認することができる。第３の方法に於ては、組換え体に よって発現される外来遺伝子産物をアッセイすることによって、組換え発現ベク ターを確認することができる。このようなアッセイは遺伝子産物の物理的、免疫 学的、または機能的な性質に基づくことができる。

ひとたび特定の組換えＤＮＡ分子か同定および単離されると、当業上知られたい くつかの方法がその増殖に使用できる。ひとたび好適な宿主系および増殖条件か 確立されると、組換え発現ベクターを大量に増殖および調製することができる。

本発明の実施例て詳述する特定の実施態様に於ては、ＣＲＩ　ｃＤＮＡ挿入物を 有するＣＤＭ８ベクターをＣＯ３細胞にトランスフェクションすることができる 。この細胞内てＣＲＩ　ｃＤＮＡ挿入物が発現されてＣＲＩタンパク質が生産さ れる。下記の実施例の項に詳細した他の特別の実施態様において、ＣＲＩコード 領域の部分に相当するＣＲＩｃＤＮＡ挿入物を育するＣＤＭ８ベクターをＣＯ３ 細胞にトランスフェクションし、そこでＣＲＩまたはフラグメントが発現する。

さらに下記のもうひとつの実施例によると、切断した可溶性ＣＲ１分子は１１． ３．１項記載のｐＴｃｓベクターのような発現ベクターの使用により哺乳動物細 胞中に発現される。既に説明したように、使用できる発現ベクターには少数例を あげれば以下のベクターまたはそれの誘導体か包含されるかそれらに限定される わけてはない。ワクシニアウィルスまたはアデノウィルスのようなヒトまたは動 物ウィルス：バキュロウィルスのような昆虫ウィルス；酵母ベクター；バクテリ オファージベクター（例、ラムダ）、およびプラスミドおよびニスミドＤＮＡベ クター、など。

さらに、挿入配列の発現を調節するかまたはキメラ遺伝子産物を特定の所望の様 式で修飾しプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。ある種のプロ モーターからの発現を特定のインデュサーの存在下に高めることができる。した がって、遺伝子工学的に作成されたＣＲＩタンパク質の発現を制御することがで きる。さらに、それぞれ異なった宿主細胞は、翻訳および翻訳後のタンパク質の プロセシングおよび修飾に関して特徴的かつ特異的なメカニズムを有する。確実 に異種の発現タンパク質に対し所望の修飾およびプロセシングを行うために、適 当な細胞系または宿主系を選択することができる。例えば、第１図の推定アミノ 酸配列を有する未グルコシル化ＣＲＩタンパク質を生産するには、細菌系での発 現を用いることができる。酵母菌中ての発現は、グリコジル化産物を産生ずる別 の実施態様に於ては、異種ＣＲＩタンパク質の「自然な」グリコジル化を保証す るために、哺乳類ＣＯ３細胞を用いることができる。さらに、種々のベクター／ 宿主発現系が種々の程度でタンパク分解的切断のようなプロセシング反応を行う ことができる。種々にプロセシングされた多くのかかるＣＲＩタンパク質を生成 させることかでき、そしてこれらは本発明の範囲内にある。本発明の好ましい実 施態様において、可溶ＣＲ１分子の大規模生産は第１２．１以下に記載のように 行なう。

５．３０発現された遺伝子産物の同定および精製ＣＲＩ遺伝子を発現する組換え 体が−たん同定されると、その遺伝子産物を分析しなければならない。これはそ の産物の物理的、免疫学的、または機能的性質に基づくアッセイによって行うこ とができる。

ＣＲＩタンパク質はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー 、およびサイジングカラムクロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー） 、遠心分離、溶解度の相違、を包含する標準的な方法によって、またはタンパク 質晴製に関する任意の他の標準的な技法によって単離および精製することができ る。

下記の実施例中に詳細した本発明の好ましい面において、大量の可溶性ＣＲＩは ＨＰＬＣを用いる方法により精製できる（１２．２以後を参照）。下記に記載の ように精製ＣＲＩの大規模生産は、始めの材料として可溶性ＣＲＩを産生ずる、 したがって界面活性剤で膜結合ＣＲＩを可溶化する必要性を排除する発現方法を 使用することにより達成できる。バイオリアクター培養物中のウシ胎児血清濃度 の減少および／またはこれらの培養物中に他の培養地の使用により、続く精製中 に可溶性ＣＲＩ含有の始めの材料から高濃度の外部タンパク質を取り除く必要を 排除する。陽イオンＨＰＬＣまたは陽イオンＨＰＬＣの組合せのうちいずれか一 方の後で陰イオン交換ＨＰＬＣを、この好ましい面における精製のために使用で きる。

このようにして、かなり純粋な可溶性ＣＲＩを大量に、一または二段階だけで達 成できる。

また、組換え体によって生産されるＣＲＩタンパク質か−たん同定されると、組 換え体に含まれるキメラ遺伝子のヌクレオチド配列から、このタンパク質のアミ ノ酸配列を推定することかできる。結果として、このタンパク質を当業上知られ た標準的な化学的方法によッテ合成することかできる（例えば、Ｈｕｎｋａｐｉ ｌｌｅｒ、　Ｍ。

ら、１９８４．　Ｎａｔｕｒｅ　３１０：１０５−１１１参照）。

本発明の詳細な実施態様に於ては、このようなＣＲＩタンパク質は、それが組換 えＤＮＡ技法によって生成されるかまたは化学合成法によって生成されるかに関 わらず、実質的に第１図に示すようなアミノ酸配列のすへてまたは一部分を主要 アミノ酸配列として含有するタンパク質を包含するがそれに限定されるわけでは ない。またこのアミノ酸配列には機能的に等価のアミノ酸残基か配列内の残基と 置換されてサイレントな変化を起こしているような変化した配列が包含される。

例えば、一つまたはそれ以上の配列内アミノ酸残基を、同様の極性を示し機能的 に等価な作用をする別のアミノ酸により置換して、結果としてサイレントな変化 を生成させることかできる。また非保存的置換は機能的に等価なタンパク質を生 じる。

ひとつの実施態様において、ＣＲＩ配列内でのアミノ酸の代替物はそのアミノ酸 が属するクラスの他のアミノ酸から選択することかできる。例えば、非極性（疎 水性）アミノ酸にはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フ ェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが包含される。極性中性アミ ノ酸にはグリシン、セリン、トレオニン、システィン、チロシン、アスパラギン 、およびグルタミンか包含される。陽性荷電（塩基性）アミノ酸にはアルギニン 、リジン、およびヒスチジンが包含される。陰性荷電（酸性）アミノ酸にはアス パラギン酸およびグルタミン酸か包含される。翻訳中または翻訳後に例えばグリ コジル化、タンパク分解的切断などによって特別に修飾されたＣＲＩタンパク質 も本発明の範囲に含まれる。

下記に詳記した本発明の実施例において、トランスフェクションした細胞により 発現されるクローン化組換えＣＲＩは、５ＤＳ−ＰＡＧＥによると赤血球のアロ タイプから識別できないことを示しく第１４図）、Ｃ４ｂまたはＣ３ｂのいずれ か一方を担持するヒツジ赤血球の結合に介在することかでき、ＣＲＩのリガンド 特異性を再産生すること（第１３図）、およびＣ３（ｍａ）のアルファポリペプ チド切断のためのファクターエコーファクター機能を表わすこと（第１５図）か できる。

５．４．ＣＲ１遺伝子およびタンパク質の構造ＣＲＩ遺伝子およびタンパク質の 構造は下記に記載された方法を含むが、それらに限定されない当業上知られた種 々の方法により分析することができる。

５．４．１．遺伝子分析 ＣＲＩ遺伝子に相当するクローン化ＤＮＡまたはｃＤＮＡはサザンハイプリダイ ゼーション（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｅ、　Ｍ、、１９７５、　Ｊ、　Ｍｏ１．　 Ｂｉｏｌ、　９８：５０３−５１７）、ノーザンハイブリダイゼーション（例え ば、Ｆｒｅｅｍａｎら、１９８３．　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８０　：　４０９４−４０ ９８参照）、制限エンドヌクレアーゼマツピング（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、 　１９８２゜Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）、およ びＤＮＡ配列分析を包含するがそれらに限定されない方法によって分析すること ができる。用いられた特異的なＣＲＩプローブに対して所望度合の関連性を有す る核酸の検出を確保するために、サザンおよびノーサンハイブリダイゼーション の両方のハイブリダイゼーション条件の厳密さを加減することができる。

ＣＲＩ遺伝子の遺伝子構造を大まかに決定するために制限エンドヌクレアーゼマ ツピングを用いることができる。特定の実施態様に於ては、下記第２図に示す制 限地図を得るために、制限酵素での切断を用いることかできる。制限エンドヌク レアーゼ切断によって得られた制限地図をＤＮＡ配列分析によって確認すること ができる。

当業上知られた任意の方法によってＤＮＡ配列分析を行うことかできる。このよ うな方法にはマキサム（Ｍａｘａｍ）およびギルバー）　（Ｇｉｌｂｅｒｔ）の 方法（１９８０，Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、　６５　：　４９９−５６０）、サンが−のジデオキシ法（Ｓ ａｎｇｅｒ、Ｆ、ら、１９７７、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ 、Ｓ。

Ａ、　７４：５４６３）、または自動化ＤＮＡシークエネーター（例えば、Ａｐ ｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）の使 用か包含されるがそれらに限定されるわけではない。ＣＲ１遺伝子のｃＤＮＡ配 列は、実質的には第１図に示されそして下記６および７項に詳述される配列を包 含する。

５　、４．２．タンパク質分析 ＣＲＩタンパク質のアミノ酸配列をＤＮＡ配列からの推定によるか、またはその 代わりに例えば自動化アミノ酸シークエンサーを用いたタンパク質の直接配列決 定により導くことができる。ＣＲＩタンパク質の代表的なもののアミノ酸配列は 、実質的には第１図に示されそして下記６項に詳述される配列を含有する。

下記に記載されているように、Ｆア℃タイプＣＲＩコード配列の全てはクローン 化され、４１アミノ酸のシグナルペプチドの切断後、成熟レセプターは３０のＳ ＣＲを形成する１９３０基の外部ドメインを包含する１９９８アミノ酸を含む。

３０のＳＣＲのうち２８は、ＬＨＲ−Ａ、　−Ｂ、、　−Ｃおよび−Ｄ　（第１ ０図）、２５アミノ酸の単一膜間ドメイン、および４３アミノ酸の比較的短い細 胞質ドメインを構成する。

多数のＳＣＲを含むＣ３／Ｃ４結合タンパク質中で、ＣＲＩはＬＨＲを構成する ＳＣＲのグループを有することで特有である。ＣＲＩの４つのＬＨＲの比較によ り、それぞれは４種のＳＣＲ，ａ、　ｂ、　ｃおよびｄ種、からなる合成物であ ることが明らかになる（第１９図）。例えば、ＬＨＲ−Ａの５ＣＲ−１および− ２の配列は、ＬＨＲ−８，−Ｃおよび一〇の最初の２つのＳＣＲに対して、それ ぞれ６２％、６２％および５７％だけ同一である。しかしながら、５ＣＲ−３か ら５ＣＲ−７までは単一の位置でのみＬＨＲ−Ｂの対応するＳＣＲとは異なり、 ５ＣＲ−３および−４は、三個所の位置でのみＬＨＲ−Ｃのそれらとは異なる（ 第１０図）。したがって、ＬＨＲ−Ａの“ａ”種ＳＣＲのいくつかもＬＨＲ−Ｂ および−Ｃに存在する。　ＬＨＲ−８の最初の２つのＳＣＲは、ＬＨＲ−Ａのそ れとは異なり、ＬＨＲ−Ｃの対応するＳＣＲと９９％同一であり、その結果ＬＨ Ｒ−Ｂおよび−Ｃは、これらの位置で“ｂ”種ＳＣＲを共育する。ＬＨＲ−Ｃの 第５．６および７　ＳＣＲは、これらの位置でＬＨＲ−Ａおよび−Ｂの“ａ”種 ＳＣＲと７７％だけ同一であり、“Ｃ”種ＳＣＲと考えられている。ＬＨＲ−Ｄ の第１から４までのＳＣＲは比較的特有のものてあり、“ｄ′種であるが、一方 策５から７までのＳＣＲは、ＬＨＲ−Ｃ中に見い出される“Ｃ“種と約９３％同 一である。

ＣＲＩタンパク質配列配列水性分析によってさらに特性決定することができる（ Ｈｏｐｐ、　Ｔ、およびＷｏｏｄｓ、　Ｋ、。

１９８１、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　 ７８：３８２４）。親水性プロフィールは、ＣＲＩタンパク質の疎水性および親 水性領域、およびかかる領域をコードする遺伝子配列の対応する領域の同定に用 いることかできる。ＣＲＩタンパク質のＣ００Ｈ−末端の親水性プロフィールを 第５図に示す。

特異的な二次構造か想定されるＣＲＩの予想領域を同定するために、二次的構造 分析（Ｃｈｏｕ、　Ｐ、およびＦａｓｍａｎ。

Ｇ、、　１９７４．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１３：２２２）を行うことも できる。

他の構造分析法を用いることもできる。これらにはＸ線結晶学（Ｅｎｇｓｔｏｍ 、丸、　１９７４．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ。

１１ニア−１３）およびコンピューターモデリング（Ｆｌｅｔｔｅｒｉｃｋ。

Ｒ１およびＺｏｌｌｅｒ、　Ｍ、（纒）、　１９８６．　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇ ｒａｐｈｉｃｓａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｍｏｄｅｌｉｎｇ、ｉｎ　Ｃｕｒ ｒｅｎｔ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ ｏｇｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒｙ、 　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）か包含されるか それらに限定されるわけてはない。

５．５．ＣＲ１関連誘導体、類似体、およびペプチドＣＲＩに関連する誘導体、 類似体およびペプチドの生産および使用も意図されており、それらは本発明の範 囲内にある。所望の免疫原性または抗原性を有するかかる誘導体、類似体または ペプチドは、例えばイムノアッセイに於いて、免疫化のために、治療上の目的な どに用いることかてきる。例えばＣ３ｂまたはＣ４ｂの結合、補体活性の調節、 または免疫刺激または食作用の促進等のような所望のＣＲＩの性質を保持し、あ るいはまたそれを阻害するかかる分子は、かかる性質のそれぞれインデューサー としてまたはインヒビターとして用いることができる。

本発明のＣＲＩ関連誘導体、類似体およびペプチドは当業上知られた様々な方法 て生産できる。このような生産をもたらす操作は遺伝子またはタンパク質レベル て行うことがてきる。例えば、クローン化ＣＲＩ遺伝子は当業上知られた多数の 任意の方法で修飾することかてきる（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ら、１９８２　 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ ｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）　ａ　ＣＲ１配 列をインビトロで、制限エンドヌクレアーゼを用いて適当な部位で切断し、所望 の場合はさらに酵素的に修飾し、単離し、そして連結することができる（下記８ 項参照）。

ＣＲＩ関連誘導体、類似体、またはペプチドをコードする遺伝子の生産において は、修飾された遺伝子が、所望のＣＲＩ特異的活性をコードする遺伝子領域内に 、翻訳終止シグナルに中断されることなく、ＣＲＩと同じ翻訳の解読枠になるこ とが確保されるよう注意が払われるべきである。特別な実施態様において、融合 タンパク質をコードし、ＣＲＩ配列の部分プラス非ＣＲＩ配列を含んでなる分子 から構成される核酸配列を生成できる。

さらに、ＣＲＩ遺伝子をインビトロまたはインビボで突然変異させて、翻訳、開 始、および／または終止配列を生成させおよび／または破壊するか、あるいはコ ード領域に変化を生成させ、そして／または新たな制限エンドヌクレアーゼ部位 を形成させるかまたは既に存在する部位を破壊させ、さらにインビトロ修飾を促 進することかできる。突然変異誘発のための当業上知られた任意の方法を用いる ことができ、このような方法にはインビトロ特定部位の突然変異誘発（Ｈｕｔｃ ｈｉｎｓｏｎ。

Ｃ１ら、１９７８．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５３：６５５１）、ＴＡＢ （開襟）リンカ−（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の使用、なとが包含されるかそれらに 限定されない。

ＣＲＩ配列の操作はタンパク質レベルでも行うことかできる。多数の化学的修飾 のいずれても既知の技法によって行うことができ、これらには臭化シアン、トリ プシン、キモトリプシン、パハイン、■８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異 的化学的分解ニアセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシン存在下の 代謝的合成；などか包含されるかそれらに限定されない。

さらに、ＣＲＩ関連類似体およびペプチドを化学的に合成することかできる。例 えば、遺伝子発現の所望の機能（例えばＣ３ｂおよび／またはＣ４ｂ結合、免疫 刺激、補体調節、等）を仲介するＣＲＩの一部分に相当するペプチドをＤＮＡシ ンセサイザーを用いて合成することができる。

ＣＲＩのヌクレオチド配列の特別な変更は複数のＬＨＲ−Ｂ配列を育するタンパ ク質をコードする配列を生じる組換えＤＮＡ法によりなされる。かかる結合変更 はＣ３ｂ結合の度合いを変化される。

５．６．ＣＲ１の使用 ５．６．１．アッセイおよび診断 ＣＲＩタンパク質、その類似体、誘導体、およびサブ配列、および抗−ＣＲＩ抗 体は診断に用途を有する。所望のＣＲＩ性質または機能を示す本発明の分子は、 かかる性質または機能をアッセイするために使用できる。

例えば、単独でおよび／または複合体の形でＣ３ｂおよび／またはＣ４ｂの結合 を示すＣＲＩタンパク質またはそのフラグメントは、例えば患者の体液のような 試料中のかかる物質の量を測定するアッセイに使用できる。

詳細な実施態様において、Ｃ３ｂ（例えば下記第■表、９項参照）　、１Ｃ３ｂ またはＣ４ｂ（例えば、第■表参照）と結合する能力を有する細胞表面上に発現 する完全な長さのＣＲＩまたはＣＲＩ欠失変異種（例えば、下記８項に記載され ているもの）は、試料中のそれぞれＣ３ｂ、１ｃ３ｂ、またはＣ４ｂのレベルを 測定するアッセイに使用できる。他の実施態様において、組換えＤＮＡ技術によ り構築された、膜横断配列を欠＜　ＣＲ１タンパク質またはそのフラグメントは 、このように分泌され、使用される。

特別な実施態様において、Ｃ３ｂおよび／またはＣ４ｂのかかる測定は補体機能 の指標として信頼でき、炎症性および免疫系障害の診断に有用である。かかる障 害は、やけとまたは心筋梗塞誘導損傷による組織損傷、成人呼吸困難症候群（シ ョック肺）、リウマチ様関節炎、全身性紅斑性狼癒のような自己免疫障害、およ び望ましくないまたは、不適切な補体機能に関係した他の疾患または障害を含む か、それらに限定されない（例えばＭｉｅｓｃｈｅｒ、　Ｐ、Ａ、およびＭｕｌ ｌｅｒ−Ｅｂｅｒｈａｒｄ。

Ｈ，Ｊ、、（編）、　１９７９．　Ｔｅｘｔ　Ｂｏｏｋ　ｏｆ　ｒｍｍｕｎｏｐ ａｔｈｏｌｏｇｙ。

２ｄ　Ｅｄ、、　Ｖｏｌｓ、　ｒ　ａｎｄ　Ｉｌ、　Ｇｒｕｎｅ　ａｎｄ　５ｔ ｒａｔｔｏｎ、　ＮｅｗＹｏｒｋ；　Ｓａｎｄｂｅｒｇ、　Ａ、Ｌ、、　１９８ １．　ｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓｉｎ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　 ａｎｄ　Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ、Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ、Ｊ、Ｊ、ら、（編） 、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　 ｐ、３７３；Ｃｏｎｒｏｗ、Ｒ，Ｂ、ら、１９８０．　Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｃｈｅ ｍ、　２３：２４２；　Ｒｅｇａｌ。

Ｊ、　Ｆ、およびＰｉｃｋｅｒｉｎｇ、　Ｒ，Ｈ，、１９８３，Ｉｎｔ、　Ｊ、 ［ｍｍｕｎｏ−ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　５ニア１；　Ｊａｃｏｂｓ、　Ｈ，Ｓ、 、　１９８０．　Ａｒｃｈ、　Ｐａｔｈｏｌ。

Ｌａｂ、　１０４：６１７を参照）。

エピトープを含むＣＲＩタンパク質およびそのフラグメントはイムノアッセイを 含むかそれに限定されないアッセイに用途を育する。使用できるイムノアッセイ には、少数例をあげれば、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（エンザイムリン クトイムノソルベントアッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、沈降反応 、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、イ ムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロティンＡイムノアッ セイ、および免疫電気泳動アッセイ、のような技法を用いる競合および非競合ア ッセイ系か包含されるがそれらに限定されない。

ＣＲＩ遺伝子および、関連核酸配列およびサブ配列はハイブリダイゼーションア ッセイに用いることができる。かかるハイブリダイゼーションアッセイは、ＣＲ １発現に関連した炎症または免疫反応を監視するため、ＣＲ１発現の変化に関連 した特定の疾患状態を診断するため、患者のＣＲＩアロタイプを決定するため、 そしてＣＲＩ遺伝子および関連した遺伝子（例えばＣＲ２）の存在および／また は発現を検出するために使用することかできる。

本発明において用いられるアッセイを実行するためのキットもまた提供される。

５．６．２．治　療 ＣＲＩタンパク質およびフラグメント、誘導体、およびそれの類似体はＣＲＩに より介在された機能の調節をするのに治療上有用である。かかる機能は、単独で または複合体の形てＣ３ｂおよび／またはＣ４ｂの結合、食作用の促進、補体調 節、免疫刺激、等を含むがそれらに限定されない。本発明のＣＲＩタンパク質お よび関連分子の作用をおよぼす役員は、免疫または炎症性障害のような、かかる 機能に関連した多くの疾患または障害に治療上の価値を有する（例えば、上記５ ．６．１項に記載されている障害）。例えば、所望の機能を示す完全な長さのＣ ＲＩまたはそのフラグメントおよび関連した分子は補体構成物Ｃ３ｂまたはＣ４ ｂの不可逆的不活性化を促進するファクターエコーファクターとして作用するそ の能力により（Ｆｅａｒｏｎ、　Ｄ、Ｔ、、　１９７９．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７６：５８６７；　ｌ１ｄａ、　Ｋ、お よびＮｕｓｓｅｎ−ｚｗｅｉｇ、　Ｖ、、　１９８１．　Ｊ、　ＥＸＩ）、　Ｍ ｅｄ、　１５３：１１３８）および／または副経路または主経路のＣ３またはＣ ５コンパ−チーズを阻止する能力により補体の阻止に治療上の用途を育する。

本発明の詳細な実施態様において、膜横断領域を欠き（例えば、大部分のＣ末端 ＳＣＲによりコードされたアルギニンからカルボキシ末端の欠失により）可溶性 ＣＲＩフラグメントの産生を生じるＣＲ１分子をコードさせるために発現ベクタ ーを構築できる。ひとつの実施態様において、かかるフラグメントは、単独でま たは複合体の形てＣ３ｂおよび／またはＣ４ｂと結合する能力を保持することが できる。特別な実施態様において、かかる可溶性ＣＲＩタンパク質はファクター エコーファクター機能を、もはや示さない。可溶性ＣＲＩ産物は患者にインビボ で投与し、可溶性ＣＲＩは、本来備わっている細胞表土のＣＲＩに対するＣ３ｂ および／またはＣ４ｂの結合競争に勝り、したがって細胞表面ＣＲＩファクター Ｉコーファクター機能を阻止し補体機能を増大する。

Ｃ３ｂか粒子および可溶性免疫複合体に共存的に付着した後、タンパク質分解プ ロセシングされて１Ｃ３ｂおよびＣ３ｄｇになるＣ３ｂの不活性化は２つの生物 学的結果を有する。すなわち増幅経路を経由して補体組織の過度の活性を防ぐこ と、およびＣＲＩ以外のレセプターと結びつくリガンドの形成である。１Ｃ３ｂ フラグメントはＢ因子に結合できないので、この状態への転換は副経路増幅回路 経由の追随的補体活性を阻止する。しかしながら、１ｃ３ｂは、骨髄性単核球細 胞による食作用を介在する２つの補体レセプターである、ＣＲＩおよびＣＲ３に より結合しつる。したがって、Ｃ３ｂから１Ｃ３ｂへの転換の主要な生物学的帰 結は、Ｃ３でおおわれた複合体のＣＲ１−およびＣＲ３介在のクリアランスを妨 げることなく補体活性を中止する。対照的に１Ｃ３ｂからＣ３ｄｇへの追随的転 換は、ＣＲ２とだけ相互作用するがＣＲＩおよびＣＲ３とは相互作用しないフラ グメントを創る。この状況は、Ｂ　ＩＪンパ細胞、濾胞性樹状細胞および、おそ ら（真皮の上皮細胞を包含するＣＲ２を発現する細胞型に対するＣ３ｄｇ担持複 合体の補体依存結合を制限し、食作用細胞種との相互作用を減少させるかまたは 遮断する。細胞的かかわりあいの変化したパターンの生物学的帰結は、粒子およ び複合体のクリアランスおよび分解にかかわる細胞よりもむしろ免疫反応の導入 期にかかわる細胞に対するＣ３ｄｇ担持複合体の標的であろう。したかって、Ｃ Ｒ１分子はクリアランス過程に影響を与えるのみならず、抗原提示および抗体産 出に関与するＣＲ２担持細胞種にも治療上使用できる。

他の実施態様において、Ｃ３ｂまたはＣ４ｂに結合し、および／または、副経路 または主経路のＣ３またはＣ５コンパ−チーズを阻止する能力を保持する、また はファクター■−コーファクターを保持するＣＲＩタンパク質またはそのフラグ メントは補体不活性化を促進するのに使用できる。かかる実施態様において、Ｃ ＲＩタンパク質またはフラグメントは望ましくないまたは不適当な補体機能に関 係する障害の治療に価値がある（例えば、ショック肺、やけどまたは２血性心臓 異常による組織損傷、自己免疫障害、炎症性疾患等）。

下記ｌｌ−１４項の実施例に詳記した特別の実施態様において、例えばインビト ロにおいて主経路の補体介在溶血反応、主経路Ｃ５ａ産生、主経路Ｃ３ａ産生ま たは好中球酸化的破裂を阻止する能力により示されるように所望の機能的活性を 保持する可溶性ＣＲ１分子は発現する。

特別の実施態様において、かかる可溶性ＣＲ１分子は、炎症およびその有害な作 用な減少するために、または心筋性梗塞の大きさを減少するために、または再潅 流損傷を防ぐ等のために、使用できる。インビボでの治療に有用な、かかるＣＲ １分子は逆受身アルサス反応（１４，１項参照）およびラット心筋性梗塞モデル （１４゜３項参照）を含むがそれらに限定されない当業上知られる種々のモデル 系で検定される。

本発明のもうひとつの実施態様において、所望のＣＲ１性質または機能を阻止す ることを示すＣＲＩのフラグメントまたは類似体またはその誘導体は、その機能 に関連する疾患または障害を防ぐのにまたは治療するのに使用できる。

種々の放出系か知られており、そしてそれらをＣＲＩ及び関連分子の放出に使用 することかできる。例えばリポソーム内カプセル化、遺伝子療法における造血幹 細胞子細胞による発現なと。導入のための他の方法には、皮肉、筋肉内、腹腔内 、静脈内、皮下および鼻内および経口経路が包含されるがそれらに限定されない 。

本発明はまた医薬組成物を提供する。かかる組成物はＣＲＩタンパク質、または 類似物、誘導体、またはそれらのフラグメントおよび医薬上許容される担体の治 療上効果的な量を含んで成る。かかる担体は食塩水、緩衝食塩水、デキストロー ズおよび水を包含するがそれらに限定されない。

５　、６．３．結合療法 さらにつけ加えられた面においては、人および動物の血栓症状、特に急性心筋梗 塞を治療する方法か提供される。その方法は必要としている人や動物に本発明に 従い可溶性ＣＲＩタンパク質の効果的な量および血栓溶解剤の効果的な量を投与 することを含んでなる。

本発明はまた人および動物の血栓症状の治療のために薬剤製造における可溶性Ｃ ＲＩタンパク質および血栓溶解剤の用途を提供する。

上の方法において、化合物は例えば注入や濃縮塊注射によりどんな便利な経路か らでも投与てきるし、逐次的にまたは一度に投与できる。本発明の可溶性タンパ ク質および血栓溶解剤を逐次的に投与する場合、可溶性ＣＲＩタンパク質は血栓 溶解剤の前または後いずれか一方に投与できる。可溶性ＣＲＩタンパク質および 血栓溶解剤を共に投与した場合、それらは両剤を含んで成る医薬組成物の形態で 与えられることか好ましい。

したかって本発明のさらにつけ加えられた面において医薬的に許容される担体と 共に可溶性ＣＲＩタンパク質および血栓溶解剤を含んでなる医薬組成物か提供さ れる。

好ましい実施態様において、組成物は人に静脈投与するのに適した医薬組成物と してふつうの方法に従い処方される。

通常、静脈投与用組成物は滅菌等張性水性緩衝液の溶液である。必要な場合、組 成物は、また可溶性剤および注射の部位の痛みをやわらげるためのりグノカイン のような局所麻酔薬をも包含する。一般に、成分は、例えば活性単位中の活性剤 量を示すアンプルまたはサシエッチ（ｓａｃｈｅｔｔｅ）のような密閉状にシー ルした容器に乾燥凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、単位用量形態 で別々にまたは混合して供給される二とになる。組成物が注入により投与される 場合、それは滅菌医藁等級の“注入用水”または食塩水を含有する注入ボトルに 調剤される。組成物が注射により投与される場合、注射用の滅菌水または食塩水 のアンプルか提供され、成分は投与前に混合される。医薬組成物の１またはそれ 以上の成分を詰めた１またはそれ以上の容器を含んで成る医薬バックもまた本発 明の範囲内にある。

投与される物質の量および血栓溶解剤のＣＲＩタンパク質に対する割合は血栓塞 栓症状の重大さおよび凝血の位置およびサイズに依ることになる。使用される正 確な用量および投与の様式は、いやおうなしに病みの本質を考慮に入れて、治療 を管理している医師により状況に応じて決定されねばならない。しかしながら、 一般に血栓て治療されている患者は血栓溶解剤の標準用量当り補体阻害剤（可溶 性ＣＲＩ構成物）　０．５−５０ｍｇの用量を一般に取ることになる。

上記の結合療法で用いられる特別な血栓溶解剤はプラスミノーゲ・／アクチベー ターを包含する線維製溶解酵素である。

プラスミノーゲンアクチベーターの用語はストレプトキナーゼ、ヒト組織プラス ミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）およびウロキナーゼ（ｕ−ＰＡ）　（単 一および２鎖形態両方）を包含するがそれらに限定されない。かかる酵素は自然 源または組織からまたは細菌、イースト、真菌、または動物細胞のような異種宿 主生物がその酵素に特定する遺伝子を発現する組換えＤＮＡ法により得られる。

その用語はまた （ａｌ　ハイブリッドタンパク質か除去可能なブロック基て場合によりブロック される線維製溶解活性に必須の触媒部位を有するようにハイブリッドタンパク質 の鎖の少なくとも１本か線維製溶解活性プロテアーゼ由来である、異なる２本鎖 プロテアーゼの１鎖に結合された２本鎖プロテアーゼの１鎖を含んでなる線維素 溶解活性ハイブリッドタンパク質を開示しているＥＰ　（ヨーロッパ特許公報） 　−Ａ−０１５５３８７およびＥＰ−Ａ−０２９７８８２に開示されているタン パク質、 （ｂｌ　ＥＰ−Ａ−０１５２７３６に開示された可逆性ブロックプラズミンと結 合したウロキナーゼのようなタンパク質コンジュゲート、 ｆＣｌ　線維製溶解活性を果す酵素の触媒部位が、例えばヒトブラズミンの活性 中心と可逆的に結合しているウロキナーゼのような可逆的結合基により、それに 付着したヒトタンパク質によりブロックされているＥＰ−Ａ−０１５５３８８に 開示された線維製溶解酵素の誘導体、（ｄｌ　ＥＰ−Ａ−０１８３５０３に開示 されている可逆的結合基により水可溶性ポリマーと結合した線維製溶解酵素を含 んでなるコンジュゲート、および （ｅ）　ｄｅＳ（ＣＹＳｓ＋−ａｓｌ）＊ｙ）ｔ−ＰＡのようにＢＰ−Ａ−０２ ０１１５３゜ＥＰ−Ａ−０２０７５８９，ＷＯ（ＰＣＴ公報）−８６０４３５１ ，ＥＰ−００４１７６６゜ＥＰ−０２１３７９４，ＢＰ−０１９９５７４，ＥＰ −Ａ−０２４０３３４，ＥＰ−Ａ−０２４１２０８、ＥＰ−Ａ−０２４１２０９ ，ＥＰ−Ａ−０２４１２１０，ＥＰ−Ａ−０２３３０１３，ＥＰ−Ａ−２９０１ １８，ＥＰ−Ａ−２９２３２６，ＢＰ−Ａ−０２１３７９４，ＥＰ−Ａ−０２３ １８８３、ＷＯ８７０４７２２，ＥＰ−Ａ−０２４２８３６，ＥＰ−Ａ−０２３ ４０５１，ＥＰ−Ａ−０２５３５８２，ＢＰ−Ａ−０２５３２４１，ＷＯ−８６ ０４３５１，ＥＰ−Ａ−０２３６０４０゜ＥＰ−Ａ−０２００４５１，ＥＰ−Ａ −０２３８３０４，ＢＰ−Ａ−０２２５２８６，ＤＥ（西ドイツ公報）−３５３ ７１７６、ＥＰ−Ａ−０２３６２８９，ＷＯ−８６０１５３８゜ＥＰ−０２２７ ４６２，ＡＵ（オーストラリア公報）−８６６１８０４，ＷＯ−８７０３９０６ およびＥＰ−０１９９５７４に開示された自然に存在するプラスミノーゲンアク チベーターのミューティン（ｍｕｔｅｉｎｓ）を包含する遺伝子操作された誘導 体、を包含する。

本発明の特別な面において、プラスミノーゲンアクチベーターは、ｔ−ＰＡの２ ７５および２７６残基とシスティン残基２６４間のｔ−ＰＡ切断部位またはｕ− ＰＡの１５８および１５９残基とシスティン残基１４８間のｕ−ＰＡ切断部位、 それぞれを含んでなるアミノ酸配列を介してｔ−ＰＡまたはｕ−ＰＡのβ鎖と結 合したプラスミノーゲンの５個のクリングルドメインを含んでなる、ＥＰ−Ａ− ０２９７８８２に記載されているハイブリッド分子である。

かかるハイブリッドの例は、１および２鎖変異種、１ｙＳ７ｓおよびｇｌｕ＋変 異種、およびその混合物を包含するプラスミノーゲン１−５４４／１−ＰＡ　２ ６２−５２７．１および２鎖変異種、１ｙＳｙｓおよびｇｌｕ、変異種、および その混合物を包含するプラスミノーゲン１−５４４／１−ＰＡ　２６２−５２７ 　（ａｒｇｚ７ｓ　ｇｉｎ）■および２Ｍ変異種、１ｙＳ７．およびｇｌｕ＋変 異種、およびその混合物を包含するプラスミノーゲン１−５４１／１−ＰＡ　２ ６２−５２７ １および２ｍ変異種、ｇｌｙ−ｚ、Ｓｅｎ　＋およびｖａＬ変異種、およびその 混合物を包含するｔ−ＰＡ　１−５０／１−ＰＡ　８８−９１／ｐｒｏ−ｇｌｙ −ｓｅｒ／プラスミノーゲン８４−５４４／１−ＰＡ　２６２−５２７１および ２鎖変異種、ｇｌｙ−ｓ、Ｓｅｒ　＋およびｖａｉ４変異種、およびその混合物 を包含する、ｔ−ＰＡ　１−９１／ｐｒｏ−ｇｌｙ−ｓｅｒ／プラスミノーゲン ８４−５４４／１−ＰＡ　２６２−５２７または １および２Ｍ変異種、ＩＹＳ７１およびｇｌｕ、変異種、およびその混合物を包 含する、プラスミノーゲンｌ−５４６／ｕ−ＰＡ　１３７−４１１を包含する。

好ましい実施態様において、結合療法において使用される血栓溶解剤はＵ、　Ｓ 、特許Ｎｏ、　４．２８５．９３２のＳｍ１ｔｈに示された意味を有するインビ ボ線維製溶解酵素を可逆的にブロックする。すなわち線維製溶解活性に必須の触 媒部位は、加水分解の偽似−次速度定数が等張水性培地中吐７．４．３７°Ｃで １０””５ｅｅ−’　−１０−’５ｅｃ−’の範囲にあるような速度で加水分解 により除去しうる基によりブロックされるインビボ線維製溶解酵素。

線維製溶解酵素かｔ−ＰＡまたはウロキナーゼのセリンプロテアーゼドメインを 含んで成るプラスミノーゲンアクチベーターである場合、取り除き可能なブロッ ク基の例は、ハロゲン原子で置換されさらに１またはそれ以上の弱電子永別また は電子供与基で光学的に置換された、３または４位置にある２−アミノベンゾイ ル基であり、そこにおいて誘導体の加水分解の偽似−次速度定数が、０．０５Ｍ リン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、約１３００の分子量を有するポリ オキシエチレンソルビタンモノオレエートを含んで成る０、０１％Ｖ／Ｖ洗剤か ら成る緩衝液系中、ｐＨ７，４，３７°Ｃで測定した場合６．　ＯＸＩＯ”−４ ，ＯＸｌ０−’５ｅｅ−’の範囲である。

好ましくは、可逆的にブロックされるインビボ線維系溶解酵素はストレプトキナ ーゼとプラスミノーゲンの２成分複合体、最も好ましくは商標ＥＭＩＮＡＳＥ（ 商品名アニストレブラーゼ（ａｎｉｓｔｒｅｐｌａｓｅ）以後ＡＰＳＡＣと称す る。すなわちアニフィル化ヒトプラスミノーゲンーストレプトキナーゼーアクチ ベーター複合体。例えばＪ、　Ｐ、　Ｍｏｎｋ　ａｎｄ　Ｒ，Ｃ，Ｈｅｅｌ、　 １９８７．　Ｄｒｕｇｓ　３４：２５−４９を参照）でＢｅｅｃｈａｍ　Ｇｒｏ ｕｐ　ｐｌｃにより市場に出さレテいるＵ、　Ｓ、特許Ｎｏ、　４．８０８．４ ０５に記載された内部結合切断のないｐ−アニソイルストレプトキナーゼ／プラ スミノーゲン複合体である。

