TW201730211A - 抗因子d抗體及結合物 - Google Patents

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惠妮 沙茨
戴文 泰瑟
賈斯汀 Ｍ 舍爾
蜜雪兒 狄昂
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建南德克公司
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Abstract

本發明提供抗因子D抗體及結合物及使用該等抗因子D抗體及結合物之方法。

Description

抗因子D抗體及結合物
本發明係關於抗因子D抗體及結合物及使用該等抗因子D抗體及結合物之方法。
補體系統在清除免疫複合體及對感染劑、外來抗原、病毒感染之細胞及腫瘤細胞之免疫反應中起主要作用。然而，補體係亦涉及病理炎症及自體免疫疾病。因此，抑制補體級聯過度的及失控的活化作用提供給患有此等疾病及病症之病患臨床利益。
補體系統包含三種不同活化途徑，命名為經典途徑、甘露糖結合凝集素途徑及替代途徑。V.M.Holers In Clinical Immunology：Principles and Practice，R.R.Rich編，Mosby Press；1996,363-391。該經典途徑係鈣/鎂依賴性級聯，其通常藉由抗原-抗體複合體之形成活化。該甘露糖結合凝集素(MBL)途徑係藉由MBL與病原體上之醣結構之結合開始，該結合導致裂解C2及C4以形成活性C2a、C2b、C4a及C4b之MBL蛋白酶(MASP)之活化。該替代途徑係鎂依賴性級聯，其係藉由C3於某些易感表面(例如，酵母及細菌之細胞壁多醣，及某些生物聚合物材料)上之沈積及活化進行活化。補體途徑之活化會產生補體蛋白之生物活性片段，例如C3a、C4a及C5a過敏毒素及C5b-9膜攻擊複合體(MAC)，其介導涉及白細 胞趨化反應、巨噬細胞、嗜中性球、血小板、肥胖細胞及內皮細胞之活化作用、血管滲透性、細胞溶解及組織損傷之炎性活性。
因子D係針對替代補體途徑之活化所必需的高度特異性絲胺酸蛋白酶。因子D裂解結合至C3b之因子B，從而產生C3b/Bb酶，其係替代途徑C3/C5轉化酶之活性組分。因子D是可用於抑制作用適當的目標，因為人類中之其血漿濃度係極低的(1.8μg/ml)，及已顯示為用於活化替代補體途徑之限制酶。P.H.Lesavre及H.J.Müller-Eberhard.(1978)J.Exp.Med.148：1498-1510；J.E.Volanakis等人(1985)New Eng.J.Med.312：395-401。
在動物模型及活體外研究中已證實補體活化之下調可有效治療數種疾病適應症，例如全身性紅斑狼瘡及腎絲球腎炎、類風濕性關節炎、心肺分流及血液透析、器官移植中之超急性排斥反應、心肌梗塞、再灌注損傷及成人呼吸窘迫症候群。另外，其他炎性病症及自體免疫/免疫複合體疾病亦係與補體活化密切相關，包括熱損傷、嚴重哮喘、過敏性休克、腸道炎症、蕁麻疹、血管性水腫、血管炎、多發性硬化症、重症肌無力、膜性增生性腎絲球腎炎及休格倫氏症候群(Sjögren’s syndrome)。
年齡相關性黃斑變性(AMD)係對視力造成顯著後果之中央視網膜之進行性慢性疾病。Lim等人(2012)Lancet 379：1728。該疾病之晚期形式係工業化國家中視力損失之主要原因。就年齡40歲之高加索人群而言，早期AMD之流行率評估為6.8%及晚期AMD之流行率為1.5%。de Jong(2006)N.Engl.J.Med.355：1474。晚期AMD之流行率隨年齡顯著增長，在80歲之後上升至11.8%。存在兩種類型之AMD：非滲出性(乾性)及滲出性(濕性)AMD。更常見之乾燥形式AMD涉及位於中央視網膜(斑)下 方之視網膜色素上皮細胞(RPE)中之萎縮性及肥厚性變化及沈積(隱結)於RPE上。晚期乾性AMD可導致顯著視網膜損傷，其包括地圖狀萎縮(GA)，及不可逆之視力損失。此外，患有乾性AMD之病患可進展至濕性形式，其中被稱為脈絡膜新生血管膜(CNVM)之異常血管在視網膜、滲漏液體及血液下生長，及最終在視網膜中及在視網膜下引起致盲性盤狀瘢痕。
靶向新血管形成(新生血管生成)之藥物已成為用於治療濕性AMD之中流砥柱。已證實蘭尼單抗(其係抗VEGFA抗體片段)對改善患有濕性AMD之病患之視力係高度有效的。近期研究已顯示AMD與補體級聯中之關鍵蛋白之間的關聯性及正發展許多靶向特異性補體組分之療法以治療乾性AMD。透過結合至因子D上之外部位點有效抑制因子D及替代補體途徑之人類化抗因子D Fab片段(aFD.WT；蘭帕珠單抗；FCFD4514S)係目前於臨床開發中以治療與乾性AMD相關聯之GA。Katschke等人(2012)J.Biol.Chem.287：12886。最近之II期臨床試驗已顯示，蘭帕珠單抗之每月玻璃體內注射可有效減緩患有晚期乾性AMD病患中之GA病灶的進展。
眼具有許多獨特之生物物理及解剖學特徵，該等特徵使得眼藥物遞送更具挑戰。例如，血-眼屏障係保護眼睛免於感染之防禦機制，但同時使得藥物難以滲透，尤其對眼睛後段之疾病而言。因此，通常需要高劑量投與以達成及維持藥物之原位生物可利用率(例如，眼部停留時間)以改善療效。同時，眼睛後部的有限空間限制待遞送之藥物體積，其進一步需要藥物以高濃度調配物形式遞送。
患有眼部疾病之病患亦可從治療劑之長效/緩釋遞送得到好處。低頻率給藥提供給病患經改善的便利性，具有減低感染率及增加臨床療效的潛 在利益。高劑量藥物之可控釋放亦可最小化藥物副作用。用於長效遞送之兩種頗具前景之系統係基於PLGA之固體植入物及可植入口遞送系統(PDS)。兩種系統均具有在延長之時間週期內提供近零級釋放動力學之可能性。就PLGA植入物而言，蛋白藥物囊封於疏水性聚合物基材中且藥物釋放係經由該聚合物之緩慢水解完成。釋放速率可藉由變化藥物負載、聚合物疏水性或聚合物分子量進行控制。該PDS係可再填充裝置，其中進入玻璃體內之釋放係由包含鈦熔塊之多孔金屬膜控制。由於容器具有較小體積，因此使用PDS有效遞送需要高蛋白濃度。
除高濃度及長效遞送外或代替高濃度及長效遞送，可藉由轉譯後修飾達成或促進該藥物之增加之生物可利用率(例如，眼部停留時間)，其中蛋白藥物係共價結合天然或合成聚合物，諸如聚唾液酸化、羥基化(HESylation)(結合羥乙基澱粉)及聚乙二醇化(PEGylation)。Chen等人(2011)Expert.Opin.Drug Deliv.8：1221-36；Kontermann(2009)BioDrugs 23：93-109。聚乙二醇化(聚合物聚乙二醇(PEG)共價連接至蛋白質)係尤其適用於延長抗體片段治療劑之半衰期之成熟技術。Jevsevar等人(2010)Biotech.J.5：113-128。
藥物曝露之條件取決於所使用之遞送系統而變化。就併入固體PLGA植入物中而言，可使用經凍乾或噴霧乾燥之藥物。植入物係使用熱熔擠出方法產生，使得該藥物暫時曝露於接近90℃之溫度。儘管該藥物在釋放持續期間保持固態，但PLGA之降解可使該藥物曝露於低pH環境。對比之下，使用PDS遞送之藥物在液態下維持高濃度及曝露於玻璃體，其特徵在於在生理離子強度及pH下呈還原環境。
因此，存在對具有改善之穩定性之抗因子D抗體(較佳適用於高濃度 調配及/或長效遞送之具有改善之穩定性之抗因子D抗體)之巨大需求。
蘭帕珠單抗目前正處於用以治療地圖狀萎縮(GA)(乾性AMD之晚期形式)之III期臨床試驗中。雖然GA中之人類臨床試驗顯示使用蘭帕珠單抗之每月玻璃體內注射可獲得治療效果，但仍需要使用較高藥物劑量以達成甚至更佳療效。另外，較低頻率給藥提供給病患經改善之便利性，具有經減小之感染率及經增加之臨床療效的潛在利益，且可促進對患有乾性AMD之較不晚期形式之病患之治療。為發展適用於較高藥物劑量或長效遞送之具有改善之穩定性及化學穩定性之抗因子D抗體，已研究抗因子D變體。已確定抗因子D變體具有改善之溶解性及化學穩定性。為進一步延長抗因子D抗體之作用，結合至多元醇(諸如PEG)係有利的。發現具有改善之溶解性及化學穩定性之抗因子D變體當以高濃度溶液結合至PEG時係非常黏的，然而，使得其等較不適用於玻璃體內注射。本發明者已發展額外抗因子D抗體，其等具有堪比蘭帕珠單抗對人類因子D之親和性、對食蟹猴因子D之改善之親和性、以及改善之溶解性及化學穩定性、及當結合至PEG時具有較小黏性，從而使得其等更適合作為長效治療劑。
本發明提供改善之抗因子D抗體及結合物及使用該等改善之抗因子D抗體及結合物之方法。
在一些實施例中，提供結合至因子D之分離抗體，其中該抗體包含(a)包含胺基酸序列SYYMY(SEQ ID NO：15)之HVR-H1；(b)包含胺基酸序列X4INPX5X6GX7TNFNEKFKS(SEQ ID NO：111)之HVR-H2，其中X4係選自E及W；X5係選自T及Y；X6係選自N、S及Q；及X7係選自G、D及E；(c)包含胺基酸序列EGGFAY(SEQ ID NO：25)之HVR-H3；(d)包含 胺基酸序列KASQNVDTDVA(SEQ ID NO：9)之HVR-L1；(e)包含胺基酸序列SASSRX1S(SEQ ID NO：108)之HVR-L2，其中X1係選自Y、K及R；及(f)包含胺基酸序列QQYX3NYPLT(SEQ ID NO：110)之HVR-L3，其中X3係選自N及E。
在一些態樣中，該抗體包含序列X2SASSRX1S(SEQ ID NO：109)，其中X1係選自Y、K及R，及X2係選自Y、R、S、K及Q。在一些實施例中，X2係R。在其他態樣中，X1係Y。
在一些實施例中，該抗體包含包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1、包含選自SEQ ID NO：16至24之胺基酸序列之HVR-H2、包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1、包含選自SEQ ID NO：10至12之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO：13或14之胺基酸序列之HVR-L3。
在某些實施例中，該抗體包含：a.包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H2、包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1、包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2、包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3；b.包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之HVR-H2、包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1、包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2、包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3； c.包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-H2、包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1、包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2、包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3；d.包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2、包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1、包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2、包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3；e.包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之HVR-H2、包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1、包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2、包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3；f.包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列之HVR-H2、包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1、包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2、包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3；g.包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列HVR-H2、包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1、包含SEQ ID NO：10 之胺基酸序列之HVR-L2、包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3；h.包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H2、包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1、包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2、包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3；i.包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H2、包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1、包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列之HVR-L2、包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3；j.包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H2、包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1、包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-L2、包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3；k.包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H2、包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1、包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2、包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-L3；或l.包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO： 24之胺基酸序列之HVR-H2、包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1、包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2、包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，輕鏈之位置49之胺基酸係精胺酸(R)。
在某些態樣中，該抗體包含包含選自SEQ ID NO：27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61及63之胺基酸序列之重鏈可變區。
在其他態樣中，該抗體包含包含選自SEQ ID NO：26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60及62之胺基酸序列之輕鏈可變區。
該抗體可包含：包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列之輕鏈可變區；包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列之輕鏈可變區；包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列之輕鏈可變區；包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列之輕鏈可變區；包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列之輕鏈可變區；包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO： 48之胺基酸序列之輕鏈可變區；包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列之輕鏈可變區；包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列之輕鏈可變區；包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之輕鏈可變區；包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之輕鏈可變區；包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列之輕鏈可變區；包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之輕鏈可變區；包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列之輕鏈可變區；包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列之輕鏈可變區；包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之輕鏈可變區；包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之輕鏈可變區；包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列之輕鏈可變區；或 包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在一些實施例中，該抗體包含包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列之輕鏈可變區，或其中該抗體包含包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列之輕鏈可變區。
該抗體可為單株抗體、人類化抗體或嵌合抗體或單株、人類化及嵌合抗體之組合。
在一些實施例中，該抗體可結合因子D。
在某些態樣中，該抗體係片段。在一些實施例中，該片段係Fab片段。
在一些實施例中，該抗體輕鏈包含包含SEQ ID NO：112之序列之輕鏈恆定區。
在一些實施例中，該抗體重鏈包含包含選自SEQ ID NO：113、128至132、134至137及154至156之序列之重鏈恆定區。
