JP3097753B2 - ヒトＣ３ｂ／Ｃ４ｂレセプター（ＣＲ１） - Google Patents

ヒトＣ３ｂ／Ｃ４ｂレセプター（ＣＲ１）

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Description

【発明の詳細な説明】 米国法典35、§202（Ｃ）の規定に従って、アメリカ
合衆国政府がこの発明について権利を有することをここ
に承認する。この発明の基金の一部はNIHから拠出され
ている。
1.序 論 本発明は、C3b/C4bレセプター（CR1）遺伝子およびそ
のコードされたタンパク質に関する。また本発明はCR1
核酸配列およびその70ヌクレオチドを含んでなるフラグ
メントおよびそれらからコードされたペプチドまたは24
アミノ酸を含んでなるタンパク質にも関する。また本発
明はCR1タンパク質およびそのフラグメントの発現も提
供する。CR1核酸およびタンパク質は補体機能および種
々の炎症性および免疫障害にかかわる障害の診断または
治療に用途を有する。
2.発明の背景 2.1.補体組織 補体組織はヒト正常血清におけるグロブリンの約10％
を構成する一グループのタンパク質である（Hood,L.E.,
ら、1984,Immunology,2d Ed.,The Benjamin/Cummings P
ublishing Co.,Menlo Park,California,p.339）。補体
（Ｃ）は免疫およびアレルギー反応の介在において、重
要な役割を果す（Rapp,H.J.およびBorsos,T,1970,Molec
ular Basis of Complement Action,Appleton−Century
−Crofts（Meredith）,Ner York）。補体構成物の活性
化は、補体依存疾患と関連した炎症を介在する化学走性
的ペプチドを包含する一グループのファクターの生成に
導く。補体カスケードの連続的活性化は抗原−抗体複合
体を伴う主経路経由にてまたは特定の細胞壁多糖の認識
を伴う副経路により起る。活性化した補体タンパク質に
より介在される機能は、標的細胞の溶解、化学走性、オ
プソニン作用、脈管および他の平滑筋細胞の刺激および
マスト細胞の脱顆粒反応、小血管の透過性の増大、白血
球遊走の支配、およびＢリンパ細胞およびマクロファー
ジの活性化のような機能的異常を包含する（Eisen,H.
N.,1974,Immunology,Harper ＆ Row Publishers,Inc.Ha
gerstown,Maryland,p.512）。
タンパク質分解カスケードの段階期に、生物学的に活
性のあるペプチドフラグメント、アナフィラトキシンC3
a、C4a、およびC5a（WHO Scientific Group,1977,WHO T
ech.Rep.Ser.606:5およびそこに引用した参考文献を参
照）は第３（C3）、第４（C4）、および第５（C5）の本
来備わっている補体構成物から放出される（Hugli,T.
E.,1981,CRC Crit.Rev.Immumol.1:321;Bult,H.およびHe
rman,A.G.,1983,Agents Actions 13:405）。
2.2.C3b/C4b補体レセプター（CR1） CR1と命名する、ヒトC3b/C4bレセプターは、赤血球、
単球／マクロファージ、顆粒細胞、Ｂ細胞、いくつかの
Ｔ細胞、脾臓濾胞性樹状細胞および糸球体足細胞に存在
する（Fearon,D.T.,1980,J.Exp.Med.152:20,Wilson,J.
G.,ら、1983,J.Immunol.131:684;Reynes,M.,ら、1985,I
mmunol.135:2687;Gelfand,M.C.,ら、1976,N.Engl.J.Me
d.295:10;Kazatchkine,M.D.,ら、1982,Clin.Immunol.Im
munopathol.27:170）。CR1はC3b、C4bおよびiC3bに特異
的に結合するレセプターの可溶化形態はリガンド結合機
能および膜関連CR1と同じ分子量を有する血しょう中に
見い出される（Yoon,S.H.およびFearon,D.T.,1985,J.Im
munol.134:3332）。CR1は免疫複合体および他の補体活
性化因子に共有的に付着しているC3bおよびC4bに結合
し、これらの相互作用の帰結はレセプターを担持してい
る細胞型に依存する（Fearon,D.T.およびWong,W.W.,198
3,Ann.Rev.Immunol.1:243）。赤血球CR1は肝臓に輸送す
るために免疫複合体に結合する（Cornacoff,J.B.,ら、1
983,J.Clin.Invest.71:236;Medof,M.E.,ら、1982,J.Ex
p.Med.156:1739）。好中球および単球のCR1は表面をお
おわれたくぼみを通して吸着的細胞内取り込みか（Fear
on,D.T.,ら、1981,J.Exp.Med.153:1615;Abrahamson,D.
R.およびFearon,D.T.,1983,Lab.Invest.48:162）または
ホルボールエステル、化学走性ペプチド、またはフィブ
ロネクチンおよびラミニンのような細胞外マトリックス
中に存在するタンパク質によるレセプターの活性化の後
食作用により（Newman,S.L.,ら、1980,J.Immunol.125:2
236;Wright,S.D.およびSilverstein,S.C.,1982,J.Exp.M
ed.156:1149;Wright,S.D.,ら、1983,J.Exp.Med.158:133
8）結合複合体は内在化する。CR1のリン酸化は食作用機
能を獲得する役割を有する（Changelian,P.S.およびFea
ron,D.T.,1986,J.Exp.Med.163:101）。これらの細胞をC
R1に対する抗体で処理することによりポークウィードマ
イトジェンの最適に近い投与量に対する細胞の反応を強
化するが、Ｂリンパ細胞におよぼすCR1の機能は、ほと
んど定義づけられていない（Daha,M.R.,ら、1983,Immun
obiol.164:227（Abstr.））。濾胞性樹状細胞上のCR1は
抗原提示の役割に有用である（Klaus,G.G.B.,ら、1980,
Immunol.Rev.53:3）。
またCR1は主経路および副経路のC3/C5コンバーテーズ
を阻止し、ファクターＩによるC3bおよびC4bの切断のた
めのコーファクターとして作用する。このことはCR1
が、レセプターとしての役割の他に補体調節機能をも有
することを示す（Fearon,D.T.,1979,Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A.76:5867;Iida,K.およびNussenzweig,V.,1981,
J.Exp.Med.153:1138）。補体活性化の副経路において二
分子複合体C3b、BbはC3活性酵素（コンバーテーズ）で
ある。CR1（および高濃度で、ファクターＨ）はC3bに結
合し、またC3b、Bbの解離も促進する。さらにC3b、CR1
（およびC3b、Ｈ）の形成はC3bをファクターＩによる不
可逆的タンパク質分解不活性化の作用を受けやすくす
る、その結果不活性のC3b（iC3b）の形成となる。補体
活性化の主経路において、複合体C4b、2aはC3コンバー
テーズである。CR1（および高濃度で、C4結合タンパク
質、C4bp）はC4bに結合し、またC4b、2aの解離も促進す
る。結合は、C4bをファクターＩによる、不可逆的タン
パク質分解不活性化の作用を受けやすくなり、C4cおよ
びC4d（不活性の補体タンパク質）に切断される。
CR1は単一のポリペプチド鎖で構成される糖タンパク
質である。CR1の４種のアロタイプ形態が知られてお
り、増大量〜40,000−50,000ダルトン分子量の差があ
る。２種の最もよくある形態はＦおよびＳアロタイプ
で、ＡおよびＢアロタイプとも呼ばれ、分子量をそれぞ
れ250,000および290,000ダルトン有し、（Dykman,T.R.,
ら、1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:1698;Wong,W.
W.,ら、1983,J.Clin.Invest.72:685）２種のまれな形態
は分子量210,000および＞290,000ダルトンを有する（Dy
kman,T.R.,ら、1984,J.Exp.Med.159:691;Dykman,T.R.,
ら、1985,J.Immunol.134:1787）。これらの相異は、グ
リコシル化の状態というよりもむしろ、CR1のポリペプ
チド鎖における変異体を明らかに示している。なぜな
ら、それらは精製されたレセプタータンパク質をエンド
グリコシダーゼＦで処理することによりなくすことはで
きず、（Wong,W.W.,ら、1983,J.Clin.Invest.72:685）
それらは、レセプターアロタイプをチュニカマイシン
（tunicamycin）の存在下で生合成されるのが観察され
たからである（Lublin,D.M.,ら、1986,J.Biol.Chem.26
1:5736）。４種のCR1アロタイプの全ては、C3b結合機能
を有する（Dykman,T.R.,ら、1983,Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.80:1698;Wong,W.W.,ら、1983,J.Clin.Unveat.72:
685;Dykman,T.R.,ら、1984,J.Exp.Med.159:691;Dykman
T.R.,ら、1985,J.Immunol.134:1787）。
CR1 cDNAの２つの非重複制限フラグメントは高い緊縮
条件の下でクロスハイブリダイズすることを示した（Wo
ng,W.W.,ら、1985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:771
1）。また両cDNAプローブはゲノムDNAの多数の制限フラ
グメントにもハイブリッド形成し、大部分のフラグメン
トは両プローブに共通である（上記著者）。CR1内の反
復コード配列の存在は配列比較により確認された（Klic
kstein,L.B.,ら、1985,Complement 2:44（Abstr.））。
さらに、CR1遺伝子は、いくつかのゲノム制限フラグメ
ントに対し、コード配列を欠くゲノムプローブがクロス
ハイブリダイゼーションを示したことにより反復的に中
に入った配列を有することを示す（Wong,W.W.,ら、198
6,J.Exp.164:1531）。さらに、大きなＳアロタイプを有
する個人からのDNAは、Ｆアロタイプを有する個人から
のDNAと比較した場合、このゲノムプローブにハイブリ
ッド形成する他の制限フラグメントを有した。このこと
はゲノム配列の重複は高分子量CR1対立遺伝子との関連
において起ることを示す（上記著者）。
CR1は補体レセプター２型（CR2）との相同性を有する
ことを示す（Weis,J.J.,ら、1986,Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.83:5639−5643）。
2.3.ヒトの疾患におけるCR1の異常 全身性紅斑性狼瘡（SLE）を有する患者の赤血球上のC
R1発現の減少は、日本（Miyakawaら、1981,Lancet 2:49
3−497;Minotaら、1984,Arthr.Rheum.27:1329−133
5）、アメリカ合衆国（Iidaら、1982,J.Exp.Med.155:14
27−1438;Wilsonら、1982,N.Engl.Med.307:981−986）
およびヨーロッパ（Walportら、1985,Clin.Exp.Immuno
l.59:547;Jouvinら、1986,Complement 3:88−96;Holme
ら、1986,Clin.Exp.Immunol.63:41−48）を包含する、
いくつかの地理上の地域から調査員らにより報告されて
いる。ひとグループとしてとらえると、患者は細胞当り
のレセプターの平均数は正常な人々のそれの50−60％で
ある。初期の報告では、赤血球上のCR1の数は、疾患活
動度とは逆に変化する、すなわち、SLEの最もひどい徴
候の期間中は最も低い数で、高い数は同じ患者の寛解期
中に観察されたことに注目している（Iidaら、1982,J.E
xp.Med.155:1427−1438）。またCR1の数は免疫複合体の
血清中レベル、C3dの血清中レベル、および補体活性性
免疫複合体の取り入れ、および“無害な傍観者”として
赤血球上に置かれていることを、おそらく示している赤
血球結合C3dgの量と逆相関関係することが知られている
（Rossら、1985,J.Immunol.135:2005−2014;Holmeら、1
986,Clin.Exp.Immunol.63:41−48;Walportら、1985,Cli
n.Exp.Immunol.59:547）。赤血球上にCR1を欠くSLEを有
する、ひとりの患者はCR1に対する自己抗体を有するこ
とが見い出された（Wilsonら、1985,J.Clin.Invest.76:
182−190）。抗CR1抗体の力価の減少と患者の臨床状態
の改善およびレセプター異常の部分的後退と偶然一致す
る。抗CR1抗体は他の２人のSLE患者に検出されている
（Cookら、1986,Clin.Immunol.Immunopathol.38:135−1
38）。最近、活動期SLEおよび溶血性貧血の状態におい
て赤血球CR1の後天的に失なわれることが輸血赤血球の
レセプターが早く失なわれることを観察することにより
示された（Walportら、1987,Clin.Exp.Immunol.69:501
−507）。
また赤血球からCR1を相対的に失うことは、ヒト免疫
不全ウイルス（HIV）感染を有する患者（Tausk,F.A.,
ら、1986,J.Clin.Invest.78:977−982）およびらい腫ら
いを有する患者にも観察される（Tausk,F.A.,ら、1985,
J.Invest.Dermat.85:58s−61s）。
SLEの補体レセプター発現異常は赤血球CR1に限定され
ない。SLE患者の好中球の全細胞CR1およびＢリンパ細胞
の原形質膜CR1の相対的に欠乏することが起ることが見
られる（Wilsonら,1986,Arthr.Rheum.29:739−747）。
SLE IV型腎炎を有する患者の中には、検出できるCR1
抗原の全てが足細胞から失なわれているが、一方、SLE
腎炎のややひどくない種類および膜増殖性糸球性腎炎Ｉ
型およびII型を包含する増殖性腎炎の非SLE種において
は、糸球体足細胞上のCR1発現は正常とは相異しない（K
azatchkineら、1982,J.Clin.Invest.69:900−912;Emanc
ipatorら、1983,Clin.Immunol.Immunopathol.27:170−1
75）。しかしながら、SLE IV型腎炎を有する患者は、腎
臓狼瘡または全く腎炎のない他の型を有するSLE患者よ
りも赤血球CR1の数が少なくはない（Jouvinら、1986,Co
mplement 3:88−96）。
インビボにおける補体活性化は好中球の原形質膜のCR
1発現をアップレギュレートする（Lee,J.,ら、1984,Cli
n.Exp.Immunol.56:205−214;More,F.D.,Jr.,ら、1986,
N.Engl.J.Med.314:948−953）。
補体活性化もまた、炎症をともなう疾患状態に関連し
ている。腸の炎症であるクローン病は、単核性および多
形核性の白血球のリンパ様浸潤により特徴づけられる。
クローン病疾患の空腸体液中の補体C4濃度が正常な対照
に比べて増加したことが最近わかった（Ahrenstedtら、
1990,New Engl.J.Med.322:1345−９）炎症において補体
系と関連している他の病状は熱障害（やけど、凍傷）
（Gelfandら、1982,J.Clin.Invest.70:1170;Demling
ら、1989,Surgery 106:52−９）、血液透析（Deppisch
ら、1990,Kidney Inst.37:696−706;Kojimaら、1989,Ni
ppon Jenzo Gakkai Shi 31:91−７）、心肺バイパスの
ポンプ後症候群（Chenowethら、1981,Complement Infla
mm.3:152−165;Chenowethら、1986,Complement 3:152−
165;Salamaら、1988,N.Engl.J.Med.318:408−14）を包
含する。補体および白血球の両方は成人呼吸障害症候群
の病理発生に関連していると報告されている（Zilow
ら、1990,Clin.Exp.Immunol.79:151−57;Langloisら、1
989,Heart Lung 18:71−84）。補体系の活性化は敗血症
においては致命的合併症への発展に関係していることが
示唆され（Hackら、1989,Am.J.Med.86:20−26）免疫複
合体誘導血管炎（Cochrane,1984,Springer Seminar Imm
unopathol.7:263）、糸球体腎炎（Couserら、1985,Kidn
ey Inst.29:879）、溶血性貧血（Schreiber ＆ Frank,1
972,J.Clin.Invest.51:575）、重症筋無力症（Lennon
ら、1978,J.Exp.Med.147:973;Biesecker ＆ Gomez,198
9,J.Immunol.142:2654）、２型コラーゲン誘導関節炎
（Watson ＆ Townes,1985,J.Exp.Med.162:1878）および
経験性アレルギー神経炎（Feasbyら、1987,Brain Res.4
19:97）のような自己免疫疾患の動物モデルにおける組
織傷害を生じる。補体系は、また超急性同種組織移植お
よび異種組織移植拒絶にも関係している（Knechtleら、
1985,J.Heart Transplant 4（５）:541;Guttman,1974,T
ransplantation 17:383;Adachiら、1987,Trans.Proc.19
（１）:1145）。組換えIL−２での免疫療法中の補体活
性化はIL−２治療から観察されるひどい毒性および副作
用を生じるようである（Thijsら、1990,J.Immunol.144:
2419）。
補体はまた免疫複合体に関係する疾患においても役割
を果たしている。免疫複合体はリウマチ性関節炎または
SLE、AIDSのような血液原性悪性（Taylerら、1983,Arth
ritis Rheum.26:736−44;Inadaら、1986,AIDS Research
2:235−247）および自己抗体および／または補体活性
化に関係する不全を包含するがこれらに限定されない多
くの病理状態に見い出される（Rossら、1985,J.Immuno
l.135:2005−14）。Inadaらは、赤血球CR1は自己免疫患
者の循環している免疫複合体の除去に機能的役割を有
し、それにより体組織内に免疫複合体の沈着を阻害する
（Inadaら、1989,Ann.Rheum.Dis 4:287）。CR1活性の低
下はARCおよびAIDS患者において臨床疾患状態と関連し
ている（Inadaら、1986,AIDS Res.2:235）。
3.発明の要約 本発明は、C3b/C4bレセプター（CR1）遺伝子およびそ
のコードされたタンパク質に関する。また本発明はCR1
核酸配列およびそれの70ヌクレオチドを含んでなるフラ
グメントおよびそれらからコードされたペプチドまたは
24アミノ酸を含んでなるタンパク質にも関する。本発明
はCR1タンパク質およびそのフラグメントの発現をさら
に提供する。本発明の遺伝子およびタンパク質は補体機
能および種々の免疫組織および炎症性障害にかかわる障
害の診断または治療に用途を有する。
下記の実施例の項に詳記しているように本発明の詳細
な実施態様において、完全な長さのCR1 cDNAおよびその
フラグメントのクローニング、ヌクレオチド配列および
推定アミノ酸配列を記載している。CR1タンパク質およ
びそのフラグメントの発現もまた記載されている。C3b
および／またはC4bに対する結合部位を含み、ファクタ
ーＩコーファクター機能を示すCR1タンパク質およびそ
のフラグメントの発現が得られる。
また下記の実施例中に記載しているのは、可溶性CR1
分子の産出および精製であり、この分子は炎症性反応の
治療および心筋梗塞の大きさの減少および再灌流損傷の
予防に治療上有用であることを示す。
3.1.定 義 Ad2MLP ＝アデノウイルス２後期プロモーター C ＝補体 C3（ma）＝メチルアミン処理C3 C4bp ＝C4結合タンパク質 CMV ＝サイトロメガロウイルス CR1 ＝補体レセプター１型、C3b/C4bレセプター CR2 ＝補体レセプター２型 DCFDA ＝ジクロロフルオレセインダイアセテイト HPLC ＝高速液体クロマトグラフィー iC3b ＝不活性化C3b LHR ＝長い相同性反復 mAb ＝モノクローナル抗体 PAGE ＝ポリアクリルアミドゲル電気泳動 RPAR ＝逆受身アルサス反復 SCR ＝短いコンセンサス反復 sCR1 ＝可溶性CR1分子 4.図面の説明 第１図．全CR1コード領域のヌクレオチドおよびアミ
ノ酸配列。この配列はクローンλT109.1のオクタマーEc
oR Iリンカーに続く第１番目のヌクレオチドで始まる。
この配列のヌクレオチド番号1531は第３図に示される配
列のヌクレオチド番号１の５′側の第１番目のヌクレオ
チドである。mRNAに相当するストランドが示されてお
り、推定アミノ酸配列が下に示されている。ヌクレオチ
ド番号28−147によりコードされる推定のシグナル配列
をブラケットに入れてある。
第２図．ヒトCR1 cDNAの5.5Kbの制限地図。黒い棒線
はcDNAを示し、制限部位は、H,Hind III;B,BamH I;R,Ec
oR I;P,Pst I;A,Apa I;S,Sac I;G,Bgl II;K,Kpn Iであ
る。その配列が由来するcDNAクローンを地図の下に示
す。矢印はジデオキシヌクレオチドチェインターミネー
ション法による配列分析の方向および程度を示す。cDNA
クローンは制限地図および重複する配列の同一性に基づ
き方向づけた。
第３図．ヒトCR1 cDNAの5.5Kbのヌクレオチド配列。m
RNAに相当するストランドが示されており、そして塩基
番号１（第１図の塩基番号1532に相当）は最も５′側ク
ローンのEcoR Iリンカーの後の第１番目の塩基である。
終止コドンには下線が付してある。ボックス中の110bp
配列はヌクレオチド147と148の間に見られ（矢印）、そ
して介在配列の一部分であると考えられている。
第４図．ヒトCR1 cDNAの5.5Kbのヌクレオチド配列の
ドット マトリックス分析。ドットは90bpのうち少なく
とも40bpの一致が存在する場合にプロットした。正方形
を対角線に二等分している黒い線はそれ自身との配列の
同一性を示す。同一性の線から1.35および2.7Kbにある
２本の付加的な平行した黒い線はそれぞれ1.35Kbの２つ
の直接縦列した長い相同反復（LHR）である。２つのLHR
の間にある６個のより細い点線は〜0.2Kbの短いコンセ
ンサス反復に相当する。この短いコンセンサス反復（SC
R）は長い相同反復を0.4Kbこえている。
第５図．ヒトCR1の推定アミノ酸配列。各残基を１文
字コードで示す（Lehninger,A.L.1975,Biochemistry,2n
d Ed.,Worth Publishers,Inc.,New York,p.72）。長い
相同反復中の残基はそれらの相同性を示すために整列さ
せてある。LHR−Ｂ中のすべての残基が示されており、
そしてLHR−ＣおよびLHR−Ｄの残基はそれがLHR−Ｂの
残基と異なる個所のみ示されている。ヒドロパシープロ
フィルは推定膜貫通領域を示すためにタンパク質のCOOH
末端の下に並べてある。疎水性配列の直後の４つの陽性
荷電した残基部分の上にラインを付してある。表皮成長
因子レセプター中のプロテインキナーゼＣ燐酸化部位と
67％の相同性を有する６アミノ酸配列には下線が付して
ある。CR1タンパク質の概略図を配列の上に示す。（T
M）膜貫通領域、（Cyt）細胞質内領域、（３′UT）３′
非翻訳配列。
第６図．（Ａ）CR1のSCRの整列。反復部はNH2末端か
らCOOH末端の方へ１−23と番号付けしてある。整列を最
大限に合致させるためにスペースを設けてある。ボック
スは不変残基を表わしそして垂直矢印はアミノ酸保存部
分を示す。残基または保存置換がSCRの少くとも半分に
存在する場合に、その残基は保存されていると見なされ
る。水平矢印はやはりCR1ゲノムクローン２−38から配
列されそして１つのエキソンによりコードされるSCRを
示す。（Ｂ）ゲノムクローンλ２−38の制限地図、配列
法、および部分配列を示す。制限部位は、（Ｂ）BamH
I,（Ｓ）Sac I,（Ｅ）EcoR V,（Ｋ）Kpn I,（Ｐ）Pst I
である。水平矢印はエキソン−イントロン境界を示す。
第７図．この構造を有することが知られているタンパ
ク質のSCRのコンセンサス配列の整列。整列を最大限に
合致させるためにスペースを導入した。残基が存在する
場合は他のタンパク質の少くとも半分でそれが保存され
ているものである１種または２個のSCRを有するタンパ
ク質を除き、残基は第５図で保存されていると見なされ
る。CR2およびC2bの下線部分はこれらのタンパク質に関
しこの領域では何らの配列情報も刊行されていないこと
を示す。ボックスは不変半シスチンを示す。配列の右方
向の番号はコンセンサス配列を生成させるのに用いられ
るSCRの番号を示す。コンセンサス配列を決定するのに
用いられる配列データに関するタンパク質略語および参
照は次のとおりである：（CR1）補体レセプタータイプ
1,（Ｈ）ファクターＨ（Kristensen,T.,ら、1986,J.Imm
unol.136:3407），（C4bp）C4結合タンパク質（Chung,
L.P.,ら、1985,Biochem.J.230:133），（CR2）補体レセ
プタータイプ２（Weis,J.J.,ら、1986,Proc.Natl.Acad.
Sci.U.S.A.83:5639），（Ba）ファクターＢのタンパク
分解フラグメント（Morley,B.J.およびCambell,R.D.,19
84,EMBO J.3:153），（C2b）C2タンパク分解フラグメン
ト（Gagnon,J.,1984,Philos.Trans.R.Soc.Lond.Biol.Sc
i.306:301），（Clr）C1のγサブユニット（Leytus,S.
P.,ら、1986,Biochemistry 25:4855），（XIII b）ファ
クターXIIIのｂサブユニット（Ichinose,A.,ら、1986,B
iochemistry 25:4633），（β2GP1）β２糖タンパク質
Ｉ（Lozier,J.,ら、1984,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8
1:3640），（Hap）ハプトグロビン（Kurosky,A.,ら、19
80,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77:3388），（IL−２−
Ｒ）インターロイキン−２レセプター（Leonard,W.J.,
ら、1985,Science 230:633）。星印は不完全配列が入手
しうることを示す。
第８図．ヒトCR1配列について提案された構造の概略
図。COOH末端細胞質内領域が脂質二重層の右側にある。
30SCRは細胞質膜の細胞外に直線状に並べられている。
カッコはLHRを示す。挿入図はトリプルループ構造を示
すために１個のSCRを拡大して示す。
第９図．ヒトCR1をコードするプラスミドpBSABCDの挿
入物の制限地図。コード配列を含有する領域の輪郭を示
すボックス内には、CR1構築物を形成するために連結さ
れた８個のcDNAクローンの９個のフラグメントが存在す
る。ブラケットはそれぞれLHR−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、およ
び−Ｄを示す。ボックスの下の線は新たに単離された
５′cDNAクローンの位置を示す。制限部位は、A,Apa I,
B,BamH I;G,Bgl II;H,Hind III;K,Kpn I;M,BspM II;P,P
st I;R,EcoR I;およびS,Sac Iである。
第10図.LHR−Ａの７個のSCRをコードする５′cDNAク
ローンの推定アミノ酸配列、およびこの配列とLHR−
Ｂ、−Ｃ、および−Ｄの相当するSCRとの整列。各SCR中
に保存されている４個のシステインに下線を付してあ
る。LHR−Ｂ、−Ｃおよび−Ｄの残基はそれがLHR−Ａの
それと異なる個所のみ示す。
第11図．発現プラスミドpiABCDおよびpMTABCDの制限
地図。PmMTおよびPCMVはそれぞれマウスメタロチオネイ
ンおよびサイトメガロウイルス極初期プロモーターを示
す。
第12図．それぞれpiABCD（パネルａおよびｂ）および
CDM8ベクターのみ（パネルＣおよびＤ）でトランスフェ
クションさせ、そしてYZ1モノクローナル抗−CR1抗体お
よびフルオレセイン標識ヤギ抗−マウスＦ（ab′）２で
間接的に染色したCOS細胞の位相差（パネルａおよび
ｃ）および免疫蛍光（パネルｂおよびｄ）顕微鏡写真で
ある。
第13図．組換えCR1を発現するCOS細胞によるC3b−お
よびC4b−結合の分析。piABCD（パネルａおよびｃ）ま
たはCDM8ベクターのみ（パネルｂおよびｄ）でトランス
フェクションさせたCOS細胞をEAC 4b（lim）、3b（パネ
ルａおよびｂ）またはEAC 4b（パネルｃおよびｄ）とイ
ンキュベーションしそして位相差顕微鏡によりロゼット
形成について検査した。
第14図．トランスフェクションされたCOS細胞により
発現された組換えCR1のSDS−PAGEによる分析。CDM8ベク
ターのみ（レーン１および４）およびpiABCD（レーン２
および５）でそれぞれトランスフェクションしたCOS細
胞、およびCR1のＦおよびＳアロタイプを有する個体か
らの赤血球（レーン３および６）を125Iで表面標識し
た。細胞の界面活性剤による溶解物を続いてセファロー
スUPC10（レーン１−３）およびセファロース−YZ1（レ
ーン４−６）で免疫吸着させそして溶出物を非還元条件
下のSDS−PAGEおよびオートラジオグラフィーにより分
析した。
第15図．免疫固定化された組換えCR1の存在下におけ
るファクターＩによる125I−C3（ma）切断。125I−C3
（ma）の複製試料を、ファクターＨの存在下におけるフ
ァクターＩ（レーン１）、CDM8ベクターのみでトランス
フェクションさせたCOS細胞の溶解物とブレインキュベ
ートしたセファロース−UPC10（レーン２）、piABCD−
トランスフェクションCOS細胞の溶解物とプレインキュ
べートしたセファロース−UPC10（レーン３）、CDM8−
トランスフェクションCOS細胞の溶解物とプレインキュ
ベートしたセファロース−YZ1（レーン４）、およびpiA
BCD−トランスフェクションCOS細胞の溶解物とプレイン
キュベートしたセファロース−YZ1の６μ（レーン
５）、12μ（レーン６）および25μ（レーン７）で
処理した。125I−標識C3（ma）の試料もファクターＩの
非存在下に、piABCD−トランスフェクションCOS細胞の
溶解物とプレインキュベートしたセファロース−YZ1 25
μで処理した（レーン８）。還元後、125I−C3（ma）
をSDS−PAGEおよびオートラジオグラフィーにより分析
した。
第16図.CR1欠失突然変異体をコードするcDNA構築物。
４つのLHRをコードするcDNAセグメントの位置を欠失突
然変異体の調製に用いられた制限部位が示してある全長
piABCD構築物の上方にブラケットで示す。各突然変異体
中に残存するcDNA制限フラグメントを黒い線で示す。制
限部位はA,Apa I;B,Bsm I;E,BstE II;およびP,Pst Iで
ある。
第17図.CR1の組換え欠失変異体とCR1の野生型Ｆおよ
びＳアロタイプとの比較。赤血球（レーン１および
７）、およびCDM8ベクターのみ（レーン２および８）、
piABCD（レーン３および９）、piBCD（レーン４および1
0）、piCD（レーン５および11）およびpiD（レーン６お
よび12）でそれぞれトランスフェクションさせたCOS細
胞を125Iで表面標識したものの界面活性剤による溶解物
をセファロース−UPC10抗−レバン抗体（レーン１−
６）、セファロース−YZ1抗−CR1モノクローナル抗体
（レーン７−11）およびウサギ抗−CR1抗体およびセフ
ァロース−プロテインＡ（レーン12）でそれぞれ免疫沈
降させた。溶出物を還元条件下のSDS−PAGEおよびオー
トラジオブラフィーにかけた。
第18図．全長CR1および欠失変異体を発現するCOS細胞
の存在下におけるファクターＩによる125I−C3（ma）の
切断。125I−C3（ma）の複製試料をファクターＩの非存
在下（レーン１−６）または存在下（レーン７−12）
に、それぞれCDM8ベクターのみ（レーン１および７）、
piABCD（レーン２および８）、piAD（レーン３および
９）、piBD（レーン４および10）、piCD（レーン５およ
び11）、およびpiD（レーン６および12）でトランスフ
ェクションしたCOS細胞とインキュベートした。125I−C
3（ma）の試料もそれぞれファクターＨおよびファクタ
ーＩ（レーン13）とおよびファクターＩのみ（レーン1
4）とインキュベートした。還元後、125I−C3（ma）をS
DS−PAGEおよびオートラジオグラフィーにより分析し
た。
第19図.CR1の各LHR、およびC3bおよびC4bのレセプタ
ーの特異性を決定する予想部位を含有するSCR型の模式
図。これらの二次的な結合特異性をカッコで示す。
第20図．可溶性CR1 DNA構築物中に残存するDNA領域を
示す概略図。全長CR1 cDNA領域を図面の上方のボックス
により示す。
第21図．発現ベクターのpTCSシリーズ中の主要エレメ
ントを示す概略図。
第22図．発現ベクターpTCSgptの概略図。ポリアデニ
ル化部位はマウスIgカッパ配列から（NBRF ヌクレイッ
ク データベース アクセッション ＃κcms、bp1306
−1714）;Ad2 MLPおよび三分節系領域はAd2配列から（N
BRF ヌクレイック データベース アクセッション
＃Gdad2、bp 5790−6069）;SV40初期プロモーターはSV4
0ゲノムから（NBRF ヌクレイック データベース ア
クセッション ＃GSV40W）得られた。gpt遺伝子、アン
ピシリン遺伝子および複製の細菌性起点はベクターpSV2
gptから（ATCC アクセッション No.37145）得た。
第23図．抗体アフィニティ精製sCR1の４−20％SDS−P
AGE。非還元（レーン1,2,3）および還元（レーン4,5,
6）条件下。レーン1,3:分子量マーカー；レーン3,5:細
胞培養上清出発物質；レーン4,6:抗体アフィニティクロ
マトグラフィーにより精製したsCR1。
第24図．カチオン交換HPLC溶離プロフィル。溶離され
たタンパク質を280nmでの吸光度（Ｙ軸）により監視し
た。フロースルー（０−100分）および溶出sCR1（150−
160分）の吸光度はいずれも目盛外であった。Ｘ軸は溶
離時間（分）を表わす。
第25図．カチオンおよびアニオン交換HPLC精製sCR1の
４−20％グラジェントSDS−PAGE。SDS−ポリアクリルア
ミドゲルは非還元条件下に行われた。レーン1,バイオリ
アクター上清の一部分；レーン2,カチオンHPLC出発緩衝
液で透析したバイオリアクター上清の一部分；レーン3,
カチオン交換HPLCカラムからのsCR1溶出ピークの一部
分；レーン4,カチオン交換HPLCカラムからのsCR1ピーク
をアニオンHPLCの出発緩衝液で透析した一部分；レーン
５および6,アニオンHPLCから溶離されたsCR1の２つの異
なるフラクションの一部分。
第26図．ヒト好中球における酸素バーストのC5a誘
導。C5a誘導酵素バーストに続き、DCFDAが酸化されそし
て明るく蛍光を発した。フローサイトメトリーにより測
定した蛍光強度をＸ軸にそして細胞の数をＹ軸に示す。
パネルa,細胞のプロフィルおよびゲート；パネルb,C5a
添加０分後；パネルc,1分後；パネルd,2分後；パネルe,
3分後；パネルf,4分後；パネルg,20分後。このDCFDAア
ッセイによりC5aが高感度で示される。
第27図.sCR1の存在下におけるヒト補体の活性化によ
りDCFCDAアッセイにおいてC5a活性の低下が示される。
パネルa,未刺激細胞；パネルb,高度の蛍光を示すsCR1を
含まない対照；パネルc,蛍光強度の75％低下を示すsCR1
の存在下におけるDCFDAアッセイ。Ｙ軸は細胞数であり
そしてＸ軸は蛍光強度である。
第28図．ヒト血清における古典的経路C5aおよびC3a産
生のsCR1による阻害。同様のプロフィルが抗体アフィニ
ティ精製またはHPLC精製sCR1で観察された。
第29図．組換えsCR1による補体仲介溶血の阻害。同様
のプロフィルが抗体アフィニティ精製またはHPLC精製sC
R1で観察された。
第30図.sCR1−処置（左）および未処置（右）ラット
のRPARの肉眼的形態。（ａ）両ラットともオバルブミン
の静脈注射に続きsCR1（左ラット）またはPBS（右ラッ
ト）と、生のままの抗−オバルブミン（左部分）;1/2希
釈抗−オバルブミン（中央部分）またはウサギIgG（右
部分）の混合物の皮内注射を受けた。注射は二通りずつ
行い、上方および下方の列で同じ結果が得られた。sCR1
を与えられたラットは目で見える変化をほとんど示さな
かったが、未処置ラットはRPARの完全な徴候を生じた。
（ｂ）（ａ）からの皮膚バイオプシーの皮膚表面。未処
置ラット（右）からのバイオプシーは明らかに見ること
のできる病変を示したが、sCR1処置ラット（左）からの
バイオプシーは正常な形態を示した。
第31図、sCR1処置（ａ）および未処置（ｂ）ラットの
皮膚バイオプシーの光学顕微鏡写真。（ａ）多形核およ
び単核細胞の血管周囲の蓄積が観察されるが、好中球の
広範な浸潤も赤血球の遊出も見られなかった。（ｂ）多
形核細胞の広範な浸潤および赤血球の遊出が確認され
た。
第32図 αおよびβクリアランス相の二重相を示すラ
ットおよびモンキーの血液から注射したsCR1のクリアラ
ンス。
第33図 CR1 cDNAおよびイントロンプローブがＦ又は
Ｆ′アロタイプを発現する個体からのDNAのEcoR V消化
物にハイブリダイズされるサザンプロットのオートラジ
オグラフィー。λDNAのHind IIIフラグメントの位置は
左側のキロベースで示される。Ｆ′特異性フラグメント
の位置は単一矢印により示される。
第34図 CR1のＦ対立遺伝子のEcoR V制限地図。白い
ボックスはエクソンの位置を示し、点線のボックスはイ
ントロンプローブのハイブリダイゼーションの部位を示
す。LHR−Ｂおよび−Ｃ上のブラケットは欠失がありえ
る２領域を示す。ＶはEcoR V部位を示す。
第35図 種々の形態の組換えrCR1へのcDNAインサー
ト。示されている制限部位は、A,ApaL I;B,BamH I;C,Sa
c I;H,Hind III;L,Bgl I;P,Pst I;R,EcoR I;and S,Sma
Iである。上部の概略図はCR1タンパク質を示し、同一の
配列を有するSCRは同じパターンで満たされている。
第36図 YZ−１−セファローズ吸収により精製された
組換えsCR1の非還元条件下のクーマシーブルー染色され
たSDS−PAGE。各レーンはpasecABBCD（レーン１）、pas
ecABCD（レーン２）、またはpasecACD（レーン３）でト
ランスフェクトされたCOS細胞の培養上清から精製され
た組換えsCR1 10μｇを含有する。Mrマーカーの位置は
右にKDで示されている。
第37図 組換えsCR1の補因子活性。C3bのα′鎖の切
断はpasecABBCD,pasecABCD,またはpasecACDでトランス
フェクトされたCOS細胞由来の組換えsCR1の漸増量の存
在下で測定された。
第38図 組換えsCR1による赤血球の125I−C3bダイマ
ー取込み阻害。赤血球結合リガンドはC3bダイマー、C3b
モノマー、およびpasecABBCD、pasecABCD、またはpasec
ACDでトランスフェクトされたCOS細胞由来の組換えsCR1
の漸増濃度の存在下で測定された。
第39図 CR1変異種をコードする種々のプラスミドで
トランスフェクトされたCOS細胞から精製された組換えs
CR1による副経路（Ａ）および主経路（Ｂ）C3コンバー
ターゼの阻害。
第40図 CR1変異種をコードする種々のプラスミドで
トランスフェクトされたCOS細胞から精製された組換えs
CR1により副経路（Ａ）および主経路（Ｂ）C5コンバー
ターゼの阻害。
5.発明の詳細な説明 本発明はC3b/C4bレセプター（CR1）遺伝子およびそれ
がコードするタンパク質に関する。本発明はまた、CR1
核酸配列および70ヌクレオチドを含有するそのフラグメ
ントおよびそれらがコードする24アミノ酸を含有するペ
プチドまたはタンパク質にも関する。本発明はさらに、
CR1タンパク質およびそのフラグメントの発現をも提供
するものである。かかるCR1配列およびタンパク質は炎
症または免疫系の障害および補体活性が関わる障害の診
断および治療に価値がある。
詳細な態様においては、本発明は可溶性CR1分子およ
びその発現、精製および用途に関する。ここで用いられ
る「可溶性CR1分子」なる用語は、天然型CR1タンパク質
と対照的に、細胞表面に膜タンパク質として発現されな
いCR1タンパク質の部分を意味しよう。特定の例として
は、膜貫通領域を実質的に含有しないCR1分子が可溶性C
R1分子である。好ましい態様においては、可溶性CR1分
子はそれらを発現する細胞により分泌される。
下記実施例の項で詳述される本発明の詳細な態様にお
いては、全長CR1 cDNAおよびそのフラグメントのクロー
ニングおよび完全なヌクレオチドおよび推定アミノ酸配
列、およびそれらがコードするCR1産物の発現が記載さ
れる。C3bおよび／またはC4bの結合部位を有し、そして
ファクターＩコファクター活性を阻害するCR1およびそ
のフラグメントの発現も記載される。本発明はさらに、
可溶性で、先端の切れたCR1分子の産生および精製によ
っても説明する。詳細な実施例においては、かかる分子
は炎症の低下、および心筋梗塞規模の低下および再灌流
損傷の防止に治療上有用であることが示される。
5.1.CR1遺伝子の単離 CR1遺伝子の全コード配列およびその推定アミノ酸配
列は第１図に示す。任意のヒト細胞はCR1遺伝子の分子
クローニングの核酸源として役立つ可能性がある。CR1
遺伝子の単離は、CR1関連構造または性質、例えばC3bま
たはC4bまたは免疫複合体の結合、食作用修飾、免疫刺
激または増殖、および補体の調節を示すタンパク質をコ
ードするこれらのDNA配列の単離を必要とする。DNAは、
当業上知られている標準的手法、クローン化DNA（例え
ばDNA“ライブラリー”）から、化学的合成により、cDN
Aクローニングにより、または所望のヒト細胞から精製
されたゲノムDNAまたはそのフラグメントのクローニン
グにより得られる（例えばManiatisら、1982,Molecular
Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor La
boratory,Cold SpringHarbor,New York;Glover,D.M.