好ましい面において、結合療法で用いられる可溶性ＣＲＩ構成物ハｐＢｓｃＲ１ ｃ、　ｐＢｓｃＲｌｓ、　ｐＢＭ−ＣＲｌｃ、　ｐＢｓｃＲＩｃ／ｐ’ｒｃｓｇ ｐｔおよびｐＢｓｃＲ１ｓ／ＰＴＣ３ｇｐｔがら成るグループから選択される核 酸ベクターによりコードされ上記のｐＢＳＣＲ１ｃ／ｐＴＣ３ｇｐｔから特別に 調製されたものである（１２項参照）。

（本頁以下余白） 結合療法で用いられる特別の血栓溶解物は下記の様である（用量の例および投与 方法）。

ストレプトキナーゼ　１．０−３．０　メガ単位　３０分−３時間かけてＡＰＳ ＡＣ３０単位　２−５分注射 ｔ−ＰＡ　（野生型’）　５０−１５０　ｍｇ　注入６時間まで２　Ｗｉ　４０ −１００　ｍｇ　注入６時間までウロキナーゼ　（３−１２メガ単位） １　鎖３０−１００　ｍｇ　注入５時間までウロキナーゼ へイブリ１ド　プラスミノーゲン　２０−１００　ｍｇ　注射または注入アクチ ベーターおよび了ンル 誘導体（例えばＥＰ −Ａ−０１５５３８７にある ような） プラスミノーゲン　１０−１００　ｍｇ　注射または注入アクチベークーのミコ ーティン （伊以ばＥＰ−Ａ〜０２０７ ５８９にあるような） （本頁以下余白） ６、実施例：ヒトＣ３ｂ／Ｃ４ｂレセプター（ＣＲＩ）のクローニングおよび配 列決定 ここで詳述する実施例に於て、５゜５キロベースペア（Ｋｂ）のＣＲＩコード領 域のクローニングおよびヌクレオチド配列を説明する（Ｋｌｉｃｋｓｔｅｉｎ、 　Ｌ、Ｂ、ら、１９８７．　Ｊ。

ＥＸＩ）、　、Ｍｅｄ、　１６５：１０９５−１１１２）。

５、５　Ｋｂの範囲にわたる１０個の重なりあったＣＦ？１　ｃＤＮＡクローン を扁桃腺のライブラリーから単離し、全体または一部を配列決定した。それらの クローンの５′末端に始まり４．７ｋｂ下流の終止コドンまで続く単一の長い読 みとり枠を同定した。ＣＲＩのＦアロタイプのコード配列について算出された６ ｋｂの８０％に当たる。３個の縦列で、同方向で、長い、４５０アミノ酸からな る相同反復（ＬＨＲ）を同定した。トリプシンペプチドの配列分析によって、Ｃ Ｒ１のＦアロタイプにおいて第４のＬＨＲの存在が証明された。ＬＨＲ間のアミ ノ酸同一性は第１と第３反復の間での７０％から、第１と第２反復のＮＨ２−末 端２５０アミノ酸の間での９９％までの範囲であった。

各々のＬｌ（１？は６０−７０アミノ酸からなる７個の短いコンセンサス反復（ ＳＣＲ）を含んでなり、これらは例えば相補的レセプタータイプ２、ファクター ＢおよびＨ，Ｃ４結合タンパク質、およびＣ２のような他のＣ３／Ｃ４結合タン パク質の５ＣＦ７と類似する。さらに別の２個のＳＣＲがＬＨＲを２５アミノ酸 からなる単一の膜結合ドメインに結合する。したかってＣＲＩのＦアロタイプは おそらく少なくとも３０個のＳＣＲを含有し、そのうち２３個は既に配列決定さ れている。各ＳＣＲは三重ループ構造を形成すると予想され、この構造に於て、 ４個の保存された％−シスチンかジスルフィド結合を形成する。半開構造として 一列にならぶ３０個のＳＣＲは原形質膜がら１．Ｉ４Ｑオングストロームにおよ び、免疫複合体と微生物細胞壁の間の空隙に位置するＣＩ？ＩとＣ３ｂおよびＣ ４ｂとの相互作用を容易にすることができよう。４３残基からなるＣｏｏｌ（末 端細胞質ドメインは、６アミノ酸の配列を含有し、これはプロティンキナーゼＣ によってリン酸化される表皮成長因子レセプターに於ける配列と相同である。

６．１．材料および方法 ６．１．１．　ＣＲＩ　トリプシンペプチドの単離および配列洗浄したヒト赤血 球膜から、マトリックスレッドＡおよびＹ２−１モノクローナル抗体アフィニテ ィークロマトグラフィーを続けて行うことによってＣＲＩを精製した（Ｗｏｎｇ 、　Ｗ、Ｗ、ら、１９８５．　Ｊ、ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　８２： ３０３）。（Ｗｏｎｇ、Ｗ、Ｗ、ら、１９８５．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、　８２ニア７１１）に記載のように、グラジェントおよびイソクラ チックの逆相１（ＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）を連続して行うこと によって、トリプシンペプチドを調製し、単離した。４７０Ａタンパク質シーク エンサー　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ、、Ｆｏｓｔｅｒ 　Ｃ１ｔｙ。

ＣＡ）を用いてトリプシンペプチド分析を行い、各分解サイクルの分析は１２０ ＰＴＨ−アミノ酸分析計（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、） を用いて行われた。

６．１．２．　ｃＤＮＡクローンおよびゲノムクローンの単離記載（Ｗｏｎｇ、 　Ｗ、Ｗ、ら、１９８５．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、　８２ニア７１１）のようにして、ヒト扁桃腺ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ からλｇｔｌｌにｃＤＮＡライブラリーを構築した。ＲＮＡプロットハイブリッ ド形成よって、扁桃腺ドナーはＣＲ１のＦ対立遺伝子間してホモ接合性であった （同上）。

クローニング段階の前に、２から７Ｋｂの間の断片を包含するｃＤＮＡをアガロ ースゲル上で選択した。このライブラリーの最初の組換え率は、１１００ｎ　ｃ ＤＮＡ当り４．５×１０６組換え体であり、このライブラリーをエシエリヒア・ コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｙ１０８８株て増幅した。

ライブラリーをＣＲＩプローブ、ＣＲ１−１（ＡＴＣＣ番号５７３３０（ＣＲ１ −１プラスミド含有Ｅ、コリ、５７３３１（精製ＣＲＩ−ＩＤＮＡ））およびＣ Ｒ１−２（Ｗｏｎｇ、　Ｗ、Ｗ、ら、１９８５．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８２：　７７１１）を用いてスクリーニン グした（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ら、　１９８２．　Ｍｏ１ｅ−ｃｕｌａｒ　 Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓ ｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂ。

ｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ ）　ｏ　これらのプローブはニックトランスレーションにより比活性２−８　ｘ 　１０”ｃｐｍ／μｇに予め放射性標識された。５０％ホルムアミド、５　Ｘ５ ＳＣ（Ｉ　Ｘ５ＳＣ：　１５ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウ ム）中で、４３°Ｃで、ハイブリッド形成を行い、フィルターを６０°Ｃで、Ｃ Ｒ２ｃＤＮＡクローンが検出されない条件である０、２ＸＳＳＣて洗浄した（Ｗ ｅｉｓ、Ｊ、Ｊ、ら、１９８６．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ 、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８３　：　５６３９）。陽性クローンを２回プラーク精製し た後、制限地図作成およびＤＮＡ配列分析を行った。

ヒト白血球ＤＮＡの５ａｕ３ＡＩ部分消化によって生じた１５−２０ｋｂフラグ メントを用いてゲノムライブラリーをＥＭＢＬ−３に構築した。最初の組換え率 は１．２Ｘ１０”であり、ライブラリーをＥ、コリＰ２３９２中で増幅させた。

このライブラリーもｃＤＮＡプローブＣＲ１−１およびＣＲ１−２を用いてスク リーニングした（Ｗｏｎｇ、　Ｗ、Ｗ、ら、１９８５．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８２：　７７１１）。

６．１．３．　ＤＮＡ配列分析 ｃＤＮＡクローンの制限断片をＭ１３ｍｐ１８またはＭ１３ｍｐ１９にサブクロ ーニングし、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法（Ｓａｎｇｅ ｒ、　Ｆ、ら、１９７７、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７４：５４６３）によって 配列決定した。一部のクローンはエキソヌクレアーゼ■を用いて最初に作成され た定序欠失変異体によって、全体または部分的に配列決定された（Ｈｅｎｉｋｏ ｆｆ、　Ｓ、、　１９８４゜Ｇｅｎｅ　２８：３５１）。各領域は二本鎖で配列 決定され、はとんとの場合、各領域は２個の相互に無関係に単離されたｃＤＮＡ クローンから構築されたＭ１３サブクローンで配列決定された（第２図）。Ｗｉ ｓｃｏｎｓｉｎ大学遺伝コンピューターグループパッケージ（Ｍａｄｉｓｏｎ、 　ＷＴ）を用いて配列データを分析した。

６．２．結　果 ６．２．１．　ＣＲＩ遺伝子のヌクレオチド配列分子量で選択した扁桃腺ｃＤＮ Ａライブラリーを、ＣＲＩｃＤＮＡクローン、λＴ８から得られたＣＲ１−１お よびＣＲｌ　−２プローブを用いてスクリーニングした（Ｗｏｎｇ、　Ｗ、Ｗ、 　ラ、１９８５、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、 Ａ、　８２：　７７１１）。

１５個の陽性ファージを１．５Ｘ１０’の組換え体から同定し、そのうち１３個 は異なるクローンに相当する。１０個は制限地図を作成し、ジデオキシチェイン ターミネーション法によって全体、または一部を配列決定した。

同一配列の重なり合いに基づいてｃＤＮＡクローンを整列させ（第２図）、５． ５ｋｂに及ぶことを見いだした（第３図）。ｃＤＮＡクローンの５°末端に始ま り終止コドンの４．７ｋｂ下流にいたる単一の長い読みとり枠を同定した。この ライブラリーに於けるＣＲＩに関するコード配列は、非グリコジル化レセプター の推定分子量２２０．０００ダルトンに基づいて６ｋｂであると予想される（Ｗ ｏｎｇ。

Ｗ、　Ｗ、ら、　１９８３．　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　７２：６８５ ）。したかって、これらのクローンは推定コード配列の約８０％をカバーする。

クローンＴ４９．　ｌ及びＴ５５．１は、その５°末端にコード配列を含有する 。このことはさらに他の５′コードおよび非コード配列か同定されずに残ってい ることを示す。

３°領域に於て、重なり部分のあるクローン、Ｔ８，２、Ｔ４３．１およびＴａ ２．１は、各クローンの同一配列によってコードされる膜貫通および細胞質領域 を含有する。最も３°側に広がるクローンＴ８．２はポリ（Ａ）配列を持たない ８０７ｂｐの非翻訳領域を含有する。クローンＴ６．１およびＴ５５．　ｌに見 いだされた配列と比較して、クローンＴ８．３はヌクレオチド１．４０６−１． ４９７の９１ｂｐの欠失を有し、クローンＴ４０．１はヌクレオチド１．４９８ −１．５０７の９ｂｐの欠失を有する。これらの欠失は、５′スプライス部位と 相同な配列を有する領域に生じたが、このような欠失はｍＲＮＡに於けるスプラ イシングエラーを意味するのかもしれない。クローンＴ４９．１およびＴ５５． １は読みとり枠フレームのヌクレオチド１４７と１４８の間に１１０ｂｐの挿入 を有する（第３図）。この配列は、扁桃腺ポリ（Ａ）”　ＲＮＡのプロットに対 してハイブリッド形成しなかったこと、５゛スプライス位を有すること（Ｂｒｅ ａｔｈｎａｃｈ、Ｒ，ら、１９７８．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、Ｌｌ、Ｓ、Ａ、　７５　：　４８５３Ｘ第３図）、ＣＲＩゲノムクローンに 於てｃＤＮＡ配列に隣接すること、およびその読み枠がシフトしていることから 、イントロンの一部分であると判定される。クローンＴ９．４は、扁桃腺ポリ（ Ａ）”　ＲＮＡのブロツクに対してハイブリッド形成しない０．８８ｋｂの介在 配列を３°末端に有する。

６．２．２．　ＣＲＩのヌクレオチドおよびアミノ酸配列分析ＣＲＩのヌクレオ チド配列のドツトマトリクス分析（第３図）は２タイプの内部相同性を示したく 第４図）。

第１のタイプの内部相同性は、太く切れ目のない線で表され、これは３個の縦列 で、同一方向で、相同性の高い１．３５ｋｂの反復を示す。これらのヌクレオチ ド配列はＣＲＩの長い相同反復配列（ＬＨＲ）をコードする。第２のタイプの反 復は点線の平行線によって表され、これは相同性の比較的低い領域を示す。この ような配列は１９０−２１０ヌクレオチド毎に現われ、ＣＲＩの短いコンセンサ ス反復配列をコードする。

ｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列を第５図に示す。ＬＨＲ−Ｂ、　ＬＨ Ｒ−ＣおよびＬＨＲ−Ｄと命名された３個のＬＨＲを並べてそれらの相同性を明 示する。ＬＨＲ−Ｂは残基１から残基４３８まてであり、ＬＨＲ−Ｃは残基４３ ９−８９１に相当し、　ＬＨＲ−Ｄは残基８９２から１，３４１におよぶ。ＬＨ Ｒ−Ｃの４５１−６９４残基は、　ＬＨＲ−Ｂの残基１−２４４と９９％同一で あるか、ＬＨＲ−Ｄの対応する残基とはわずかに６１９３同一である。対照的に 、ＬＨＲ−Ｃの残基６９５−８９１はＬＨＲ−Ｄの残基１．１４８−１．３４１ と９１％同一であるが、ＬＨＲ−Ｂの対応する領域とはわずかに７６％同一であ る。したかってＬＨＲ−Ｃは、ＬＨＲ−Ｂの前半およびＬＨＲ−Ｄの後半にきわ めて相同な配列を含んでなるハイブリッドであると思われる。ＬＨＲに続いて反 復のない二つのＳＣＲかあり、２５残基の疎水性セグメントおよびそのＳＣＲに 対して配列相同性を持たない４３アミノ酸のＣ００Ｈ−末端領域である（第５図 ）。

５°１．３ｋｂのＣＲＩコード配列は第４のＬＨＲ，ＬＨＲ−Ａに相当する（上 記第１図および下記第７項参照）。この結論は、赤血球ＣＲＩのトリプシンペプ チドの分析によって支持された。１０個のトリプシンペプチドはｃＤＮＡクロー ン由来のアミノ酸配列と同一の配列を有する（第１表）。

（本質以下余白） 第工表 得られたアミノ酸配列中に見出されたＣＲＩ４９−−−−−−−−−−−−ＩＦ Ｃ−ＮＰ−ＡＩＬ　８０５−８２６．１．２５８−１、２７９ ３５　ＣＱＡＬＮＫＷＥＰＥＬＰＳＣ３Ｒ２２８−２４３，６７８−６９３４１ ｃ　ＤＫＤＮＦＳＰＧＱＥＶＦＹＳＣＥＰＧＹＤＬＲ２６０−２８１３４１）Ａ Ｖ−ＹＴＣＤＰＨＰＤＲＧＴＳＦＤＬＩＧＥＳＴＩＲ３９３−４１７４４ｄ　Ｖ ＣＱＰＰＰＥＩＬＨＧ　６９４−７０４．１，１４７−１．１５７ ５４ｄ　ＶＦＥＬＶＧＥＰＳＩＹＣＴＳＮＤＤＱＶＧＩＷＳＧＰＡＰＱ　１５２ −１７９．６０２−６２９５７ｂ　ＹＥＣＲＰＥＹＹＧＲＰＦＳ　１９−３１． ４６９−４８１３９ｂ　ＬＩＧＨ３ＳＡＥＣＩＬＳＧＮＡＡ　８５−１００零得 られたアミノ酸配列内に見いだされたヒト赤血球ＣＲＩ由来のトリプシンペプチ ド。右側の番号範囲は、得られたアミノ酸配列に於けるそのペプチドの位置を示 す。ペプチド６６．２８および４９にある各々のダッシュは、多数の残基かその サイクルで同定されたことを示す。ペプチド３４ｂのダッシュは、そのサイクル て残基か同定されなかったことを示す。

各ＬＨＲは７個の６０−７０アミノ酸ＳＣＲを含んでなり、これらのＳＣＲはＣ ３およびＣ４結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）群を特徴付ける（第６Ａ図）。ＣＲＩ の２３のＳＣＲ間の最大の相同性は、整列にスペースを導入することによって観 察された（第６Ａ図）。各反復配列に於ける平均６５残基のうち２９が保存され ている。すべてのＳＣＲに存在する６個の残基がある。４個の％シスチン（これ らは比較的類似した位置にあり、このことはこれらの各々が不可欠なジスルフィ ド結合に関係する可能性を示唆する）。

およびトリプトファン、および第２の％シスチンの後の第２のグリシン（第６Ａ 図）。変化しない各シスチンの間の配列をＣｈｏｕおよびＦａｓ＋ｎａｎの算法 （Ｃｈｏｕ、　Ｐ、Ｙ。

およびＦａｓｍａｎ、　Ｇ、Ｄ、、　１９７４．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　 １３：２２２）を用いて二次構造分析することによって、β−ターン形成の可能 性か高く、α−へリックス形成の可能性は低いことか予想された。二つのＣＲＩ ゲノムクローン、２．３８（第６Ｂ図）および２．４６の配列分析は、５ＣＲ− １４（第６Ａ図）が単一のエキソンによってコードされること、および５ＣＲ− ２３のＣ００Ｈ−末端がエキソンの末端に対応することを示す。したかって、フ ァクターＢ（Ｃａｍｐｂｅｌｌ、　Ｒ，Ｄ、およびＢｅｎｔｌｅｙ、　Ｄ、Ｒ， ，１９８５，ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｒｅｖ、　８７：１９）や［Ｌ−２−Ｒ（Ｌｅｏｎａｒｄ、　Ｗ、Ｊ、ら、１９ ８５．　５ｃｉｅｎｃｅ２３０：６３３）のＳＣＲについて示されたように別々 のエキソンかＣＲＩのＳＣＲをコードする可能性かある。

ＣＲＪのＳＣＲのコンセンサス配列をこのような特徴的構造を育する一群の別の メンバーのＳＣＲと比較する（第７図）。これらのメンバーはＣ３／Ｃ４結合機 能を有するタンパク質、すなわちＣＲ２（Ｗｅｉｓ、　Ｊ、　Ｊ、ら、１９８６ ．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８３　： 　５６３９）　、Ｃ４ｂｐ（Ｃｈｕｎｇ、　Ｌ、Ｐ、ら、１９８５．　Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、　Ｊ、　２３０：１３３）、ファクター　Ｈ（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ、 Ｔ、　ら、　１９８６．　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３６：３４０７）、ファクタ ーＢ　（Ｍｏｒｌｅｙ、　Ｂ、Ｊ、およびＣａｍｐｂｅｌｌ。

Ｒ，Ｄ、、１９８４．ＥＭＢＯＪ、３：１５３；　Ｍｏ１ｅ、Ｊ、Ｅ、ら、１９ ８４゜Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２５９：３４０７）　、およびＣ２（Ｂｅ ｎｔｌｅｙ、　Ｄ。

ＲｏおよびＰｏｒｔｅｒ、Ｒ，Ｒ，、１９８４，Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　［Ｊ、Ｓ、Ａ、　８１：１２１２；　Ｇａｇｎｏｎ、　Ｊ、 、　１９８４．　Ｐｈ１ｌｏｓ、　Ｔｒａｎｓ、　Ｒ，Ｓａｃ、　Ｌｏｎｄ、Ｂ 、　Ｂｉｏｌ、　Ｓｃｉ、　３０６：３０１）のみならず、例えばインターロイ キン−２レセプター（ＬｅｏｎａｒｄＷ、　Ｊ、ら、　１９８５，５ｃｉｅｎｃ ｅ　２３０：６３３）、β２−糖タンパク質Ｉ　（Ｌａｚｉｅｒ、Ｊ、ら、１９ ８４．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

［Ｊ、Ｓ、Ａ、８１：３６４０）、Ｃ１ｒ（Ｌｅｙｔｕｓ、Ｓ、Ｐ、ら、１９８ ６．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５：４８５５）　、ハプトグロビンα鎖（ Ｋｕｒｏｓｋｙ。

Ａ、ら、１９８０．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、７ ７：３３８８）および第Ｘ１ｆｌｂ因子（Ｉｃｈｉｎｏｓｅ、　Ａ、ら、１９８ ６．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５：４６３３）のような、このような機能 を有することが知られていないタンパク質をも包含する。

各シスチン残基はすべてのタンパク質のＳＣＲに於て不変であるか、例外は第３ の各シスチンを欠くハプトグロビンである。トリプトファンも不変であるか、β ２−糖タンパク質■の５番目のＳＣＲおよび第ＸｌｌＩｂ因子に存在する反復の うちの２個が例外である。保存されているかすべてのＳＣＲに存在するわけては ない他の残基は、％シスチンのまわりでクラスターを形成する傾向がある。ファ クターＢおよびＣ２に一つだけ遊離の千オール基かあり（Ｃｈｒｉｓｔｉｅ、　 Ｄ、　Ｌ、およびＧａｇｎｏｎ、　Ｊ、、　１９８２、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、２ ０１：５５５；Ｐａｒｋｅｓ、Ｃ，ら、１９８３．　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｊ、　２１３：２０１）、β２−糖タンパク質ＩのＳＣＲでは１番目の各シスチ ンが３番目と、２番目が４番目とジスルフィド結合している（Ｌａｚｉｅｒ、　 Ｊ、ら、１９８４．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ 、　Ａ、　８１：３６４０）。

得られたＣＲＩのアミノ酸配列には、Ｎ−結合オリゴ糖となる可能性のなる部位 が１７個あり、そのすべてか細胞外領域にある（第６図Ａ）。ツニカマイシン存 在下および非存在下で合成されたＣＲ１分子量の相違（Ｌｕｂｌｉｎ、Ｄ、Ｍ、 　ら、　１９８６．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６１：５７３６）とグルコサ ミン含有量の分析（Ｓｉｍ、　Ｒ，Ｂ、、　１９８５．　Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ、　 Ｊ、　２３２：８８３）は、わずかに６−８個のＮ−結合複合オリゴ糖の存在を 示唆し、可能性のある部位のすべてが利用されるわけてはないことを示す。例え ば、得られたアミノ酸配列（第５図）の残基２６３のアスパラギンは、ペプチド ４１ｃ（第工表）で同定されたか、このことはこの部位にグリコジル化のないこ とを示す。対照的に、ペプチド３４ｂの未同定のアミノ酸は、おそらく残基３９ ５　のグリコジル化されたアスパラギンに相当する。

５．５ｋｂのｃＤＮＡて同定された繰り返しのないＣＲＩ配列だけが、Ｃ００Ｈ −末端領域に存在する。この領域の二次構造分析によって、単一の２５残基から なる推定の膜−結合セグメントが同定される。このセグメントは強い疎水的性質 を暮し、α−へリックスを形成する可能性か非常に強い（第５図）。この配列に 続いてすぐに多くの膜タンパク質に特有の性質である４個のプラスに荷電した残 基がある。ＣＲＩの推定細胞質領域は４３残基を有してなり、６アミノ酸からな る配列、ＶＨＰＲＴＬ、を含有する。この配列は表皮成長因子（ＥＧＦ）レセプ ターおよびｅｒｂ　Ｂガン遺伝子産物におけるプロティンキナーゼＣリン酸化部 位、ＶＲＫＲＴＬ、と相同である（Ｈｕｎｔｅｒ。

Ｔ、ら、１９８４．　Ｎａｔｕｒｅ　３１１：４８０；　Ｄａｖｉｓ、　Ｒ，Ｊ 、およびＣｚｅｃｈ、　Ｍ、Ｐ、、　１９８５．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ。

８２　：　１９７４）。扁桃腺ＣＲＩの細胞質領域にはチロシン残基は存在しな い。

６．３考　察 ＣＲＩのＦアロタイプの一次構造の約８０％が、重なりあったｃＤＮＡクローン の配列決定により得られた。この分析で観察されたＣＲＩのもっとも他と異なる 構造上の特徴は、縦列で、同方向の、４５０アミノ酸からなるＬＨＲの存在であ り、４個のＬＨＲか２　、０００残基の推定ポリペプチド鎖長を有するＣＲＩの Ｆアロタイプに存在すると予想される　（ＷｏＢ、　Ｗ、Ｗ、ら、１９８３．　 Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ。

７２：６８５；　Ｓｉｍ、Ｒ，Ｂ、、１９８５．　８ｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、２３２ ：８８３）。

３個のＬＨＲかクローニングされ、配列決定された一方で、第４のＬＨＲの存在 に関する証拠かトリプシンペプチドの分析によって与えられた。各ＬＨＲは、他 のＣ３／Ｃ４結合タンパク質の基本的な構造単位である７個のＳＣＲで構成され る。ＳＣＲ当りの４個の各シスチンの保存、第１と第３の、および第２と第４の 各シスチンかジスルフィド結合におそらく関与すること（Ｌａｚｉｅｒ、　Ｊ。

ら、１９８４．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８ １：３６４０）、モしてβ−ターンによくみられるプロリン、グリシン、および アスパラギンのような保存されたアミノ酸の存在（Ｒｏｓｅ、　Ｇ、Ｄ、ら、１ ９８５．　ＡＤｖ、　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍ、　３７：１）は、ＳＣＲがジ スルフィド結合によって維持される三重ループ構造を形成するという提案に至る （第８図）。

各シスチンに関するこのような役割は、穏やかな条件でトリプシン処理したＣＲ Ｉ　（Ｓｉｍ、　Ｒ，Ｂ、、　１９８５．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、　２３２：８ ８３）およびファクターＨ（Ｓｉｍ、　Ｒ，Ｂ、およびＤｉＳｃｉｐｉｏ、　Ｒ ，Ｇ、、　１９８２．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　２０５：２８５）が非還元条 件下で５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分析したときに は未処理の分子と同様に移動し、還元後は多数のトリプシン断片と同様に移動す るという発見により支持される。

このような一連の縦列に反復される５ＣＲｓは、ファクターＨについて、および ヒトＣ４ｂｐの各サブユニ・ノドについて提出された延長構造（第８図）を形成 することか予想される（Ｓｉｍ、　Ｒ，Ｂ、およびＤｉＳｃｉｐｉｏ、Ｒ，Ｇ、 、　１９８２゜Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　２０５：２８５：　Ｗｈａｌｅｙ、　 Ｋ、およびＲｕｄｄｙ、　Ｓ、。

１９７６、Ｊ、Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、１４４　：　１１４７；　Ｄａａｈｌｂａｃ ｋ、Ｂ、ら、１９８３、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、Ｕ、 Ｓ、Ａ、　８０：３４６１）。

Ｃ４ｂｐのサブユニットの電子顕微鏡による研究は、３００×３０オングストロ ームの大きさであることを示した（Ｄａｈｌｂａｃｋ、Ｂ、ら、１９８３．　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、　Ｓ、Ａ、　８０：３４６１） 。各サブユニットは８個のＳＣＲから構成される（Ｃｈｕｎｇ、　Ｌ、Ｐ、ら、 １９８５．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　２３０．１３３）ので、１個のＳＣＲは ３８Ｘ３０オングストロームであると算出される。ＣＲＩのＳＣＲか同様の大き さを有することおよびＦアロタイプが３０個のＳＣＲを有することを考えるとレ セプターは細胞膜から１．１４０オングストロームはど伸びることがてきるてあ ろう。好中球上でＣＲ１と結合したフェリチン−標識抗体がしばしば原形質膜の 外薬から５００オングストロームであった（Ａｂｒａｈａｍｓｏｎ、　Ｄ、　Ｒ ，およびＦｅａｒｏｎ、　Ｄ、Ｔ、、　１９８３．　Ｌａｂ、Ｉｎｖｅｓｔ。

４８：１６２）という初期の発現はこのようなＣＲＩ構造の予想と矛盾しない。

このようなＣＲＩの延長構造は、レセプターを担う細胞と、免疫複合体内の比較 的到達しにくい部位や微生物細胞表面に共存結合したＣ３ｂとの相互作用を容易 にするてあろう。

ＳＣＲか主要なそしておそらく唯一のＣＲＩの細胞質外要素であるという発見は 、もっばらＳＣＲだけで、またはおもにＳＣＲで構成される二つの血漿タンパク 質であるファクターＨおよびＣ４ｂｐとレセプターとの間の密接な関係について 構造的な証拠を与える（Ｃｈｕｎｇ、　Ｌ、Ｐ、ら、１９８５、Ｂｉｏｃｈｅｍ 、Ｊ、　２３０：１３３；　Ｋｒ１ｓｔｅｎｓｅｎ、Ｔ、ら、１９８６゜Ｊ、　 Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３６：３４０７）　、　ＣＲＩは最初にファクターＨ様活 性を有する赤血球膜タンパク質として界面活性剤可溶化後に単離され（Ｆｅａｒ ｏｎ、　Ｄ、Ｔ、、１９７９．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７６：５８６７）、その後原形質膜上に存在するときはファ クターＨおよびＣ４ｂｐの調節機能を有することか明らかになった（ｒｉｄａ、 　Ｋ、およびＮｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ、　Ｖ、、　１９８１．　Ｊ、　Ｅｘｐ、 　Ｍｅｄ、　１５３：１１３８）　、　ＣＲＩ、ファクターＨ１およびＣ４ｂｐ の構造的多型性の遺伝子を分析することによって、これら３つのタンパク質をコ ードする遺伝子が連なっていることが示され（ｄｅ　Ｃｏｒｄｏｂａ、　Ｒ，ら 、１９８５．　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、１６１：１１８９）、この連鎖群の、 および構造的に関係のあるレセプター、ＣＲ２、の遺伝子座が、生体内原位置ハ イブリッド形成により、また体細胞ハイブリッドの分析により、第一染色体の長 腕、バンドｑ３２上にあることか示されている（Ｗｅｉｓ、　Ｊ、Ｈ，ら、１９ ８７．　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３８：３１２）。本研究以前に、これらの タンパク質問の構造的な関連性についての唯一の証拠は、それらのアミノ酸組成 の存意な類似てあった（ＷｏＢ、　Ｗ、Ｗ、ら、１９８５．　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ ｏｌｌＭｅｔｈｏｄｓ　８２　：　３０３）。したかつて、このようなＣＲＩに おける少なくとも２３のＳＣＨの発見は、レセプターと、同様の機能を持つタン パク質であるファクターＨおよびＣ４ｂｐとの構造的な関係（Ｃｈｕｎｇ、　Ｌ 、Ｐ、ら、１９８５．　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｊ、２３０：１３３；　Ｋｒ１ｓｔｅｎｓｅｎ、Ｔ、ら、　１９８６．　Ｊ、ｆ ｍｍｕｎｏｌ。

１３６：３４０７）　、そしてそれぞれＣ３ｂおよびＣ４ｂと酵素複合体を形成 する構成要素であるファクターＢおよびＣ２のＢａおよびＣ２ｂフラグメントと の構造的な関係（ＭｏｒｌｅＹ、　Ｂ、Ｊ、およびＣａｍｐｂｅｌｌ、　Ｒ，Ｄ 、、　１９８４．　ＥＭＢＯＪ、　３：１５３；　Ｍｏ１ｅ、Ｊ、Ｅ、ら、１９ ８４．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５９：３４０７；Ｂｅｎｔｌｅｙ、　Ｄ、 Ｒ，およびＰｏｒｔｅｒ、　Ｒ，Ｒ，、１９８４，Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８１：１２１２；　Ｇａｇｎｏｎ、、Ｌ、１９８４ 、Ｐｈ１ｌｏｓ、Ｔｒａｎｓ、Ｒ，Ｓａｃ、Ｌｏｎｄ、Ｂ、Ｂｉｏ、Ｓｃｉ、３ ０６：３０１）を直後、きちんと明示するものである。しかしながら、ＳＣＲは いくつかの補体以外のタンパク質にも発見されており（Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｒ， Ｄ、およびＢｅｎｔｌｅｙ、　Ｄ、Ｒ，、１９８５、ｒｍｍｕｎｏｌ、Ｒｅｖ、 ８７：　１９：　Ｌｏｚｉｅｒ、Ｊ、ら、１９８４．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、Ａ、　８１：３６４０；　Ｌｅｙｔｕｓ、 　Ｓ。

Ｐ、ら、１９８６．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２５　：　４８５５；　Ｋｕｒ ｏｓｋｙ、Ａ、ら、１９８０、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７７：３３８８；Ｉｃｈｉｎｏｓｅ、　Ａ、ら、１９８６． 　Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５：４６３３）（第７図）それが必ずしもＣ ３／Ｃ４結合構造を表していないことを示す。

ＳＣＲを有するタンパク質の中で、ＣＲＩは、この基本構造および遺伝ユニット をＬＨＲの高次構造ユニツト中に編成した点で独特である。Ｓアロタイプの発現 に関連するゲノムＤＮＡの１４．５ｋｂ　ＢａｍＨＩフラグメントの分析は、Ｃ ＲＩにおける少なくとも一つの反復するゲノムユニ・ノドか、少なくとも５個の ＳＣＲとそれらのフランキング°イントロンをコードするエキソンを含有するＤ ＮＡの延長セグメントであることを示唆した（Ｗｏｎｇ、　Ｗ、Ｗ、ら、１９８ ６、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６４：１５３１）。これらの研究はまた、 Ｆ対立遺伝子に存在する数と比較して、Ｓ対立遺伝子がこのゲノムユニットの付 加的コピーを含有することを示唆した。この観察を、トリブシンペプチドマ・ソ ビング研究（Ｎｉｃｋｅｌｌｓ、　Ｍ、Ｗ、ら、１９８６．　Ｍｏ１．　Ｉｍｍ ｕｎｏｌ。

２３：６６１）およびＬＨＲが−４０−５０ｋＤのペプチドに相当するというこ こでの発見と組み合わせることによって、われわれはＳアロタイプ（２９０ｋＤ ）に付加的なＬＨＲか存在することを、Ｆアロタイプ（２５０，０００ダルトン 分子量）の４個のＬＨＲの推定値と比較して、予想することができる。

重複現象に関する証拠を提供することに加えて、ＬＨＲの配列はまた、ＣＲＩ遺 伝子内で変換現象か起こったことを示唆する。ＬＨＲ−Ｂおよび−Ｄは、相互の 全長にわたって６７％同一であるか、これにたいしてＬＨＲ−ＣはＬＨＲ−Ｂと ＮＨ２−末端４　ＳＣＲに於て９９％同一てあり、　ＬＨＲ−ＤとＣ００Ｉ（− 末端３　ＳＣＲに於て９１％同一である。このような機構は、このハイブリッド プラスミドの起源に於て同一の親対立遺伝子の間で一回組換えか起きただけでは 生じなかったであろう。むしろハイブリットＬＨＲは、ＬＨＲ−Ｃ前駆体にある 配列かＬＨＲ−ＢまたはＬＨＲ−Ｄに存在する配列によって置き換えられるよう な遺伝子変換によって生じた可能性がある（Ａｔｃｈｉｓｏｎ、　Ｍ、およびＡ ｄｅｓｎｉｋ、　Ｍ、、　１９８６．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　Ｌｌ、Ｓ、Ａ。

８３　：　２３００）。また、これらのＬＨＲにおけるほとんと完全な同一性お よび相同配列の正確な配列（第５図）は、遺伝子変換を含む機構によって維持さ れたのかもしれない。ＬＨＲをコードするＣＲＩ遺伝子セグメントの介在配列間 の相同性の程度の分析は、遺伝子変換が機能的制約に基づく選択のどちらか配列 分岐を厳密に限定したかを決定するはずである。

以前の研究がＣＲＩか一価であることを示唆した（Ｗｉ　１ｓｏｎ。

１、　Ｇ、ら、１９８２．　Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３０７：９８ １）か、各々のＬＨＲは単一のＣ３ｂ／Ｃ４ｂ結合ドメインに相当し、それによ ってレセプターば多価となり、そして多数のＣ３ｂおよびＣ４ｂ分子を担う複合 体の結合に適応される。あるいはまた、異なるＬＨＲがそれぞれＣ３ｂおよびＣ ４ｂの結合に対応しく下記第９項参照）、ＣＲＩに於けるファクターＨおよびＣ ４ｂｐ活性の組合せに関する構造的な基礎を与える。最後に、ＣＲＩのＬＨＲは 、提出された構造モデル（第８図）によって示唆されるようにＣＲＩを原形質膜 から伸長させるのに有用な構造ドメインに相当する可能性かあり、ＮＨｔ−末端 領域のＳＣＲはファクターＨについて見いだされたようにＣ３ｂおよびＣ４ｂと 結合する（Ｓｉｍ、　Ｒ，Ｂ、およびＤｉＳｃｉｐｉｏ、　Ｒ，Ｇ、、　１９８ ２．　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｊ、２０５：２８５；Ａｌ５ｅｎＺ、Ｊ、ら、１９８４．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ 、　２２４：３８９）。ホルボールエステルによるプロティンキナーゼＣの活性 化は、好中球、単球、および好酸球におし）てＣＲＩのリン酸化を誘導しくＣｈ ａｎｇｅｌｉａｎ、　Ｐ、　Ｓ、およびＦｅａｒｏｎ、Ｄ、Ｔ、、１９８６．　 Ｊ、Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、１６３：１０１）　、４３アミノ酸からなるＣＲＩ細胞 質ドメインは、上皮成長因子においてプロティンキナーゼＣによってリン酸化さ れル部位と相同な配列を有する（Ｈｕｎｇｅｒ、　Ｔ、ら、１９８４゜Ｎａｔｕ ｒｅ　３１１：４８０；　Ｄａｖｉｓ、　Ｒ，Ｊ、およびＣｚｅｃｈ、　Ｍ、Ｐ 、、１９８５、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ 、　８２：　１９７４）　。しかしなから、この細胞質の配列は扁桃腺ライブラ リーの三つの独立したクローンに於て見いだされたが、それはＢ細胞ＣＲＩのも のである可能性が最も高く、このＣＲＩはプロティンキナーゼＣによる活性化の 後にリン酸化されない（Ｃｈａｎｇｅｌｉａｎ、　Ｐ、Ｓ、およびＦｅａｒｏｎ 、　Ｄ、Ｔ、。