在某些態樣中，該抗體包含：包含選自SEQ ID NO：71、118至122及140至146之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列之輕鏈；包含選自SEQ ID NO：75、123至127及147至153之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列之輕鏈；包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列之輕鏈； 包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列之輕鏈；包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列之輕鏈；包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列之輕鏈；包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列之輕鏈；包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列之輕鏈；包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列之輕鏈；包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列之輕鏈；包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列之輕鏈；包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之輕鏈；包含SEQ ID NO：89之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列之輕鏈；包含SEQ ID NO：91之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列之輕鏈； 包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列之輕鏈；包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列之輕鏈；包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列之輕鏈；或包含SEQ ID NO：99之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：98之胺基酸序列之輕鏈。
在一些態樣中，該抗體包含：包含選自SEQ ID NO：71、118至122及140至146之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列之輕鏈；或包含選自SEQ ID NO：75、123至127及147至153之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列之輕鏈。
在一些實施例中，該抗體包含經工程改造之半胱胺酸。該經工程改造之半胱胺酸可選自重鏈中之T110C、A136C、L170C、L175C、T183C或T205C突變及輕鏈中之I106C、R108C、R142C、K149C及V205C突變，其中殘基編號係根據Kabat編號。
在某些態樣中，因子D係包含SEQ ID NO：106之胺基酸序列之人類因子D。
在一些實施例中，該抗體結合至食蟹猴因子D。該食蟹猴因子D可包含SEQ ID NO：107之胺基酸序列。
在一些態樣中，該抗體以比針對人類因子D之KD高小於10倍或小於7倍或小於5倍或小於3倍之KD結合至食蟹猴因子D。
涵蓋編碼本文描述之抗體中之任何一者之分離核酸。提供包含該核酸之宿主細胞。
在一些實施例中，本發明涵蓋產生本文揭示之抗體中之任何一者之方法，其包括培養宿主細胞使得該抗體產生。
涵蓋包含本文揭示之抗體中之任何一者及醫藥上可接受之載劑之醫藥調配物。該醫藥上可接受之載劑可包含具有在約5.5與約8.0之間之pH之緩衝劑。該抗體可以至少150mg/mL、至少160mg/mL、至少170mg/mL、至少180mg/mL、至少190mg/mL、至少200mg/mL或至少210mg/mL或至少220mg/mL或至少230mg/mL或至少240mg/mL或至少250mg/mL或至少260mg/mL或至少270mg/mL或至少280mg/mL或至少290mg/mL或至少300mg/mL之濃度存在於該醫藥調配物中。
該抗體可以在150mg/mL與350mg/mL之間或在150mg/mL與300mg/mL之間或在170mg/mL與300mg/mL之間或在200mg/mL與300mg/mL之間之濃度存在於該醫藥調配物中。
在一些實施例中，該醫藥調配物不包含在4℃下儲存至少一週、至少兩週、至少四週、至少六週、至少八週、至少12週、至少16週、至少20週、至少24週或至少28週後可見之沈澱。
在一些實施例中，該組合物在25℃下之黏度係小於30cP、小於25cP、小於20cP、小於15cP或小於10cP。
在一些態樣中，抗因子D抗體於該組合物中之濃度係在100mg/mL與300mg/mL之間或在150mg/mL與300mg/mL之間。
在一些實施例中，該醫藥調配物係適用於透過窄孔針進行之玻璃體內投與。該窄孔針為約30、29、28、27、26、25、24、23或22號針規。
本發明進一步包含一種結合物，其包含至少一個共價連接至一或多個多元醇之如本文描述之抗體。在一些實施例中，該多元醇係多臂多元醇。在一些態樣中，該結合物包含至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或至少六個共價連接至多臂多元醇之抗體。
結合物之多元醇可透過半胱胺酸胺基酸之游離巰基共價連接至至少一個抗體。該半胱胺酸胺基酸可為經工程改造之半胱胺酸。該胱胺酸胺基酸可在該抗體之恆定區中。該半胱胺酸胺基酸可在該抗體之重鏈或輕鏈之C端。
在一些實施例中，該結合物包含透過離胺酸胺基酸之游離胺基共價連接至至少一個抗體之多元醇。該離胺酸胺基酸可在該抗體之恆定區中。該離胺酸胺基酸可在該抗體之重鏈或輕鏈之C端。
在一些實施例中，該多元醇係選自二聚物、四聚物、六聚物及八聚物之多臂多元醇。
在一些態樣中，該多臂多元醇係八聚物。
在一些實施例中，該多元醇係聚乙二醇。在一些態樣中，該聚乙二醇具有約500D至約300,000D之重量平均分子量。在其他態樣中，該聚乙二醇具有約20,000D至約60,000D之重量平均分子量。在其他態樣中，該聚乙二醇具有約40,000D之重量平均分子量。
在一些實施例中，本文描述之結合物具有具有通式(Ia)之結構之聚乙二醇：
其中各m獨立地係45至1000或3至250或50至200或100至250之整數；n係1至10之整數；各R1獨立地係不存在或者係連接基團；及各R2獨立地係氫或者末端反應性基團；其中至少一個R2係末端反應性基團且係共價連接至抗因子D抗體或抗體變體。
在一些實施例中，該聚乙二醇具有通式(Ib)之結構：
其中各m獨立地係45至1000或3至250或50至200或100至250之整數；各R1獨立地係不存在或者連接基團；及各R2獨立地係氫或者末端反應性基團；其中至少一個R2係末端反應性基團且係共價連接至抗因子D抗體或抗體變體。
在一些實施例中，該聚乙二醇具有通式(IIa)之結構：
其中各m獨立地係45至1000或3至250或50至200或100至250之整數；n係1至10之整數；各R1獨立地係不存在或者係連接基團；及各R2獨立地係氫或者末端反應性基團；其中至少一個R2係末端反應性基團且係共價連接至抗因子D抗體或抗體變體。在一些實施例中，n係4。
在一些態樣中，該聚乙二醇具有通式(IIIa)之結構：
其中各m獨立地係45至1000或3至250或50至200或100至250之整數；n係1至10之整數；各R1獨立地係不存在或者係連接基團；及各R2獨立地係氫或者末端反應性基團；其中至少一個R2係末端反應性基團及係共價連接至抗因子D抗體或抗體變體。在一些實施例中，n係4。
在一些態樣中，該聚乙二醇具有通式(IVa)之結構：
其中各m獨立地係45至1000或3至250或50至200或100至250之整數；各R1獨立地係不存在或者係連接基團；及各R2獨立地係氫或者末端反應性基團；其中至少一個R2係末端反應性基團且係共價連接至抗因子D抗體或抗體變體。在一些實施例中，m係50至200之整數。在其他實施例中，m係100至150之整數。
在一些實施例中，該至少一個R1係連接基團，其中R1及R2當在一起時係選自由以下組成之群： ；；及；及其組合；其中各i獨立地係0至10之整數；及j係0至10之整數。
在一些實施例中，R2係獨立地選自巰基反應性基團、胺基反應性基團及其組合。
在一些實施例中，各R2係獨立地選自順丁烯二醯亞胺、巰基、硫醇、三氟甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、氮丙啶、環氧化物、二硫吡啶、琥珀醯亞胺酯、-NH2、醛、鹵代乙酸酯、鹵代乙醯胺及碳酸對硝基苯基酯。
在一些態樣中，R2係順丁烯二醯亞胺。
該結合物可具有R1及R2，當在一起時，係，i係0至10之整數；及j係0至10之整數。
在一些實施例中，該等R2基團中之至少七個係共價連接至抗因子D抗體或抗體變體中之一者。
在一些實施例中，該等R2基團中之至少八個係共價連接至抗因子D抗體或抗體變體中之一者。
在一些實施例中，該結合物係藉由將至少一個本文描述之抗體共價連接至多臂多元醇製得。
涵蓋包含如本文描述之結合物及醫藥上可接受之載劑之醫藥調配物。該抗體之濃度係至少100mg/mL或至少150mg/mL或至少200mg/mL或至少300mg/mL。在其他實施例中，該抗因子D抗體或抗體變體之濃度係約50mg/mL至約300mg/mL。
在一些實施例中，該醫藥調配物或組合物在25℃下之黏度係小於1000cP、小於900cP、小於800cP、小於700cP、小於600cP、小於500cP、小於400cP或小於300cP。
在一些實施例中，該調配物或組合物中之抗因子D抗體之濃度係至少100mg/mL或至少150mg/mL。
亦涵蓋用於眼遞送之遞送裝置，其包含本文描述之醫藥調配物及用於向病患玻璃體內遞送該調配物之構件。
在一些實施例中，該遞送裝置調配物保持對位點之有效性達延長時間。
在一些實施例中，涵蓋治療個體中經補體介導之失調症之方法，該方法包括向該個體投與有效量之本文描述之抗體、結合物或醫藥調配物。
在一些實施例中，該經補體介導之失調症係全身性的。
在另一實施例中，該經補體介導之失調症係補體相關眼部病症。
在一些態樣中，該補體相關眼部病症係選自年齡相關性黃斑變性(AMD)(包括乾性及濕性(非滲出性及滲出性)形式)、脈絡膜新生血管性疾病(CNV)、眼色素層炎、糖尿病視網膜病變、缺血性視網膜病變、糖尿病性黃斑水腫、病理性近視、逢希伯-林道失調症、眼組織胞漿菌病、中央視網膜靜脈阻塞(CRVO)、角膜新生血管形成及視網膜新生血管形成。
在一些實施例中，該補體相關眼部病症係選自中度乾燥形式AMD或地圖狀萎縮(GA)。
在一些態樣中，該方法包括使用可植入口遞送系統投與該抗體、結合物或醫藥調配物。
在一些實施例中，該方法包括藉由玻璃體內投與而投與該抗體、結合物或醫藥調配物。該玻璃體內投與可透過窄孔針。在一些實施例中，該窄孔針係約30、29、28、27、26、25、24、23或22號針規。
在一些態樣中，該治療方法進一步包括向個體投與額外治療劑。在一些實施例中，該額外治療劑係選自ANG2拮抗劑、TIE2拮抗劑、VEGF拮抗劑及第二補體組分拮抗劑。
在一些實施例中，該額外治療劑係抗ANG2抗體。
在其他實施例中，該額外治療劑係抗TIE2抗體。
在一些態樣中，該額外治療劑係選自VEGF捕獲劑及抗VEGF抗體。
在其他態樣中，該額外治療劑係第二補體組分拮抗劑，其中該第二補體組分拮抗劑抑制選自C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8及9之補體組分。
本發明涵蓋本文描述之抗體或結合物於製造用於治療個體中經補體介導之失調症之藥劑之用途。在一些實施例中，該經補體介導之失調症係 補體相關眼部病症。在其他實施例中，該經補體介導之失調症係全身性的。在一些態樣中，該補體相關眼部病症係選自年齡相關性黃斑變性(AMD)(包括乾性及濕性(非滲出性及滲出性)形式)、脈絡膜新生血管性疾病(CNV)、眼色素層炎、糖尿病視網膜病變、缺血性視網膜病變、糖尿病性黃斑水腫、病理性近視、逢希伯-林道失調症、眼組織胞漿菌病、中央視網膜靜脈阻塞(CRVO)、角膜新生血管形成及視網膜新生血管形成。該補體相關眼部病症可選自中度乾燥形式AMD或地圖狀萎縮(GA)。
在一些態樣中，本文描述之抗體或結合物係用於治療中。
在一些實施例中，本文描述之抗體或結合物係用於治療個體中經補體介導之失調症之方法中。
在一些實施例中，該抗體、結合物或調配物係用於治療個體中全身性經補體介導之失調症之方法中。在一些實施例中，該經補體介導之失調症係補體相關眼部病症。在一些態樣中，該補體相關眼部病症係選自年齡相關性黃斑變性(AMD)(包括乾性及濕性(非滲出性及滲出性)形式)、脈絡膜新生血管性疾病(CNV)、眼色素層炎、糖尿病視網膜病變、缺血性視網膜病變、糖尿病性黃斑水腫、病理性近視、逢希伯-林道失調症、眼組織胞漿菌病、中央視網膜靜脈阻塞(CRVO)、角膜新生血管形成及視網膜新生血管形成。在一些實施例中，該補體相關眼部病症係選自中度乾燥形式AMD或地圖狀萎縮(GA)。
圖1A至C顯示鼠類20D12輕鏈可變區、人類VL κ I(VLK)共同序列及20D12之人類化變體之輕鏈可變區之比對。
圖2A至C顯示鼠類20D12重鏈可變區、人類VH子群I(VHI)共同序列 及20D12之人類化變體之重鏈可變區之比對。
圖3A至C顯示hu20D12.v2.0-因子D共晶結構及蘭帕珠單抗-因子D共晶結構之部分之覆蓋圖。A)抗體與因子D之間之結合界面之覆蓋圖。B)抗體與因子D之間之某些重鏈接觸之細節。C)抗體與因子D之間之某些輕鏈接觸之細節。
圖4顯示蘭帕珠單抗輕鏈(SEQ ID NO：100)及重鏈可變區(SEQ ID NO：101)及hu20D12.v2.0(「hu20D12.v1.N54S」)輕鏈(SEQ ID NO：32)及重鏈(SEQ ID NO：33)可變區之比對。
圖5A至B顯示如使用因子B活化之TR-FRET分析量測，人類化20D12抗體Fab及結合物抑制因子D。
圖6A至C顯示hu20D12.v2.0(6A)及hu20D12.v2.1(6C)具有分別292mg/mL及260mg/mL的溶解度，而蘭帕珠單抗以227mg/mL(6B)沈澱自溶液。
圖7A至C顯示PEG-八聚物結合之hu20D12.v2.1.C之典型SEC-MALS曲線(7A)，及用於測定流體動力學半徑(RH)之SEC-QELS分析(7B、7C)。
圖8A至C顯示PEG-八聚物結合之hu20D12.v2.1.C溶離份之CEX層析圖(8A)、SEC-MALS曲線(8B)，及該等溶離份之Mw(kDa)、多分散性(Mw/Mn)及RH(nM)之表(8C)。
圖9A至B顯示PEG-八聚物結合之抗體之濃度依賴性黏度。AFD.v14.C+TP-Oct；hu20D12.v2.1.C+TP-Oct；及hu20D12.v2.3.C+TP-Oct(9A)，及AFD.v8.C+PEG四聚物；及hu20D12.v2.3+PEG四聚物(9B)。
圖10A至B藉由結合能力(10A)及CE-SDS(10B)顯示PEG-八聚物結合 之Fab之熱穩定性。
圖11顯示人類化20D12抗體、蘭帕珠單抗及抗因子D變體AFD.v8及AFD.v14之各種特性。
圖12A至B顯示包含六聚甘油(HGEO)核(Sunbright® HGEO-400MA,NOF America,Corp.)及三季戊四醇(TP)核(8臂(TP)-PEG-MAL,JenKem Technology,USA)之多臂PEG之MALDI分析(12A：HGEO核；12B：TP核)。
圖13A至B顯示在玻璃體內(IVT)注射蘭帕珠單抗(13A)或未結合AFD.v14(13B)後之食蟹猴中由rRBC之經時相對溶血量測衡量之百分率全身性AP補體活性。
圖14A至C顯示食蟹猴眼部中IVT注射AFD.v14.C+TP-Oct(14A)或AFD.v14.C+HG-Oct(14B,14C)後之由rRBC或ELISA之相對溶血衡量之百分率全身性AP補體活性。
圖15A至C顯示在食蟹猴Gyrolab XP分析中AFD.v14.C+TP-Oct與未結合AFD.v14相比之血清PK。
圖16A至B顯示在雄性食蟹猴中單一ITV或IV投與AFD.v14.C+TP-Oct後之血清(16A)及玻璃體液、眼房液或視網膜勻漿(16B)中之組平均(+/-SD)濃度。
圖17A至B顯示來自Gyrolab XP分析之AFD.v14及AFD.v14.C+TP-Oct在食蟹猴玻璃體體液中之PK結果。
圖18A至B顯示來自Gyrolab XP分析之AFD.v14及AFD.v14.C+TP-Oct於食蟹猴眼房液中之PK結果。
圖19A至B顯示來自Gyrolab XP分析之AFD.v14及AFD.v14.C+TP- Oct於食蟹猴視網膜勻漿中之PK結果。
圖20顯示hu20D12.v2.1.C+TP-Oct之SEC分析。
圖21顯示hu20D12.v2.1.C+TP-Oct之CE-SDS非還原(NR)電泳圖。
圖22顯示玻璃體內投與125I-hu20D12.v2.1.C+TP-Oct(組1、2及3)或125I-hu20D12.v2.1.C(組4)之食蟹猴之玻璃體液中之經時Fab濃度。
圖23顯示玻璃體內投與125I-hu20D12.v2.1.C+TP-Oct(組1、2及3)或125I-hu20D12.v2.1.C(組4)之食蟹猴之眼房液中之經時Fab濃度。
圖24顯示玻璃體內投與125I-hu20D12.v2.1.C+TP-Oct(組1、2及3)或125I-hu20D12.v2.1.C(組4)之食蟹猴之視網膜中之經時Fab濃度。
現將詳細參考本發明之某些實施例，其實例係繪示於隨附結構及式中。儘管將結合枚舉型實施例描述本發明，但應瞭解其等無意將本發明限制於彼等實施例。相反地，本發明意欲涵蓋所有替代、修飾及相等物，其等可包括於如藉由申請專利範圍定義之本發明範圍內。熟習此項技術者將知曉類似於或相等於彼等本文描述者之許多方法及材料，其等可用於本發明之實務中。本發明不以任何方式限制於本文描述之方法及材料。
本發明通篇中所引用之所有參考文獻係以全文引用之方式明確併入本文中。在併入之文獻、專利案及類似材料中之一或更多者不同於本申請案或與本申請案相矛盾(包括但不限於定義之術語、術語用法、描述之技術或類似物)之情況下，以本申請案為準。
I.定義
措辭「包含」及「包括」在用於本說明書及申請專利範圍中時係意欲指定規定特徵、整數、組分或步驟之存在，但其等不排除一或更多種其 他特徵、整數、組分、步驟或其群之存在或添加。
出於本文之目的之「受體人類框架」係包含衍生自如下文定義之人類免疫球蛋白框架或人類共同框架之輕鏈可變域(VL)框架或重鏈可變域(VH)框架之胺基酸序列之框架。「衍生自」人類免疫球蛋白框架或人類共同框架之受體人類框架可包含其相同胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中，胺基酸變化之數量係10或以下、9或以下、8或以下、7或以下、6或以下、5或以下、4或以下、3或以下或2或以下。在一些實施例中，該VL受體人類框架之序列係與VL人類免疫球蛋白框架序列或人類共同框架序列相同。
「親和性」係指分子(例如，抗體)之單一結合位點及其結合配體(例如，抗原)之間之非共價相互作用之總和之強度。如本文使用，除非另有指示，否則「結合親和性」係指固有結合親和性，其反映結合對之成員(例如，抗體及抗原)之間之1：1相互作用。分子X對其配體Y之親和性可通常藉由解離常數(Kd)表示。親和性可藉由此項技術中已知的常見方法量測，該等常見方法包括彼等本文描述者。用於量測結合親和性之特定闡述性及繪示性實施例係描述於下文中。
「親和性成熟」抗體係指在一或多個高度可變區(HVR)中具有一或多個改變之抗體，其相較於不具有此等改變之親代抗體，此等改變導致該抗體對抗原之親和性改善。