（編）,1985,DNA Cloning:A Practical Approach,MRL P
ress,Ltd.,Oxford,U.K.,Vol.I.II.参照）。CR1遺伝子の
cDNAクローニングの核酸源として役立つ細胞は、単球／
マクロファージ、顆粒細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、脾臓毛包
性樹状細胞および腎糸球体足細胞を包含するがそれらに
限定されない。ゲノムDNAに由来するクローンはコード
領域の他に調節およびイントロンDNA領域を含有しう
る。cDNAに由来するクローンはエクソン配列のみを含有
しよう。その起源が何であろうと、CR1遺伝子は遺伝子
増殖のための適当なベクター内に分子的にクローン化さ
れるべきである。
ゲノムDNAからの遺伝子の分子クローニングに於て
は、DNAフラグメントが生成され、その一部が所望のCR1
遺伝子をコードしているであろう。DNAを種々の制限酵
素を用いて特定の部位で切断することができる。あるい
はまた、DNAをフラグメントにするためにそのDNアーゼ
をマンガン存在下で用いることができ、また例えば音波
処理によるように、物理的にDNAを切断することもでき
る。次に、アガロースおよびポリアクリルアミドゲル電
気泳動およびカラムクロマトグラフィーを包含するがそ
れらに限定されない標準的技法により、線状DNAフラグ
メントを分子量に従って分離することができる。
ひとたびDNAフラグメントが生成されると、CR1遺伝子
を含有する特定のDNAフラグメントを多数の方法で同定
することができる。例えばある量のCR1遺伝子またはそ
の特異的なRNA、またはそのフラグメントが利用可能
で、それを精製し標識化することができれば、生成した
DNAフラグメントを標識化プローブとの核酸ハイブリダ
イゼーションにより選抜することができる（Benton,W.
およびDavis,R.,1977,Science 196:180;Grunstein,M.お
よびHogness,D.1975,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72:396
1）。プローブと実質的に相同のこれらDNAフラグメント
はハイブリダイズするであろう。もし精製CR1特異的プ
ローブが利用できない場合は、最初の選択方法として、
CR1に富む核酸フラクションをプローブとして用いるこ
とができる。一例として、繊維芽細胞により発現された
メッセージを取り去ったＢ細胞cDNAであるプローブを用
いることができる。制限酵素消化およびもし利用できれ
ば既知の制限地図にしたがって予想されるものとのフラ
グメントの大きさの比較により適当なフラグメントを同
定することも可能である。最初の選択の後に、以下に記
載されるように、遺伝子の性質、または発現された産物
の物理的、化学的または免疫学的性質に基づいて、さら
に選択を行うことができる。
また、CR1遺伝子は、核酸ハイブリダイゼーションに
よるmRNAの選択とそれに続くインビトロ翻訳により同定
することもできる。この方法に於ては、ハイブリッド形
成により相補性mRNAを単離するのにフラグメントが用い
られる。このようなDNAフラグメントは利用可能な精製C
R1 DNA、またはCR1配列に富むDNAであることができる。
単離されたmRNAのインビトロ翻訳産物の免疫沈降分析ま
たは機能アッセイ（例えば、C3bまたはC4b結合、または
食作用または免疫刺激の促進、または補体調節等に関し
て）によりmRNAが同定され、従ってCR1配列を含有する
相補性DNAフラグメントが同定される。さらに、細胞か
ら単離されたポリソームを、CR1特異的な固定化抗体に
吸着させることによって特異的なmRNAを選択できる。
（吸着されたポリゾームから）選択されたmRNAを鋳型と
して用いて、放射性標識CR1 cDNAを合成することができ
る。次いで、放射性標識mRNAまたはcDNAをプローブとし
て使って、CR1 DNAフラグメントを他のゲノムDNAフラグ
メントの中から同定することができる。
CR1ゲノムDNAを単離する以外の方法には、遺伝子配列
自体を既知配列から化学的に合成すること、またはCR1
遺伝子をコードするmRNAに対するcDNAを作成することが
包含されるがこれに限定されるわけではない。例えば、
上記記載のようにCR1遺伝子のcDNAクローニングのため
のRNAを、単球／マクロファージ、顆粒細胞、Ｂ細胞、
Ｔ細胞、樹状細胞、および足細胞を包含するがそれに限
定されない細胞から単離することができる。好ましい実
施態様において、扁桃腺細胞はcDNAクローニングのmRNA
の起源として役立つ（下記、6.1.2項参照）他の方法も
可能でありそしてそれは本発明の範囲内である。
次に同定および単離された遺伝子を適当なクローニン
グベクターに挿入することができる。当業上知られた多
数のベクター宿主系を用いることができる。使用可能な
ベクターにはプラスミドまたは修飾されたウイルスが包
含されるがそれらに限定されるわけではない。しかしベ
クター系は使用される宿主細胞と適合しなければならな
い。このようなベクターには、ラムダ誘導体のようなバ
クテリオファージ、またはPBR322またはpUCプラスミド
またはCDM8プラスミド（Seed.B.,1987,Nature 329:840
−842）または誘導体のようなプラスミドが包含される
がそれらに限定されるわけではない。形質転換、トラン
スフェクション、感染、エレクトロポレーションなどに
よって、組換え分子を宿主細胞に導入することができ
る。
別法では、「ショットガン」法で適当なクローニング
ベクターに挿入後、CR1遺伝子を同定および単離するこ
とができる。クローニングベクターへの挿入の前に、例
えば、分子量による分画によってCR1遺伝子を増強する
ことができる。
CR1遺伝子を、適当な宿主細胞の形質転換、トランス
フェクション、または感染に使用できるクローニングベ
クターに挿入すると、その結果多コピーの遺伝子配列が
生成される。詳細な実施態様に於ては、クローニングベ
クターとして哺乳動物宿主細胞中で発現を達成するのに
使用できるCDM8ベクターを用いることができる。例えば
相補性付着末端を有するクローニングベクターにDNAフ
ラグメントを連結することによって、クローニングベク
ターへの挿入を行うことができる。しかしながら、もし
DNAをフラグメントに切断するのに用いられた相補性制
限部位がクローニングベクターに存在しない場合は、DN
A分子の末端を酵素的に修飾することができる。このよ
うな修飾には、一本鎖DNA末端をさらに消化するかまた
は一本鎖末端を充填することによって平滑末端を生成さ
せることが包含され、かくしてこれら末端が平滑末端と
して連結できる。あるいはまた、DNA末端へのヌクレオ
チド配列（リンカー）の結合によって任意の所望の部位
をつくり出すことができる。これらの連結されたリンカ
ーは制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特異
的な化学合成オリゴヌクレオチドからなることができ
る。別法では、切断したベクターおよびCR1遺伝子をホ
モポリメリックティリングによって修飾することができ
る。
クローン化されたCR1遺伝子は、DNAそれ自体の性質ま
たは、代わりにそのコードするタンパク質の物理的、免
疫学的、または機能的性質に基づく多くの方法で同定す
ることができる。例えば、DNAそれ自体は、標識化プロ
ーブに対するプラークまたはコロニー核酸ハイブリダイ
ゼーションによって検出できる（Benton,W.およびDavi
s,R.,1977,Science 196:180;Grunstein,M.およびHognes
s,D.,1975,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72:3961）。ま
た、その発現された産物の性質に基づくアッセイによっ
てCR1遺伝子の存在を検出することもできる。例えば、C
R1について知られているのと同様のまたは同一の、電気
泳動での移動、等電点電気泳動での挙動、タンパク分解
的消化地図、C3bおよび／またはC4bおよび／または免疫
複合体結合活性、補体調節活性、食作用または免疫刺激
におよぼす作用、または抗原性を有するタンパク質を生
産するcDNAクローン、または適合するmRNAをハイブリッ
ド選択するDNAクローンを選択することができる。CR1に
対する抗体が使用できれば、ELISA（エンザイムリンク
トイムノソルベントアッセイ）型の方法で、標識化抗体
の推定CR1合成クローンへの結合によって、CR1タンパク
質を同定できる。
詳細な実施態様に於ては、単離されたCR1遺伝子、cDN
A、または合成DNA配列を組み込んだ組換えDNA分子を用
いて宿主細胞を形質転換することによって、多コピーの
遺伝子を生成させることができる。従って、その形質転
換体を増殖させ、形質転換体から繰換えDNA分子を単離
し、そして必要ならば単離された組換え体DNAから挿入
遺伝子を回収することによって、遺伝子を大量に得るこ
とができる。
特定の実施態様に於ては、サイトメガロウイルスのプ
ロモーターの制御下で大規模発現させるにはCDM8ベクタ
ーのCR1 cDNAクローンを、COS（サル腎臓）細胞にトラ
ンスフェクションさせることができる（下記6.1.8項参
照）。
究極の目的が、ワクシニアウイルスまたはアデノウイ
ルスのようなウイルス発現ベクターに遺伝子を挿入する
ことであるならば、CR1遺伝子を組み込んだ組換えDNA分
子を、その遺伝子の側面がウイルス配列で挟まれるよう
に修飾でき、それによってウイルスに感染した細胞中で
ゲノムでの組換えが可能となってその結果遺伝子をウイ
ルスゲノム中に挿入することができる。
CR1 DNA−含有クローンを同定、増殖、および収穫し
た後、下記5.4.1項に記載されたようにしてそのDNA挿入
物を特性決定することができる。
CR1遺伝子の遺伝子構造が判明すると、本発明に於て
最適に利用するためにその構造を操作することが可能で
ある。例えば、タンパク質の発現を増加させるために、
もともと備わっているプロモーターに加えて、またはそ
の代わりにプロモーターDNAをCR1コード配列の５′側に
連結することができる。CR1欠失変異株を発現する発現
ベクターもCR1配列の特定のフラグメントの発現を提供
するために作られる（下記実施例の項参照）。特別の実
施態様においては、所要のC3bおよび／またはC4b結合機
能（下記９項参照）、例えばC4b結合のためのLHR−Ａま
たはC3b結合のためのLHR−Ｃを示すCR1タンパク質のフ
ラグメントをコードする欠失変異株を構築できる。好ま
しい実施態様においては、膜横断領域の欠失を有するCR
1分子をコードする発現ベクターは可溶性CR1分子を産生
するのに使用できる（下記実施例11−14頁参照）。多く
の操作が可能であり、そしてそれらは本発明の範囲内で
ある。
5.2.CR1遺伝子の発現 CR1タンパク質（第１図）またはその一部分をコード
するヌクレオチド配列を適当な発現ベクター、すなわち
挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必
要なエレメントを含有するベクター中に挿入することが
できる。必要な転写および翻訳シグナルはもともとのCR
1遺伝子および／またはその隣接領域から供給されるこ
ともできる。種々の宿主ベクター系がタンパク質コード
配列を発現させるのに利用できる。これらには、ウイル
ス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスな
ど）感染哺乳類細胞系；ウイルス（例えばバキュロウイ
ルス）感染昆虫細胞系；酵母ベクターを含有する酵母の
ような微生物、またはバクテリオファージDNA、プラス
ミドDNA、またはコスミドDNAで形質転換された細菌、が
包含されるがそれらに限定されるわけではない。これら
のベクターの発現エレメントはその強度および特異性が
変動する。使用される宿主−ベクター系に応じて、多数
の適当な転写および翻訳エレメントの任意の一つを用い
ることができる。例えば、哺乳類細胞系でクローニング
する場合は、哺乳類細胞ゲノムから単離されたプロモー
ターまたは哺乳類細胞中で増殖するウイルス例えばアデ
ノウイルス、シミアンウイルス40、サイトメガロウイル
スから単離されたプロモーターを使用することができ
る。挿入配列の転写を引き起こすためには、組換えDNA
または合成技法によって作成されたプロモーターを用い
ることもできる。
また挿入されたタンパク質コード配列を効率的に翻訳
するには特異的な開始シグナルも必要である。これらの
シグナルにはATG開始コドンおよび隣接配列が包含され
る。それ自身の開始コドンおよび隣接配列を包含する完
全なCR1遺伝子を適当な発現ベクターに挿入する場合
は、翻訳制御シグナルを更に加える必要はない。しかし
ながら、CR1コード配列の一部分のみが挿入された場合
には、ATG開始コドンを含む外来翻訳制御シグナルが付
与されねばならない。さらに挿入物全体の翻訳を保証す
るには開始コドンはタンパク質コード配列と読み枠が一
致しなければならない。このような外来翻訳制御シグナ
ルおよび開始コドンは天然および合成両方の種々な起源
のものであることができる。
適当な転写／翻訳制御シグナルおよびタンパク質コー
ド配列からなるキメラ遺伝子を含有する発現ベクターを
構築するには、DNAフラグメントのベクターへの挿入に
関して既に述べた任意の方法を用いることができる。こ
のような方法にはインビトロ組換えDNAおよび合成技
法、およびインビボ組換え（遺伝的組換え）が包含され
うる。
特別の実施態様において、可溶性CR1分子を発現す
る。かかる可溶性分子は、CR1膜横断領域をコードするD
NA配列を欠失する組換えDNA技法の使用により産生でき
る（下記11−14項参照）。下記に示す様に、可溶性CR1
分子を発現する能力は、CR1核酸配列のいかなる遺伝子
的改変にも限定されない。すなわちCR1膜横断領域のか
なりの部分をコードする核酸配列を欠失するかぎり、可
溶性CR1構築物は得られる。
CR1遺伝子挿入物を含有する発現ベクターは３つの一
般的な方法によって確認することができる。すなわち
（ａ）DNA−DNAハイブリダイゼーション、（ｂ）「マー
カー」遺伝子機能の存在または非存在、および（ｃ）挿
入配列の発現。最初の方法に於ては、発現ベクター中に
挿入された外来遺伝子の存在は挿入されたCR1遺伝子と
相同の配列を含有するプローブを用いるDNA−DNAハイブ
リダイゼーションによって検出できる。第２の方法に於
ては、組換えベクター／宿主系はベクターへの外来遺伝
子の挿入によって引き起こされた特定の「マーカー」遺
伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐
性、形質転換表現型、バキュロウイルスに於ける閉塞体
形成）の有無に基づいて確認および選択することができ
る。例えば、もしCR1遺伝子がベクターのマーカー遺伝
子配列内に挿入されるならば、CR1挿入物を含有する組
換え体はマーカー遺伝子機能の欠如によって確認するこ
とができる。第３の方法に於ては、組換え体によって発
現される外来遺伝子産物をアッセイすることによって、
組換え発現ベクターを確認することができる。このよう
なアッセイは遺伝子産物の物理的、免疫学的、または機
能的な性質に基づくことができる。
ひとたび特定の組換えDNA分子が同定および単離され
ると、当業上知られたいくつかの方法がその増殖に使用
できる。ひとたび好適な宿主系および増殖条件が確立さ
れると、組換え発現ベクターを大量に増殖および調製す
ることができる。
本発明の実施例で詳述する特定の実施態様に於ては、
CR1 cDNA挿入物を有するCDM8ベクターをCOS細胞にトラ
ンスフェクションすることができる。この細胞内でCR1
cDNA挿入物が発現されてCR1タンパク質が生産される。
下記の実施例の項に詳細した他の特別の実施態様におい
て、CR1コード領域の部分に相当するCR1 cDNA挿入物を
有するCDM8ベクターをCOS細胞にトランスフェクション
し、そこでCR1またはフラグメントが発現する。さらに
下記のもうひとつの実施例によると、切断した可溶性CR
1分子は11.3.1項記載のpTCSベクターのような発現ベク
ターの使用により哺乳動物細胞中に発現される。既に説
明したように、使用できる発現ベクターには少数例をあ
げれば以下のベクターまたはそれの誘導体が包含される
がそれらに限定されるわけではない。ワクシニアウイル
スまたはアデノウイルスのようなヒトまたは動物ウイル
ス；バキュロウイルスのような昆虫ウイルス；酵母ベク
ター；バクテリオファージベクター（例、ラムダ）、お
よびプラスミドおよびコスミドDNAベクター、など。
さらに、挿入配列の発現を調節するかまたはキメラ遺
伝子産物を特定の所望の様式で修飾しプロセシングする
宿主細胞株を選択することができる。あの種のプロモー
ターからの発現を特定のインデュサーの存在下に高める
ことができる。したがって、遺伝子工学的に作成された
CR1タンパク質の発現を制御することができる。さら
に、それぞれ異なった宿主細胞は、翻訳および翻訳後の
タンパク質のプロセシングおよび修飾に関して特徴的か
つ特異的なメカニズムを有する。確実に異種の発現タン
パク質に対し所望の修飾およびプロセシングを行うため
に、適当な細胞系または宿主系を選択することができ
る。例えば、第１図の推定アミノ酸配列を有する未グル
コシル化CR1タンパク質を生産するには、細菌系での発
現を用いることができる。酵母菌中での発現は、グルコ
シル化産物を産生する別の実施態様に於ては、異種CR1
タンパク質の「自然な」グリコシル化を保証するため
に、哺乳類COS細胞を用いることができる。さらに、種
々のベクター／宿主発現系が種々の程度でタンパク分解
的切断のようなプロセシング反応を行うことができる。
種々にプロセシングされた多くのかかるCR1タンパク質
を生成させることができ、そしてこれらは本発明の範囲
内にある。本発明の好ましい実施態様において、可溶CR
1分子の大規模生産は第12.1以下に記載のように行な
う。
5.3.発現された遺伝子産物の同定および精製 CR1遺伝子を発現する組換え体が一たん同定される
と、その遺伝子産物を分析しなければならない。これは
その産物の物理的、免疫学的、または機能的性質に基づ
くアッセイによって行うことができる。
CR1タンパク質はクロマトグラフィー（例えば、イオ
ン交換、アフィニティー、およびサイジングカラムクロ
マトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー）、遠心
分離、溶解度の相違、を包含する標準的な方法によっ
て、またはタンパク質精製に関する任意の他の標準的な
技法によって単離および精製することができる。
下記の実施例中に詳細した本発明の好ましい面におい
て、大量の可溶性CR1はHPLCを用いる方法により精製で
きる（12.2以後を参照）。下記に記載のように精製CR1
の大規模生産は、始めの材料として可溶性CR1を産生す
る、したがって界面活性剤で膜結合CR1を可溶化する必
要性を排除する発現方法を使用することにより達成でき
る。バイオリアクター培養物中のウシ胎児血清濃度の減
少および／またはこれらの培養物中に他の培養地の使用
により、続く精製中に可溶性CR1含有の始めの材料から
高濃度の外部タンパク質を取り除く必要を排除する。陽
イオンHPLCまたは陽イオンHPLCの組合せのうちいずれか
一方の後で陰イオン交換HPLCを、この好ましい面におけ
る精製のために使用できる。このようにして、かなり純
粋な可溶性CR1を大量に、一または二段階だけで達成で
きる。
また、組換え体によって生産されるCR1タンパク質が
一たん同定されると、組換え体に含まれるキメラ遺伝子
のヌクレオチド配列から、このタンパク質のアミノ酸配
列を推定することができる。結果として、このタンパク
質を当業上知られた標準的な化学的方法によって合成す
ることができる（例えば、Hunkapiller,M.ら、1984,Nat
ure310:105−111参照）。
本発明の詳細な実施態様に於ては、このようなCR1タ
ンパク質は、それが組換えDNA技法によって生成される
かまたは化学合成法によって生成されるかに関わらず、
実質的に第１図に示すようなアミノ酸配列のすべてまた
は一部分を主要アミノ酸配列として含有するタンパク質
を包含するがそれに限定されるわけではない。またこの
アミノ酸配列には機能的に等価のアミノ酸残基が配列内
の残基と置換されてサイレントな変化を起こしているよ
うな変化した配列が包含される。例えば、一つまたはそ
れ以上の配列内アミノ酸残基を、同様の極性を示し機能
的な等価な作用をする別のアミノ酸により置換して、結
果としてサイレントな変化を生成させることができる。
また非保存的置換は機能的に等価なタンパク質を生じ
る。
ひとつの実施態様において、CR1配列内でのアミノ酸
の代替物はそのアミノ酸が属するクラスの他のアミノ酸
から選択することができる。例えば、非極性（疎水性）
アミノ酸にはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリ
ン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよ
びメチオニンが包含される。極性中性アミノ酸にはグリ
シン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、ア
スパラギン、およびグルタミンが包含される。陽性荷電
（塩基性）アミノ酸にはアルギニン、リジン、およびヒ
スチジンが包含される。陰性荷電（酸性）アミノ酸には
アスパラギン酸およびグルタミン酸が包含される。翻訳
中または翻訳後に例えばグリコシル化、タンパク分解的
切断などによって特別に修飾されたCR1タンパク質も本
発明の範囲に含まれる。
下記に詳記した本発明の実施例において、トランスフ
ェクションした細胞により発現されるクローン化組換え
CR1は、SDS−PAGEによると赤血球のアロタイプから識別
できないことを示し（第14図）、C4bまたはC3bのいずれ
か一方を担持するヒツジ赤血球の結合に介在することが
でき、CR1のリガンド特異性を再産生すること（第13
図）、およびC3（ma）のアルファポリペプチド切断のた
めのファクターＩコーファクター機能を表わすこと（第
15図）ができる。
5.4.CR1遺伝子およびタンパク質の構造 CR1遺伝子およびタンパク質の構造は下記に記載され
た方法を含むが、それらに限定されない当業上知られた
種々の方法により分析することができる。
5.4.1.遺伝子分析 CR1遺伝子に相当するクローン化DNAまたはcDNAはサザ
ンハイブリダイゼーション（Southern,E.M.,1975,J.Mo
l.Biol.98:503−517）、ノーザンハイブリダイゼーショ
ン（例えば、Freemanら、1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.
S.A.80:4094−4098参照）、制限エンドヌクレアーゼマ
ッピング（Maniatis,T.,1982,Molecular Cloning,A Lab
oratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold
Spring Harbor,New York）、およびDNA配列分析を包含
するがそれらに限定されない方法によって分析すること
ができる。用いられた特異的なCR1プローブに対して所
望度合の関連性を有する核酸の検出を確保するために、
サザンおよびノーザンハイブリダイゼーションの両方の
ハイブリダイゼーション条件の厳密さを加減することが
できる。
CR1遺伝子の遺伝子構造を大まかに決定するために制
限エンドヌクレアーゼマッピングを用いることができ
る。特定の実施態様に於ては、下記第２図に示す制限地
図を得るために、制限酵素での切断を用いることができ
る。制限エンドヌクレアーゼ切断によって得られた制限
地図をDNA配列分析によって確認することができる。
当業上知られた任意の方法によってDNA配列分析を行
うことができる。このような方法にはマキサム（Maxa
m）およびギルバート（Gilbert）の方法（1980,Mech.En
zymol.65:499−560）、サンガーのジデオキシ法（Sange
r,F.ら、1977,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74:5463）、
または自動化DNAシークエネーター（例えば、Applied B
iosystems,Foster City,CA）の使用が包含されるがそれ
らに限定されるわけではない。CR1遺伝子のcDNA配列
は、実質的には第１図に示されそして下記６および７項
に詳述される配列を包含する。
5.4.2.タンパク質分析 CR1タンパク質のアミノ酸配列をDNA配列からの推定に
よるか、またはその代わりに例えば自動化アミノ酸シー
クエンサーを用いたタンパク質の直接配列決定により導
くことができる。CR1タンパク質の代表的なもののアミ
ノ酸配列は、実質的には第１図に示されそして下記６項
に詳述される配列を含有する。 下記に記載されている
ように、ＦアロタイプCR1コード配列の全てはクローン
化され、41アミノ酸のシグナルペプチドの切断後、成熟
レセプターは30のSCRを形成する1930基の外部ドメイン
を包含する1998アミノ酸を含む。
30のSCRのうち28は、LHR−A,−B,−Ｃおよび−Ｄ（第10
図）、25アミノ酸の単一膜間ドメイン、および43アミノ
酸の比較的短い細胞質ドメインを構成する。
多数のSCRを含むC3/C4結合タンパク質中で、CR1はLHR
を構成するSCRのグループを有することで特有である。C
R1の４つのLHRの比較により、それぞれは４種のSCR,a、
ｂ、ｃおよびｄ種、からなる合成物であることが明らか
になる（第19図）。例えば、LHR−ＡのSCR−１および−
２の配列は、LHR−Ｂ、−Ｃおよび−Ｄの最初の２つのS
CRに対して、それぞれ62％、62％および57％だけ同一で
ある。しかしながら、SCR−３からSCR−７までは単一の
位置でのみLHR−Ｂの対応するSCRとは異なり、SCR−３
および−４は、三個所の位置でのみLHR−Ｃのそれらと
は異なる（第10図）。したがって、LHR−Ａの“a"種SCR
のいくつかもLHR−Ｂおよび−Ｃに存在する。LHR−Ｂの
最初の２つのSCRは、LHR−Ａのそれとは異なり、LHR−
Ｃの対応するSCRと99％同一であり、その結果LHR−Ｂお
よび−Ｃは、これらの位置で“b"種SCRを共有する。LHR
−Ｃの第5,6および7SCRは、これらの位置でLHR−Ａおよ
び−Ｂの“a"種SCRと77％だけ同一であり、“c"種SCRと
考えられている。LHR−Ｄの第１から４までのSCRは比較
的特有のものであり、“d"種であるが、一方第５から７
までのSCRは、LHR−Ｃ中に見い出される“c"種と約93％
同一である。
CR1タンパク質配列は親水性分析によってさらに特性
決定することができる（Hopp,T.およびWoods,K.,1981,P
roc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:3824）。親水性プロフィ
ールは、CR1タンパク質の疎水性および親水性領域、お
よびかかる領域をコードする遺伝子配列の対応する領域
の同定に用いることができる。CR1タンパク質のCOOH−
末端の親水性プロフィールを第５図に示す。
特異的な二次構造が想定されるCR1の予想領域を同定
するために、二次的構造分析（Chou,P.およびFasman,
G.,1974,Biochemistry13:222）を行うこともできる。
他の構造分析法を用いることもできる。これらにはＸ
線結晶学（Engstom,A.,1974,Biochem.Exp.Biol.11:7−1
3）およびコンピューターモデリング（Fletterick,R.お
よびZoller,M.（編）,1986,Computer Graphics and Mol
ecular Modeling.in Current Communications in Molec
ular Biology,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Sp
ring Harbor,New York）が包含されるがそれらに限定さ
れるわけではない。
5.5.CR1関連誘導体、類似体、およびペプチド CR1に関連する誘導体、類似体およびペプチドの生産
および使用も意図されており、それらは本発明の範囲内
にある。所望の免疫原性または抗原性を有するかかる誘
導体、類似体またはペプチドは、例えばイムノアッセイ
に於いて、免疫化のために、治療上の目的などに用いる
ことができる。例えばC3dまたはC4dの結合、補体活性の
調節、または免疫刺激または食作用の促進等のような所
望のCR1の性質を保持し、あるいはまたそれを阻害する
かかる分子は、かかる性質のそれぞれインデューサーと
してまたはインヒビターとして用いることができる。
本発明のCR1関連誘導体、類似体およびペプチドは当
業上知られた様々な方法で生産できる。このような生産
をもたらす操作は遺伝子またはタンパク質レベルで行う
ことができる。例えば、クローン化CR1遺伝子は当業上
知られた多数の任意の方法で修飾することができる（Ma
niatis,T.ら、1982Molecular Cloning,A Laboratory Ma
nnal,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Har
bor,New York）。CR1配列をインビトロで、制限エンド
ヌクレアーゼを用いて適当な部位で切断し、所望の場合
はさらに酵素的に修飾し、単離し、そして連結すること
ができる（下記８項参照）。CR1関連誘導体、類似体、
またはペプチドをコードする遺伝子の生産においては、
修飾された遺伝子が、所望のCR1特異的活性をコードす
る遺伝子領域内に、翻訳終止シグナルに中断されること
なく、CR1と同じ翻訳の解読枠になることが確保される
よう注意が払われるべきである。特別な実施態様におい
て、融合タンパク質をコードし、CR1配列の部分プラス
非CR1配列を含んでなる分子から構成される核酸配列を
生成できる。
さらに、CR1遺伝子をインビトロまたはインビボで突
然変異させて、翻訳、開始、および／または終止配列を
生成させおよび／または破壊するか、あるいはコード領
域に変化を生成させ、そして／また新たな制限エンドヌ
クレアーゼ部位を形成させるかまたは既に存在する部位
を破壊させ、さらにインビトロ修飾を促進することがで
きる。突然変異誘発のための当業上知られた任意の方法
を用いることができ、このような方法にはインビトロ特
定部位の突然変異誘発（Hutchinson,C.ら、1978,J.Bio
l.Chem.253:6551）、TAB（商標）リンカー（Pharmaci
a）の使用、などが包含されるがそれらに限定されな
い。
CR1配列の操作はタンパク質レベルでも行うことがで
きる。多数の化学的修飾のいずれでも既知の技法によっ
て行うことができ、これらには臭化シアン、トリプシ
ン、キモトリプシン、パハイン、V8プロテアーゼ、NaBH
4による特異的化学的分解；アセチル化、ホルミル化、
酸化、還元；ツニカマインシン存在下の代謝的合成；な
どが包含されるがそれらに限定されない。
さらに、CR1関連類似体およびペプチドを化学的に合
成することができる。例えば、遺伝子発現の所望の機能
（例えばC3bおよび／またはC4b結合、免疫刺激、補体調
節、等）を仲介するCR1の一部分に相当するペプチドをD
NAシンセサイザーを用いて合成することができる。
CR1のヌクレオチド配列の特別な変更は複数のLHR−Ｂ
配列を有するタンパク質をコードする配列を生じる組換
えDNA法によりなされる。かかる結合変更はC3b結合の度
合いを変化される。
5.6.CR1の使用 5.6.1.アッセイおよび診断 CR1タンパク質、その類似体、誘導体、およびサブ配
列、および抗−CR1抗体は診断に用途を有する。所望のC
R1性質または機能を示す本発明の分子は、かかる性質ま
たは機能をアッセイするために使用できる。例えば、単
独でおよび／または複合体の形でC3bおよび／またはC4b
の結合を示すCR1タンパク質またはそのフラグメント
は、例えば患者の体液のような試料中のかかる物質の量
を測定するアッセイに使用できる。
詳細な実施態様において、C3b（例えば下記第II表、
９項参照）、iC3bまたはC4b（例えば、第II表参照）と
結合する能力を有する細胞表面上に発現する完全な長さ
のCR1またはCR1欠失変異種（例えば、下記８項に記載さ
れているもの）は、試料中のそれぞれC3b、iC3b、また
はC4bのレベルを測定するアッセイに使用できる。他の
実施態様において、組換えDNA技術により構築された、
膜横断配列を欠くCR1タンパク質またはそのフラグメン
トは、このように分泌され、使用される。
特別な実施態様において、C3bおよび／またはC4bのか
かる測定は補体機能の指標として信頼でき、炎症性およ
び免疫系障害の診断に有用である。かかる障害は、やけ
どまたは心筋梗塞誘導損傷による組織損傷、成人呼吸困
難症候群（ショック肺）、リウマチ様関節炎、全身性紅
斑性狼瘡のような自己免疫障害、および望ましくないま
たは、不適切な補体機能に関係した他の疾患または障害
を含むが、それらに限定されない（例えばMiescher,P.