１９８６、　Ｊ、　ＥＸＩ）、　Ｍｅｄ、　１６３：１０１）。

７、実施例：　ＣＲＩ　５’　ｃＤＮＡ配列は第４の長く相同な反復を含有する ＣＲＩの部分的なｃＤＮＡ配列の分析により、４５０アミノ酸からなる三つのＬ ＨＲ，ＬＨＲ−Ｂ、　ＬＨＲ−Ｃ，ＬＨＲ−Ｄを含み、その各々かＣ３／Ｃ４結 合タンパク質に特徴的な６５アミノ酸からなる７個の短いコンセンサス反復（Ｓ ＣＲ）を含んでなる構造か明らかになった（上記第６項参照）。ここで述へる実 施例に於て、本発明者らは５’　ｃＤＮＡクローンの配列決定によって第４のア ミノ末端ＬＨＲ，ＬＨＲ−Ａ（Ｋｌｉｃｋｓｔｅｉｎ、　Ｌ、Ｂ、ら、１９８７ ．　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　４　：　１８０）のクローニングおよびヌクレオチ ド配列を説明する。ＬＨＲ−Ａの分析により、５個の３’　ＳＣＲに於てＬＨＲ −ＡはＬＨＲ−Ｂに９９％相同であるか、２個の５’　ＳＣＲにおいては６１％ しか相同でないことが明らかになった。

７．１．材料および方法 ７．１．１．　ｃＤＮＡライブラリーの構築記載　（ＣＨｉｒｇｗｉｎ、Ｊ、Ｍ 、ら、１９７９．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１８：５２９０；　Ａｖｉｖ、 　Ｈ，およびＬｅｄｅｒ、　Ｐ、、　１９７２．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、６９：１４０８；　Ａｕ５ｕｂｅｌ、Ｆ、Ｍ、 ら、１９８７、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ ｒ　Ｂｉｏｌｇｙ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ ）に従い、以下の改変を加えて、選択的にプライマーを用いたｃＤＮＡライブラ リー、λＨＨ１をＤＭＳＯ誘導細胞から精製した３μｇのポリ（Ａ）”　ＲＮＡ から構築した。ＬＫ３５．１．３５−マーオリゴヌクレオチド、５゛−ＴＧＡＡ ＧＴＣＡＴＣＡＣＡＧＧＡＴＴＴＣＡＣＴＴＣＡＣＡＴＧ　ＴＧＧＧＧ−３’を オリゴ（ｄＴ）　、□−１８の代わりに用い、４０μＣｉのα”Ｐ−ｄＣＴＰを 第二のストランド合成の間に添加した。ｃＤＮＡの３分のｌかλｇｔｌｌにクロ ーニングされ、ｃＤＮＡライブラリーか上記６．１．２項に従ってヒト扁桃腺ポ リ（Ａ）”ＲＮＡから構築された。７５０．０００個の相互に無関係な組換え体 か得られた。

７．１．２．　クローンの単離、プローブ、およびＤＮＡ配列分析 ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために用いられたプローブは、ＣＲ ｌ　−１（Ｗｏｎｇ、　Ｗ、Ｗ、ら、１９８５゜Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８２：　７７１１ＸＡＴＣＣ番号５７３３１ ）、ＣＲ−２（Ｗｏｎｇ、　Ｗ、Ｗ、ら、上記）　、ＣＲ１−４（Ｗｏｎｇ。

Ｗ、　Ｗ、ら、１９８６．　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６４：１５３１）、 および第１図でヌクレオチド１０１−３５２に相当するｃＤＮＡクローンλＨ３ ，１の０．５　ｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメント由来の２５２１］ｐＳａｕ３Ａ− フラグメントであるＣＲＩ−１８であった。高緊縮条件下で、ＣＲＩ−１８はＬ ＦＲ−ＡのＮＨ２−末端ＳＣＲまたはシグナルペプチドのいずれかをコードした ｃＤＮＡにに対してのみハイブリッド形成する。ｃＤＮＡクローンのインサート を、フラグメントのＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９へのサブクローニング の後（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、　Ｃ，ら、１９８５．　Ｇｅｎｅ２８： ３５１）、ジデオキシヌクレオチド法（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、ら、１９７７、　 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７２：５４６ ３）によって配列決定した。

７．２．結　果 ７．５Ｘ１０’の組換え体を含有する特異的なブライマ−を用いたλｇｔｌｌ　 ｃＤＮＡライブラリーを、ＤＭＳＯ誘導ＨＬ−６０細胞由来のポリ（Ａ）”　Ｒ ＮＡから合成されたｃＤＮＡを用いて調製した。これらの細胞はＣＲＩのＦアロ タイプのみを発現するか（Ｌｕｂｌｉｎ、　Ｄ、Ｍ、ら、１９８６．　Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２６１：５７３６）　、これは４個のＬＨＲを有すると予想される （Ｌａｐａｔａ、　Ｍ、Ａ、ら、１９８４．　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅ ｓ。

１２：５７０７）。プライマー、ＬＫ３５．１は第３図に示すＣＲＩの部分的な ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド８９６−９３０に相当するアンチセンス３５〜マー てあった。このオリゴヌクレオチドが逆転写条件下てＬＨＲ−Ｂ、　ＬＨＲ−Ｃ およびＬＨＲ−Ｄとハイブリッド形成することか示された。ＣＲＩ　ｃＤＮＡプ ローブ、ＣＲ１−１およびＣＲｌ−４の混合物を用いてスクリーニングされた３ ゜８Ｘ１０’個の増幅していない組換えファージの平板に於て、２５０個の陽性 コロニーか同定された。３８個の陽性クローンを取りあげてプラーク精製した。

これらのクローン由来のＥｃｏＲｌ消化ＤＮＡのササンプロットを、２３−マー オリゴヌクレオチド、ＫＳ２３．１．５’　−ＣＴＧＡＧＣＧＴＡＣＣＣＡＡＡ ＧＧＧＡＣＡＡＧ−３’　を用いてスクリーニングした。このオリゴヌクレオチ ドは第３図の部分的なＣＲＩ　ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド７６３−７８５に相 当する。このプローブは高度に緊縮な条件下で、ＬＨＲ−Ｂをコードする配列に 於て一つの部位でハイブリッド形成するか、ＬＨＲ−ＣまたはＬ）ＩＲ−Ｄをコ ードする配列てはハイブリッド形成しない。クローンのλＨ７，４（第９図）の 挿入物は、１．　Ｏｋｂ、　０．９　ｋｂおよび０．４　ｋｂの３個のＥｃｏＲ Ｉフラグメント、および２個のそれより大きい、ＫＳ２３．１　とハイブリッド 形成するフラグメントを含有したか、このことはこのクローンか３゛側５／７の ＬＨＲ−ＡおよびすべてのＬＨＲ−８のコード配列を含有することを示す。この 発見は、ＬＨＲ−Ａが、ＬＨＲ−Ｂに対してきわめて相同であることを確証した 。クローンλ）４３．１（第９図）は、１．　Ｏｋｂの単位のＫＳ２３．　ｌを 育するＥｃｏＲ［フラグメントおよび高緊縮下でＣＲ１−４と弱くハイブリッド 形成する０、　５ｋｂフラグメントを含有した。このクローンはＬＨＲ−Ａを完 成し、５ＣＲ−１および−２と０、ｌｋｂの上流配列を包含する追加の５゛配列 を含有すると考えられる。

残った３６クローンのうち一つも、それらのすべてかＣＲ１−１とはハイブリッ ド形成したが、プローブ、ＣＲＩ−１８で検出されなかった。このプローブはＬ ＨＲ−Ｂ、　−Ｃ，または−Ｄをコードして配列とハイブリッド形成しないクロ ーンλＨ３，１の０．５　ｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメント由来の２５２ｂｐ　５ ａｕ３Ａｒフラグメントである。

λ８３．１のＤＮＡ配列分析は、オーブンリーディングフレームがｃＤＮＡの５ ′末端まで続くことを明らかにし、このことはそのクローンが翻訳開始部位まで 達しなかったことを示す。したかって、ｃＤＮＡライブラリー、λＨ）Ｉおよび λＳ２ＴをプローブＣＲＩ−１８を用いて再度スクリーニングし、各々から−ク ローンずつ、それぞれλＨ１０，３およびλＴ１０９．　ｌを同定した。ＣＲＩ −１８とハイブリツド形成するこれらのクローンのＥｃｏＲＩ　フラグメントを 、そのクローン由来の挿入物、λＨ３，１およびλＨ７，１と同様に配列決定し た。合成した配列を第１図に示すか、第１図のヌクレオチド番号１５３１は第３ 図のヌクレオチド＃１である。ＨＬ−６０および扁桃腺ライブラリー由来のｃＤ ＮＡクローンの重なりあう配列は同一である。

ＬＨＲ−Ａのすぐ上流に、クローンλＴＩ０．３およびλＨ１０９，１は、同一 の推定疎水性リーダー配列（Ｖｉｎ　）（ｅｉｊｎｅ。

Ｇ、、　１９８６．　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４：４６８３）を 含存するが、この配列は４１アミノ酸をコードし、真核翻訳開始部位に関して提 出された共通配列ＮＮＡ／　ＧＮＮＡＴＧＧに適合するＡＴＧを包含する（第１ ０図ＸＫｏｚａｋ、　Ｍ、、　１９８６．　Ｃｅ１１４４：２８３）。その選ば れたＡＴＧの６コドン上流、そしてインフレーム終止コドンのすぐ下流に存在す る第２のＡＴＧは、このコンサンサス配列にあまり当てはまらない。ＣＲＩのよ うなリーダー配列の最初の三つのアミノ酸、ＭＧＡは、ＣＲ２について報告され ているのと同じである。これら二つのクローンのその配列はＡＴＧの上流で分か れ、λ１０．３クローン由来のそれは、上記第６項て他のＣＲ１ｃＤＮＡクロー ンについて記載されたように、介在配列の一部に相当すると考えられる。

シグナルペプチド切断かグリシン−４６およびグルタミン−４７の間で起こるこ とか予想され（Ｖｏｎ　Ｈｅ１ｊ）ｎｅ。

Ｇ、、１９８６．　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１４：４６８３）　、こ のことはＣＲ−１のブロックされたＮＨ２−末端（Ｗｏｎｇ、　Ｗ、Ｗ、ら、１ ９８５゜Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　８２：３０３；　Ｈｏ１ｅｉｓ 、Ｖ、Ｍ、ら、１９８６゜Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　３：６３）のために、ピロリ ドンアミドか存在するのかもしれないことを示唆する。これらのクローンに含ま れるＮＨ２−末端ＬＨＲ−Ａの最初の二つのＳＣＲは、ＬＨＲ−８の対応する領 域に対して６１％しか同一でなく、一方ＬＨＲ−Ａの５ＣＲ３−７はＬＨＲ−Ｂ の対応ＳＣＲに９９％同一である（第１０図）。ＬＨＲ−ＡのＬＨＲ−Ｃとの比 較により、各々の第３と第４のＳＣＲのみか相同性が高い（９９％同一）ことが 明らかである。ＬＨＲ−Ａおよび−Ｄは、全体ではわずかに６８％の同一性を有 するのみだが、各ＬＨＲの第６　ＳＣＲ間では最大の８１％の同一性を有する。

したがって、ＣＲＩの５’　ｃＤＮＡ配列の完成は、Ｆアロタイプが２０３９ア ミノ酸を含んでなり、４１アミノ酸のシグナルペプチド、それぞれ７個のＳＣＲ からなる４個のＬＨＲ、二つのＣ００Ｈ−末端ＳＣＲ、２５残基の膜貫通領域お よび４３アミノ酸細胞質ドメインを包含する。２５個の可能性のあるＮ−結合グ リコシル化部位が存在する。

７．３．考　察 ＣＲＩのＦアロタイプのＮＨ２−末端およびシグナルペプチドの一次構造は、５ ’　ｃＤＮＡクローンの単離および配列決定によって推定された。ＣＲＩ配列の 高い反復性の性質のために、レセプターのこの領域をコードするｃＤＮＡクロー ンの調製および同定のための適当な方法を開発することは不可欠になった。逆転 写の条件下てＬＨＲ−Ｂ、　−Ｃおよび−Ｄとハイブリッド形成することか知ら れている３５−マーオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてｃＤＮＡライ ブラリーを調製した。このプライマーが、ＬＨＲ−Ｂと非常に相同であると予想 されたＬＨＲ−Ａともハイブリッド形成する可能性が考えられた（上記第６項参 照）。別のオリゴヌクレオチドＫＳ２３．１を用いて適当なｃＤＮＡクローンを 同定したが、このＫＳ２３．１は緊縮条件下でＬＨＲ−Ｂとのみハイブリッド形 成し、そのことにより５’　ｃＤＮＡクローン発見の確率を増加させる。はとん どすべてのＣＲＩの残基の配列を包含する二つのクローンを発見し、この内の一 つの５ａｕ３Ａ　Ｉフラグメント、ＣＲＩ−１８は残りの５クローンの同定にそ れを用いるのに十分ユニークな配列を有した（１９．１０図）。

ＬＨＲ−Ａの５′領域由来の２５０ｂｐプローブは、７．９および９．２ｋｂの ＣＲ１転写物のみならず、緊縮条件下でヒト扁桃腺ＲＮＡに於ける２ｋｂ転写物 ともハイブリッド形成した。このようなりロス−ハイブリッド形成ｍＲＮＡは、 他のＬＨＲ由来のＣＲＩ　ｃＤＮＡプローブでは、またはジメチルスルホキシド 誘導ＨＬ−６０細胞およびＨ３Ｂ−２Ｔリンパ芽球細胞由来のＲＮＡのノーサン プロットに於いては、観察されなかった。したがって、ＣＲＩはさらに二つのＢ 細胞タンパク質、一つはこの新たな認識されたｍＲＮＡによってコードされ、も う一つはＣＲ２である、に相同な配列を含有する。

８、実施例：組換えヒトＣＲＩの発現 上記のように７．ＯｋｂにおよぶヒトＣＲＩ　ｃＤＮＡクローンが単離され、そ れは２０３９アミノ酸をコードする読みとり枠を有する（第１図）。提案された レセプターの前駆体型は、４１アミノ酸のシグナルペプチド、　４５０アミノ酸 からなる４個の長く相同な反復（ＬＨＲ）（各ＬＨＲは７個の短いコンセンサス 反復（ＳＣＲ）を含んでなる）、６５アミノ酸からなる二つのＣ００Ｈ−末端Ｓ ＣＲ、２５アミノ酸膜貫通ドメイン、および４３アミノ酸細胞質領域を包含する 。したがって、ＣＲＩ　Ｆアロタイプは３０ＳＣＲを含有する。ＮＨ２−末端Ｌ ＨＲ、ＬＨＲ−Ａ　（上記第７項参照）は、最初の二つのＳＣＲに於いてＬＨＲ −Ｂの対応する領域に対して６１％同一であり、Ｃ００Ｈ−末端の５３ＣＲでは ９９％同一である。８個のＣＲＩ　ｃＤＮＡクローンの制限フラグメントをスプ ライスして６．９ｋｂの全長構築物を作成し、マウスメタロチオネインプロモー ターまたはサイトロスガロウイルスプロモーターの下流に置き、Ｌ（マウス）細 胞またはＣ０３（サル）細胞にトランスフェクションさせた。組換え細胞表面Ｃ ＲＩを間接的なラジオイノムアッセイおよび免疫蛍光法により検出した。親ベク ター（ＣＲＩ−）だけでトランスフェクションした細胞には抗原は検出されなか った。トランスフェクションし、表面１２５１−標識したＣ０５（サル）細胞の 抗ＣＲＩモノクローナル抗体による免疫沈降反応、および非還元ドデシル硫酸ナ トリウム（ＳＯ３）ポリアクリルアミノゲル電気泳動による分析は、ヒト赤血球 由来のＦアロタイプとともに移動する分子量１９０．０００ダルトンのバンドを 生じた。正確な分子量の組換えＣＲＩ抗原の発現（Ｋｌｉｃｋｓｔｅｉｎ。

Ｌ、　Ｂ、ら、１９８８．　ＦＡＳＥＢ　、１．２：　Ａ１８３３）は、そのｃ ＤＮＡがヒトＣＲＩの完全なコード配列を含有することを証明する。

８．１．完全なＣＲＩコード配列を含有するプラスミドｐＢＳＡＢＣＤの構築 ここで、全長の（ＳＣＲ１−３０）　ＣＲ１タンパク質をコードするベクター、 プラスミドｐＢＳＡＢＣＤの構築について説明する。

ｃＤＮＡクローンλＴ８．２由来の２．３ｋｂ挿入物（Ｋｌｉｃ−ｋｓｔｅｉｎ 。

Ｌ、Ｂら、１９８７．　Ｊ、　ＥｘｐｏＭｅｄ、　１６５：　１０９５；上記第 ６項参照）をＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＵｃ１８にサブクローニングし、 その結果５°末端はプラスミドポリリンカーに於てＨｉｎｄｌｌＩに近接した。

このプラスミドをｐ１８８．２と命名した。ｐ１８８．２をＡｐａｒおよびＨｉ ｎｄＩＩＩＴ：切断し、５ＣＲ２６から３′非翻訳領域までのＣＲＩ配列および ベクター配列を含有する大きな４．７ｋｂフラグメントをゲル精製した。

ｃＤＮＡλＴ５０．１由来の挿入物（ｋｌｉｃｋｓｔｅｉｎ、　Ｌ、Ｂ、ら、１ ９８７、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６５：１０９５．上記第６項参照）を ＥｃｏＲＩフラグメントとしてＭ１３ｍｐ１８にサブクローニングした。このフ ァージを１８Ｒ５０，１と称した。このクローンの複製型に由来するＤＮＡをＡ ｐａｌおよびｔ（ｉｎｄＩ［で切断し、ＣＲＩ　５ＣＲ１８−２５を含有する１ 、　４５ｋｂフラグメントを単離し、ｐ１８８．２由来の４．７ｋｂフラグメン トに結合し、その結合をＥ、コリＤＨ５αに形質転換した。このプラスミドをｐ ８．２５０．１と称した。

ｃＤＮＡクローンλＴ８．３由来の０．７５ｋｂおよび０．９３ｋｂＥｃｏＲＩ フラグメント（Ｗｏｎｇ、　Ｗ、Ｗ、ら、１９８５．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　２２＋７７１１）をプラスミドｐＢＲ３２ ７にサブクローニングした。これらのサブクローンをそれぞれｐｃＲｌ−１およ びｐｃＲｌ−２と呼び、これらはそれぞれ５ＣＲＩＩ−１４および５ＣＲＩ７− ２１を含有した。ＥｃｏＲ［挿入物を各々から精製した０、　７５ｋｂのｐｃＲ ｌ−１フラグメントをＳｍａ　Ｉで消化し、その消化物をＥｃｏＲＩおよびＳｍ ａ　Ｉで切断したｐ［Ｉｃ１８ＤＮＡに結合した。５ＣＲ１２−１４に対応する ０、５ｋｂ挿入物を育するサブクローンの一つ、ｐ１８１−１．１を単離した。

ｐｃＲｌ−２の０．９３ｋｂフラグメントをＨｉｎｄＩＩ［で消化し、ＥｃｏＲ ＩおよびＨｉｎｄＩ［［で切断したｐｔＪｃ１９に結合し、５ＣＲ１７を含有す る０、２７ｋｂインサートを有するサブクローンの一つ、ｐ１９１−２．１を単 離した。

ｃＤＮＡクローンλ６．１（上記第６項参照；　Ｋ１１ｃｋｓｔｅｉｎ。

Ｌ、　Ｂ、ら、１９８７．　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、１６５：１０９５；　Ｗ ｏｎｇ、　Ｗ、Ｗ。

ら、１９８７．　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６４：１５３１）をＥｃｏＲＩ て消化し、ＣＲＩの５ＣＲ１５および１６に相当する０、３７ｋｂフラグメント をｐＢＲ３２２にサブクローニングした。このクローンをｐｃＲｌ４と名付けた 。クローンＩ）１８１−１．１をＥｃｏＲＩおよびＳｃａ　ｒて切断し、１．４ 　ｋｂフラグメントを単離した。クローンｐ１９１−２．１（Ｋｌｉｃｋｓｔｅ ｉｎ、Ｌ、Ｂ、ら、１９８７．　Ｊ、Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、　１６５　：　１０９５；上記第６項参照）をＥｃｏＲＩおよび５ｃａ Ｉて消化し、２．Ｏｋｂフラグメントを単離し、ｐ１８１−１．１由来１．４　 ｋｂフラグメントに結合し、その混合物をＥ、コリＤＩ（５αに形質転換した。

結果として得られたプラスミドをｐｉ−１１−２と名付けた。プラスミドｐ１− １１−２をＥｃｏＲＩて消化し、ｐｃＲｌ−４由来の０．３７ｋｂ挿入物フラグ メントを連結によって挿入した。その結果生じたプラスミドをＥ、コリＤＨ５α の形質転換に用いた。

０、３９ｋｂ　Ｂａｍｆ（ｆ　−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを含有するサブク ローンを選択した。このプラスミドをｐ１４２と称し、これはＣＲＩ　５ＣＲ１ ２−１７を含有した。ｐ８．２５０．１由来の３．５ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎ ｄＩＩＩ挿入物フラグメントをｐＧＥＭ３ｂに移した。このプラスミドをｐＧ８ ．２５０．１　と命名した。１）１４２由来の１．２　）１ｉｎｄＩＩＩフラグ メントを精製し、Ｈｉｎｄｕで予め切断したｐｃｓ、　２５０．１に結合した。

２．４．ｋｂのＰｓｔｌ−Ａｐａ！挿入物を含有するサブクローンを選択し、し た　かって正しい方向を選択した。このプラスミドをｐＣＤと呼び、これは５Ｃ Ｒ１２から３°末端までのＣＲＩ配列を含有した。ｃＤＮＡクローンλ５°ア＋ 　Ｉ　（Ｋｌｉｃｋｓｔｅｉｎ、Ｌ、Ｂ、ら、１９８７、　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎ ｔ　４：１８０；上記第７項参照）を　ＰｓｔＩて切断し、５ＣＲ６−１２に相 当する１、　３５ｋｂフラグメントを単離し、Ｐｓｔｌ−切断ｐＣＤに結合した 。その混合物を形質転換し、１．３５ｋｂおよび１．　ｌｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩ フラグメントを含有するサブクローンを選択した。

ｃＤＮＡクローンλ５’　３．１　（Ｋｌｉｃｋｓｔｅｉｎ、　Ｌ、Ｂ、ら、１ ９８７゜Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　４：１８０；上記第７項参照）をＥｃｏＲＩで 切断し、その消化物をＥｃｏＲＩ−切断ｐＵｃ１８に結合した。サブクローン、 ρ３．１１−１を単離し、これはＳＣｌ？３−７に相当する１、　Ｏｋｂ挿入物 を含有するが、この挿入物をゲル精製した。ｃＤＮＡクローンλ５’　１０．３ （Ｋｌ　１ｃｋｓｔｅｉｎ、　Ｌ、　Ｂ、ら、１９８７、　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎ ｔ　４：１８０；上記第７項参照）をＥｃｏＲＩて切断し、ＳＣＲ１および２を 含有する０、　６３ｋｂ挿入物をｐ［ＪｃＩ８にサブクローニングした。このク ローンをｐｌｏ、　３．５と命名した。プラスミドｐｌＯ，３，５をＥｃｏＲＩ で部分消化し、線状プラスミドに相当する３、４ｋｂフラグメントを単離し、ｐ ３，１１−１由来のｌｋｂフラグメントに結合した。サブクローンＩＩＬＡを取 あげたが、これは１．３ｋｂ　Ｐｓｔｌフラグメントを挿入および方向の正しい 部位に含有した。

ｃＤＮＡクローンλＴ１０９．４（Ｋｌ　１ｃｋｓｔｅｉｎ、　Ｌ、　Ｂ、ら、 １９８７゜Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　４：１８０；上記第７項参照）をＥｃｏＲＩ て消化し、ｐＵｃ１８にサブクローニングした。リーダー配列およびＳＣＲＩお よび２を通じて５゛非翻訳領域に相当する０、５５ｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメン トを含有するサブクローンを選択した。プラスミドｐ１０９．４をＰｓｔｌおよ びＢｓｐＭＩ［て切断し、ベクター、リーダー配列、およびＳＣＲ１を含有する ３、０ｋｆｌフラグメントを単離した。そのフラグメントを、５ＣＲ２−５を含 有するｐＬＡ由来の０．８１ｋｂ　Ｐｓｔｌ−ＢｓｐＭＩＩフラグメントに結合 した。この新たなプラスミドをｐＮＬＡと命名した。プラスミドｐＮＬＡをＥｃ ｏＲＩて部分消化して、Ｐｓｔ［で完全消化し、リーダー配列からＳＣｆ？　５ に通じるＣＲＩ配列を含有する１、Ｉｋｂ　ＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔｌフラグメント を単離し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ＋（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＳａｎ　Ｄ ｉｅｇｏ、　ＣＡ）に結合し、ｃＤＮＡの５゛部位にＸｈｏ１部位を置いた。こ のプラスミドをｐＸＬＡと称す。

プラスミドｐＢＣＤをＥｃｏＲＶで切断し、次にＰｓｔｌて部分消化し、ＳＣＲ ６から３゛非翻訳領域にいたるＣＲＩ配列を含有する６、Ｏｋｂ　Ｐｓｔ［−Ｅ ｃｏＲＶ　７　ラフメン）　’ｆｃ単離Ｌ、Ｐｓｔｌ＋Ｓｍａｌ−消化ｐＸＬＡ に結合した。その結果生じた細菌発現プラスミドは、完全なＣＲＩ　ｃＤＮＡコ ード配列を含有し、ｐＢＳＡＢＣＤと命名した。

８．２．完全なＣＲＪコード配列を含有する曙乳動物発現ベクタープラスミドｐ ｉＡＢＣＤの構築およびアッセイ プラスミドｐＢＳＡＢＣＤをＸｈｏｌおよびＮｏｔｌて消化し、その挿入物を、 やはりこれらの制限酵素で予め切断した発現ベクターＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ、　Ｂ 、、　１９８７．　Ｎａｔｕｒｅ　３２９：８４０−８４２）の４．４　ｋｂフ ラグメントに於てＣＭＶプロモーターから下流に結合した。得られた構築物をｐ ｉＡＢＣＤと名付けた（第１１図）。あるいはまた、６．９ｋｂ　ＸｈｏＩ−Ｎ ｏｔｌフラグメントを、やはりこれらの制限酵素で予め切断した発現ベクター、 ｐＭＴ、　ｎｅｏｌにおいて、メタロチオネインプロモーターから下流に結合し た。得られた構築物をｐＭＴＡＢＣＤと名付けた（第１１図）。

ウサギ抗体で感作されたヒツジ赤血球（ＥＡ）、および限られた量のＣ４ＭＥＡ Ｃ４ｂ（Ｊｉｍ）］　、および細胞当り１２、０００Ｃｐｍの”Ｊ−Ｃ３ｂ［Ｅ ＡｃＣ４ｂ（Ｊｉｍ）、　３ｂ］を、ＥＡＣ４ｂ（Ｉｉｍ）（Ｄｉａｍｅｄｉｘ ）をＣＩ、Ｃ２および１２５１−Ｃ３で連続的に処理し、つぎに４０ｍＭＥＤＴ Ａ含有ゼラチンベロナール−緩衝食塩水中で、３７°Ｃ６０分間インキュベート することによって調製した。あるいはまた、メチルアミン−処理したＣ３　［Ｃ ３ｍａ）　］を、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスク シンイミドエステル（Ｓｉｇｍａ）で処理したヒツジＥ（赤血球）に共有結合さ せた（Ｌａｍｂｒｉｓ、Ｊ、Ｄ、ら、１９８３．　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅ ｔｈｏｄｓ　６５：２７７）、　ＥＡＣ４ｂを精製Ｃ４を用いて調製した（Ｈａ ｍｍｅｒ、　Ｃ，Ｈ，ら、１９８１、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５６： ３９９５）。

ｐｉＡＢＣＤおよびｐＭＴＡＢＣＤはいずれも、ＤＥＡＥ−ジエチルアミノエチ ル）−デキストラン法によって、Ｃ０３（サル）細胞にトランスフェクションさ れた。抗−ＣＲＩモノクローナル抗体、ＹＺ−１を用いた免疫蛍光反応によって ；そして１２６Ｉ−標識細胞の免疫沈降反応とその後の非還元５ＤＳ−ＰＡＧＥ によって；そしてＣ３ｂでコートされたヒツジ赤血球でのロゼツト形成によって （Ｆｅａｒｏｎ、　Ｄ、Ｔ、、１９８０、　Ｊ、　ＥＸｐ、　Ｍｅｄ、　１５２ ：２０）、組換えＣＲＩをトランスフェクション細胞の表面に検出した。この５ ＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｆアロタイプにホモ接合性のドナーのヒト赤血球から免疫沈 澱させたＣＲＩと同一の移動度を有するタンパク質を示した（Ｗｏｎｇ、　Ｗ、 Ｗ、ら、１９８３．　Ｊ、　Ｃ１１ｎ　Ｉｎｖｅｓｔ。

７２：　６８５）。天然型と組換えＣＲＩの電気泳動移動度が同一であることは 、ＣＲＩＦアロタイプがＳＣＲｌ　−３０を含有することを確認した。

さらに、マウスＬ細胞をＤＥＡＥ−デキストラン法（Ａｕｓｕｂｏｌ、Ｆ、Ｍ、 ら、１９８７．　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａ ｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｓｅｉｄｍａｎ、　Ｊ、Ｇ、および５ｔｒｕｈ１．　Ｋ 。

編、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ；　５ｅｅｄ、 　Ｂ、、　１９８７゜Ｎａｔｕｒｅ　３２９：８４０）によって、二通りで、０ ．２．または４μｇのｐｉＡＢＣＤまたはｐＭＴＡＢＣＤのいずれか一方、およ び成長ホルモンの発現を指示するレポータープラスミドである２μｇのｐＸＧＨ ５（Ｓｅｌｄｅｎ、　Ｒ，Ｆ、ら、１９８６．　Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　６：３１７３）を用いて、同時にトランスフェクション した。三日後細胞を集め、ＹＺ１モノクローナル抗−ＣＲＩ抗体の結合によって ＣＲＩの発現をアッセイした。組換えプラスミドＤＮＡとＣＲＩ抗原の発現の間 には用量応答関係が存在した（第■表）。

第■表 同時にトランスフェクションしたし細胞における組換えＣＲＩおよびヒト成長ホ ルモンの用量応答ＹＺｌ抗−ＣＲＩ プレート　ｐＸＧＨ５ｐＭＴＡＢＣＤ　１）ＩＡＢｃＤ　ｍＡＢ　Ｒ［Ａ”　成 長ホルモン本ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）　＋こついては、１％ウシ血清ア ルブミンおよび０．２％アジ化ナトリウムを含有する０、１−リン酸緩衝食塩水 の３Ｘ１０５　トランスフェクション細胞の複製試料を０　”Ｃで６０分間３μ ｇ／ｒｎｌＹＺ−１　１ｇＧ１抗−ＣＲＩとともにインキュベートした　（Ｃｈ ａｎｇｅｌｉｓｎ、Ｐ、Ｓ、ら、１９８５．　Ｊ、Ｉ＋ｎｍｕｎｏ１．　１３４ ：１８５１）　、細胞を洗浄し、ｌ−２μｃｌ／ｒＩＬｌの１２’Ｉ−Ｆ（ａｂ ’　）ヤギー抗−マウスＩｇＧまたは１２５ｉ−プロティン八を含有する０、１ −バッファーに再懸濁した。０°Ｃて１−２時間後、細胞を洗浄し１２６［をア ッセイした。

プラスミドｐｉＡＢＣＤはｐＭＴＡＢＣＤよりも約３倍多いＣＲＩ抗原の発現を 指示した。培地中の成長ホルモン濃度は、プレート５を除けば２倍以下の範囲で 変化した。追加実験は、ｐｉＡＢＣＤがＣＯ８細胞に於て、Ｌ細胞よりも３倍多 いＣＲＩ抗原の一過性の発現を指示することを示した。

ＺＹＩ抗ＣＲ１ｍＡＢで染色させた細胞の間接的な免疫蛍光反応で評価する場合 には、ＣＲＩはトランスフェクションＣＯ８細胞表面のクラスターに存在した（ 第１２図）。

ＣＯ８細胞上の組換えＣＲＩのこのような分布は、野生型ＣＲＩのヒト白血球上 での分布に似ている（Ｆｅａｒｏｎら、１９８１、　Ｊ、　Ｅｘｔ）、　Ｍｅｄ 、　１５３：１６１５）。

組換えＣＲＩの分子量を、ｐｉＡＢＣＤを用いてトランスフェクションしたＣＯ ８細胞の表面ヨウ素化、細胞溶解物とセファロース−ＹＺｌとの免疫沈降反応、 ５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによって決定した。組換えＣＲ Ｉは非還元で分子量１９０．０００を有し、これはＦアロタイプと等しく赤血球 ＣＲＩのＳアロタイプより小さい（第１４図）。

組換えＣＲＩのＣ３ｂ結合およびＣ４ｂ結合機能を、トランスフェクションＣＯ ８細胞とＥＡＣ４ｂまたはＥＡＣ４ｂ（ｌｉｍ）。

３ｂとのロゼツト形成によってアッセイした。３１の別個のトランスフェクショ ンに於て、プラスミドｐｉＡＢＣＤを用いてトランスフェクションされたＣＯ８ 細胞の５％−５０％か、５個またはそれ以上のＥＡＣ４ｂまたはＥＡＣ４ｂ（ｌ ｉｍ）、　３　ｂと結合した（第１３図）。’ＣＲ１を発現するＣＯＳ細胞は、 ＥＡＣ４ｂ（ｌｉｍ）、３　ｂｉとロゼツト形成しなかった（ただしこの中間体 はＣＲ２を発現するＲａｊｉＢリンパ芽球細胞とはロゼツトを形成した）。

８．３．ＣＲ１フラグメントの発現 ＣＲＩコード配列の一部をコードした発現ベクター（欠失変異体）を下記のよう に構築し、それらがＣＯ３細胞に形質転換されたときそれぞれＣＲＩ挿入物を発 現することを見いだした。ＣＲＩフラグメントは細胞表面タンパク質として発現 された。

８．３．１．欠失変異体ｐｉＢＣＤ、　ｐｉＡＢＤ、　ｐｉＡＣＤ、　ｐｉＡＤ 、　ｐｉＢＤ。

ｐｉｃＤおよびｐｉＤの構築 このような変異体の構築は、４個のＣＲＩの長く相同を反復（ＬＨＲ）の各々の アミノ末端付近に単一のＢｓｍ　Ｉサイトが存在し、ＣＲＩ　ｃＤＮＡおよびＢ ｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、 　ＣＡ）内に他にはＢｓｍＩ部位が存在しないことを利用して行われた。

ｌＯマイクログラムのプラスミドｐＢＳＡＢＣＤを５０ユニツトの制限酵素Ｂｓ ｍｒで４５分間、部分消化し、その消化物をアガロースゲル電気泳動によって分 画した。それぞれ！、２または３個のＬＨＲを欠失した親プラスミドの線状セグ メントに対応する８、５５ｋｂ、　７．２０ｋｂおよび５．８５ｋｂのＤＮＡフ ラグメントを精製した。３フラグメントの各々をそれ自身に結合し、その連結は 別々に、コンピテントなＥ、コリＤｆ（５αをアンピシリン耐性に形質転換する ために用いられた。

８、５５ｋｂフラグメントはｐＢＳＡＢＣＤを二つの隣接したＢｓｍ１サイトで 切断した結果生じた。したがって連結後３種の産物プラスミド、ｐＢＣＤ、　ｐ ＡＣＤまたはｐＡＢＤか存在する可能性がある。ここにおいて、大文字はプラス ミドに残ったＬＨＲを表す。これらはＳｍａｌを用いた制限マツピングによって 区別される。ＤＮＡを１２コロニーから調製し、ＳｍａＩで消化し、アガロース ゲル電気泳動で分離した。５コロニーは、２．５ｋｂと６．１ｋｂの二つのＳｍ ａｌフラグメントを存し、ＬＨＲ−Ａコード配列の欠失に相当する、したがって ｐＢＣＤに当たる。３コロニーは８．５ｋｂの単一の直線フラグメントを有し、 ｐＡＣＤに相当する。４コロニーは１．２ｋｂと７．４ｋｂの二つのＳｍａ　Ｉ フラグメントを有し、これらはＬＨＲ−Ｃコード配列の欠失か予想され、１）Ａ ＢＣを示す。これら３種の構築物の各々５゜６ｋｂ挿入物を、ＸｈｏｌとＮｏｔ Ｉで二重に消化した後、ゲル−精製し、あらかじめ同制限酵素で消化後ゲル精製 した発現ベクターＣＤＭ８に結合した。Ｅ、コリＤＫＩ／Ｐ３を連結混合物を用 いて形質転換し、各々の５コロニーからＤＮＡを調製した。発現ベクター中に欠 失したＣＲＩ　ｃＤＮＡ挿入物か存在することは、各々の場合に於て、５ａｃＩ 消化によって示され、それは４．２０ｋｂと５．７５ｋｂの予想された二つのフ ラグメントを示した。これらのプラスミドをｐｉ１３ｃｌ）、　ｐｉＡＣＤ及び ｐｉＡＢＤと命名した。

ｐＢＳＡＢＣＤの部分消化から得られた７、　２０ｋｂフラグメントは、三つの 隣接部位での、または、同様に大きなフラグメントについては、その二つの部位 の間に一つの非切断部位を持つ二部位での、ＢｓｍＩ消化の結果であり、したか って、形質転換後に二つの産物、ｐＡＤおよびｐＣＤか得られる可能性があった 。これらはＸｈｏｒとＰｓｔｆを用いた二重の消化によって区別することができ 、この消化によってｐＡＤの場合１．Ｏｋｂと６．２ｋｂの二つのフラグメント が生じ、ｐＣＤについては７．２ｋｂの直線フラグメントか生じる。これらのプ ラスミド各々からの４．２ｋｂ挿入物をＸｈｏｌとＮｏｔｌで二重に消化した後 、ゲル−精製し、上記のようにＣＤＭ８にサブクローニングした。発現ベクター 中に欠失のあるＣＲＩ　ＣＤＮＡか存在することは、Ｐｓｔｒ及びＢｇｌ　ＩＩ て二重に消化することによって示された。クローンｐｉＡＤは２．４ｋｂと６． ２ｋｂのフラグメントを有し、一方ｐｉｃｌ）は８．６ｋｂの一つのフラグメン トを有した。