術語「抗因子D抗體」、「aFD抗體」、「AFD.Ab」及「結合至因子D之抗體」係指如下之抗體：能夠以足夠之親和性結合因子D使得該抗體適用作靶向因子D之診斷及/或治療劑。在一些實施例中，抗因子D抗體結合至無關非因子D蛋白之程度係小於如(例如)藉由放射免疫分析法(RIA) 量測之該抗體對因子D之結合之約10%。在某些實施例中，結合至因子D之抗體具有1μM、100nM、10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM(例如，10-8M或以下，例如10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)之解離常數(Kd)。在某些實施例中，抗因子D抗體結合至因子D之在不同物種因子D之間保守之抗原決定基。該等抗因子D抗體包括但不限於AFD.v#變體及hu20D12.v#變體，及#係用以識別特定變體之數量。
術語「抗體」係在文中以最廣義使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)及抗體片段，只要其等顯示所需抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指除完整抗體外之分子，其包含完整抗體之一部分且結合完整抗體所結合之抗原。抗體片段之實例包括但不限於Fv、Fab、Fab-SH、Fab’-SH、Fab’、Fab-C、Fab’-C、Fab’-C-SH、Fab-C-SH、scFv、雙功能抗體或F(ab’)2；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如，scFv)；及自抗體片段形成之多特異性抗體。
如本文使用，「Fab」係指包含包括CH1域或該CH1域之足夠部分以與輕鏈恆定區形成雙硫鍵，但不含有CH2域或CH3域之重鏈恆定區之抗體。如本文使用，Fab可包含鉸鏈區之一或多個胺基酸。因此，如本文使用，術語「Fab」涵蓋Fab’抗體。Fab可包含額外非天然胺基酸，諸如C端半胱胺酸，在該情況下可將其稱為Fab-C。如下文討論，術語Fab-C亦涵蓋包含鉸鏈區之天然胺基酸(包括在C端之天然半胱胺酸)之Fab。在一些實施例中，Fab包含經工程改造之半胱胺酸(即，Fab可為THIOMAB)。
「Fab-C」係指具有C端半胱胺酸之Fab，C端半胱胺酸可為出現於該 殘基位置之天然半胱胺酸(諸如來自鉸鏈區之半胱胺酸)，或可為添加至非對應於半胱胺酸之C端之半胱胺酸。該等抗因子D抗體包括但不限於AFD.C抗體及hu20D12.C抗體，及「C」指示該抗體係具有C端半胱胺酸之Fab。非限制例示性Fab-C重鏈恆定區包括SEQ ID NO：129、130、132、154、155、156、157及158之序列。
「Fab-SH」係指具有游離硫醇基之Fab。在一些實施例中，該游離硫醇基係位於Fab之C端之最後10個胺基酸中。Fab-C抗體亦通常被稱為Fab-SH抗體。另一非限制例示性Fab-SH重鏈恆定區具有SEQ ID NO：131之胺基酸序列。通常，包含經工程改造之半胱胺酸之Fab(即，係THIOMAB之Fab)係Fab-SH。
與參考抗體「結合至相同抗原決定基之抗體」係指在競爭分析中阻斷參考抗體與其抗原之結合達50%或以上之抗體，及相反地，該參考抗體在競爭分析中阻斷該抗體與其抗原之結合達50%或以上。本文提供例示性競爭分析。
術語「補體相關失調症」係以最廣義使用且包括與過度或不受控制之補體活化相關聯之失調症。該等失調症包括心肺分流手術期間之補體活化；因急性心肌梗塞、動脈瘤、中風、失血性休克、擠壓損傷、多器官功能衰竭、低血容量性休克、腸缺血或引起缺血之其他事件後之缺血-再灌注引起之補體活化。補體活化亦已顯示與諸如以下之炎性病症相關聯：嚴重燒傷、內毒血症、敗血性休克、成人呼吸窘迫症候群、血液透析；過敏性休克、嚴重哮喘、血管性水腫、克隆氏病(Crohn’s disease)、鐮狀細胞貧血症、鏈球菌感染後腎絲球腎炎及胰臟炎。該失調症可為不良藥物反應、藥物過敏、IL-2引起之血管滲漏症候群或放射線造影劑過敏症之結 果。該失調症亦包括自體免疫疾病，諸如全身性紅斑狼瘡、重症肌無力、類風濕性關節炎、阿茲海默症(Alzheimer’s disease)及多發性硬化症。補體活化係亦與移植排斥反應相關聯。補體活化係亦與諸如以下之眼部疾病：年齡相關性黃斑變性、糖尿病視網膜病變及其他缺血相關視網膜病變、脈絡膜新生血管性疾病(CNV)、眼色素層炎、糖尿病性黃斑水腫、病理性近視、逢希伯-林道失調症、眼組織胞漿菌病、中央視網膜靜脈阻塞(CRVO)、角膜新生血管形成及視網膜新生血管形成。
術語「補體相關眼部病症」係以最廣義使用且包括病理學上涉及補體(包括經典及替代途徑，及特定言之補體之替代途徑)之所有眼部病症。補體相關眼部病症包括但不限於黃斑變性疾病，諸如年齡相關性黃斑變性(AMD)之所有階段(包括乾性及濕性(非滲出性及滲出性)形式)、脈絡膜新生血管性疾病(CNV)、眼色素層炎、糖尿病及其他缺血相關視網膜病變及其他眼內新生血管疾病，諸如糖尿病性黃斑水腫、病理性近視、逢希伯-林道失調症、眼組織胞漿菌病、中央視網膜靜脈阻塞(CRVO)、角膜新生血管形成及視網膜新生血管形成。在一個實例中，補體相關眼部病症包括年齡相關性黃斑變性(AMD)(包括非滲出性(例如，中度乾性AMD或地圖狀萎縮(GA))及滲出性(例如，濕性AMD(脈絡膜新生血管性疾病(CNV))AMD)、糖尿病視網膜病變(DR)、眼內炎及眼色素層炎。在另一實例中，非滲出性AMD可包括硬質隱結、軟質隱結、地圖狀萎縮及/或色素凝集之存在。在一個實例中，補體相關眼部病症包括年齡相關性黃斑變性(AMD)，包括早期AMD(例如，包括多個小至一或多個非廣泛中型隱結)、中度AMD(例如，包括廣泛中型隱結至一或多個大型隱結)及晚期AMD(例如，包括地圖狀萎縮或晚期濕性AMD(CNV)。(Ferris等人， AREDS Report No.18；Sallo等人，Eye Res.,34(3)：238-40(2009)；Jager等人，New Engl.J.Med.,359(1)：1735(2008))。在另一實例中，中度乾性AMD可包括大型融合性隱結。在另一實例中，地圖狀萎縮可包括經光受體及/或視網膜染色之上皮(RPE)損失。在另一實例中，地圖狀萎縮之面積可小可大及/或可在黃斑區域中或在外周視網膜中。在一個實例中，補體相關眼部病症係中度乾性AMD。在一個實例中，補體相關眼部病症係地圖狀萎縮。在一個實例中，補體相關眼部病症係濕性AMD(脈絡膜新生血管性疾病(CNV))。
術語「嵌合」抗體係指其中重鏈及/或輕鏈之一部分係衍生自特定來源或物種，同時該重鏈及/或輕鏈之剩餘部分係衍生自不同來源或物種之抗體。
抗體之「類別」係指其重鏈具有之恆定域或恆定區之類型。抗體具有五種主要類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，及此等中之數種可進一步分為子類(同型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於免疫球蛋白之不同類別之重鏈恆定域被分別稱為α、δ、ε、γ及μ。
術語「多元醇」在本文中使用時係廣泛地指多元醇化合物。多元醇可為任何水溶性聚(環氧烷)聚合物例如且可具有直鏈或分支鏈。較佳多元醇包括彼等於一或多個羥基位置經化學基團(諸如具有一至四個碳之烷基)取代者。通常，該多元醇係聚(烷二醇)，較佳聚乙二醇(PEG)。然而，熟習此項技術者知曉可使用本文針對PEG描述之結合技術採用其他多元醇(諸如，例如，聚(丙二醇)及聚乙烯-聚丙二醇共聚物)。本發明多元醇包括彼等此項技術中熟知者及彼等公開可獲得者，諸如來自市售來源。
術語「結合物」係在本文中根據最廣義定義使用以意謂參與或連接 在一起。分子在其等起作用或操作時「結合」就如同其等參與其中。在特定實施例中，「結合物」係指共價結合至多臂多元醇之抗體(例如，如本文詳細描述之抗體片段)。
「效應子功能」係指彼等歸因於抗體之Fc區之生物活性，其隨抗體同型而變化。抗體效應子功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如，B細胞受體)之下調；及B細胞活化。
藥劑(例如，醫藥調配物)之「有效量」係指在必要劑量及時間週期下有效達成所需治療結果或預防結果(諸如目標疾病或病症(諸如，例如，補體相關眼部病症)之狀態(例如，病理學)之可量測改善)之量。
術語「抗原決定基」係指抗原分子上抗體所結合之特定位點。
「框架」或「FR」係指除高度可變區(HVR)殘基外之可變域殘基。可變域之FR通常由四個FR域組成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，該等HVR及FR序列通常以下列順序出現在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」係在本文中可交換使用以指具有大體上類似於天然抗體結構之結構或具有含有如本文定義之Fc區之重鏈之抗體。
術語「因子D之醣基化形式」係指因子D之天然生成之形式，其等係藉由添加醣殘基而經轉譯後修飾。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞系」及「宿主細胞培養物」可交換使用且係指其中已引入外源性核酸之細胞，包括此等細胞之子代。宿主細胞包括「轉形體」及「轉形細胞」，其等包括原代轉形細胞及自其衍生之 子代(不考慮傳代數)。子代在核酸含量上與親代細胞可能不完全相同，但可含有突變。本文包括具有與在最初轉形細胞中篩選或選擇之功能或生物活性相同之功能或生物活性之突變體子代。
「人類抗體」係具有胺基酸序列對應於由人類或人類細胞所產生或自利用人類抗體庫或其他編碼人類抗體之序列之非人類源所衍生之抗體之胺基酸序列之抗體。人類抗體之此定義明確排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。
「人類共同框架」係表示在人類免疫球蛋白VL或VH框架序列之選擇中最常出現之胺基酸殘基之框架。通常，人類免疫球蛋白VL或VH序列之選擇係來自可變域序列之子組。通常，序列之子組係如於Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH出版物91-3242,Bethesda MD(1991)，第1至3卷中之子組。在一些實施例中，就VL而言，該子組係如於Kabat等人(同上)中之子組κ I。在一些實施例中，就VH而言，該子組係如於Kabat等人(同上)中之子組III。
「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基之嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含大體上所有之至少一個及通常兩個可變域，其中所有或大體上所有之HVR(例如，CDR)對應於彼等非人類抗體者，及所有或大體上所有之FR對應於彼等人類抗體者。人類化抗體視需要可包含衍生自人類抗體之抗體恆定區之至少一部分。抗體(例如，非人類抗體)之「人類化形式」係指已經人類化之抗體。
如本文使用，術語「高度可變區」或「HVR」係指抗體可變域之在序列上高度可變及/或形成結構上定義之環(「高度可變環」)之區之各者。 通常，天然四鏈抗體包含六個HVR；三個在VH(H1、H2、H3)中及三個在VL(L1、L2、L3)中。HVR通常包含來自高度可變環及/或來自「互補決定區」(CDR)之胺基酸殘基，後者具有最高序列可變性及/或涉及抗原識別。例示性高度可變環出現於胺基酸殘基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)。(Chothia及Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。例示性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)出現於胺基酸殘基L1之24-34、L2之50-56、L3之89-97、H1之31-35B、H2之50-65及H3之95-102。(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。除VH中之CDR1外，CDR通常包含形成高度可變環之胺基酸殘基。CDR亦包含「特異性決定殘基」或「SDR」，其等係接觸抗原之殘基。SDR係包含於縮寫-CDR(abbreviated-CDR)或a-CDR之CDR之區域內。例示性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2及a-CDR-H3)出現於L1之胺基酸殘基31-34、L2之50-55、L3之89-96、H1之31-35B、H2之50-58及H3之95-102。(參見Almagro及Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008))。除非另有指示，否則本文中HVR殘基及可變域中之其他殘基(例如，FR殘基)係根據Kabat等人(同上)編號。
若蛋白質(包括抗體)基本上保留完整構形結構及生物活性，則認為其係「穩定」的。用於量測蛋白質穩定性之各種分析技術可於此項技術中獲得及回顧於(例如)Peptide and Protein Drug Delivery,247-301，Vincent Lee編，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)及Jones (1993)Adv.Drug Delivery Rev.10：29-90。具有「改善之穩定性」之抗體變體係指比初始參考抗體更具穩定性之抗體變體。較佳地，具有改善之穩定性之抗體變體係天然(野生型)抗體之變體，其中特定胺基酸殘基出於改善天然抗體之物理穩定性及/或化學穩定性及/或生物活性及/或減小天然抗體之免疫原性之目的而經改變。Walsh(2000)Nat.Biotech.18：831-3。
術語「異構化」通常係指將化學化合物轉化為其異構形式(即，具有相同化學組成但具有不同結構或構形及因此通常具有不同物理及化學性質之形式)中之任何一者之化學方法。明確言之，本文使用天冬胺酸異構化，其中多肽之一或多個天冬胺酸(D或Asp)殘基已經轉化為異天冬胺酸殘基之方法。Geiger及Clarke(1987)J.Biol.Chem.262：785-94。
術語「脫醯胺」通常係指其中自有機化合物中移除醯胺官能基之化學反應。明確言之，本文使用天冬醯胺酸脫醯胺，其中多肽之一或多個天冬醯胺酸(N或Asn)殘基已經轉化為天冬胺酸(D或Asp)之方法，即，中性醯胺側鏈已經轉化為具有整體酸性性質之殘基。Xie及Schowen(1999)J.Pharm.Sci.88：8-13。
「結合物」係結合至一或多個異源性分子(包括但不限於多元醇)之抗體。
「病患」或「個體(individual或subject)」係哺乳動物。哺乳動物包括但不限於家養動物(例如，牛、綿羊、貓、狗及罵)、靈長類動物(例如，人類及非人類靈長類動物，諸如猴)、兔及嚙齒動物(例如，小鼠及大鼠)。在某些實施例中，該病患或個體係人類。
「單一治療」意謂包括在治療週期期間僅用單一治療劑治療目標疾 病或病症(諸如，例如，補體相關眼部病症)之治療方案。
「維持治療」意謂經給出以減小疾病復發或進展之可能性之治療方案。維持治療可經提供持續任何時間長度，包括長達個體壽命之延長時間週期。維持治療可於初始治療後提供或結合初始或額外治療提供。用於維持治療之劑量可變化且可包括相較於用於其他類型療法之劑量而經減少之劑量。
「分離抗體」係已自其天然環境之組分分離之抗體。在一些實施例中，抗體係經純化至大於95%或99%純度，如藉由(例如)電泳(例如，SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如，離子交換或逆相HPLC)測得。就回顧用於評估抗體純度之方法，參見，例如，Flatman等人，J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。
「分離核酸」係指已自其天然環境之組分分離之核酸分子。分離核酸包括包含於通常含有該核酸分子之細胞中之核酸分子，但該核酸分子係存在於染色體外或存在於不同於其天然染色體位置之染色體位置。
「編碼抗因子D抗體之分離核酸」係指編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)之一或多個核酸分子，包括於單一載體或不同載體中之此(等)核酸分子及存在於宿主細胞中之一或多個位置之此(等)核酸分子。
如本文使用，術語「因子D」及「fD」及「FD」係指因對細胞中之因子D前驅蛋白進行處理而產生之任何天然、成熟因子D。除非另有指示，否則該術語包括來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如，人類及食蟹猴)及嚙齒動物(例如，小鼠及大鼠))之因子D。該術語亦包括因子D之天然生成之變體，例如，剪接變體或對偶基因變體。例示性人類因子D前多肽原之胺基酸序列示於SEO ID NO：104中。例示性 成熟人類因子D之胺基酸序列係SEQ ID NO：104(SEQ ID NO：106)之胺基酸26-253。
如本文使用之術語「單株抗體」係指自大體上均質抗體群體獲得之抗體，即，組成該群體之個別抗體係相同的及/或結合相同抗原決定基，除可能之變體抗體(例如，含有天然生成之突變或於產生單株抗體製劑期間產生)外，此等變體通常少量存在。與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體之多株抗體製劑相比，單株抗體製劑之各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。因此，修飾語「單株」指示該抗體的特性為獲得自抗體之大體上均質群體，且不應視為需要以任何特定方法產生該抗體。例如，根據本發明待使用之單株抗體可藉由各種技術製得，包括(但不限於)融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體展示方法及利用含有人類免疫球蛋白基因座之所有或部分之基因轉殖動物之方法，本文正描述用於製備單株抗體之此等方法及其他例示性方法。
「裸抗體」係指非結合至異源性部分(例如，細胞毒性部分)或放射性標記之抗體。該裸抗體可存在於醫藥調配物中。
「天然抗體」係指具有變化結構之天然生成之免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗體係約150,000道爾頓之異四聚醣蛋白，其由以二硫化物鍵聯之兩條相同輕鏈及兩條相同重鏈組成。自N端至C端，各重鏈具有可變區(VH)(亦稱為可變重域或重鏈可變域)，接著為三個恆定域(CH1、CH2及CH3)。同樣地，自N端至C端，各輕鏈具有可變區(VL)(亦稱為可變輕域或輕鏈可變域)，接著為恆定輕(CL)域。抗體之輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列分配兩種類型(稱為kappa(κ)及lambda(λ))中之一者。
「小瓶」係適用於裝載液體或凍乾製劑之容器。在一些實施例中， 該小瓶係單一用途小瓶，例如，具有瓶塞之20-cc單一用途小瓶。
「口遞送系統」或「PDS」係具有可再填充貯存槽之用於眼部之可植入裝置，可再填充貯存槽容許在延長時間週期內遞送治療劑。該植入物係經構築以具有與貯存槽連通之再填充口及決定將藥物釋放至眼部內之速率之釋放控制元件。參見，例如，US20100174272,8,277,830；8,399,006；8,795,712；及8,808,727。
「小孔針」係指具有約30、29、28、27、26、25、24、23或22號針規或更高之用於注射流體組合物之針，諸如30號針規的針。在一些實施例中，該小孔針具有標準尺寸壁。在另一實施例中，該小孔針具有薄壁，其可優先適用於黏性溶液。
術語「包裝插頁」用以係指通常包括於治療產品之商業包裝中之使用說明，其含有關於適應症、使用方法、劑量、投與、組合療法、禁忌及/或涉及使用此等治療產品之警告之資訊。
相對於參考多肽序列之「百分率(%)胺基酸序列一致性」定義為在比對序列並引入間隔(若有必要)後得到最大百分率序列一致性，及未考慮任何保守取代為序列一致性之一部分時，候選者序列中胺基酸殘基與參考多肽序列中之胺基酸殘基相同之百分率。出於測定百分率胺基酸序列一致性之目的之比對可以熟悉此項技術者已知的各種方式達成，例如，使用公開可用之電腦軟體(諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體)。熟習此項技術者可決定用於比對序列之適當參數，包括在比較中之序列之全長上達成最大比對所需之任何演算法。出於本文之目的，然而，%胺基酸序列一致性值係使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生。該ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech,Inc.授權，且源代碼已與 用戶文檔一起於U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559提出申請，其中其以U.S.Copyright Registration No.TXU510087註冊。該ALIGN-2程式係公開獲得自Genentech,Inc.,South San Francisco,California或可編譯自源代碼。該ALIGN-2程式應經編譯以於UNIX操作系統(包括數位UNIX V4.0D)上使用。所有序列比較參數由ALIGN-2程式設定且請勿改變。