A.およびMuller−Eberhard,H.J.,（編）,1979,Text Boo
k of Immunopathology,2d Ed.,Vols.I and II,Grune an
d Stratton,New York;Sandberg,A.L.,1981,in Cellular
Functions in Immunity and Inflammation,Oppenheim,
J.J.ら、（編）,Elsevier/North Holland,New York,p.3
73;Conrow,R.B.ら、1980,J.Med.Chem.23:242;Regal,J.
F.およびPickering,R.H.,1983,Int.J.Immunopharmacol.
5:71;Jacobs,H.S.,1980,Arch.Pathol.Lab.104:617を参
照）。
エピトープを含むCR1タンパク質およびそのフラグメ
ントはイムノアッセイを含むがそれに限定されないアッ
セイに用途を有する。使用できるイムノアッセイには、
少数例をあげれば、ラジオイムノアッセイ、ELISA（エ
ンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ）、「サン
ドイッチ」イムノアッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反
応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセ
イ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッ
セイ、プロテインＡイムノアッセイ、および免疫電気泳
動アッセイ、のような技法を用いる競合および非競合ア
ッセイ系が包含されるがそれらに限定されない。
CR1遺伝子および、関連核酸配列およびサブ配列はハ
イブリダイゼーションアッセイに用いることができる。
かかるハイブリダイゼーションアッセイは、CR1発現に
関連した炎症または免疫反応を監視するため、CR1発現
の変化に関連した特定の疾患状態を診断するため、患者
のCR1アロタイプを決定するため、そしてCR1遺伝子およ
び関連した遺伝子（例えばCR2）の存在および／または
発現を検出するために使用することができる。
本発明において用いられるアッセイを実行するための
キットもまた提供される。
5.6.2.治療 CR1タンパク質およびフラグメント、誘導体、および
それの類似体はCR1により介在された機能の調節をする
のに治療上有用である。かかる機能は、単独でまたは複
合体の形でC3bおよび／またはC4dの結合、食作用の促
進、補体調節、免疫刺激、等を含むがそれらに限定され
ない。本発明のCR1タンパク質および関連分子の作用を
およぼす投量は、免疫または炎症性障害のような、かか
る機能に関連した多くの疾患または障害に治療上の価値
を有する（例えば、上記5.6.1項に記載されている障
害）。例えば、所望の機能を示す完全な長さのCR1また
はそのフラグメントおよび関連した分子は補体構成物C3
bまたはC4bの不可逆的不活性化を促進するファクターＩ
コーファクターとして作用するその能力により（Fearo
n,D.T.,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76:5867;Iida,
K.およびNussenzweig,V.,1981,J.Exp.Med.153:1138）お
よび／または副経路または主経路のC3またはC5コンバー
テーズを阻止する能力により補体の阻止に治療上の用途
を有する。
本発明の詳細な実施態様において、膜横断領域を欠き
（例えば、大部分のＣ末端SCRによりコードされたアル
ギニンからカルボキシ末端の欠失により）可溶性CR1フ
ラグメントの産生を生じるCR1分子をコードさせるため
に発現ベクターを構築できる。ひとつの実施態様におい
て、かかるフラグメントは、単独でまたは複合体の形で
C3bおよび／またはC4bと結合する能力を保持することが
できる。特別な実施態様において、かかる可溶性CR1タ
ンパク質はファクターＩコーファクター機能を、もはや
示さない。可溶性CR1産物は患者にインビボで投与し、
可溶性CR1は、本来備わっている細胞表上のCR1に対する
C3bおよび／またはC4bの結合競争に勝り、したがって細
胞表面CR1ファクターＩコーファクター機能を阻止し補
体機能を増大する。
C3bが粒子および可溶性免疫複合体に共有的に付着し
た後、タンパク質分解プロセシングされてiC3bおよびC3
dgになるC3bの不活性は２つの生物学的結果を有する。
すなわち増殖経路を経由して補体組織の過度の活性を防
ぐこと、およびCR1以外のレセプターと結びつくリガン
ドの形成である。iC3bフラグメントはＢ因子に結合でき
ないので、この状態への転換は副経路増幅回路経由の追
随的補体活性を阻止する。しかしながら、iC3bは、骨髄
性単核球細胞による食作用を介在する２つの補体レセプ
ターである、CR1およびCR3により結合しうる。したがっ
て、C3bからiC3bへの転換の主要な生物学的帰結は、C3
でおおわれた複合体のCR1−およびCR3介在のクリアラン
スを妨げることなく補体活性を中止する。対照的にiC3b
からC3dgへの追随的転換は、CR2とだけ相互作用するがC
R1およびCR3とは相互作用しないフラグメントを創る。
この状況は、Ｂリンパ細胞、濾胞性樹状細胞および、お
そらく真皮の上皮細胞を包含するCR2を発現する細胞型
に対するC3dg担持複合体の補体依存結合を制限し、食作
用細胞種との相互作用を減少させるかまたは遮断する。
細胞的かかわりあいの変化したパターンの生物学的帰結
は、粒子および複合体のクリアランスおよび分解にかか
わる細胞よりもむしろ免疫反応の導入期にかかわる細胞
に対するC3dg担持複合体の標的であろう。したがって、
CR1分子はクリアランス過程に影響を与えるのみなら
ず、抗原提示および抗体産出に関与するCR2担持細胞種
にも治療上使用できる。
他の実施態様において、C3bまたはC4bに結合し、およ
び／または、副経路または主経路のC3またはC5コンバー
テーズを阻止する能力を保持する、またはファクターＩ
−コーファクターを保持するCR1タンパク質またはその
フラグメントは補体不活性化を促進するのに使用でき
る。かかる実施態様において、CR1タンパク質またはフ
ラグメントは望ましくないまたは不適当な補体機能に関
係する障害の治療に価値がある（例えば、ショック肺、
やけどまたは之血性心臓異常による組織損傷、自己免疫
障害、炎症性疾患等）。
下記11−14項の実施例に詳記した特別の実施態様にお
いて、例えばインビトロにおいて主経路の補体介在溶血
反応、主経路C5a産生、主経路C3a産生または好中球酸化
的破壊を阻止する能力により示されるように所望の機能
的活性を保持する可溶性CR1分子は発現する。特別の実
施態様において、かかる可溶性CR1分子は、炎症および
その有害な作用な減少するために、または心筋性梗塞の
大きさを減少するために、または再灌流損傷を防ぐ等の
ために、使用できる。インビボでの治療に有用な、かか
るCR1分子は逆受身アルサス反応（14.1項参照）および
ラット心筋性梗塞モデル（14.3項参照）を含むがそれら
に限定されない当業上知られる種々のモデル系で検定さ
れる。
本発明のもうひとつの実施態様において、所望のCR1
性質または機能を阻止することを示すCR1のフラグメン
トまたは類似体またはその誘導体は、その機能に関連す
る疾患または障害を防ぐのにまたは治療するのに使用で
きる。
種々の放出系が知られており、そしてそれらをCR1及
び関連分子の放出に使用することができる。例えばリポ
ソーム内カプセル化、遺伝子療法における造血幹細胞子
細胞による発現など。導入のための他の方法には、皮
内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下および鼻内および経
口経路が包含されるがそれらに限定されない。
本発明はまた医薬組成物を提供する。かかる組成物は
CR1タンパク質、または類似物、誘導体、またはそれら
のフラグメントおよび医薬上許容される担体の治療上効
果的な量を含んで成る。かかる担体は食塩水、緩衝食塩
水、デキストローズおよび水を包含するがそれらに限定
されない。
5.6.3.結合療法 さらにつけ加えられた面においては、人および動物の
血栓症状、特に急性心筋梗塞を治療する方法が提供され
る。その方法は必要としている人や動物に本発明に従い
可溶性CR1タンパク質の効果的な量および血栓溶解剤の
効果的な量を投与することを含んでなる。
本発明はまた人および動物の血栓症状の治療のために
薬剤製造における可溶性CR1タンパク質および血栓溶解
剤の用途を提供する。
上の方法において、化合物は例えば注入や濃縮塊注射
によりどんな便利な経路からでも投与できるし、逐次的
にまたは一度に投与できる。本発明の可溶性タンパク質
および血栓溶解剤を逐次的に投与する場合、可溶性CR1
タンパク質は血栓溶解剤の前または後いずれか一方に投
与できる。可溶性CR1タンパク質および血栓溶解剤を共
に投与した場合、それらは両剤を含んで成る医薬組成物
の形態で与えられることが好ましい。したがって本発明
のさらにつけ加えられた面において医薬的に許容される
担体と共に可溶性CR1タンパク質および血栓溶解剤を含
んでなる医薬組成物が提供される。
好ましい実施態様において、組成物は人に静脈投与す
るのに適した医薬組成物としてふつうの方法に従い処方
される。
通常、静脈投与用組成物は滅菌等張性水性緩衝液の溶
液である。必要な場合、組成物は、また可用性剤および
注射の部位の痛みをやわらげるためのリグノカインのよ
うな局所麻酔薬をも包含する。一般に、成分は、例えば
活性単位中の活性剤量を示すアンプルまたはサシェッテ
（sachette）のような密閉状にシールした容器に乾燥凍
結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、単位用量
形態で別々にまたは混合して供給されることになる。組
成物が注入により投与される場合、それは滅菌医薬等級
の“注入用水”または食塩水を含有する注入ボトルに調
剤される。組成物が注射により投与される場合、注射用
の滅菌水または食塩水のアンプルが提供され、成分は投
与前に混合される。医薬組成物の１またはそれ以上の成
分を詰めた１またはそれ以上の容器を含んで成る医薬パ
ックもまた本発明の範囲内にある。
投与される物質の量および血栓溶解剤のCR1タンパク
質に対する割合は血栓塞栓症状の重大さおよび凝血の位
置およびサイズに依ることになる。使用される正確な用
量および投与の様式は、いやおうなしに病みの本質を考
慮に入れて、治療を管理している医師により状況に応じ
て決定されねばならない。しかしながら、一般に血栓で
治療されている患者は血栓溶解剤の標準用量当り補体阻
害剤（可溶性CR1構成物）0.5−50mgの用量を一般に取る
ことになる。
上記の結合療法で用いられる特別な血栓溶解剤はプラ
スミノーゲンアクチベーターを包含する線維素溶解酵素
である。
プラスミノーゲンアクチベーターの用語はストレプト
キナーゼ、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター
（ｔ−PA）およびウロキナーゼ（ｕ−PA）（単一および
２鎖形態両方）を包含するがそれらに限定されない。か
かる酵素は自然源または組織からまたは細菌、イース
ト、真菌、または動物細胞のような異種宿主生物がその
酵素に特定する遺伝子を発現する組換えDNA法により得
られる。その用語はまた （ａ） ハイブリッドタンパク質が除去可能なブロック
基で場合によりブロックされる線維素溶解活性に必順の
触媒部位を有するようにハイブリッドタンパク質の鎖の
少なくとも１本が線維素溶解活性プロテアーゼ由来であ
る、異なる２本鎖プロテアーゼの１鎖に結合された２本
鎖プロテアーゼの１鎖を含んでなる線維素溶解活性ハイ
ブリッドタンパク質を開示しているEP（ヨーロッパ特許
公報）−Ａ−0155387およびEP−Ａ−297882に開示され
ているタンパク質、 （ｂ） EP−Ａ−0152736に開示された可逆性ブロック
プラズミンと結合したウロキナーゼのようなタンパク質
コンジュゲート、 （ｃ） 線維素溶解活性を果す酵素の触媒部位が、例え
ばヒトプラズミンの活性中心と可逆的に結合しているウ
ロキナーゼのような可逆的結合基により、それに付着し
たヒトタンパク質によりブロックされているEP−Ａ−01
55388に開示された線維素溶解酵素の誘導体、 （ｄ） EP−Ａ−0183503に開示されている可逆的結合
基により水可溶性ポリマーと結合した線維素溶解酵素を
含んでなるコンジュゲート、および （ｅ） des（cys51−asp87）ｔ−PAのようにEP−Ａ−0
201153,EP−Ａ−0207589,WO（PCT公報）−8604351,EP−
0041766,EP−0213794,EP−0199574,EP−Ａ−020334,EP
−Ａ−0241208,EP−Ａ−0241209,EP−Ａ−0241210,EP−
Ａ−0233013,EP−Ａ−290118,EP−Ａ−292326,EP−Ａ−
0213794,EP−Ａ−0231883,WO8704722,EP−Ａ−0242836,
EP−Ａ−0234051,EP−Ａ−0253582,EP−Ａ−0253241,WO
−8604351,EP−Ａ−0236040,EP−Ａ−0200451,EP−Ａ−
0238304,EP−Ａ−0225286,DE（西ドイツ公報）−353717
6,EP−Ａ−0236289,WO−8601538,EP−0227462,AU（オー
ストラリア公報）−8661804,WO−8703906およびEP−019
9574に開示された自然に存在するプラスミノーゲンアク
チベーターのミューティン（muteins）を包含する遺伝
子操作された誘導体、を包含する。
本発明の特別な面において、プラスミノーゲンアクチ
ベーターは、ｔ−PAの275および276残基とシステイン残
基264間のｔ−PA切断部位またはｕ−PAの158および159
残基とシステイン残基148間のｕ−PA切断部位、それぞ
れを含んでなるアミノ酸配列を介してｔ−PAまたはｕ−
PAのβ鎖と結合したプラスミノーゲンの５個のクリング
ルドメインを含んでなる、EP−Ａ−0297882に記載され
ているハイブリッド分子である。
かかるハイブリッドの例は、１および２鎖変異種、ly
s78およびglu1変異種、およびその混合物を包含するプ
ラスミノーゲン１−544/t−PA262−527、 １および２鎖変異種、lys78およびglu1変異種、およ
びその混合物を包含するプラスミノーゲン１−544/t−P
A262−527（arg275gln） １および２鎖変異種、lys78およびglu1変異種、およ
びその混合物を包含するプラスミノーゲン１−541/t−P
A262−527 １および２鎖変異種、gly-3、ser1およびval4変異
種、およびその混合物を包含するｔ−PA1−50/t−PA88
−91/pro−gly−ser/プラスミノーゲン84−544/t−PA26
2−527 1および２鎖変異種、gly-3、ser1およびval4変
異種、およびその混合物を包含する、ｔ−PA1−91/pro
−gly−ser/プラスミノーゲン84−544/t−PA262−527ま
たは １および２鎖変異種、lys78およびglu1変異種、およ
びその混合物を包含する、プラスミノーゲン１−546/u
−PA137−411を包含する。
好ましい実施態様において、結合療法において使用さ
れる血栓溶解剤はU.S.特許No.4,285,932のSmithに示さ
れた意味を有するインビボ線維素溶解酵素を可逆的にブ
ロックする。すなわち線維素溶解活性に必須の触媒部位
は、加水分解の偽似一次速度定数が等張水性陪地中pH7.
4、37℃で10-8sec-1−10-3sec-1の範囲にあるような速
度で加水分解により除去しうる基によりブロックされる
インビボ線維素溶解酵素。
線維素溶解酵素がｔ−PAまたはウロキナーゼのセリン
プロテアーゼドメインを含んで成るプラスミノーゲンア
クチベーターである場合、取り除き可能なブロック基の
例は、ハロゲン原子で置換されさらに１またはそれ以上
の弱電子求引または電子供与基で光学的に置換された、
３または４位置にある２−アミノベンゾイル基であり、
そこにおいて誘導体の加水分解の偽似一次速度定数が、
0.05Mリン酸ナトリウム、0.1M塩化ナトリウム、約1300
の分子量を有するポリオキシエチレンソルビタンモノオ
レエートを含んで成る0.01％v/v洗剤から成る緩衝液系
中、pH7.4、37℃で測定した場合6.0×10-5−4.0×10-4s
ec-1の範囲である。
好ましくは、可逆的にブロックされるインビボ線維系
溶解酵素はストレプトキナーゼとプラスミノーゲンの２
成分複合体、最も好ましくは商標EMINASE（商品名アニ
ストレプラーゼ（anistreplase）以後APSACと称する。
すなわちアニソイル化ヒトプラスミノーゲン−ストレプ
トキナーゼ−アクチベーター複合体。例えばJ.P.Monk a
nd R.C.Heel,1987,Drugs 34:25−49を参照）でBeecham
Group plcにより市場に出されているU.S.特許No.4,808,
405に記載された内部結合切断のないｐ−アニソイルス
トレプトキナーゼ／プラスミノーゲン複合体である。
好ましい面において、結合療法で用いられる可溶性CR
1構成物はpBSCR1c,pBSCR1s,pBM−CR1c,pBSCR1c/pTCSgpt
およびpBSCR1s/PTCSgptから成るグループから選択され
る核酸ベクターによりコードされ上記のpBSCR1c/pTCSgp
tから特別に調製されたものである（12項参照）。
結合療法で用いられる特別の血栓溶解物は下記の様で
ある（用量の例および投与方法）。
6.実施例：ヒトC3b/C4bレセプター（CR1）のクローニン
グおよび配列決定 ここで詳述する実施例に於て、5.5キロベースペア（K
b）のCR1コード領域のクローニングおよびヌクレオチド
配列を説明する（Klickstein,L.B.ら、1987,J.Exp.Med.
165:1095−1112）。
5.5Kbの範囲にわたる10個の重なりあったCR1 cDNAク
ローンを扁桃腺のライブラリーから単離し、全体または
一部を配列決定した。それらのクローンの５′末端に始
まり4.7kb下流の終止コドンまで続く単一の長い読みと
り枠を同定した。CR1のＦアロタイプのコード配列につ
いて算出された6kbの80％に当たる。３個の縦列で、同
方向で、長い、450アミノ酸からなる相同反復（LHR）を
同定した。トリプシンペプチドの配列分析によって、CR
1のＦアロタイプにおいて第４のLHRの存在が証明され
た。LHR間のアミノ酸同一性は第１と第３反復の間での7
0％から、第１と第２反復のNH2−末端250アミノ酸の間
での99％までの範囲であった。各々のLHRは60−70アミ
ノ酸からなる７個の短いコンセンス反復（SCR）を含ん
でなり、これらは例えば相補的レセプタータイプ２、フ
ァクターＢおよびＨ、C4結合タンパク質、およびC2のよ
うな他のC3/C4結合タンパク質のSCRと類似する。さらに
別の２個のSCRがLHRを25アミノ酸からなる単一の膜結合
ドメインに結合する。したがってCR1のＦアロタイプは
おそらく少なくとも30個のSCRを含有し、そのうち23個
の既に配列決定されている。各SCRは三重ループ構造を
形成すると予想され、この構造に於て、４個の保存され
た1/2−シスチンがジスルフィド結合を形成する。半剛
構造として一列にならぶ30個のSCRは原形質膜から1.140
オングストロームにおよび、免疫複合体と微生物細胞壁
の間の空隙に位置するCR1とC3bおよびC4bとの相互作用
を容易にすることができよう。43残基からなるCOOH末端
細胞質ドメインは、６アミノ酸の配列を含有し、これは
プロテインキナーゼＣによってリン酸化される表皮成長
因子レセプターに於ける配列と相同である。
6.1.材料および方法 6.1.1.CR1トリプシンペプチドの単離および配列 洗浄したヒト赤血球膜から、マトリックスレッドＡお
よびYZ−１モノクローナル抗体アフィニティークロマト
グラフィーを続けて行うことによってCR1を精製した（W
ong,W.W.ら、1985,J.Immunol.Methods82:303）。（Won
g,W.W.ら、1985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:7711）
に記載のように、グラジェントおよびイソクラチックの
逆相HPLC（高性能液体クロマトグラフィー）を連続して
行うことによって、トリプシンペプチドを調製し、単離
した。470Aタンパク質シークエンサー（Applied Biosys
tems,Inc.,Foster City.CA）を用いてトリプシンペプチ
ド分析を行い、各分解サイクルの分析は120PTH−アミノ
酸分析計（Applied Biosystems,Inc.）を用いて行われ
た。
6.1.2.cDNAクローンおよびゲノムクローンの単離 記載（Wong,W.W.ら、1985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A.82:7711）のようにして、ヒト扁桃腺ポリ（Ａ）＋RNA
からλgtllにcDNAライブラリーを構築した。RNAブロッ
トハイブリッド形成よって、扁桃腺ドナーはCR1のＦ対
立遺伝子関してホモ接合性であった（同上）。クローニ
ング段階の前に、２から7Kbの間の断片を包含するcDNA
をアガロースゲル上で選択した。このライブラリーの最
初の組換え率は、100ng cDNA当り4.5×106組換え体であ
り、このライブラリーをエシュリヒア・コリ（Escheric
hia coli）Y1088株で増幅した。ライブラリーをCR1プロ
ーブ、CR1−１（ATCC番号57330（CR1−１プラスミド含
有E.コリ、57331（精製CR−1 DNA））およびCR1−２（W
ong,W.W.ら、1985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:771
1）を用いてスクリーニングした（Maniatis,T.ら、198
2,Mole−cular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spr
ing HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,New Yor
k）。これらのプローブはニックトランスレーションに
より比活性２−８×108cpm/μｇに予め放射性標識され
た。50％ホルムアミド、５×SSC（１×SSC:15mMクエン
酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム）中で、43℃で、
ハイブリッド形成を行い、フィルターを60℃で、CR2 cD
NAクローンが検出されない条件である0.2×SSCで洗浄し
た（Weis,J.J.ら、1986,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83:
5639）。陽性クローンを２回プラーク精製した後、制限
地図作成およびDNA配列分析を行った。
ヒト白血球DNAのSau3A I部分消化によって生じた15−
20kbフラグメントを用いてゲノムライブラリーをEMBL−
３に構築した。最初の組換え率は1.2×106であり、ライ
ブラリーをE.コリP2392中で増幅させた。このライブラ
リーもcDNAプローブCR1−１およびCR1−２を用いてスク
リーニングした（Wong,W.W.ら、1985,Proc.Natl.Acad.S
ci.U.S.A.82:7711）。
6.1.3.DNA配列分析 cDNAクローンの制限断片をM13mp18またはM13mp19にサ
ブクローニングし、ジデオキシヌクレオチドチェインタ
ーミネーション法（Sanger,F.ら、1977,Proc.Natl.Aca
d.Sci.U.S.A.74:5463）によって配列決定した。一部の
クローンはエキソヌクレアーゼIIIを用いて最初に作成
された定序欠失変異体によって、全体または部分的に配
列決定された（Henikoff,S.,1984,Gene28:351）。各領
域は二本鎖で配列決定され、ほとんどの場合、各領域は
２個の相互に無関係に単離されたcDNAクローンから構築
されたM13サブクローンで配列決定された（第２図）。W
isconsin大学遺伝コンピューターグループパッケージ
（Madison,WT）を用いて配列データを分析した。
6.2.結果 6.2.1.CR1遺伝子のヌクレオチド配列 分子量で選択した扁桃腺cDNAライブラリーを、CR1 cD
NAクローン、λT8から得られたCR1−１およびCR1−２プ
ローブを用いてスクリーニングした（Wong,W.W.ら、198
5,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:7711）。15個の陽性フ
ァージを1.5×108の組換え体から同定し、そのうち13個
は異なるクローンに相当する。10個は制限地図を作成
し、ジデオキシチェインターミネーション法によって全
体、または一部を配列決定した。同一配列の重なり合い
に基づいてcDNAクローンを整列させ（第２図）、5.5kb
に及ぶことを見いだした（第３図）。cDNAクローンの
５′末端に始まり終止コドンの4.7kb下流にいたる単一
の長い読みとり枠を同定した。このライブラリーに於け
るCR1に関するコード配列は、非グリコシル化レセプタ
ーの推定分子量220,000ダルトンに基づいて6kbであると
予想される（Wong,W.W.ら、1983,J.Clin.Invest.72:68
5）。したがって、これらのクローンは推定コード配列
の約80％をカバーする。
クローンT49.1及びT55.1は、その５′末端にコード配
列を含有する。このことはさらに他の５′コードおよび
非コード配列が同定されずに残っていることを示す。
３′領域に於て、重なり部分のあるクローン、T8.2、T4
3.1およびT87.1は、各クローンの同一配列によってコー
ドされる膜貫通および細胞質領域を含有する。最も３′
側に広がるクローンT8.2はポリ（Ａ）配列を持たない80
7bpの非翻訳領域を含有する。クローンT6.1およびT55.1
に見いだされた配列と比較して、クローンT8.3はヌクレ
オチド1,406−1,497の91bpの欠失を有し、クローンT40.
1はヌクレオチド1,498−1.507の9bpの欠損を有する。こ
れらの欠失は、５′スプライス部位と相同な配列を有す
る領域に生じたが、このような欠失はmRNAに於けるスプ
ライシングエラーを意味するのかもしれない。クローン
T49.1およびT55.1は読みとり枠フレームのヌクレオチド
147と148の間に110bpの挿入を有する（第３図）。この
配列は、扁桃腺ポリ（Ａ）+RNAのブロットに対してハイ
ブリッド形成しなかったこと、５′スプライス部位を有
すること（Breat hnach,R.ら、1978,Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A.75:4853）（第３図）、CR1ゲノムクローンに於
てcDNA配列に隣接すること、およびその読み枠がシフト
していることから、イントロンの一部分であると判定さ
れる。クローンT9.4は、扁桃腺ポリ（Ａ）+RNAのブロッ
クに対してハイブリッド形成しない0.88kbの介在配列を
３′末端に有する。
6.2.2.CR1のヌクレオチドおよびアミノ酸配列分析 CR1のヌクレオチド配列のドットマトリクス分析（第
３図）は２タイプの内部相同性を示した（第４図）。第
１のタイプの内部相同性は、太く切れ目のない線で表さ
れ、これは３個の縦列で、同一方向で、相同性の高い1.
35kbの反復を示す。これらのヌクレオチド配列はCR1の
長い相同反復配列（LHR）をコードする。第２のタイプ
の反復は点線の平行線によって表され、これは相同性の
比較的低い領域を示す。このような配列は190−210ヌク
レオチド毎に現われ、CR1の短いコンセンサス反復配列
をコードする。
cDNA配列から推定されるアミノ酸配列を第５図に示
す。LHR−B,LHR−ＣおよびLHR−Ｄと命名された３個のL
HRを並べてそれらの相同性を明示する。LHR−Ｂは残基
１から残基438までであり、LHR−Ｃは残基439−891に相
当し、LHR−Ｄは残基892から1,341におよぶ。LHR−Ｃの
451−694残基は、LHR−Ｂの残基１−244と99％同一であ
るが、LHR−Ｄの対応する残基とはわずかに61％同一で
ある。対照的に、LHR−Ｃの残基695−891はLHR−Ｄの残
基1,148−1,341と91％同一であるが、LHR−Ｂの対応す
る領域とはわずかに76％同一である。したがってLHR−
Ｃは、LHR−Ｂの前半およびLHR−Ｄの後半にきわめて相
同な配列を含んでなるハイブリッドであると思われる。
LHRに続いて反復のない二つのSCRがあり、25残基の疎水
性セグメントおよびそのSCRに対して配列相同性を持た
ない43アミノ酸のCOOH−末端領域である（第５図）。
５′1.3kbのCR1コード配列は第４のLHR,LHR−Ａに相
当する（上記第１図および下記第７項参照）。この結論
は、赤血球CR1のトリプシンペプチドの分析によって支
持された。10個のトリプシンペプチドはcDNAクローン由
来のアミノ酸配列と同一の配列を有する（第Ｉ表）。
各LHRは７個の60−70アミノ酸SCRを含んでなり、これ
らのSCRはC3およびC4結合タンパク質（C4bp）群を特徴
付ける（第6A図）。CR1の23のSCR間の最大の相同性は、
整列にスペースを導入することによって観察された（第
6A図）。各反復配列に於ける平均65残基のうち29が保存
されている。すべてのSCRに存在する６個の残基があ
る。４個の1/2シスチン（これらは比較的類似した位置
にあり、このことはこれらの各々が不可欠なジスルフィ
ド結合に関係する可能性を示唆する）。およびトリプト
ファン、および第２の1/2シスチンの後の第２のグリシ
ン（第6A図）。変化しない1/2シスチンの間の配列をCho
uおよびFasmanの算法（Chou,P.Y.およびFasman,G.D.,19
74,Biochemistry13:222）を用いて二次構造分析するこ
とによって、β−ターン形成の可能性が高く、α−ヘリ
ックス形成の可能性は低いことが予想された。二つのCR
1ゲノムクローン、2.38（第6B図）および2.46の配列分
析は、SCR−14（第6A図）が単一のエキソンによってコ
ードされること、およびSCR−23のCOOH−末端がエキソ
ンの末端に対応することを示す。したがって、ファクタ
ーＢ（Campbell,R.D.およびBentley,D.R.,1985,immuno
l.Rev.87:19）やIL−２−Ｒ（Leonard,W.J.ら、1985,Sc
ience230:633）のSCRについて示されたように別々のエ
キソンがCR1のSCRをコードする可能性がある。
CR1のSCRのコンセンサス配列をこのような特徴的構造
を有する一群の別のメンバーのSCRと比較する（第７
図）。これらのメンバーはC3/C4結合機能を有するタン
パク質、すなわちCR2（Weis,J.J.ら、1986,Proc.Natl.A
cad.Sci.U.S.A.83:5639）、C4bp（Chung,L.P.ら、1985,
Biochem,J.230:133）、ファクターＨ（Kristensen,T.
ら、1986,J.Immunol.136:3407）、ファクターＢ（Morle
y,B.J.およびCampbell,R.D.,1984,EMBO J.3:153;Mole,
J.E.ら、1984,J.Biol.Chem.259:3407）、およびC2（Ben
tley,D.R.およびPorter,R.R.,1984,Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A.81:1212;Gagnon,J.,1984,Philos.Trans.R.Soc.
Lond.B.Biol.Sci.306:301）のみならず、例えばインタ
ーロイキン−２レセプター（Leonard W.J.ら、1985,Sci
ence230:633）、β２−糖タンパク質Ｉ（Lozier,J.ら、
1984,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:3640）、Clr（Leyt
us,S.P.ら、1986,Bioc hemistry25:4855）、ハプトグロ
ビンα鎖（Kurosky,A.ら、1980,Proc.Natl.Acad.Sci.U.
S.A.77:3388）および第XIII b因子（Ichinose,A.ら、19
86,Biochemistry25:4633）のような、このような機能を
有することが知られていないタンパク質をも包含する。
1/2シスチン残基はすべてのタンパク質のSCRに於て不変
であるが、例外は第３の1/2シスチンを欠くハプトグロ
ビンである。トリプトファンも不変であるが、β２−糖
タンパク質Ｉの５番目のSCRおよび第XIII b因子に存在
する反復のうちの２個が例外である。保存されているが
すべてのSCRに存在するわけではない他の残基は、1/2シ
スチンのまわりでクラスターを形成する傾向がある。フ
ァクターＢおよびC2に一つだけ遊離のチオール基があり
（Christie,D.L.およびGagnon,J.,1982,Biochem.J.201:
555;Parkes,C.ら、1983,Biochem.J.213:201）、β２−
糖タンパク質ＩのSCRでは１番目の1/2シスチンが３番目
と、２番目が４番目とジスルフィド結合している（Lozi
er,J.ら、1984,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:3640）。
得られたCR1のアミノ酸配列には、Ｎ−結合オリゴ糖
となる可能性のなる部位が17個あり、そのすべてが細胞
外領域にある（第６図Ａ）。ツニカマイシン存在下およ
び非存在下で合成されたCR1分子量の相違（Lublin,D.M.