ｐＢＳＡＢＣＤのＢｓｍ１消化から得られた５、　８５ｋｂフラグメントは完全 消化産物に相当し、一つのクローンｐＤはＥ、コリＤＨ５αの形質転換後に得ら れた。これはＨｉｎｄｌＩＩおよびＢｇｌＩＩを用いた二重の消化によって確認 され、予想された３、　７ｋｂおよび２．２ｋｂのフラグメントを生じた。その クローンの２．９ｋｂ挿入物をＸｈｏ　ＩとＮｏｔｌで二重に消化した後、ゲル −精製し、上記のように発現ベクターに結合した。その結果生じたｐｉＤクロー ンの旧ｎｄＩ［消化は、予想された７、３ｋｂフラグメントを生じ、Ｘｈｏｌと ＢｇｌＩＩを用いた二重の消化は、２．２ｋｂと５．１ｋｂのフラグメントを与 えた。そして、５ａｃｌ消化物は予想された１゜５ｋｂおよび５．８ｋｌｌフラ グメントを生じた。

ｐＢＣＤのＢｓｍ１部分消化によってプラスミドｐＢＤを調製した。二つの隣接 するＢｓｍＩ部位での切断に対応する線状７．２ｋｂフラグメントをゲル精製し 、上記のようにそれ自身に結合し、Ｅ、コリＤＨ５αをアンピシリン耐性に形質 転換した。ｐＢＤは、Ｓｍａ　Ｉ消化でのＬ２ｋｂおよび６゜Ｏｋｂフラグメン トの存在によって同定された。４．２ｋｂ挿入物を、Ｘｈｏ　ＩとＮｏｔｌて二 重に消化した後、精製し、上記のようにＣＤＭ８に移した。クローンｐｉＢＤは 、ＨｉｎｄＩ［消化後の予想された０、　８　ｋｂおよび７．８ｋｂのフラグメ ントの観察によって確認された。

それぞれｐｉＡＢＣＤ、　ｐｉ［３ｃｌ）、　ｐｉＣＤ、およびｐｉｆ）構築物 を一過性に発現するＣＯ３細胞を、１′ｒて表面標識し、抗−ＣＲＩ抗体ととも に免疫沈降させた。還元後の５ＤＳ−ＰＡＧＥで、ｐｉＡＢＣＤ構築物の産物は 、ＣＲＩのＦアロタイプと同様に移動し、他方、欠失変異体はそれぞれ１，２゜ および３　ＬＨＲの欠失を示す約４５．０００ダルトンづつの段階的な減少を示 した（第１７図）。

８．３゜２．欠失変異体ｐｉＰ１．　ｐｉＥｌ、　ｐｉＥ２．　ｐｉＥ−２，ｐ ｉｌｌ。

ｐ　ｉ　Ｕ−２およびｐｉＡ／Ｄの構築プラスミドｐｉＡＢＣＤをＢｓｔＥＩＩ て完全に消化し、１．３５ｋｂ（タブレット）および８．６　ｋｂの二つのフラ グメントをゲル精製し、混合し、結合し、そしてＥ、コリＤＫＩ／Ｐ３をアンピ シリンおよびテトラサイクリン耐性に形質転換した。ＣＲＩ　ｃＤＮＡプローブ ＣＲ１−４とのハイブリッド形成により、コロニーをスクリーニングしく上記８ ．１項参照）、強く陽性のクローンをつり上げ、Ｓｍａ　Ｉでの消化によりさら にスクリーニングした。ｐｉＥｌは、２．７ｋｂおよび７．３ｋｂの二つのフラ グメントの存在によって同定された。ｐｉＥ２は単一のＩＯ，Ｏｋｂ＃Ｉ状フラ グメントによって同定された。ｐｉＥ−２は、単一の８．６ｋｂ　Ｓｍａｌフラ グメントを含有する弱いＣＲ１−４陽性クローンとして同定された。

プラスミドｐｉＰ１は、ｐｉＡＢＣＤのＰｓｔ［完全消化、および大きな１０． 　Ｏｋｂフラグメントのゲル精製によって得られた。このフラグメントを結合し 、Ｅ、コリＤＫＩ／Ｐ３をその混合物を用いて形質転換した。その結果生じたプ ラスミド、ｐｉＰｌは、単一のｌｏ、ｏｋｂ　Ｓｍａｌ　フラグメントを含有し た。

プラスミドｐｉＵ１およびｐｉＵ−２は、プラスミドｐＸＬＡを用いたｄｃｍ− 株ＧＭ２７１／Ｐ３の最初の形質転換によって調製された。このＤＮＡは、５ｔ ｕｌおよびＮｅｏ　Ｉて二重に消化し、３．３ｋｂフラグメントをゲル精製した 。プラスミドｐＢＳＡＢＣＤをＮｓｉ［で部分消化し、その結果生じた４塩基対 の３°オーバーラツプをＥ５コリＤＮＡポリメラーゼＩのフレナラフラグメント で処理することによって取り除いた。

次にそのＤＮＡを、Ｎｏｔｔで完全に消化し、５．４　ｋｂおよび４、Ｏｋｂフ ラグメントをゲル精製した。これらをｐＸＬＡ由来の３．３ｋｂ　５ｔｕｌ−Ｎ ｏｔＩフラグメントに結合し、その連結混合物を用いてＥ、コリＤＨ５αをアン ピシリン耐性に形質転換した。ＣＲＩ　ｃＤＮＡプローブＣＲｌ−４とのハイブ リッド形成によって、コロニーをスクリーニングし、陽性クローンをＨｉｎｄＩ ＩＩ制限消化によってさらにチェックし、その消化はｐｕｔについて０．８　ｋ ｂ、　１．３　ｋｂおよび６゜５ｋｂの３種のフラグメントを、そしてｐＵ−２ については０．８ｋｂおよび６．５　ｋｂの２種のフラグメントを生じた。

５ｔｕｒでプラントしたＮｓｉ［スプライスは、これらのプラスミドのＤＮＡ配 列決定により読み枠が一致することか確認された。それぞれ５．６ｋｂおよび４ ．２　ｋｂのｐＵｌおよびｐＵ−２の挿入物を、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩの二重 消化後にゲル精製し、上記のように発現ベクターＣＤＭ８に結合した。

クローン、ｐｉＵｌおよびｐｉＵ−２（７）構造は、ＸｈｏｒおヨヒＰＳ１［を 用いた制限消化によって確認され、ｐｉＬｌｔについては、予想された１、２ｋ ｂおよび８．８　ｋｂの二つのフラグメントを、そしてｐｉＵ−２については線 状８．７ｋｂフラグメントを生じた。

プラスミドｐｉＡ／Ｄは、Ｐｓｔｒを用いたｐｉＡＢＣＤの最初の完全消化によ って調製された。Ｐｓｔｌ消化物を次にＡｐａｒで部分消化し、３゛オーバーラ ツプを、Ｅ、コリＤＮＡポリメラーゼ■のフレナラフラグメントを用いて除去し た。

次にＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で分画し、７゜５ｋｂフラグメントを単離 し、結合し、それを用いてＥ、コリＤＫＩ／Ｐ３をアンピシリンおよびテトラサ イクリン耐性に形質転換した。その構築はＫｐｎＥ＋　５ａｃｔを用いた二重消 化によって確認され、予想された０、　８　ｋｂ、１．５ｋｂ、１．７ｋｂおよ び３．３ｋｂの４フラグメントを生じた。

（本頁以下余白） ９、実施例：　Ｃ３ｂおよびＣ４ｂ結合ドメインの同定９．１．アッセイおよび 結果 その名称の頭文字により示されるＬＨＲを含存するプラスミドｐｉＡＢＣＤ、　 ｐｉＡＤ、　ｐｉｃ［ｌおよびｐｉＤをＣＯＳ細胞中に形質転換し、これらを、 そのコードされたＣＲＩフラグメントがＣ３ｂまたはＣ４ｂと結合する能力を評 価するアッセイに用いた。結合アッセイは、それらの細胞表面上で完全長ＣＲ１ 分子またはＣＲＩ欠失組換え体を発現する（一過性発現）ＣＯ８細胞によるＣ３ ｂまたはＣ４ｂ被覆赤血球の結合から生じる赤血球ロゼツト形成を観察すること によって行った。トランスフェクション細胞１−４　Ｘ　１０’／ｒＩＬｌをＣ ３またはＣ４担持赤血球２−６　ｘｌＯ”／−と共に０．０２ｍ７中て６０分間 ２０℃でインキュベートした。

トランスフェクション細胞形成ロゼツトの％は顛微鏡的に、少なくとも５個の付 着性赤血球かある場合を１０ゼツトとして記録されたトランスフェクション細胞 により評価した。その結果を第１表に示す。

（本頁以下余白） 第１表 ＣＲＩおよびヒツジ赤血球を担持するＣ３（ｍａ）またはＣ４（ｍａ）の組換え 体形を発現するＣＯ３細胞トランスフエクタント間のロゼツトの形式 ％式％（） ネ１赤血球あたりのＣ３（ｍａ）数はこの中間体を用いる３つの実験においてそ れぞれ６０．０００．３５０．０００および９００、０００であった。

＃１赤血球あたりのＣ４（ｍａ）数はこの中間体を用いる２つの実験においてそ れぞれ１６０．０００および１４０．０００であった。

π実験数 ３つの別個の各実験において、ＥＣ３（ｍａ）でロゼツトを形成した完全長ｐｉ ＡＢＣＤ構築物を発現するＣＯ８細胞の比率は、Ｙ２１モノクローナル抗−ＣＲ Ｉ抗血清またはウサギ抗−ＣＲＲ抗血清のいずれかを用いるイムノフルオレッセ ンスにより評価して、検出しうる組換え体レセプターを存するフラクションと同 様であった（第■表）。

これと対照的に、ｐｉＤを発現する細胞はロゼツトを形成しなかった。これはＣ ３−結合部位がＬＨＲ−Ａ、−Ｂまたは−Ｃ中に存在するはずであることまたは これらの存在を必要とすることを示している。ある１つの部位は、ｐｉＢＤまた はｐｉＣＤのいずれかを発現する細胞がＥＣ３（ｍａ）でロゼツトを形成するこ とを実証することによってＬＨＲ−Ｂおよび−Ｃの両方に存在することか示され た。ｐｌＡＤ、ρｉＡ／ＤまたはｐｉＥ−２を発現する細胞は同等のＣ３−結合 機能を有しなかった。ｐｉＥ−２構築物は、ＬＨＲ−Ｃの最初の２つのＳＣＲの 代わりにＬＨＡの５ＣＲ−１および−２を有する点てのみｐｉＣＤと相異するの で、Ｌｌ（Ｒ−Ｃ中のＣ３−結合部位の機能はこれらＮＨ２−末端ＳＣＲを必要 とするはずである。

ＥＣ４（ｍａ）でロゼツトを形成した完全長ｐｉＡＢＣＤ組換え体を発現するＣ Ｏ３細胞の比率は、ＥＣ３（ｍａ）でロゼツト形成するフラクションよりも少な かった。これは恐らく、１血球球あたりのＣ４（ｍａ）がより少ないこと（第■ 表）または】レセプターあたりの０４−結合部位がより少ないを反映している。

ＬＨＲ−Ａの全部または一部分を有する欠失組換え体ｐｉＡＤ、　ｐｉＡ／Ｄお よびｐｉｅ−２構築物は、欠失組換え体ｐｉＢＤおよびｐｉＣＤよりも良好にＥ Ｃ４（ｍａ）を結合し；　ｐｉＤにはこの機能が欠けていた。従って、ＣＲＩの ０４−結合物は、二次的部位がＬＨＲ−Ｂおよび−Ｃ中に存在するかもしれない が、最初はＬＨＲ−Ａ中にある。

ｐｉＥ−２構成のロゼツト化能かｐｉｃＤのそれに比して良好であることは、Ｌ ＨＲ−Ａの５ＣＲ−１および−２がＣ４−結合部位に関連していることを示唆し ている。

ＹＺＩモノクローナル抗−ＣＲＩ抗体の結合のラジオイムノアッセイは、ｐｉＡ ＢｃＤ、　ｐｉＡＤ、　ｐｉＢＤおよびｐｉＣＤ構築物を発現するＣＯ３細胞に よる有意な取り込みを示した（第■表）。ＬＨＲ−Ａの５個のＮＨｚ−末端ＳＣ ＲおよびＬＨＲ−Ｄの３個のＣ００Ｉ（＝末端ＳＣＲから構成されるｐｉＤまた はｐｉＡ／Ｄでトランスフェクションされた細胞は、これらの構築物の産生物が ポリクローナル抗−ＣＲＩ抗血清と結合したか、ＹＺＩ抗−ＣＲＩ抗体とは結合 しなかった（第■表）。

従って、ＹＺＩエピトープはＬＨＲ−Ａ、　−Ｂおよび−Ｃ中で反復され、ＬＨ Ｒ−ＡのＮＨ２−末端ＳＣＲ中には存在せず、そしてＬＨＲ−Ｄ中では存在しな いかまたは利用できない。

（本頁以下余白） 第■表 ＣＲＩの組換え体形を発現するＣＯ８細胞トランスフエクタントへのモノクロー ナルおよびポリクローナル抗−ＣＲＩ抗体の結合 ｐ　ｉＡＤ　２８７９　１９８９１ ＣＤＭ８　４２８　４８８６ 本　１％ウシ血清アルブミンおよび０．０２％ナトリウムアジドを含有する０、 　１　ｍｌ　’）ン酸塩緩衝塩溶液中の３×１０’　トランスフェクション細胞 の複製サンプルを３μｇ／ｍｌ　ＹＺＩ　ｔｇＧ１抗−ＣＲＩ　ｍＡｂと共に（ Ｃｈａｎｇｅｌｉａｎ。

Ｐ、　Ｓ、ら、１９８５．　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３４：１８５１）または ９ＣＲｇ、／ｍＮウサギＩｇＧ抗−ＣＲＩ抗体と共にＯ″Ｃて６０分間インキュ ベートした。細胞を洗浄し、そして”５１　Ｆ（ａｂ’）２ヤギ−抗−マウスＩ ｇＧまたは１２ｓｊ−プロティンＡｌ−２μＣｉ／ｍｌを含有する緩衝液０．１ ７ｄ！中に再浮遊させた。０°Ｃで１−２時間後、細胞を洗浄し、１２５Ｉにつ いてアッセイした。示した値は２通りの測定の平均、ｃｐｍ／　３　Ｘ　１０’ 　ＣＯ３細胞である。

９．２．考　察 各ＬＨＲ中の最初のＳＣＲのコード化配列の途中に見出された保存されたＢｓｍ ［部位により、ＬＨ３の境界に密接に対応しそしてオーブン読枠および推定ジス ルフィド結合形成のために必要な４個のシスティンの適切な位置を保持した一連 の欠失組換え体を構成することが可能であった（第１６図）。これらの欠失組換 え体のＣ３（ｍａ）−およびＣ４（ｍａ）−結合機能の比較により、これらの特 異性を有するＬＨＲだけでなく配位子特異性の決定に決定的なＳＣＲも区別され た。従って、ｐｉＤ形ではなくてｐｉＡＤ。

ｐｉＡ／ＤおよびｐｉＥ−２形がトランスフェクションＣＯ３細胞とＥＣ４（ｍ ａ）との間のロゼツト形成を仲介する能力は、ＬＨＲ−Ａの２個のＮＨ，−末端 ＳＣＲがこの補体タンパク質と相互作用するための部位を含有することを示した （第■表）。この部位はｐｉＡＤおよびｐｉＡ／Ｄを発現するトランスフェクシ ントがＥＣ３（ｍａ）を結合することができたので（第■表）　、Ｃ４（ｍａ） に対して比較的に特異的であるにすぎなかった。ロゼツトアッセイならびにｐｉ ＢＤおよびｐｉＣＤおよびＣ３（ｍａ）の開裂のためファクターニーコファクタ ー機能により実証された（第■表；第１８図）ｐｉＢＤおよびｐｉＣＤ構築物に よりコードされたレセプター〇Ｃ３（ｍａ）−結合機能は、これらのＬ）［Ｈの 最初の２つのＳＣＲ中にＣ３（ｍａ）に対して特異的な部位が存在することを示 した。これらの部位はＣ４（ｍａ）と相互作用することも可能であった（第１表 ）。したかって、ＬＨＲ−Ａ、　−８および一〇には選択的ではあるか重複する ０４−およびＣ３−結合活性がある。

あるいはまた、ｐｉＢＤおよびｐｉＣＤを発現するＣＯ８細胞かＥＣ４（ｍａ） と結合する能力は、ＮＨ，−末端３６アミノ酸をコードするヌクレオチドがＢｓ ｍ１フラグメントの連結によりＬＨＲ−Ａの５ＣＲ−１からＬＨＲ−８および一 〇に転移することによって生じたものであろう。しかしながら、これらの３６ア ミノ酸だけでは、　ｐｌＤ産生物に０４−ロゼツト形成機能を与えなかった。本 発明者らはこれらの反応におけるＬＨＲ−Ｄの二次的機能を排除することができ ない。なぜならばこのＬＨＲ−Ｄは機能についてアッセイした構築物のすべてに 存在したからである。ＣＲ１中に３つの明確なリガンド認識部位、Ｃ３ｂについ て２つおよびＣ４ｂについて１つがあるとの発見は、各レセプター分子は１価の リガンドに対して比較的低い親和性を存するにもかかわらず（Ａｒｎａｏｕｔ、 　Ｍ、　Ａ、ら、１９８３．　［ｍｍｕｎｏｌｏｇＹ　４８：２２９）複数のＣ ４ｂおよびＣ３ｂ分子を担持する複合体を有効に結合できるであろうことを示す 。この発見は、可溶性Ｃ４ｂかＣ３ｂ担持赤血球とヒトＢリンパ芽球様細胞系と の間でのロゼツト形成を阻害する能力かないことについての説明をも提供する（ Ｇａｉｔｈｅｒ、　Ｔ。

Ａ、ら、１９８３．　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３１：８９９）。ＣＲＩか特 に適合するであろうありうるリガンドは、それぞれ主経路および副経路の活性化 の際に生成する分子複合体Ｃ４ｂ／Ｃ３ｂおよびＣ３ｂ／Ｃ３ｂであろう。４つ のＬＨＲのうちの３つに明確な結合部位かあるので、それらのしＨＨの数により 異なるＣＲＩ構造アロタイプはリガンド結合部位の数の変化によって生じた有意 な機能上の相違を有するであろう。インビトロ研究はＦ、　ＳおよびＦ’（それ ぞれＡ、ＢおよびＣ）アロタイプの異なる結合活性を報告していないが、おそら く３個のみのしＩ（Ｒを有する小さいＦｏ　アロタイプは免疫複合体を解明する にはそこなわれた能力を有するかもしれない。Ｆｏ　アロタイプは全身性エリテ マトーデスと多分関連することが報告されている（ｖａｎ　Ｄｙｎｅ、　Ｓ、ら 、１９８７．　Ｃ１１ｎ、　Ｅｘｐ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　６８　：　５７０）。

１０、実施例：ファクターエコファクター活性の提示細胞表面および可溶化形の 両方における組換えＣＲＩタンパク質およびその特定のフラグメントはＣ３ｂフ アクター■コフアクター活性を有することか示された。

ファクターエコファクター活性のアッセイは、刊行された操作法（Ｆｅａｒｏｎ 、　Ｄ、Ｔ、、　１９７９．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７６：５８６７）を変更して行った。

可溶化したＣＲＩおよびフラグメントのファクターエコファクターをアッセイす るため、細胞表面ＣＲＩタンパク質およびフラグメントをＮｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ− ４０で可溶化し、溶解物をセファロースゲルに結合させた抗−ＣＲ１モノクロー ナル抗体ＹＺ−１で免疫沈降させた。１ＸｌＯｓ　トランスフェクション細胞の 界面活性剤溶解物を、セファロースｕｐｃｔｏ抗−レパンおよびセフ了ロース− ＹＺ−１で順次免疫沈降させた。次いで洗浄したビーズを０．０５ｍ／ＰＢＳ、 ０．５％ＮＰ−４０中の０．５μｇの’　２５１−Ｃ３（ｍａ）および２００ｎ ｇのファクター■と共に３７°Ｃて６０分間インキュベートすることにより、免 疫沈降物をファクターエコファクター活性についてアッセイした。インキュベー ション後、放射性標識Ｃ３（ｍａ）を含有する上溝を５ＤＳ−ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーにより分析した。ファクターエコ ファクター活性は、ファクター■によるタンパク質分解開裂から生じるＣ３（ｍ ａ）のアルファー鎖の低分子量形がオートラジオグラム上に現われることによっ て示された。

細胞表面ＣＲＩおよびフラグメントのファクターエコファクター（上記のｐｉＡ ＢＣＤ、　Ｉ）ｉＡＣ，ｐｉＢＤ、　ｐｉｃＤまたはｐｉＤ）を担持するトラン スフェクションＣＯ３細胞を０．５μｇ　’　２’　ｌ−Ｃ３（＋ｎａ）および ０．２μｇファクター■と共にインキュベートした（Ｆｅａｒｏｎ、　Ｄ、Ｔ、 、１９７７、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１１９：１２４８）。

細胞表面組換えＣＲＩのファクターニーコファクター活性を第１５図に示す。フ ァクターエは免疫固定化された組換えＣＲＩまたはファクターＨの存在下でのみ Ｃ３（ｍａ）のアルファー鎖を開裂して分子量７６、０００および４６．０００ のフラグメントにした（第１５図）。オートラジオグラムからのバントに対応す る領域をゲルから切り出し、＋２５【についてアッセイして開裂されたアルファ ー鎖の量を測定した。ファクターＨの存在下で９１％のアルファー鎖か開裂され たか、漸増量の組換えＣＲＩの存在下ではそれぞれ２６％、４１％および５５％ が開裂された。いくらかの内因性ファクターニーコファクター活性を含有するＣ Ｉ）Ｍ８ベクター単独でＣＯ３細胞をトランスフェクションしたが、この機能の 増加はｐｉＡＢＣＤ、　ｐｉＢＤおよびｐｉＣＤてトランスフェクションされた ＣＯ３により明らかてあった（第１８図）。ｐｉＡＤまたはｐｉＤでトランスフ ェクションされたＣＯ８細胞によっては＋　ｔ　ｓ　１−Ｃ１−Ｃ３（の高めら れた開裂はみられなかった。従って、これらの構築物のうち、ＣＯ８細胞にＣ３ 結合能を与えた欠失組換え体ｐｉＢＤおよびｐｉＣＤだけが０３開裂についての ファクターニーコファクター活性をも有していた。

ＣＲＩおよびそのフラグメントの細胞表面および可溶化形によりファクターニー コファクター活性をアッセイした結果を第ｖ表に示す。

（重責以下余白） 第７表 ＣＲＩおよびＣＲＩフラグメントの細胞表面および可溶化形のファクターニーコ ファクター活性 １）ｉＡＢＣＤ＋＋ ｐｉＡＤ　−− ｐｉＢＤ　＋　ＮＤｃ ａアッセイしたＣＲＩタンパク質またはフラグメントをコードしており、そして 発現のためにＣＯ３細胞中にトランスフェクションしたＯ ｂ（＋）はＣＤＭ８ベクター単独でのトランスフェクションに際して観察された 内因性レベル以上にコファクター活性か増加したことを示す。

Ｃ測定せず。

ｄ抗−ＣＲＩモノクローナル抗体ＹＺ−１により認識されるエピトープのＬＨＲ −Ｄが存在しないために測定せず。

第７表に示すように、ｐｉＡＢＣＤ　（完全長ＣＲＩタンパク質をコードする） 　、ｐｉＢＤ（ＬＨＲ−Ｂおよび−Ｄをコードする）またはｐｉＣＤ（ＬＨＲ− Ｃおよび−Ｄをコードする）の発現はＣ３ｂファクターＩ−コファクター活性を 有するＣＲＩ産生物を産生した。従って第７表のデータは、ＣＲＩタンパク質ま たはそのフラグメントか補体不活性化を促進することかできるとの証明を提供す る。

１１、実施例二組換え可溶性ＣＲＩの発現ＣＲＩ　ｃＤＮＡを組換えＤＮＡ操作 により修飾してＣＲＩまたはＣＲＩフラグメントの可溶性形（ｓｃＲｌ）を生成 させた。

５ｃＲ１構築物を哺乳類系中で発現させ、そこで細胞から発現タンパク質を分泌 させた。大量の可溶性ポリペプチドか産生され、これらのものはＣＲＩタンパク 質の膜結合形と対照的に、溶液として得るために可溶化させる必要はなかった。

１１．１．材料および方法 １１、１．１．酵素消化 す゛べての制限酵素消化、リンカ一連結、およびＴ４ＤＮＡ　リガーゼおよびＥ 、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼ反応を製造業者（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂ ｉｏｌａｂｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｂｅｖｅｒｌｅｙ、　ＭＡ）の説明書に従って行 った。Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＨＩまたはＤＨ５αをＭｏｒｒｉｓｏｎ、　Ｄ、Ａ、、 １９７９．　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ　６８：３２６−３３１の操作法によ りコンピテントにした。コンピテント細菌細胞をＭａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ら、 １９８２．　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　ＹｏｒｋによりＤＮＡで形 質転換した。プラスミドをアルカリ溶解または煮沸方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　 Ｔ、ら、上記）により精製した。

１１．１．２．　ＤＮＡフラグメントの単離ＤＮＡフラグメントをアガロース（ ＢｉｏＲａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ。

（Ａ）ゲルから下記のようにして精製した。適切なりＮＡバンドをゲルからカミ ソリを用いて切り出し、アガローススライスをパラフィン片上に置き、きわめて 小さい切片にスライスし、新しいパラフィン片に移した。

アガロース片をつぶし、アガロースを１．５ｍＩ！管に移した。同容量のフェノ ール（超純粋、ＢＲＬ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ。

ＭＤ）を添加し、混合物を回転させ、次いで一７０°Ｃて１０分間凍結し、１０ 分間遠心した。水相をさらにフェノール／クロロホルム（１：　１）で２回、ク ロロホルムで２回抽出した。次いてＤＮＡをエタノール沈降させ、ベレットを洗 浄し、真空乾燥し、　１０ｍＭ　トリス−ＭＣＩ、　ｐＨ７，０゜１　ｍＭ　Ｅ ＤＴＡに再浮遊させた。

ＤＮＡフラグメントを低ゲル化温度アガロース（ＦＭＣ。

Ｃｏｒｐ、、　Ｒｏｃｋｌａｎｄ、　ＭＥ）から下記のようにして単離した。適 切なりＮＡバンドをアガロースゲルから切出し、１、５　ｍｌ管に入れ、６５° Ｃて１５分間融解させた。液化ゲルを０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ 、超純粋、　ＢＲＬ。

Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ、　ＭＤ）を含有するフェノールで抽出した。

水相をさらにフェノール−５ＤＳで１回、クロロホルムで２回抽出した。次いて ＤＮＡを２．０ＭＮＨ４アセテート中でエタノール沈降させ、乾燥し、水に再浮 遊させた。

１１．１．３．　ｆｆ１ｉ乳類細胞へのトランスフエクンヨン補乳類細胞へのＤ ＮＡのトランスフェクションをＣａＰＯ４沈降およびＧｒａｈａｍおよびｖａｒ 　ｄｅｒ　Ｅｂのグリセロールショック法（１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２ ：４５６−４６７）　ｆ：より行った。

ＤＬＩＸ　Ｂｌｌ　ＣＨＯ細胞を、ＤＮＡ−リン酸カルシウム調製物と共に４〜 ６時間インキュベートしたのち、通気による成長培地の除去および２％グリセロ ールＤＭＥＭ培地５ｒｎｌの１分間添加によってグリセロールショックにかけた 。

次いて細胞を完全アルファーＭＥＭで２回洗浄し、この培地中で４８時間インキ ュベートした。

＋１．１．４．　ＣＨＯトランスフエクタント細胞培養ＤＬＩＸ　Ｂｌｌ　ＣＩ Ｏ細胞トランスフエクタントを、ヌクレオシド不含で１０％透析ウシつ児血清（ Ｇｉｂｃｏ）および４ｍＭＬ−グルタミンを補充したアルファーＭＥＭ培地（Ｇ ｉｂｃｏ）からなるＤＨＰＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）選択培地中で増殖さ せた。漸増量のメトトレキセー）　（Ｓｉｇｍａ。

＃Ａ−６７７０．　Ａｍｅｔｈｏｐｒｏｔｅｉｎ）　８度で細胞を増殖させるこ とにより増幅を行った（Ｋａｕｆｍａｎ、　Ｒ，Ｊ、ら、１９８５゜Ｍｏ１ｅｃ 、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、５＋１７５０−１７５９）。

１１、１．５．可溶性ＣＲＩレベル測定用ＥＬＩＳＡ１１、１．５．１．　ＣＲ １標準物 ヘモグロビン不合赤血球細胞（ＲＢＣ）　ｇｈｏｓｔの界面活性剤溶解物をＥＬ ＩＳＡ（酵素−結合イムノソルベントアッセイ）におけるＣＲＩ標準物として用 いた。ｇｈｏｓｔは先に記載されたようにして作製した（Ｗｏｎｇ、　Ｗ、Ｗ、 およびＦｅａｒｏｎ、　Ｄ、Ｔ、、１９８７．　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ　 １５０：５７９−５８５）。

簡単にいうと、赤十字から使用期限の切れた全血を得た。赤血球をＰＢＳで３回 洗浄したのち、６容量の低張溶解緩衝液（１０ｍＭ　トリスｐＨ８，０，１ｍＭ 　ＰＭＳＦ（ニア　工＝ルメチルスルホニルフル才リド）　、０．１　ｍＭ　Ｔ ＰＣＫ（）シルアミド−フェニルエチルクロロメチルケトン）、アブロトニン、 ２　ｍＭ　ＥＤＴＡ）中て溶解した。ｇｈｏｓｔを溶解緩衝液で数回洗浄し、血 球針でカウントし、小部分に分け、必要になるまで一７０℃で凍結した。ＣＲＩ 　ＥＬＩＳＡについては、ｇｈｏｓｔを可溶化緩衝液（１０ｍＭ）リスｐＨ８゜ ５０ｍＭ　ＫＣｌ、　０．２％ＮＰＯ４０，０，３％ＤＯＣ，６，２ｍＭ　ＰＭ ＳＦ、　０．２ｍＭヨードアセトアミド、アブロトニン、０．１ｍＭ　ＴＰＣＫ 。

２ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．２％ＮａＮ　ｚ　）中で１．６　Ｘ　１０”　ｇｈｏ ｓｔ　７ｍＮｌニー希釈し、ＥＬ４ＳＡにおける標準物として用いるために連続 的にＺ　５　ＸＩＯ’　ｇｈｏｓｔ　／ｍｌに希釈した。４９０ｎｍにおける吸 光度をプロットし、すべての未知サンプル操作をプロットと関連させてｇｈｏｓ 　を当量／ｒＩＬＩを得た。

１．１．５．２．　ＣＲＩ　ＥＬ４ＳＡＩｍｍｕｎｌｏｎ−ＩＩプレートをＰＢ Ｓ中の０．４　μｇｌｒｄＪ度の抗−ＣＲ１％／：１７０一ナル抗体（クロー　 ：／　Ｊ３Ｄ３．　ＡＭＡＣｌｏＴ　１７）の１００μｌ／ウエルで被覆しくＣ ｏｏｋ、　Ｊ、ら、１９８５、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　２２：５３ １−５３８）　、４°Ｃてｌ夜インキュベートした。次いて抗体溶液を捨て、ブ ロッキング溶液（１，０％ＢＳＡ、　ＰＢＳ中）を３００ｕｌ／ウニ）’ｖで添 加することによりプレートをブロックし、３７°Ｃで２時間インキュベートした 。ブロッキングののち、プレートをそのまま使用し、または必要になるまで４° Ｃて保存した。

０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳを用いてプレートを３回洗浄した 。サンプルを１００μｌ／ウエルで２通りずつで添加し、３７°Ｃて２時間イン キュベートした。

場合によってはサンプルを可溶化緩衝液で希釈した。

標準ＲＢＣｇｈｏｓｔを各プレートに包含させた。サンプルインキュベーション ののち、プレートを３回洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）お よびモノクローナル抗体ＹＺＩ　（Ｃｈａｎｇｅｌｉａｎ、　Ｐ、Ｓ、ら、１９ ８５．　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌｏ、　１８４：１８５１−１８５８）の結合物（Ｗｉｌｓｏｎ、 　Ｍ、Ｂ、およびＮａｋａｎｅ、　Ｐ、に、、　１９７８．　Ｉｍｍｕｎｏｆｌ ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｎｄＲｅｌａｔｅｄ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎ ｉｑｕｅｓ、　Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｅｓ ｓ、　ｐｐ、２１５−２２４）を５０％ＦＣ３，５０％ブロッキング緩衝液中で ｔ　：　５ｏｏｏに希釈し、１００μｌ／ウエルて添加した。３７°Ｃで２時間 インキュベートしたのち、プレートをＱ、０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで 再び２回洗浄した。基質オルトフェニレンジアミン（ＯＰＨ）を基質緩衝液（０ ，３６％クエン酸Ｈ，０，１，７４％ＮａｚＨＰＯ４”　７Ｈ，０゜０、１％チ メロサール、０．４％ＨｔＯｔ、　Ｉ）８６．３）中０．２％濃度で１００μｌ ／ウエルで添加した。室温で２０分後に２Ｎ　Ｈ２ＳＯ，５０μｌ／ウエルを用 いて反応を中断させた。４９０ｎｍにおける吸光度を読み取った。

１１．２．　ＣＲＩコード配列の遺伝子修飾ＣＩ？Ｉ　ｃＤＮＡは約６．９５１ 　ヌクレオチド塩基対から構成される（第１図、上記の第６および７節）。天然 型ｃＤＮＡの翻訳停止シグナルは塩基対６１４５に位置する。このタンパク質は 、細胞膜の外表面に露出された４個の長い相同性反復（ＬＨＲ）プラス約２５ア ミノ酸の膜に及ぶドメイン、これに続く細胞質内に伸びるカルボキシル末端領域 から構成された膜結合レセプター分子である。この細胞質ドメインは４３アミノ 酸から構成される。可溶性ＣＲ１分子（ｓｃＲｌ）の産生に用いた戦略は、細胞 膜にタンパク質を固定する膜貫通領域を除去し、次いで切りつめられた構築物を 分泌ポリペプチドとして発現させることであった。

１１．２．１．　ｐＢｓｃＲｌｃの形式プラスミドｐＢＳＡＢＣＤ（上記の実施 例８）はヌクレオチド１−６８６０からのＣＲＩ　ｃＤＮＡを含有し、非翻訳配 列３′からヌクレオチド６８６０におけるＥｃｏＲＶ部位を有しない。

ＣＲＩ　ｃＤＮＡは膜貫通ドメインの開始から２９塩基離れた、塩基対５９１４ における独特な制限ヌクレアーゼ認識部位を有する。ｐＢＳＡＢＣＤをまずＢａ ｌ［で消化してフラッシュ末端を有する線状分子を生成させ、次いてＴ４　ＤＮ Ａリガーゼを用いて下記の配列を有する２個の３８ヌクレオチド相補鎮からなる 合成オリゴヌクレオチドに連結した。

５°：ＣＣＡＡＡＴＧＴＡＣＣＴＣＴＣＧＴＧＣＡＣＡＴＧＡＴＧＣＴｔａａＣ ＴＣＧＡＧ３’　：ＧＧＴＴＴＡＣＡＴＧＧＡＧＡＧＣＡＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣ ＧＡＡＴＴＧＡＧＣＴＣ生成した分子は回復されたＢａ１１部位および膜貫通ド メインの開始点におけるアラニン残基まで（これを含む）の天然型ＣＲＩ配列を 再生する変化した配列を有していた。これに加えて、翻訳停止シグナル（下記場 合で及び上で下線つき）はアラニンの直後に挿入されており、続いて変化したｃ ＤＮＡのサブクローニングを容易にするＸｈｏ　Ｅ制限部位かあった。

このプラスミドのＸｈｏ　Ｉ消化（消化されたｐＢｓｃＲｌｃ）は、ｃＤＮＡの オリゴヌクレオチド付加ＸｈｏＩ部位およびＣＲＩｃＤＮＡの５′末端における ｐＢＳＫＳ＋■多重クローニング部位のＸｈｏ　［部位において切断することに よりｃＤＮＡ挿入物（消化された５ｃＲ１ｃ）を切出した。ｐＢｓｃＲｌｃは下 記のＮ−末端配列を含有する。

塩基Ｎα５９１１　：　ＣＴＧＧＣＣＡＡＡＴＧＴＡＣＣＴＣＴＣＧＴＧＣＡＣ ＡＴＧＡＴＧＣＴＴＡＡＣＴＣＧＡＧアミノ酸：　ＬＡＫＣＴＳＲＡＨＤＡ　末 端Ｘｈｏ１部位１１．２．２．　ｐＢｓｃＲｌの形成 膜貫通領域を有しない第２の５ｃＲ１構築物を次のようにして生成させた。ｐＢ ＳＡＢＣＤをＳａｃ　Ｉで消化した。これはＣＲＩ　ｃＤＮＡのヌクレオチド塩 基対５４８５における独特な５ａｃｒ部位およびＣＲＩ　ｃＤＮＡの３゛末端に 位置する宿主プラスミドの多重クローニング部位のＳａｃ　Ｉ部位において切断 する。この消化はｃＤＮＡの３°末端から１３７５ヌクレ才チドのＤＮＡ配列の 切出しを生じさせた。次いでこのフラグメントを電気泳動により除去した。残り の５ｃＲ１ｃＤＮＡを含有する生成プラスミドの露出末端を、Ｔ４　ＤＮＡポリ メラーゼを用いてフラッシュとなし、プラント末端連結を行った。Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ翻訳ターミネータ−（力知グ＃２７−４８９０−０１．　Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ、Ｉｎｃ、、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）、３つのすべての読枠中に 翻訳終止シグナルを含有する自己相補性オリゴマーも、連結に含まれていた。連 結に際して、挿入されたオリゴマーは５ｃＲ１ｃＤＮＡについての新たな翻訳停 止シグナルを提供した。