在其中採用ALIGN-2以供胺基酸序列比較之情況下，給定胺基酸序列A相對於給定胺基酸序列B之%胺基酸序列一致性(或者，可表述為相對於給定胺基酸序列B具有或包含一定%胺基酸序列一致性之給定胺基酸序列A)係如下計算：100乘以分數X/Y
其中X係藉由序列比對程式ALIGN-2進行A及B之程式比對，經評分為相同匹配之胺基酸殘基之數量，且其中Y係B中胺基酸殘基之總數。應瞭解，在胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度時，A對B之%胺基酸序列一致性將不等於B對A之%胺基酸序列一致性。除非另有明確說明，否則本文使用之所有%胺基酸序列一致性值可如前一段落中描述使用ALIGN-2電腦程式獲得。
術語「醫藥調配物」係指以可以讓其中所含之活性成分之生物活性起效之形式呈現之製劑，且其不含有毒性是該調配物所投與之個體所不能接受之額外組分。
「醫藥上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成分以外之對個體無毒的成分。醫藥上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
如本文使用，「治療(treatment)」(及其語法變化，諸如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指嘗試改變治療中之個體之自然病程且可針對預防或在臨床病理病程期間進行之臨床干預。治療之所需效果包括(但不限於)防止疾病之出現或復發；緩解症狀；減小該疾病之任何直接或間接病理學後果；減小疾病進展之速率；改善或減輕疾病狀態；及緩和或提高預後。在一些實施例中，本發明抗體係用以延遲疾病之發展或減緩疾病之進展。在治療免疫相關疾病中，治療劑可直接改變免疫反應之組分之反應之量級，或使得該疾病更易藉由其他治療劑(例如，抗生素、抗真菌劑、抗炎性劑、化學治療劑等)進行治療。
疾病(諸如補體相關眼部病症)之「病理學」包括危及病患健康之所有現象。此包括但不限於異常或不可控制之細胞(嗜中性、嗜伊紅、單核球性、淋巴球性細胞)生長、抗體產生、自體抗體產生、補體產生、干擾相鄰細胞之正常工作、以異常濃度釋放細胞介素或其他分泌產物、抑制或加劇任何炎性或免疫反應、炎性細胞(嗜中性、嗜伊紅、單核球性、淋巴球性細胞)浸潤至細胞空間內等。
「組合」一或多種其他治療劑之投與包括同時(並行)及按任何順序之連續投與。
與一或多種其他藥物「並行」投與之藥物係在相同治療週期期間、在與一或多種其他藥物治療之同一天及視需要在與一或多種其他藥物治療之同時投與。
「治療有效量」係達成目標疾病或病症(諸如，例如，補體相關眼部病症)之狀態(例如，病理學)之可量測改善所需之因子D拮抗劑之量。
術語「長效遞送」、「緩釋」及「控制釋放」係通常用以描述遞送 機制，該遞送機制使用調配物、劑型、裝置或其他類型之技術以達成治療藥物之延長或延伸釋放或生物可利用率。其可為指向一般全身性循環或個體或個體中之局部作用位點(包括但不限於細胞、組織、器官、關節、區域及類似物)提供藥物之延長或延伸釋放或生物可利用率之技術。此外，此等術語可係指用以延長或延伸藥物自調配物或劑型之釋放之技術或其等可係指用以延伸或延長藥物對個體之生物可利用率或藥物動力學或持續作用時間之技術或其等可係指用以延伸或延長由調配物引起之藥物動力學效應之技術。「長效調配物」、「緩釋調配物」或「控制釋放調配物」係用以提供長效遞送之醫藥調配物、劑型或其他技術。在一些實施例中，該控制釋放係用以改善藥物之局部生物可利用率，明確言之，在眼遞送之情況中為眼部停留時間。「增加之眼部停留時間」係指經遞送之眼藥物在品質(活性)及數量(有效量)上皆保持有效之遞送後時間。除高劑量及控制釋放外或代替高劑量及控制釋放，該藥物可經轉譯後修飾，諸如經由聚乙二醇化，以達成增加之活體內半衰期。
術語「可變區」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈中涉及將該抗體結合至抗原之結構域。天然抗體之重鏈及輕鏈之可變域(分別係VH及VL)通常具有相似結構，且各域包含四個保守框架區(FR)及三個高度可變區(HVR)。(參見，例如，Kindt等人Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91頁(2007))。單一VH或VL域可足以賦予抗原結合特異性。此外，結合特定抗原之抗體可使用來自結合該抗原之抗體之VH或VL域以分別篩選互補VL或VH域之庫進行分離。參見，例如，Portolano等人，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352：624-628(1991)。
如本文使用，術語「載體」係指核酸分子，該核酸分子能夠傳播與其連接之另一核酸。該術語包括呈自我複製核酸結構之載體及併入宿主細胞(該宿主細胞中已引入該載體)之基因體內之載體。某些載體能夠引導其等操作連接之核酸之表現。本文中亦將此等載體稱為「表現載體」。
II.組合物及方法
在一些實施例中，本發明係(部分)基於結合至因子D之抗體及包含此等抗體之結合物。本發明抗體及結合物係(例如)適用於治療補體相關失調症(諸如補體相關眼部病症)。
A.例示性抗因子D抗體
本文提供結合至因子D之分離抗體。特定言之，本文提供以非常高親和性(諸如以小於100pM、或小於75pM、或小於50pM、或小於10pM之KD)結合因子D之抗體。另外，本文提供高度可溶之抗體(諸如Fab)。例如，在一些實施例中，包含高濃度本文提供之抗體之醫藥調配物不含有在4℃下儲存至少20週後可見之沈澱。在一些實施例中，包含高濃度本文提供之抗體之醫藥調配物包含至少200mg/mL或至少230mg/mL或至少250mg/mL或至少270mg/mL之抗體(諸如Fab)。在一些實施例中，本文提供之抗體可以高濃度(諸如至少150mg/mL)調配，且在25℃下具有小於30cP或小於20cP或小於15cP或小於10cP之黏度。在本文描述之實施例中之任何一者中，該等抗體可為單株抗體。在一些實施例中，該等抗體可為人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體。在本文描述之實施例中之任何一者中，該等抗體可為Fab片段。
在一些實施例中，本發明提供包含選自以下之至少一、二、三、四、五或六個HVR之抗因子D抗體：(a)包含胺基酸序列SYYMY(SEQ ID NO：15)之HVR-H1；(b)包含胺基酸序列X4INPX5X6GX7TNFNEKFKS(SEQ ID NO：111)之HVR-H2，其中X4係選自E及W；X5係選自T及Y；X6係選自N、S及Q；及X7係選自G、D及E；(c)包含胺基酸序列EGGFAY(SEQ ID NO：25)之HVR-H3；(d)包含胺基酸序列KASQNVDTDVA(SEQ ID NO：9)之HVR-L1；(e)包含胺基酸序列SASSRX1S(SEQ ID NO：108)之HVR-L2，其中X1係選自Y、K及R；及(f)包含胺基酸序列QQYX3NYPLT(SEQ ID NO：110)之HVR-L3，其中X3係選自N及E。在一些實施例中，本發明提供包含序列X2SASSRX1S(SEQ ID NO：109；即，包含緊接著HVR-L2之胺基酸X2)之抗因子D抗體，其中X1係選自Y、K及R；X2係選自Y、R、S、K及Q。在一些實施例中，X2係R。在一些實施例中，X1係Y。
在一些實施例中，本發明提供包含選自以下之至少一、二、三、四、五或六個HVR之抗因子D抗體：(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含選自SEQ ID NO：16至24之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含選自SEQ ID NO：10至12之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：13或14之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，本發明提供包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列之抗體：(a)包含胺基酸序列SYYMY(SEQ ID NO：15)之HVR-H1；(b)包含胺基酸序列X4INPX5X6GX7TNFNEKFKS(SEQ ID NO：111)之HVR-H2，其中X4係選自E及W；X5係選自T及Y；X6係選自N、S及Q；及X7係選自G、D及E；(c)包含胺基酸序列EGGFAY(SEQ ID NO：25)之HVR-H3。在一些實施例中，本發明提供包含選自以 下之至少一個、至少兩個或所有三個HVR之抗因子D抗體：(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含選自SEQ ID NO：16至24之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3。在一些實施例中，本發明提供包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個HVR之抗因子D抗體：(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3。在一些實施例中，本發明提供包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個HVR之抗因子D抗體：(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3。在一些實施例中，本發明提供包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個HVR之抗因子D抗體：(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3。在一些實施例中，本發明提供包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個HVR之抗因子D抗體：(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3。在一些實施例中，本發明提供包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個HVR之抗因子D抗體：(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3。在一些實施例中，本發明提供包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個HVR之抗因子D抗體：(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：21 之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3。在一些實施例中，本發明提供包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個HVR之抗因子D抗體：(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3。在一些實施例中，本發明提供包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個HVR之抗因子D抗體：(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3。在一些實施例中，本發明提供包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個HVR之抗因子D抗體：(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3。
在一些實施例中，本發明提供包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VL HVR序列之抗體：(a)包含胺基酸序列KASQNVDTDVA(SEQ ID NO：9)之HVR-L1；(b)包含胺基酸序列SASSRX1S(SEQ ID NO：108)之HVR-L2，其中X1係選自Y、K及R；及(c)包含胺基酸序列QQYX3NYPLT(SEQ ID NO：110)之HVR-L3，其中X3係選自N及E。在一些實施例中，本發明提供包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個HVR之抗因子D抗體：(a)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含選自SEQ ID NO：10至12之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：13或14之胺基酸序列之HVR-L3。在一些實施例中，本發明提供包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個HVR之抗因子D抗體：(a)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO： 10之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3。在一些實施例中，本發明提供包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個HVR之抗因子D抗體：(a)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3。在一些實施例中，本發明提供包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個HVR之抗因子D抗體：(a)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3。在一些實施例中，本發明提供包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個HVR之抗因子D抗體：(a)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-L3。在一些實施例中，本發明提供包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個HVR之抗因子D抗體：(a)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3。在一些實施例中，本發明提供包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個HVR之抗因子D抗體：(a)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-L3。在前述實施例之任何一者中，緊跟著HVR-L2之胺基酸可選自Y、R、S、K及Q。在一些實施例中，緊跟著HVR-L2之胺基酸係R。
在一些實施例中，提供抗因子D抗體，其中該抗體包含(a)包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列之VH域：(i)包含胺 基酸序列SYYMY(SEQ ID NO：15)之HVR-H1；(ii)包含胺基酸序列X4INPX5X6GX7TNFNEKFKS(SEQ ID NO：111)之HVR-H2，其中X4係選自E及W；X5係選自T及Y；X6係選自N、S及Q；及X7係選自G、D及E；及(iii)包含胺基酸序列EGGFAY(SEQ ID NO：25)之HVR-H3；及(b)包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VL HVR序列之VL域：(i)包含胺基酸序列KASQNVDTDVA(SEQ ID NO：9)之HVR-L1；(ii)包含胺基酸序列SASSRX1S(SEQ ID NO：108)之HVR-L2，其中X1係選自Y、K及R；及(c)包含胺基酸序列QQYX3NYPLT(SEQ ID NO：110)之HVR-L3，其中X3係選自N及E。
在一些實施例中，提供抗因子D抗體，其中該抗體包含(a)包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列之VH域：(i)包含胺基酸序列SYYMY(SEQ ID NO：15)之HVR-H1；(ii)包含胺基酸序列X4INPX5X6GX7TNFNEKFKS(SEQ ID NO：111)之HVR-H2，其中X4係選自E及W；X5係選自T及Y；X6係選自N、S及Q；及X7係選自G、D及E；及(iii)包含胺基酸序列EGGFAY(SEQ ID NO：25)之HVR-H3；及(b)包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VL HVR序列之VL域：(i)包含胺基酸序列KASQNVDTDVA(SEQ ID NO：9)之HVR-L1；(ii)包含胺基酸序列SASSRX1S(SEQ ID NO：108)之HVR-L2，其中X1係選自Y、K及R；及(c)包含胺基酸序列QQYX3NYPLT(SEQ ID NO：110)之HVR-L3，其中X3係選自N及E。在一些實施例中，本發明提供包含序列X2SASSRX1S(即，包含緊接著HVR-L2之胺基酸X2)之抗因子D抗體，其中X1係選自Y、K及R；X2係選自Y、R、S、K及Q。在一些實施例中，X2係R。在一些實施例中，X1係Y。
在一些實施例中，提供抗因子D抗體，其中該抗體包含(a)包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列之VH域：(i)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(ii)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H2；及(iii)包含選自SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VL HVR序列之VL域：(i)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，提供抗因子D抗體，其中該抗體包含(a)包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列之VH域：(i)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(ii)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之HVR-H2；及(iii)包含選自SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VL HVR序列之VL域：(i)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，提供抗因子D抗體，其中該抗體包含(a)包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列之VH域：(i)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(ii)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-H2；及(iii)包含選自SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VL HVR序列之VL域：(i)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：13之胺基酸 序列之HVR-L3。