ら、1986,J.Biol.Chem.261:5736）とグルコサミン含有
量の分析（Sim,R.B.,1985,Biochem.J.232:883）は、わ
ずかに６−８個のＮ−結合複合オリゴ糖の存在を示唆
し、可能性のある部位のすべてが利用されるわけではな
いことを示す。例えば、得られたアミノ酸配列（第５
図）の残基263のアスパラギンは、ペプチド41c（第Ｉ
表）で同定されたが、このことはこの部位にグリコシル
化のないことを示す。対照的に、ペプチド34bの未同定
のアミノ酸は、おそらく残基395のグリコシル化された
アスパラギンに相当する。
5.5kbのcDNAで同定された繰り返しのないCR1配列だけ
が、COOH−末端領域に存在する。この領域の二次構造分
析によって、単一の25残基からなる推定の膜−結合セグ
メントが同定される。このセグメントは強い疎水的性質
を有し、α−ヘリックスを形成する可能性が非常に強い
（第５図）。この配列に続いてすぐに多くの膜タンパク
質に特有の性質である４個のプラスに荷電した残基があ
る。CR1の推定細胞質領域は43残基を有してなり、６ア
ミノ酸からなる配列、VHPRTL、を含有する。この配列は
表皮成長因子（EGF）レセプターおよびerbBガン遺伝子
産物におけるプロテインキナーゼＣリン酸化部位、VRKR
TL、と相同である（Hunter,T.ら、19845,Nature311:48
0;Davis,R.J.およびCzech,M.P.,1984,Proc.Natl.Acad.S
ci.U.S.A.82:1974）。扁桃腺CR1の細胞質領域にはチロ
シン残基は存在しない。
6.3考察 CR1のＦアロタイプの一次構造の約80％が、重なりあ
ったcDNAクローンの配列決定により得られた。この分析
で観察されたCR1のもっとも他と異なる構造上の特徴
は、縦列で、同方向の、450アミノ酸からなるLHRの存在
であり、４個のLHRが2,000残基の推定ポリペプチド鎖長
を有するCR1のＦアロタイプに存在すると予想される（W
ong,W.W.ら、1983,J.Clin.Invest.72:685;Sim,R.B.,198
5,Biochem.J.232:883）。３個のLHRがクローニングさ
れ、配列決定された一方で、第４のLHRの存在に関する
証拠がトリプシンペプチドの分析によって与えられた。
各LHRは、他のC3/C4結合タンパク質の基本的な構造単位
である７個のSCRで構成される。SCR当りの４個の1/2シ
スチンの保存、第１と第３の、および第２と第４の1/2
シスチンがジスルフィド結合におそらく関与すること
（Lozier,J.ら、1984,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:36
40）、そしてβ−ターンによくみられるプロリン、グリ
シン、およびアスパラギンのような保存されたアミノ酸
の存在（Rose,G.D.ら、1985,ADv.Protein Chem.37:1）
は、SCRがジスルフィド結合によって維持される三重ル
ープ構造を形成するという提案に至る（第８図）。1/2
シスチンに関するこのような役割は、穏やかな条件でト
リプシン処理したCR1（Sim,R.B.,1985,Biochem.J.232:8
83）およびファクターＨ（Sim,R.B.およびDiScipio,R.
G.,1982,Biochem.J.205:285）が非還元条件下でSDS−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）で分析したとき
には未処理の分子と同様の移動し、還元後は多数のトリ
プシン断片と同様に移動するという発見により支持され
る。
このような一連の縦列に反復されるSCRsは、ファクタ
ーＨについて、およびヒトC4bpの各サブユニットについ
て提出された延長構造（第８図）を形成することが予想
される（Sim,R.B.およびDiScipiD,R.G.,1982,Biochem,
J.205:285;Whaley,K.およびRuddy,S.,1976,J.Exp.Med.1
44:1147;Daahlback,B.ら、1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.
S.A.80:3461）。C4bpのサブユニットの電子顕微鏡によ
る研究は、300×30オングストロームの大きさであるこ
とを示した（Dahlback,B.ら、1983,Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A.80:3461）。各サブユニットは８個のSCRから構
成される（Chung,L.P.ら、1985,Biochem.J.230:133）の
で、１個のSCRは38×30オンストロームであると算出さ
れる。CR1のSCRが同様の大きさを有することおよびＦア
ロタイプが30個のSCRを有することを考えるとレセプタ
ーは細胞膜から1,140オングストロームほど伸びること
ができるであろう。好中球上でCR1と結合したフェリチ
ン−標識抗体がしばしば原形質膜の外葉から500オング
ストロームであった（Abrahamson,D.R.およびFearon,D.
T.1983,Lab.Invest.48:162）という初期の発現はこのよ
うなCR1構造の予想と矛盾しない。このようなCR1の延長
構造は、レセプターを担う細胞と、免疫複合体内の比較
的到達しにくい部位や微生物細胞表面に共有結合したC3
bとの相互作用を容易にするであろう。
SCRが主要なそしておそらく唯一のCR1の細胞質外要素
であるという発見は、もっぱらSCRだけで、またはおも
にSCRで構成される二つの血漿タンパク質であるファク
ターＨおよびC4bpとレセプターとの間の密接な関係につ
いて構造的な証拠を与える（Chung,L.P.ら、1985,Bioch
em.J.230:133;Kristensen,T.ら、1986,J.Immunol.136:3
407）。CR1は最初にファクターＨ様活性を有する赤血球
膜タンパク質として界面活性剤可溶化後に単離され（Fe
aron,D.T.,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76:586
7）、その後原形質膜上に存在するときはファクターＨ
およびC4bpの調節機能を有することが明らかになった
（Iida,K.およびNussenzweig,V.,1981,J.Exp.Med.153:1
138）。CR1、ファクターＨ、およびC4bpの構造的多型性
の遺伝子を分析することによって、これら３つのタンパ
ク質をコードする遺伝子が連なっていることが示され
（de Cordoba,R.ら、1985,J.Exp.Med.161:1189）、この
連鎖群の、および構造的に関係のあるレセプター、CR
2、の遺伝子座が、生体内原位置ハイブリッド形成によ
り、また体細胞ハイブリッドの分析により、第一染色体
の長腕、バンドq32上にあることが示されている（Weis,
J.H.ら、1987,J.Immunol.138:312）。本研究以前に、こ
れらのタンパク質間の構造的な関連性についての唯一の
証拠は、それらのアミノ酸組成の有意な類似であった
（Wong,W.W.ら、1985,J.Immunol.Methods82:303）。し
たがって、このようなCR1における少なくとも23のSCRの
発見は、レセプターと、同様の機能を持つタンパク質で
あるファクターＨおよびC4bpとの構造的な関係（Chung,
L.P.ら、1985,Biochem.J.230:133;Kristensen,T.ら、19
86,J.Immunol.136:3407）、そしてそれぞれC3bおよび4C
bと酵素複合体を形成する構成要素であるファクターＢ
およびC2のBaおよび2Cbフラグメントとの構造的な関係
（Morley,B.J.およびCampbell,R.D.,1984,EMBO J.3:15
3;Mole,J.E.ら、1984,J.Biol.Chem.259:3407;Bentley,
D.R.およびPorter,R.R.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A.81:1212;Gagnon,J.,1984,Philos.Trans.R.Soc.Lond.
B.Bio.Sci.306:301）を直後、きちんと明示するもので
ある。しかしながら、SCRはいくつかの補体以外のタン
パク質にも発見されており（Campbell,R.D.およびBentl
ey,D.R.,1985,Immunol.Rev.87:19;Lozier,J.ら、1984,P
roc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:3640;Leytus,S.P.ら、198
6,Biochemistry25:4855;Kurosky,A.ら、1980,Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.77:3388;Ichinose,A.ら、1986,Bio−
chemistry25:4633）（第７図）それが必ずしもC3/C4結
合構造を表していないことを示す。
SCRを有するタンパク質の中で、CR1は、この基体構造
および遺伝ユニットをLHRの高次構造ユニット中に編成
した点で独特である。Ｓアロタイプの発現に関連するゲ
ノムDNAの14.5kb BamH Iフラグメントの分析は、CR1に
おける少なくとも一つの反復するゲノムユニットが、少
なくとも５個のSCRとそれらのフランキングイントロン
をコードするエキソンを含有するDNAの延長セグメント
であることを示唆した（Wong,W.W.ら、1986,J.Exp.Med.
164:1531）。これらの研究はまた、Ｆ対立遺伝子に存在
する数と比較して、Ｓ対立遺伝子がこのゲノムユニット
の付加的コピーを含有することを示唆した。この観察
を、トリプシンペプチドマッピング研究（Nickells,M.
W.ら、1986,Mol.Immunol.23:661）およびLHRが−40−50
kDのペプチドに相当するというここでの発見と組み合わ
せることによって、われわれはＳアロタイプ（290kD）
に付加的なLHRが存在することを、Ｆアロタイプ（250,0
00ダルトン分子量）の４個のLHRの推定値と比較して、
予想することができる。
重複現象に関する証拠を提供することに加えて、LHR
の配列はまた、CR1遺伝子内で変換現象が起こったこと
を示唆する。LHR−Ｂおよび−Ｄは、相互の全長にわた
って67％同一であるが、これにたいしてLHR−ＣはLHR−
ＢとNH2−末端4SCRに於て99％同一であり、LHR−ＤとCO
OH−末端3SCRに於て91％同一である。このような機構
は、このハイブリッドプラスミドの起源に於て同一の親
対立遺伝子の間で一回組換えが起きただけでは生じなか
ったであろう。むしろハイブリッドLHRは、LHR−Ｃ前駆
体にある配列がLHR−ＢまたはLHR−Ｄに存在する配列に
よって置き換えられるような遺伝子変換によって生じた
可能性がある（Atchison,M.およびAdesnik,M.,1986,Pro
c.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83:2300）。また、これらのLHR
におけるほとんど完全な同一性および相同配列の正確な
配列（第５図）は、遺伝子変換を含む機構によって維持
されたのかもしれない。LHRをコードするCR1遺伝子セグ
メントの介在配列間の相同性の程度の分析は、遺伝子変
換が機能的制約に基づく選択のどちらが配列分岐を厳密
に限定したかを決定するはずである。
以前の研究がCR1が一価であることを示唆した（Wilso
n,I.G.ら、1982,N.Engl.J.Med.307:981）が、各々のLHR
は単一のC3b/C4b結合ドメインに相当し、それによって
レセプターば多価となり、そして多数のC3bおよびC4b分
子を担う複合体の結合に適応される。あるいはまた、異
なるLHRがそれぞれC3bおよびC4bの結合に対応し（下記
第９項参照）、CR1に於けるファクターＨおよびC4bp活
性の組合せに関する構造的な基礎を与える。最後に、CR
1のLHRは、提出された構造モデル（第８図）によって示
唆されるようにCR1を原形質膜から伸長させるのに有用
な構造ドメインに相当する可能性があり、NH2−末端領
域のSCRはファクターＨについて見いだされたようにC3b
およびC4bと結合する（Sim,R.B.およびDiScipio,R.G.,1
982,Biochem.J.205:285;Alsenz,J.ら、1984,Biochem.J.
224:389）。ホルボールエステルによるプロテインキナ
ーゼＣの活性化は、好中球、単球、および好酸球におい
てCR1のリン酸化を誘導し（Changelian,P.S.およびFear
on,D.T.,1986,J.Exp.Med.163:101）、43アミノ酸からな
るCR1細胞質ドメインは、上皮成長因子においてプロテ
インキナーゼＣによってリン酸化される部位と相同な配
列を有する（Hunger,T.ら、1984,Nature311:480;Davis,
R.J.およびCzech,M.P.,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A.82:1974）。しかしながら、この細胞質の配列は扁桃
腺ライブラリーの三つの独立したクローンに於て見いだ
されたが、それはＢ細胞CR1のものである可能性が最も
高く、このCR1はプロテインキナーゼＣによる活性化の
後にリン酸化されない（Changelian,P.S.およびFearon,
D.T.,1986,J.Exp.Med.163:101）。
7.実施例:CR1 5′cDNA配列は第４の長く相同な反復を含
有する CR1の部分的なcDNA配列の分析により、450アミノ酸か
らなる三つのLHR,LHR−B,LHR−C,LHR−Ｄを含み、その
各々がC3/C4結合タンパク質に特徴的な65アミノ酸から
なる７個の短いコンセンサス反復（SCR）を含んでなる
構造が明らかになった（上記第６図参照）。ここで述べ
る実施例に於て、本発明者らは５′cDNAクローンの配列
決定によって第４のアミノ末端LHR,LHR−Ａ（Klickstei
n,L.B.ら、1987,Complement4:180）のクローンニングお
よびヌクレオチド配列を説明する。LHR−Ａの分析によ
り、５個の３′SCRに於てLHR−ＡはLHR−Ｂに99％相同
であるうが、２個の５′SCRにおいては61％しか相同で
ないことが明らかになった。
7.1.材料および方法 7.1.1.cDNAライブラリーの構築 記載 （CHirgwin,J.M.ら、1979,Biochemistry18:5290;
Aviv,H.およびLeder,P.,1972,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A.69:1408;Ausubel,F.M.ら、1987,Current Protocols i
n Molecular Biolgy,John Wiley ＆ Sons,New York）に
従い、以下の改変を加えて、選択的にプライマーを用い
たcDNAライブラリー、λHH、をDMSO誘導細胞から精製し
た３μｇのポリ（Ａ）+RNAから構築した。LK35.1、35−
マーオリゴヌクレオチド、５′−TGAAGTCATC ACAGGATTT
C ACTTCACATG TGGGG−３′をオリゴ（dT）12-18の代わ
りに用い、40μCiのα32P−dCTPを第二のストランド合
成の間に添加した。cDNAの３分の１がλgtllにクローニ
ングされ、cDNAライブラリーが上記6.1.2項に従ってヒ
ト扁桃腺ポリ（Ａ）+RNAから構築された。750,000個の
相互に無関係な組換え体が得られた。
7.1.2.クローンの単離、プローブ、およびDNA配列分析 cDNAライブラリーをスクリーニングするために用いら
れたプローブは、CR−１（Wong,W.W.ら、1985,Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.82:7711）（ATCC番号57331）、CR−
２（Wong.W.W.ら、上記）、CR1−４（Wong,W.W.ら、198
6,J.Exp.Med.164:1531）、および第１図でヌクレオチド
101−352に相当するcDNAクローンλH3.1の0.5kb EcoR I
フラグメント由来の252bp Sau3A−フラグメントであるC
R1−18であった。高緊縮条件下で、CR1−18はLFR−Ａの
NH2−末端SCRまたはシグナルペプチドのいずれかをコー
ドしたcDNAにに対してのみハイブリッド形成する。cDNA
クローンのインサートを、フラグメントのM13mp18およ
びM13mp19へのサブクローニングの後（Yanisch−Perro
n,C.ら、1985,Gene28:351）、ジデオキシヌクレオチド
法（Sanger,F.ら、1977,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72:
5463）によって配列決定した。
7.2.結果 7.5×105の組換え体を含有する特異的なプライマーを
用いたλgtll cDNAライブラリーを、DMSO誘導HL−60細
胞由来のポリ（Ａ）+RNAから合成されたcDNAを用いて調
製した。これらの細胞はCR1のＦアロタイプのみを発現
するが（Lublin,D.M.ら、1986,J.Biol.Chem.261:573
6）、これらは４個のLHRを有すると予想される（Lapat
a,M.A.ら、1984,Nucl.Acids.Res.12:5707）。プライマ
ー、LK35.1は第３図に示すCR1の部分的なcDNA配列のヌ
クレオチド896−930に相当するアンチセンス35−マーで
あった。このオリゴヌクレオチドが逆転写条件下でLHR
−B,LHR−ＣおよびLHR−Ｄとハイブリッド形成すること
が示された。CR1 cDNAプローブ、CR1−１およびCR1−４
の混合物を用いてスクリーニングされた3.8×106個の増
幅していない組換えファージの平板に於て、250個の陽
性コロニーが同定された。38個の陽性クローンを取りあ
げてプラーク精製した。これらのクローン由来のEcoR I
消化DNAのサザンブロットを、23−マーオリゴヌクレオ
チド、KS23.1、５′−CTGAGCGTAC CCAAAGGGAC AAG−
３′を用いてスクリーニングした。このオリゴヌクレオ
チドは第３図の部分的なCR1 cDNA配列のヌクレオチド76
3−785に相当する。このプローブは高度に緊縮な条件下
で、LHR−Ｂをコードする配列に於て一つの部位でハイ
ブリッド形成するが、LHR−ＣまたはLHR−Ｄをコードす
る配列ではハイブリッド形成しない。クローンのλH7.4
（第９図）の挿入物は、1.0kb、0.9kbおよび0.4kbの３
個のEcoR Iフラグメント、および２個のそれよい大き
い、KS23.1とハイブリッド形成するフラグメントを含有
したが、このことはこのクローンが３′側5/7のLHR−Ａ
およびすべてのLHR−Ｂのコード配列を含有することを
示す。この発見は、LHR−Ａが、LHR−Ｂに対してきわめ
て相同であることを確証した。クローンλH3.1（第９
図）は、1.0kbの単位のKS23.1を有するEcoR Iフラグメ
ントおよび高緊縮下でCR1−４と弱くハイブリッド形成
する0.5kbフラグメントを含有した。このクローンはLHR
−Ａを完成し、SCR−１および−２と0.1kbの上流配列を
包含する追加の５′配列を含有すると考えられる。残っ
た36クローンのうち一つも、それらのすべてがCR1−１
とはハイブリッド形成したが、プローブ、CR1−18で検
出されなかった。このプローブはLHR−B,−C,または−
Ｄをコードして配列とハイブリッド形成しないクローン
λH3.1の0.5kb EcoR Iフラグメント由来の252bp Sau3A
Iフラグメントである。
λH3.1のDNA配列分析は、オーブンリーディングフレ
ームがcDNAの５′末端まで続くことを明らかにし、この
ことはそのクローンが翻訳開始部位まで達しなかったこ
とを示す。したがって、cDNAライブラリー、λHHおよび
λS2TをプローブCR1−18を用いて再度スクリーニング
し、各々から一クローンずつ、それぞれλH10.3および
λT109.1を同定した。CR1−18とハイブリッド形成する
これらのクローンのEcoR Iフラグメントを、そのクロー
ン由来の挿入物、λH3.1およびλH7.1と同様に配列決定
した。合成した配列を第１図に示すが、第１図のヌクレ
オチド番号1531は第３図のヌクレオチド＃１である。HL
−60および扁桃腺ライブラリー由来のcDNAクローンの重
なりあう配列は同一である。
LHR−Ａのすぐ上流に、クローンλT10,3およびλH10
9.1は、同一の推定疎水性リーダー配列（Vin Heijne,
G.,1986,Nucl.Acids Res.14:4683）を含有するが、この
配列は41アミノ酸をコードし、真核翻訳開始部位に関し
て提出された共通配列NNA/GNNATGGに適合するATGを包含
する（第10図）（Kozak,M.,1986,Cell44:283）。その選
ばれたATGの６コドン上流、そしてインフレーム終止コ
ドンのすぐ下流に存在する第２のATGは、このコンサン
サス配列にあまり当てはまらない。CR1のようなリーダ
ー配列の最初の三つのアミノ酸、MGAは、CR2について報
告されているのと同じである。これら二つのクローンの
その配列はATGの上流で分かれ、λ10.3クローン由来の
それは、上記第６項で他のCR1 cDNAクローンについて記
載されたように、介在配列の一部に相当すると考えられ
る。
シグナルペプチド切断がグリシン−46およびグルタミ
ン−47の間で起こることが予想され（Von Heij）ne,G.,
1986,Nucl,Acids Res.14:4683）、このことはCR−１の
ブロックされたNH2−末端（Wong,W.W.ら、1985,J.Immun
ol.Methods82:303;Holeis,V.M.ら、1986,Complement3:6
3）のために、ピロリドンアミドが存在するのかもしれ
ないことを示唆する。これらのクローンに含まれるNH2
−末端LHR−Ａの最初の二つのSCRは、LHR−Ｂの対応す
る領域に対して61％しか同一でなく、一方LHR−ＡのSCR
3−７はLHR−Ｂの対応SCRに99％同一である（第10
図）。LHR−ＡのLHR−Ｃとの比較により、各々の第３と
第４のSCRのみが相同性が高い（99％同一）ことが明ら
かである。LHR−Ａおよび−Ｄは、全体ではわずかに68
％の同一性を有するのみだが、各LHRの第6SCR間では最
大の81％の同一性を有する。したがって、CR1の５′cDN
A配列の完成は、Ｆアロタイプが2039アミノ酸を含んで
なり、41アミノ酸のシグナルペプチド、それぞれ７個の
SCRからなる４個のLHR、二つのCOOH−末端SCR、25残基
の膜貫通領域および43アミノ酸細胞質ドメインを包含す
る。25個の可能性のあるＮ−結合グリコシル化部位が存
在する。
7.3.考察 CR1のＦアロタイプのNH2−末端およびシグナルペプチ
ドの一次構造は、５′cDNAクローンの単離および配列決
定によって推定された。CR1配列の高い反復性の性質の
ために、レセプターのこの領域をコードするcDNAクロー
ンの調製および同定のための適当な方法を開発すること
は不可欠になった。逆転写の条件下でLHR−B,−Ｃおよ
び−Ｄとハイブリッド形成することが知られている35−
マーオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてcDNA
ライブラリーを調製した。このプライマーが、LHR−Ｂ
と非常に相同であると予想されたLHR−Ａともハイブリ
ッド形成する可能性が考えられた（上記第６項参照）。
別のオリゴヌクレオチドKS23.1を用いて適当なcDNAクロ
ーンを同定したが、このKS23.1は緊縮条件下でLHR−Ｂ
とのみハイブリッド形成し、そのことにより５′cDNAク
ローン発見の確率を増加させる。ほとんどすべてのCR1
の残基の配列を包含する二つのクローンを発見し、この
内の一つのSau3A Iフラグメント、CR1−18は残りの５ク
ローンの同定にそれを用いるのに十分ユニークな配列を
有した（第9,10図）。
LHR−Ａの５′領域由来の250bpプローブは、7.9およ
び9.2kbのCR1転写物のみならず、緊縮条件下でヒト扁桃
腺RNAに於ける2kb転写物ともハイブリッド形成した。こ
のようなクロス−ハイブリッド形成mRNAは、他のLHR由
来のCR1 cDNAプローブでは、またはジメチルスルホキシ
ド誘導体LH−60細胞およびHSB−2 Tリンパ芽球細胞由来
のRNAのノーザンプロットに於いては、観察されなかっ
た。したがって、CR1はさらに二つのＢ細胞タンパク
質、一つはこの新たな認識されたmRNAによってコードさ
れ、もう一つはCR2である、に相同な配列を含有する。
8.実施例：組換えヒトCR1の発現 上記のように7.0kbにおよぶヒトCR1 cDNAクローンが
単離され、それは2039アミノ酸をコードする読みとり枠
を有する（第１図）。提案されたレセプターの前駆体型
は、41アミノ酸のシグナルペプチド、450アミノ酸から
なる４個の長く相同な反復（LHR）（各LHRは７個の短い
コンセンサス反復（SCR）を含んでなる）、65アミノ酸
からなる二つのCOOH−末端SCR、25アミノ酸膜貫通ドメ
イン、および43アミノ酸細胞質領域を包含する。したが
って、CR1 Fアロタイプは30SCRを含有する。NH2−末端L
HR、LHR−Ａ（上記第７項参照）は、最初の二つのSCRに
於いてLHR−Ｂの対応する領域に対して61％同一であ
り、COOH−末端の5SCRでは99％同一である。８個のCR1
cDNAクローンの制限フラグメントをスプライスして6.9k
bの全長構築物を作成し、マウスメタロチオネインプロ
モーターまたはサイトロメガロウイルスプロモーターの
下流に置き、Ｌ（マウス）細胞またはCOS（サル）細胞
にトランスフェクションさせた。組換え細胞表面CR1を
間接的なラジオイノムアッセイおよび免疫蛍光法により
検出した。親ベクター（CR1-）だけでトランスフェクシ
ョンした細胞には抗原は検出されなかった。トランスフ
ェクションし、表面125I−標識したCOS（サル）細胞の
抗CR1モノクローナル抗体による免疫沈降反応、および
非還元ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリアクリルア
ミノゲル電気泳動による分析は、ヒト赤血球由来のＦア
ロタイプとともに移動する分子量190,000ダルトンのバ
ンドを生じた。正確な分子量の組換えCR1抗原の発現（K
lickstein,L.B.ら、1988,FASEB J.2:A18 33）は、そのc
DNAがヒトCR1の完全なコード配列を含有することを証明
する。
8.1.完全なCR1コード配列を含有するプラスミドpBSABCD
の構築 ここで、全長の（SCR1−30）CR1タンパク質をコード
するベクター、プラスミドpBSABCOの構築について説明
する。
cDNAクローンλT8.2由来の2.3kb挿入物（Klic−kstei
n,L.Bら、1987,J.Exp.Med.165:1095;上記第６項参照）
をEcoR IフラグメントとしてpUC18にサブクローニング
し、その結果５′末端はプラスミドポリリンカーに於て
Hind IIIに近接した。このプラスミドをp188.2と命名し
た。p188.2をApa IおよびHind IIIで切断し、SCR26から
３′非翻訳領域までのCR1配列およびベクター配列を含
有する大きな4.7kbフラグメントをゲル精製した。
cDNAλT50.1由来の挿入物（klickstein,L.B.ら、198
7,J.Exp.Med.165:1095,上記第６項参照）をEcoR Iフラ
グメントとしてM13mp18にサブクローニングした。この
ファージを18R50.1と称した。このクローンの複製型に
由来するDNAをApa IおよびHind IIIで切断し、CR1 SCR1
8−25を含有する1.45kbフラグメントを単離し、p188.2
由来の4.7kbフラグメントに結合し、その結合をE.コリD
H5αに形質転換した。このプラスミドをp8,250.1と称し
た。
cDNAクローンλT8.3由来の0.75kbおよび0.93kb EcoR
Iフラグメント（Wong,W.W.ら、1985,Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A.22:7711）をプラスミドpBR327にサブクローニ
ングした。これらのサブクローンをそれぞれpCR1−１お
よびpCR1−２と呼び、これらはそれぞれSCR11−14およ
びSCR17−21を含有した。EcoR I挿入物を各々から精製
した0.75kbのpCR1−１フラグメントをSma Iで消化し、
その消化物をEcoR IおよびSma Iで切断したpUC18DNAに
結合した。SCR12−14に対応する0.5kb挿入物を有するサ
ブクローンの一つ、p181−1.1を単離した。
pCR1−２の0.93kbフラグメントをHind IIIで消化し、
EcoR IおよびHind IIIで切断したpUC19に結合し、SCR17
を含有する0.27kbインサートを有するサブクローンの一
つ、p191−2.1を単離した。
cDNAクローンλ6.1（上記第６項参照;Klickstein,L.
B.ら、1987,J.Exp.Med.165:1095;Wong,W.W.ら、1987,J.
Exp.Med.164:1531）をEcoR Iで消化し、CR1のSCR15およ
び16に相当する0.37kbフラグメントをpBR322にサブクロ
ーニングした。このクローンをpCR1−４と名付けた。ク
ローンp181−1.1をEcoR IおよびSca Iで切断し、1.4kb
フラグメントを単離した。クローンp191−2.1（Klickst
ein,L.B.ら、1987,J.Exp.Med.165:1095;上記第６項参
照）をEcoR IおよびSca Iで消化し、2.0kbフラグメント
を単離し、p181−1.1由来し1.4kbフラグメントに結合
し、その混合物をE.コリDH5αに形質転換した。結果と
して得られたプラスミドをp1−11−２と名付けた。プラ
スミドp1−11−２をEcoR Iで消化し、pCR1−４由来の0.
37kb挿入物フラグメントを連結によって挿入した。その
結果生じたプラスミドをE.コリDH5αの形質転換に用い
た。
0.39kb BamH I−Hind IIIフラグメントを含有するサ
ブクローンを選択した。このプラスミドをp142と称し、
これはCR1 SCR12−17を含有した。p8.250.1由来の3.5kb
EcoR I−Hind III挿入物フラグメントをpGEM3bに移し
た。このプラスミドをpG8.250.1と命名した。p142由来
の1.2Hind IIIフラグメントを精製し、Hind IIIで予め
切断したpG8.250.1に結合した。2.4kbのPst I−Apa I挿
入物を含有するサブクローンを選択し、したがって正し
い方向を選択した。このプラスミドをpCDと呼び、これ
はSCR12から３′末端までのCR1配列を含有した。cDNAク
ローンλ５′7.1（Klickstein,L.B.ら、1987,Complemen
t4:180;上記第７項参照）をPst Iで切断し、SCR6−12に
相当する1.35kbフラグメントを単離し、Pst I−切断pCD
に結合した。その混合物を形質転換し、1.35kbおよび1.
1kb Hind IIIフラグメントを含有するサブクローンを選
択した。
cDNAクローンλ５′3.1（Klickstein,L.B.ら、1987,C
omplement4:180;上記第７項参照）をEcoR Iで切断し、
その消化物をEcoR I−切断pUC18に結合した。サブクロ
ーン、p3.11−１を単離し、これはSCR3−７に相当する
1.0kb挿入物を含有するが、この挿入物をゲル精製し
た。cDNAクローンλ５′10.3（Klickstein,L.B.ら、198
7,Complement4:180;上記第７項参照）をEcoR Iで切断
し、SCR1および２を含有する0.63kb挿入物をpUC18にサ
ブクローニングした。このクローンをp10.3.5と命名し
た。プラスミドp10.3.5をEcoR Iで部分消化し、線状プ
ラスミドに相当する3.4kbフラグメントを単離し、p3.11
−１由来の1kbフラグメントに結合した。サブクローンp
LAを取あげたが、これは1.3kb Pst Iフラグメントを挿
入および方向の正しい部位に含有した。
cDNAクローンλT109.4（Klickstein,L.B.ら、1987,Co
mplement4:180;上記第７項参照）をEcoR Iで消化し、pU
C18にサブクローニングした。リーダー配列およびSCR1
および２を通じて５′非翻訳領域に相当する0.55kb Eco
R Iフラグメントを含有するサブクローンを選択した。
プラスミドp109.4をPst IおよびPspM IIで切断し、ベク
ター、リーダー配列、およびSCR1を含有する3.0kbフラ
グメントを単離した。そのフラグメントを、SCR2−５を
含有するpLA由来の0.81kb Pst I−BspM IIフラグメント
に結合した。この新たなプラスミドをpNLAと命名した。
プラスミドpNLAをEcoR Iで部分消化して、Pst Iで完全
消化し、リーダー配列からSCR5に通じるCR1配列を含有
する1.1kb EcoR I−Pst Iフラグメントを単離し、pBlue
script KS＋（Stratagene San Diego,CA）に結合し、cD
NAの５′部位にXho I部位を置いた。このプラスミドをp
XLAと称す。
プラスミドpBCDをEcoR Vで切断し、次にPst Iで部分
消化し、SCR6から３′非翻訳領域にいたるCR1配列を含
有する6.0kb Pst I−EcoR Vフラグメントを単離し、Pst
I＋Sma I−消化pXLAに結合した。その結果生じた細菌
発現プラスミドは、完全なCR1 cDNAコード配列を含有
し、pBSABCDと命名した。
8.2.完全なCR1コード配列を含有する哺乳動物発現ベク
タープラスミドpiABCDの構築およびアッセイ プラスミドpBSABCDをXho IおよびNot Iで消化し、そ
の挿入物を、やはりこれらの制限酵素で予め切断した発
現ベクターCDM8（Seed,B.,1987,Nature329:840−842）
の4.4kbフラグメントに於てCMVプロモーターから下流に
結合した。得られた構築物をpiABCDと名付けた（第11
図）。あるいはまた、6.9kb Xho I−Not Iフラグメント
を、やはりこれらの制限酵素で予め切断した発現ベクタ
ー、pMT.neolにおいて、メタロチオネインプロモーター
から下流に結合した。得られた構築物をpMTABCDと名付
けた（第11図）。
ウサギ抗体で感作されたヒツジ赤血球（EA）、および
限られた量のC4b［EAC4b（lim）］、および細胞当り12,
000cpmの125I−C3b［EAcC4b（lim）,3b］を、EAC4b（li
m）（Diamedix）をC1、C2および125I−C3で連続的に処
理し、つぎに40mMEDTA含有ゼラチンベロナール−緩衝食
塩水中で、37℃60分間インキュベートすることによって
調製した。あるいはまた、メチルアミン−処理したC3
［C3ma）］を、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン
酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Sigma）で
処理したヒツジＥ（赤血球）を共有結合させた（Lambri
s,J.D.ら、1983,J.Immunol.Methods65:277）。EAC4bを
精製C4を用いて調製した（Hammer,C.H.ら、1981,J.Bio
l.Chem.256:3995）。
piABCDおよびpMTABCDはいずれも、DEAE−ジエチルア
ミノエチル）−デキストラン法によって、COS（サル）
細胞にトランスフェクションされた。抗−CR1モノクロ
ーナル抗体、YZ−１を用いた免疫蛍光反応によって；そ
して125I−標識細胞の免疫沈降反応とその後の非還元SD
S−PAGEによって；そしてC3bでコートされたヒツジ赤血
球でのロゼット形成によって（Fearon,D.T.,1980,J.Ex
p.Med.152:20）、組換えCR1をトランスフェクション細
胞の表面に検出した。このSDS−PAGEは、Ｆアロタイプ
にホモ接合性のドナーのヒト赤血球から免疫沈澱させた
CR1と同一の移動度を有するタンパク質を示した（Wong.