１１．２．３．　ｐＢＭ−ＣＲｌｃの形成ｐＢＭ７３Ｘは、ヒトメタロチオネイ ン−ＩＡ遺伝子を含有する真核発現ベクター（Ｋｒｙｓｔａｌ、　Ｍ、ら、１９ ８６．　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８３：２７０９−２７１３ ）であり、この遺伝子は重金属例えばカドミウムの増加レベルに対する抵抗性を 細胞に与える。このベクターはまた、Ｍｔ−１タンパク質に関する開始コドンの 前にある遺伝子操作されたＸｈｏ１部位を含有するマウスメタロチオネイン−１ 遺伝子を含む。このＸｈｏ　１部位はマウスＭｔ−１プロモーターの割面下での 遺伝子発現に関する挿入部位として用いられる。

ｐＢｓｃＲｌｃからＸｈｏｌを用いて５ｃＲ１ｃ挿入物（約５．９　ｋｂ）を切 出し、次いてベクターｐＢＭＴ３Ｘの独特なＸｈｏ１部位に連結した。ｐＢＭＴ ３Ｘ中のｃｃＲＩｃの正しい方向を制限消化により測定した（Ｍａｎｉａｔｉｓ 、　Ｔ、ら、１９８２．　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂ ｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｆ（ａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏ ｒｋ）。生成したプラスミドをｐＢＭ−ＣＲＩＣと命名した。

１１、２．４．欠失組換え体ｐＴ−ＣＲ１ｃｌ、ｐＴ−ＣＲｌｃ２、ｐＴ−ＣＲ ｌｃ３、ｐＴ−ＣＲｌｃ４およびｐＴ−ＣＲｌｃ５の形成５ｃＲ１ｃＤＮＡのタ ンパク質を特異的に欠失した種々の欠失組換え体も構築された（第２０図）。各 欠失組換え体は完全長ｃＤＮＡの膜貫通領域を欠いていたので、組換え体の発現 は可溶性ポリペプチドを生じさせるてあろう。

１１．２．４．１．　ｐＴ−ＣＲｌｃｌｐＢｓｃＲｌｃをＳｍａ　［で消化して 大きさ２．５６ｋｂおよび７．３ｋｂの２個のフラグメントを生成した。これら のフラグメントをアガロースゲル電気泳動により分離し、７．３ｋｂフラグメン トを精製してそれ自体に連結した。Ｅ、ｃｏｌｉＤＨ５（２細胞をコンピテント となしくＭｏｒｒｉｓｏｎ、　Ｄ、Ａ、。

１９７９、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　６８：３２６−３３１）、次いて 連結混合物で形質転換した。生成したプラスミドを１）ＢＬ−ＣＲｌｃｌと命名 した。この構築物はＣＲ１ｃ挿入物のＬＨＲ−８３８％、ＬＨＲ−Ｃ１００％お よびＬＨＲ−Ｄ　５１％を除去した。さらに、これは接合部２３３５／４８９４ ｂｐてＳｍａ　ｒ部位を再生し、正しい翻訳枠を保持していた。ｐＢＬ−ＣＲｌ ｃｌをＸｈｏｌて消化し、ＣＲＩ挿入物をｐＢ１ｅＵｓｃｒｉｐｔ■ベクターか ら分離した・単離されたＣＲＩフラグメントを次いて発現ベクターｐＴｃｓｇｐ ｔの独特なＸｈｏ１部位中に挿入してプラスミドｐＴ−ＣＲ１ｃｌを生成した。

１１．２．４．２．　ｐＴ−ＣＲ１ｃ２ｐＢｓｃＲ１ｃをＣ１ａｌおよびＢａ１ ｌて消化して大きさ３．９６ｋｂおよび５．９ｋｂの２個のフラグメントを生成 した。これらのフラグメントをアガロースゲルから精製した。プラスミドｐＢＲ ３２２をＣ１ａｌおよびＢａ１Ｉて消化し、２．９ｋｂｐＢＲ３２２フラグメン トを精製し、ｐＢｓｃＲｌｃからの５．９ｋｂフラグメントに連結した。Ｅ、Ｃ ０１ｉ　ＤＨ５α細胞を連結混合物で形質転換し、生成したプラスミドをｐＢＲ ８，８と命名した。このプラスミドをＸｂａ　［で消化し、大きさ７．４５ｋｂ および１．３５ｋｂの２個のフラグメントを生成した。

７、４５ｋｂフラグメントをアガロースゲルから精製し、それ自体に連結させた 。生成したプラスミドｐＢＲ７，４５をＣａ１ｌおよびＢａ１Ｉで消化し、５ｃ Ｒ１ｃＤＮＡを含有する単離された４、　５　ｋｂフラグメントをｐＢｓｃＲｌ ｃからの３．９６ｋｂフラグメントに連結し、プラスミド１）ＢＬ−ＣＲｌｃ２ を生成した。二の構築物はＬＨＲ−８９０％を５ｃＲ１挿入物において除去して おり、接合部１６３７／２９８７ｐｂでＸｂａ　［部位を再生し、正しい読伜を 保持していた。ｐＢＬ−ＣＲｌｃ２をＸｈｏｌで消化し、５ｃＲ１挿入物をｐＢ １ｅｕｓｃｒｉｐｔ■ベクターから分離した。単離された５ｃＲ１フラグメント を次いて発現ベクター　ｐＴＣ３ｇｐｔの独特なＸｈｏ　１部位に挿入し、プラ スミドｐ’ｒ−ＣＲ１ｃ２を生成した。

１１．２．４．３．　ｐＴ−ＣＲＩｃ３ｐＢｓｃＲ１ｃをＮ５ｉｌて消化して大 きさ１．０９ｋｂ、　１．３５ｋｂおよび７．４６ｋｂの３つのフラグメントを 生成した。７．４６ｋｂフラグメントをアガロースゲルから精製し、それ自体に 連結させ、プラスミドｐＢＬ−ＣＲ１ｃ３を生成した。この構築物はＬＨＲ−Ａ の７７％およびＣＲＩ挿入物の残りを除去していた。Ｎ５ｉｌ部位を接合部４６ ３／２９０７ｐｂて再生した。

ナンセンスコドンを再生されたＮ５ｉｌ部位のすぐ後に導入することにより翻訳 枠を修飾した。ｐＢＬ−ＣＲｌｃ３をＸｈｏｒで消化し、５ｃＲ１挿入物をｐＢ ｌｅｕｓｃｒｉｐｔ■ベクターから分離した。挿入された５ｃＲ１フラグメント を次いで発現ベクターｐＴＳＣｇｐｔの独特なＸｈｏ　１部位に挿入し、プラス ミドｐＴ−ＣＲ１ｃ３を生成した。

１１．２．４．４．ｐＴ−ＣＲ１ｃ４ ｐＢｓｃＲ１ｃをＰｓｔｌで消化した。ｐＢ１ｅｕｓｃｒｉｐｔ■のポリリンカ ーのＰｓｔｒ部位は、このベクターにＣＲＩ　ｃＤＮＡを連続する際に除去され ていた（上記の実施例８．１）。生成した大きさ１．３５ｋｂおよび８．５　ｋ ｂのフラグメントをゲル電気泳動により分離し、８．５　ｋｂフラグメントを精 製し、それ自体に連結させ、プラスミドｐＢＬ−ＣＲ１ｃ４を生成した。この構 築物はＬ）ＩＲ−Ａの３１％および５ｃＲ１挿入物のＬＨＲ−Ｂの６９％を除去 した。Ｐｓｔ１部位を接合部１０７４／２４２４ｐｂて再生させ、こうして正し い読枠を保持させた。

１）ＢＬ−ＣＲ１ｃ４をＸｈｏｌて消化し、５ｃＲ１挿入物をｐＢｌｅｕｓｃｒ ｉｐｔ■ベクターから分離した。単離された５ｃＲ１フラグメントを次いで発現 ベクターｐＴＣ３ｇｐｔの独特なＸｈｏ　Ｉ部位に挿入してプラスミドｐＴ−Ｃ Ｒ１ｃ４を生成した。

１１．２．４．５．　ｐＴ−ＣＲ１ｃ５ｐＢＬ−ＣＲｌｃｌをＳｍａ　Ｉで消化 し、こうしてこのプラスミドを独特なＳｍａＩ部位で線状にした。このプラスミ ドを脱ホスホリル化し、ナンセンスコドン（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａ ｂｓ、　Ｂｅｖｅｒｌｅｙ、　ＭＡ）を含有するホスホリル化Ｎｈｅｌリンカ− に連結した。この型のリンカ−は３つのすへてのありうる読枠中に翻訳停止コド ンを含有し、Ｎｈｅｌ制限部位をも含有し、これは５ｃＲ１ｃＤＮＡ中のナンセ ンスリンカ−の存在の確認を容易にする。ｐＢＬ−ＣＲ１ｃ５をＸｈｏ　Ｉで消 化し、５ｃＲ１挿入物をｐＢ１ｅｕｓｃｒｉｐｔ＠ベクターから分離した。単離 された５ｃＲＩフラグメントを次いて発現ベクターｐＴＣ５ｇｐｔの独特なＸｈ ｏ　１部位に挿入してプラスミドｐＴ−ＣＲＩｃ５を生成した。

１１、３．可溶性ＣＲＩの発現 ここに示すように、細胞から高収率て分泌させることのできるＣＲＩの可溶性形 の発現は、（ｉ）欠失または切りつめのために使用するＣＲＩ　ＤＮＡ中の１つ のその位置に限られず、そして（ｉｉ）特別の発現ベクターの使用にも限定され ない（下記参照）。分？＆５ＣＲ１を産生ずる能力は２つの異なる発現系におい て示された。

）１１３．１９発現ベクターのｐＴＣＳンリーズの形成用いられた発現ベクター のｐ’ｒｃｓシリーズは３つのプラスミドから成り、それぞれはｃＤＮＡの挿入 のための独特なＸｈｏＩクローニング部位を有する（第２１図）。挿入されたｃ ＤＮＡの転写は１組のタンデムプロモーターにより誘導される。ＳＶ４０初期プ ロモーターはアデノウィルス２主要延期プロモーター（ＡＤ２　ＭＬＰ）の上流 に位置する。ｃＤＮＡの初めとＡＤ２　ＭＬＰの間にはアデノウィルス３分節系 リーダーかある。転写されたｍＲＮＡは、Ｘｈｏ［ｃＤＮＡクローニング部位の 下流に位置するマウス免疫グロブリンカッパ（Ｉｇに）配列により供給されたポ リアデニル化シグナルで停止される。選択可能なマーカーであるキサンチン−グ アニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）　、ジヒドロ葉酸レダクタ ーゼ（ｄｈｆｒ）またはネオマイシン耐性（ｎｅｏつはそれぞれｐＳＶ２ｇｐｔ 　、　ｐＳＶ２ｄｈｆｒまたはｐｓＶ２ｎｅＯからの対応するマーカーの挿入に より供給された。これらのプラスミドは、アンピシリン耐性についての複製およ びベーターラクタマーゼ遺伝子の細菌系の源でもあった。一般に、これらのベク ターのうちどれを選んで使用するかは、との選択可能なマーカーまたはマーカー の組合せが組換体の選択に好ましいかの如何による。

完全なりＮＡ配列ハアデノウィルス２　（ＡＤ２）　、ＳＶ４０、ｐｓＶ２ｃａ ｔ（Ｇｏｒｍａｎ、　Ｃ，、１９８５，ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｖｏｌｕｍ ｅ　ＩＩ。

Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、ｅｄ、Ｄ、Ｍ、Ｇｌｏｖｅｒ、Ｉ ＲＬ　Ｐｒｅｓｓ。

ｐｐ、　１４３−１９０）およびマウス免疫グロブリンカッパについて知られて いる。配列はＧｅｎＢａｎｋ■データベースおよびＮａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｍ ｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈの注解および参考文献中にある。これらの配列 のいずれもかｐ’ｒｃｓベクターの適切なセグメントのための源として役立つ。

ベクター１）ＴＣＳｇｐｔ、　ｐＴｃｓｎｅｏおよび９ＴＣ８ｄｈｆｒは中間体 プラスミドｐＥＡＸｇｐｔおよびｐＭＬＥｇｐｔから下記のようにして形成した 。

１１．３．１．１．　ｐＥＡＸｇｐｔの形成階段１　、　Ａｄ２　ＭＬＤ　ＮＤ ＡフラグメントをＭ２Ｓ　ｍｐ　９　／ＭＬＰから誘導した（Ｃｏｎｃｉｎｏ、 　Ｍ、Ｆ、ら、１９８３．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

２５８：８４９３−８４９６）。このプラスミドは、ヌクレオチド６０６９にお けるＰｖｕ　ＩＩ制限部位およびヌクレオチド５７９１におけるＳａｃ　Ｉｆ部 位を含むヌクレオチド５７７８（Ｘｈｏ１部位）ないし６２３１　（ＨｉｎｄＩ ［［部位）のアデノウィルス２配列を含有する（ＮＢＲＦ　Ｎｕｃｌｅｉｃデー タベース、受入れ＃Ｇｄａｄ２参照）　、　ＸｈｏｌないしＨｉｎｄｌＩｒフラ グメントをＭ１３ｍｐ９のＨｉｎｄＩＩＩおよび５ａｉｌ部位中にクローニング してプラスミドＭ１３　ｍｐ　９　／ＭＬＰを生成した。

プラスミドＭ１３　ｍｐ　９　／ＭＬＰをＥｃｏＲ［およびＨｉｎｄＩ［Ｉて消 化し、フラグメントを含有するより小さいＭＬＰを単離した。ｐＵＣプラスミド （Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｉｎｃ、、Ｐｉｓｃａｔｗａｙ。

ＮＪ）もＥｃｏＲ［およびＨｉｎｄｌｌ［て消化し、このプラスミドからのより 大きいフラグメントを次いでＥｃｏＲ［ないしＨｉｎｄＩＩＩ　ＭＬＰフラグメ ントに連結した。これはｐＵｃのプラスミドバックボーンを有する新規なＭＬＰ 含有プラスミドを生成した。このプラスミドをＳｍａ［で消化し、５ａｉｒリン カ−に連結し、再び環状化した。次いてこの新規なプラスミドをＰｖｕ　Ｋて消 化し、これはプラスミドをアデノウィルス２挿入配列内の位置＃６０６９に位置 するＰｖｕ　Ｍ部位で開裂した。生成した線状フラグメントをＸｈｏｌリンカ− に連結し、再び環状化した。次いで二のプラスミドをＸｈｏ　Ｉおよび５ａｉｌ で消化し、ＭＬＰ　ＤＮＡを含存するより小さいフラグメントを単離した（フラ グメント＃ｌ）。

段階２．プラスミドｐＳＶ２ｇｐｔ　（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔ ｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）受託ｋ　３７１４５　）をＰｖｕ　 Ｋて消化し、５ａｉｌリンカ−に連結し、５ａｌｌで消化した。最終生成物は、 ｇｐｔ遺伝子源として役立つ線状ｐｓＶ２ｇｐｔフラグメントてあった（フラグ メント＃２）。

段階３．マウス免疫グロブリンＩｇにフラグメント（Ｈｉｅｔｅｒ。

Ｐ、　Ａ、ら、１９８０．　Ｃｅ１ｌ　２２：１９７−２０２）をＨｉｎｄＩＩ ［およびＡｖａ　ＩＩで消化し、ポリアデニル化配列を含有するフラグメントを 単離した。ＮＢＲＦ　Ｎｕｃｌｅｉｃデータベース（受託＃にｃｍｓ　）て入手 できるマウスｒｇカッパ配列には、１ｇ停止コドンが位置１２９６にあり、続い て１３０６にＡｖａｌＩ部位、Ｉ４８４にＡＡＴＡＡＡポリアデニル化部位およ び１７１４にＨｉ　ｎｄＭＬ部位かある。このフラグメントのオーバー／’％ン グ端をＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼで充填し、次いてこのフラグメントを Ｘｈｏｌリンカ−に連結し、Ｘｈｏｌて消化した。このフラグメント（フラグメ ント＃３）はポリアデニル化部位源とし役立った。

段階４．フラグメント１，２および３をＴ４　ＤＮＡリガーゼにより一緒に連結 し、環状プラスミドを生成した。

このプラスミド中のフラグメントの正しい方向は制限酵素分析により確認された 。Ｘｈｏｌ　ｃＤＮＡクローニング部位の下流にはマウスカッパポリアデニル化 部位があり、この部位からさらに下流にはＳＶ４０プロモーターおよびｇｐｔ遺 伝子があった。Ｘｈｏ［部位の上流にはＭＬＰプロモーターかあり、このプロモ ーターからさらに上流には細菌由来の複製およびアンピシリン遺伝子かあった。

次いでこのプラスミドを５ａｌｌで消化し、オーバーハング端をＥ、ｃｏｌｉ　 ＤＮＡポリメラーゼで充填した。生成したプラントエンドフラグメントをＥｃｏ ＲＩ　リンカ−に連結し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼて再び環状化した。この最終プ ラスミドをｐＥＡＸｇｐｔ　と命名した。

１１．３．１．２−　１）ＭＬＥｇｐｔの形成段階ｌ、プラスミドｐＭＬＰ　Ｃ ＡＴ　（Ｌｅｅ、　Ｒ，Ｆ、ら、１９８８゜Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　１６５：５Ｏ −５６）はｐＭＬベクターバックグランドを有する発現プラスミドてあり、アデ ノウィルス２ＭＬＰおよびＣＡＴ遺伝子の５“側の３分節系リーダー配列を含有 する。ｐＭＬＰ　ＣＡＴをＸｈｏ　ｒおよびＳａｃ　ＩＩて消化した；Ｘｈｏｌ はＣＡＴ遺伝子と３連リーダーのＬ３領域との間の部位で切断し、そして５ａｃ ＩＩはアデノウィルスＤＮＡ内の位置＃５７９１で、ただしＭＬＰの５゛て切断 する。こうして、ＡＤ２　ＭＬＰおよび３分節系リーダーはこの小さいＸｈｏ　 ｒ上にＳａｃ　ＩＩフラグメントまで位置した（フラグメント＃４）。

段階２．ブラスミｔ”ｐＥＡＸｇｐｔをＸｈｏｒおよび５ａｃＩ［テ消化し、フ ラグメントを含有するより小さいＭＬＰを捨てた。より大きいフラグメント（フ ラグメント＃５）を単離した。５ａｃＩ［およびＸｈｏ［末端の両方を有するフ ラグメント４および５を連結してプラスミドｐＭＬＥｇｐｔを生成した。

１１．３．１．３．　ｐ’ｒｃｓｇｐｔの形成段階１．　ｐＭＬＰＥｇｐｔを５ ａｃｌＩで消化し、末端をＴ４　ＤＮＡポリメラーゼで充填し、プラントエンド フラグメント（フラグメント＃６）を生成した。このＳａｃ　Ｋ部位はアデノウ ィルス２配列中のヌクレオチド５７９１にＭＬＰ−３分節系リーダーの５′に位 置する。

段階２　、ｐＳＶ２　ｄｈｆｒ　（ＡＴＣＣ受託に３７１４６）をＨｉｎｄＩＩ ＩおよびＰｖｕ　Ｉ［で消化した。ＳＶ４０初期プロモーターを含有するより小 さな３４２ヌクレオチドフラグメントを、Ｅ。

ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼのフレノウフラグメントを用いてプラントエンド とした（フラグメント＃７）。フラグメント６および７をＴ４　ＤＮＡリガーゼ で連結した。制限酵素分析により、これらのフラグメントは正しく配向して、Ｘ ｈｏＩ　ｃＤＮＡクローニング部位の上流に２個のタンデムプロモーターを与え 、各プロモーターは同じ方向へのＲＮＡ合成を誘引できることが確認された。こ のプラスミドはｐＴｃｓｇｐｔと命名された（第２２図）。

１１．３．１．４．　ｐＴＣ３ｄｈｆｒの形成段階１　、ｐＳＶ　２　ｄｈｆｒ をＨｉｎｄｌＩｒおよびＰｖｕ　Ｉｆて消化し、次いでより大きいフラグメント をアガロースゲルから精製した（フラグメント＃８）。より小さいＳＶ４０初期 プロモーター含有フラグメントを捨てた。

段階２．　ｐ’ｒｃｓｇｐｔをＥｃｏＲＩで消化し、次いでＥ、ｃｏｌｉＤＮＡ ポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントで充填してプラントエンドを生成した 。次いでこの線状フラグメントをＨｉｎｄＩＩ［て消化し、ＳＶ４０プロモータ ーのｐ’ｒｃｓ転写ユニット、ＭＬＰ、３分節系リーダー、Ｘｈｏｌ　ｃＤＮＡ クローニング部位、マウス［ｇλ配列および第２のＳＶ４０プロモーターを含有 するフラグメント（約１６００ヌクレオチド）を単離した（フラグメント＃９） 。このフラグメントは１個のフラッシュエンドおよび１個のＨｉｎｄＩＩＩオー バーハングエンドを育した。フラグメント８および９の連結はプラスミドｐＴＣ ５ｄｈｆｒを生成した。

１１．３．１．５　ｐＴｃｓｎｅｏの形成段階１　、ｐＳＶ２　ｎｅｏ　（ＡＴ ＣＣＮＣＬ３７１４９）をＨｉｎｄＩＩｒおよびＢａｍＨＩで消化し、より大き いフラグメント（フラグメント＃ｌＯ）を単離した。このフラグメントはプラス ミドバックグランドおよびｎｅｏ遺伝子を含有していた。

段階２．　ｐＴｃｓｄｈｆｒをＨｉｎｄｌＩ［およびＢａｍＨＩて消化し、ｐ’ ｒｃｓ転写ユニット（フラグメント＃１１）を消化生成物の電気泳動ののちアガ ロースゲルから単離した。フラグメント１０および１１の連結はプラスミドｐＴ ＣＳｎｅｏを生成した。

１１、３．２．　プラスミドＩ）ＢＳＣＲｌｃ、　ｐＢｓｃＲｌｓおよびｐＢＭ −ＣＲｌｃの発現およびアッセイ、可溶性ＣＲＩクローニング配列を含有する哺 乳類発現ベクター１１．３．２．１．　ＣＲＩ　ｃＤＮＡ内の異なる位置で切り つめられたＣＲＩ構築物の発現 プラスミドｐＢｓｃＲ１ｃおよびｐＢｃｓＲｌｓを形成しく上記の第１１．１節 ）、膜貫通および細胞質内領域を除いて大部分のｃＤＮＡコード領域を保存する ようにした（第２０図）。

ｐＢｃｓＲｌｓは、ＬＨＲ−Ｄの一部分およびｐＢｓｃＲｌｃに存在する５ＣＲ ｓ２９および３０を欠くので、ｐＢｓｃＲｌｃよりも短い。

これらのプラスミドの５ｃＲ１部分をｐＴｃｓｇｐｔ中に挿入し、次いで上記の ようにしてトランスフェクションおよび発現を行った。

ｐＢｓｃＲＩｃ／ｐＴＣＳｇｐｔ構築物：　ｐＢｓｃＲｌｃをＸｈｏ［で消化し て５．９ｋｂ挿入物を５ｃＲ１ｃを生成した。５ｃＲ１ｃ　ＧｐＴＣ３ｇｐｔの Ｘｈｏｌ　ｃＤＮＡクローニング部位中に挿入して１）ＢＳＣＲ１ｃ／ｐＴＣＳ ｇｐｔを生成した。

ｐＢｓｃＲ１ｓ／ｐＴＣ３ｇｐｔ構築物：　ｐＢｓｃＲｌｓをＸｈｏ　Ｉおよび Ｐｖｕ　１で消化して５ＣＲＩＳ挿入物を放出させた。この挿入物の両端をＴ４ 　ＤＮＡポリメラーゼでプラントにした。この挿入物をアガロースゲルから精製 した。ベクターｐＴＣ３ｇｐｔをＸｈｏＴで消化し、オーバーハングＸｈｏｌエ ンドをＥ、ｃｏｌｉＤＮＡポリメラー゛ゼＩで充填した。次いて５ＣＲＩＳ挿入 物をプラントエンドベクターに連結してｐＢｓｃＲＩｓ／ｐＴＣＳｇｐｔを生成 した。

プラスミドｐＢＳＣＩ？Ｉｃ／ｐＴＣＳｇｐｔおよびＩ）ＢＳＣＲＩｓ／Ｉ）Ｔ ＣＳｇｐｔをＦｓｐｌで消化し、生成した線状ＤＮＡをチャイニーズハムスター 卵巣細胞中にトランスフェクションし、この細胞はプラスミドｐＳＶ　２　ｄｈ ｆｒとのリン酸カルシウム共沈によるｄｈｆｒ遺伝子中の組換え体（ＣＨＯＤＵ Ｘ　Ｂｌｌ細胞）であった。トランスフエクタントをＤＨＰＲ選択培地中てのそ の増殖能により選択した。トランスフェクタントクローンの培養物上清をＥＬ／ ＩＳＡにより選択された５ｃＲ１についてアッセイした。５０のｐＢｓｃＲ１ｃ ／ｐＴＣ３ｇｐｔ組換え体からの培養物上清をアッセイし、陽性組換え体を漸増 濃度のメトトレキセート中ての培養による増殖方法によって取出した。さらに、 トランスフェクタントのプールを、各プールにつき８個のｐＢｓｃＲ１ｃ／ｐＴ ＣＳｇｐｔ　トランスフェクタントを一緒に培養し、同じ増幅方法によりそれら を担持させることによって作製した。増幅の結果を第■表に示す。

（重責以下余白） 第■表 ｐＢｓｃＲｃｌ／ｌ）ＴＣＳｇｐｔの発現プール Ｄ　＜０．０２　＜０．０２ 本５ｃＲ１の大規模産生のためにクローン２および３５を選択した。

＋クローン３５を希釈を限定することによりサブクローニングし、各サブクロー ンについて可溶性ＣＲＩの産生を測定した。９ＢＳＣＲ１ｃ／ｐＴＣ８ｇｐｔ− クローン３５．６はより高い産生体で１７．７μｇ／ｍｌ５ｃＲ１を示した。

ＭＴＸ　：メトトレキセート ｐＢｓｃＲ１ｓ／ｐＴＣＳｇｐｔからの１２の組換え体をＥＬＩＳＡにより可溶 性ＣＲＩの産生についてアッセイした。１２のすべての候補は認めうるレベルの 分泌５ｃＲ１を示した。最良の産生体は、最良のｐＢｓｃＲｃｌ／Ｉ）ＴＣＳｇ ｐｔ　トランスフエクタントにより産生されたものに匹敵する５ＣＲ１レベルを 生じた。

１）ＢＳＣＲ１ｃ／ｐＴＣ３ｇｐｔおよびｐＢＳＣＲ１ｓ／Ｉ）ＴＣ３ｇｐｔ組 換え体は可溶性ＣＲＩを同様の産生レベルで産生じた。これは可溶性ＣＲＩポリ ペプチドの産生能かＣＲＩ　ｃＤＮＡ内のその切りつめた点に依存しないことを 示した。

細胞系を増幅する最初の試み、５００ｎｍメトトレキサートを越えたクローン３ ５．６は成功しなかった。この理由のために、他の細胞系が表■に示されたパネ ルから探された。候補はクローン３５に相当する発現に基づいて選ばれた。発現 が高原状態になり始めるメトトレキセートレベルで、系はサブクローンされ上滑 上の５ＣＲ１濃度をスクリーンした。５０ｎｍメトトレキサートに耐性のある細 胞系１５はこれに基づき選ばれた。それをサブクローンし、細胞系１５．１９を 創り出し、発現を３５．６レベルまで増大した。次に１５．１９を種々の濃度の メトトレキサートを含有する培地中で培養した。２５００ｎｍメトトレキサート だけがｓＣＲ発現レベルの増大を生じ、±の３５．６より６３％分泌を増加した 。１５．１９２５００と命名された、この細胞系は次に限定された希釈によりサ ブクローンされ細胞系１５．１９２５００．０７．１５．１９２５００．１０お よび１５．１９２５００．６５を創った。これらの細胞系は３５．６よりもｍ１ 当りの５ｃＲ１をそれぞれ１４３．１１９、および１０３Ｖ５多く産生じた。

１１．３．２．２．二つの異なる形質発現系中の５ｃＲ１ｃの形質発現 切形ＣＲＩ　ｃＤＮＡ挿入物である５ｃＲ１ｃを発現ベクター１）ＴＣ３ｇｐｔ 中に挿入し、上記のように発現した。また、それを比２．３項に記載のようにし て発現ベクター９８ＭＴａＸ中に挿入してｐＢＭ−ＣＲｌｃを生じた。これら両 方の発現ベクターは、非常に強いプロモーターを育する。一つの系か分泌ポリペ プチドの一層良好な産物を生じるが否かを決定するため、可溶性ＣＲＩの発現を 両方の系中て試験した。

Ｃｌ２７Ｌｖウス細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ１６１６、Ｒｏｃｋｖｉ　ｌｉ ｅ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ）を、リン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍ、　Ｆ、Ｌ、及びｖ ａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　Ａ、Ｊ、、１９７３．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２巻、４ ５６−４６７）を用いてｐＢＭ−ＣＲｌｃてトランスフェクションした。グリセ ロールショック後に、細胞を１０％ウシ胎児血清及び２ｍＭのし一グルタミンを 含むＤ−ＭＥＭ培地を再度供給し、３７°Ｃて４８時間インキュベートした。そ の後、細胞をトリプシン処理し、完全Ｄ−ＭＥＭ培地＋ＩＯμＭの塩化カドミウ ム中に１＝５及び１：ｌＯの比で分割した。カドミウム耐性コロニーが１０日以 内に現われた。１０のコロニーをクローニングシリンダーの使用により取り出し た。

夫々のコロニーを、完全Ｄ−ＭＥＭ培地を含む６０士のペトリ皿に移し、細胞が 集密に達するまで３７°Ｃ，５％ＣＯ□でインキュベートした。その後、夫々の 皿に関し、細胞をトリプシン処理し、３個の６０皿の皿に分けて、凍結細胞株の 調製、ＲＮＡ抽出、分泌５ｃＲ１ｃの存在に関する細胞培地のＥＬＩＳＡ試験に 使用した。

夫々の集密ペトリ皿から細胞培地を取り出しＥＬＩＳＡ分析にかけた時、試験し た全てのｐＢＭ−ＣＲ１ｃＲ１−ンは可溶性ＣＲＩ生産に関して陽性であった。

ｐＢＭ−ＣＲｌｃ組換え体からの分泌５ｃＲ１のレベルはｐＢｓｃＲ１ｃ／Ｉ） ＴＣ３ｇｌ）を組換え体からの分泌量に匹敵した。これは、高レベルの分泌５ｃ ＲＩポリペプチドを生産する能力が或種のプロモーターまたは形質発現系のみの 使用に依存性でないことを示した。

１１．３．３．可溶性ＣＲＩ　コード配列を含有する補乳類の発現ベクター、プ ラスミドｐＴ−ＣＲＩｃｌ、ｐＴ−ＣＲｌｃ２、ｐＴ−ＣＲｌｃ３、ｐＴ−ＣＲ ｌｃ４、及びｐＴ−ＣＲｌｃ５の形質発現及び分析アッセイ 欠失変異体のｐＴ−ＣＲＩｃシリーズは、構成物ｐＢｓｃＲ１ｃ及びｐＢｓｃＲ ｌｓのように、膜貫通及び細胞質ドメインを失っていた。加えて、欠失変異体は ＣＲＩ　ｃＤＮＡの種々のＬＨＲ領域のかなり大きな欠失をも含んでいた（第２ ０図参照）。欠失変異体をＣＨＯＤＵＸ　Ｂｌｌ細胞中で発現し、生産された可 溶性ＣＲＩポリペプチドのレベルを測定した。

夫々の欠失構成物に関し、クローンの４０の異なるプールを、可溶性ＣＲＩポリ ペプチドが生産されているか否かを測定するＥＬＩＳＡ分析のために選択した。

５つの１）Ｔ−ＣＲｌｃ全での構築物はＥＬｒＳＡまたは細胞培地中の機能活性 の存在のいずれかにより測定され、５ｃＲ１を細胞培地に分泌していることかわ かった。５つの１）Ｔ−ＣＲ１ｃ構築物のうちの４つによりトランスフェクショ ンされた細胞からの上溝は、溶血アッセイにより測定されるように機能がある５ ｃＲ１を生産していた（上記第■表及び１３．２項参照）。

（重責以下余白） 第■表 ｐＴ−ＣＲｌｃ４　＋　測定せず ６　ＥＬｒＳＡまたは溶血分析に関して試験した上溝はＴ７５フラスコ中または ２４ウ工ル皿中で増殖する培養物から得た。種々の量の可溶性ＣＲＩはこれらの 条件下で培養上溝中に累積し得たので、示された結果は定性的である。（＋）は 、示された分析により検出される機能のある５ｃＲ１の生産を示す。

欠失変異体がまた可溶性ＣＲＩを生産し得たという事実は、５ｃＲ１を発現する 能力かＣＲＩ　ｃＤＮＡの一つの正確な遺伝的改変に依存しないことを更に示し た。膜内外領域が欠失された限り、全ての構成物は可溶性ポリペプチドを生産し 得た。

１２、実施例：可溶性ＣＲＩの生産及び精製多量の５ｃＲ１を中空繊維バイオリ アクター系中で生産した。得られた５ｃＲ１の量は、接種した組換えクローンの 相対収量に比例していた。最適の精製結果のために、多量の外部から添加される ウシ胎児血清ポリペプチドの非存在下で５ｃＲ１の高い生産量を生じる血清を含 まない培地を選択した。

１２．１．可溶性ＣＲＩの大規模生産 モデルＩＶ−Ｌ中空繊維バイオリアクター（３０ｋＤ分子量力ットオ））を備え たＣｅｌｌ−Ｐｈａｒｍ、商標、細胞培養系Ｉ　（ＣＤ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｉｎ ｃ、　Ｍｉａｍｉ　Ｌａｋｅｓ、　ＰＬ）を無菌条件下で組立てた。二種のクロ ーン（ｐＢｓｃＲ１ｃ／ｐＴＣ３ｇｐｔのクローン２及びクローン３５）を８個 のＴ−２２５フラスコで増殖させた。集密時に、細胞をトリプシン処理し、洗浄 し、ペレットにし、培地中で再懸濁した。クローン２の約５Ｘ１０”個の細胞及 びクローン３５の約１０ＸＩＯ”個の細胞を二つの別個の中空繊維バイオリアク ターに接種した。アルファーＭＥＭ＋１０％のウシ胎児血清、８ｍＭのし一グル タミン、１００μｇ／ｒｎＩ！のペニシリン−ストレプトマイシン及び適当な濃 度のメトトレキセート（クローン２に関して５０μＭ　；クローン３５に関して ５０００Ｍ）の２０１の培養リザーバーを使用した。既混合ガス（空気中５％Ｃ Ｏ□）を酸素添加装置によりリザーバー培地中に吹き込んでｐＨを維持した。培 地循環速度、交換速度及びガス流速を、最大の生産を生じるように調節した。

試料を接種口により回収し、１１０００ｒｐて１０分間遠心分離し、０．２２μ Ｍの孔径のフィルターで濾過し、精製前に４°Ｃに保った。回収容量及び頻度を 、培養の開始時に２５７ｒＬＩ、週３回から、２〜３ケ月後に４０ｒＩＬｌ、週 ５回に次第に増加した。５ｃＲ１の生産をＣＲＩ　ＥＬＩＳＡによりアッセイし た。接種後の最初の１ケ月でクローン２及びクローン３５の収量は、夫々６６μ ｇ７日及び１０６０μｇ７日であった。これらの収量は、培養が確立されるよう になるにつれて増加した。

１２、　］、　１．血清を含まない培地中の５ｃＲ１の生産２種の市販の血清を 含まない培地を、細胞増殖及び５ｃＲ１の生産を支持するそれらの能力に関して 試験した。

ｐＢｓｃＲ１ｃ／ｐＴＣ３ｇｐｔクローン３５の集密Ｔ７５フラスコを２個のＴ ７５フラスコに分けた。一つのフラスコを、１０％ウシ胎児血清、Ｌ−グルタミ ン、抗生物質、及び５００ｎＭのメトトレキセートで補充されたアルファＭＥＭ で培養した。別のフラスコを、アルファＭＥＭ＋Ｌ−グルタミン、抗生物質、５ ００ｎＭのメトトレキセート十ＨＢ　ＣＨＯ増殖補足物（Ｈａｎａ　Ｂｉｏｌｏ ｇｉｅｓ　Ｉｎｃ、　Ａｌａｍｅｄａ、　ＣＡ）中にウシ胎児血清を５％から１ ％、０．５％及び０％と段階的に離乳させた。２個のフラスコの細胞増殖及５ｃ Ｒ１生産量を比較した。血清を含まない培地中の細胞の増殖は、集密に達しなか った。５ｃＲ１生産のレベルを第１表に示す。

夫々の場合、５ｃＲ１生産のレベルは、細胞を１０％胎仔ウシ血清中で増殖した 時に最良であった。比較のために、血清を含まない培地中で１４日ロー見られた レベルは、１０％胎仔ウシ血清で補足した培地の場合４．２Ｘ１０１０個のｇｈ ｏｓｔｓ／ｍ／に比べて、１．４Ｘ１０”個のｇｈｏｓｔｓ／ｍｌであった。

第１表 １０％ウシ胎児血清を含む培地に対し、ＣＨＯ増殖補足物で補足された血清を含 まない培地中の５ｃＲ１生産。

フラスコ２ １０％ＦＣＳ　４．８　３．８５　４．３　４．２本１ｏｌＧ個のｇｈｏｓｔｓ ／ｒｎｌとして表わされる組換え体中の細胞増殖及び５ｃＲ１生産を、血清を含 まない培地の第二の源（ＣＨＯ−１，Ｖｅｎｔｒｅｘ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ ｓＩｎｃ、　Ｐｏｒｔｌａｎｄ　ＭＥ）を用いて試験した。血清で増殖された細 胞をこの培地中に離乳させることは必要てなかったので、細胞を解凍し血清を含 まない培地中で直接培養した。この培地は、ＤＭＥ−Ｆ１２ベース及び増殖添加 剤からなる。同数の細胞を解凍し、２４ウエルプレートの別個のウェル中に接種 した。細胞が付着した後、培地を廃棄し、１０％ウシ胎児血清を含む培地または 血清を含まない培地を適当なウェルに添加した。夫々の条件を重複して行なった 。先に試験した血清を含まない培地と異なって、ＣＨＯ−１、即ちＶｅｎｔｒｅ ｘ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ培地は、胎仔ウシ血清を含む培地の場合と同様の 量の増殖細胞を生じた。