在一些實施例中，提供抗因子D抗體，其中該抗體包含(a)包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列之VH域：(i)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(ii)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2；及(iii)包含選自SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VL HVR序列之VL域：(i)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，提供抗因子D抗體，其中該抗體包含(a)包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列之VH域：(i)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(ii)包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之HVR-H2；及(iii)包含選自SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VL HVR序列之VL域：(i)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，提供抗因子D抗體，其中該抗體包含(a)包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列之VH域：(i)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(ii)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列之HVR-H2；及(iii)包含選自SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VL HVR序列之VL域：(i)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，提供抗因子D抗體，其中該抗體包含(a)包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列之VH域：(i)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(ii)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2；及(iii)包含選自SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VL HVR序列之VL域：(i)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，提供抗因子D抗體，其中該抗體包含(a)包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列之VH域：(i)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(ii)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H2；及(iii)包含選自SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VL HVR序列之VL域：(i)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，提供抗因子D抗體，其中該抗體包含(a)包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列之VH域：(i)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(ii)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-H2；及(iii)包含選自SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VL HVR序列 之VL域：(i)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，提供抗因子D抗體，其中該抗體包含(a)包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列之VH域：(i)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(ii)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H2；及(iii)包含選自SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VL HVR序列之VL域：(i)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，提供抗因子D抗體，其中該抗體包含(a)包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列之VH域：(i)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(ii)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H2；及(iii)包含選自SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VL HVR序列之VL域：(i)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，提供抗因子D抗體，其中該抗體包含(a)包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列之VH域：(i)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(ii)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H2；及(iii)包含選自SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR- H3；及(b)包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VL HVR序列之VL域：(i)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；(ii)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，提供抗因子D抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，提供抗因子D抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，提供抗因子D抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，提供抗因子D抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之 HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，提供抗因子D抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，提供抗因子D抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，提供抗因子D抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，提供抗因子D抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，提供抗因子D抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR- H2；(c)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，提供抗因子D抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，提供抗因子D抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，提供抗因子D抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3。
在本文實施例之任何一者中，抗因子D抗體可經人類化。在一些實施例中，抗因子D抗體包含如於上文實施例中之任何一者中之HVR，及其進一步包含人類受體框架(例如，人類免疫球蛋白框架或人類共同框架)。在某些實施例中，該人類受體框架係人類VL κ I共同(VLKI)框架及/或VH框架VH1。在某些實施例中，該人類受體框架係人類VL κ I共同(VLKI)框架 及/或包含本文描述之突變中之任何一者之VH框架VH1。
在另一態樣中，抗因子D抗體包含具有與選自SEQ ID NO：27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61及63之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之序列之重鏈可變域(VH)序列。在某些實施例中，具有與選自SEQ ID NO：27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61及63之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同之VH序列含有相對於參考序列之取代(例如，保守取代)、嵌入或刪除，但包含該序列之抗因子D抗體保留結合至因子D之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO：27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61或63中總計1至10個胺基酸已經取代、嵌入及/或刪除。在某些實施例中，在SEQ ID NO：27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61或63中總計1至5個胺基酸已經取代、嵌入及/或刪除。在某些實施例中，取代、嵌入或刪除發生在HVR外部區域中(即，在FR中)。視需要，該抗因子D抗體包含SEQ ID NO：27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61或63之VH序列，包括該序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，該VH包含選自以下之一、二或三個HVR：(a)包含胺基酸序列SYYMY(SEQ ID NO：15)之HVR-H1；(b)包含胺基酸序列X4INPX5X6GX7TNFNEKFKS(SEQ ID NO：111)之HVR-H2，其中X4係選自E及W；X5係選自T及Y；X6係選自N、S及Q；及X7係選自G、D及E；及(c)包含胺基酸序列EGGFAY(SEQ ID NO：25)之HVR-H3。在一些 實施例中，該VH包含選自以下之一、二或三個HVR：(a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：16或20之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3。
在另一態樣中，提供抗因子D抗體，其中該抗體包含具有與選自SEQ ID NO：26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60及62之胺基酸序列至少90%,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈可變域(VL)。在某些實施例中，具有與選自SEQ ID NO：26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60及62之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VL序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、嵌入或刪除，但包含該序列之抗因子D抗體保留結合至因子D之能力。在某些實施例中，總計1至10個胺基酸於SEQ ID NO：26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或62中已經取代、嵌入及/或刪除。在某些實施例中，總計1至5個胺基酸於SEQ ID NO：26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或62中已經取代、嵌入及/或刪除。在某些實施例中，該等取代、嵌入或刪除發生於HVR外(即，於FR中)。視需要，該抗因子D抗體包含SEQ ID NO：26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或62之VL序列，其包括該序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，該VL包含選自以下之一、二或三個HVR：(a)包含胺基酸序列KASQNVDTDVA(SEQ ID NO：9)之HVR-L1；(b)包含胺基酸序列SASSRX1S(SEQ ID NO：108)之HVR-L2，其中X1係選自Y、K及R； 及(c)包含胺基酸序列QQYX3NYPLT(SEQ ID NO：110)之HVR-L3，其中X3係選自N及E。在一些實施例中，該VL包含選自以下之一、二或三個HVR：(a)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3。在前述實施例之任何一者中，緊接著HVR-L2之胺基酸可選自Y、R、S、K及Q。在一些實施例中，緊接著HVR-L2之胺基酸係R。
在另一態樣中，提供抗因子D抗體，其中該抗體包含如上文提供之實施例中之任何一者中之VH及如上文提供之實施例中之任何一者中之VL。
在一些實施例中，該抗體包含分別為SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：34中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一些實施例中，該抗體包含分別為SEQ ID NO：39及SEQ ID NO：38中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。
在另一態樣中，本文提供與抗因子D抗體結合至相同抗原決定基之抗體。例如，在某些實施例中，本文提供與抗因子D抗體結合至相同抗原決定基之抗體，其分別包含SEQ ID NO：35之VH序列及SEQ ID NO：34之VL序列。在某些實施例中，提供與抗因子D抗體結合至相同抗原決定基之抗體，其分別包含SEQ ID NO：39之VH序列及SEQ ID NO：38之VL序列。
本文提供包含包含如圖1A至C中繪示之根據Kabat編號之HVR1-LC、HVR2-LC及HVR3-LC序列之輕鏈可變域及包含包含如圖2A至C中繪示之根據Kabat編號之HVR1-HC、HVR2-HC及HVR3-HC序列之重鏈可變域之抗體。在一些實施例中，該抗體包含包含如圖1A至C中繪示之HVR1-LC、HVR2-LC及/或HVR3-LC序列及FR1-LC、FR2-LC、FR3-LC及/或 FR4-LC序列之輕鏈可變域。在一些實施例中，該抗體包含包含如圖2A至C中繪示之HVR1-HC、HVR2-HC及/或HVR3-HC序列及FR1-HC、FR2-HC、FR3-HC及/或FR4-HC序列之重鏈可變域。
在本發明之另一態樣中，根據上文實施例中之任何一者之抗因子D抗體係單株抗體(包括人類抗體)。在一些實施例中，抗因子D抗體係抗體片段，例如，Fv、Fab、Fab-SH、Fab’-SH、Fab’、Fab-C、Fab’-C、Fab’-C-SH、Fab-C-SH、scFv、雙功能抗體或F(ab’)2片段。在另一實施例中，該抗體係大體上全長抗體，例如，IgG1抗體、IgG2a抗體或如本文定義之其他抗體分類或同型。在一些實施例中，該抗因子D抗體係Fab。
在另一態樣中，根據上文實施例中之任何一者之抗因子D抗體可各自或組合併入如下文描述之特徵中之任何一者。
1.抗體親和性
在某些實施例中，本文提供之抗體具有1μM、100nM、50nM、10nM、5nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM，及視需要係10-13M之解離常數(Kd)。(例如，10-8M或以下，例如，10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)。
在一些實施例中，Kd係藉由以受關注之抗體之Fab版本及其抗原進行之放射性標記抗原結合分析(RIA)進行量測，如藉由下列分析描述。Fab對抗原之溶液結合親和性係藉由在滴定系列之未標記抗原之存在下以最小濃度之(125I)標記抗原平衡Fab，然後以經抗Fab抗體塗覆之板捕獲經結合之抗原進行量測(參見，例如，Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999))。為建立用於該分析之條件，將MICROTITER®多孔板(Thermo Scientific)用含於50mM碳酸鈉(pH 9.6)中之5μg/ml捕獲抗Fab 抗體(Cappel Labs)塗覆整夜，及接著用含於PBS中之2%(w/v)胎牛血清白蛋白在室溫(約23℃)下阻斷二至五個小時。在非吸附板(Nunc #269620)中，將100pM或26pM[125I]-抗原與受關注之Fab之連續稀釋物混合(例如，與抗VEGF抗體(Fab-12)之評估一致，Presta等人，Cancer Res.57：4593-4599(1997)中)。然後將受關注之Fab培養整夜；然而，該培養可繼續進行較長時間(例如，約65小時)以確保達成平衡。此後，將混合物轉移至捕獲板中以在室溫下進行培養(例如，培養一小時)。然後移除該溶液及該板用含於PBS中之0.1%聚山梨醇酯20(TWEEN-20®)清洗八次。當該等板已變乾時，添加150μL/孔之閃爍體(MICROSCINT-20 TM；Packard)，及該等板係於TOPCOUNT TM加馬計數器(Packard)上計數十分鐘。給出最大結合之小於或等於20%之各Fab之濃度係經選擇以用於競爭結合分析中。