W.W.ら、1983,J.Clin Invest.72:685）。天然型と組換
えCR1の電気泳動移動度が同一であることは、CR1 Fアロ
タイプがSCR1−30を含有することを確認した。
さらに、マウスＬ細胞をDEAE−デキストラン法（Ausu
bol,F.M.ら、1987,Current Protocols in Molecular Bi
ology,Seidman,J.G.およびStruhl.K.編、John Wiley ＆
Sons,New York;Seed,B.,1987,Nature329:840）によっ
て、二通りで、0.2,または４μｇのpiABCDまたはpMTABC
Dのいずれか一方、および成長ホルモンの発現を指示す
るレポータープラスミドである２μｇのpXGH5（Selden,
R.F.ら、1986,Mol.Cell.Biol.6:3173）を用いて、同時
にトランスフェクションした。二日後細胞を集め、YZ1
モノクローナル抗−CR1抗体の結合によってCR1の発現を
アッセイした。組替えプラスミドDNAとCR1抗原の発現の
間には用量応答関係が存在した（第II表）。
プラスミドpiABCDはpMTABCDよりも約３倍多いCR1抗原
の発現を指示した。培地中の成長ホルモン濃度は、プレ
ート５を除けば２倍以下の範囲で変化した。追加実験
は、piABCDがCOS細胞に於て、Ｌ細胞よりも３倍多いCR1
抗原の一過性の発現を指示することを示した。
ZY1抗CR1 mABで染色させた細胞の間接的な免疫蛍光反
応で評価する場合には、CR1はトランスフェクションCOS
細胞表面のクロスターに存在した（第12図）。COS細胞
上の組換えCR1のこのような分析は、野生型CR1のヒト白
血球上での分布に似ている（Fearonら、1981,J.Exp.Me
d.153:1615）。
組換えCR1の分子量を、piABCDを用いてトランスフェ
クションしたCOS細胞の表面ヨウ素化、細胞溶解物とセ
ファロースーYZ1との免疫沈降反応、SDS−PAGEおよびオ
ートラジオグラフィーによって決定した。組換えCR1は
非還元で分子量190,000を有し、これはＦアロタイプと
等しく赤血球CR1のＳアロタイプより小さい（第14
図）。
組換えCR1のC3b結合およびC4b結合機能を、トランス
フェクションCOS細胞とEAC4bまたはEAC4b（lim）,3bと
のロゼット形成によってアッセイした。31の別個のトラ
ンスフェクションに於て、プラスミドpiABCDを用いてト
ランスフェクションされたCOS細胞の５％−50％が、５
個またはそれ以上のEAC4bまたはEAC4b（lim）,3bと結合
した（第13図）。CR1を発現するCOS細胞は、EAC4b（li
m）,3biとロゼット形成しなかった（ただしこの中間体
はCR2を発現するRajiBリンパ芽球細胞とはロゼットを形
成した）。
8.3.CR1フラグメントの発現 CR1コード配列の一部をコードした発現ベクター（欠
失変異体）を下記のように構築し、それらがCOS細胞に
形質転換されたときそれぞれCR1挿入物を発現すること
を見いだした。CR1フラグメントは細胞表面タンパク質
として発現された。
8.3.1.欠失変異体piBCD,piABD,piACD,piAD,piBD,piCDお
よびpiDの構築 このような変異体の構築は、４個のCR1の長く相同を
反復（LHR）の各々のアミノ末端付近に単一のBsm Iサイ
トが存在し、CR1 cDNAおよびBluescriptベクター（Stra
tagene,San Diego,CA）内に他にはBsm I部位が存在しな
いことを利用して行われた。
10マイクログラムのプラスミドpBSABCDを50ユニット
の制限酵素Bsm Iで45分間、部分消化し、その消化物を
アガロースゲル電気泳動によって分画した。それぞれ
１、２または３個のLHRを欠失した親プラスミドの線状
セグメントに対応する8.55kb,7.20kbおよび5.85kbのDNA
プラグメントを精製した。３フラグメントの各々をそれ
自身に結合し、その連結は別々に、コンピテントなE.コ
リDH5αをアンピシリン耐性に形質転換するために用い
られた。
8.55kbフラグメントはpBSABCDを二つの隣接したBsm I
サイトで切断した結果生じた。したがって連結後３種の
産物プラスミド、pBCD,pACDまたはpABDが存在する可能
性がある。ここにおいて、大文字はプラスミドに残った
LHRを表す。これらはSma Iを用いた制限マッピングによ
って区別される。DNAを12コロニーから調製し、Sma Iで
消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。５コロニ
ーは、2.5kbと6.1kbの二つのSma Iフラグメントを有
し、LHR−Ａコード配列の欠失に相当する、したがってp
BCDに当たる。３コロニーは8.5kbの単一の直線フラグメ
ントを有し、pACDに相当する。４コロニーは1.2kbと7.4
kbの二つのSma Iフラグメントを有し、これらはLHR−Ｃ
コード配列の欠失が予想され、pABCを示す。これら３種
の構築物の各々5.6kb挿入物を、Xho IとNot Iで二重に
消化した後、ゲル−精製し、あらかじめ同制限酵素で消
化後ゲル精製した発現ベクターCDM8に結合した。E.コリ
DK1/P3を連結混合物を用いて形質転換し、各々の５コロ
ニーからDNAを調製した。発現ベクター中に欠失したCR1
cDNA挿入物が存在することは、各々の場合に於て、Sac
I消化によって示され、それは4.20kbと5.75kbの予想さ
れた二つのフラグメントを示した。これらのプラスミド
をpiBCD,piACD及びpiABDと命名した。
pBSABCDの部分消化から得られた7.20kbフラグメント
は、三つの隣接部位での、または、同様に大きなフラグ
メントについては、その二つの部位の間に一つの非切断
部位を持つ二部位での、Bsm I消化の結果であり、した
がって、形質転換後に二つの産物、pADおよびpCDが得ら
れる可能性があった。これらはXho IとPst Iを用いた二
重の消化によって区別することができ、この消化によっ
てpADの場合1.0kbと6.2kbの二つのフラグメントが生
じ、pCDについては7.2kbの直線フラグメントが生じる。
これらのプラスミド各々からの4.2kb挿入物をXho IとNo
t Iで二重に消化した後、ゲル−精製し、上記のようにC
DM8にサブクローニングした。発現ベクター中に欠失の
あるCR1 cDNAが存在することは、Pst I及びBgl IIで二
重に消化することによって示された。クローンpiADは2.
4kbと6.2kbのフラグメントを有し、一方piCDは8.6kbの
一つのフラグメントを有した。
pBSABCDのBsm I消化から得られた5.85kbフラグメント
は完全消化産物に相当し、一つのクローンpDはE.コリDH
5αの形質転換後に得られた。これはHind IIIおよびBgl
IIを用いた二重の消化によって確認され、予想された
3.7kbおよび2.2kbのフラグメントを生じた。そのクロー
ンの2.9kb挿入物をXho IとNot Iで二重に消化した後、
ゲル−精製し、上記のように発現ベクターに結合した。
その結果生じたpiDクローンのHind III消化は、予想さ
れた7.3kbフラグメントを生じ、Xho IとBgl IIを用いた
二重の消化は、2.2kbと5.1kbのフラグメントを与えた。
そして、Sac I消化物は予想された1.5kbおよび5.8kbフ
ラグメントを生じた。
pBCDのBsm I部分消化によってプラスミドpBDを調製し
た。二つの隣接するBsm I部位での切断に対応する線状
7.2kbフラグメントをゲル精製し、上記のようにそれ自
身に結合し、E.コリDH5αをアンピシリン耐性に形質転
換した。pBDは、Sma I消化での1.2kbおよび6.0kbフラグ
メントの存在によって同定された。4.2kb挿入物を、Xho
IとNot Iで二重に消化した後、精製し、上記のようにC
DM8に移した。クローンpiBDは、Hind III消化後の予想
された0.8kbおよび7.8kbのフラグメントの観察によって
確認された。
それぞれpiABCD,piBCD,piCD,およびpiD構築物を一過
性に発現するCOS細胞を、125Iで表面標識し、抗−CR1抗
体とともに免疫沈降させた。還元後のSDS−PAGEで、piA
BCD構築物の産物は、CR1のＦアロタイプと同様に移動
し、他方、欠失変異体はそれぞれ1,2,および3LHRの欠失
を示す約45,000ダルトンづつの段階的な減少を示した
（第17図）。
8.3.2.欠失変異体piP1,piE1,piE2,piE−2,piU1,piU−２
およびpiA/Dの構築 プラスミドpiABCDをBstE IIで完全に消化し、1.35kb
（タブレット）および8.6kbの二つのフラグメントをゲ
ル精製し、混合し、結合し、そしてE.コリDK1/P3をアン
ピシリンおよびテトラサイクリン耐性に形質転換した。
CR1 cDNAプローブCR1−４とのハイブリッド形成によ
り、コロニーをスクリーニングし（上記8.1項参照）、
強く陽性のクローンをつり上げ、Sma Iでの消化により
さらにスクリーニングした。piE1は、2.7kbおよび7.3kb
の二つのフラグメントの存在によって同定された。piE2
は単一の10.0kb線状フラグメントによって同定された。
piE−２は、単一の8.6kb Sma Iフラグメントを含有する
弱いCR1−４陽性クローンとして同定された。
プラスミドpiP1は、piABCDのPst I完全消化、および
大きな10.0kbフラグメントのゲル精製によって得られ
た。このフラグメントを結合し、E.コリDK1/P3をその混
合物を用いて形質転換した。その結果生じたプラスミ
ド、piP1は、単一の10.0kb Sma Iフラグメントを含有し
た。
プラスミドpiU1およびpiU−２は、プラスミドpXLAを
用いたdcm-株GM271/P3の最初の形質転換によって調製さ
れた。このDNAは、Stu IおよびNco Iで二重に消化し、
3.3kbフラグメントをゲル精製した。プラスミドpBSABCD
をNsi Iで部分消化し、その結果生じた４塩基対の３′
オーバーラップをE.コリDNAポリメラーゼＩのクレナウ
フラグメントで処理することによって取り除いた。次に
そのDNAを、Not Iで完全に消化し、5.4kbおよび4.0kbフ
ラグメントをゲル精製した。これらをpXLA由来の3.3kb
Stu I−Not Iフラグメントに結合し、その連結混合物を
用いてE.コリDH5αをアンピシリン耐性に軽形質転換し
た。CR1 cDNAプローブCR1−４とのハイブリッド形成に
よって、コロニーをスクリーニングし、陽性クローンを
Hind III制限消化によってさらにチェックし、その消化
はpU1について0.8kb、1.3kbおよび6.5kbの３種のフラグ
メントを、そしてpU−２については0.8kbおよび6.5kbの
２種のフラグメントを生じた。Stu IでブラントしたNsi
Iスプライスは、これらのプラスミドのDNA配列決定に
より読み枠が一致することが確認された。それぞれ5.6k
bおよび4.2kbのpU1およびpU−２の挿入物を、Xho I−お
よびNot Iの二重消化後にゲル精製し、上記のように発
現ベクターCDM8に結合した。クローン、piU1およびpiU
−２の構造は、Xho IおよびPst Iを用いた制限消化によ
って確認され、piU1については、予想された1.2kbおよ
び8.8kbの二つのフラグメントを、そしてpiU−２につい
ては線状8.7kbフラグメントを生じた。
プラスミドpiA/Dは、Pst Iを用いたpiABCDの最初の完
全消化によって調製された。Pst I消化物を次にApa Iで
部分消化し、３′オーバーラップを、E.コリDNAポリメ
ラーゼＩのクレナウフラグメントを用いて除去した。次
にDNAをアガロースゲル電気泳動で分画し、7.5kbフラグ
メントを単離し、結合し、それを用いてE.コリDK1/P3を
アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性に形質転換し
た。その構築はKpn I＋Sac Iを用いた二重消化によって
確認され、予想された0.8kb、1.5kb、1.7kbおよび3.3kb
の４フラグメントを生じた。
9.実施例:C3bおよびC4b結合ドメインの同定 9.1.アッセイおよび結果 その名称の頭文字により示されるLHRを含有するプラ
スミドpiABCD、piAD、piCDおよびpiDをCOS細胞中に形質
転換し、これらを、そのコードされたCR1フラグメント
がC3bまたはC4bと結合する能力を評価するアッセイに用
いた。結合アッセイは、それらの細胞表面上で完全長CR
1分子またはCR1欠失組換え体を発現する（一過性発現）
COS細胞によるC3bまたはC4b被覆赤血球の結合から生じ
る赤血球ロゼット形成を観察することによって行った。
トランスフェクション細胞１−４×106/mlをC3またはC4
担持赤血球２−６×108/mlと共に0.02ml中で60分間20℃
でインキュベートした。トランスフェクション細胞形成
ロゼットの％は顕微鏡的に、少なくとも５個の付着性赤
血球がある場合を１ロゼットとして記録されたトランス
フェクション細胞により評価した。その結果を第III表
に示す。
３つの別個の各実験において、EC3（ma）でロゼット
を形成した完全長piABCD構築物を発現するCOS細胞の比
率は、YZ1モノクローナル抗−CR1抗血清またはウサギ抗
−CRR抗血清のいずれかを用いるイムノフルオレッセン
スにより評価して、検出しうる組換え体レセプターを有
するフラクションと同様であった（第III表）。これと
対照的に、piDを発現する細胞はロゼットを形成しなか
った。これはC3−結合部位がLHR−A,−Ｂまたは−Ｃ中
に存在するはずであることまたはこれらの存在を必要と
することを示している。ある１つの部位は、piBDまたは
piCDのいずれかを発現する細胞がEC3（ma）でロゼット
を形成することを実証することによってLHR−Ｂおよび
−Ｃの両方に存在することが示された。piAD,piA/Dまた
はpiE−２を発現する細胞は同等のC3−結合機能を有し
なかった。piE−２構築物は、LHR−Ｃの最初の２つのSC
Rの代わりにLHAのSCR−１および−２を有する点でのみp
iCDと相異するので、LHR−Ｃ中のC3−結合部位の機能は
これらNH2−末端SCRを必要とするはずである。
EC4（ma）でロゼットを形成した完全長piABCD組換え
体を発現するCOS細胞の比率は、EC3（ma）でロゼット形
成するフラクションよりも少なかった。これは恐らく、
１赤血球あたりのC4（ma）がより少ないこと（第III
表）または１レセプターあたりのC4−結合部位がより少
ないを反映している。LHR−Ａの全部または一部分を有
する欠失組換え体piAD,piA/DおよびpiE−２構築物は、
欠失組換え体piBDおよびpiCDよりも良好にEC4（ma）を
結合し;piDにはこの機能が欠けていた。従って、CR1のC
4−結合物は、二次的部位がLHR−Ｂおよび−Ｃ中に存在
するかもしれないが、最初はLHR−Ａ中にある。piE−２
構成のロゼット化能がpiCDのそれに比して良好であるこ
とは、LHR−ＡのSCR−１および−２がC4−結合部位に関
連していることを示唆している。
YZ1モノクローナル抗−CR1抗体の結合のラジオイムノ
アッセイは、piABCD、piAD、piBDおよびpiCD構築物を発
現するCOS細胞による有意な取り込みを示した（第IV
表）。LHR−Ａの５個のNH2−末端SCRおよびLHR−Ｄの３
個のCOOH−末端SCRから構成されるpiDまたはpiA/Dでト
ランスフェクションされた細胞は、これらの構築物の産
生物がポリクローナル抗−CR1抗血清と結合したが、YZ1
抗−CR1抗体とは結合しなかった（第IV表）。従って、Y
Z1エピトープはLHR−A,−Ｂおよび−Ｃ中で反復され、L
HR−ＡのNH2−末端SCR中には存在せず、そしてLHR−Ｄ
中では存在しないかまたは利用できない。
9.2.考察 各LHR中の最初のSCRのコード化配列の途中に見出され
た保存されたBsm I部位により、LHSの境界に密接に対応
しそしてオープン読枠および推定ジスルフィド結合形成
のために必要な４個のシステインの適切な位置を保持し
た一連の欠失組換え体を構成することが可能であった
（第16図）。これらの欠失組換え体のC3（ma）−および
C4（ma）−結合機能の比較により、これらの特異性を有
するLHRだけでなく配位子特異性の決定に決定的なSCRも
区別された。従って、piD形ではなくてpiAD、piA/Dおよ
びpiE−２形がトランスフェクションCOS細胞とEC4（m
a）との間のロゼット形成を仲介する能力は、LHR−Ａの
２個のNH2−末端SCRがこの補体タンパク質と相互作用す
るための部位を含有することを示した（第III表）。こ
の部位はpiADおよびpiA/Dを発現するトランスフェクタ
ントがEC3（ma）を結合することができたので（第III
表）、C4（ma）に対して比較的に特異的であるにすぎな
かった。ロゼットアッセイならびにpiBDおよびpiCDおよ
びC3（ma）の開裂のためファクターＩ−コファクター機
能により実証された（第III表；第18図）piBDおよびpiC
D構築物によりコードされたレセプターのC3（ma）−結
合機能は、これらのLHRの最初の２つのSCR中にC3（ma）
に対して特異的な部位が存在することを示した。これら
の部位はC4（ma）と相互作用することも可能であった
（第III表）。したがって、LHR−A,−Ｂおよび−Ｃには
選択的ではあるが重複するC4−およびC3−結合活性があ
る。
あるいはまた、piBDおよびpiCDを発現するCOS細胞がE
C4（ma）と結合する能力は、NH2−末端36アミノ酸をコ
ードするヌクレオチドがBsm Iフラグメントの連結によ
りLHR−ＡのSCR−１からLHR−Ｂおよび−Ｃに転移する
ことによって生じたものであろう。しかしながら、これ
らの36アミノ酸だけでは、piD産生物にC4−ロゼット形
成機能を与えなかった。本発明者らはこれらの反応にお
けるLHR−Ｄの二次的機能を排除することができない。
なぜならばこのLHR−Ｄは機能についてアッセイした構
築物のすべてに存在したからである。CR1中に３つの明
確なリガンド認識部位、C3bについて２つおよびC4bにつ
いて１つがあるとの発見は、各レセプター分子は１価の
リガンドに対して比較的低い親和性を有するにもかかわ
らず（Arnaout,M.A.ら、1983,Immunology 48:229）複数
のC4bおよびC3b分子を担持する複合体を有効に結合でき
るであろうことを示す。この発見は、可溶性C4bがC3b担
持赤血球とヒトＢリンパ芽球様細胞系との間でのロゼッ
ト形成を阻害する能力がないことについての説明をも提
供する（Gaither,T.A.ら、1983,J.Immunol.131:399）。
CR1が特に適合するであろうありうるリガンドは、それ
ぞれ主経路および副経路の活性化の際に生成する分子複
合体C4b/C3bおよびC3b/C3bであろう。４つのLHRのうち
の３つに明確な結合部位があるので、それらのLHRの数
により異なるCR1構造アロタイプはリガンド結合部位の
数の変化によって生じた有意な機能上の相違を有するで
あろう。インビトロ研究はF,SおよびＦ′（それぞれA,B
およびＣ）アロタイプの異なる結合活性を報告していな
いが、おそらく３個のみのLHRを有する小さいＦ′アロ
タイプは免疫複合体を解明するにはそこなわれた能力を
有するかもしれない。Ｆ′アロタイプは全身性エリテマ
トーデスと多分関連することが報告されている（van Dy
ne,S.ら、1987,Clin.Exp.Immunol.68:570）。
10.実施例：ファクターＩコファクター活性の提示 細胞表面および可溶化形の両方における組換えCR1タ
ンパク質およびその特定のフラグメントはC3bファクタ
ーＩコファクター活性を有することが示された。
ファクターＩコファクター活性のアッセイは、刊行さ
れた操作法（Fearon,D.T.,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.U.
S.A.76:5867）を変更して行った。
可溶化したCR1およびフラグメントのファクターＩコ
ファクターをアッセイするため、細胞表面CR1タンパク
質およびフラグメントをNonidet P−40で可溶化し、溶
解物をセファロースゲルに結合させた抗−CR1モノクロ
ーナル抗体YZ−１で免疫沈降させた。１×106トランス
フェクション細胞の界面活性剤溶解物を、セファロース
UPC10抗−レバンおよびセファロース−YZ−１で順次免
疫沈降させた。次いで洗浄したビーズを0.05ml PBS、0.
5％NP−40中の0.5μｇの125I−C3（ma）および200ngの
ファクターＩと共に37℃で60分間インキュベートするこ
とにより、免疫沈降物をファクターＩコファクター活性
についてアッセイした。インキュベーション後、放射性
標識C3（ma）を含有する上清をSDS−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーにより分
析した。ファクターＩコファクター活性は、ファクター
Ｉによるタンパク質分解開裂から生じるC3（ma）のアル
ファー鎖の低分子量形がオートラジオグラム上に現われ
ることによって示された。
細胞表面CR1およびフラグメントのファクターＩコフ
ァクター（上記のpiABCD、piAC、piBD、piCDまたはpi
D）を担持するトランスフェクションCOS細胞を0.5μg
125I−C3（ma）および0.2μｇファクターＩと共にイン
キュベートした（Fearon,D.T.,1977,J.Immunol.119:124
8）。
細胞表面組換えCR1のファクターＩ−コファクター活
性を第15図に示す。ファクターＩは免疫固化された組換
えCR1またはファクターＨの存在下でのみC3（ma）のア
ルファー鎖を開裂して分子量76,000および46,000のフラ
グメントにした（第15図）。オートラジオグラムからの
バントに対応する領域をゲルから切り出し、125Iについ
てアッセイして開裂されたアルファー鎖の量を測定し
た。ファクターＨの存在下で91％のアルファー鎖が開裂
されたが、漸増量の組換えCR1の存在下ではそれぞれ26
％、41％および55％が開裂された。いくらかの内因性フ
ァクターＩ−コファクター活性を含有するCDM8ベクター
単独でCOS細胞をトランスフェクションしたが、この機
能の増加はpiABCD、piBDおよびpiCDでトランスフェクシ
ョンされたCOSにより明らかであった（第18図）。piAD
またはpiDでトランスフェクションされたCOS細胞によっ
ては125I−C3（ma）の高められた開裂はみられなかっ
た。従って、これらの構築物のうち、COS細胞にC3結合
能を与えた欠失組換え体piBDおよびpiCDだけがC3開裂に
ついてのファクターＩ−コファクター活性をも有してい
た。
CR1およびそのフラグメントの細胞表面および可溶化
形によりファクターＩ−コファクター活性をアッセイし
た結果を第Ｖ表に示す。
第Ｖ表に示すように、piABCD（完全長CR1タンパク質
をコードする）、piBD（LHR−Ｂおよび−Ｄをコードす
る）またはpiCD（LHR−Ｃおよび−Ｄをコードする）の
発現はC3bファクターＩ−コファクター活性を有するCR1
産生物を産生した。従って第Ｖ表のデータは、CR1タン
パク質またはそのフラグメントが補体不活性化を促進す
ることができるとの証明を提供する。
11.実施例：組換え可溶性CR1の発現 CR1 cDNAを組換えDNA操作により修飾してCR1またはCR
1フラグメントの可溶性形（sCR1）を生成させた。sCR1
構築物を哺乳類系中で発現させ、そこで細胞から発現タ
ンパク質を分泌させた。大量の可溶性ポリペプチドが産
生され、これらのものはCR1タンパク質の膜結合形と対
照的に、溶液として得るために可溶化させる必要はなか
った。
11.1.材料および方法 11.1.1.酵素消化 すべての制限酵素消化、リンカー連結、およびT4DNA
リガーゼおよびE.coli DNAポリメラーゼ反応を製造業者
（New England Biolabs,Inc.,Beverley,MA）の説明書に
従って行った。E.coli DH1またはDH5αをMorrison,D.
A.,1979,Meth.Enzymol 68:326−331の操作法によりコン
ピテントにした。コンピテント細菌細胞をManiatis,T.
ら、1982,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,Cold
Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New Y
orkによりDNAで形質転換した。プラスミドをアルカリ溶
解または煮沸方法（Maniatis,T.ら、上記）により精製
した。
11.1.2.DNAフラグメントの単離 DNAフラグメントをアガロース（BioRad,Richmond,
（Ａ）ゲルから下記のようにして精製した。適切なDNA
バンドをゲルからカミソリを用いて切り出し、アガロー
ススライスをパラフィン片上に置き、きわめて小さい切
片にスライスし、新しいパラフィン片に移した。アガロ
ース片をつぶし、アガロースを1.5ml管に移した。同容
量のフェノール（超純粋、BRL,Gaithersburg,MD）を添
加し、混合物を回転させ、次いで−70℃で10分間凍結
し、10分間遠心した。水相をさらにフェノール／クロロ
ホルム（1:1）で２回、クロロホルムで２回抽出した。
次いでDNAをエタノール沈降させ、ペレットを洗浄し、
真空乾燥し、10mMトリス−HCl,pH7.0,1mM EDTAに再浮遊
させた。
DNAフラグメントを低ゲル化温度アガロース（FMC,Ccr
p.,Rockland,ME）から下記のようにして単離した。適切
なDNAバンドをアガロースゲルから切出し、1.5ml管に入
れ、65℃で15分間融解させた。液化ゲルを0.1％ドデシ
ル硫酸ナトリウム（SDS,超純粋,BRL,Gaithersberg,MD）
を含有するフェノールで抽出した。水相をさらにフェノ
ール−SDSで１回、クロロホルムで２回抽出した。次い
でDNAを2.0M NH4アセテート中でエタノール沈降させ、
乾燥し、水に再浮遊させた。
11.1.3.哺乳類細胞へのトランスフェクション 哺乳類細胞へのDNAのトランスフェクションをCaPO4沈
降およびGrahamおよびvar der Ebのグリセロールショッ
ク法（1973,Virology 52:456−467）により行った。DUX
B11 CHO細胞を、DNA−リン酸カルシウム調製物と共に
４〜６時間インキュベートしたのち、通気による成長培
地の除去および２％グリセロールDMEM培地5mlの１分間
添加によってグリセロールショックにかけた。次いで細
胞を完全アルファ−MEMで２回洗浄し、この培地中で48
時間インキュベートした。
11.1.4.CHOトランスフェクタント細胞培養 DUX B11 CHO細胞トランスフェクタントを、ヌクレオ
シド不含で10％透析ウシ胎児血清（Gibco）および4mML
−グルタミンを補充したアルファ−MEM培地（Gibco）か
らなるDHFR（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）選択培地中で
増殖させた。漸増量のメトトレキセート（Sigma,＃Ａ−
6770,Amethoprotein）濃度で細胞を増殖させることによ
り増幅を行った（Kaufman,R.J.ら、1985,Molec.Cell Bi
ol.5:1750−1759）。
11.1.5.可溶性CR1レベル測定用ELISA 11.1.5.1.CR1標準物 ヘモグロビン不含赤血球細胞（RBC）ghostの界面活性
剤溶解物をELISA（酵素−結合イムノソルベントアッセ
イ）におけるCR1標準物として用いた。ghostは先に記載
されたようにして作製した（Wong.W.W.およびFearon.D.
T.,1987,Meth.Enzymol 150:579−585）。簡単にいう
と、赤十字から使用期限の切れた全血を得た。赤血球を
PBSで３回洗浄したのち、６容量の低張溶解緩衝液（10m
MトリスpH8,0.1mM PMSF（フェニルメチルスルホニルフ
ルオリド）、0.1mM TPCK（トシルアミド−フェニルエチ
ルクロロメチルケトン）、アプロトニン、2mM EDTA）中
で溶解した。ghostを溶解緩衝液で数回洗浄し、血球計
でカウントし、小部分に分け、必要になるまで−70℃で
凍結した。CR1 ELISAについては、ghostを可溶化緩衝液
（10mMトリスpH8,50mM KC1,0.2％NPO4O,0.3％DOC,6.2mM
PMSF,0.2mMヨードアセトアミド，アプロトニン,0.1mM
TPCK,2mM EDTA,0.2％NaN3）中で1.6×108ghost/mlに希
釈し、ELISAにおける標準物として用いるために連続的
に2.5×106ghost/mlに希釈した。90nmにおける吸光度を
プロットし、すべての未知サンプル操作をプロットと関
連させてghost当量/mlを得た。
1.1.5.2.CR1 ELISA Immunlon−IIプレートをPBS中の0.4μg/ml濃度の抗−
CR1モノクローナル抗体（クローンJ3D3,AMAC IOT 17）
の100μ／ウェルで被覆し（Cook,J.ら、1985,Molec.I
mmunol.22:531−538）、４℃で１夜インキュベートし
た。次いで抗体溶液を捨て、ブロッキング溶液（1.0％B
SA,PBS中）を300μ／ウェルで添加することによりプ
レートをブロックし、37℃で２時間インキュベートし
た。ブロッキングののち、プレートをそのまま使用し、
または必要になるまで４℃で保存した。
0.05％Tween−20を含有するPBSを用いてプレートを３
回洗浄した。サンプルを100μ／ウェルで２通りずつ
で添加し、37℃で２時間インキュベートした。場合によ
ってはサンプルを可溶化緩衝液で希釈した。標準RBC gh
ostを各プレートに包含させた。サンプルインキュベー
ションののち、プレートを３回洗浄し、セイヨウワサビ
ペルオキシダーゼ（HRP）およびモノクローナル抗体YZ1
（Changelian,P.S.ら、1985,J.Immunolo.184:1851−185
8）の結合物（Wilson,M.B.およびNakane,P.K.,1978,Imm
unofluorescence and Related Staining Techniques,No
rth Holland Biomedical Press.pp.215−224）を50％FC
S,50％ブロッキング緩衝液中で1:8000に希釈し、100μ
／ウェルで添加した。37℃で２時間インキュベートし
たのち、プレートを0.05％Tween−20含有PBSで再び２回
洗浄した。基質オルトフェニレンジアミン（OPH）を基
質緩衝液（0.36％クエン酸H2O、1.74％Na2HPO4・7H2O,
0.1％チメロサール,0.4％H2O2,pH6.3）中0.2％濃度で10
0μ／ウェルで添加した。室温で20分後に2N H2SO450
μ／ウェルを用いて反応を中断させた。490nmにおけ
る吸光度を読み取った。
11.2.CR1コード配列の遺伝子修飾 CR1 cDANは約6,951ヌクレオチド塩基対から構成され
る（第１図、上記の第６および７節）。天然型cDNAの翻
訳停止シグナルは塩基対6145に位置する。このタンパク
質は、細胞膜の外表面に露出された４個の長い相同性反
復（LHR）プラス約25アミノ酸の膜に及ぶドメイン、こ
れに続く細胞質内に伸びるカルボキシル末端領域から構
成された膜結合レセプター分子である。この細胞質ドメ
インは43アミノ酸から構成される。可溶性CR1分子（sCR
1）の産生に用いた戦略は、細胞膜にタンパク質を固定
する膜貫通領域を除去し、次いで切りつめられた構築物
を分泌ポリペプチドとして発現させることであった。
11.2.1.pBSCR1cの形式 プラスミドpBSABCD（上記の実施例８）はヌクレオチ
ド１−6860からのCR1 cDNAを含有し、非翻訳配列３′か
らヌクレオチド6860におけるEcoR V部位を有しない。CR
1 cDNAは膜貫通ドメインの開始から29塩基離れた、塩基
対5914における独特な制限ヌクレアーゼ認識部位を有す
る。pBSABCDをまずBal Iで消化してフラッシュ末端を有
する線状分子を生成させ、次いでT4 DNAリガーゼを用い
て下記の配列を有する２個の38ヌクレオチド相補鎖から
なる合成オリゴヌクレオチドに連結した。
生成した分子は回復されたBal I部位および膜貫通ド
メインの開始点におけるアラニン残基まで（これを含
む）の天然型CR1配列を再生する変化した配列を有して
いた。これに加えて、翻訳停止シグナル（下記場合で及
び上で下線つき）はアラニンの直後に挿入されており、
続いて変化したcDNAのサブクローニングを容易にするXh
o I制限部位があった。
このプラスミドのXho I消化（消化されたpBSCR1c）
は、cDNAのオリゴヌクレオチド付加Xho I部位およびCR1
cDNAの５′末端におけるpBSKS＋ 多重クローニング部
位のXho I部位において切断することによりcDNA挿入物
（消化されたsCR1c）を切出した。pBSCR1cは下記のＮ−
末端配列を含有する。
11.2.2.pBSCR1の形成 膜貫通領域を有しない第２のsCR1構築物を次のように
して生成させた。pBSABCDをSac Iで消化した。これはCR
1 cDNAのヌクレオチド塩基対5485における独特なSac I
部位およびCR1 cDNAの３′末端に位置する宿主プラスミ
ドの多重クローニング部位のSac I部位において切断す
る。この消化はcDNAの３′末端から1375ヌクレオチドの
DNA配列の切出しを生じさせた。次いでこのフラグメン
トを電気泳動により除去した。残りのsCR1 cDNAを含有
する生成プラスミドの露出末端を、T4 DNAポリメラーゼ
を用いてフラッシュとなし、ブラント末端連結を行っ
た。Pharmacia翻訳ターミネーター（カタログ＃27−489
0−01,Pharmacia,Inc.,Piscataway,NJ）、３つのすべて
の読枠中に翻訳終止シグナルを含有する自己相補性オリ
ゴマーも、連結に含まれていた。連結に際して、挿入さ
れたオリゴマーはsCR1 cDNAについての新たな翻訳停止
シグナルを提供した。
11.2.3.pBM−CR1cの形成 pBMT3Xは、ヒトメタロチオネイン−1A遺伝子を含有す
る真核発現ベクター（Krystal,M.ら、1986,Proc.Natl.A
cad.Sci.U.S.A.83:2709−2713）であり、この遺伝子は
重金属例えばカドミウムの増加レベルに対する抵抗性を
細胞に与える。このベクターはまた、Mt−１タンパク質
に関する開始コドンの前にある遺伝子操作されたXho I
部位を含有するマウスメタロチオネイン−１遺伝子を含
む。このXho I部位はマウスMt−Ｉプロモーターの制御
下での遺伝子発現に関する挿入部位として用いられる。
pBSCR1cからXho Iを用いてsCR1c挿入物（約5.9kb）を
切出し、次いでベクターpBMT3Xの独特なXho I部位に連
結した。pBMT3X中のcCR1cの正しい方向を制限消化によ
り測定した（Maniatis,T.ら、1982,Molecular Cloning,
A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor,New York）。生成したプラスミド
をpBM−CR1cと命名した。
11.2.4.欠失組換え体pT−CR1c1、pT−CR1c2、pT−CR1c
3、pT−CR1c4およびpT−CR1c5の形成 sCR1 cDNAのタンパク質を特異的に欠失した種々の欠
失組換え体も構築された（第20図）。各欠失組換え体は
完全長cDNAの膜貫通領域を欠いていたので、組換え体の
発現は可溶性ポリペプチドを生じさせるであろう。
11.2.4.1.pT−CR1c1 pBSCR1cをSma Iで消化して大きさ2.56kbおよび7.3kb
の２個のフラグメントを生成した。これらのフラグメン
トをアガロースゲル電気泳動により分離し、7.3kbフラ
グメントを精製してそれ自体に連結した。E.coli DH5α
細胞をコンピテントとなし（Morrison,D.A.,1979,Meth.