１２、１．２．結　論 上記の結果は、５ｃＲ１を生産するＣＨＯ細胞か特定の血清を含まない培地中で 維持し得ることを示した。これは、大規模な生産実験のための培地のコストの節 減をもたらした。更に別の利点は、細胞培養上清からの５ｃＲ１の精製か簡素化 されることであった。何となれば、胎仔ウシ血清タンパク質を除去する必要がな かったからである。

１２、２．可溶性ＣＲＩの精製 特異的な抗−ＣＲＩ抗体の出現により、精製ＣＲＩを生産するのに必要とされる 多くのクロマトグラフィ一工程を、簡素化された二工程操作で置換することか可 能になった。これは、得ることかできるＣＲＩ　タンパク質の収量を５．９Ｘ１ ０”個の赤血球当り約１〜５■のＣＲＩに増加したＷｏｎｇ、　Ｗ、Ｗ、ら、　 １９８５．　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　８２：　３０３−３１３） 　。しかしながら、報告された精製は膜に結合形態のＣＲＩてあったので、界面 活性剤中でＣＲＩを含む物質を可溶化することが常に必要であった。

組換えトランスフエクタントにより生産された可溶性ＣＲＩは、精製用の界面活 性剤で可溶化される必要はない。それは既に可溶性である。可溶性ＣＲＩは抗Ｃ ＲＩ抗体クロマトグラフィー（下記参照）により精製し得るか、この操作はそれ 自体を大規模生産に容易にしない。スケールアップの程度は、抗体精製カラムの 抗体マトリックスを調製するために得ることができる抗ＣＲＩ抗体の量により制 限される。加えて、ＣＲＩに対するＹＺ−１の如き抗体の高い結合親和性は、か なり苛酷な条件、例えばｐＨ１２，２か結合された５ＣＲＩ生産物を抗体マトリ ックスから除去するために使用される必要があることを意味するＷｏｎｇ、　Ｗ 、Ｗ、、　１９８５．　Ｊ、Ｌｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ８２　：　３０３ −３１３）。

非常に多量の可溶性ＣＲＩを精製する能力を有するために、ＨＰＬＣカラムを伴 なう精製操作が開発された。これらのＨＰＬＣカラムは、更に多量の精製された 可溶性ＣＲＩを生産するために容易にスケールアップし得る。

加えて、それらは５ｃＲ１の溶離及び回収のために苛酷な条件を必要としない。

１２．２．１．抗体アフィニティ力ラム精製１２．２．１．１．方　法 ５ｃＲ１の抗体アフィニティ精製に関し、モノクローナル抗体ＹＺ−１１００■ を、製造業者の指示に従って、ＡｆｆｉＧｅｌ−１０ＢｉｏＲａｄ、　Ｒｉｃｈ ｍｏｎｄ、　ＣＡ）７ｍｇに共育結合した。

細胞培養からのＣＲＩを含む上溝を、揺動するフラスコ中で固定化ＹＺ−１と共 に４℃で一夜インキユベートした。

その物質をガラスカラムに注入し、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．１ＭのＮａＣｌ 、　ｐＨ７で徹底的に洗浄した。５ｃＲ１を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、０ ．７ＭのＮａＣｌ、　ｐＨ１２を用いて溶離したＹｏｏｎ、　Ｓ、Ｈ，及びＦｅ ａｒｏｎ、　Ｄ、Ｔ、、　１９８５．　Ｊ、［ｍｍｕｎｏｌ、１３４゜３３３２ −３３３８）。溶離した画分を、Ｂｉｏｒａｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　・アッセイ（ Ｂｉｏｒａｄ　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）を用いてタンパク質の存在に関して 試験した。タンパク質を含む試料を直に溜め、０．１ＭのＨｅｐｅｓ　ｐＨ７中 で４°Ｃで一夜透析した（２×Ｉｆ）。その後、試料をＰＢＳ中で透析した。５ ｃＲ１の存在をＣＲＩ　ＥＬＩＳＡにより分析した。

１２．２．１．２．結　果 トランスフエクタントｐＢＳＣＲＩｃ／ｐＴｃｓｇｌｌ　ｔクローン２により生 産された５ｃＲ１を含む細胞培養上清を、抗ＣＲＩ抗体アフィニティカラムに装 填し、ピーク５ｃＲ１画分を溜めた。この精製物質の一部分を４〜２０％５ＤＳ −ＰＡＧＥゲルにかけたＤＡＩＩＣＨＩ　Ｉｎｃ、　；ポリアクリルアミドゲル ；Ｌａｅｍｍｌｉ　Ｕ、に、の改変操作、１９７０．　Ｎａｔｕｒｅ　２２７． ６８０−６８５）。

還元条件下で、可溶性ＣＲＩの見掛分子量は約２２４．０００ダルトンであった （第２４図）。また、この精製ＣＲＩは、補体媒介溶血並びにＣ５ａ及びＣ３ａ 生産を抑制するその能力により活性であることが示された（下記の１３項）。

１２．２．２．　ＨＰＬＣによるＣＲＩ精製１２．２．２．１．方　法 １２、２．２．１．１．出発物質 培養物をバイオリアクター中で最初に定着させた場合、５ｃＲ１生産のレベルは 、培養物か数カ月間増殖していた場合よりも少なかった。一般に、バイオリアク ター中の細胞か集密に達し、最大量の５ｃＲ１を生産するまでに、数週間の期間 があった。少量の５ｃＲ１を含む細胞培養上清を、精製の前に硫酸アンモニウム 沈澱または限外濾過により濃縮できた。６０〜８０％の飽和の範囲にわたる上清 の硫酸アンモニウム分別は、実質的に等しい収量で５ｃＲ１を沈澱させた。沈澱 を最小容量に溶解し、陽イオン交換ＨＰＬＣのために出発緩衝液中で透析した。

またＣＨＯ細胞培養上清は、限外濾過により濃縮でき、陽イオン交換クロマトグ ラフィーのために出発緩衝液中に透析できた。

バイオリアクターが一層高い濃度の可溶性ＣＲＩを生産するにつれて、これらの 培養物からのＣＨＯ細胞培養上清は、陽イオン交換クロマトグラフィーのために 出発緩衝液中に直接に透析てきた。

１２、２．２．１．２．陽イオン交換１（ＰＬＣ操作試料を出発緩衝液（０，０ ２Ｍのリン酸ナトリウム、０．０６Ｎの塩化ナトリウム、ｐＨ７，０）中に透析 し、続いて、０．２μｍのフィルターで濾過して粒状物を除去した。その後、試 料を陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーカラム（１０ａｎ　ｘ　１０ｍｍ 、　Ｒａ１ｎｉｎからのＨｙｄｒｏｐｏｒｅ−３ＣＸ　ＨＰＬＣカラム）に装填 した。カラムを洗浄し、塩化ナトリウム勾配で溶離し、０．０２Ｍのリン酸塩、 ０．５ＮのＮａＣ１，１）Ｈ７，Ｏを用いて溶離した。５ｃＲ１は０．０６Ｎ　 〜０．２５ＮのＮａＣ１のとこかで溶出した。溶離を、２８０ｎｍに於ける吸光 度及びＥＬＩＳＡにより監視した。

＋２．２．２．１．３．陰イオン交換ＨＰＬＣ操作所望により、陽イオンＨＰＬ ＣＩ製５ｃＲ１の更に精製か、陰イオンＨＰＬＣにより得ることかできた。陰イ オンＨＰＬＣからのピーク画分を、陰イオンＨＰＬＣのために出発緩衝液中に透 析した。試料を装填し、カラム（ＲａｉｎｉｎからのＨｙｄｒｏｐｏｒｏ−ＡＸ ）を０．０１Ｍのリン酸塩液ｐｉ（７，５中で洗浄した。カラムを一連の工程及 びグラジェントにかけ０．０１Ｍのリン酸塩、０．５ＮのＮａＣ１，ｐＨ７，５ を用いて溶離した。５ｃＲ１はＯ，ＯＮ〜０．３ＮのＮａＣ１のどこかで溶出し た。

溶離は、陽イオン交換ＨＰＬＣに関して前記したようにして監視した。陽イオン ＨＰＬＣカラム緩衝液及び陰イオンＨＰＬＣカラム緩衝液の濃度及びｐＨは、例 示にすぎない。

その他の緩衝液濃度、塩の条件、またはｐＨ条件かまた可能である。

１２、２．２．１．４．　ウェスタンプロット分析Ｔｏｗｂｉｎ、Ｈ，ら、１９ ７９．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ。

７６、４３５０−４３５４からの改変操作を用いて、ウェスタンブロッティング を行なった。簡単に云えば、精製５ｃＲ１を４〜２０％の５Ｏ３−ＰＡＧＥで処 理し、ニトロセルロースに移し、抗ＣＲＩ（７ウスｍＡｂ　ＹＺ−１またはＪ３ Ｄ３）で詳細に探査し、アルカリホスファターゼと接合したヤギ抗マウス抗体で 検出した。

１２．２．２．２．結　果 典型的な実験に関して、バイオリアクター培養からの上清５０〜１００−を出発 緩衝液中に透析し、１０ａｎＸ１０關の陽イオン交換ＨＰＬＣに装填した。ピー ク画分をＥＬＩＳＡ及び２８０ｎｍに於ける吸光度により測定し、溜めた。プー ルのタンパク質濃度を、２８０ｎｍに於ける吸光度により測定した（ＣＲ１ｃア ミノ酸組成から概算して、２８０ｎｍにおけるε（１％’）　＝１０）。数十■ を、増幅培養上清１００＋ｙ＋１から精製した。

一例として、トランスフェクタントｐＢＳＣＲ１ｃ／ｐＴｃｓｇｌ）ｔクローン ２からの培養上清液１００−は、陽イオンＨＰＬＣにより精製した場合、２８０ ｎｍに於ける吸光度により測定されるように、精製５ｃＲ１２２ｍｇを生産した （第２４図）。ｃ＋ｎ　ＥＬｒｓＡにより監視した場合、収率は２０２％である と計算され、その他１３％か貫通画分またはカラム洗浄画分中にあった。１００ ％より大きい収率は、おそら＜　ＥＬＩＳＡ中のマトリックス作用を反映してい る。

培養上清をバイオリアクターから抜き取ることかてきる速度が与えられたとする と、１基のバイオリアクター当り１週間で約１００■の精製した可溶性ＣＲＩを 生産することは、この水準のメトトレキセート増幅で可能であるべきである。こ のレベルの生産をスケールアップし得る幾つかの方法は、バイオリアクターに接 種する前に出発培養物をメトトレキセートで最大限に増特表平５−５０４０５３ 　（４４） 幅すること、生産時のバイオリアクターの数をいずれか一度に増加すること、及 び大容量のＨＰＬＣカラムを使用することを含む。

１２、２．２．３．精製した可溶性ＣＲＩの特性決定陽イオンＨＰＬＣからの５ ｃＲ１を含むピーク画分（第２４図）を、陰イオンＨＰＬＣて更に精製した。種 々の工程に於ける５ｃＲ１物質の純度を５Ｏ３−ＰＡＧＥにより試験した（第２ ５図）。

これらの重度に装填されたゲル中に見られる一層小さいバンドは、抗ＣＲＩモノ クローナル抗体ＹＺＩまたはＪ３Ｄ３を用いるウェスタンプロット分析により測 定されるように、５ｃＲ１のフラグメントを代表する。フラグメント５ｃＲ１バ ンドは、殆どの調製物中に見られなかった。

精製５ｃＲ１の機能的活性を、０．２５　μｇ／ｍｌの精製ｓＣＲ１濃度で主経 路補体媒介溶血を５０％抑制するその能力により試験した。また、精製した可溶 性ＣＲＩは５μｇ／ＷＬｌで主経路補体Ｃ５ａ生産を５０％抑制でき、１３ｕｇ ／ｒｎｌでＣ３ａ生産を５０％抑制できた（下記、１３項参照）。

１２．２．２．４．結　論 上記のように、我々は、治療用途に必要とされる５ＣＲ１の量を生産するために 容易にスケールアップし得る可溶性ＣＲＩの精製の改良方法を開発した。この操 作の基本要素は、既に可溶性であり、それにより、膜に結合されたＣＲＩを界面 活性剤で可溶化するという必要をなくす出発物質を含んでいた。バイオリアクタ ー培養物中のウシ胎児血清濃度の減少及び／またはこれらの培養物中の代替培地 の使用は、その後の精製中に高濃度の外来タンパク質を、５ｃＲ１を含む出発物 質から除去する必要をなくした。更に、精製のためのＨＰＬＣ操作の開発は、大 規模な精製方法を提供した。陽イオンＨＰＬＣまたは陽イオンＨＰＬＣとその後 の陰イオン交換ＨＰＬＣとの組合せか、精製に使用し得る。高収率の実質的に純 粋な可溶性ＣＲＩを、この操作により１工程または２工程のみで得ることができ る。

１３、実施例：可溶性ＣＲＩのインビトロ活性の実証１３．１．好中球酸化的バ ーストの抑制心筋梗塞中に受ける組織損傷の再潅流（ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ） 損傷モデルに於いて、活性補体成分は好中球の癒着及び活性化を誘発する。活性 好中球は、非常に毒性の酸素ラジカルを生じる酸化的バーストを受ける。これら 及びその他の潜在的な毒素は、好中球の顆粒消失中に放出され、周囲の組織を損 傷する。可溶性ＣＲＩは、Ｃ３ａ及びＣ５ａ　、即ち好中球活性化に関与する補 体成分の発生を防止することにより損傷組織の領域を減少し得る。

インビトロで補体活性化中のＣ５ａの発生を阻止する可溶性ＣＲＩの能力を監視 するため、Ｃ５ａ誘発の酸素バーストに好中球により生じられる酸素ラジカルの 発生を定量化し得るバイオアッセイを使用したＢａ５ｓ、　Ｄ、Ａ。

ら、　１９８３．　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３０．１９１０−１９１７）。こ の分析は、ジクロロフルオレセイン　ジアセラート（ＤＣＦＤＡ）を使用し、こ れは細胞に入って閉じ込められ、酸化の際に非常に螢光性になることかできる脂 質可溶性の分子である。

＋３．１．１．材料及び方法 １３、１．１．１．材　料 新しい全血、ヒト補体源（Ｂｅｔｈ　ｌ５ｒａｅｌ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ。

Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ）、乾燥パン酵母、０．１％のゼラチン及び５ｍＭのグル コースを含むＰＢＳ　、　１００ｍＭのＥＤＴＡＳＨＢＳＳ（Ｋｏｄａｋ社）中 の１０ｍＭのＤＣＦＤＡ、赤血球（ＲＢＣ）を溶解する緩衝液（Ｏｒｔｈｏ　Ｄ ｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、精製Ｃ５ａ（Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、、　 Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）　、及び可溶性ＣＲＩを使用した。

１３、１．１．２．好中球の調製 好中球をＢａ５ｓにより記載されたように調製した（１９８３、　Ｊ、Ｉｍｍｕ ｎｏｌ、　１３０．１９１０〜１９１７）　、全血２−７をＰＢＳ−ゼラチン− グルコース中で３回洗浄し、ＨＢＳＳ中の１０μＭのＤＣＦＤＡ　５ｒｎｌ＋Ｐ ＢＳ−ゼラチン−グルコース５−中で再懸濁し、３７℃で１５分間インキュベー トした。その後、細胞を遠心分離し、ＰＢＳ−ゼラチン−グルコース＋５ｍＭの ＥＤＴＡ　２．ＯｍＪ中で再懸濁した。

１３、１．１．３．酵母粒子の調製 乾燥パン酵母を水中で再懸濁し、２回洗浄し、３０分間沸騰させた。粒子を水中 で２回再洗浄し、水中で０．５ｇ／ｍｌで再懸濁した（上記のＳｉｍｐｓｏｎ、 　Ｐ、Ｊ、ら）。

１３．１．１．４．精製Ｃ５ａによる好中球の活性化ＤＣＦＤＡを含んだ細胞１ ００μｌを、ＲＢＣを溶解する緩衝液で処理し、ＰＢＳ−ゼラチン−グルコース −ＥＤＴＡ中で１回洗浄し、ＰＢＳ−ゼラチン−グルコースｉ、　０ｍｌ中で再 懸濁した。２００ｎｇ／ｍｉの精製Ｃ５ａまたは対照５０μｌを標的細胞０．５ ７ｎＩに３７°Ｃで添加し、種々の時間間隔でフロートサイトメトリーで分析し た。

１３、１．１．５．　ヒトの血清または血漿における純化されたＣ５ａによる好 中球の活性化 ＤＣＦＤＡ−負荷した細胞１００μｌをヒト血清またはヘパリン化した血漿（１ １００ｎ／ｍｌ）または対照で１＝１に希釈したＣ５ａの５０μ！中で、３７° Ｃ１３０分間インキユベートシた。ＲＢＣ’　ｓを溶解させ、モして好中球をフ ロー血球計算器で分析した。

１３、１．１．６．酵母粒子で活性化したヒトの血清または血漿による好中球の 活性化 新しい凍結血清及び血漿４２５μｍ７＋５ｃＲ１または対照５０μｌを、酵母粒 子２５μｌと共に３７°Ｃて３０分間インキュベートした。その後、補体活性化 試料及び対照試料を、遠心分離して酵母粒子を除去した。これらの試料の夫々の １０回の２倍希釈をＰＢＳ−ゼラチン−グルコース−ＥＤＴＡ中て行なった。対 照並びに活性化された血清及び血漿の夫々の連続希釈液５０μｌを、ＤＣＦＤＡ を含んだ標的細胞５０μｌに添加し、３７°Ｃて３０分間インキュベートした。

その後、ＲＢＣを溶解して除き、好中球をフローサイトメトリーにより分析した 。

１３、１．２．結　果 １３．１．２．１．　Ｃ５ａはＤＣＦＤＡを用いて測定し得るヒト好中球中の酸 素バーストを誘発する 第２６図は、精製Ｃ５ａによる刺激後のヒト好中球の螢光強度の急速な増加を示 す。Ｃ５ａ　（２０ｎｇ／−最終濃度）の添加の４分以内に、好中球は対照のＤ ＣＦＤＡを含んだ好中球よりも１０倍明石かった。２０分までに、好中球は対照 の２０倍明石かった。この分析は、Ｃ５ａの感度のよい指標であるように思われ る。

１３、１．２．２．　ヒト血清は、好中球に及ぼす精製Ｃ５ａの酸素バースト作 用を阻止する ＤＣＦＤＡが含まれ、ヒト血清中で希釈された精製Ｃ５ａと共にインキュベート された好中球では、螢光強度の増加か観察されなかった。この作用は、凝固中に 血小板から放出される血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）によるものであり得る。

少量のＰＤＧＦはＣ５ａ誘発の好中球活性化を抑制し得ることか示されていた（ Ｗｉｌｓｏｎ、　Ｅ、ら、１９８７、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　８４：　２２１３−２２１７）。

１３、１．２．３．ヘパリン化血漿は好中球に及ぼすＣ５ａの作用を阻止しない ヘパリン化血漿中でＩ：ｌに希釈されたＣ５ａは、ＤＣＦＤＡを含んだ好中球中 に酸素バーストを誘発した。緩衝液中のＣ５ａはと著しくないか、好中球と共に ３０分間インキュベートした後、螢光強度の１０倍の増加があった。シグナル低 下は、瀉血または血漿分離中のＰＤＧＦ放出により生じ得る。血液の細胞成分か らの血漿の一層穏やかで迅速な単位は、ＰＤＧＦの放出を最小にし、一層良好な Ｃ５ａ機能を生じ得る。

１３、１．２．４、補体活性化中に存在する５ｃＲ１はＣ５ａ発生を阻止する 可溶性ＣＲＩの存在下のヒト補体のザイモサン誘発活性化は、ＤＣＦＤＡ分析に より測定されるようにＣ５ａ活性の低下を示した。第２７図に見られるように、 ５ｃＲ１の存在下で活性化されたヒト血漿の１＝１６希釈物は、５ｃＲ１か存在 しないで活性化された１：１６希釈血漿に較べて好中球中で７０％少ない螢光強 度の増加を生じた。これは５ｃＲ１によるＣ５ａ発生の抑制を意味する。ＤＣＦ ＤＡアッセイ及び血漿収集の更に最適化は、可溶性ＣＲＩ活性の一層動的で、し かも感度の良い分析をもたらす。

１３、２．補体媒介溶血の抑制 御３．２．１．方　法 補体を阻害する能力を、補体媒介赤血球溶解（溶血）の阻害に関して分析するこ とにより試験した。溶血の阻害を、可溶性ＣＲＩ濃度の関数として測定した。試 験すべき５ｃＲ１試料を０．１Ｍのヘペス緩衝液（０，１５Ｎ　ＮａＣ１，ｐＨ ７，４）中で希釈し、５０μｌをＶ字形の底部のマイクロタイタープレートの夫 々のウェルに代表的には三通りずって添加した。補体源として使用したヒト血清 をへペス緩衝液中で１−１２５倍に希釈し、５０μｌを夫々のウェルに添加した 。次に、抗ヒツジ抗体を含む市販のヒツジ赤血球（Ｄｉａｍｅｄｉｘカタログ番 号７８９−００２）を、入手したまま使用し、　１００μ！／ウエルで添加し、 溶血に至る補体経路を開始させた。プレートを３７°Ｃで６０分間インキュベー トし、続いて、５００Ｘｇで１０分間遠心分離した。上溝を取り出し、平底のマ イクロタイタープレートに入れた。溶血の程度を、４１０ｎｍに於ける試料の吸 光度の関数として測定した。最大吸光度（最高の溶血に相当する）　Ａｍａｘを 、ヒトの血清のみを含有する赤血球試料の吸光度Ａｓ−赤血球のみを含存する試 料の吸光度Ａｏから得た。したがってＡｍａｘ＝Ａｓ−Ａｏ、ヒト血清及び５ｃ Ｒ１の両方を含む赤血球試料の吸光度と、５ｃＲ１のみを含む細胞試料の吸光度 との差を入試料と定義した。

阻害、ＩＨを分数（Ａｍａｘ−Ａ試料／Ａｍａｘ）として表わし、ｒＨ６゜をｒ Ｈ＝１／２の値を生じるのに必要とされる５ｃＲ１の濃度として定義した。クロ マトグラフィー画分を監視するため、無血清対照を包含させず、抗補体活性を試 料の４１０ｎｍに於ける吸光度の減少として定性的に監視した。

また、上記の溶血アッセイを使用して、モルモット及びラットの如きその他の種 からの補体によるヒツジ赤血球溶解を阻害するヒト組換え体５ｃＲ１の能力を評 価した。夫々の種に関して、新しい凍結血清または新たに凍結乾燥した血清もし くは血漿を、補体源として使用した。成る場合には、血清を商業的に入手した（ ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ） 。

まず、血清を、活性化赤血球を溶解するその能力に関して滴定した。最高の赤血 球溶解の少なくとも８０％を生じる最大希釈度を、添加ヒト５ｃＲ１の作用を評 価するのに選んだ。その後、ヒト血清を動物血清に代え、好ましい希釈度で、ア ッセイを上記のように行なった。

！３．２．２．結　果 第２８図に示されるように、精製５ｃＲ１は０．１２μｇ／ｒ！Ｌｌの５ｃＲ１ 濃度で主経路補体媒介溶血を５０％阻害した。溶血アッセイを阻害する抗体アフ ィニティ精製５ｃＲＩの能力を、未精製物質（ｓｃＲｌを含む細胞培養上清）の 能力と比較した。精製５ｃＲ１は、未精製５ｃＲ１の活性に匹敵する活性を存し 、両者は１．６ＸＩＱ”個のｇｈｏｓｔ／ｍｌで溶血アッセイで５０％の阻害を 生じた。これは、精製操作か最終的５ｃＲ１生産物の機能的活性を実質的に低下 させていないことを示した。

精製５ｃＲ１か凍結して貯蔵し得るかを調へるために、一部分を一７０°Ｃて１ 週間貯蔵した。凍結５ｃＲ１の濃度は、２８０ｎｍに於ける吸光度及びＣＲＩ　 ＥＬＩＳＡにより測定されるように、凍結しなかった５ｃＲ１と同じであった。

また、凍結５ｃＲ１は、溶血の阻害により測定されるように、凍結しなかった５ ｃＲ１と同じ活性を有していた。

幾つかの種からの補体により媒介される溶血を阻害するヒト組換え体５ｃＲ１の 能力を第■表に要約する。

（本貫以下余白） 第■表 種々の動物血清からの補体を用いて感作したヒツジＲＢＣの溶血 使用した血清　５ｃＲＩに　抑制（ＩＨ）”　ＩＨ，、”動物　の最終濃度　よ る抑制　（ｇｈｏｓｔ／ｍｌ）　（ｇｈｏｓｔ／ｍｆ）モルモット　°　１：５ ００　有　６６％（２，６Ｘ１０’）　１．ＯＸＩＯ’ヒト　１：５００　有　 ９４％（２，５Ｘ１０’）　２．ＯＸＩＯ”ヒト　１：３１２　有　９４％（１ ，２Ｘ１０”）　１．０　ＸｌＯ７ラフト　ｌ：２００　有　８５％（２，６Ｘ １０’）　２．４　ＸＩＯ’ラフト　１：２００　有　７７％（３，８ＸｌＯ’ ）　１．ＯＸＩＯ”イヌ　ｌ：５０　無 ウサギ　’　１：２０　無 ７ウス　９　１：５　無 零商業的に得られた凍結乾燥血清（Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、、　Ｓ ｔ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）本本明細書（１３，２項）中に定義される。

モルモット補体及びラット補体の両方は、ヒト５ｃＲ１により阻害されることか 明らかであった。その他の種に関して明らかな阻害の欠如は、（ａｌアッセイ系 中にウサギ抗体及びヒツジ赤血球を使用することの不適なこと、またはｆｂｌこ の系中における高濃度の血清が溶血に必要とされることを反映しているものかも 知れない。

１３．３．　Ｃ３ａ及びＣ５ａの産生の阻害１３．３．１．方　法 補体を阻害する能力を、Ｃ３ａ及びＣ５ａ産生の特異的な阻害に関してアッセイ することにより、また試験した。全ての実験に関して、補体の源として使用すべ き単一のヒト血清プールを、一部分ずつ分け、−７０°Ｃで凍結して貯蔵した。

ヒト１ｇＧを熱凝集させ、一部分ずつ分け、−７０°Ｃで凍結して貯蔵した。夫 々の実験に関し、血清一部分を、試験すべき５ｃＲ１の濃度を変えて３７°Ｃで 平衡化した。補体経路を、凝集したヒトＩｇＧの添加により開始させた。ＩｇＧ を含有しない対照試料を常に包含させた。１５分の一定の反応時間（早期の経時 検討で、Ｃ５ａまたはＣ３ａの生産かほぼ完結される、即ち９０％以上完結する 都合のよい時間間隔を得るために決定されていた）の後に、放出された補体ペプ チド（Ｃ５ａまたはＣ３ａ）のレベルを、改変操作で市販の放射性免疫測定（Ｒ ＩＡと称する）キット（Ｃ５ａ　ＲＩＡ、　（Ａｍｅｒｓｈａｍ）カタログ番号 ＲＰＡ、５２０；　Ｃ３ａ　ＲＩＡ、（Ａｍｅｒｓｈａｍ）カタログ番号ＲＰＡ 、　５１８）を用いる放射性免疫測定法により測定した。

競合免疫測定法を使用したので、補体ペプチド（Ｃ５ａ及びＣ３ａ）濃度は、計 数と逆に変化した。試料に関する結合数（ＣＢ）は、ペレット中で測定された全 計数（１分当りの計数、ｃｐｍ）として定義された。

第２９図中のｙ軸は、フラクション阻害を表わす。フラクション阻害は、（“Ｉ ｇＧを含まない対照”に関するＣＢ−“５ｃＲ１を含まない試料”中のＣＢ）で 割った（“試料”に関する結合数（ＣＢ）−“５ＣＲ１を含む試料”中のＣＢ） に等しい。

１３．３．２．結　果 精製５ｃＲ１の活性を、活性化ヒト血清試料中でＣ５ａ及びＣ３ａの生産を阻害 するその能力を試験することによりアッセイした。

第２９図により示されるように、試験条件下で、精製５ｃＲ１はＣ５ａ生産を１ ００％、Ｃ３ａ生産を６０％、最大に阻害し得た。５０％の阻害は、Ｃ５ａ生産 に関して５ａｇ／ｒｎｌ、モしてＣ３ａの生産に関して１５〜２０μｇ／ｒｎｌ の５ｃＲ１濃度で観察された。これらのデータは、組換え５ｃＲ１がＣ３コンバ ーターゼよりもＣ５コンバーターゼを前動に阻害することを示唆する。

１４、実施例：可溶性ＣＲＩの機能的なインビボの治療活性の実証 １４、１．可溶性ＣＲＩは逆受身アルチュス反応にインビボ作用を示す アルチュス反応は、抗原を局所注射し、その抗原か次に循環中に抗体と反応する ことにより引き起こされる古典的な免疫誘導炎症応答である。主要な生物応答は 、免疫複合体沈着、補体結合、多形核（ＰＭＮ）白血球浸潤、リソシーム酵素の 放出、血管活性アミン、及び局所の組織損傷により特徴づけられる（Ｕｒｉｕｈ ｕｒａ、　Ｔ。

及びＭｏｖａｔ、　Ｈ，Ｚ、、１９６６、　Ｅｘｐ、Ｍｏ１．Ｐａｔｈｏｌ、　 ５　：　５３９−５５８：　Ｃｏｃｈｒａｎｅ、Ｃ，Ｇ、、１９６８．　Ａｄｖ 、Ｉｍｍｕｎｏｌ、９　：　９７−１６２）　。

直接アルチュス反応の改変、即ち逆受身アルサス反応（ＲＰＡＲ）は、抗炎症薬 を同定するためのモデルとして使用されている（Ｐｆｌｕｍ、　Ｌ、Ｒ，及びＧ ｒａｅｍ、　Ｍ、Ｌ、、　１９７９゜Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄＡｃｔｉｏｎｓ、　 ９．１８４−１８９）。ＲＰＡＲでは、抗体が局所注射され、抗原が循環中に存 在する。

ラットＲＰＡＲモデル中で試験した場合、可溶性ＣＲＩｓは局所炎症反応を阻止 できた。インビボのこの可溶性ＣＲ１機能の作用機構は、補体経路酵素の阻害に より媒介されている。

１４、１．１．材料及び方法 体重約１００−１２５ｇの生後５週の雌のＳｐｒａｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙラット （ＣＤ株ＸＣｈａｒｌｅｓ　ＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｗｉｌｍ ｉｎｇｔｏｎ、　ＭＡ）を、０．１〜０．３ｍｌのＡｖｅｒｔｉｎ溶液の腹腔内 注射により麻酔した。この溶液は、１５ｒｎＩ！のアメルＡｍｅ　１エタノール 中の１ｇのトリブロモエタノールでつくられた貯蔵液の１：２希釈物であった。

動物の背中の毛皮を剃った。次に、尾部を、まず温水で、次にヒートランプで温 めた。１ｒＩＬｌの注射器を用いて、０．１５Ｍのリン酸塩緩衝食塩水（ＦＩＢ Ｓ）中の５■／ｒｎＩ！の卵アルブミン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ　Ｃａｒｐ　Ｓ ａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）　０．３５ｍＮを尾部静脈１尾部の先端から約２． ５〜５．１　ａｎ　（１〜２インチ）の位置に静脈内注射した。５分後、ラット を、４■／−の抗体力価を有する抗−卵アルブミン抗体の２０■／−のウサギＩ ｇ画分（Ｏｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｋｎｉｋａ　Ｃａｒｐ、　Ｃａｐｐｅｌ　Ｄｉｖ ｉ−ｓｉｏｎ、　Ｗｅｓｔ　Ｃｈｅｓｔｅｒ、　ＰＡ）　０．０８ｒＩＬｌまた は２０ｍｇ／ｍｊのウサギＩｇＧ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｃａｌ　Ｃｏ、、　 ＳＴ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＤ）　０．０８ｉ、またはＰＢＳで皮肉注射した。夫々 の注射を二通りずつ行ない、注射付近の領域をマーカーベンで円形に印した。そ の後、ラットを１時間後、４時間後、１８時間後に監視した。２４時間後にラッ トをドライアイス中に３分間法めることにより死亡させた。皮膚試料を注射部位 から切開した。二通り試料の一つを、パラフィン包埋のために１０％のホルマリ ン中で固定し、別の試料をクリオスタット切片用に凍結した。組織部分を調製し 、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。

１４、１．２．結　果 弱いＲＰＡＲ反応（例えば、浮腫及び紅斑）が抗−卵アルブミン抗体の皮肉注射 の３〜５時間後に目視てきるようになり始めた。反応の大きさが２４時間後に直 径３〜５−に達するまで、反応の強さが次第に増大した（第３０ｂ図を）。非免 疫ウサギ■ｇＧまたはＰＢＳのみを注射した夜分のラットの皮膚では反応は観察 されなかった。

病変の部位から調製された組織切片の顕微鏡検査のもとで、多くの急性炎症細胞 か、特に血管付近の皮膚中に目視てきた（第３１ｂ図）。これは、典型的に脈管 炎及び脈管周囲炎として識別される。その組織は、血管外部のＰＭＮの広範囲に 及ぶ浸潤、結合組織中の赤血球の存在、及びコラーゲン繊維の弛緩を伴なう典型 的な炎症症状を示した。

１４、１．３．可溶性ＣＲＩの皮肉投与の作用０．７５■／−の５ｃＲ１４０μ ｌを等容量の抗−卵アルブミンまたは正常なウサギｒｇＧまたはＰＢＳと組合せ ることにより、精製５ＣＲＩの混合物を調製した。５ｃＲ１：抗−卵アルブミン 混合物または５ｃＲ１：ウサギ１ｇＧ混合物、または５ｃＲ１：　ＰＢＳ混合物 を、卵アルブミンで静脈内に感作されたラットに皮肉注射した。わずかに目視で きる病変が、５ｃＲ１＋抗−卵アルブミン抗体を受けた注射部位中に現われた（ 第３０ａ図）。予測されるように、病変は５ｃＲ１：ウサギＩｇＧまたは５ｃＲ １：　ＰＢＳを受けた注射部位中に現われなかった。５ｃＲ１：抗−卵アルブミ ン注射部位の周囲の組織の部分を顕微鏡で調べたところ、ＰＭＮ及び単核細胞の クラスターか細静脈の周囲に見られたか、ＰＭＨの広範囲に及ぶ浸潤または赤血 球の湯圧はなかった（第３１ａ図）。これらのデータは、可溶性ＣＲＩの投与が 内皮細胞の損傷の抑制及び炎症反応の抑制を生じたことを示す。

上記の卵アルブミンラットモデル中のＲＰＡＲを阻止するのに必要とされる５ｃ Ｒ１の最小有効量を測定するために、０．７５■／ｍ／５ｃＲ１原液の１０倍の 連続希釈液（希釈なし、ｌ／１０．１／１００．１／１．０００及びｌ／１０． ０００）を試験した。

夫々の５ｃＲ１希釈物を、等容量の生のままニートまたは％希釈抗−卵アルブミ ン抗体と混合した。夫々の部位に合計８０μｌを注射した。ＲＰＡＲを阻害する ５ｃＲ１の能力は用量依存性であり、浮腫の有効な減少が部位当り３００ｎｇで 観察された（第Ｘ表）。

第Ｘ表 ０　＋＋＋＋ ＋４．２．インビボに投与された５ｃＲ１の薬物速度論インビボの５ｃＲ１の生 物学半減期を、以下のように測定した。同様の齢（６週）及び体重（１１Ｏ〜１ ２５ｇ）のラットに、０．３Ｗ中２５０μｇの５ｃＲ１を静脈内注射した。

注射後、２分、５分、１０分、６０分及び２４時間で、ラットを犠牲にし、大静 脈孔から血液を得た。夫々のラットからの血清１〜２−を、１８００ｒｐｍで１ ０分間の遠心分離により得、夫々の試料中の５ｃＲ１の量をＣＲＩ　ＥＬＩＳＡ により測定した。対照のラット血清またはヘモグロビンを含まない赤血球ｇｈｏ ｓｔ（１，６ｘ　１０’個のｇｈｏｓｔ　／ｍＩ）の界面活性剤溶解産物中に加 えられた精製５ｃＲＩ　Ｉμｇ／−の２倍希釈液を、ＣＲＩ標準物質として使用 した。

結果を第ＸＩ表に示す。

第ＸＩ表 注射ｓＣＲ１の血清濃度の経時的な薬物速度論データ静脈内注射　ｓＣＲ１濃度 後の時間　（μｇ／イ） 対照　０．０１ ２分　０．１７ ５分　０．８０ １０分　１．０１ ６０分　０．３８ ２４時間　０．４９ これらのデータは、５ｃＲ１が静脈内注射の２４時間後に検出し得ることを示す 。２４時間の時点で、血清中の５ｃＲ１のレベルは、注射後１０分で観察された ピークレベルの５０％であった。

スブラーグドーレイ（Ｓｐｒａｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙ）ラットおよびサインモル ガスモンキー（表Ｘｒｌ）における追加研究を行いインビボ投与５ｃＲ１の薬物 動力学をさらに特徴づけた。各動物は＋２５１標識５ｃＲＩのみ（ラットは１４ −２８Ｘ１０’ｃｐｍ、モンキーは１２６−１５３ｘ　１０’ｃｐｍ）または非 標識（約１ｍｇ／ｋｇ）および１２５１１１１ｉ識５ｃＲ１の混合物を単一静脈 注射された。２−４３１研究において、非標識５ｃＲ１１ｍｇ／ｋｇまたは１０ ｍｇ／ｋｇの用量もまたモンキーで検査された。血液は、表ＸＩＩに示されたサ ンプル時間内に、いくつかの時間ポイントで各動物から集めた。血液からの５ｃ Ｒ１のクリアランスはラットおよびモンキーにおいて２重相パターンに従った。