根據另一實施例，Kd係使用BIACORE®-2000或BIACORE®-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)在25℃下用~10反應單元(RU)的固定化抗原CM5晶片使用表面電漿子共振分析量測。簡而言之，羧甲基化聚葡萄糖生物感測器晶片(CM5,BIACORE,Inc.)係用N-乙基-N’-(3-二甲基胺基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)根據供應商之使用說明進行活化。抗原在以5μL/分鐘之流動速率注射前用10mM乙酸鈉(pH 4.8)稀釋至5μg/ml(~0.2μM)以達成約10個反應單元(RU)之偶聯蛋白。注射抗原後，注射1M乙醇胺以阻斷未反應之基團。就動力學量測而言，在25℃下以約25μL/min之流動速率將Fab(0.78nM至500nM)之兩倍連續稀釋物注射至含0.05%聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性劑(PBST)之PBS中。結合速率(kon)及解離速率(koff)係使用簡單一比一朗謬 結合模型(BIACORE®評估軟體3.2版)藉由同時擬合結合及解離感測圖進行計算。平衡解離常數(Kd)係計算為比率koff/kon。參見，例如，Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。若藉由上文之表面電漿子共振分析測定之結合速率超過106 M-1 s-1，則該結合速率可藉由使用螢光猝滅技術進行測定，該技術量測在如於分光光度計(諸如停流裝備分光光度計(Aviv Instruments)或具有經攪拌之光析管之8000系列SLM-AMINCO TM分光光度計(ThermoSpectronic))中量測之漸增濃度抗原之存在下，含於PBS(pH 7.2)中之20nM抗抗原抗體(Fab形式)在25℃下之螢光發射強度(激發=295nM；發射=340nM，16nM帶通)之增加或減小。
2.抗體片段
在某些實施例中，本文提供之抗體係抗體片段。抗體片段包括但不限於Fv、Fab、Fab-SH、Fab’-SH、Fab’、Fab-C、Fab’-C、Fab’-C-SH、Fab-C-SH、scFv、雙功能抗體或F(ab’)2片段及本文描述之其他片段。為回顧某些抗體片段，參見Hudson等人Nat.Med.9：129-134(2003)。為回顧scFv片段，參見，例如，Pluckthün，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編，(Springer-Verlag,New York)，第269至315頁(1994)；亦參見WO 93/16185；及美國專利案第5,571,894及5,587,458號。為討論包含挽救受體結合抗原決定基殘基且具有增加之活體內半衰期之Fab及F(ab')2片段，參見美國專利案第5,869,046號。具有游離硫醇基之抗體片段可用「-SH」指示。例如，Fab-SH(包括Fab-C-SH)係用於指定其中恆定域之至少一個半胱胺酸攜載游離硫醇基之Fab。
在一些實施例中，Fab片段之重鏈之C端於胺基酸「CDKTHT」 (SEQ ID NO：165)、「CDKTHL」(SEQ ID NO：166)、「CDKTH」(SEQ ID NO：167)、「CDKT」(SEQ ID NO：168)、「CDK」或「CD」中結束。在一些實施例中，Fab片段之重鏈之C端於序列CDKTH X (SEQ ID NO：169)中結束，其中 X 係除T外之任何胺基酸。C端處之截斷及/或突變可能夠減少或消除針對Fab之AHA反應性，而不折損熱穩定性或表現。在一些實施例中，Fab片段之重鏈之C端於胺基酸「CDKTHTC」(SEQ ID NO：170)、「CDKTHTCPPC」(SEQ ID NO：171)、「CDKTHTCPPS」(SEQ ID NO：172)、「CDKTHTSPPC」(SEQ ID NO：173)、「CDKTHTAPPC」(SEQ ID NO：174)、「CDKTHTSGGC」(SEQ ID NO：175)或「CYGPPC」(SEQ ID NO：176)中結束。在一些此等實施例中，C端胺基酸中之游離半胱胺酸可適合結合(例如)至聚合物(諸如PEG)。在一些實施例中，Fab片段包含選自SEQ ID NO：113(CDKTHT(SEQ ID NO：165))、128至132(CDKTHL(SEQ ID NO：166)、CDKTHTC(SEQ ID NO：170)、CDKTHTCPPC(SEQ ID NO：171)、CDKTHTCPPS(SEQ ID NO：172)、CDKTHTSPPC(SEQ ID NO：173))、154至156(APPC(SEQ ID NO：177)、SGGC(SEQ ID NO：178)、CYGPPC(SEQ ID NO：176))及134至137(CDKTH(SEQ ID NO：167)、CDKT(SEQ ID NO：168)、CDK、CD)之重鏈恆定區。在一些實施例中，Fab係包含SEQ ID NO：138(VERK(SEQ ID NO：179))之重鏈恆定區之IgG2 Fab片段或包含SEQ ID NO：157(VERKC(SEQ ID NO：180))之重鏈恆定區之IgG2 Fab-C片段。在一些實施例中，Fab係包含選自SEQ ID NO：139(KYGPP(SEQ ID NO：181))、SEQ ID NO：163(KYGP(SEQ ID NO：182))及159至161(KYG,KY,K)之重鏈恆定區之 IgG4 Fab片段，或包含SEQ ID NO：158(KYGPPC(SEQ ID NO：183))之重鏈恆定區之IgG4 Fab-C片段。作為C端處之截斷及/或突變之替代，為避免預先存在之抗鉸鏈抗體(PE-AHA)反應，可使用IgG2或IgG4 Fab片段，因為此等不顯示PE-AHA反應。
雙功能抗體係具有兩個抗原結合位點之抗體片段，其等可為二價或雙特異性的。參見，例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三功能抗體及四功能抗體係亦描述於Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)中。
單域抗體係包含抗體之重鏈可變域之所有或部分或抗體之輕鏈可變域之所有或部分之抗體片段。在某些實施例中，單域抗體係人類單域抗體(Domantis,Inc.,Waltham,MA；參見，例如，美國專利案第6,248,516 B1號)。
如本文描述，抗體片段可藉由各種技術製得，該等技術包括但不限於完整抗體之蛋白水解消化及藉由宿主細胞(例如，大腸桿菌或噬菌體)之產生。
3.嵌合及人類化抗體
在某些實施例中，本文提供之抗體係嵌合抗體。某些嵌合抗體係描述(例如)於美國專利案第4,816,567號；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855(1984))中。在一個實例中，嵌合抗體包含非人類可變區(例如，衍生自小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物諸如猴之可變區)及人類恆定區。在另一實例中，嵌合抗體係「經類別轉換之」抗體，其中該類別或子類已變化自親代抗體之類別或子類。嵌合抗 體包括其抗原結合片段。
在某些實施例中，嵌合抗體係人類化抗體。通常，非人類抗體係經人類化以減小對人類之免疫原性，同時保留親代非人類抗體之特異性及親和性。通常，人類化抗體包含一或多個可變域，其中HVR例如CDR(或其部分)係衍生自非人類抗體及FR(或其部分)係衍生自人類抗體序列。人類化抗體視需要將亦包含人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基係經來自非人類抗體(例如，衍生HVR殘基之抗體)之相應殘基取代(例如)以恢復或改善抗體特異性或親和性。
人類化抗體及其製造方法係回顧於(例如)於Almagro及Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008)中，且係進一步描述(例如)於Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美國專利案第5,821,337、7,527,791、6,982,321及7,087,409號；Kashmiri等人，Methods 36：25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)接合)；Padlan,Mol.Immunol.28：489-498(1991)(描述「表面重修」)；Dall’Acqua等人，Methods 36：43-60(2005)(描述「FR改組」)；及Osbourn等人，Methods 36：61-68(2005)及Klimka等人，Br.J.Cancer,83：252-260(2000)(描述解決FR改組之「定向選擇」方法)。
可用於人類化之人類框架區包括但不限於：使用「最佳擬合」方法選定之框架區(參見，例如，Sims等人，J.Immunol.151：2296(1993))；自輕鏈或重鏈可變區之特定子群之人類抗體之共同序列衍生之框架區(參見，例如，Carter等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4285(1992)；及Presta等人J.Immunol.,151：2623(1993))；人類成熟(經體細胞突變之)框 架區或人類生殖系列框架區(參見，例如，Almagro及Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；及自篩選FR庫衍生之框架區(參見，例如，Baca等人，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)及Rosok等人，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。
4.人類抗體
在某些實施例中，本文提供之抗體係人類抗體。人類抗體可使用此項技術中已知的各種技術產生。人類抗體係通常描述於van Dijk及van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20：450-459(2008)中。
人類抗體可藉由向已經修飾以產生完整人類抗體或具有人類可變區以回應於抗原激發之完整抗體之轉基因動物投與免疫原製得。此等動物通常含有人類免疫球蛋白基因座之所有或部分，其等置換內源性免疫球蛋白基因座，或其等係存在於染色體外或隨機整合於該動物之染色體內。在此等轉基因小鼠中，該內源性免疫球蛋白基因座通常已經滅活。為回顧用於自轉基因動物獲得人類抗體之方法，參見Lonberg,Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。亦參見，例如，描述XENOMOUSETM技術之美國專利案第6,075,181及6,150,584號；描述HUMAB®技術之美國專利案第5,770,429號；描述K-M MOUSE®技術之美國專利案第7,041,870號；及描述VELOCIMOUSE®技術之美國專利申請公開案第US 2007/0061900號)。來自藉由此等動物產生之完整抗體之人類可變區可經進一步修飾，例如，藉由組合不同人類恆定區。
人類抗體亦可藉由基於融合瘤之方法製得。已描述於用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤細胞系。(參見，例如， Kozbor J.Immunol.,133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51至63頁(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；及Boerner等人，J.Immunol.,147：86(1991))。經由人類B細胞融合瘤技術產生之人類抗體亦描述於Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103：3557-3562(2006)中。額外方法包括彼等(例如)描述於美國專利案第7,189,826號(描述自融合瘤細胞系產生單株人類IgM抗體)及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4)：265-268(2006)(描述人類-人類融合瘤)中。人類融合瘤技術(Trioma技術)亦描述於Vollmers及Brandlein，Histology and Histopathology,20(3)：927-937(2005)及Vollmers及Brandlein，Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3)：185-91(2005)中。
人類抗體亦可藉由分離選自人類衍生之噬菌體展示庫之Fv純系可變域序列產生。此等可變域序列然後可組合所需人類恆定域。下文描述用於自抗體庫選擇人類抗體之技術。
5.庫衍生之抗體
本發明抗體亦可藉由篩選組合庫以獲得具有所需活性之抗體來分離。例如，此項技術中已知用於產生噬菌體展示庫及篩選此等庫以獲得具有所需結合特性之抗體的各種方法。此等方法係評述(例如)於Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O’Brien等人編，Human Press,Totowa,NJ,2001)中及進一步描述(例如)於McCafferty等人，Nature 348：552-554；Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks及Bradbury，於Methods in Molecular Biology 248：161-175(Lo編， Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)中。
在某些噬菌體展示技術方法中，VH及VL基因庫係藉由聚合酶鏈反應(PCR)分別選殖並隨機重組在噬菌體庫中，其等然後以如描述於Winter等人，Ann.Rev.Immunol.,12：433-455(1994)針對抗原-結合噬菌體進行篩選。噬菌體通常會展示抗體片段，呈單鏈Fv(scFv)片段或呈Fab片段。來自免疫源之庫可提供針對免疫原之高親和性抗體而無需構築融合瘤。或者，天然庫可經選殖(例如，自人類)，以提供大範圍之非自身及還有自身抗原抗體之單一來源而無須任何免疫作用，如Griffiths等人，EMBO J,12：725-734(1993)所描述。最後，天然庫亦可藉由自幹細胞選殖未經重排之V基因嵌段，及使用含有隨機序列之PCR引子以編碼高度可變CDR3區及完成活體外重排而合成製得，如藉由Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227：381-388(1992)所描述。描述人類抗體噬菌體庫之專利公開案包括(例如)：美國專利案第5,750,373號及美國專利公開案第2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936及2009/0002360號。
自人類抗體庫分離之抗體或抗體片段在文中視為人類抗體或人類抗體片段。
6.多特異性抗體
在某些實施例中，本文提供之抗體係多特異性抗體，例如，雙特異性抗體。多特異性抗體係對至少兩個不同位點具有結合特異性之單株抗 體。在某些實施例中，該等結合特異性中之一者係針對因子D及另一者係針對任何其它抗原。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合至因子D之兩個不同抗原決定基。雙特異性抗體亦可用以將細胞毒性劑侷限至表現因子D之細胞。雙特異性抗體可製備成全長抗體或抗體片段。
用於製造多特異性抗體之技術包括(但不限於)兩個具有不同特異性之免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之重組共表現(參見Milstein及Cuello,Nature 305：537(1983))、WO 93/08829及Traunecker等人，EMBO J.10：3655(1991))，及「節至孔中(knob-in-hole)」工程改造(參見，例如，美國專利案第5,731,168號)。如本文使用之術語「節至孔中」或「KnH」技術係指藉由在相互作用之界面處將隆突(節)引入一條多肽內及將空腔(孔)引入另一個多肽內而引導兩條多肽活體外或活體內配對在一起之技術。例如，KnH已引入抗體之Fc：Fc結合界面、CL：CH1界面或VH/VL界面中(參見，例如，US 2011/0287009、US2007/0178552、WO 96/027011、WO 98/050431、Zhu等人，1997,Protein Science 6：781-788及WO2012/106587)。在一些實施例中，KnH在製造多特異性抗體期間驅動兩條不同重鏈配對在一起。例如，Fc區中具有KnH之多特異性抗體可進一步包含連接至各Fc區之單一可變域，或進一步包含與類似或不同輕鏈可變域配對之不同重鏈可變域。KnH技術亦可用以將兩個不同受體細胞外域配對在一起或配對任何其他包含不同目標識別序列之多肽序列(例如，包括親合體、肽抗體及其他Fc融合)。
如本文使用之術語「節突變」係指在多肽與另一多肽相互作用之界面處將隆突(節)引入該多肽內之突變。在一些實施例中，該另一多肽具有孔突變。
如本文使用之術語「孔突變」係指在多肽與另一多肽相互作用之界面處將空腔(孔)引入多肽內之突變。在一些實施例中，該另一多肽具有節突變。
下文提供簡要之非限制性討論。
「隆突」係指至少一個胺基酸側鏈，其自第一多肽之界面突出及因此可定位於相鄰界面(即，第二多肽之界面)之補償空腔中以便於穩定異源多聚物，及舉例而言，因此有助於異源多聚物形成於同源多聚物形成物上。該隆突可存在於原始界面中或可合成引入(例如，藉由改變編碼界面之核酸)。在一些實施例中，編碼第一多肽之界面核酸係經改變以編碼隆突。因此，編碼第一多肽之界面中之至少一個「原始」胺基酸殘基之核酸係經編碼至少一個側鏈體積大於原始胺基酸殘基之「輸入」胺基酸殘基之核酸置換。將知曉可存在不止一個原始及相應之輸入殘基。各種胺基酸殘基之側鏈體積示(例如)於US2011/0287009之表1中。引入「隆突」之突變可稱為「節突變」。
在一些實施例中，用於形成隆突之輸入殘基係選自以下之天然生成之胺基酸殘基：精胺酸(R)、苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)及色胺酸(W)。在一些實施例中，輸入殘基係色胺酸或酪胺酸。在一些實施例中，用於形成隆突之原始殘基具有小側鏈體積，諸如丙胺酸、天冬醯胺酸、天冬胺酸、甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸。
「空腔」係指至少一個胺基酸側鏈，其係自第二多肽之界面凹進及因此容納第一多肽之相鄰界面上之相應隆突。該空腔可存在於原始界面中或可合成引入(例如，藉由改變編碼該界面之核酸)。在一些實施例中，編碼第二多肽之界面之核酸係經改變以編碼該空腔。因此，編碼第二多肽之 界面中之至少一個「原始」胺基酸殘基之核酸係經編碼至少一個具有比胺基酸殘基更小之側鏈體積之「輸入」胺基酸殘基之DNA置換。將知曉可存在不止一個原始及相應之輸入殘基。在一些實施例中，用於形成空腔之輸入殘基係選自以下之天然生成之胺基酸殘基：丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)及纈胺酸(V)。在一些實施例中，輸入殘基係絲胺酸、丙胺酸或蘇胺酸。在一些實施例中，用於形成空腔之原始殘基具有大側鏈體積，諸如酪胺酸、精胺酸、苯丙胺酸或色胺酸。引入「空腔」之突變可稱為「孔突變」。
隆突係「可定位」在空腔中，其意謂第一多肽及第二多肽之界面上之隆突及空腔之各自空間位置及隆突及空腔之大小係使得該隆突可位於空腔中而不顯著擾亂第一及第二多肽於界面處之正常結合。因為隆突(Tyr、Phe及Trp)通常不自該界面之軸垂直延伸及具有較佳構形，隆突與相應空腔之對齊可(在一些實例中)依賴於基於諸如藉由X射線結晶術或核磁共振(nMR)獲得之三維結構建模隆突/空腔對。此可使用此項技術中公認之技術達成。
在一些實施例中，IgG1恆定區中之節突變係T366W(EU編號)。在一些實施例中，IgG1恆定區中之孔突變包含一或多個選自T366S、L368A及Y407V(EU編號)之突變。在一些實施例中，IgG1恆定區中之孔突變包含T366S、L368A及Y407V(EU編號)。
在一些實施例中，IgG4恆定區中之節突變係T366W(EU編號)。在一些實施例中，IgG4恆定區中之孔突變包含一或多個選自T366S、L368A及Y407V(EU編號)之突變。在一些實施例中，IgG4恆定區中之孔突變包含T366S、L368A及Y407V(EU編號)。