Enzymol.68:326−331）、次いで連結混合物で形質転換
した。生成したプラスミドをpBL−CR1c1と命名した。こ
の構築物はCR1c挿入物のLHR−B 38％、LHR−C 100％お
よびLHR−D 51％を除去した。さらに、これは接合部233
5/4894bpでSma I部位を再生し、正しい翻訳枠を保持し
ていた。pBL−CR1c1をXho Iで消化し、CR1挿入物をpBle
uscript ベクターから分離した。単離されたCR1フラグ
メントを次いで発現ベクターpTCSgptの独特なXho I部位
中に挿入してプラスミドpT−CR1C1を生成した。
11.2.4.2.pT−CR1c2 pBSCR1cをCla IおよびBal Iで消化して大きさ3.96kb
および5.9kbの２個のフラグメントを生成した。これら
のフラグメントをアガロースゲルから精製した。プラス
ミドpBR322をCla IおよびBal Iで消化し、2.9kb pBR322
フラグメントを精製し、pBSCR1cからの5.9kbフラグメン
トに連結した。E.coli DH5α細胞を連結混合物で形質転
換し、生成したプラスミドをpBR8.8と命名した。このプ
ラスミドをXba Iで消化し、大きさ7.45kbおよび1.35kb
の２個のフラグメントを生成した。7.45kbフラグメント
をアガロースゲルから精製し、それ自体に連結させた。
生成したプラスミドpBR7.45をCal IおよびBal Iで消化
し、sCR1 cDNAを含有する単離された4.5kbフラグメント
をpBSCR1cからの3.96kbフラグメントに連結し、プラス
ミドpBL−CR1c2を生成した。この構築物はLHR−B 90％
をsCR1挿入物において除去しており、接合部1637/2987p
bでXba I部位を再生し、正しい読枠を保持していた。pB
L−CR1c2をXho Iで消化し、sCR1挿入物をpBleuscript
ベクターから分離した。単離されたsCR1フラグメントを
次いで発現ベクターpTCSgptの独特なXho I部位に挿入
し、プラスミドpT−CR1c2を生成した。
11.2.4.3.pT−CR1c3 pBSCR1cをNsi Iで消化して大きさ1.09kb、1.35kbおよ
び7.46kbの３つのフラグメントを生成した。7.46kbフラ
グメントをアガロースゲルから精製し、それ自体に連結
させ、プラスミドpBL−CR1c3を生成した。この構築物は
LHR−Ａの77％およびCR1挿入物の残りを除去していた。
Nsi I部位を接合部463/2907pbで再生した。ナンセンス
コドンを再生されたNsi I部位のすぐ後に導入すること
により翻訳枠を修飾した。pBL−CR1c3をXho Iで消化
し、sCR1挿入物をpBleuscript ベクターから分離し
た。挿入されたsCR1フラグメントを次いで発現ベクター
pTSCgptの独特なXho I部位に挿入し、プラスミドpT−CR
1c3を生成した。
11.2.4.4.pT−CR1c4 pBSCR1cをPst Iで消化した。pBleuscript のポリリ
ンカーのPst I部位は、このベクターにCR1 cDNAを連続
する際に除去されていた（上記の実施例8.1）。生成し
た大きさ1.35kbおよび8.5kbのフラグメントをゲル電気
泳動により分離し、8.5kbフラグメントを精製し、それ
自体に連結させ、プラスミドpBL−CR1c4を生成した。こ
の構築物はLHR−Ａの31％およびsCR1挿入物のLHR−Ｂの
69％を除去した。Pst I部位を接合部1074/2424pbで再生
させ、こうして正しい読枠を保持させた。pBL−CR1c4を
Xho Iで消化し、sCR1挿入物をpBleuscript ベクターか
ら分離した。単離されたsCR1フラグメントを次いで発現
ベクターpTCSgptの独特なXho I部位に挿入してプラスミ
ドpT−CR1c4を生成した。
11.2.4.5.pT−CR1c5 pBL−CR1c1をSma Iで消化し、こうしてこのプラスミ
ドを独特なSma I部位で線状にした。このプラスミドを
脱ホスホリル化し、ナンセンスコドン（New England Bi
olabs,Beverley,MA）を含有するホスホリル化Nhe Iリン
カーに連結した。この型のリンカーは３つのすべてのあ
りうる読枠中に翻訳停止コドンを含有し、Nhe I制限部
位をも含有し、これはsCR1 cDNA中のナンセンスリンカ
ーの存在の確認を容易にする。pBL−CR1c5をXho Iで消
化し、sCR1挿入物をpBleuscript ベクターから分離し
た。単離されたsCR1フラグメントを次いで発現ベクター
pTCSgptの独特なXho I部位に挿入してプラスミドpT−CR
1c5を生成した。
11.3.可溶性CR1の発現 ここに示すように、細胞から高収率で分泌させること
のできるCR1の可溶性形の発現は、（ｉ）欠失または切
りつめのために使用するCR1 DNA中の１つのその位置に
限られず、そして（ii）特別の発現ベクターの使用にも
限定されない（下記参照）。分泌sCR1を産生する能力は
２つの異なる発現系において示された。
11.3.1.発現ベクターのpTCSシリーズの形成 用いられた発現ベクターのpTCSシリーズは３つのプラ
スミドから成り、それぞれはcDNAの挿入のための独特な
Xho Iクローニング部位を有する（第21図）。挿入され
たcDNAの転写は１組のタンデムプロモーターにより誘導
される。SV40初期プロモーターはアデノウイルス２主要
延期プロモーター（AD2 MLP）の上流に位置する。cDNA
の初めとAD2 MLPの間にはアデノウイルス３分節系リー
ダーがある。転写されたmRNAは、Xho I cDNAクローニン
グ部位の下流に位置するマウス免疫グロブリンカッパ
（Igκ）配列により供給されたポリアデニル化シグナル
で停止される。選択可能なマーカーであるキサンチン−
グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（gpt）、
ジヒドロ葉酸レダクターゼ（dhfr）またはネオマイシン
耐性（neor）はそれぞれpSV2gpt、pSV2dhfrまたはpSV2n
eoからの対応するマーカーの挿入により供給された。こ
れらのプラスミドは、アンピシリン耐性についての複製
およびベーターラクタマーゼ遺伝子の細菌系の源でもあ
った。一般に、これらのベクターのうちどれを選んで使
用するかは、どの選択可能なマーカーまたはマーカーの
組合せが組換体の選択に好ましいかの如何による。
完全なDNA配列はアデノウイルス２（AD2）、SV40、pS
V2cat（Gorman,C.,1985,DNA Cloning,Volume II,A Prac
tical Approach,ed.D.M.Glover,IRL Press,pp.143−19
0）およびマウス免疫グロブリンカッパについて知られ
ている。配列はGenBank データベースおよびNational
Biomedical Researchの注解および参考文献中にある。
これらの配列のいずれもがpTCSベクターの適切なセグメ
ントのための源として役立つ。
ベクターpTCSgpt,pTCSneoおよびpTCSdhfrは中間体プ
ラスミドpEAXgptおよびpMLEgptから下記のようにして形
成した。
11.3.1.1.pEAXgptの形成 階段1.Ad2 MLD NDAフラグメントをM13 mp9/MLPから誘導
した（Concino,M.F.ら、1983,J.Biol.Chem.258:8493−8
496）。このプラスミドは、ヌクレオチド6069におけるP
vu II制限部位およびヌクレオチド5791におけるSac II
部位を含むヌクレオチド5778（Xho I部位）ないし6231
（Hind III部位）のアデノウイルス２配列を含有する
（NBRF Nucleicデータベース、受入れ＃Gdad2参照）。X
ho IないしHind IIIフラグメントをM13 mp9のHind III
およびSal I部位中にクローニングしてプラスミドM13 m
p9/MLPを生成した。
プラスミドM13 mp9/MLPをEcoR IおよびHind IIIで消
化し、フラグメントを含有するより小さいMLPを単離し
た。pUCプラスミド（Pharmacia,Inc.,Piscatway,NJ）も
EcoR IおよびHind IIIで消化し、このプラスミドからの
より大きいフラグメントを次いでEcoR IないしHind III
MLPフラグメントに連結した。これはpUCのプラスミド
バックボーンを有する新規なMLP含有プラスミドを生成
した。このプラスミドをSma Iで消化し、Sal Iリンカー
に連結し、再び環状化した。次いでこの新規なプラスミ
ドをPvu IIで消化し、これはプラスミドをアデノウイル
ス２挿入配列内の位置＃6069に位置するPvu II部位で開
裂した。生成した線状フラグメントをXho Iリンカーに
連結し、再び環状化した。次いでこのプラスミドをXho
IおよびSal Iで消化し、MLP DNAを含有するより小さい
フラグメントを単離した（フラグメント＃１）。
段階2.プラスミドpSV2gpt（American Type Culture Col
lection（ATCC）受託No.37145）をPvu IIで消化し、Sal
Iリンカーに連結し、Sal Iで消化した。最終生成物
は、gpt遺伝子源として役立つ線状pSV2gptフラグメント
であった（フラグメント＃２）。
段階3.マウス免疫グロブリンIgκフラグメント（Hiete
r,P.A.ら、1980,Cell 22:197−202）をHind IIIおよびA
va IIで消化し、ポリアデニル化配列を含有するフラグ
メントを単離した。NBRF Nucleicデータベース（受託＃
κcms）で入手できるマウスIgカッパ配列には、Ig停止
コドンが位置1296にあり、続いて1306にAva II部位、14
84にAATAAAポリアデニル化部位および1714にHind III部
位がある。このフラグメントのオーバーハング端をE.co
li DNAポリメラーゼで充填し、次いでこのフラグメント
をXho Iリンカーに連結し、Xho Iで消化した。このフラ
グメント（フラグメント＃３）はポリアデニル化部位源
とし役立った。
段階4.フラグメント1,2および３をT4 DNAリガーゼによ
り一緒に連結し、環状プラスミドを生成した。このプラ
スミド中のフラグメントの正しい方向は制限酵素分析に
より確認された。Xho I cDNAクローニング部位の下流に
はマウスカッパポリアデニル化部位があり、この部位か
らさらに下流にはSV40プロモーターおよびgpt遺伝子が
あった。Xho I部位の上流にはMLPプロモーターがあり、
このプロモーターからさらに上流には細菌由来の複製お
よびアンピシリン遺伝子があった。次いでこのプラスミ
ドをSal Iで消化し、オーバーハング端をE.coli DNAポ
リメラーゼで充填した。生成したブラントエンドフラグ
メントをEcoR Iリンカーに連結し、T4 DNAリガーゼで再
び環状化した。この最終プラスミドをpEAXgptと命名し
た。
11.3.1.2.pMLEgptの形成 段階1.プラスミドpMLP CAT（Lee,R.F.ら、1988,Virolog
y,165:50−56）はpMLベクターバックグランドを有する
発現プラスミドであり、アデノウイルス2MLPおよびCAT
遺伝子の５′側の３分節系リーダー配列を含有する。pM
LP CATをXho IおよびSac IIで消化した;Xho IはCAT遺伝
子と３連リーダーのL3領域との間の部位で切断し、そし
てSac IIはアデノウイルスDNA内の位置＃5791で、ただ
しMLPの５′で切断する。こうして、AD2 MLPおよび３分
節系リーダーはこの小さいXho I上にSac IIフラグメン
トまで位置した（フラグメント＃４）。
段階2.プラスミドpEAXgptをXho IおよびSac IIで消化
し、フラグメントを含有するより小さいMLPを捨てた。
より大きいフラグメント（フラグメント＃５）を単離し
た。Sac IIおよびXho I末端の両方を有するフラグメン
ト４および５を連結してプラスミドpMLEgptを生成し
た。
11.3.1.3.pTCSgptの形成 段階1.pMLPEgptをSac IIで消化し、末端をT4 DNAポリメ
ラーゼで充填し、ブラントエンドフラグメント（フラグ
メント＃６）を生成した。このSac II部位はアデノウイ
ルス２配列中のヌクレオチド5791にMLP−３分節系リー
ダーの５′に位置する。
段階2.pSV2dhfr（ATCC受託No.37146）をHind IIIおよび
Pvu IIで消化した。SV40初期プロモーターを含有するよ
り小さな342ヌクレオチドフラグメントを、E.coli DNA
ポリメラーゼのクレノウフラグメントを用いてブラント
エンドとした（フラグメント＃７）。フラグメント６お
よび７をT4 DNAリガーゼで連結した。制限酵素分析によ
り、これらのフラグメントは正しく配向して、Xho I cD
NAクローニング部位の上流に２個のタンデムプロモータ
ーを与え、各プロモーターは同じ方向へのRNA合成を誘
引できることが確認された。このプラスミドはpTCSgpt
と命名された（第22図）。
11.3.1.4.pTCSdhfrの形成 段階1.pSV 2 dhfrをHind IIIおよびPvu IIで消化し、次
いでより大きいフラグメントをアガロースゲルから精製
した（フラグメント＃８）。より小さいSV40初期プロモ
ーター含有フラグメントを捨てた。
段階2.pTCSgptをEcoR Iで消化し、次いでE.coli DNAポ
リメラーゼのKlenowフラグメントで充填してブラントエ
ンドを生成した。次いでこの線状フラグメントをHind I
IIで消化し、SV40プロモーターのpTCS転写ユニット、ML
P、３分節系リーダー、Xho I cDNAクローニング部位、
マウスIgλ配列および第２のSV40プロモーターを含有す
るフラグメント（約1600ヌクレオチド）を単離した（フ
ラグメント＃９）。このフラグメントは１個のフラッシ
ュエンドおよび１個のHing IIIオーバーハングエンドを
有した。フラグメント８および９の連結はプラスミドpT
CSdhfrを生成した。
11.3.1.5pTCSneoの形成 段階1.pSV2neo（ATCC No.37149）をHind IIIおよびBamH
Iで消化し、より大きいフラグメント（フラグメント＃
10）を単離した。このフラグメントはプラスミドバック
グランドおよびneo遺伝子を含有していた。
段階2.pTCSdhfrをHind IIIおよびBamH Iで消化し、pTCS
転写ユニット（フラグメント＃11）を消化生成物の電気
泳動ののちアガロースゲルから単離した。フラグメント
10および11の連結はプラスミドpTCSneoを生成した。
11.3.2.プラスミドpBSCR1c,pBSCR1sおよびpBM−CR1cの
発現およびアッセイ、可溶性CR1クローニング配列を含
有する哺乳類発現ベクター 11.3.2.1.CR1 cDNA内の異なる位置で切りつめられたCR1
構築物の発現 プラスミドpBSCR1cおよびpBCSR1sを形成し（上記の第
11.1節）、膜貫通および細胞質内領域を除いて大部分の
cDNAコード領域を保存するようにした（第20図）。pBCS
R1sは、LHR−Ｄの一部分およびpBSCR1cに存在するSCRs2
9および30を欠くので、pBSCR1cよりも短い。これらのプ
ラスミドのsCR1部分をpTCSgpt中に挿入し、次いで上記
のようにしてトランスフェクションおよび発現を行っ
た。
pBSCR1c/pTCSgpt構築物:pBSCR1cをXho Iで消化して5.9k
b挿入物をsCR1cを生成した。sCR1cをpTCSgptのXho I cD
NAクローニング部位中に挿入してpBSCR1c/pTCSgptを生
成した。
pBSCR1s/pTCSgpt構築物:pBSCR1sをXho IおよびPvu Iで
消化してsCR1s挿入物を放出させた。この挿入物の両端
をT4 DNAポリメラーゼでブラントにした。この挿入物を
アガロースゲルから精製した。ベクターpTCSgptをXho I
で消化し、オーバーハングXho IエンドをE.coli DNAポ
リメラーゼＩで充填した。次いでsCR1s挿入物をブラン
トエンドベクターに連結してpBSCR1s/pTCSgptを生成し
た。
プラスミドpBSCR1c/pTCSgptおよびpBSCR1s/pTCSgptを
Fsp Iで消化し、生成した線状DNAをチャイニーズハムス
ター卵巣細胞中にトランスフェクションし、この細胞は
プラスミドpSV2dhfrとのリン酸カルシウム共沈によるdh
fr遺伝子中の組換え体（CHO DUX B11細胞）であった。
トランスフェクタントをDHFR選択培地中でのその増殖能
により選択した。トランスフェクタントクローンの培養
物上清をELISAにより選択されたsCR1についてアッセイ
した。50のpBSCR1c/pTCSgpt組換え体からの培養物上清
をアッセイし、陽性組換え体を漸増濃度のメトトレキセ
ート中での培養による増殖方法によって取出した。さら
に、トランスフェクタントのプールを、各プールにつき
８個のpBSCR1c/pTCSgptトランスフェクタントを一緒に
培養し、同じ増幅方法によりそれらを担持させることに
よって作製した。増幅の結果をVI表に示す。
pBSCR1s/pTCSgptからの12の組換え体をELISAにより可
溶性CR1の産生についてアッセイした。12のすべての候
補は認めうるレベルの分泌sCR1を示した。最良の産生体
は、最良のpBSCRc1/pTCSgptトランスフェクタントによ
り産生されたものに匹敵するsCR1レベルを生じた。
pBSCR1c/pTCSgptおよびpBSCR1s/pTCSgpt組換え体は可
溶性CR1を同様の産生レベルで産生した。これは可溶性C
R1ポリペプチドの産生能がCR1 cDNA内のその切りつめた
点に依存しないことを示した。
細胞系を増幅する最初の試み、500nmメトトレキサー
トを越えたクローン35.6は成功しなかった。この理由の
ために、他の細胞系が表VIに示されたパネルから探され
た。候補はクローン35に相当する発現に基づいて選ばれ
た。発現が高原状態になり始めるメトトレキサートレベ
ルで、系はサブクローンされ上清上のsCR1濃度をスクリ
ーンした。50nmメトトレキサートに耐性のある細胞系15
はこれに基づき選ばれた。それをサブクローンし、細胞
系15.19を創り出し、発現を35.6レベルまで増大した。
次に15.19を種々の濃度のメトトレキサートを含有する
培地中で培養した。2500nmメトトレキサートだけがsCR
発現レベルの増大を生じ、±の35.6より63％分泌を増加
した。15.192500と命名された、この細胞系は次に限定
された希釈によりサブクローンされ細胞系15.192500.0
7,15.192500.10および15.192500.65を創った。これらの
細胞系は35.6よりもml当りのsCR1をそれぞれ143、119、
および103％多く産生した。
11.3.2.2.二つの異なる形質発現系中のsCR1cの形質発現 切形CR1 cDNA挿入物であるsCR1cを発現ベクターpTCSg
pt中に挿入し、上記のように発現した。また、それを1
1.2.3項に記載のようにして発現ベクターpBMT3X中に挿
入してpBM−CR1cを生じた。これら両方の発現ベクター
は、非常に強いプロモーターを有する。一つの系が分泌
ポリペプチドの一層良好な産物を生じるか否かを決定す
るため、可溶性CR1の発現を両方の系中で試験した。
C127 Iマウス細胞（ATCC登録番号CRL1616、Rockvill
e,Maryland）を、リン酸カルシウム法（Graham,F.L.及
びvan der Eb,A.J.,1973,Virology 52巻,456−467）を
用いてpBM−CR1cでトランスフェクションした。グリセ
ロールショック後に、細胞を10％ウシ胎児血清及び2mM
のＬ−グルタミンを含むＤ−MEM培地を再度供給し、37
℃で48時間インキュベートした。その後、細胞をトリプ
シン処理し、完全Ｄ−MEM培地＋10μＭの塩化カドミウ
ム中に1:5及び1:10の比で分割した。カドミウム耐性コ
ロニーが10日以内に現われた。10のコロニーをクローニ
ングシリンダーの使用により取り出した。夫々のコロニ
ーを、完全Ｄ−MEM培地を含む60mmのペトリ皿に移し、
細胞が集密に達するまで37℃、５％CO2でインキュベー
トした。その後、夫々の皿に関し、細胞をトリプシン処
理し、３個の60mmの皿に分けて、凍結細胞株の調製、RN
A抽出、分泌sCR1cの存在に関する細胞培地のELISA試験
に使用した。
夫々の集密ペトリ皿から細胞培地を取り出しELISA分
析にかけた時、試験した全てのpBM−CR1cクローンは可
溶性CR1生産に関して陽性であった。pBM−CR1c組換え体
からの分泌sCR1のレベルはpBSCR1c/pTCSgpt組換え体か
らの分泌量に匹敵した。これは、高レベルの分泌sCR1ポ
リペプチドを生産する能力が或種のプロモーターまたは
形質発現系のみの使用に依存性でないことを示した。
11.3.3.可溶性CR1コード配列を含有する哺乳類の発現ベ
クター、プラスミドpT−CR1c1、pT−CR1c2、pT−CR1c
3、pT−CR1c4、及びpT−CR1c5の形質発現及び分析アッ
セイ 欠失変異体のpT−CR1cシリーズは、構成物pBSCR1c及
びpBSCR1sのように、膜貫通及び細胞質ドメインを失っ
ていた。加えて、欠失変異体はCR1 cDNAの種々のLHR領
域のかなり大きな欠失をも含んでいた（第20図参照）。
欠失変異体をCHO DUX B11細胞中で発現し、生産された
可溶性CR1ポリペプチドのレベルを測定した。
夫々の欠失構成物に関し、クローンの40の異なるプー
ルを、可溶性CR1ポリペプチドが生産されているか否か
を測定するELISA分析のために選択した。５つのpT−CR1
c全ての構築物はELISAまたは細胞培地中の機能活性の存
在のいずれかにより測定され、sCR1を細胞培地に分泌し
ていることがわかった。５つのpT−CR1c構築物のうちの
４つによりトランスフェクションされた細胞からの上清
は、溶血アッセイにより測定されるように機能があるsC
R1を生産していた（下記第VII表及び13.2項参照）。
欠失変異体がまた可溶性CR1を生産し得たという事実
は、sCR1を発現する能力がCR1 cDNAの一つの正確な遺伝
的改変に依存しないことを更に示した。膜内外領域が欠
失された限り、全ての構成物は可溶性ポリペプチドを生
産し得た。
12.実施例：可溶性CR1の生産及び精製 多量のsCR1を中空繊維バイオリアクター系中で生産し
た。得られたsCR1の量は、接種した組換えクローンの相
対収量に比例していた。最適の精製結果のために、多量
の外部から添加されるウシ胎児血清ポリペプチドの非存
在下でsCR1の高い生産量を生じる血清を含まない培地を
選択した。
12.1.可溶性CR1の大規模生産 モデルIV−Ｌ中空繊維バイオリアクター（30kD分子量
カットオフ）を備えたCell−Pharm、商標、細胞培養系
Ｉ（CD Medical Inc.Miami Lakes,FL）を無菌条件下で
組立てた。二種のクローン（pBSCR1c/pTCSgptのクロー
ン２及びクローン35）を８個のＴ−225フラスコで増殖
させた。集密時に、細菌をトリプシン処理し、洗浄し、
ペレットにし、培地中で再懸濁した。クローン２の約５
×108個の細胞及びクローン35の約10×108個の細胞を二
つの別個の中空繊維バイオリアクターに接種した。アル
ファーMEM＋10％のウシ胎児血清、8mMのＬ−グルタミ
ン、100μg/mlのペニシリン−ストレプトマイシン及び
適当な濃度のメトトレキセート（クローン２に関して50
nM;クローン35に関して500nM）の20の培養リザーバー
を使用した。既混合ガス（空気中５％CO2）を酸素添加
装置によりリザーバー培地中に吹き込んでpHを維持し
た。培地循環速度、交換速度及びガス流速を、最大の生
産を生じるように調節した。試料を接種口により回収
し、1000rpmで10分間遠心分離し、0.22μＭの孔径のフ
ィルターで濾過し、精製前に４℃に保った。回収容量及
び頻度を、培養の開始時に25ml、週３回から、２〜３ヶ
作後に40ml、週５回に次第に増加した。sCR1の生産をCR
1 ELISAによりアッセイした。接種後の最初の１ヶ月で
クローン２及びクローン35の収量は、夫々66μg/日及び
1060μg/日であった。これらの収量は、培養が確立され
るようになるにつれて増加した。
12.1.1.血清を含まない培地中のsCR1の生産 ２種の市販の血清を含まない培地を、細胞増殖及びsC
R1の生産を支持するそれらの能力に関して試験した。pB
SCR1c/pTCSgptクローン35の集密T75フラスコを２個のT7
5フラスコに分けた。一つのフラスコを、10％ウシ胎児
血清、Ｌ−グルタミン、抗生物質、及び500nMのメトト
レキセートで補充されたアルファMEMで培養した。別の
フラスコを、アルファMEM＋Ｌ−グルタミン、抗生物
質、500nMのメトトレキセート＋HB CHO増殖補足物（Han
a Biologics Inc.Alameda,CA）中にウシ胎児血清を５％
から１％、0.5％及び０％と段階的に離乳させた。２個
のフラスコの細胞増殖及sCR1生産量を比較した。血清を
含まない培地中の細胞の増殖は、集密に達しなかった。
sCR1生産のレベルを第VIII表に示す。夫々の場合、sCR1
生産のレベルは、細胞を10％胎仔ウシ血清中で増殖した
時に最良であった。比較のために、血清を含まない培地
中で14日目に見られたレベルは、10％胎仔ウシ血清で補
足した培地の場合4.2×1010個のghosts/mlに比べて、1.
4×1010個のghosts/mlであった。
組換え体中の細胞増殖及びsCR1生産を、血清を含まな
い培地の第二の源（CHO−1,Ventrex Laboratories Inc.
Portland ME）を用いて試験した。血清で増殖された細
胞をこの培地中に離乳させることは必要でなかったの
で、細胞を解凍し血清を含まない培地中で直接培養し
た。この培地は、DME−F12ベース及び増殖添加剤からな
る。同数の細胞を解凍し、24ウェルプレートの別個のウ
ェル中に接種した。細胞が付着した後、培地を廃棄し、
10％ウシ胎児血清を含む培地または血清を含まない培地
を適当なウェルに添加した。夫々の条件を重複して行な
った。先に試験した血清を含まない培地と異なって、CH
O−１、即ちVentrex Laboratories培地は、胎仔ウシ血
清を含む培地の場合と同様の量の増殖細胞を生じた。
12.1.2.結論 上記の結果は、sCR1を生産するCHO細胞が特定の血清
を含まない培地中で維持し得ることを示した。これは、
大規模な生産実験のための培地のコストの節減をもたら
した。更に別の利点は、細胞培養上清からのsCR1の精製
が簡素化されることであった。何となれば、胎仔ウシ血
清タンパク質を除去する必要がなかったからである。
12.2.可溶性CR1の精製 特異的な抗−CR1抗体の出現により、精製CR1を生産す
るのに必要とされる多くのクロマトグラフィー工程を、
簡素化された二工程操作で置換することが可能になっ
た。これは、得ることができるCR1タンパク質の収量を
5.9×1013個の赤血球当り約１〜5mgのCR1に増加したWon
g,W.W.ら,1985,J.Immunol.Methods 82:303−313）。し
かしながら、報告された精製は膜に結合形態のCR1であ
ったので、界面活性剤中でCR1を含む物質を可溶化する
ことが常に必要であった。
組換えトランスフェクタントにより生産された可溶性
CR1は、精製用の界面活性剤で可溶化される必要はな
い。それは既に可溶性である。可溶性CR1は抗CR1抗体ク
ロマトグラフィー（下記参照）により精製し得るが、こ
の操作はそれ自体を大規模生産に容易にしない。スケー
ルアップの程度は、抗体精製カラムの抗体マトリックス
を調製するために得ることができる抗CR1抗体の量によ
り制限される。加えて、CR1に対するYZ−１の如き抗体
の高い結合親和性は、かなり苛酷な条件、例えばpH12.2
が結合されたsCR1生産物を抗体マトリックスから除去す
るために使用される必要があることを意味するWong,W.
W.,1985,J.Immunol.Methods 82:303−313）。
非常に多量の可溶性CR1を精製する能力を有するため
に、HPLCカラムを伴なう精製操作が開発された。これら
のHPLCカラムは、更に多量の精製された可溶性CR1を生
産するために容易にスケールアップし得る。加えて、そ
れらはsCR1の溶離及び回収のために苛酷な条件を必要と
しない。
12.2.1.抗体アフィニティカラム精製 12.2.1.1.方法 sCR1の抗体アフィニティ精製に関し、モノクローナル
抗体YZ−1 100mgを、製造業者の指示に従って、AffiGel
−10 BioRad,Richmond,CA）7mgに共有結合した。細胞培
養からのCR1を含む上清を、揺動するフラスコ中で固定
化YZ−１と共に４℃で一夜インキュベートした。その物
質をガラスカラムに注入し、10mMのHepes、0.1MのNaC
l、pH7で徹底的に洗浄した。sCR1を、20mMのリン酸ナト
リウム、0.7MのNaCl、pH12を用いて溶離したYoon,S.H.
及びFearon,D.T.,1985,J.Immunol.134,3332−3338）。
溶離した画分を、Biorad Protein・アッセイ（Biorad R
ichmond,CA）を用いてタンパク質の存在に関して試験し
た。タンパク質を含む試料を直に溜め、0.1MのHepes pH
7中で４℃で一夜透析した（２×１）。その後、試料
をPBS中で透析した。sCR1の存在をCR1 ELISAにより分析
した。
12.2.1.2.結果 トランスフェクタントpBSCR1c/pTCSgptクローン２に
より生産されたsCR1を含む細胞培養上清を、抗CR1抗体
アフィニティカラムに装填し、ピークsCR1画分を溜め
た。この精製物質の一部分を４〜20％SDS−PAGEゲルに
かけたDAIICHI Inc.;ポリアクリルアミドゲル;Laemmli
U.K.の改変操作、1970,Nature 227,680−685）。還元条
件下で、可溶性CR1の見掛分子量は約224,000ダルトンで
あった（第24図）。また、この精製CR1は、補体媒介溶
血並びにC5a及びC3A生産を抑制するその能力により活性
であることが示された（下記の13項）。
12.2.2.HPLCによるCR1精製 12.2.2.1.方法 12.2.2.1.1.出発物質 培養物をバイオリアクター中で最初に定着させた場
合、sCR1生産のレベルは、培養物が数ヵ月間増殖してい
た場合よりも少なかった。一般に、バイオリアクター中
の細胞が集密に達し、最大量のsCR1を生産するまでに、
数週間の期間があった。少量のsCR1を含む細胞培養上清
を、精製の前に硫酸アンモニウム沈澱または限外濾過に
より濃縮できた。60〜80％の飽和の範囲にわたる上清の
硫酸アンモニウム分別は、実質的に等しい収量でsCR1を
沈澱させた。沈澱を最小容量に溶解し、陽イオン交換HP
LCのために出発緩衝液中で透析した。またCHO細胞培養
上清は、限外濾過により濃縮でき、陽イオン交換クロマ
トグラフィーのために出発緩衝液中に透析できた。
バイオリアクターが一層高い濃度の可溶性CR1を生産
するにつれて、これらの培養物からのCHO細胞培養上清
は、陽イオン交換クロマトグラフィーのために出発緩衝
液中に直接に透析できた。
12.2.2.1.2.陽イオン交換HPLC操作 試料を出発緩衝液（0.02Mのリン酸ナトリウム、0.06N
の塩化ナトリウム、pH7.0）中に透析し、続いて、0.2μ
ｍのフィルターで濾過して粒状物を除去した。その後、
試料を陽イオン交換高速流体クロマトグラフィーカラム
（10cm×10mm,RaininからのHydropore−SCX HPLCカラ
ム）に装填した。カラムを洗浄し、塩化ナトリウム勾配
で溶離し、0.02Mのリン酸塩、0.5NのNaCl、pH7.0を用い
て溶離した。sCR1は0.06N〜0.25NのNaClのどこかで溶出
した。溶離を、280nmに於ける吸光度及びELISAにより監
視した。
12.2.2.1.3.陰イオン交換HPLC操作 所望により、陽イオンHPLC精製sCR1の更に精製が、陰
イオンHPLCにより得ることができた。陰イオンHPLCから
のピーク画分を、陰イオンHPLCのために出発緩衝液中に
透析した。試料を装填し、カラム（RaininからのHydrop
oro−AX）を0.01Mのリン酸塩液pH7.5中で洗浄した。カ
ラムを一連の工程及びグラジェントにかけ0.01Mのリン
酸塩、0.5NのNaCl、pH7.5を用いて溶離した。sCR1は0.0
N〜0.3NのNaClのどこかで溶出した。溶離は、陽イオン
交換HPLCに関して前記したようにして監視した。陽イオ
ンHPLCカラム緩衝液及び陰イオンHPLCカラム緩衝液の濃
度及びpHは、例示にすぎない。その他の緩衝液濃度、塩
の条件、またはpH条件がまた可能である。
12.2.2.1.4.ウェスタンブロット分析 Towbin,H.ら,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76,4350
−4354からの改変操作を用いて、ウェスタンブロッティ
ングを行なった。簡単に云えば、精製sCR1を４〜20％の
SDS−PAGEで処理し、ニトロセルロースに移し、抗CR1
（マウスmAb YZ−１またはJ3D3）で詳細に探査し、アル
カリホスファターゼと接合したヤギ抗マウス抗体で検出
した。
12.2.2.2.結果 典型的な実験に関して、バイオリアクター培養からの
上清50〜100mlを出発緩衝液中に透析し、10cm×10mmの
陽イオン交換HPLCに装填した。ピーク画分をELISA及び2
80nmに於ける吸光度により測定し、溜めた。プールのタ
ンパク質濃度を、280nmに於ける吸光度により測定した
（CR1cアミノ酸組成から概算して、280nmにおけるε
（１％）＝10）。数十mgを、増幅培養上清100mlから精
製した。
一例として、トランスフェクタントpBSCR1c/pTCSgpt
クローン２からの培養上清液100mlは、陽イオンHPLCに
より精製した場合、280nmに於ける吸光度により測定さ
れるように、精製sCR1 22mgを生産した（第24図）。CR1
ELISAにより監視した場合、収率は202％であると計算
され、その他13％が貫通画分またはカラム洗浄画分中に
あった。100％より大きい収率は、おそらくELISA中のマ
トリックス作用を反映している。
培養上清をバイオリアクターから抜き取ることができ
る速度が与えられたとすると、１基のバイオリアクター
当り１週間で約100mgの精製した可溶性CR1を生産するこ
とは、この水準のメトトレキセート増幅で可能であるべ
きである。このレベルの生産をスケールアップし得る幾
つかの方法は、バイオリアクターに接種する前に出発培
養物をメトトレキセートで最大限に増幅すること、生産
時のバイオリアクターの数をいずれか一度に増加するこ
と、及び大容量のHPLCカラムを使用することを含む。
12.2.2.3.精製した可溶性CR1の特性決定 陽イオンHPLCからのsCR1を含むピーク画分（第24図）
を、陰イオンHPLCで更に精製した。種々の工程に於ける
sCR1物質の純度をSDS−PAGEにより試験した（第25
図）。これらの重度に装填されたゲル中に見られる一層
小さいバンドは、抗CR1モノクローナル抗体YZ1またはJ3
D3を用いるウェスタンブロット分析により測定されるよ
うに、sCR1のフラグメントを代表する。フラグメントsC
R1バンドは、殆どの調製物中に見られなかった。
精製sCR1の機能的活性を、0.25μg/mlの精製sCR1濃度
で主経路補体媒介溶血を50％抑制するその能力により試
験した。また、精製した可溶性CR1は５μg/mlで主経路
補体C5a生産を50％抑制でき、13μg/mlでC3a生産を50％
抑制できた（下記、13項参照）。
12.2.2.4.結論 上記のように、我々は、治療用途に必要とされるsCR1
の量を生産するために容易にスケールアップし得る可溶
性CR1の精製の改良方法を開発した。この操作の基本要
素は、既に可溶性であり、それにより、膜に結合された
CR1を界面活性剤で可溶化するという必要をなくす出発
物質を含んでいた。バイオリアクター培養物中のウシ胎
児血清濃度の減少及び／またはこれらの培養物中の代替
培地の使用は、その後の精製中に高濃度の外来タンパク
質を、sCR1を含む出発物質から除去する必要をなくし
た。更に、精製のためのHPLC操作の開発は、大規模な精
製方法を提供した。陽イオンHPLCまたは陽イオンHPLCと
その後の陰イオン交換HPLCとの組合せが、精製に使用し
得る。高収率の実質的に純粋な可溶性CR1を、この操作
により１工程または２工程のみで得ることができる。
13.実施例：可溶性CR1のインビトロ活性の実証 13.1.好中球酸化的バーストの抑制 心筋梗塞中に受ける組織損傷の再潅流（reperfusio
n）損傷モデルに於いて、活性補体成分は好中球の癒着
及び活性化を誘発する。活性好中球は、非常に毒性の酸
素ラジカルを生じる酸化的バーストを受ける。これら及
びその他の潜在的な毒素は、好中球の顆粒消失中に放出
され、周囲の組織を損傷する。可溶性CR1は、C3a及びC5
a、即ち好中球活性化に関与する補体成分の発生を防止
することにより損傷組織の領域を減少し得る。
インビトロで補体活性化中のC5aの発生を阻止する可
溶性CR1の能力を監視するため、C5a誘発の酸素バースト
に好中球により生じられる酸素ラジカルの発生を定量化
し得るバイオアッセイを使用したBass,D.A.ら,1983,J.I
mmunol.130,1910−1917）。この分析は、ジクロロフル
オレセイン ジアセラート（DCFDA）を使用し、これは
細胞に入って閉じ込められ、酸化の際に非常に螢光性に
なることができる脂質可溶性の分子である。
13.1.1.材料及び方法 13.1.1.1.材料 新しい全血、ヒト補体源（Beth Israel Hospital,Bos
ton,MA）、乾燥パン酵母、0.1％のゼラチン及び5mMのグ
ルコースを含むPBS、100mMのEDA、HBSS（Kodak社）中の
10mMのDCFDA、赤血球（RBC）を溶解する緩衝液（Ortho
Diagnostics、精製C5a（Sigma Chemical Co.,St.Louis,
MO）、及び可溶性CR1を使用した。
13.1.1.2.好中球の調製 好中球をBassにより記載されたように調製した（198
3,J.Immunol.130,1910〜1917）。全血2.0mlをPBS−ゼラ
チン−グルコース中で３回洗浄し、HBSS中の10μＭのDC
FDA5ml＋PBS−ゼラチン−グルコース5ml中で再懸濁し、
37℃で15分間インキュベートした。その後、細胞を遠心
分離し、PBS−ゼラチン−グルコース＋5mMのEDTA 2.0ml
中で再懸濁した。
13.1.1.3.酵母粒子の調製 乾燥パン酵母を水中で再懸濁し、２回洗浄し、30分間
沸騰させた。粒子を水中で２回再洗浄し、水中で0.5g/m
lで再懸濁した（上記のSimpson,P.J.ら）。
13.1.1.4.精製C5aによる好中球の活性化 DCFDAを含んだ細胞100μを、RBCを溶解する緩衝液
で処理し、PBS−ゼラチン−グルコース−EDTA中で１回
洗浄し、PBS−ゼラチン−グルコース1.0ml中で再懸濁し
た。200ng/mlの精製C5aまたは対照50μを標的細胞0.5
mlに37℃で添加し、種々の時間間隔でフロートサイトメ
トリーで分析した。
13.1.1.5.ヒトの血清または血漿における純化されたC5a
による好中球の活性化 DCFDA−負荷した細胞100μをヒト血清またはヘパリ
ン化した血漿（100ng/ml）または対照で1:1に希釈したC
5aの50μ中で、37℃、30分間インキュベートした。RB
C'sを溶解させ、そして好中球をフロー血球計算器で分
析した。
13.1.1.6.酵母粒子で活性化したヒトの血清または血漿
による好中球の活性化 新しい凍結血清及び血漿425μ＋sCR1または対照50
μを、酵母粒子25μと共に37℃で30分間インキュベ
ートした。その後、補体活性化試料及び対照試料を、遠
心分離して酵母粒子を除去した。これらの試料の夫々の
10回の２倍希釈をPBS−ゼラチン−グルコース−EDTA中
で行なった。対照並びに活性化された血清及び血漿の夫
々の連続希釈液50μを、DCFDAを含んだ標的細胞50μ
に添加し、37℃で30分間インキュベートした。その
後、PBCを溶解して除き、好中球をフローサイトメトリ
ーにより分析した。
13.1.2.結果 13.1.2.1.C5aはDCFDAを用いて測定し得るヒト好中球中
の酸素バーストを誘発する 第26図は、精製C5aによる刺激後のヒト好中球の螢光
強度の急速な増加を示す。C5a（20ng/ml最終濃度）の添
加の４分以内に、好中球は対照のDCFDAを含んだ好中球
よりも10倍明るかった。20分までに、好中球は対照の20
倍明るかった。この分析は、C5aの感度のよい指標であ
るように思われる。
13.1.2.2.ヒト血清は、好中球に及ぼす精製C5aの酸素バ
ースト作用を阻止する DCFDAが含まれ、ヒト血清中で希釈された精製C5aと共
にインキュベートされた好中球では、螢光強度の増加が
観察されなかった。この作用は、凝固中に血小板から放
出される血小板誘導成長因子（PDGF）によるものであり
得る。少量のPDGFはC5a誘発の好中球活性化を抑制し得
ることが示されていた（Wilson,E.ら、1987,Proc.Natl.