第１相（α）は分で測定される短い半減期を有した。Ｉｒｎｇ／ｋｇの用量がｔ １７□α＝９．１３分および１０ｍｇ／ｋｇ用量かｊ＋ｚ２１２＝２９分てあり 、モンキー研究において示されたようにこの半減期は用量依存であった。第２相 （β）は時間で測定される、より長い半減期を示した（表ＸＩＩおよび第３２図 参照）。

モンキー研究の結果は１．０および１０ｍｇ／ｋｇの用量で単一静脈注射投与に 関連してモンキーには観察される毒性の臨床サインは全くないことか示された。

１４．３．５ｃＲ１は再潅流された心筋梗塞のラットの梗塞の大きさを減少する 。

本明細書に記載されたように、インビトロの補体経路Ｃ３／Ｃ５コンバーターゼ の活性を抑制し得た５ｃＲ１は、またインビボのラット心筋梗塞モデル中の再潅 流損傷の程度を軽減し得た。

心筋梗塞は、冠状動脈結紮によりラット中に誘発し得る。心筋梗塞後の最初の数 時間以内に確立された場合、再潅流は、梗塞の大きさを減少し、左心室機能を改 善し、かつ死亡率を低下することが示されているＢｒａｕｎｗａｌｄ、　Ｅ、　 及びＫｌｏｎｅｒ、　Ｒ，Ａ、、１９８５．　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、　７６　：　１７１３−１７１９）　。しかしながら、重度に虚 血性であるが不可逆的に損傷されていない心筋の再潅流は、それ自体で損傷を生 じ、拡大することかある。

再潅流誘発損傷の原因となる機構は、酸素を含まないラジカル及び細胞のカルシ ウム過負荷により媒介される損傷を食前し得る。単独で、または微小血管内皮細 胞と協力して作用する白血球が、この損傷の原因となることがある。補体活性化 か、この過程に関係することがあるＲｏｓｓｅｎ、　Ｒ，Ｄ、ら、１９８５．　 Ｃｉｒ、　Ｒｅｓ、　５７．　１１９−１３０；　Ｃｒａｗ−ｆｏｒｄ、Ｍ、Ｈ ，ら、１９８８．　Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ　７８　：　１４４９−１４５８） 。

１４、３．１．　ラットにおける補体活性化及び心筋再潅流損一時的に心筋虚血 を起こしてその後再潅流させたラットに５ｃＲ１を投与した。虚血性であるか回 復てきない程の損傷ではない再潅流心筋の損傷機構は白血球依存性炎症反応を伴 い（Ｒｏｍｓｏｎら、１９８３．　Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ　６７：　１０１６ ；　Ｍａｒｔｉｎら、１９８８．　Ｃ１ｒｃ、　Ｒｅｓ、　６３：４８３；　Ｋ ｒａｅｍｅｒ＆　Ｍｕｌｌａｎｅ、　１９８９．　Ｊ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、 　Ｅｘｐ、　Ｔｈｅｒａｐ、　２５１：６２０；　Ｌｉｔｔら、１９８９．　Ｃ １ｒｃｕｌａｔｉｏｎ　８０：１８１６；　Ａｍｂｒｏｓｉ。

ら、１９８９．　Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ　８０：１８４６）、この反応は補体 の活性化を必要とする（Ｍａｒｏｋｏら、１９７８．　Ｊ、　Ｃ１１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、６１：６６１；　Ｃｒａｗｆｏｒｄら、１９８８．　Ｃ１ｒｃｕ ｌａｔｉｏｎ　７８：１４４９）。動物を無作為にグループ分けし、左冠状動脈 の縫合結紮による閉塞の直前にリン酸緩衝溶液のみ（ｎ＝２９）または１ｍｇの ５ｃＲ１を含むリン酸緩衝溶液（ｎ＝３１）をポーラス静脈注射により投与した 。３５分後、縫合をゆるめ、胸郭を閉じ、動物をゲージに戻し、７日後に動物を 殺して心筋梗塞を調べた（Ｗｅｉｓｍａｎら、１９８８、　Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉ ｏｎ　７８：１８６）　；　７日の間隔は梗塞の大きさの信頼できる評価をもた らし、さらに梗塞治癒に対する５ｃＲ１の起こりうる副作用の分析を可能にした 。メトキシフルラン麻酔をかけたラットから切除した心臓の大動脈にカニユーレ を挿入し、冠状動脈に最初はクレブスーヘンセレイト（Ｋｒｅｂｓ　Ｈｅｎ５ｅ ｌｅｉｔ）溶液を、次いて拡張期停止のために３０ｍＭ　ＫＣＩを潅流した。冠 状動脈内潅流および１０％緩衝化ホルマリンへの浸漬による固定後、心臓の２ｍ ｍ横断切片を正常、全梗塞および臓器壁内の梗塞左心室心筋の領域を計算化する ことにより組織学的に分析した。全スライスの断片的な領域の総計値は心筋梗塞 サイズおよび臓器壁内壊死の全壊死に対する割合を計算するために用いた。全て の方法および動物の世話は機関のガイドラインに依った。緩衝液のみを与えられ たグループ（２９中２４）および５ｃＲ１処理グループ（３１中２５）中の生存 率は、冠状動脈結紮直後に対照ラットの１匹以外全てか死に類似していた。

冠状動脈の結紮は次の標準の全てに合う各グループの２２動物につき成功と判断 した。すなわち虚血に適合する、すばやい心電図の変化、前方左心室壁のチアダ ーゼおよび死後の心筋壊死の組織学的証拠。構造物は５ＣＲ１処理動物中２匹を 除いて全てのラットから放出する二とに成功した。再潅流を達成してない２ラツ トを包含する全生存者の分析は５ｃＲ１処理が心筋梗塞のサイズを対照ラットに おける左心室重量の平均１６±２％から５ｃＲ１グループの９±２％に減少した こと（Ｐｒｏ、　０１）を示した。臓器壁内梗塞の頻度もまた５ｃＲ１処理（２ ５中６）は対照ラット（２４中１２）より低かった（Ｐ＜０．０４）。

５ｃＲ１処理した全てのラットからの心臓の４切片を集計した梗塞シグメントの 厚さは、７．８±０．４　ｍｍであり、それは未処理ラットてのそれ７．３±０ ．４　ｍｍからは有意に異ならなかったか、ラットのこれら２グループの心臓か ら、はるかに離れた非梗塞心室内隔壁のそれよりもわずかに少なかった（ｓｃＲ １ラット９．３±０．２ｍｍ、未処理ラット９．４±０．２ｍｍ）。またこれら ２グループの心室内窩洞サイズには違いか全くなかった（ｓｃＲ１ラット６４． ９±３．６ｍｍ’、未処理ラット６８．９±２．６　ｍｍ”）。したがって梗塞 後１週間の心臓観察から判断して、５ｃＲ１は心筋梗塞サイズを抑制するが心室 拡張を生じたり、心室壁をうずくして治癒のさまたげとならない。

５ｃＲ１による組織損傷の抑制か虚血心筋による補体活性化の阻害に関連してい るかを測定するために緩衝液処理（ｎ・７）および５ｃＲ１処理ラツト（ｎ＝８ ）のもうひとつのグループを同じ虚血再潅流プロトコルにかけて動物を再潅流３ 時間後に殺した。心臓を生存している心筋から不可逆的傷害の領域に詳細に記す るためにニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）染色（Ｌｉｌｌｉｅ、　Ｒ，Ｄ 、。

１９６５、　Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｃ　ａｎｄ　Ｐｒ ａｃｔｉｃａｌＨｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、　 Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　ｅｄ：３：３７８）によりかつラットＣ３ｂ−９膜攻撃複合 体（Ｓｃｈｕｌｘｅら、１９８９、　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ、　３５：６０）に 対するマウスモノクローナル抗体を育するイムノペロキシダーゼ染色（ＤｅＬｅ ｌｌｉｓ。

ｉｎ　Ｂａ５ｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ。

ＤｅＬｅｌｌｉｓ、　Ｅｄ、、　Ｍａｓｓｏｎ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８ １）により評価した。マウスペロキシダーゼ−アンチペロキシダーゼ（ＰＡＰ） 系は記載されているように免疫染色に用いられた。方法の全てのステップては０ ．０５Ｍ　トリス緩衝食塩水中の３回の１０分洗浄を先に行った。切片をアセト ンで固定し０．５％Ｈ２０□−メタノール溶液で５分間、４％熱不活性化ヤギ血 清で１時間処理した。そして続いてそれらを２μｇ／ｍｌの１次マウスモノクロ ーナル抗体で１８時間、マウス抗体（Ｏｒｇａｎｏｎ−Ｔｅｃｋｎｉｋａ、　Ｗ ｅｓｔＣｈｅｓｔｅｒ、　ＰＡ）へのアフィニティ精製Ｆ　（ａｂ’）２ヤギア ンチ血清で６０分間およびマウスＰＡＰで６０分間、逐次室温てインキュベート した。スライドを３．３゛−ジアミノベンジジン四塩酸塩で現像しギル（Ｇｉｌ ｌ）のへマドキシリン３で対比染色した。対照ラット（ｎ＝７）のＮＢＴ陰性、 梗塞領域において、Ｃ３ｂ−９複合体は毛細血管および小動脈の内皮に沿って主 に存在したが心筋線維にはなかった。これと対照的に、示した代表的切片に例示 されるように５ｃＲ１を受けたラットにおいては、ＮＢＴ陰性＠城はサイズか一 貫して減少し、Ｃ５１）−９複合体はこれらの領域においてほとんどあるいは全 く検出てきなかった。

これら−続きの切片における白血球の定量化（Ａｍｂ−ｒｏｓｉｏら、１９８９ ．　Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ　８０：１８４６）により、対照ラットの梗塞ゾー ン内では、毛細血管および小静脈にほぼ例外なくｍｍ”当り１９５±２８白血球 （１５０倍率視野；ｎ＝３）あることか明らかとなった。５ｃＲ１を受けたラッ トの心臓からの相当する切片はｍｍ”　（ｎ＝４；　Ｐ＝０．００６）当り８３ ±３白血球しかなく、補体活性の抑制はこの炎症細胞型の蓄積の減少に関連して いることか示された内皮表面に沿ったＣ３ｂ−９複合体の局在化は、これらの細 胞か虚血心筋への再流入損傷の病理発生において補体活性化の主要な部であるこ とを示し、冠状動脈閉鎖の２４時間後梗塞心筋全体に補体タンパク質がより拡散 して散在しているのと対照をなしている（ＭｃＭａｎｕｓら、ｌ９８３、　Ｌａ ｂ、Ｉｎｖｅｓｔ、　４８：４３６）　、後者は壊死組織が補体を活性化する能 力を単に反映しているのに対し、前者は虚血性ストレスを受けた内皮は補体活性 機能を獲得することを示している。内皮細胞による補体活性化はＣ５ａの血管内 白血球活性およびＣＲＩおよびＣＲ３を包含する細胞レセプターのそれらの急激 なアップレギュレーションを生じて好中球の虚血心筋への早期局在化に特に強力 な刺激となるてあろう　（Ｆｅａｒｏｎ　＆　Ｃｏ１１ｉｎｓ。

１９８３、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３０：３７０：　Ａｒｎａｏｕｔら、１９８ ４．　Ｊ。

Ｃ１１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　７４：１２９１）。後者のレセプターはＣＲ３゜１ Ｃ３ｂのリガンドを担持する補体活性内皮細胞への好中球の付着を促進すること が示されている（Ｍａｒｋｓら、１９８９、　Ｎａｔｕｒｅ　３３９：３１４） 　、したかって、５ｃＲＩによる補体活性化の抑制は明らかに内皮細胞に付着す る好中球の数の減少を説明している。

血栓溶解剤による虚血心筋の再潅流は梗塞のサイズを減少させ、左心室機能を改 善しもし冠状動脈閉鎖の数時間内に確立されれば死亡率を減少させる（Ｇｕｅｒ ｃｉら、１９８７．　Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、　Ｍｅｄ、３１７−１６１３；　ｌ５ ＩＳ−２Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐ、　１９８８．　Ｌａｎｃｅ ｔ　ｉｉ：４９；　Ｖａｎ　ｄｅＷｅｒｆ　＆　Ａｒｎｏｌｄ、１９８８．　Ｂ ｒ、　Ｍｅｄ、　Ｊ、　２７９：１３７４）。しかしなから再潅流の便益となり えるものは完全に達成されないかもしれない。なぜなら極度に虚血であるか不可 逆的に損傷のない心筋への再流入は壊死を誘発するからである　（Ｂｅｃｋｅｒ 　＆　Ａｍｂｒｏｓｉａ、　１９８７．　Ｐｒｏｇ。

Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ、　Ｄｉｓ、　３０：２３；　Ｂｒａｕｎｗａｌｄ　＆　 Ｋｌｏｎｅｒ、　１９８５゜Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７６：７１３ ）ｏ壊死と因果関係かあると考えられる２つの事柄は好中球の血管内蓄積および 微小血管内皮細胞損傷であり（ＶａｎＢｅｎｔｈｕｙｓｅｎら、１９８７゜Ｊ、 　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７９：２６５）、両者は補体活性化の結果であ る。５ｃＲ１心筋保護作用の本所見は補体の中心的役割の可能性を支持し、補体 がコブラ毒ファクターから激減している初期の研究を拡張し、血栓溶解療法の組 織をたすける可能性を強化する手段を提供する。

１４．３．２．結論 結果は５ｃＲ１治療かインビボで再潅流を減少させることおよび心筋梗塞の作用 を改良することに効果的であることを示している。再潅流損傷か改善される程度 に、救済された心筋の絶対量は増加し、再潅流が臨床的に有用である時間帯か伸 びる。５ｃＲ１での治療は次のセクションで記載されまたは急性梗塞中のふくら んだ冠状血管形成に、血栓溶解物と有用な同時療法となる。

１５、実施例　可溶性補体レセプター１　（ｓＣＲ−１）とｐ−アニフィル化ヒ トプラスミノーゲンーストレプトキナーゼーアクチベーター複合体（ＡＰＳＡＣ ）の共処方セクション１２．２で記載されているように調製された精製５ＣＲ− １（滅菌ダルベコリン酸緩衝食塩水中０．９３ｍｇ。

１、０　ｍｌ）を滅菌水（４，０ｍ１）中に復元したＡＰＳＡＣのバイアルに添 加した。ＡＰＳＡＣ調製物は次のものを含有した。

ＡＰＳＡＣ：３０単位 Ｄ−マンニトール　１００ｍｇ ヒト血清アルブミンＥ、　Ｐ、　３０ｍｇｐ−アミツノフェニール　ｐ−了二セ ート（ａｎｉｓａｔｅ）ＨＣＩ　０．１５ｍｇし一リシンＨｅ　ｌ　３５ｍｇ ６−アミノヘキサン酸　１．４ｍｇ （全ての数字は通常の分析的な変化を受ける）溶液をよく混合し、バイアルは固 体ＣＯ□を用いて一７８°Ｃに凍結した。生成物を２−３　ｍｂａｒ／　−６０ ℃（圧縮器温度）で２４時間凍結乾燥しバイアルを再び栓して一７０°Ｃに置い た。復元するために、バイアルを０．１Ｍヘペス、０．１５Ｍ　ＮａＣ１ｐ８７ ．４　（１，０ｍ１）中に溶解し、氷の上に置いた。アッセイ希釈はこのへペス 緩衝液で作った。対照として、ＡＰＳＡＣのみ（同じバッチ）のバイアルを同じ 方法で復元し、５ＣＲ−１（同じバッチ）の新しく解かしたサンプルも検査した 。試料はセクション１３．２．１．に記載されている方法に従って補体媒介溶血 の阻害をアッセイし、結果は下の表Ｈ［ｒに示されている。

表Ｘ［ｌｌ ５ＣＲ−１／ＡＰＳＡＣ，ＡＰＳＡＣおよび５ＣＲ−１の抗溶血活性比較１１： 　５００　４６５　９７．５（１，１）　９６．８（１，２）　０１：　２５０ ０　９３　９０．９（０，７）　９０．６（１，３）　０１：５０００　４６． ５　８１．５（２，３）　８２．６（２，５）　ＮＤｌ：１２５００　１８．６ 　５４．６（２，４）　５１．４（２，６）　Ｏｌ・５００００　４．６５　１ １．０（２，４）　１３．２（０，６）　０ブラケツト中の数字は４回測定した 標準誤差表Ｘ１１のデータに合わせた曲線は溶血を５０％阻害する５ＣＲ−１濃 度の値を示し５ＣＲ−１／ＡＰＳＡＣおよび５ＣＲ−１のみには１５．７±３． ０　ｍｇ／ｍｌおよび１６．０±２．９　ｎｇ／ｍｌである。これらの数字は異 ならず、結果は５ＣＲ−１の活性かＡＰＳＡＣ医療用量形態と共処方により影響 されないことＣ３ｂ結合部位を失うことは機能変化と関連している。

ヒトＣＲＩはＣ３ｂまたはＣ４ｂの別々の結合部位をコードする直列の長い相同 的くり返しくＬＨＲ）部分から成っている。不同の交叉を有する相同的組換えか ＬＨＲのそれらの全数か異なるＣＲＩ対立遺伝子を生じる遺伝子メカニズムとし て提案されている。Ｆアロタイプは４　ＬＨＲを有し、５′から３′へＬＨＲ− Ａ、　−Ｂ、　−Ｃ，−Ｄと名付けられている。ＬＨＲ−Ａ中の部位はＣ４ｂに 優先的に結合し、ＬＨＲ−Ｂおよび−ＣのそれらはＣ３ｂを好む。先の研究はＬ ＨＲ−Ｂと類似の配列を育する５番目のＬＨＲおよび高分子量のＳアロタイプ中 の３番目のＣ３ｂ結合部位の存在を明らかにした。本研究において、低分子量Ｆ ′アロタイプの発現と関連している１８ｋｂ　ＥｃｏＲＶフラグメントはｃＤＮ Ａの独特のパターンおよびＬＨＲ−Ｃ特異性イントロンプローブとハイブリダイ ズした。ＬＨＲ−ＢおよびひとつのＣ３ｂ結合部位の欠失はこのＦ゛特異的フラ グメントが現われるメカニズムとして提案された。Ｆ゛アロタイプＳＬＥとの関 連に関する分子メカニズムは１．２、または３、Ｃ３ｂ結合部位を育する可溶性 ５ｃＲ１の機能的比較により探究された。これら３変異種はモノマーＣ３ｂの切 断に補因子として作用するそれらの能力に、とんな前窓な違いも現わさなかった が、ダイマーリガンドのそれらの相対的結合は１００倍以上に変化した。さらに 、ひとつしかＣ３ｂ結合部位を有しない変異種は副経路Ｃ３およびＣ５コンバー ターゼの阻害において少なくとも１０倍効果的でなかった。これらの観察は、Ｆ ゛アロタイプオプソニン化免疫複合体と結合したり、副経路Ｃ３およびＣ５コン バーターゼの形成を阻害したり、たぶん他のＣＲＩ依存性細胞応答を仲介したり するその能力を妨害される、ことを示唆している。それらはまたＣＲ１分子のい くつかの機能はＣ３ｂ結合部位の結合度を増大させることにより強化されると明 らかにしている。

＋６．１．序文 ３０−５０ＫＤ増大分て、サイズの異なるＣＲＩの４アロタイプ形態を記載して いる。各アロタイプと関連している転写物もまた〜１．４　Ｋｂ増大分で異なる ことは、それらの１１次配列かＬＨＲの数において変化することを示している（ Ｗｏｎｇら、１９８３．　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　７２：６８５；Ｄ ｙｋｍａｎＧ、１９８３．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　 Ｕ、Ｓ、Ａ、　８０１６９８；　Ｄｙｋｍａｎら、１９８４．　Ｊ、ＥＸＩＴ、 　Ｍｅｄ、１５９：　６９１；　Ｄｙｋ−ｍａｎら、１９８５．　Ｊ、ｒｍｍｕ ｎｏｌ、１３４：１７８７；　Ｗｏｎｇら、１９８６゜、Ｉ　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ 、１６４：１５３１；　Ｈｏ１ｅｒｓ　ら、１９８７．　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８４：２４５９）、　〜２ ５０ＫＤのＦ（またはＡ）アロタイプには４　ＬＨＲかあり、５゛から３゜へそ れぞれＬＨＲ−Ａ、　−Ｂ、−Ｃ，および−Ｄ（実施例６および７、上記；　Ｗ ｏｎｇら、１９８９．　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６９：８４７）と名付け られている。ＬＨＲ−Ａの最初の２つのＳＣＲはＣ４ｂに結合するその能力を決 定するが、ＬＨＲ−８および−Ｃの相当する構成部分はＣ３ｂに対するそれらの 高い親和力を決定する（上記、実施例９）。ゲノムファージクローンの制限地図 により〜２９０Ｋｄのタージャー（ｌａｒｇｅｒ）Ｓ（またはＢ）アロタイプを コードする遺伝子の分析により、５′半分かＬＨＲ−８で３′半分かＬＨＲ−Ａ のキメラてあり３番目のＣ３ｂ結合部位を含有すると予測される５番目のＬＨＲ か明らかにされた（Ｗｏｎｇら、１９８９．　Ｊ、　ＥＸＩＴ。

Ｍｅｄ、　１６９：８４７）。ＳＬＥの患者に発生率増加か見られ、多発性狼癒 家庭の患者に関連している、〜２１０ＫＤのＣＲＩの最小Ｆ’（またはＣ）アロ タイプは（Ｄｙｋｍａｎら、１９８４゜Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１５９：６９１； 　Ｖａｎ　Ｄｙｎｅら、１９８７．　Ｃｌ１ｎ。

ＥＸＩ）、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　６８：５７０）　Ｉ　ＬＨＲの欠失から生じた ものであり、補体フラグメントてコートされている免疫複合体に効率的に結合す るその能力が妨害される。下記に示されたデータは各ＬＨＲに特異的にイントロ ンプローブを用いてＦ゛対立遺伝子の分子的基礎を明確にしこのアロタイプを発 現する個人に存在するＣＲＩのＥｃｏＲＶ制限断片長多ｕ　（ＲＦＬＰ）を分析 する。Ｆ゛アロタイプＳＬＥとの明らかな関連に関しての説明を提供するために 、■、２、または３、Ｃ３ｂ認識部位を有し、Ｆ’、　Ｆ、　Ｓアロタイプそれ ぞれの予測構造に相当する可溶性５ｃＲ１変異種をダイマーリガンドに結合した り、Ｃ３ｂの切断に補因子として作用したり、副および主経路Ｃ３およびＣ５コ ンバーターゼを阻害する、それらの能力を比較した。

１６、２．材料および方法 ゲノムＤＮＡを末梢血液白血球から調製しＥｃｏＲＶで消化し、電気泳動し以前 記載されているようなササンプロットにより分析した（Ｗｏｎｇら、１９８９． 　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ。

１６４　：１５３１）。ＣＲＩ　ｃＤＮＡプローブ１−１はＬＨＲ全で（７）　 ５ＣＲ−４から−７にハイブリダイズするか、プローブ１−４はＬＨＲ−Ｂおよ び−Ｃの５ＣＲ−１および−２に特異的にハイブリダイズする　（Ｋｌｉｃｋｓ ｔｅｉｎら、１９８７．　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、１６５：１０９５；Ｋ１１ ｃｋｓｔｅｉｎら、１９８８．　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、１６８：１６９９． 　Ｗｏｎｇら、１９８９．　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、１６９：８４７）　、非 コードプローブＰＥハ、ＬＨＲ−８オヨＵ−Ｃ（ＤＳＣＲ−２をコードする２工 クソン間のイントロンとハイブリダイズする。ＰＸはＬＨＲ−Ａおよび−Ｂの５ ＣＲ−６をコードする２工クソン間のイントロンにハイブリダイズし、ＨＥはＬ ＨＲ−Ａおよび−Ｂの５ＣＲ−７の５′側イントロンにハイブリダイズする（Ｗ ｏｎｇら、１９８９、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６９：８４７）　（Ｆｉ ｇ、３４）。Ｆ対立遺伝子か同型接合である個人のＤＮＡ由来のゲノムライブラ リーのＣＲＩクローンを全コード配列にまたがるｃＤＮＡプローブへのハイブリ ダイゼーションによりスクリーンした。Ｆ対立遺伝子にまたがる重複するファー ジクローンの制限地図作成は以前記載（Ｗｏｎｇら、１９８９．　Ｊ、　ＥＸＩ Ｔ。

Ｍｅｄ、１６９：８４７）されているように行った。

ＬＨＲ−Ａの５ＣＲ−ＲからＬＨＲ−Ｂの相当する位置まで及ぶＰｓｔｌフラグ メントをＣＲＩのＦアロタイプの完全なコード配列を含有するプラスミドｐＢＳ ＡＢＣＤから単離した（上記実施例８．１）。これをＰｓｔＴの部分消化により 線状化したｐｉＡＢＣＤ　（上記、実施例８．２）に挿入し、ＬＨＲ−Ｂのそれ と同一のコード配列を有する５番目のＬＨＲの創出した。インフレーム挿入物を 育するｐｉＡＢＢｃＤと名付けられたクローンを制限地図より選択し、全細胞外 ドメインをコードする部分をＸｈｏ　ＩおよびＡｐａＬＩ消化により切断しクレ ノーＤＮＡポリメラーゼで処理した。

平滑末端フラグメントをリンカ−５’　−ＴＧＡＧＣＴＡＧＣＴＣＡ−３’とリ ゲートし、Ｎｈｅ　ｒで消し、ＣＩ）Ｍ８由来物、発現ベクターＡｐ’Ｍ８のＸ ｂａ　１部位に挿入した（Ｓｅｅｄ、　１９８７゜Ｎａｔｕｒｅ　３２９：８４ ０）　ｏ　Ｉ）ａｓｅｃＡＢＢｃＤと名付けたこのプラスミドは第３７番目ＳＣ Ｒの後に挿入したストップコドンを有し、トランスメンブレンおよび細胞質ドメ インをコードする配列を欠いている。プラスミドｐａｓｅｃＡＢＣＤは、類似の 方法を用いてｐＢＳＡＢＣＤからＦアロタイプの４’　ＬＨＲをＡｌｌ’Ｍ８に 転移することにより作成された。３　ＬＨＲだけを含有しｐａｓｅｃＡｃＤと名 付けられた３番目のプラスミドは、Ｌ）ＩＲ−Ａの５ＣＲ−５からＬＨＲ−８の 相当する位置にまで及ぶＰｓｔｌフラグメントのインフレーム欠失により作成さ れた。上記プラスミドのおのおの３０−６０μｇは高グルコースおよびｌＯ％Ｎ ｕｓｅｒｕｍ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。

Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ）を有するダルベツコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）　 （Ｈａｚｅｌｔｏｎ、　Ｌｅｎｅｘａ、　、ＫＳ）中で４００μｇ／ｍｌ　ＤＥ ＡＥデキストランおよび２００μＭクロロキンの存在下で、３７°Ｃ１４時間２ 　Ｘ　１０７ＣＯ３−１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃ ｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ）をトランスフェクトする のに用いた。トランスフェクション培地を取り除いた後、細胞に室温で二価カチ オンなしのＦ（ＢＳＳ中の１０％ＤＭＳＯて３分間ショックを与え（Ａｕｓｕｂ ｅｌら、１９８７、ｉｎ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ。

Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ　ａｎｄ　Ｇｒｅｅｎｅ　Ａｓ５ｏｃ、、 　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）、洗浄しＤＭＥＭおよび１０％ＦＣ３中で培養した。培養 上清を４８時間毎に１０日間収集し遠心により細胞断片を取り除き一７０℃にて 凍結した。上溝を解かし、ＰＭＳＦおよびアジ化ナトリウムをそれぞれ最終濃度 ５ｍＭおよび０．２％になるように添加し、洗剤は溶出緩衝液から省いたことを 除いては（Ｗｏｎｇら、１９８５．　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、　８ ２：３０３；　Ｅｘａｍｐｌｅ　１２．２．１．５ｕｐｒａ）記載されているよ うにアフィニティクロマトグラフィーによりＩＩＩＡり　ＹＺ−１〜５ｅｐｈａ ｒｏｓｅて精製した。精製タンパク質は１０００倍量のＰＢＳで２回透析し、小 さなアリフォート中、−７０°Ｃで凍結した。この方法は、ＢＳＡを標準として 用いたＭｉｃｒ。

ＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ｒＬ）により決定されたよ うに５ｃＲＩ　１５０−２００μｇを通常産出した。タンパク質を５ＤＳ−ＰＡ ＧＥにより５％−１５％アクリルアミドの線勾配を含有するゲルで分析した。

５ｃＲＩの補助因子活性　’ｔｌ製ヒトＣ３（Ｔａｃｋ　＆　Ｐｒａｈｌ。

１９７６、　Ｂｉｏｃｅｈｍｉｓｔｒｙ　１５：４５１２）を３７°Ｃで５分間 ０．５％ＴＰＣＫ−トリプシン（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ） で処理し、４倍モル過剰の大豆トリプシン阻害剤を添加することにより反応停止 した。Ｉｏｄｏｇｅｎ　（Ｐｉｅｒｃｅ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ。

ＩＬ）を泪いて５Ｘ１０’の比放射能となるまでＣ３１）を１２５１で標識した 。Ｃ３Ｂ　２００ｎｇ、インタＩ　１００ｎｇ（Ｆｅ１００ｎ。

１９７７、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１１９：１２４８）を種々の量の２０ｕ ｌ　ＰＢＳ中の５ｃＲ１とともに３７°Ｃで１時間インキュベートすることによ り５ｃＲ１の補助因子活性を測定した（Ｗｏｎｇ等、１９８５、　Ｊ、　ｒｍｍ ｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、　８２：３０３；実施例１１．上記）。

０．１Ｍジチオスレイトールを含有する５ＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液等量中で試 料を煮沸することにより反応を停止した。電気泳動およびオートラジオグラフィ ーの後、α゛鎖の位置に相当する乾燥ゲルの領域を切除し、放射能の量をＢｅｃ ｋｍａｎのガンマカウンターで測定した（Ｗｏｎｇ等、１９８５．　Ｊ、　Ｉｍ ｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、　８２：３０３）　、　ＣＲＩ非存在下のα゛鎖に関 連する計数を１００％対照として採用した。

２量体Ｃ３ｂを結合する５ｃＲ１の容量　Ｃ３ｂをジメチスベリミデート　（Ｓ ｉｇｍａ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ＞（Ｗｉｌｓｏｎ等、１９８２、　Ｎ ｅｗ　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３０７：９８１）または１．６−ビスマレ イミドヘキサン（Ｐｉｅｒｃｅ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬＸＷｅｉｓｍａｎ等 、１９９０．５ｃｉｅｎｃｅｎ　２４９：ｔ４６）で架橋し、ＰＢＳ中４．５％ 〜３０％スクロースの一次勾配で沈降させることにより２量体を選択した（Ｗｉ 　１ｓｏｎ等、１９８２．　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、　Ｊ。

Ｍｅｄ、　３０７：９８１）　、何れの方法でも１〜３　Ｘ　１０”Ｍ−’（７ ）Ｉ囲の会合定数（Ｋａ）で赤血球ＣＲＩと結合した２量体か得られた。”’Ｉ 　−Ｃ３ｂ２量体３００ｎｇ　（４ｘ　１０’ｃｐｍ／ｕｇ）を、漸増量の未標 識の単量体または２量体のＣ３ｂまたは異る可溶性形態の５ｃＲ１の存在下また は非存在下、ｏ、１％ＢＳＡを含存するＨＢＳＳ　２０Ｏｕｌ中で、２Ｘ１０’ （７）赤血球とともにインキュベートした（Ｗｅｉｓｍａｎ等、１９９０．２４ ９：１４６）。氷上１時間の後、ジブチルフタレートを通して赤血球を遠心分離 することにより、細胞結合リガンドを非結合物質から分離した（Ｗｉ　１ｓｏｎ ）等、１９８２．　Ｎｅｗεｎｇ１．　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３０７：９８１）。過 剰ウサギｒｇＧ抗ＣＲＩの存在下で結合した２量体Ｃ３ｂの量を非特異的バック グラウンド値として採用し、何れの阻害剤も存在しない場合に結合した特異的計 数を１００％対照として採用した。

これ等全ての結合試験について、１人の正常な個体から採取した赤血球を使用し た。これらの細胞はＦアロタイプについてホモ接合であり、比較的大量のＣＲ− １を存していた（−８００ＹＺ−１ｍＡＢ結合部位）。

代替えおよび従来の経路転化酵素の阻害　代替経路の活性化を評価するために、 漸増量のｓＣＲ１の非存在下または存在下で、２　ｍＭ　ＭｇＣｆ２および８　 ｍＭ　ＥＧＴＡとともにＶｅｒｏｎａｌ緩衝食塩水中で５ＸＩＯ’チモサン粒子 （Ｄｒ。

Ｊｏｙｃｅ　Ｃｚｏｐ、Ｈａｒｖａｒｄ　Ｍｅｄｉｃａｌ　５ｃｈｏｏｌ、Ｂｏ ｓｔｏｎ、ＭＡ提供）と供に２５％ヒト血清をインキュベートした。従来の経路 の活性化を評価するために、熱凝集ウサギｒｇＧ６０ｕｇ／ｍｌをチモサンと置 き換え、０．５ｍＭ　ＭｇＣ１ｚおよび０、１５ｍＭ　ＣａＣ１ｚと供にＶｅｒ ｏｎａｌ緩衝食塩水中で反応を行なった（Ｗｅｉｓｍａｎ等、１９９０．５ｃｉ ｅｎｃｅ　２４９＋１４６）。３７°Ｃで４０分間インキュベートした後、１０ ｍＭ　ＥＤＴＡを添加することにより反応を停止し、ラジオイノムアッセイキッ ト（Ａｍｅｒｓｈａｍ、　Ｃｈｉｃａｇｏ、　ＩＬ）を用いてＣ３ａおよびＣ５ ａの分解の量を測定した。

ブを発現した個体のＤＮＡをＥｃｏＲＶで消化した場合にＣＲ１ｃＤＮＡプロー ブ１１を用いたササンプロットのプローブで１８ｋｂの断片が更に観察されたこ とを以前報告した（Ｗｏｎｇ等、１９８６．　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、１６４ ：１５３１）　（図３３）。

このプローブは本来ＬＨＲ−Ｂ内の５ＣＲ−３〜ＳＣＲ〜７に由来するものであ るかその配列は他のしｌ（ｆ？の４〜７番目にハイブリダイズするのに十分な相 同性を有していた（実施例６および７、上記；　Ｋ１１ｃｋｓｔｅｉｎ等、１９ ８７．　Ｊ。

Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６５：１０９５；　Ｋ１１ｃｋｓｔｅｉｎ等、１９８８ ．　Ｊ、　ＥＸｐ。

Ｍｅｄ、Ｉ６８：１６９９；　Ｗｏｎｇ等、１９８９．　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅ ｄ、　１６９：８４７）。

各断片をあるＬｌ（１？に割り付けるために、Ｆアレル全体に渡る重複ゲノミッ ククローンのＥｃｏＲＶ地図を調へた（図３４）。９．４ｋｂおよび２２ｋｂの 断片かそれぞれＬＨＲ−Ａおよび−Ｄから推定されるものに相当した。これはイ ントロンプローブＰＸおよびＨＥへ９．４ｋｂ断片はハイブリダイズてきるが２ ２ｋｂ断片はてきないことにより確認された（図３３）。ＬＨＲ−ＢにはＥｃｏ ＲＶ部位は存在しないため、全てのプローブにハイブリダイズしたプロットの最 上部の最大の断片かＬＨＲ−Ｂおよび殆どのＬＨＲ−Ｃに渡る一３２ｋｂ断片を 示した（図３３および３４）。以前報告したＣＲ１様の偽遺伝子（Ｗｏｎｇ等、 １９８９．　Ｊ、　ＥＸｐ、　Ｍｅｄ、　１６９：８７４）に渡るゲノミックク ローンの制限酵素地図により、２０ｋｂおよび１５ｋｂの断片はこの領域に由来 するものであることがわかる（図３３）。

Ｆ°アロタイプの発現に関わる１８ｋｂＥｃｏＲＶ断片はｃＤＮＡプローブ１’ −４およびイントロンプローブＰＥにハイブリダイズされ、これかＬＨＲ−８お よび−Ｃの５°側半分を含むことか示された。この断片はイントロンプローブＰ Ｘおよび）ＩＥにはハイブリダイズされなかったため、ＬＨＲ−Ｂの３゛側半を 欠損していることが示された（ＩＮ３３）。

ＬＨＲ−Ｂまたは一３２ｋｂ　ＥｃｏＲＶ断片由来の同様の長さの別の断片の欠 失は、ＬＨＲ−Ａの最も３′側のＥｃｏＲＶ部位からＬＨＲ−Ｃの最も５°側の ＥｃｏＲＶ部位に伸びる１８ｋｂの断片をもたらす（図３４）。このような断片 はプローブ１〜４゜ＰＥおよびＩ−１にのみハイブリダイズされ、図３３の結果 と合致する。ＬＨＲ−ＢのＰＸおよびＨＥ部位を含むいずれの一１５ｋｂの欠失 も必然的にＬＨＲ−Ｂまたは−Ｃの何れかのＣ３ｂ結合部位を含む、クソン少な くとも１つ含むため、得られる３個のＬｌ（Ｒのアレルは１つのＣ１６結合部位 のみニン作用を受けた免疫複合体または多量体のリガンドに対するＣＲＩアロタ イプの親和性の直接の比較は、Ｆ゛アロタイプ対してホモ接合性の個体が発見さ れていないため、行なわれてない。完全なＣＲＩおよびｃＤＮＡの配列およびゲ ノム分析の結果を用いることにより、種々の多形性変異体について予測された構 造を有する５ｃＲ１を作成することができた。Ｃ３ｂ　２量体との２価の相互作 用について各アロタイプの個々のＣＲ１分子の容量を評価するために、最も３° 側のＳＣＲの末端と膜間ドメインの開始部の間に停止コドンを挿入することによ り、可溶性ＣＲＩに対するｃＤＮＡの構築を行なった。この方法により、２量体 Ｃ３ｂと膜結合ＣＲＩの離れて隣接する分子との間の相互作用の可能性を排除で きる。更に、可溶性ＣＲＩの使用により、膜由来調製物の可溶性を維持するため に必要な洗剤による酵素検定における干渉作用の可能性を無くすることかできる 。ＬＨＲの挿入または欠失のために用いる方法は読み枠を温存するために保存さ れた制限酵素部位を利用している。挿入される、または欠失するＰｓｔｌ断片は ＬＨＲ−Ａの５ＣＲ−５，−６゜−７およびＬＨＲ−Ｂの５ＣＲ−１，−２，− ３および−４をコードしていた（図３５）。３番目〜７番目のＳＣＲのアミノ酸 配列はＬＨＲ−Ａおよび−Ｂにおいて同一であるため（図３５）（実施例６およ び７、上記）、これらの方法によりＬＨＲ−Ｂと等しい配列の挿入または欠失が 行なわれる。従ってプラスミドｐａｓｅｃＡＣＤ、ｐａｓｅｃＡＢＣＥ、および ｐａｓｅｃＡＢＢそれぞれ有するような蛋白をコードする。