多特異性抗體亦可藉由以下方式來製造：改造靜電轉向效應以製造抗體Fc-異源二聚分子(WO 2009/089004A1)；使兩個或多個抗體或片段交聯(參見，例如，美國專利案第4,676,980號及Brennan等人，Science,229：81(1985))；使用白胺酸拉鏈以產生雙特異性抗體(參見，例如，Kostelny等人，J.Immunol.,148(5)：1547-1553(1992))；使用「雙功能抗體」技術以製造雙特異性抗體片段(參見，例如，Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993))；及使用單鏈Fv(sFv)二聚物(參見，例如，Gruber等人，J.Immunol.,152：5368(1994))；及製備三特異性抗體，如描述(例如)於Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991)中。
本文亦包括具有三個或多個功能抗原結合位點之經工程改造之抗體，其等包括「章魚抗體」(參見，例如，US 2006/0025576A1)。
本文之抗體或片段亦包括「雙重作用FAb」或「DAF」，其包含結合至因子D之抗原結合位點及另一不同抗原(舉例而言，參見，US 2008/0069820)。
7.抗體變體
在某些實施例中，預期本文提供之抗體之胺基酸序列變體。例如，可能需要改善抗體之結合親和性及/或其他生物性質。抗體之胺基酸序列變體可藉由將適當之修飾引入編碼該抗體之核苷酸序列內或藉由肽合成製得。此等修飾包括(例如)於該抗體之胺基酸序列內之殘基之刪除及/或嵌入及/或取代。可作出刪除、嵌入及取代之任何組合以達成最終構築體，只要該最終構築體具有所需之特性(例如，抗原結合特性)即可。
a)取代、嵌入及刪除變體
在某些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗體變體。用於 取代誘變之所感興趣位點包括HVR及FR。保守取代係以「較佳取代」之標題示於表1中。更實質性變化係以「例示性取代」之標題提供於表1中，且如參考胺基酸側鏈類別進一步描述於下文中。可將胺基酸取代引入所感興趣抗體內並針對所需活性(例如，保留/改善之抗原結合、減小之免疫原性或改善之ADCC或CDC)篩選產物。
胺基酸可根據常見側鏈性質進行分組：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性疏水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈位向之殘基：Gly、Pro；(6)芳香性：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代將需要此等類別中之一者之成員交換成另一類別。
取代變體之一種類型涉及取代親代抗體(例如，人類化或人類抗體)之一或多個高度可變區殘基。通常，經選擇用於進一步研究之所得變體相對於親代抗體將於某些生物性質(例如，增加之親和性、減小之免疫原性)方面具有修飾(例如，改善)及/或將具有親代抗體之大體上保留之某些生物性質。例示性取代變體係親和性成熟抗體，其可合宜地(例如)使用基於噬菌體展示技術之親和性成熟技術(諸如彼等本文描述者)來產生。簡而言之，一或多個HVR殘基係經突變且該等變體抗展示於噬菌體上並針對特定生物活性(例如，結合親和性)進行篩選。
可於HVR中作出改變(例如，取代)(例如)以改善抗體親和性。該等改變可於HVR「熱點」(即，由在體細胞突變過程期間經受高頻突變之密碼子編碼之殘基(參見，例如，Chowdhury,Methods Mol.Biol.207：179-196(2008))及/或SDR(a-CDR))中作出，且測試所得變體VH或VL之結合親和性。藉由自輔助庫(secondary library)構築且再選擇之親和性成熟已描述(例如)於Hoogenboom等人之Methods in Molecular Biology 178：1-37(O’Brien等人編，Human Press,Totowa,NJ,(2001))中。在親和性成熟之一些實施例中，多樣性係藉由各種方法(例如，易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸定向誘變)中之任何一者而引入針對成熟選擇之可變基因內。然後建立輔助庫。然後篩選該庫以識別具有所需親和性之任何抗體變體。引入多 樣性之另一方法涉及HVR定向方法，其中隨機化若干HVR殘基(例如，每次4至6個殘基)。涉及抗原結合之HVR殘基可(例如)使用丙胺酸掃描誘變或建模來特定識別。通常靶向特定言之CDR-H3及CDR-L3。
在某些實施例中，取代、嵌入或刪除可發生於一或多個HVR內，只要此等改變不實質性減小抗體結合抗原之能力即可。例如，可於HVR中作出不實質性減小結合親和性之保守改變(例如，如本文提供之保守取代)。此等改變可(例如)在HVR「熱點」或SDR之外部。在上文提供之變體VH及VL序列之某些實施例中，各HVR未經改變或含有不超過一、二或三個胺基酸取代。
適用於識別抗體之可經靶向以誘變之殘基或區域之方法稱為「丙胺酸掃描誘變」，如由Cunningham及Wells(1989)Science,244：1081-1085描述。在此方法中，目標殘基(例如，帶電殘基，諸如arg、asp、his、lys及glu)之殘基或群組經識別且經中性或帶負電胺基酸(例如，丙胺酸或聚丙胺酸)置換以判定抗體與抗原之相互作用是否受影響。可於該等胺基酸位置引入證實對初始取代功能敏感之其他取代。或者或另外，使用抗原-抗體複合體之晶體結構以識別抗體與抗原之間之接觸點。此等接觸殘基及相鄰殘基可經靶向或作為用於取代之候選者進行消除。變體可經篩選以判定其等是否含有所需之性質。
胺基酸序列嵌入包括長度介於一個殘基至含有一百或更多個殘基之多肽之範圍內之胺基端及/或羧基端融合，及單一或多個胺基酸殘基之序列內嵌入。端嵌入之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他嵌入變體包括將抗體之N端或C端融合至酶(例如，針對ADEPT)或增加抗體之血清半衰期之多肽。
b)醣基化變體
在某些實施例中，本文提供之抗體係經改變以增加或減小該抗體之醣基化程度。抗體之醣基化位點之添加或刪除可藉由改變胺基酸序列使得建立或移除一或多個醣基化位點便利地完成。
在抗體包含Fc區之情況下，連接至該抗體之碳水化合物可經改變。由哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包含分支、雙觸寡醣，其通常藉由N鍵聯連接至Fc區之CH2域之Asn297。參見，例如，Wright等人TIBTECH 15：26-32(1997)。該寡醣可包括各種碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙醯基葡萄胺糖(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸及連接至雙觸寡醣結構之「主幹」中之GlcNAc之岩藻糖。在一些實施例中，可對本發明抗體中之寡醣作出修飾以產生具有某些改善之性質之抗體變體。
在一個實施例中，提供具有不存在(直接或間接)連接至Fc區之岩藻糖之碳水化合物結構之抗體變體。例如，此抗體中之岩藻糖之量可為1%至80%；1%至65%；5%至65%或20%至40%。例如，岩藻糖之量係藉由相對於如藉由MALDI-TOF質譜儀測得之連接至Asn 297之所有醣結構(例如，複合體、混合物及高甘露糖結構)之總數，計算在Asn297處之糖鏈內之岩藻糖之平均量而測定，如WO 2008/077546中所描述。Asn297係指在Fc區中之約位置297(Fc區殘基之Eu編號)處之天冬醯胺酸殘基；然而，Asn297亦可因抗體中之輕微序列變化而位於位置297之約±3個胺基酸上游或下游(即，在位置294與300間)。此等岩藻糖化變體可具有改善之ADCC功能。參見，例如，美國專利公開案第US 2003/0157108號(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。涉及「去岩藻糖化」或「岩藻糖不存在」抗體變體之公開案之實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87：614(2004)。可產生去岩藻糖化抗體之細胞系之實例包括不存在蛋白質岩藻糖化之Lec13 CHO細胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；US Pat Appl No US 2003/0157108 A1,Presta,L；及WO 2004/056312 A1,Adams等人，尤其於實例11處)，及基因剔除細胞系(諸如α-1,6-岩藻糖轉移酶基因、FUT8)，基因剔除CHO細胞(參見，例如，Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda,Y.等人，Biotechnol.Bioeng.,94(4)：680-688(2006)；及WO2003/085107)。
進一步提供具有平分型寡醣之抗體變體，例如，其中連接至抗體之Fc區之雙觸寡醣係藉由GlcNAc平分。此等抗體變體可具有減少之岩藻糖化及/或改善之ADCC功能。此等抗體變體之實例描述(例如)於WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美國專利案第6,602,684號(Umana等人)；及US 2005/0123546(Umana等人)中。亦提供具有至少一個連接至Fc區之寡醣中之半乳糖殘基之抗體變體。此等抗體變體可具有改善之CDC功能。此等抗體變體描述(例如)於WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
c)Fc區變體
在某些實施例中，可將一或多種胺基酸修飾引入本文提供之抗體之Fc區內，藉此產生Fc區變體。該Fc區變體可包含人類Fc區序列(例如，人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)，該序列在一或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾(例如，取代)。
在某些實施例中，本發明預期具有一些但非所有效應子功能之抗體變體，該等效應子功能使該抗體變體成為其中該抗體活體內之半衰期係重要的應用所需之候選者，然而某些效應子功能(諸如補體及ADCC)係非必要的或有害的。可進行活體外及/或活體內細胞毒性分析以證實CDC及/或ADCC活性之減小/損耗。例如，可進行Fc受體(FcR)結合分析以確保該抗體缺乏FcγR結合(因此，很可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC之原代細胞(NK細胞)僅表現Fc(RIII，而單核細胞表現Fc(RI、Fc(RII及Fc(RIII。造血細胞上之FcR表現匯總於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)之第464頁上之表3中。活體外分析以評定所感興趣分子之ADCC活性之非限制性實例描述於美國專利案第5,500,362號(參見，例如，Hellstrom,I.等人Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))及Hellstrom,I等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；5,821,337(參見Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))中。或者，可採用非放射性分析方法(參見例如用於流動式細胞測量術之ACTITM非放射性細胞毒性分析(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；及CytoTox 96®非放射性細胞毒性分析(Promega,Madison,WI)。適用於此等分析之效應子細胞包括末梢血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者或另外，所感興趣分子之ADCC活性可活體內例如於動物模型(諸如揭示於Clynes等人Proc. Nat’l Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中之動物模型)來評估。亦可進行C1q結合分析以證實抗體無法結合C1q且因此缺乏CDC活性。參見，例如，WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評定補體活化，可進行CDC分析(參見，例如，Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)；Cragg,M.S.等人，Blood 101：1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.及M.J.Glennie,Blood 103：2738-2743(2004))。FcRn結合及活體內廓清率/半衰期測定亦可使用此項技術中已知的方法來進行(參見，例如，Petkova,S.B.等人，Int’l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。
在一些實施例中，可將一或多個胺基酸修飾引入本文提供之抗體之Fc部分內以增加IgG結合至新生Fc受體。在某些實施例中，該抗體包含下列三個根據EU編號之突變：M252Y、S254T及T256E(「YTE突變」)(美國專利案第8,697,650號；亦參見Dall’Acqua等人，Journal of Biological Chemistry 281(33)：23514-23524(2006)。在某些實施例中，該YTE突變不影響抗體結合至其同源抗原之能力。在某些實施例中，該YTE突變相較於天然(即，非YTE突變體)抗體增加抗體之血清半衰期。在一些實施例中，該YTE突變相較於天然(即，非YTE突變體)抗體增加抗體之血清半衰期達3倍。在一些實施例中，該YTE突變相較於天然(即，非YTE突變體)抗體增加抗體之血清半衰期達2倍。在一些實施例中，該YTE突變相較於天然(即，非YTE突變體)抗體增加抗體之血清半衰期達4倍。在一些實施例中，該YTE突變相較於天然(即，非YTE突變體)抗體增加抗體之血清半衰期達至少5倍。在一些實施例中，該YTE突變相較於(即，非YTE突變體)抗體增加抗體之血清半衰期達至少10倍。參見，例如，美國專利案第 8,697,650號；亦參見Dall’Acqua等人，Journal of Biological Chemistry 281(33)：23514-23524(2006)。
在某些實施例中，該YTE突變體提供調節抗體之抗體依賴性細胞介導細胞毒性(ADCC)活性之方式。在某些實施例中，該YTEO突變體提供調節人類化IgG抗體針對人類抗原之ADCC活性之方式。參見，例如，美國專利案第8,697,650號；亦參見Dall’Acqua等人，Journal of Biological Chemistry 281(33)：23514-23524(2006)。
在某些實施例中，該YTE突變體容許同時調節血清半衰期、組織分佈及抗體活性(例如，IgG抗體之ADCC活性)。參見，例如，美國專利案第8,697,650號；亦參見Dall’Acqua等人，Journal of Biological Chemistry 281(33)：23514-23524(2006)。
具有減少之效應子功能之抗體包括彼等具有Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者之取代(美國專利案第6,737,056號)。此等Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或多者處具有取代之Fc突變體，其等包括殘基265及297取代為丙胺酸之所謂之「DANA」Fc突變體(美國專利案第7,332,581號)。
在某些實施例中，於野生型人類Fc區之位置329(EU編號)之脯胺酸(P329)係經甘胺酸或精胺酸或足夠長以至於可破壞Fc/Fcγ受體界面內之脯胺酸夾層之胺基酸殘基取代，該脯胺酸夾層係形成於Fc之P329與FcγRIII之色胺酸殘基W87及W110之間(Sondermann等人：Nature 406,267-273(20 July 2000))。在另一實施例中，Fc變體中之至少一個其他胺基酸取代係S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S及在又另一實施例中，該至少一個其他胺基酸取代係人類IgG1 Fc區之 L234A及L235A或人類IgG4 Fc區之S228P及L235E，所有皆根據EU編號(美國專利案第8,969,526號，該案以全文引用之方式併入本文中)。
在某些實施例中，多肽包含野生型人類IgG Fc區之Fc變體，其中該多肽具有經甘胺酸取代之人類IgG Fc區之P329及其中該Fc變體包含至少兩個在人類IgG1 Fc區之L234A及L235A或人類IgG4 Fc區之S228P及L235E處之其他胺基酸，及其中該等殘基係根據EU編號(美國專利案第8,969,526號，該案以全文引用之方式併入本文中)編號。在某些實施例中，包含P329G、L234A及L235A(EU編號)取代之多肽顯示對人類FcγRIIIA及FcγRIIA之減小之親和性，用於將ADCC下調至由包含野生型人類IgG Fc區之多肽所引起之ADCC之至少20%，及/或用於下調ADCP(美國專利案第8,969,526號，該案以全文引用之方式併入本文中)。
在特定實施例中，包含野生型人類Fc多肽之Fc變體之多肽包含三重突變：在位置Pro329處之胺基酸取代、根據EU編號之L234A及L235A突變(P329/LALA)(美國專利案第8,969,526號，該案以全文引用之方式併入本文中)。在特定實施例中，該多肽包含下列胺基酸取代：根據EU編號之P329G、L234A及L235A。
描述某些具有改善或減少之結合至FcR之抗體變體。(參見，例如，美國專利案第6,737,056號；WO 2004/056312；及Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001))。
在某些實施例中，抗體變體包含具有一或多個改善ADCC之胺基酸取代(例如，於Fc區之位置298、333及/或334處之取代(殘基之EU編號))之Fc區。
在一些實施例中，改變係在Fc區中作出，從而導致改變之(即，改善 或減少之)C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)，例如，如描述於美國專利案第6,194,551號、WO 99/51642及Idusogie等人J.Immunol.164：4178-4184(2000)中。
具有增加之半衰期及改善之與負責將母體IgG轉移至胎兒之結合(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))之新生Fc受體(FcRn)之抗體描述於US2005/0014934A1(Hinton等人)中。彼等抗體包含其中具有一或多個取代之Fc區，該等取代改善Fc區對FcRn之結合。此等Fc變體包括彼等於以下Fc區殘基中之一或多者處具有取代者：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，Fc區殘基434之取代(美國專利案第7,371,826號)。
亦參見涉及Fc區變體之其他實例之Duncan及Winter,Nature 322：738-40(1988)；美國專利案第5,648,260號；美國專利案第5,624,821號；及WO 94/29351。
d)經半胱胺酸工程改造之抗體變體
在某些實施例中，可能需要產生經半胱胺酸工程改造之抗體，例如，「THIOMABTM」，其中抗體之一或多個殘基係經半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，該等經取代之殘基出現於該抗體之可供結合之位點。如本文進一步描述，藉由以半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基藉此定位於該抗體之可接近位點且可用以將該抗體結合至其他部分以產生結合物。在某些實施例中，下列殘基中之任何一者或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之K149(Kabat編號)；輕鏈之V205(Kabat編號)；重鏈之A118(EU編號)；重鏈之A140(EU編號)；重鏈之T174(EU編號)；重鏈之Y373 (EU編號)；及重鏈Fc區之S400(EU編號)。在特定實施例中，本文描述之抗體包含HC-A140C(EU編號)半胱胺酸取代。在特定實施例中，本文描述之抗體包含LC-K149C(Kabat編號)半胱胺酸取代。在特定實施例中，本文描述之抗體包含HC-A118C(EU編號)半胱胺酸取代。可產生經半胱胺酸工程改造之抗體，如描述(例如)於美國專利案第7,521,541號中。