Acad.Sci.USA84:2213−2217）。
13.1.2.3.ヘパリン化血漿は好中球に及ぼすC5aの作用を
阻止しない ヘパリン化血漿中で1:1に希釈されたC5aは、DCFDAを
含んだ好中球中に酸素バーストを誘発した。緩衝液中の
C5aほど著しくないが、好中球と共に30分間インキュベ
ートした後、螢光強度の10倍の増加があった。シグナル
低下は、瀉血または血漿分離中のPDGF放出により生じ得
る。血液の細胞成分からの血漿の一層穏やかで迅速な単
位は、PDGFの放出を最小にし、一層良好なC5a機能を生
じ得る。
13.1.2.4.補体活性化中に存在するsCR1はC5a発生を阻止
する 可溶性CR1の存在下のヒト補体のザイモサン誘発活性
化は、DCFDA分析により測定されるようにC5a活性の低下
を示した。第27図に見られるように、sCR1の存在下で活
性化されたヒト血漿の1:16希釈物は、sCR1が存在しない
で活性化された1:16希釈血漿に較べて好中球中で70％少
ない螢光強度の増加を生じた。これはsCR1によるC5a発
生の抑制を意味する。DCFDAアッセイ及び血漿収集の更
に最適化は、可溶性CR1活性の一層動的で、しかも感度
の良い分析をもたらす。
13.2.補体媒介溶血の抑制 13.2.1.方法 補体を阻害する能力を、補体媒介赤血球溶解（溶血）
の阻害に関して分析することにより試験した。溶血の阻
害を、可溶性CR1濃度の関数として測定した。試験すべ
きsCR1試料を0.1Mのヘペス緩衝液（0.15N NaCl,pH7.4）
中で希釈し、50μをＶ字形の底部のマイクロタイター
プレートの夫々のウェルに代表的には三通りずつで添加
した。補体源として使用したヒト血清をヘペス緩衝液中
で１−125倍に希釈し、50μを夫々のウェルに添加し
た。次に、抗ヒツジ抗体を含む市販のヒツジ赤血球（Di
amedixカタログ番号789−002）を、入手したまま使用
し、100μ／ウェルで添加し、溶血に至る補体経路を
開始させた。プレートを37℃で60分間インキュベート
し、続いて、500×ｇで10分間遠心分離した。上清を取
り出し、平底のマイクロタイタープレートに入れた。溶
血の程度を、410nmに於ける試料の吸光度の関数として
測定した。最大吸光度（最高の溶血に相当する）Amax
を、ヒトの血清のみを含有する赤血球試料の吸光度As−
赤血球のみを含有する試料の吸光度Aoから得た。したが
ってAmax＝As−Ao。ヒト血清及びsCR1の両方を含む赤血
球試料の吸光度と、sCR1のみを含む細胞試料の吸光度と
の差をＡ試料と定義した。阻害、IHを分数（Amax−Ａ試
料/Amax）として表わし、IH50をIH＝1/2の値を生じるの
に必要とされるsCR1の濃度として定義した。クロマトグ
ラフィー画分を監視するため、無血清対照を包含させ
ず、抗補体活性を試料の410nmに於ける吸光度の減少と
して定性的に監視した。
また、上記の溶血アッセイを使用して、モルモット及
びラットの如きその他の種からの補体によるヒツジ赤血
球溶解を阻害するヒト組換え体sCR1の能力を評価した。
夫々の種に関して、新しい凍結血清または新たに凍結乾
燥した血清もしくは血漿を、補体源として使用した。或
る場合には、血清を商業的に入手した（Sigma Chemical
Company,St.Louis,MO）。
まず、血清を、活性化赤血球を溶解するその能力に関
して滴定した。最高の赤血球溶解の少なくとも80％を生
じる最大希釈度を、添加ヒトsCR1の作用を評価するのに
選んだ。その後、ヒト血清を動物血清に代え、好ましい
希釈度で、アッセイを上記のように行なった。
13.2.2.結果 第28図に示されるように、精製sCR1は0.12μg/mlのsC
R1濃度で主経路補体媒介溶血を50％阻害した。溶血アッ
セイを阻害する抗体アフィニティ精製sCR1の能力を、未
精製物質（sCR1を含む細胞培養上清）の能力と比較し
た。精製sCR1は、未精製sCR1の活性に匹敵する活性を有
し、両者は1.6×108個のghost/mlで溶血アッセイで50％
の阻害を生じた。これは、精製操作が最終的sCR1生産物
の機能的活性を実質的に低下させていないことを示し
た。
精製sCR1が凍結して貯蔵し得るかを調べるために、一
部分を−70℃で１週間貯蔵した。凍結sCR1の濃度は、28
0nmに於ける吸光度及びCR1 ELISAにより測定されるよう
に、凍結しなかったsCR1と同じであった。また、凍結sC
R1は、溶血の阻害により測定されるように、凍結しなか
ったsCR1と同じ活性を有していた。
幾つかの種からの補体により媒介される溶血を阻害す
るヒト組換え体sCR1の能力を第IX表に要約する。
モルモット補体及びラット補体の両方は、ヒトsCR1に
より阻害されることが明らかであった。その他の種に関
して明らかな阻害の欠如は、（ａ）アッセイ系中にウサ
ギ抗体及びヒツジ赤血球を使用することの不適なこと、
または（ｂ）この系中における高濃度の血清が溶血に必
要とされることを反映しているものかも知れない。
13.3.C3a及びC5aの産生の阻害 13.3.1.方法 補体を阻害する能力を、C3a及びC5a産生の特異的な阻
害に関してアッセイすることにより、また試験した。全
ての実験に関して、補体の源として使用すべき単一のヒ
ト血清プールを、一部分ずつ分け、−70℃で凍結して貯
蔵した。ヒトIgGを熱凝集させ、一部分ずつ分け、−70
℃で凍結して貯蔵した。夫々の実験に関し、血清一部分
を、試験すべきsCR1の濃度を変えて37℃で平衡化した。
補体経路を、凝集したヒトIgGの添加により開始させ
た。IgGを含有しない対照試料を常に包含させた。15分
の一定の反応時間（早期の経時検討で、C5aまたはC3aの
生産がほぼ完結される、即ち90％以上完結する都合のよ
い時間間隔を得るために決定されていた）の後に、放出
された補体ペプチド（C5aまたはC3a）のレベルを、改変
操作で市販の放射性免疫測定（RIAと称する）キット（C
5a、RIA、（Amersham）カタログ番号RPA.520;C3a RIA、
（Amersham）カタログ番号RPA.518）を用いる放射性免
疫測定法により測定した。
競合免疫測定法を使用したので、補体ペプチド（C5a
及びC3a）濃度は、計数と逆に変化した。試料に関する
結合数（CB）は、ペレット中で測定された全計数（１分
当りの計数、cpm）として定義された。
第29図中のｙ軸は、フラクション阻害を表わす。フラ
クション阻害は、（“IgGを含まない対照”に関するCB
−“sCR1を含まない試料”中のCB）で割った（“試料”
に関する結合数（CB）−“sCR1を含む試料”中のCB）に
等しい。
13.3.2.結果 精製sCR1の活性を、活性化ヒト血清試料中でC5a及びC
3aの生産を阻害するその能力を試験することによりアッ
セイした。
第29図により示されるように、試験条件下で、精製sC
R1はC5a生産を100％、C3a生産を60％、最大に阻害し得
た。50％の阻害は、C5a生産に関して５μg/ml、そしてC
3aの生産に関して15〜20μg/mlのsCR1濃度で観察され
た。これらのデータは、組換えsCR1がC3コンバーターゼ
よりもC5コンバーターゼを有効に阻害することを示唆す
る。
14.実施例：可溶性CR1の機能的なインビボの治療活性の
実証 14.1.可溶性CR1は逆受身アルチュス反応にインビボ作用
を示す アルチュス反応は、抗原を局所注射し、その抗原が次
に循環中に抗体と反応することにより引き起こされる古
典的な免疫誘導炎症応答である。主要な生物応答は、免
疫複合体沈着、補体結合、多形核（PMN）白血球浸潤、
リソゾーム酵素の放出、血管活性アミン、及び局所の組
織損傷により特徴づけられる（Uriuhura,T.及びMovat,
H.Z.,1966,Exp.Mol.Pathol.5:539−558;Cochrane,C.G.,
1968,Adv.Immunol.9:97−162）。直接アルチュス反応の
改変、即ち逆受身アルサス反応（RPAR）は、抗炎症薬を
同定するためのモデルとして使用されている（Pflum,L.
R.及びGraem,M.L.,1979,Agents andActions,9,184−18
9）。RPARでは、抗体が局所注射され、抗原が循環中に
存在する。
ラットRPARモデル中で試験した場合、可溶性CR1sは局
所炎症反応を阻止できた。インビボのこの可溶性CR1機
能の作用機構は、補体経路酵素の阻害により媒介されて
いる。
14.1.1.材料及び方法 体重約100−125gの生後５週の雌のSprague Dawleyラ
ット（CD株）（Charles RiverLaboratories）、Wilming
ton,MA）を、0.1〜0.3mlのAvertin溶液の腹腔内注射に
より麻酔した。この溶液は、15mlのアメルAmelエタノー
ル中の1gのトリブロモエタノールでつくられた貯蔵液の
1:2希釈物であった。動物の背中の毛皮を剃った。次
に、尾部を、まず温水で、次にヒートランプで温めた。
1mlの注射器を用いて、0.15Mのリン酸塩緩衝食塩水（PB
S）中の5mg/mlの卵アルブミン（Calbiochem Corp San D
iego,CA）0.35mlを尾部静脈１尾部の先端から約2.5〜5.
1cm（１〜２インチ）の位置に静脈内注射した。５分
後、ラットを、4mg/mlの抗体力価を有する抗−卵アルブ
ミン抗体の20mg/mlのウサギIg画分（Organon Teknika C
orp、Cappel Division,West Chester,PA）0.08mlまたは
20mg/mlのウサギIgG（Sigma Chemcal Co.,ST.Louis,M
D）0.08ml、またはPBSで皮内注射した。夫々の注射を二
通りずつ行ない、注射付近の領域をマーカーペンで円形
に印した。その後、ラットを１時間後、４時間後、18時
間後に監視した。24時間後にラットをドライアイス中に
３分間沈めることにより死亡させた。皮膚試料を注射部
位から切開した。二通り試料の一つを、パラフィン包埋
のために10％のホルマリン中で固定し、別の試料をクリ
オスタット切片用に凍結した。組織部分を調製し、ヘマ
トキシリンおよびエオシンで染色した。
14.1.2.結果 弱いRPAR反応（例えば、浮腫及び紅斑）が抗−卵アル
ブミン抗体の皮内注射の３〜５時間後に目視できるよう
になり始めた。反応の大きさが24時間後に直径３〜5mm
に達するまで、反応の強さが次第に増大した（第30b
図）。非免疫ウサギIgGまたはPBSのみを注射した夜分の
ラットの皮膚では反応は観察されなかった。
病変の部位から調製された組織切片の顕微鏡検査のも
とで、多くの急性炎症細胞が、特に血管付近の皮膚中に
目視できた（第31b図）。これは、典型的に脈管炎及び
脈管周囲炎として識別される。その組織は、血管外部の
PMNの広範囲に及ぶ浸潤、結合組織中の赤血球の存在、
及びコラーゲン繊維の弛緩を伴なう典型的な炎症症状を
示した。
14.1.3.可溶性CR1の皮内投与の作用 0.75mg/mlのsCR1 40μを等容量の抗−卵アルブミン
または正常なウサギIgGまたはPBSと組合せることによ
り、精製sCR1の混合物を調製した。sCR1:抗−卵アルブ
ミン混合物またはsCR1:ウサギIgG混合物、またはsCR1:P
BS混合物を、卵アルブミンで静脈内に感作されたラット
に皮内注射した。わずかに目視できる病変が、sCR1＋抗
−卵アルブミン抗体を受けた注射部位中に現われた（第
30a図）。予測されるように、病変はsCR1:ウサギIgGま
たはsCR1:PBSを受けた注射部位中に現われなかった。sC
R1:抗−卵アルブミン注射部位の周囲の組織の部分を顕
微鏡で調べたところ、PMN及び単核細胞のクラスターが
細静脈の周囲に見られたが、PMNの広範囲に及ぶ浸潤ま
たは赤血球の溢出はなかった（第31a図）。これらのデ
ータは、可溶性CR1の投与が内皮細胞の損傷の抑制及び
炎症反応の抑制を生じたことを示す。
上記の卵アルブミンラットモデル中のRPARを阻止する
のに必要とされるsCR1の最小有効量を測定するために、
0.75mg/mlsCR1原液の10倍の連続希釈液（希釈なし、1/1
0,1/100,1/1,000及び1/10,000）を試験した。夫々のsCR
1希釈物を、等容量の生のままニートまたは1/2希釈抗−
卵アルブミン抗体と混合した。夫々の部位に合計80μ
を注射した。RPARを阻害するsCR1の能力は用量依存性で
あり、浮腫の有効な減少が部位当り300ngで観察された
（第Ｘ表）。
14.2.インビボに投与されたsCR1の薬物速度論 インビボのsCR1の生物学半減期を、以下のように測定
した。同様の齢（６週）及び体重（110〜125g）のラッ
トに、0.35ml中250μｇのsCR1を静脈内注射した。注射
後、２分、５分、10分、60分及び24時間で、ラットを犠
牲にし、大静脈孔から血液を得た。夫々のラットからの
血清１〜2mlを、1800rpmで10分間の遠心分離により得、
夫々の試料中のsCR1の量をCR1 ELISAにより測定した。
対照のラット血清またはヘモグロビンを含まない赤血球
ghost（1.6×108個のghost/ml）の界面活性剤溶解産物
中に加えられた精製sCR1 1μg/mlの２倍希釈液を、CR1
標準物質として使用した。結果を第XI表に示す。
これらのデータは、sCR1が静脈内注射の24時間後に検
出し得ることを示す。24時間の時点で、血清中のsCR1の
レベルは、注射後10分で観察されたピークレベルの50％
であった。
スプラーグドーレイ（Sprague Dawley）ラットおよび
サイノモルガスモンキー（表XII）における追加研究を
行いインビボ投与sCR1の薬物動力学をさらに特徴づけ
た。各動物は125I標識sCR1のみ（ラットは14−28×106c
pm、モンキーは126−153×106cpm）または非標識（約1m
g/kg）および125I標識sCR1の混合物を単一静脈注射され
た。２−431研究において、非標識sCR1 1mg/kgまたは10
mg/kgの用量もまたモンキーで検査された。血液は、表X
IIに示されたサンプル時間内に、いくつかの時間ポイン
トで各動物から集めた。血液からのsCR1のクリアランス
はラットおよびモンキーにおいて２重相パターンに従っ
た。第１相（α）は分で測定される短い半減期を有し
た。1mg/kgの用量がｔ1/2α＝9.13分および10mg/kg用量
がｔ1/2α＝29分であり、モンキー研究において示され
たようにこの半減期は用量依存であった。第２相（β）
は時間で測定される、より長い半減期を示した（表XII
および第32図参照）。モンキー研究の結果は1.0および1
0mg/kgの用量で単一静脈注射投与に関連してモンキーに
は観察される毒性の臨床サインは全くないことが示され
た。
14.3.sCR1は再潅流された心筋梗塞のラットの梗塞の大
きさを減少する。
本明細書に記載されたように、インビトロの補体経路
C3/C5コンバーターゼの活性を抑制し得たsCR1は、また
インビボのラット心筋梗塞モデル中の再潅流損傷の程度
を軽減し得た。
心筋梗塞は、冠状動脈結紮によりラット中に誘発し得
る。心筋梗塞後の最初の数時間以内に確立された場合、
再潅流は、梗塞の大きさを減少し、左心室機能を改善
し、かつ死亡率を低下することが示されているBraunwal
d,E.及びKloner,R.A.,1985,J.Clin.Invest.76:1713−17
19）。しかしながら、重度に虚血性であるが不可逆的に
損傷されていない心筋の再潅流は、それ自体で損傷を生
じ、拡大することがある。再潅流誘発損傷の原因となる
機構は、酸素を含まないラジカル及び細胞のカルシウム
過負荷により媒介される損傷を含有し得る。単独で、ま
たは微小血管内皮細胞と協力して作用する白血球が、こ
の損傷の原因となることがある。補体活性化が、この過
程に関係することがあるRossen,R.D.ら、1985,Cir.Res.
57,119−130;Craw−ford,M.H.ら、1988,Circulation 7
8:1449−1458）。
14.3.1.ラットにおける補体活性化及び心筋再潅流損傷
のsCR1による抑制 一時的に心筋虚血を起こしてその後再潅流させたラッ
トにsCR1を投与した。虚血性であるが回復できない程の
損傷ではない再潅流心筋の損傷機構は白血球依存性炎症
反応を伴い（Romsonら、1983,Circulation 67:1016;Mar
tinら、1988,Circ.Res.63:483;Kraemer ＆ Mullane,198
9,J.Pharmacol.Exp.Therap.251:620;Littら、1989,Circ
ulation 80:1816;Ambrosioら、1989,Circulation 80:18
46）、この反応は補体の活性化を必要とする（Maroko
ら、1978,J.Clin.Invest.61:661;Crawfordら、1988,Cir
culation 78:1449）。動物を無作為にグループ分けし、
左冠状動脈の縫合結紮による閉塞の直前にリン酸緩衝溶
液のみ（ｎ＝29）または1mgのsCR1を含むリン酸緩衝溶
液（ｎ＝31）をボーラス静脈注射により投与した。35分
後、縫合をゆるめ、胸郭を閉じ、動物をゲージに戻し、
７日後に動物を殺して心筋梗塞を調べた（Weismanら、1
988,Circulation 78:186）;7日の間隔は梗塞の大きさの
信頼できる評価をもたらし、さらに梗塞治癒に対するsC
R1の起こりうる副作用の分析を可能にした。メトキシフ
ルラン麻酔をかけたラットから切除した心臓の大動脈に
カニューレを挿入し、冠状動脈に最初はクレブス−ヘン
セレイト（Krebs Henseleit）溶液を、次いで拡張期停
止のために30mM KClを潅流した。冠状動脈内潅流および
10％緩衝化ホルマリンへの浸漬による固定後、心臓の2m
m横断切片を正常、全梗塞および臓器壁内の梗塞左心室
心筋の領域を計算化することにより組織学的に分析し
た。全スライスの断片的な領域の総計値は心筋梗塞サイ
ズおよび臓器壁内壊死の全壊死に対する割合を計算する
ために用いた。全ての方法および動物の世話は機関のガ
イドラインに依った。緩衝液のみを与えられたグループ
（29中24）およびsCR1処理グループ（31中25）中の生存
率は、冠状動脈結紮直後に対照ラットの１匹以外全てが
死に類似していた。冠状動脈の結紮は次の標準の全てに
合う各グループの22動物につき成功と判断した。すなわ
ち虚血に適合する、すばやい心電図の変化、前方左心室
壁のチアノーゼおよび死後の心筋壊死の組織学的証拠。
構造物はsCR1処理動物中２匹を除いて全てのラットから
放出することに成功した。再潅流を達成してない２ラッ
トを包含する全生存者の分析はsCR1処理が心筋梗塞のサ
イズを対照ラットにおける左心室重量の平均16±２％か
らsCR1グループの９±２％に減少したこと（Ｐ＜0.01）
を示した。臓器壁内梗塞の頻度もまたsCR1処理（25中
６）は対照ラット（24中12）より低かった（Ｐ＜0.0
4）。
sCR1処理した全てのラットからの心臓の４切片を集計
した梗塞シグメントの厚さは、7.8±0.4mmであり、それ
は未処理動物全てのそれ7.3±0.4mmからは有意に異なら
なかったが、ラットのこれら２グループの心臓から、は
るかに離れた非梗塞心室内隔壁のそれよりもわずかに少
なかった（sCR1ラット9.3±0.2mm、未処理ラット9.4±
0.2mm）。またこれら２グループの心室内窩洞サイズに
は違いが全くなかった（sCR1ラット64.9±3.6mm3、未処
理ラット68.9±2.6mm3）。したがって梗塞後１週間の心
臓観察から判断して、sCR1は心筋梗塞サイズを抑制する
が心室拡張を生じたり、心室壁をうすくして治癒のさま
たげとならない。
sCR1による組織損傷の抑制が虚血心筋による補体活性
化の阻害に関連しているかを測定するために緩衝液処理
（ｎ＝７）およびsCR1処理ラット（ｎ＝８）のもうひと
つのグループを同じ虚血再潅流プロトコルにかけて動物
を再潅流３時間後に殺した。心臓を生存している心筋か
ら不可逆的傷害の領域に詳細に記するためにニトロブル
ーテトラゾリウム（NBT）染色（Lillie,R.D.,1965,Hist
opathologic Technic and Practical Histochemistry,M
cGraw−Hill,New York ed:3:378）によりかつラットC5b
−９膜攻撃複合体（Schulzeら、1989,Kidney Int.35:6
0）に対するマウスモノクローナル抗体を有するイムノ
ペロキシダーゼ染色（DeLellis,in Basic Techniques o
f Immunohistochemistry,DeLellis,Ed.,Masson,New Yor
k,1981）により評価した。マウスペロキシダーゼ−アン
チペロキシダーゼ（PAP）系は記載されているように免
疫染色に用いられた。方法の全てのステップでは0.05M
トリス緩衝食塩水中の３回の10分洗浄を先に行った。切
片をアセトンで固定し0.5％H2O2−メタノール溶液で５
分間、４％熱不活性化ヤギ血清で１時間処理した。そし
て続いてそれらを２μg/mlの１次マウスモノクローナル
抗体で18時間、マウス抗体（Organon−Tecknika,West C
hester,PA）へのアフィニティ精製Ｆ（ab′）２ヤギア
ンチ血清で60分間およびマウスPAPで60分間、逐次室温
でインキュベートした。スライドを3,3′−ジアミノベ
ンジジン四塩酸塩で現像しギル（Gill）のヘマトキシリ
ン３で対比染色した。対照ラット（ｎ＝７）のNBT陰
性、梗塞領域において、C5b−９複合体は毛細血管およ
び小動脈の内皮に沿って主に依存したが心筋線維にはな
かった。これた対照的に、示した代表的切片に例示され
るようにsCR1を受けたラットにおいては、NBT陰性領域
はサイズが一貫して減少し、C5b−９複合体はこれらの
領域においてほとんどあるいは全く検出できなかった。
これら一続きの切片における白血球の定量化（Ambros
ioら、1989,Circulation 80:1846）により、対照ラット
の梗塞ゾーン内では、毛細血管および小静脈にほぼ例外
なくmm2当り195±28白血球（150倍率視野;n＝３）ある
ことが明らかとなった。sCR1を受けたラットの心臓から
の相当する切片はmm2（ｎ＝4;P＝0.006）当り83±３白
血球しかなく、補体活性の抑制はこの炎症細胞型の蓄積
の減少に関連していることが示された内皮表面に沿った
C5b−９複合体の局在化は、これらの細胞が虚血心筋へ
の再流入損傷の病理発生において補体活性化の主要な部
であることを示し、冠状動脈閉鎖の24時間後梗塞心筋全
体に補体タンパク質がより拡散して散在しているのと対
照をなしている（McManusら、1983,Lab.Invest.48:43
6）。後者は壊死組織が補体を活性化する能力を単に反
映しているのに対し、前者は虚血性ストレスを受けた内
皮は補体活性機能を獲得することを示している。内皮細
胞による補体活性化はC5aの血管内白血球活性およびCR1
およびCR3を包含する細胞レセプターのそれらの急激な
アップレギュレーションを生じて好中球の虚血心筋への
早期局在化に特に強力な刺激となるであろう（Fearon
＆ Collins,1983,J.Immunol.130:370;Arnaoutら、1984,
J.Clin.Invest.74:1291）。後者のレセプターはCR3,iC3
bのリガンドを担持する補体活性内皮細胞への好中球の
付着を促進することが示されている（Marksら、1989,Na
ture 339:314）。したがって、sCR1による補体活性化の
抑制は明らかに内皮細胞に付着する好中球の数の減少を
説明している。
血栓溶解剤による虚血心筋の再潅流は梗塞のサイズを
減少させ、左心室機能を改善しもし冠状動脈閉鎖の数時
間内に確立されれば死亡率を減少させる（Guerciら、19
87,N.Engl.J.Med.317−1613;ISIS−2 Collaborative Gr
oup,1988,Lancet ii:49;Van de Werf ＆ Arnold,1988,B
r.Med.J.279:1374）。しかしながら再潅流の便益となり
えるものは完全に達成されないかもしれない。なぜなら
極度に虚血であるが不可逆的に損傷のない心筋への再流
入は壊死を誘発するからである（Becker ＆ Ambrosio,1
987,Prog.Cardiovasc.Dis.30:23;Braunwald ＆ Kloner,
1985,J.Clin.Invest.76:713）。壊死と因果関係がある
と考えられる２つの事柄は好中球の血管内蓄積および微
小血管内皮細胞損傷であり（VanBenthuysenら、1987,J.
Clin.Invest.79:265）、両者は補体活性化の結果であ
る。sCR1心筋保護作用の本所見は補体の中心的役割の可
能性の支持し、補体がコブラ毒ファクターから激減して
いる初期の研究を拡張し、血栓溶解療法の組織をたすけ
る可能性を強化する手段を提供する。
14.3.2.結 論 結果はsCR1治療がインビボで再潅流を減少させること
および心筋梗塞の作用を改良することに効果的であるこ
とを示している。再潅流損傷が改善される程度に、救済
された心筋の絶対量は増加し、再潅流が臨床的に有用で
ある時間帯が伸びる。sCR1での治療は次のセクションで
記載されまたは急性梗塞中のふくらんだ冠状血管形成
に、血栓溶解物と有用な同時療法となる。
15.実施例 可溶性補体レセプター１（sCR−１）とｐ−
アニソイル化ヒトプラスミノーゲン−ストレプトキナー
ゼ−アクチベーター複合体（APSAC）の共処方 セクション12.2で記載されているように調製された精
製sCR−１〔滅菌ダルベコリン酸緩衝食塩水中0.93mg,1.