可溶性組換体ＣＲＩは、ＣＲ１プラスミドでトランスフェクションされたＣＯ３ 細胞の培養上澄みからＹＺ−１−セファロース上のクロマトグラフィーにより単 離した。

各５ｃＲ１蛋白は９５％を超える純度を有しており、３つの形態は、天然のアロ タイプで観察されるものと同様に、５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で非還元条件下で一３０ ｋｂで漸増するＭｒ差を示した（ＩＮ３５）。ベクターＡｐ’Ｍ８のみでトラン スフェクションしたＣＯ８細胞の２″Ｓ−システィンによる生合成標識では、ｙ ｚ−ｉセファロースへのＣＲＩ様蛋白の吸収を示さなかった。更に、可溶性５ｃ Ｒ１は、＋２５１標識赤血球から単離されたＣＲＩと同様のＭｒを有しており、 これは各分子から僅か７０のアミノ酸が欠失していたことと合致していた。ｐａ ｓｅｃＡＢＢＣＤ−またはｐａｓｅｃＡＢＣＤでトランスフェクションした細胞 から単離された５ｃＲ１を含有するレーン内には、より小さい形態と同様のＭｒ を有する蛋白少量か観察された（レーン２および３）。これらは、トランスフェ クションされたＣＯ８細胞内に自然発生した相同組換産物を表わしている。

５ｃＲ１の補助因子活性　放射標識Ｃ３ｂを１Ｃ３ｂおよびＣ３ａｇ断片に転換 した補助因子検定において種々の形態の５ｃＲ１の機能的統合性を測定した。Ｃ ３ｂのα′鎖の５０％因子Ｉ媒介分解に必要な５ｃＲ１の量は、ｐａｓｅｃＡＢ ＢＣＤ由来蛋白て３．５　ｎＭ−ｐａｓｅｃＡｃＤ由来蛋白で８ｎＭであり、３ つの形態の差は僅かであった（図３７）。更に、Ｃ３ｂからＣ３ａｇへの変換は １０ｎＭ〜２０ｎＭの全ての形態の５ｃＲ１の添加て認められた。即ち、可溶性 組換体ＣＲＩは、Ｃ３ｂｃ結合部位の数に関係なく、Ｃ３ｂに結合する天然の分 子の容量を保持しており、因子■分解のための補助因子として作用した。

２量体Ｃ３ｂに結合する５ｃＲ１の容量　Ｃ３ｂコーティング標的の結合に対す る異なる数のＬＪ（Ｒ−Ｂを有することの作用を評価するために、５ｃＲ１変異 体を用いて赤血球ＣＲＩによる１２５ｒ−Ｃ３ｂ２量体の取り込みを阻害した。

５０％阻害に必要な濃度はリガンドまたは細胞の結合受容体の何れかの相対的結 合を反映していた。図３８に示す実験において、未標識のＣ３ｂ　２量体１０ｎ Ｍが１２Ｓｒ−Ｃ３ｂ２量体と赤血球ＣＲＩとの間の相互作用の５０％阻害に必 要であった。単量体Ｃ３ｂと受容体の相互作用はかなり弱く、同様の阻害を達成 するためには、１ｕＭまたは１００倍を超えるこのリガンドが必要であった（図 ３８）。この単量体相互作用の低い結合性は、２量体Ｃ３ｂリガンドによる可溶 性ＣＲＩの２つの異なる分子の架橋がこれらの条件下では望ましくなく、２つの 分子内結合部位の占有か有効な拮抗には必要であることを示している。

この２価の相互作用は、５０％阻害のためにはｐａｓｅｃＡＢｃＤおよびｐａｓ ｅｃＡｃＤに由来する５ｃＲ１がそれぞれｌＯｎＭおよびＩＱＯｎＭ必要である ことにより確認された。興味深いことに、３つのＣ３ｂ結合部位を有するｐａｓ ｅｃＡＢＢＣＤ由来５ｃＲ１の僅かＩｎＭが同様の作用のために必要であった（ 図３８）。即ち、１つ、２つまたは３つのＣ３ｂ結合部位を有する可溶性ＣＲＩ 形態はその２量体Ｃ３ｂの結合性においては異っていたが、因子■分解の基質と して使用したこのリガンドの単量体形態については異なっていなかった（図３７ ）。

代替および従来の経路添加酵素の阻害　チモサンまたは凝集１ｇＧとともにヒト 血清をインキュベートした差異に遊離するＣ３ａおよびＣ５ａを測定することに より、代替および従来の経路添加酵素をブロックする可溶性ＣＲＩ変異体の容量 を比較した。代替経路Ｃ３およびＣ５の転化酵素の両方の５０％阻害を達成する ために僅か１〜２ｎＭのｐａｓｅｃＡＢＢｃＤまたはｐａｓｅｃＡＢｃＤに由来 するｓＣＲ１か必要であったのに対し、同様の作用をえるためにｐａｓｅｃＡＣ Ｄの５ｃＲ１は３０倍を超える濃度が必要であった（図３９Ａおよび４０Ａ）。

これは、５ｃＲ１変異体か０５転化酵素内のＣ３ｂホモ２量体と異るように結合 するという上記予測と合致していた（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ等、１９８８．　Ｊ、 　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１４１　：３８９５）。Ｃ３点か酵素でも同様の作用かみとめられたことは、プ ロベルジン安定化Ｃ３ｂＢｂ複合体に関わるＣ３ｂの複数の分子の存在を示して いた。対照的に、５ｃＲ１の変異体の間で従来の経路Ｃ３およびＣ５の転化酵素 を阻害する容量には差が観察されず（図３９Ｂおよび４０Ｂ）、これらか同様に ０５転化酵素のＣ４ｂＣ２ａ複合体またはＣ４ｂ／Ｃ３ｂヘテロ２量体内のＣ４ ｂ分子に結合したことを示していた（Ｔａｋａｔａ等、１９８７．　Ｊ、　ＥＸ Ｉ）、　Ｍｅｄ、１６５：１４９４）。更にｐａｓｅｃＡＣＤ肉来分子を除き、 代替経路と比較して従来の経路の酵素を阻害するためには２〜１０倍より高濃度 の組み換えＣＲＩが必要であり、これはおそらくはＣ４ｂ含有転化酵素に対する ５ｃＲ１の低い結合性を反映していると考えられた。

１６．４．考察 ヒトＣＲＩの各多形性変異体の各々は異る数のＬＨＲでコードされていることは 、各アロタイプに関わる転写における−１．３ｋｂの差により予測されている（ Ｗｏｎｇ等、１９８６、　Ｊ、　ＥＸｐ、　Ｍｅｄ、　１６４：１５３１；　Ｈ ｏ１ｅｒｓ等、１９８７゜Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ ＳＡ、　８４：２４５９）。ＣＲＩ遺伝子の異るＬＨＲのコード領域の相同性と 相当する非コード領域の相同性の間の平行性により、ゲノミッククローンの制限 酵素地図に基づいてコード配列を予測することか可能になった。即ち、ＬＨＲ− ８に似た５゛側半およびＬＨＲ−Ａに似た３°側半分に有するＳアレルにおける ５番目のＬｌ（ＲはＳアロタイプ内のＣ３ｂに対する３番目の結合部位をコード していると予測された（Ｗｏｎｇ等、１９８９、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　 １６９：８４７）。他の１９の酵素の内ＥｃｏＲＶは、Ｆ°アロタイプに関わる ＲＦＬＰを明らかにした唯一の制限酵素であるため（Ｗｏｎｇ等、１９８９．　 Ｊ、　Ｅｘｔ）、　Ｍｅｄ。

１６４：１５３１）、このアレル内の欠失は明らかに高度な相同性を有する領域 に関与していた。本試験において、１８ｋｂのＥｃｏＲＶ断片が、ＬＨＲ−Ｃに 特異的にエクソンおよびイントロンに由来するプローブの組合せによりハイブリ ダイズされたＦ゛アロタイプ発現した個体に関わるものであった（ＷｏＢ等、１ ９８９．　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６４：１５３１）。このパターンは１ つのＣ３ｂ結合部位の損失をもたらすＬＨＲ−Ｂまたは同等の領域の欠失とのみ 合致していた。１８ｋｂ断片の現われがＨＬＲ−８または一〇に由来する一３０ ｋｂ断片のササンプロット上の消失を伴っていたことは、Ｆ“アレルに対してホ モ接合性の個体を比較のため得ることができなかったため、確認できなかった。

このアロタイプに対するより小さい転写物は代替のスプライシングを通じて現わ れると考えられるが（Ｗｏｎｇ等、１９８６．　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１ ６４：　１５３１；　Ｈｏ１ｅｒｓ等、１９８７゜Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８４：　２４５９）、これらの機構は観察され たＥｃｏＲＶ　ＲＦＬＰを説明できない。

５ＬＥ８とのＦ゛アロタイプ関わりは、オプソニン作用を受けた免疫複合体に結 合するこの変異体の容量が低減しているという示唆と合致している（Ｄｙｋｍａ ｎ等、１９８４、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、１５９：６９１；　Ｖａｎ　Ｄｙ ｎｅ等、１９８７．　Ｃｌ１ｎ。

Ｅｘｐ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　６８：５７０）　、　ＬＨＲ−Ｂの数の異る５ｃ Ｒ１の官能基容量を比較した。最近の試験における可溶性ＣＲＩによるＣ３ｂ　 ２量体取り込みの効果的な拮抗は直列結合部位の占有が起こることを示しくＷｅ ｉｓｍａｎ等、１９９０゜５ｃｉｅｎｃｅ　２４９：１４６）、即ち、この２価 のリガンドに対して各受容体分子の結合を直接評価することが可能になった。我 々の方法は、挿入された停止コドンの部位、および、ＬＨＲ−８を１つまたは２ つ有するか有さないＣＲ１分子をコードするプラスミドで一時的にトランスフェ クションしたＣＯ８細胞の培養上澄みから精製した可溶性ＣＲＩの使用の両方に おいて、異っている（図３５）。

赤血球への放射標識２量体Ｃ３ｂの結合を５０％阻害するために必要な単量体ま たは２量体のＣ３ｂおよびｐａＳｅＣＡＢＣＤ由来の組み換えＣＲＩの量は過去 に報告されたものと極めて近いものであった（Ｗｅｉｓｍａｎ等、１９９０．５ ｃｉｅｎｃｅ２４９　：１４６）。更に、２量体Ｃ３ｂに対する精製５ｃＲ１の 結合性は、各Ｃ３ｂ結合部位の添加により１０倍増大し、ｐａｓｅｃＡＣＤまた はｐａｓｅｃＡＢＢｃＤに由来する５ｃＲ１分子の間には１００倍の差が生じた （図３８）。ＬＨＲ−Ａ内のＣ４ｂ結合部位かＣ３ｂに対する低い親和性を保持 しているという以前の観察結果と矛盾することなく　（Ｋｌｉｃｋｓｔｅｉｎ等 、１９８８、　Ｊ、　ＥＸｐ、　Ｍｅｄ、　１６８：１６９９）、ＬＨＲ−Ａお よび−Ｃのみを有するｐａｓｅｃＡｃＤ由来５ｃＲ１は、放射標識２１体の取り 込みのブロックにおいてＣ３ｂ単量体よりもより効果的であった（図３８）。ｐ ａｓｅｃＡＢＣＤ由来分子と比較してｐａｓｅｃＡＢＢｃＤ由来ＣＲＩに対して より高い結合性が観察されたことも同様に、２対の結合部位の拡大を示唆してお り（図３８）、また、このようなＬＨＲの直鎖配列には多価の相互作用が好まし いという以前の仮説を確認するものであった（Ｋｌｉｃｋｓｔｅｉｎ等、１９８ ８．　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ。

１６８：１６９９；　Ｗｏｎｇ等、１９８９．　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１ ６９：８４７）。

単量体Ｃ３ｂに対するＣＲＩの結合性は比較的低いため（図３８）、本試験（図 ３７）および他の試験（Ｓｅｙａ等、１９８５、　Ｊ、　ｒｍｍｕｎｏｌ、　１ ３５：２６６６）において種々の５ｃＲ１形態の補助因子容量における見かけの 差か無いことは、使用した条件には単量体リガンドによる１つより多い活性部位 の同時占有か適さなかったことを示している。

代替経路Ｃ３およびＣ５の転化酵素をブロックする可溶性ＣＲＩ変異体の有効性 における差は、Ｃ３ｂホモ２量体に対するそれらの親和性か異ることと合致する （Ｋｉｎｏ−ｓｈｉｔａ等、１９８８．　Ｊ、　［ｍｍｕｎｏｌ、　１４１：３ ８９５）　、実際に、本検定において、２つ以上のＣ３ｂ結合部位を有する５ｃ Ｒ１変異体は、１つのみの部位を育するものよりも、少なくとも３０倍より有効 であった（図３９Ａおよび４０Ａ）。

しかしなから、ｐａｓｅｃＡＢＢＣＤ由来５ｃＲ１は、その結合性は液相検定で はかなり高値てあった（図３８）ものの、ｐａｓｅｃＡＢＣＤ由来のものほど有 効ではなかった（図３９Ａおよび４０Ａ）。即ち、本検定における最大容量は活 性化表面上の転化酵素部位の地形学的分布により制限されると考えられる。試験 したこれらの変異体の全てはＣ，４ｂては１つの部位、そしてＣ３ｂについては 少なくとも１つの隣接部位を保持していたため、その構造は、それらが従来の経 路の転化酵素を阻害する容量が同等であることと合致している（図３９Ｂおよび ４０Ｂ）（Ｔａｋａｔａ等、１９８７．　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６５： １４９４）。我々の観察結果と別の試験の結果との間の差は、前により安定性の 低い液相の転化酵素を使用したことや精製形態のかわりにＦ（またはＡ）および Ｆ”　（またはＣ）のアロタイプの混合物を使用したこと（Ｓｅｙａ等、１９８ ５．　Ｊ。

［ｍｍｕｎｏｌ、　１３５：２６６１）により説明されるであろう。また、その 試験で使用されたＦ°変異体は異る組成のＬＨＲを存していたことからも説明さ れている。

ＣＲＩによる免疫複合体の取り込みの効率は赤血球上のこの受容体の集団形成に より増強される（Ｐａｃｃａｕｄ等、１９８８、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１ ４１：３８８９；　Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ　＆　Ｋａｚａｔｃｈ−ｋｉｎｅ、　１ ９８９．　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４２：２０３１）　、少ないＣＲＩＯ数 を育する個体のこの受容体の集団はより少なく、または集団当りの受容体分子数 もより少ない（Ｐａｃｃａｕｄ等、１９８８．　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４１： ３８８９）　、即ちＳＬＥ患者にはＦ°アロタイプおよび少量のＣＲＩが存在す る結果、Ｃ３ｂおよびＣ４ｂの結合部位の総量が少なく、そして循環系からの免 疫複合体のクリアランスの効率か低くなる（Ｄｙｋｍａｎ等、１９８４．　Ｊ、 　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１５９：６９１；　Ｖａｎ　Ｄｙｎｅ等、１９８７．　 Ｃｌ１ｎ、　Ｅｘｐ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　６８：５７０；　Ｗｉｌｓｏｎ等、１ ９８７、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｒｅｓ、　６：１９２；　Ｍｉｙａｋａｗａ等、 １９８１゜Ｌａｎｃｅｔ　ｉｉ：４９３；　５ｃｈｉｆｆｅｒｌｉ等、１９８８ ．　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１４０　：８９９）。従来の経路の転化酵素で観察された５ｃＲ１の低い親和性 （図３９および４０）は、可溶性免疫複合体上に付着するＣ４ｂおよびＣ３ｂの 相対量がＣＲ１依存取り込みおよびプロセシングにとって重要であることを示し ている。いくつかの条件下て好中球内に予備集団形成したＣＲＩか存在しないこ と（Ｐａｃｃａｕｄ等、１９９０．　Ｅｕｒ。

Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　２０：２８３）は、受容体の凝集を誘発する機構か育 核細胞内の生物学的反応を開始させるために重要であることを示唆している（Ｄ ａｈａ等、１９８４．　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３２：１１９７；　Ｂａｃｌｅ等、１９９０．　Ｊ、Ｉｍｍ ｕｎｏｌ、１４４１４７）。より短いＣＲＩアロタイプはこのような相互作用の 効率を更に低下させ、そして組織炎症部位における受容体媒介細胞応答の傷害を もたらすと考えられる。

１７、微生物の寄託 完全な長さのＣＲＩタンパク質をコードするプラスチックｐｉＡＢｃＤ（ｐｃＲ ｌ−ｐｉＡＢＣＤと称する）を担持する大腸菌ＤＫＩ／Ｐ３を、イリノイ州Ｐｅ ｏｒｉａにあるＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　 Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＮＲＲＬ）に１９８８年３月３１日に寄託し、登録番 号Ｂ−１８３５５を指定された。

可溶性ＣＩ’？１分子をコードするプラスミドｐＢｓｃＲＩｃ／ｐＴｃｓｇｐｔ クローン３５．６を担持するチャイニーズハムスター卵巣細胞系ＤＵＸ　Ｂｌｌ を、メリーランド州、ＲｏｃｋｖｉｌｌｅにあるＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　 Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）に１９８９年３月２３日 に寄託し、登録番号ＣＲＬ　１００５２を指定された。

本発明は、寄託された微生物により範囲を限定されるべきではない。何となれば 、寄託された実施態様は本発明の一つの特徴の単なる例示として意図され、機能 的に同等である任意の微生物が本発明の範囲内にあるからである。実際に、本明 細書に示され説明されたものの他に、本発明の種々の改変か、上記の説明及び添 付図面から当業者に明らかになる。このような改変は、請求の範匠の中に入るこ とが意図される。

また、ヌクレオチドに関して示された全ての塩基対の大きさは概略であり、説明 の目的で使用されることか理解される。

種々の文献が本明細書中に引用されており、その開示はそのまま参考として含ま れる。

０←　Ｏａ　ｏ←　ＯＦ’　ＯＣＪ　ＯＱ　０ｈｔＪ）（ＪＱ、ＦＪ←〉　の← −！く〉　ｏ←〉　１←＞　ＮＬ）Ｑト　ト ごｌｊ　ｇ＞　５Ｑ、　噺２　＝“　と“　と“３ａ、ｇ＜　じ１　じ４　ゴ２ 　ご０　ご２ト　ビ・　ｔ−Ｆ−ミ・　９・　ヨ・ ごエ　ｅ、認、　已、　ご、　じエ　眸。

４　（Ｊ　Ｏ（Ｌｌ　（Ｊ　（ く ｒ、３ｏ、４ｃｎ　ｕｔｓ、ｇ＋ｖ　ｇｕ　２ｚ　’Ｂｃｉ？（Ｕ　←　ＣＪ　 Ｅ−（Ｊ ＱＶＪ　Ｏｏ　０く　←−トー　じ区　Ｑの←　ＱＯ（（（ＪＥ− ト ｒ、２ｖｒ　ａａ　ゴ２　８１　シ１　已０　８０８　と、舅（ト　ト　ト　ト ８　υ　ｕ＜ｈ　ＣＪ　ａ Ｑ−ｕｎ、　１−＋−ベー　くロ　←〉Ｅ−Ｕ　（Ｊ　（Ｊ　Ｅ−ロ　ロ ：むｈ　”：’：３＠　斜３　：８４８淀。：定。＝８，８ご。

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Claims (129)

【特許請求の範囲】
1. １．実質的に第１図に示される全長ＣＲ１タンパク質のヌクレオチド番号２８か ら６１４７までをコードする配列を含有する核酸配列。
2. ２．ＤＮＡ配列からなる請求項１記載の配列。
3. ３．ＲＮＡ配列からなる請求項１記載の配列。
4. ４．請求項１記載の配列からなる組換え核酸ベクター。
5. ５．請求項２記載の配列からなる組換え核酸ベクター。
6. ６．ｐＡＢＣＤからなる組換えＤＮＡベクター。
7. ７．ＮＲＲＬに寄託されておりそして受託番号Ｂ−１８３５５を有する、ｐｉＡ ＢＣＤからなる組換えＤＮＡベクター。
8. ８．請求項１記載の配列からなる組換え発現ベクター。
9. ９．前記配列を細菌中で発現しうる請求項８記載の発現ベクター。
10. １０．前記配列を哺乳類細胞中で発現しうる請求項８記載の発現ベクター。
11. １１．ＮＲＲＬに寄託されておりそして受託番号Ｂ−１８３５５を有する、ｐｉ ＡＢＣＤからなる請求項１０記載の発現ベクター。
12. １２．請求項１記載の配列からなる組換え細胞。
13. １３．請求項４記載の核酸ベクターを含有する細胞からなる組換え細胞。
14. １４．請求項５記載の核酸ベクターからなる細胞からなる組換え細胞。
15. １５．請求項８記載の核酸ベクターからなる細胞からなる組換え細胞。
16. １６．請求項１０記載の核酸ベクターからなる細胞からなる組換え細胞。
17. １７．細菌からなる請求項１２、１３または１４記載の組換え細胞。
18. １８．ＮＲＲＬに寄託されておりそして受託番号Ｂ−１８３５５を有するエシェ リヒア・コリ。
19. １９．実質的に第１図に示される配列のヌクレオチド番号２８から１５３３まで からなる核酸配列。
20. ２０．実質的に膜貫通領域を含有しないタンパク質をコードする請求項１９記載 の核酸配列。
21. ２１．前記タンパク質がそれを発現する細胞により分泌される、請求項２０記載 の核酸配列。
22. ２２．前記タンパク質がインビトロで、好中球酸化的バースト、補体仲介溶血、 またはＣ３ａおよびＣ５ａ産生を阻害する能力により検出される機能を有する請 求項２１記載の核酸配列。
23. ２３．ＤＮＡ配列からなる請求項１９、２０または２１記載の核酸配列。
24. ２４．ＲＮＡ配列からなる請求項１９、２０または２１記載の核酸配列。
25. ２５．請求項１９または２０記載の配列からなる組換え核酸バクター。
26. ２６．請求項２１または２２記載の配列からなる組換え核酸ベクター。
27. ２７．請求項１９記載の配列からなる組換え発現ベクター。
28. ２８．請求項２０記載の配列からなる組換え発現ベクター。
29. ２９．請求項２１記載の配列からなる組換え発現ベクター。
30. ３０．ｐＢＳＣＲ１ｃ、ｐＢＳＣＲ１ｓ、ｐＢＭ−ＣＲｌｃ、ｐＢＳＣＲ１ｃ／ ｐＴＣＳｇｐｔおよびｐＢＳＣＲ１ｓ／ｐＴＣＳｇｐｔからなる群から選択され る請求項２８記載の組換え発現ベクター。
31. ３１．ｐＴ−ＣＲ１ｃ１、ｐＴ−ＣＲ１ｃ２、ｐＴ−ＣＲ１ｃ３、ｐＴ−ＣＲ１ ｃ４およびｐＴ−ＣＲ１ｃ５からなる群から選択される請求項２８記載の組換え 発現ベクター。
32. ３２．ＡＴＣＣに寄託されておりそして受託番号ＣＲＬ１００５２を有する、プ ラスミドｐＢＳＣＲ１ｃ／ｐＴＣＳｇｐｔからなる組換えＤＮＡベクター。
33. ３３．請求項１９、２０または２１記載の配列からなる組換え細胞。
34. ３４．細菌からなる請求項３３記載の組換え細胞。
35. ３５．請求項２５記載のベクターからなる細胞からなる組換え細胞。
36. ３６．請求項２６記載のベクターからなる細胞からなる組換え細胞。
37. ３７．請求項２７記載のベクターからなる細胞からなる組換え細胞。
38. ３８．請求項２８記載のベクターからなる細胞からなる組換え細胞。
39. ３９．請求項２９記載のベクターからなる細胞からなる組換え細胞。
40. ４０．ＡＴＣＣに寄託されておりそして受託番号ＣＲＬ１００５２を有する、プ ラスミドｐＢＳＣＲ１ｃ／ｐＴＣＳｇｐｔを担持するチャイニーズハムスター卵 巣細胞ＤＵＸＢ１１。
41. ４１．実質的に第１図に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
42. ４２．Ｃ３ｂと結合しうることを特徴とする請求項４１記載のタンパク質のフラ グメント。
43. ４３．Ｃ４ｂと結合しうることを特徴とする請求項４１記載のタンパク質のフラ グメント。
44. ４４．Ｃ３ｂおよびＣ４ｂと結合しうることを特徴とする請求項４１記載のタン パク質のフラグメント。
45. ４５．ファクターＩコファクター活性を有する請求項４１記載のタンパク質のフ ラグメント。
46. ４６．Ｃ３コンバーターゼ活性を阻害しうる請求項４１記載のタンパク質のフラ グメント。
47. ４７．Ｃ５コンバーターゼ活性を阻害しうる請求項４１記載のタンパク質のフラ グメント。
48. ４８．グリコシル化されている請求項４１記載のタンパク質または２４個のアミ ノ酸を含有するそのフラグメント。
49. ４９．グリコシル化されていない請求項４１記載のタンパク質。
50. ５０．細胞表面タンパク質として発現される請求項４１記載のタンパク質。
51. ５１．第１図に示されるヌクレオチドの番号２８から１５３３までにより実質的 にコードされるアミノ酸配列を含有するタンパク質。
52. ５２．請求項５１記載のタンパク質をコードする核酸配列。
53. ５３．実質的に膜貫通ドメインを含有しない請求項５１記載のタンパク質。
54. ５４．それを発現した細胞により分泌される、請求項５３記載のタンパク質。
55. ５５．実質的に膜貫通領域を含有しないＣＲ１分子。
56. ５６．それを発現した細胞により分泌される、請求項５５記載のＣＲ１分子。
57. ５７．グリコシル化されていない請求項５５記載のＣＲ１分子。
58. ５８．グリコシル化されている請求項５５記載のＣＲ１分子。
59. ５９．インビトロで、好中球酸化的バースト、補体仲介溶血、またはＣ３ａおよ びＣ５ａ産生を阻害する能力により検出される機能を有する請求項５５記載のＣ Ｒ１分子。
60. ６０．ｐＢＳＣＲ１ｃ、ｐＢＳＣＲ１ｓ、ｐＢＭ−ＣＲ１ｃ、ｐＢＳＣＲ１ｃ／ ｇＴＣＳｇｐｔおよびｐＢＳＣＲ１ｓ／ｐＴＣＳｇｐｔからなる群から選択され る核酸ベクターによりコードされる請求項５５記載のＣＲ１分子。
61. ６１．ｐＴ−ＣＲ１ｃ１、ｐＴ−ＣＲ１ｃ２、ｐＴ−ＣＲ１ｃ３、ｐＴ−ＣＲ１ ｃ４およびｐＴ−ＣＲ１ｃ５からなる群から選択される核酸ベクターによりコー ドされる請求項５５記載のＣＲ１分子。
62. ６２．ＡＴＣＣに寄託されておりそして受託番号ＣＲＬ１００５２を有する、プ ラスミドｐＢＳＣＲ１ｃ／ｐＴＣＳｇｐｔを担持するチャイニーズハムスター卵 巣細胞ＤＵＸＢ１１により発現される、請求項５５記載のＣＲ１分子。
63. ６３．請求項４１記載のタンパク質をその表面に発現する組換え細胞。
64. ６４．請求項４２、４３または４５記載のタンパク質を発現する組換え細胞。
65. ６５．請求項５１記載のタンパク質を発現する組換え細胞。
66. ６６．請求項５５記載のタンパク質を発現する組換え細胞。
67. ６７．請求項５６記載のタンパク質を発現する組換え細胞。
68. ６８．２４個のアミノ酸からなる請求項３６記載のタンパク質の、細胞により分 泌されるフラグメントを発現する組換え細胞。
69. ６９．（ａ）ＣＲ１タンパク質またはそのフラグメントからなる試料を得； （ｂ）該試料をカチオン交換高圧液体クロマトグラフィーにかけ；そして （ｃ）該高圧液体クロマトグラフィーカラムからタンパク質またはそのフラグメ ントを溶離する、ことを含んでなるＣＲ１タンパク質またはそのフラグメントの 精製法。
70. ７０．工程（ｃ）の後に （ｄ）前記タンパク質またはそのフラグメントをアニオン交換高圧液体クロマト グラフィーにかけ；そして（ｅ）工程（ｄ）の高圧液体クロマトグラフィーカラ ムからタンパク質またはそのフラグメントを溶離する、ことをさらに含んでなる 、請求項６９記載の方法。
71. ７１．ＣＲ１タンパク質またはそのフラグメントが実質的に膜貫通ドメインを含 有しない請求項６９または７０記載の方法。
72. ７２．（ａ）ＣＲ１分子が分泌されるような様式で、培養中の細胞において、実 質的に膜貫通ドメインを含有しないＣＲ１分子を発現させ； （ｂ）ＣＲ１分子からなる細胞培養液の試料を得；（ｃ）該試料をカチオン交換 高圧液体クロマトグラフィーにかけ；そして （ｄ）該高圧液体クロマトグラフィーカラムからＣＲ１分子を溶離する、 ことを含んでなるＣＲ１分子の精製法。
73. ７３．工程（ｃ）の後に （ｄ）前記分子をアニオン交換高圧液体クロマトグラフィーにかけ；そして （ｅ）工程（ｄ）の高圧液体クロマトグラフィーカラムから該分子を溶離する、 ことをさらに含んでなる請求項７２記載の方法。
74. ７４．請求項１２記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。
75. ７５．請求項１３記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。
76. ７６．請求項１４記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。
77. ７７．請求項１５記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。
78. ７８．請求項３３記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。
79. ７９．請求項３４記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。
80. ８０．請求項３５記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。
81. ８１．請求項３６記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。
82. ８２．請求項３７記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。
83. ８３．請求項３８記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。
84. ８４．請求項３９記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。
85. ８５．請求項４０記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。
86. ８６．請求項４１記載のタンパク質または２４個のアミノ酸からなるそのフラグ メントを患者に投与することを含んでなる、免疫障害または望ましからぬかまた は不適当な補体活性が関わる障害を有する患者の治療法。
87. ８７．請求項４２または４３記載のフラグメントを患者に投与することを含んで なる、免疫障害または望ましからぬかまたは不適当な補体活性が関わる障害を有 する患者の治療法。
88. ８８．請求項４５記載のフラグメントを患者に投与することを含んでなる、免疫 障害または望ましからぬかまたは不適当な補体活性が関わる障害を有する患者の 治療法。
89. ８９．請求項５１、５３または５４記載のフラグメントを投与することを含んで なる、免疫障害または望ましからぬかまたは不適当な補体活性が関わる障害を有 する患者の治療法。
90. ９０．請求項５５記載の分子を患者に投与することを含んでなる、免疫障害また は望ましからぬかまたは不適当な補体活性が関わる障害を有する患者の治療法。
91. ９１．請求項５６記載の分子を患者に投与することを含んでなる、免疫障害また は望ましからぬかまたは不適当な補体活性が関わる障害を有する患者の治療法。
92. ９２．請求項５９記載の分子を患者に投与することを含んでなる、免疫障害また は望ましからぬかまたは不適当な補体活性が関わる障害を有する患者の治療法。
93. ９３．請求項６２記載の分子を患者に投与することを含んでなる、免疫障害また は望ましからぬかまたは不適当な補体活性が関わる障害を有する患者の治療法。
94. ９４．請求項４１記載のタンパク質または２４個のアミノ酸からなるそのフラグ メントを患者に投与することを含んでなる、心筋梗塞に起因する患者の損傷を治 療または予防する方法。
95. ９５．請求項５５記載の分子を患者に投与することを含んでなる、心筋梗塞に起 因する患者の損傷を治療または予防する方法。
96. ９６．請求項５６記載の分子を患者に投与することを含んでなる、心筋梗塞に起 因する患者の損傷を治療または予防する方法。
97. ９７．請求項５９記載の分子を患者に投与することを含んでなる、心筋梗塞に起 因する患者の損傷を治療または予防する方法。
98. ９８．請求項６０または６１記載の分子を患者に投与することを含んでなる、心 筋梗塞に起因する患者の損傷を治療または予防する方法。
99. ９９．請求項６２記載の分子を患者に投与することを含んでなる、心筋梗塞に起 因する患者の損傷を治療または予防する方法。
100. １００．請求項４１記載のタンパク質または２４個のアミノ酸からなるそのフラ グメントを患者に投与することを含んでなる、炎症に起因する患者の損傷を治療 または予防する方法。
101. １０１．請求項５５記載の分子を患者に投与することを含んでなる、炎症に起因 する患者の損傷を治療または予防する方法。
102. １０２．請求項５６記載の分子を患者に投与することを含んでなる、炎症に起因 する患者の損傷を治療または予防する方法。
103. １０３．請求項５９記載の分子を患者に投与することを含んでなる、炎症に起因 する患者の損傷を治療または予防する方法。
104. １０４．請求項６０または６１記載の分子を患者に投与することを含んでなる、 炎症に起因する患者の損傷を治療または予防する方法。
105. １０５．請求項６２記載の分子を患者に投与することを含んでなる、炎症に起因 する患者の損傷を治療または予防する方法。
106. １０６．請求項４２、４３または４４記載のフラグメントを含んでなる分子。
107. １０７．請求項４５、４６または４７記載のフラグメントを含んでなる分子。
108. １０８．請求項５５、５６または５９記載のフラグメントを含んでなる分子。
109. １０９．請求項６０、６１または６２記載のフラグメントを含んでなる分子。
110. １１０．請求項４２、４３または４５記載の効果的量のタンパク質またはフラグ メントおよび医薬的に許容される担体を含んでなる、医薬組成物。
111. １１１．請求項５５、５６または５９記載の効果的量のタンパク質またはフラグ メントおよび医薬的に許容される担体を含んでなる、医薬組成物。
112. １１２．請求項６０、６１または６２記載の効果的量のタンパク質またはフラグ メントおよび医薬的に許容される担体を含んでなる、医薬組成物。
113. １１３．ヒトまたは動物に効果的量の可溶性ＣＲ１タンパク質および効果的量の 血栓溶解剤を投与することを含んでなる、ヒトおよび動物の血栓症状を治療する 方法。
114. １１４．可溶性ＣＲ１タンパク質および血栓溶解剤を同時に投与する、請求項１ １３記載の方法。
115. １１５．ＣＲ１タンパク質がｐＢＳＣＲ１ｃ，ｐＢＳＣＲ１ｓ，ｐＢＭ−ＣＲ１ ｃ，ｐＢＳＣＲ１ｃ／ｐＴＣＳｇｐｔおよびｐＢＳＣＲ１ｓ／ｐＴＣＳｇｐｔか ら成るグループから選ばれる核酸ベクターによりコードされている、請求項１１ ３記載の方法。
116. １１６．血栓溶解剤がプラスミノーゲンアクチベーターである、請求項１１３記 載の方法。
117. １１７．血栓溶解剤が組織プラスミノーゲンアクチベーターまたはその突然変異 タンパク質、１本領ウロキナーゼ、２本領ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼお よびハイブリッドタンパク質が除去可能なブロック基で場合によりブロックされ る線維素溶解活性に必須の触媒部位を有するように、ハイブリッドタンパク質の 鎖の少なくとも１本が線維素溶解活性プロテアーゼ由来である、異なる２本鎖プ ロテアーゼの１鎖に結合された２本鎖プロテアーゼの１鎖を含んでなる線維素溶 解活性ハイブリッドタンパク質から成るグループから選ばれる、請求項１１３記 載の方法。
118. １１８．血栓溶解剤は線維素溶解活性に必須の触媒部位が、加水分解の偽似１次 速度定数が等張水性培地ｐＨ７．４、３７℃で１０−５／秒−１０−３／秒の範 囲であるような速度で加水分解により除去しうる基によりブロックされる、可逆 的にブロックされたインビボ線維素溶解性酵素である、請求項１１３記載の方法 。
119. １１９．血栓溶解剤がアニソイル化ストレプトキナーゼプラスミノーゲンアクチ ベーター複合体（ＡＰＳＡＣ）である、請求項１１３記載の方法。
120. １２０．医薬的に許容される担体または賦形剤と共に可溶性ＣＲ１タンパク質お よび血栓溶解剤を含んでなる、医薬組成物。
121. １２１．血栓溶解剤がアニソイル化ストレプトキナーゼプラスミノーゲンアクチ ベーター複合体（ＡＰＳＡＣ）である、請求項１２０記載の医薬組成物。
122. １２２．可溶性ＣＲ１タンパク質がＡＴＣＣに寄託されておりそして受託番号Ｃ ＲＬ１００５２を有する、プラスミドｐＢＳＣＲ１ｃ／ｐＴＣＳｇｐｔを担持す るチャイニーズハムスター卵巣細胞ＤＵＸＢ１１により発現される、請求項１２ ０記載の医薬組成物。
123. １２３．実質的に第１図に示されるアミノ酸配列の部分を含んでなる分子であっ て、その部分がＣ３ｂに結合する能力により特徴づけられ、ＬＨＲ−Ｂ配列の少 なくとも２コピーを含んでなる分子。
124. １２４．患者が人間以外の動物である請求項８６記載の方法。
125. １２５．患者が人間以外の動物である請求項９０記載の方法。
126. １２６．患者が人間以外の動物である請求項９４記載の方法。
127. １２７．患者が人間以外の動物である請求項９５記載の方法。
128. １２８．患者が人間以外の動物である請求項１００記載の方法。
129. １２９．患者が人間以外の動物である請求項１０１記載の方法。