0ml〕を滅菌水（4.0ml）中に復元したAPSACのバイアル
に添加した。APSAC調製物は次のものを含有した。
APSAC: 30単位 Ｄ−マンニトール 100mg ヒト血清アルブミンE.P. 30mg ｐ−アミジノフェニールｐ′−アニセート（anisat
e）HCl 0.15mg Ｌ−リシンHCl 35mg ６−アミノヘキサン酸 1.4mg （全ての数字は通常の分析的な変化を受ける） 溶液をよく混合し、バイアルは固体CO2を用いて−78
℃に凍結した。生成物を２−3mbar/−60℃（圧縮器温
度）で24時間凍結乾燥しバイアルを再び栓して−70℃に
置いた。復元するために、バイアルを0.1Mヘペス、0.15
M NaCl pH7.4（1.0ml）中に溶解し、氷の上に置いた。
アッセイ希釈はこのヘペス緩衝液で作った。対照とし
て、APSACのみ（同じバッチ）のバイアルを同じ方法で
復元し、sCR−１（同じバッチ）の新しく解かしたサン
プルも検査した。試料はセクション13.2.1に記載されて
いる方法に従って補体媒介溶血の阻害をアッセイし、結
果は下の表XIIIに示されている。
表XIIのデータに合わせた曲線は溶血を50％阻害するs
CR−１濃度の値を示しsCR−1/APSACおよびSCR−１のみ
には15.7±3.0mg/mlおよび16.0±2.9ng/mlである。これ
らの数字は異ならず、結果はsCR−１の活性がAPSAC医療
用量形態と共処方により影響されないことを示す。
16.実施例 ヒトCR1のＦ′アロタイプの分子定義、C3b
結合部位を失うことは機能変化と関連している。
ヒトCR1はC3bまたはC4bの別々の結合部位をコードす
る直列の長い相同的くり返し（LHR）部分から成ってい
る。不同の交叉を有する相同的組換えがLHRのそれらの
全数が異なるCR1対立遺伝子を生じる遺伝子メカニズム
として提案されている。Ｆアロタイプは4LHRを有し、
５′から３′へLHR−A,−B,−C,−Ｄと名付けられてい
る。LHR−Ａ中の部位はC4bに優先的に結合し、LHR−Ｂ
および−ＣのそれらはC3bを好む。先の研究はLHR−Ｂと
類似の配列を有する５番目のLHRおよび高分子量のＳア
ロタイプ中の３番目のC3b結合部位の存在を明らかにし
た。本研究において、低分子量Ｆ′アロタイプの発現と
関連している18kb EcoR VフラグメントはcDNAの独特の
パターンおよびLHR−Ｃ特異性イントロンプローブとハ
イブリダイズした。LHR−ＢおよびひとつのC3b結合部位
の欠失はこのＦ′特異的フラグメントが現われるメカニ
ズムとして提案された。Ｆ′アロタイプのSLEとの関連
に関する分子メカニズムは1,2、または３、C3b結合部位
を有する可溶性sCR1の機能的比較により探究された。こ
れら３変異種はモノマーC3bの切断に補因子として作用
するそれらの能力は、どんな有意な違いも現わさなかっ
たが、ダイマーリガンドのそれらの相対的結合は100倍
以上に変化した。さらに、ひとつしかC3b結合部位を有
しない変異種は副経路C3およびC5コンバーターゼの阻害
において少なくとも10倍効果的でなかった。これらの観
察は、Ｆ′アロタイプがオプソニン化免疫複合体と結合
したり、副経路C3およびC5コンバーターゼの形成を阻害
したり、たぶん他のCR1依存性細胞応答を仲介したりす
るその能力を妨害される、ことを示唆している。それら
はまたCR1分子のいくつかの機能はC3b結合部位の結合度
を増大させることにより強化されると明らかにしてい
る。
16.1.序 文 30−50KD増大分で、サイズの異なるCR1の４アロタイ
プ形態を記載している。各アロタイプと関連している転
写物もまた〜1.4Kb増大分で異なることは、それらの第
１次配列がLHRの数において変化することを示している
（Wongら、1983,J.Clin.Invest.72:685;Dykmanら、198
3,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:1698;Dykmanら、1984,
J.Exp.Med.159:691;Dykmanら、1985,J.Immunol.134:178
7;Wongら、1986,J.Exp.Med.164:1531;Holersら、1987,P
roc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:2459）。〜250KDのＦ（ま
たはＡ）アロタイプには4LHRがあり、５′から３′へそ
れぞれLHR−A,−B,−C,および−Ｄ（実施例６および7,
上記;Wongら、1989,J.Exp.Med.169:847）と名付けられ
ている。LHR−Ａの最初の２つのSCRはC4bに結合するそ
の能力を決定するが、LHR−Ｂおよび−Ｃの相当する構
成部分はC3bに対するそれらの高い親和力を決定する
（上記、実施例９。ゲノムファージクローンの制限地図
により〜290Kdのラージャー（larger）Ｓ（またはＢ）
アロタイプをコードする遺伝子の分析により、５′半分
がLHR−Ｂで３′半分がLHR−Ａのキメラであり３番目の
C3b結合部位を含有すると予測される５番目のLHRが明ら
かにされた（Wongら、1989,J.Exp.Med.169:847）。SLE
の患者に発生率増加が見られ、多発性狼瘡家庭の患者に
関連している、〜210KDのCR1の最小Ｆ′（またはＣ）ア
ロタイプは（Dykmanら、1984,J.Exp.Med.159:691;Van D
yneら、1987,Clin.Exp.Immunol.68:570）1LHRの欠失か
ら生じたものであり、補体フラグメントでコートされて
いる免疫複合体に効率的に結合するその能力が妨害され
る。下記に示されたデータは各LHRに特異的にイントロ
ンプローブを用いてＦ′対立遺伝子の分子的基礎を明確
にしこのアロタイプを発現する個人に存在するCR1のEco
R V制限断片長多型（RFLP）を分析する。Ｆ′アロタイ
プのSLEとの明らかな関連に関しての説明を提供するた
めに、1,2、または３、C3b認識部位を有し、Ｆ′,F,Sア
ロタイプそれぞれの予測構造に相当する可溶性sCR1変異
種をダイマーリガンドに結合したり、C3bの切断に補因
子として作用したり、副および主経路C3およびC5コンバ
ーターゼを阻害する、それらの能力を比較した。
16.2.材料および方法 DNAの分析 ゲノムDNAを末梢血液白血球から調製しEcoR Vで消化
し、電気泳動し以前記載されているようなサザンブロッ
トにより分析した（Wongら、1989,J.Exp.Med.164:153
1）。CR1 cDNAプローブ１−１はLHR全てのSCR−４から
−７にハイブリダイズするが、プローブ１−４はLHR−
Ｂおよび−ＣのSCR−１および−２に特異的にハイブリ
ダイズする（Klicksteinら、1987,J.Exp.Med.165:1095;
Klicksteinら、1988,J.Exp.Med.168:1699,Wongら、198
9,J.Exp.Med.169:847）。非コードプロープPEは、LHR−
Ｂおよび−ＣのSCR−２をコードする２エクソン間のイ
ントロンとハイブリダイズする。PXはLHR−Ａおよび−
ＢのSCR−６をコードする２エクソン間のイントロンに
ハイブリダイズし、HEはLHR−Ａおよび−ＢのSCR−７の
５′側イントロンにハイブリダイズする（Wongら、198
9,J.Exp.Med.169:847）（Fig.34）。Ｆ対立遺伝子が同
型接合である個人のDNA由来のゲノムライブラリーのCR1
クローンを全コード配列にまたがるcDNAプローブへのハ
イブリダイゼーションによりスクリーンした。Ｆ対立遺
伝子にまたがる重複するファージクローンの制限地図作
成は以前記載（Wongら、1989,J.Exp.Med.169:847）され
ているように行った。
発現プラスミドの構築および可溶性sCR1の精製 LHR−ＡのSCR−ＲからLHR−Ｂの相当する位置まで及
ぶPst IフラグメントをCR1のＦアロタイプの完全なコー
ド配列を含有するプラスミドpBSABCDから単離した（上
記実施例8.1）。これをPst Iの部分消化により線状化し
たpiABCD（上記、実施例8.2）に挿入し、LHR−Ｂのそれ
と同一のコード配列を有する５番目のLHRの創出した。
インフレーム挿入物を有するpiABBCDと名付けられたク
ローンを制限地図より選択し、全細胞外ドメインをコー
ドする部分をXho IおよびApaL I消化により切断しクレ
ノーDNAポリメラーゼで処理した。平滑末端フラグメン
トをリンカー５′−TGAGCTAGCTCA−３′とリゲートし、
Nhe Iで消し、CDM8由来物、発現ベクターAprM8のXba I
部位に挿入した（Seed,1987,Nature 329:840）。pasecA
BBCDと名付けたこのプラスミドは第37番目得SCRの後に
挿入したストップコドンを有し、トランスメンブレンお
よび細胞質ドメインをコードする配列を欠いている。プ
ラスミドpasecABCDは、類似の方法を用いてpBSABCDから
Ｆアロタイプの4LHRをAprM8に転移することにより作成
された。3LHRだけを含有しpasecACDと名付けられた３番
目のプラスミドは、LHR−ＡのSCR−５からLHR−Ｂの相
当する位置にまで及ぶPst Iフラグメントのインフレー
ム欠失により作成された。上記プラスミドのおのおの30
−60μｇは高グルコースおよび10％Nuserum（Collabora
tive Research,Bedford,MA）を有するダルベッコ改変イ
ーグル培地（DMEM）（Hazelton,Lenexa,KS）中で400μg
/ml DEAEデキストランおよび100μＭクロロキンの存在
下で、37℃、４時間２×107COS−１細胞（American Typ
e Culture Collection,Rockville,MD）をトランスフェ
クトするのに用いた。トランスフェクション培地を取り
除いた後、細胞に室温で二価カチオンなしのHBSS中の10
％DMSOで３分間ショックを与え（Ausubelら、1987,in C
urrent Protocols in Molecular Biology,John Wiley
＆ Sons and Greene Assoc.,New York）、洗浄しDMEMお
よび10％FCS中で培養した。培養上清を48時間毎に10日
間収集し遠心により細胞断片を取り除き−70℃にて凍結
した。上清を解かし、PMSFおよびアジ化ナトリウムをそ
れぞれ最終濃度5mMおよび0.2％になるように添加し、洗
剤は溶出緩衝液から省いたことを除いては（Wongら、19
85,J.Immunol.Meth.82:303;Example 12.2.1,supra）記
載されているようにアフィニティクロマトグラフィーに
よりmAb YZ−１−Sepharoseで精製した。精製タンパク
質は1000倍量のPBSで２回透析し、小さなアリクォート
中、−70℃で凍結した。この方法は、BSAを標準として
用いたMicro BCAキット（Pierce,Rockford,IL）により
決定されたようにsCR1 150−200μｇを通常産出した。
タンパク質をSDS−PAGEにより５％−15％アクリルアミ
ドの線勾配を含有するゲルで分析した。
sCR1の補助因子活性 精製ヒトC3（Tack ＆ Prahl,19
76,Biocehmistry 15:4512）を37℃で５分間0.5％TPCK−
トリプシン（Sigma,St.Louis,MO）で処理し、４倍モル
過剰の大豆トリプシン阻害剤を添加することにより反応
停止した。Iodogen（Pierce,Rockford,IL）を用いて５
×105の比放射能となるまでC3bを125Iで標識した。C3B
200ng,インシI 100ng（Fearon,1977,J.Immunol.119:124
8）を種々の量の20ul PBS中のsCR1とともに37℃で１時
間インキュベートすることによりsCR1の補助因子活性を
測定した（Wong等、1985,J.Immunol.Meth.82:303;実施
例11,上記）。0.1Mジチオスレイトールを含有するSDS−
PAGE試料緩衝液等量中で試料を煮沸することにより反応
を停止した。電気泳動およびオートラジオグラフィーの
後、α′鎖の位置に相当する乾燥ゲルの領域を切除し、
放射能の量をBeckmanのガンマカウンターで測定した（W
ong等、1985,J.Immunol.Meth.82:303）。CR1非存在下の
α′鎖に関連する計数を100％対照として採用した。
２量体C3bを結合するsCR1の容量 C3bをジメチスペリ
ミデート（Sigma,St.Louis,MO）（Wilson等、1982,New
Engl.J.Med.307:981）または1,6−ビスマレイミドヘキ
サン（Pierce,Rockford,IL）（Weisman等、1990,Scienc
en 249:146）で架橋し、PBS中4.5％〜30％スクロースの
一次勾配で沈降させることにより２量体を選択した（Wi
lson等、1982,New Engl.J.Med.307:981）。何れの方法
でも１〜３×108M-1の範囲の会合定数（Ka）で赤血球CR
1と結合した２量体が得られた。125I−C3b 2量体300ng
（４×106cpm/ug）を、漸増量の未標識の単量体または
２量体のC3bまたは異る可溶性形態のsCR1の存在下また
は非存在下、0.1％BSAを含有するHBSS200ul中で、２×1
08の赤血球とともにインキュベートした（Weisman等、1
990,249:146）。氷上１時間の後、ジブチルフタレート
を通して赤血球を遠心分離することにより、細胞結合リ
ガンドを非結合物質から分離した（Wilson）等、1982,N
ew Engl.J.Med.307:981）。過剰ウサギIgG抗CR1の存在
下で結合した２量体C3bの量を非特異的バックグラウン
ド値として採用し、何れの阻害剤も存在しない場合に結
合した特異的計数を100％対照として採用した。これ等
全ての結合試験について、１人の正常な個体から採取し
た赤血球を使用した。これらの細胞はＦアロタイプにつ
いてホモ接合であり、比較的大量のCR−１を有していた
（−800YZ−1mAB結合部位）。
代替えおよび従来の経路転化酵素の阻害 代替経路の
活性化を評価するために、漸増量のsCR1の非存在下また
は存在下で、2mM MgCl2および8mM EGTAとともにVeronal
緩衝食塩水中で５×106チモサン粒子（Dr.Joyce Czop,H
arvard Medical School,Boston,MA提供）と供に25％ヒ
ト血清をインキュベートした。従来の経路の活性化を評
価するために、熱凝集ウサギIgG60ug/mlをチモサンと置
き換え、0.5mM MgCl2および0.15mM CaCl3と供にVeronal
緩衝食塩水中で反応を行なった（Weisman等,1990,Scien
ce 249:146）。37℃で40分間インキュベートした後、10
mM EDTAを添加することにより反応を停止し、ラジオイ
ノムアッセイキット（Amersham,Chicago,IL）を用いてC
3aおよびC5aの分解の量を測定した。
16.3.結 果 CR1のＦ′アレルの構造 CR1の−210kDのＦ′アロタ
イプを発現した個体のDNAをEcoR Vで消化した場合にCR1
cDNAプローブ１−１を用いたサザンブロットのプロー
ブで18kbの断片が更に観察されたことを以前報告した
（Wong等、1986,J.Exp.Med.164:1531）（図33）。この
プローブは本来LHR−Ｂ内のSCR−３〜SCR−７に由来す
るものであるがその配列は他のLHRの４〜７番目にハイ
ブリダイズするのに十分な相同性を有していた（実施例
６および７、上記;Klickstein等、1987,J.Exp.Med.165:
1095;Klickstein等、1988,J.Exp.Med.168:1699;Wong
等、1989,J.Exp.Med.169:847）。各断片をあるLHRに割
り付けるために、Ｆアレル全体に渡る重複ゲノミックク
ローンのEcoR V地図を調べた（図34）。9.4kbおよび22k
bの断片がそれぞれLHR−Ａおよび−Ｄから推定されるも
のに相当した。これはイントロンプローブPXおよびHEへ
9.4kb断片はハイブリダイズできるが22kb断片はできな
いことにより確認された（図33）。LHR−ＢにはEcoR V
部位は存在しないため、全てのプローブにハイブリダイ
ズしたプロットの最上部の最大の断片がLHR−Ｂおよび
殆どのLHR−Ｃに渡る−32kb断片を示した（図33および3
4）。以前報告したCR1様の偽遺伝子（Wowg等、1989,J.E
xp.Med.169:874）に渡るゲノミッククローンの制限酵素
地図により、20kbおよび15kbの断片はこの領域に由来す
るものであることがかる（第33）。
Ｆ′アロタイプの発現に係わる18kb EcoR V断片はcDN
Aプローブ１−４およびイントロンプローブPEにハイブ
リダイズされ、これがLHR−Ｂおよび−Ｃの５′側半分
を含むことが示された。この断片はイントロンプローブ
PXおよびHEにはハイブリダイズされなかったため、LHR
−Ｂの３′側半分を欠損していることが示された（図3
3）。LHR−Ｂまたは−32kb EcoR V断片由来の同様の長
さの別の断片の欠失は、LHR−Ａの最も３′側のEcoR V
部位からLHR−Ｃの最も５′側のEcoR V部位に伸びる18k
bの断片をもたらす（図34）。このような断片はプロー
ブ１−4,PEおよび１−１にのみハイブリダイズされ、図
33の結果と合致する。LHR−ＢのPXおよびHE部位を含む
いずれの−15kbの欠失も必然的にLHR−Ｂまたは−Ｃの
何れかのC3b結合部位を含む、クソン少なくとも１つ含
むため、得られる３個のLHRのアレルは１つのC3B結合部
位のみをコードする。
プラスミドの構築および可溶性sCR1の精製 オプソニ
ン作用を受けた免疫複合体または多量体のリガンドに対
するCR1アロタイプの親和性の直接の比較は、Ｆ′アロ
タイプに対してホモ接合性の個体が発見されていないた
め、行なわれてない。完全なCR1およびcDNAの配列およ
びゲノム分析の結果を用いることにより、種々の多形性
変異体について予測された構造を有するsCR1を作成する
ことができた。C3b 2量体との２価の相互作用について
各アロタイプの個々のCR1分子の容量を評価するため
に、最も３′側のSCRの末端と膜間ドメインの開始部の
間に停止コドンを挿入することにより、可溶性CR1に対
するcDNAの構築を行なった。この方法により、２量体C3
bと膜結合CR1の離れて隣接する分子との間の相互作用の
可能性を排除できる。更に、可溶性CR1の使用により、
膜由来調製物の可溶性を維持するために必要な洗剤によ
る酵素検定における干渉作用の可能性を無くすることが
できる。LHRの挿入または欠失のために用いる方法は読
み枠を温存するために保存された制限酵素部位を利用し
ている。挿入される、または欠失するPst I断片はLHR−
ＡのSCR−5,−6,−７およびLHR−ＢのSCR−1,−2,−３
および−４をコードしていた（図35）。３番目〜７番目
のSCRのアミノ酸配列はLHR−Ａおよび−Ｂにおいて同一
であるため（図35）（実施例６および７、上記）、これ
らの方法によりLHR−Ｂと等しい配列の挿入または欠失
が行なわれる。従ってプラスミドpasecACD、pasecABCE,
およびpasecABBCD（図35）は１つ、２つまたは３つのC3
b結合部位をそれぞれ有するような蛋白をコードする。
可溶性組換体CR1は、CR1プラスミドでトランスフェク
ションされたCOS細胞の培養上澄みからYZ−１−セファ
ロース上のクロマトグラフィーにより単離した。各sCR1
蛋白は95％を超える純度を有しており、３つの形態は、
天然のアロタイプで観察されるものと同様に、SDS−PAG
E上で非還元条件下で−30kbで漸増するMr差を示した
（図35）。ベクターAprM8のみでトランスフェクション
したCOS細胞の26S−システインによる生合成標識では、
YZ−１セファロースへのCR1様蛋白の吸収を示さなかっ
た。更に、可溶性sCR1は、125I標識赤血球から単離され
たCR1と同様のMrを有しており、これは各分子から僅か7
0のアミノ酸が欠失していたことと合致していた。pasec
ABBCD−またはpasecABCDでトランスフェクションした細
胞から単離されたsCR1を含有するレーン内には、より小
さい形態と同様のMrを有する蛋白少量が観察された（レ
ーン２および３）。これらは、トランスフェクションさ
れたCOS細胞内に自然発生した相同組換産物を表わして
いる。
sCR1の補助因子活性 放射標識C3bをiC3bおよびC3dg
断片に転換した補助因子検定において種々の形態のsCR1
の機能的統合性を測定した。C3bのα′鎖の50％因子Ｉ
媒介分野に必要なsCR1の量は、pasecABBCD由来蛋白で3.
5nM〜pasecACD由来蛋白で8nMであり、３つの形態の差は
僅かであった（図37）。更に、C3bからC3dgへの変換は1
0nM〜20nMの全ての形態のsCR1の添加で認められた。即
ち、可溶性組換体CR1は、C3bc結合部位の数に関係な
く、C3bに結合する天然の分子の容量を保持しており、
因子Ｉ分解のための補助因子として作用した。
２量体C3bに結合するsCR1の容量 C3bコーティング標
的の結合に対する異なる数のLHR−Ｂを有することの作
用を評価するために、sCR1変異体を用いて赤血球CR1に
よる125I−C3b 2量体の取り込みを阻害した。50％阻害
に必要な濃度はリガンドまたは細胞の結合受容体の何れ
かの相対的結合を反映していた。図38に示す実験におい
て、未標識のC3b 2量体10nMが125I−C3b 2量体と赤血球
CR1との間の相互作用の50％阻害に必要であった。単量
体C3bと受容体の相互作用はかなり弱く、同様の阻害を
達成するためには、1uMまたは100倍を超えるこのリガン
ドが必要であった（図38）。この単量体相互作用の低い
結合性は、２量体C3bリガンドによる可溶性CR1の２つの
異なる分子の架橋がこれらの条件下では望ましくなく、
２つの分子内結合部位の占有が有効な拮抗には必要であ
ることを示している。この２価の相互作用は、50％阻害
のためにはpasecABCDおよびpasecACDに由来するsCR1が
それぞれ10nMおよび100nM必要であることにより確認さ
れた。興味深いことに、３つのC3b結合部位を有するpas
ecABBCD由来sCR1の僅か1nMが同様の作用のために必要で
あった（図38）。即ち、１つ、２つまたは３つのC3b結
合部位を有する可溶性CR1形態はその２量体C3bの結合性
においては異っていたが、因子Ｉ分解の基質として使用
したこのリガンドの単量体形態については異なっていな
かった（図37）。
代替および従来の経路添加酵素の阻害 チモサンまた
は凝集IgGとともにヒト血清をインキュベートした差異
に遊離するC3aおよびC5aを測定することにより、代替お
よび従来の経路添加酵素をブロックする可溶性CR1変異
体の容量を比較した。代替経路C3およびC5の転化酵素の
両方の50％阻害を達成するために僅か１〜2nMのpasecAB
BCDまたはpasecABCDに由来するsCR1が必要であったのに
対し、同様の作用をえるためにpasecACDのsCR1は30倍を
超える濃度が必要であった（図39Aおよび40A）。これ
は、sCR1変異体がC5転化酵素内のC3bホモ２量体と異る
ように結合するという上記予測と合致していた（Kinosh
ita等、1988,J.Immunol.141:3895）。C3点か酵素でも同
様の作用がみとめられたことは、プロペルジン安定化C3
bBb複合体に関わるC3bの複数の分子の存在を示してい
た。対照的に、sCR1の変異体の間で従来の経路C3および
C5の転化酵素を阻害する容量には差が観察されず（図39
Bおよび40B）、これらが同様にC5転化酵素のC4bC2a複合
体またはC4b/C3bヘテロ２量体内のC4b分子に結合したこ
とを示していた（Takata等、1987,J.Exp.Med.165:149
4）。更にpasecACD由来分子を除き、代替経路と比較し
て従来の経路の酵素を阻害するためには２〜10倍より高
濃度の組み換えCR1が必要であり、これはおそらくはC4b
含有転化酵素に対するsCR1の低い結合性を反映している
と考えられた。
16.4.考 察 ヒトCR1の各多形性変異体の各々は異る数のLHRでコー
ドされていることは、各アロタイプに関わる転写におけ
る−1.3kbの差により予測されている（Wong等、1986,J.
Exp.Med.164:1531;Holers等、1987,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA.84:2459）。CR1遺伝子の異るLHRのコード領域の
相同性と相当する非コード領域の相同性の間の平行性に
より、ゲノミッククローンの制限酵素地図に基づいてコ
ード配列を予測することが可能になった。即ち、LHR−
Ｂに似た５′側半分およびLHR−Ａに似た３′側半分に
有するＳアレルにおける５番目のLHRはＳアロタイプ内
のC3bに対する３番目の結合部位をコードしていると予
測された（Wong等、1989,J.Exp.Med.169:847）。他の19
の酵素の内EcoR Vは、Ｆ′アロタイプに関わるRFLPを明
らかにした唯一の制限酵素であるため（Wong等、1989,
J.Exp.Med.164:1531）、このアレル内の欠失は明らかに
高度な相同性を有する領域に関与していた。本試験にお
いて、18kbのEcoR V断片が、LHR−Ｃに特異的にエクソ
ンおよびイントロンに由来するプローブの組合せにより
ハイブリダイズされたＦ′アロタイプを発現した個体に
関わるものであった（Wong等、1989,J.Exp.Med.164:153
1）。このパターンは１つのC3b結合部位の損失をもたら
すLHR−Ｂまたは同等の領域の欠失とのみ合致してい
た。18kb断片の現われがLHR−Ｂまたは−Ｃに由来する
−30kb断片のサザンブロット上の消失を伴っていたこと
は、Ｆ′アレルに対してホモ接合性の個体を比較のため
得ることができなかったため、確認できなかった。この
アロタイプに対するより小さい転写物は代替のスプライ
シングを通じて表われると考えられるが（Wong等、198
6,J.Exp.Med.164:1531;Holers等、1987,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA.84:2459）、これらの機構は観察されたEcoR
V RFLPを説明できない。
SLE8とのＦ′アロタイプの関わりは、オプソニン作用
を受けた免疫複合体に結合するこの変異体の容量が低減
しているという示唆と合致している（Dykman等、1984,
J.Exp.Med.159:691;Van Dyne等、1987,Clin.Exp.Immuno
l.68:570）。LHR−Ｂの数の異るsCR1の官能基容量を比
較した。最近の試験における可溶性CR1によるC3b 2量体
取り込みの効果的な拮抗は直列結合部位の占有が起こる
ことを示し（Weisman等、1990,Science 249:146）、即
ち、この２価のリガンドに対して各受容体分子の結合を
直接評価することが可能になった。我々の方法は、挿入
された停止コドンの部位、および、LHR−Ｂを１つまた
は２つ有するか有さないCR1分子をコードするプラスミ
ドで一時的にトランスフェクションしたCOS細胞の培養
上澄みから精製した可溶性CR1の使用の両方において、
異っている（図35）。赤血球への放射標識２量体C3bの
結合を50％阻害するために必要な単量体または２量体の
C3bおよびpasecABCD由来の組み替えCR1の量は過去に報
告されたものと極めて近いものであった（Weisman等、1
990,Science249:146）。更に、２量体C3bに対する精製s
CR1の結合性は、各C3b結合部位の添加により10倍増大
し、pasecACDまたはpasecABBCDに由来するsCR1分子の間
には100倍の差が生じた（図38）。LHR−Ａ内のC4b結合
部位がC3bに対する低い親和性を保持しているという以
前の観察結果と矛盾することなく（Klickstein等、198
8,J.Exp.Med.168:1699）、LHR−Ａおよび−Ｃのみを有
するpasecACD由来sCR1は、放射標識２量体の取り込みの
ブロックにおいてC3b単量体よりもより効果的であった
（図38）。pasecABCD由来分子と比較してpasecABBCD由
来CR1に対してより高い結合性が観察されたことも同様
に、２対の結合部位の拡大を示唆しており（図38）、ま
た、このようなLHRの直鎖配列には多価の相互作用が好
ましいという以前の仮説を確認するものであった（Klic
kstein等、1988,J.Exp.Med.168:1699;Wong等、1989,J.E
xp.Med.169:847）。単量体C3bに対するCR1の結合性は比
較的低いため（図38）、本試験（図37）および他の試験
（Seya等、1985,J.Immunol.135:2666）において種々のs
CR1形態の補助因子容量における見かけの差が無いこと
は、使用した条件には単量体リガンドによる１つより多
い活性部位の同時占有が適さなかったことを示してい
る。
代替経路C3およびC5の転化酵素をブロックする可溶性
CR1変異体の有効性における差は、C3bホモ２量体に対す
るそれらの親和性が異ることと合致する（Kinoshita
等、1988,J.Immunol.141:3895）。実際に、本検定にお
いて、２つ以上のC3b結合部位を有するsCR1変異体は、
１つのみの部位を有するものよりも、少なくとも30倍よ
り有効であった（図39Aおよび40A）。しかしながら、pa
secABBCD由来sCR1は、その結合性は液相検定ではかなり
高値であった（図38）ものの、pasecABCD由来のものほ
ど有効ではなかった（図39Aおよび40A）。即ち、本検定
における最大容量は活性化表面上の転化酵素部位の地形
学的分布により制限されると考えられる。試験したこれ
らの変異体の全てはC4bでは１つの部位、そしてC3bにつ
いては少なくとも１つの隣接部位を保持していたため、
その構造は、それらが従来の経路の転化酵素を阻害する
容量が同等であることと合致している（図39Bおよび40
B）（Takata等、1987,J.Exp.Med.165:1494）。我々の観
察結果と別の試験の結果との間の差は、前により安定性
の低い液相の転化酵素を使用したことや精製形態のかわ
りにＦ（またはＡ）およびＦ′（またはＣ）のアロタイ
プの混合物を使用したこと（Seya等、1985,J.Immunol.1
35:2661）により説明されるであろう。また、その試験
で使用されたＦ′変異体は異る組成のLHRを有していた
ことからも説明されている。
CR1による免疫複合体の取り込みの効率は赤血球上の
この受容体の集団形成により増強される（Paccaud等、1
988,J.Immunol.141:3889;Chevalier ＆ Kazatchkine,19
88,J.Immunol.142:2031）、少ないCR1の数を有する個体
のこの受容体の集団はより少なく、または集団当りの受
容体分子数もより少ない（Paccaud等、1988,J.Immunol.
141:3889）。即ちSLE患者にはＦ′アロタイプおよび少
量のCR1が存在する結果、C3bおよびC4bの結合部位の総
量が少なく、そして循環系からの免疫複合体のクリアラ
ンスの効率が低くなる（Dykman等、1984,J.Exp.Med.15
9:691;Van Dyne等、1987,Clin.Exp.Immunol.68:570;Wil
son等、1987,Immunol.Res.6:192;Miyakawa等、1981,Lan
cet ii:493;Schifferli等、1988,J.Immunol.140:89
9）。従来の経路の転化酵素で観察されたsCR1の低い親
和性（図39および40）は、可溶性免疫複合体上に付着す
るC4bおよびC3bの相対量がCR1依存取り込みおよびプロ
セシングにとって重要であることを示している。いくつ
かの条件下で好中球内に予備集団形成したCR1が存在し
ないこと（Paccaud等、1990,Eur.J.Immunol.20:283）
は、受容体の凝集を誘発する機構が有核細胞内の生物学
的反応を開始させるために重要であることを示唆してい
る（Daha等、1984,J.Immunol.132:1197;Bacle等、1990,
J.Immunol.144:147）。より短いCR1アロタイプはこのよ
うな相互作用の効率を更に低下させ、そして組織炎症部
位における受容体媒体細胞応答の傷害をもたらすと考え
られる。
17.微生物の寄託 完全な長さのCR1タンパク質をコードするプラスチッ
クpiABCD（pCR1−piABCDと称する）を担持する大腸菌DK
1/P3を、イリノイ州PeoriaにあるAgricultural Researc
h Culture Collection（NRRL）に1988年３月31日に寄託
し、登録番号Ｂ−18355を指定された。
可溶性CR1分子をコードするプラスミドpBSCR1c/pTCSg
ptクローン35.6を担持するチャイニーズハムスター卵巣
細胞系DUX B11を、メリーランド州、RockvilleにあるAm
erican Type Culture Collection（ATCC）に1989年３月
23日に寄託し、登録番号CRL10052を指定された。
本発明は、寄託された微生物により範囲を限定される
べきではない。何となれば、寄託された実施態様は本発
明の一つの特徴の単なる例示として意図され、機能的に
同等である任意の微生物が本発明の範囲内にあるからで
ある。実際に、本明細書に示され説明されたものの他
に、本発明の種々の改変が、上記の説明及び添付図面か
ら当業者に明らかになる。このような改変は、請求の範
囲の中に入ることが意図される。
また、ヌクレオチドに関して示された全ての塩基対の
大きさは概略であり、説明の目的で使用されることが理
解される。
種々の文献が本明細書中に引用されており、その開示
はそのまま参考として含まれる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (73)特許権者 999999999 アヴァント イムノセラピューティク ス，インコーポレーテッド アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02139，ケンブリッジ，シドニー スト リート 38 (72)発明者 フェアロン，ダグラス，ティ. アメリカ合衆国 メリーランド州 21210，ボルチモア，ブリテウッド ロ ード ２ (72)発明者 クリックステイン，ロイド，ビー. アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02146，ブルックリン，アパートメント ８，セントポール ストリート 32 (72)発明者 ウォング，ウィニー，ダブリュ. アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02159，ニュートン，パーカー ストリ ート ９ (72)発明者 カーソン，ジェラルド，アール. アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02181，ウェルスレイ，ウェルスレイ カレッジ，ホウ マッカピー （番地な し) (72)発明者 コンチーノ，マイケル，エフ. アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02159，ニュートン，アセルステイン ロード 76 (72)発明者 イプ，ステファン，エイチ. アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01776，サドバリー，シンギング ヒル サークル 11 (72)発明者 マクリッズ，サバス，シー. アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01730，ベッドフォード，フレッチャー ロード 37 (72)発明者 マーシュ，ヘンリー，シー．，ジュニ ア. アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01867，リーディング，ハイストリート 218 (56)参考文献 Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．168, Ｐ．1255−1270（1988) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 A61K 38/00 A61P 7/02 A61P 9/10 C07K 14/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（１）実質的に図１に示されるアミノ酸配
    列を含み、且つ膜貫通領域が欠けている、可溶性補体レ
    セプター１型（sCR1）分子、又は全長補体レセプター１
    型分子の生理活性を保持しているその断片、及び（２）
    血栓溶解剤を、それぞれヒト又は他の動物の血栓性病態
    の治療法に組合わせて使用するのに有効な量で含む組成
    物。
  2. 【請求項２】前記可溶性補体レセプター１型分子又はそ
    の断片が、 （ａ）C3b結合； （ｂ）C4b結合； （ｃ）C3b結合及びC4b結合； （ｄ）ファクターＩコーファクター活性； （ｅ）C3コンバーターゼの阻害； （ｆ）C5コンバーターゼ活性の阻害； （ｇ）in vitroにおけるC3a又はC5a産生の阻害； （ｈ）in vitroにおける好中球酸化的バーストの阻害；
    及び （ｉ）in vitroにおける補体仲介溶血の阻害 からなる群より選ばれる生理活性を有する、請求項１記
    載の組成物。
  3. 【請求項３】可溶性補体レセプター１型分子が、pBSCR1
    s,pBM−CR1c,pBSCR1s/pTCSgpt,pT−CR1c1,pT−CR1c2,pT
    −CR1c3,pT−CR1c4及びpT−CR1−c5からなる群から選ば
    れる核酸ベクターによりコードされる、請求項１記載の
    組成物。
  4. 【請求項４】アミノ酸配列が、ATCCに受託番号CRL10052
    により寄託されている細胞系に含まれている、核酸ベク
    ターpBSCR1c/pTCSgptによりコードされる、請求項１記
    載の組成物。
  5. 【請求項５】（１）可溶性補体レセプター１型分子又は
    全長補体レセプター１型分子の生理活性を保持している
    その断片、及び（２）血栓溶解剤を、それぞれヒト又は
    他の動物の血栓性病態の治療法に組合わせて使用するの
    に有効な量で含む組成物。
  6. 【請求項６】（１）核酸ベクターpBSCR1c/pTCSgpt（ATC
    C受託番号CRL10052）によりコードされるアミノ酸配列
    を有する可溶性補体レセプター１型分子、及び（２）血
    栓溶解剤を、それぞれヒト又は他の動物の血栓性病態の
    治療法に組合せて使用するのに有効な量で含む組成物。
  7. 【請求項７】請求項１記載の組成物及び医薬上許容可能
    な担体又は賦型剤を含む、ヒト又は他の動物の血栓性病
    態又は心筋梗塞治療のための医薬組成物。
  8. 【請求項８】（１）実質的に図１に示されるアミノ酸配
    列を含み、且つ膜貫通領域が欠けている、可溶性補体レ
    セプター１型分子（sCR1）、又は全長補体レセプター１
    型分子の生理活性を保持しているその断片を第１コンテ
    ナーに、そして（２）血栓溶解剤を第２コンテナーに含
    み、それぞれヒト又は他の動物の血栓性病態の治療法に
    組合せて使用するのに有効な量である、血栓性病態の治
    療に用いるための医薬パック。
  9. 【請求項９】（１）可溶性補体レセプター１型分子又は
    全長補体レセプター１型分子の生理活性を保持している
    その断片を第１コンテナーに、そして（２）血栓溶解剤
    を第２コンテナーに含み、それぞれヒト又は他の動物の
    血栓性病態の治療法に組合せて使用するのに有効な量で
    ある、心筋梗塞治療に用いるための医薬パック。
  10. 【請求項１０】（１）核酸ベクターpBSCR1c/pTCSgpt（A
    TCC受託番号CRL10052）によりコードされるアミノ酸配
    列を有する可溶性補体レセプター１型分子を第１コンテ
    ナーに、そして（２）血栓溶解剤を第２コンテナーに含
    む、請求項８または９記載の医薬パック。
  11. 【請求項１１】前記血栓溶解剤が （ａ）プラスミノーゲンアクチベーター又はそのムテイ
    ン； （ｂ）アニソイル化プラスミノーゲン−ストレプトキナ
    ーゼ−アクチベーター複合体； （ｃ）一本鎖ウロキナーゼ； （ｄ）二本鎖ウロキナーゼ； （ｅ）ストレプトキナーゼ； （ｆ）線維素溶解活性に必須の触媒部位を有するよう
    に、第２の二本鎖プロテアーゼの１つの鎖に結合した第
    １の二本鎖プロテアーゼの１つの鎖を含む線維素溶解活
    性ハイブリッドタンパク質であって、触媒部位が除去可
    能なブロック基で任意にブロックされている前記ハイブ
    リッドタンパク質；及び （ｇ）可逆的に保護されたin vivo線維素溶解酵素であ
    って、前記酵素中の線維素溶解活性に必須の触媒部位
    が、加水分解の擬一次反応速度定数がpH7.4、37℃の等
    張水溶液中で10-6/秒〜10-3/秒の範囲となるような速度
    で加水分解により除去できる基によってブロックされて
    いる前記酵素 からなる群より選ばれる、請求項１〜７のいずれか１項
    に記載の組成物。
  12. 【請求項１２】前記血栓溶解剤が （ａ）プラスミノーゲンアクチベーター又はそのムテイ
    ン； （ｂ）アニソイル化プラスミノーゲン−ストレプトキナ
    ーゼ−アクチベーター複合体； （ｃ）一本鎖ウロキナーゼ； （ｄ）二本鎖ウロキナーゼ； （ｅ）ストレプトキナーゼ； （ｆ）線維素溶解活性に必須の触媒部位を有するよう
    に、第２の二本鎖プロテアーゼの１つの鎖に結合した第
    １の二本鎖プロテアーゼの１つの鎖を含む線維素溶解活
    性ハイブリッドタンパク質であって、触媒部位が除去可
    能なブロック基で任意にブロックされている前記ハイブ
    リッドタンパク質；及び （ｇ）可逆的に保護されたin vivo線維素溶解酵素であ
    って、前記酵素中の線維素溶解活性に必須の触媒部位
    が、加水分解の擬一次反応速度定数がpH7.4、37℃の等
    張水溶液中で10-6/秒〜10-3/秒の範囲となるような速度
    で加水分解により除去できる基によってブロックされて
    いる前記酵素 からなる群より選ばれる、請求項８〜10のいずれか１項
    に記載の医薬パック。
  13. 【請求項１３】血栓性病態の治療のための、請求項７記
    載の組成物の使用方法。
  14. 【請求項１４】心筋梗塞の治療のための、請求項７記載
    の組成物の使用方法。
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