在某些實施例中，抗體包含下列重鏈半胱胺酸取代中之一者：
抗體Fab片段中適用於半胱胺酸取代之重鏈殘基包括位置110、136、170、175、183及205(Kabat編號)。
在某些實施例中，抗體包含下列輕鏈半胱胺酸取代中之一者：
e)抗體衍生物
在某些實施例中，本文提供之抗體可經進一步修飾以含有此項技術中已知且易於獲得之額外非蛋白質部分。適用於抗體之衍生化之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二噁烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及聚葡萄糖或聚(正乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其於水中之穩定性而在製造中可具有優勢。該聚合物可具有任何分子量，且可為分支鏈或非分支鏈。連接至抗體之聚合物之數量可變化，且若連接超過一個聚合物，則其等可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生化之聚合物之數量及/或類型可基於包括(但不限於)以下之考量來決定：抗體欲改善之特定性質或功能；該抗體衍生物是否將在已定義之條件下用於療法中等。
在另一實施例中，提供抗體與可藉由曝露於放射下而經選擇性加熱之非蛋白質部分之結合物。在一些實施例中，該非蛋白質部分係碳奈米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。該放射可具有任何波長，且包括(但不限於)不傷害普通細胞但會將該非蛋白質部分加熱至殺死鄰近抗體-非蛋白質部分之細胞之溫度之波長。
B.重組方法及組合物
抗體可使用(例如)如描述於美國專利案第4,816,567號中之重組方法及組合物產生。在一些實施例中，提供編碼本文描述之抗因子D抗體之分 離核酸。此核酸可編碼包含抗體之VL之胺基酸序列及/或包含抗體之VH之胺基酸序列(例如，抗體之輕鏈及/或重鏈)。在另一實施例中，提供一或多個包含此核酸之載體(例如，表現載體)。在另一實施例中，提供包含此核酸之宿主細胞。在一個此實施例中，宿主細胞包含(例如，已經以下轉形)：(1)包含編碼包含抗體之VL之胺基酸序列及包含抗體之VH之胺基酸序列之核酸之載體，或(2)包含編碼包含抗體之VL之胺基酸序列之核酸之第一載體及包含編碼包含抗體之VH之胺基酸序列之核酸之第二載體。在一些實施例中，該宿主細胞係真核細胞，例如，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或類淋巴細胞(例如，Y0、NS0、Sp20細胞)。在一些實施例中，提供製造抗轉鐵蛋白受體抗體之方法，其中該方法包括在適用於表現抗體(如上文提供)之條件下培養包含編碼該抗體之核酸之宿主細胞，及視需要自該宿主細胞(或宿主細胞培養基)中回收該抗體。
就抗因子D抗體之重組產生而言，分離編碼抗體之核酸(例如，如上文描述)並嵌入於一或多個載體內以用於進一步選殖及/或於宿主細胞中表現。此核酸可使用習知程序(例如，藉由使用可特異性結合至編碼該抗體之重鏈及輕鏈之基因之寡核苷酸探針)容易地分離並定序。
適用於抗體編碼載體之選殖或表現之宿主細胞包括本文描述之原核細胞或真核細胞。例如，抗體可於細菌中產生，特定言之當無需醣基化及Fc效應子功能時。就於細菌中表現抗體片段及多肽而言，參見例如美國專利案第5,648,237,5,789,199及5,840,523號。(亦參見Charlton,Methods in Molecular Biology，第248卷，(B.K.C.Lo編，Humana Press,Totowa,NJ,2003)，第245至254頁，其描述抗體片段於大腸桿菌中之表現)。表現後，該抗體可自於可溶性溶離份中之細菌細胞糊狀物分離且可 經進一步純化。
除原核生物外，真核微生物(諸如絲狀真菌或酵母菌)係適用於抗體編碼載體之選殖或表現宿主，其等包括醣基化路徑已經「人類化」且因此導致具有部分或完全人類醣基化模式之抗體之產生之真菌及酵母菌菌株。參見Gerngross,Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)；及Li等人，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。
適用於表現醣基化抗體之宿主細胞亦衍生自多細胞生物(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已經識別許多可與昆蟲細胞結合使用(特定言之，用於草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞之轉染)之桿狀病毒菌株。
亦可使用植物細胞培養物作為宿主細胞。參見，例如，美國專利案第5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978及6,417,429號(其等描述用於在基因轉殖植物中產生抗體之PLANTBODIESTM技術)。
亦可使用脊椎動物細胞作為宿主細胞。例如，適應於懸浮生長之哺乳動物細胞系可為有用的。有用之哺乳動物宿主細胞系之其他實例係經SV40轉形之猴腎CV1細胞系(COS-7)；人類胚胎腎細胞系(如描述(例如)於Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977)中之293或293細胞)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞氏(sertoli)細胞(如描述(例如)於Mather,Biol.Reprod.23：243-251(1980)中之TM4細胞)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK；水牛大鼠肝細胞(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞，如描述(例如)於Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)中；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他有 用之哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR-CHO細胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；及骨髓瘤細胞系，諸如Y0、NS0及Sp2/0。為回顧適用於抗體產生之某些哺乳動物宿主細胞系，參見，例如，Yazaki及Wu,Methods in Molecular Biology，第248卷，(B.K.C.Lo編，Humana Press,Totowa,NJ)，第255至268頁(2003)。
C.分析
本文提供之抗因子D抗體可藉由此項技術中已知的各種分析針對其等物理/化學性質及/或生物活性進行識別、篩選、或表徵。
在一些實施例中，測試本發明抗體之抗原結合活性，例如，藉由已知的方法諸如ELISA、BIACore®、FACS或西方墨點轉漬法。
在另一態樣中，競爭分析可用以識別與本文描述之抗體中之任何一者競爭結合至因子D之抗體。在某些實施例中，此競爭抗體結合至本文描述之抗體所結合之相同抗原決定基(例如，直鏈或構形抗原決定基)。用於繪製抗體結合之抗原決定基之詳細例示性方法係提供於Morris(1996)「Epitope Mapping Protocols」，Methods in Molecular Biology，第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中。
在例示性競爭分析中，將固定化因子D培養於包含結合至因子D之第一標記抗體(例如，本文描述之抗體中之任何一者)及針對與第一抗體競爭結合至因子D之能力進行測試之第二標記抗體之溶液中。該第二抗體可存在於融合瘤上清液中。作為對照，將固定化因子D培養於包含第一標記抗體但不包含第二標記抗體之溶液中。在允許第一抗體結合至因子D之條件下培養後，移除過量之未結合抗體，及量測與固定化因子D相關聯之標記 之量。若相對於對照樣品，測試樣品中與固定化因子D相關聯之標記之量係大體上減少，則其指示第二抗體係與第一抗體競爭結合至因子D。參見Harlow及Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
為判定抗因子D抗體或其變體或片段(例如，抗原結合片段)是否可結合至因子D並發揮生物效應(例如，抑制替代途徑溶血)，可使用溶血抑制分析(例如)使用兔RBC。此溶血抑制可使用標準分析(Kostavasili等人(1997)J of Immunology 158：1763-72；Wiesmann等人(2006)Nature 444：159-60)測定。此等分析中之補體之活化可使用血清或血漿啟始。因子D於血清或血漿中之適當濃度(Pascual等人(1998)Kidney International 34：529-536；Complement Facts Book,Bernard J.Morley及Mark J.Walport編，Academic Press(2000)；Barnum等人(1984)J.Immunol.Methods,67：303-309)可根據此項技術中已知的方法例行測定，該等方法包括彼等已描述於諸如Pascual等人(1998)Kidney International 34：529-536及Barnum等人(1984)J.Immunol.Methods 67：303-309之參考文獻中者。本發明大體上係關於可抑制與因子D相關聯之生物活性之抗體。例如，在18μg/ml之濃度下(等於血液中之人類因子D之莫耳濃度之約1.5倍；抗因子D抗體相對於因子D之莫耳比約1.5：1)，可見抗體顯著抑制替代補體活性(參見，例如，美國專利案第6,956,107號)。
在一些實施例中，本發明係關於抗因子D抗體及其結合物，其中此等抗體之Fab片段以小於30nM或小於15nM或小於10nM或小於5nM之IC50值抑制替代途徑溶血。在一些實施例中，本發明係關於抗因子D抗體及其結合物，其中此等抗體之Fab片段以30nM至2nM或25nM至2nM或20 nM至2nM或10nM至2nM或7nM至2nM之IC50值抑制替代途徑溶血。
在一些實施例中，本發明係關於抗因子D抗體及其結合物，其中此等抗體之Fab片段以小於80nM或小於50nM或小於40nM或小於20nM或小於15nM之IC90值抑制替代途徑溶血。在一些實施例中，本發明係關於抗因子D抗體及其結合物，其中此等抗體之Fab片段以80nM至5nM或75nM至5nM或70nM至5nM或65nM至5nM或60nM至5nM或55nM至5nM或50nM至5nM或50nM至10nM之IC90值抑制替代途徑溶血。
在一些實施例中，本發明係關於抗因子D抗體及其結合物，其中此等抗體之Fab片段以約0.05：1(0.05)至約10：1(10)或約0.09：1(0.09)至約8：1(8)或約0.1：1(0.1)至約6：1(6)或約0.15：1(0.15)至約5：1(5)或約0.19：1(0.19)至約4：1(4)或約0.2：1(0.2)至約3：1(3)或約0.3：1(0.3)至約2：1(2)或約0.4：1(0.4)至約1：1(1)或約0.5：1(0.5)至約1：2(0.5)或約0.6：1(0.6)至約1：3(0.33)或約0.7：1(0.7)至約1：4(0.25)或約0.8：1(0.8)至約1：5(0.2)或約0.9：1(0.9)至約1：6(0.17)之抗體相對於因子D莫耳比抑制替代途徑溶血。
在一些實施例中，本發明係關於抗因子D抗體及包含人類化抗因子D抗體之片段(例如，抗原結合片段)之結合物。本發明抗體片段可(例如)為Fv、Fab、Fab-SH、Fab’-SH、Fab’、Fab-C、Fab’-C、Fab’-C-SH、Fab-C-SH、scFv、雙功能抗體或F(ab’)2、dAb、互補決定區(CDR)片段、直鏈抗體、單鏈抗體分子、迷你抗體、雙功能抗體或形成自抗體片段之多特異性抗體。在另一實施例中，本發明係關於人類化抗因子D抗體片段或其結合物(例如，抗原結合片段)，其可大體上滲透所有視網膜。在甚至其他實施例中，本發明係關於人類化抗因子D抗體片段或其結合物(例如，抗原結合片段)，其可滲透整個視網膜之整個厚度。
在一些實施例中，本發明係關於包含抗因子D抗體之結合物，其中此等抗體之未結合Fab片段在經由單一玻璃體內注射投與哺乳動物(例如，人類)眼部內後具有至少3、5、7、10或12天之半衰期。在一些實施例中，本發明係關於包含人類化抗因子D抗體之結合物，其中此等抗體之未結合Fab片段在經由單一玻璃體內注射投與哺乳動物(例如，人類)眼部內後將替代途徑(AP)補體活化抑制至少40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110或115天。在另一實施例中，本發明係關於包含人類化抗因子D抗體之結合物，其中抑制替代途徑(AP)補體活化之此等抗體之未結合Fab片段之濃度在經由單一玻璃體內注射投與哺乳動物(例如，人類)眼部內後係在視網膜組織中維持至少40、45、50、55、60、65、70、75、80或85天。在另一實施例中，本發明係關於包含人類化抗因子D抗體之結合物，其中抑制替代途徑(AP)補體活化之此等抗體之未結合Fab片段之濃度在經由單一玻璃體內注射投與哺乳動物(例如，人類)眼部內後係在玻璃體液中維持至少80、85、90、95、100、105、110或115天。
D.結合物
本發明亦提供包含本文提供之任何抗因子D抗體之結合物，其等結合至一或多個異源性分子(諸如多元醇)。
1.多臂聚合物
在一些實施例中，本發明結合物可藉由藉由以使本文描述之抗因子抗體或其變體與多臂聚合物結合而衍生該等抗體來製造。將知曉提供具有所需大小之結合物或具有如本文描述之經選擇之平均分子量之任何多臂聚合物係適用於構築本發明之抗體-聚合物結合物。
許多聚合物係適用於藥物中。參見，例如，Davis等人，Biomedical Polymers：Polymeric Materials and Pharmaceuticals for Biomedical Use，第441至451頁(1980)。在本發明之所有實施例中，使用非蛋白聚合物以形成本發明結合物。非蛋白聚合物通常係親水性合成聚合物，即，非原本於自然中發現之聚合物。然而，存在於自然中及藉由重組或活體外方法產生之聚合物可亦係有用的，如同自天然來源分離之聚合物。
在一些實施例中，該等抗因子D抗體係藉由將該等抗體或其變體結合(例如，共價連接)至多臂多元醇來衍生。因此，在一些實施例中，本發明係關於包含一或多個共價連接至一或多個多臂多元醇之本文描述之抗因子D抗體或抗體變體之結合物。採用之多元醇可為任何水溶性聚(環氧烷)聚合物且可具有直鏈或分支鏈。合適之多元醇包括彼等在一或多個羥基位置經嵌合基團(諸如具有一至四個碳之烷基)取代者。通常，該多元醇係聚(烷二醇)，諸如聚乙二醇(PEG)，及因此，為便於描述，討論之剩餘部分係關於例示性實施例，其中採用之多元醇係PEG，及將多元醇結合至多肽之方法稱為「聚乙二醇化」。然而，熟習此項技術者將知曉可採用其他多元醇，諸如，例如，聚(丙二醇)及聚乙烯-聚丙二醇共聚物，使用用於針對PEG之本文描述之結合之技術。
用以形成本發明結合物之多元醇係多臂多元醇。如本文使用，「多臂多元醇」係指包含連接至少兩個臂之核結構之多元醇。該多臂多元醇可為(例如)二聚物(兩個臂)、四聚物(四個臂)、六聚物(六個臂)、八聚物(八個臂)等。在一些態樣中，該多臂多元醇係多臂PEG。
用於抗因子D抗體及抗體變體之聚乙二醇化中之多臂PEG之重量平均分子量可變化且通常可在約500至約300,000道耳頓(D)之範圍內。在一些 實施例中，多臂PEG之重量平均分子量係約1,000至約100,000D，及在一些實施例中，約20,000至約60,000D。在一些實施例中，聚乙二醇化係用具有約40,000D之重量平均分子量之多臂PEG進行。
此項技術中已知用於聚乙二醇化蛋白質之各種方法。產生結合至PEG之蛋白質之特定方法包括描述於美國專利案第4,179,337號、美國專利案第4,935,465號及美國專利案第5,849,535號中之方法，其等中之所有以全文引用之方式併入本文中。通常，該蛋白質係經由該蛋白質之胺基酸殘基中之一或多者共價結合至聚合物上之末端反應性基團。本文將具有該(等)反應性基團之聚合物稱為經活化或官能化之聚合物(例如，官能化PEG)。該反應性基團與抗體或抗體變體上之游離之巰基或胺基或其他反應性基團選擇性反應。該多臂PEG聚合物可以隨機或者位點特異性方式結合至抗體或抗體變體上之巰基或胺基或其他反應性基團。然而，應瞭解，為獲得最佳化結果所選反應性基團之類型及量及採用之聚合物之類型將取決於所採用之特定抗體或抗體變體，以限制及較佳大體上防止使該反應性基團與抗體上之過多活性基團反應。因為在一些實例中可能無法足夠限制或防止，因此取決於抗體濃度可採用每莫耳抗體通常約0.05至約1000莫耳，或在一些實施例中，約0.05至約200莫耳之官能化聚合物。每莫耳抗體之官能化聚合物之最終量平衡以維持最佳化活性，同時若可能則最佳化抗體之玻璃體液、視網膜及/或眼房液半衰期。
雖然殘基可為抗體或抗體變體上之任何反應性胺基酸，諸如N端胺基酸基團，但在一些實施例中，該反應性胺基酸係半胱胺酸，其係透過其游離硫醇基連接至官能化聚合物之反應性基團，如顯示(例如)於WO 99/03887、WO 94/12219、WO 94/22466、美國專利案第5,206,344號、 美國專利案第5,166,322號及美國專利案第5,206,344號中，其等中之所有以全文引用之方式併入本文中。在此等實施例中，該聚合物可包含至少一個可與親代抗體上之游離巰基或硫醇基特異性反應之末端反應性基團。此等基團包括但不限於順丁烯二醯亞胺、巰基、硫醇基、三氟甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、氮丙啶、環氧化物、二硫吡啶、琥珀醯亞胺酯、-NH2、醛、鹵代乙酸酯、鹵代乙醯胺及碳酸對硝基苯基酯等。該聚合物可使用適用於所選結合系統之化學過程之任何方案結合至親代抗體，諸如描述於美國專利案第4,179,337號、美國專利案第7,122,636號及Jevsevar等人，Biotech J.,Vol.5，第113至128頁(2010)中之方案及系統。或者，反應性胺基酸可為離胺酸，其係透過其游離ε-胺基連接至官能化聚合物之反應性基團(參見，例如，WO 93/00109，該案以引用之方式併入本文中)或麩胺酸或天冬胺酸，其係透過醯胺鍵連接至該聚合物。聚合物之反應性基團然後可與(例如)蛋白質之α(alpha)及ε(epsilon)胺或巰基反應以形成共價鍵。應知曉本發明不限於利用抗體或抗體片段與聚合物之間之任何特定類型鍵聯之結合物。
適用於製備本發明結合物之官能化多臂PEG可藉由許多習知反應產生。例如，PEG(M-NHS-PEG)之N-羥基琥珀醯亞胺酯可根據Buckmann及Merr,Makromol.Chem.，第182卷，第1379至1384頁(1981)之方法，藉由與N,N'-二環己基碳二亞胺(DCC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)之反應製備自PEG-單甲醚。另外，可將PEG端羥基轉化為胺基，例如，藉由與亞硫醯溴反應以形成PEG-Br，接著以過量氨進行胺解以形成PEG-NH2。該PEG-NH2然後可使用標準偶合試劑(諸如Woodward氏試劑K)結合至所感興趣之抗體或抗體變體。此外，可將PEG端-CH2OH基團轉化為醛基， 例如，藉由用MnO2氧化。該醛基可藉由與諸如氰基硼氫化物之試劑還原性烷基化結合至抗體或抗體變體。
在一些實施例中，用以製備本發明結合物之多臂PEG具有通式(I)之結構：
其中各m指示多元醇(PEG)之特定臂之長度或大小且獨立地係約45至約1000、約3至約250或約50至約200或約100至約150之整數；及係約1至約10之整數。
在一些實施例中，該多臂PEG具有通式(I)之結構，其中n係1，及該多臂PEG係四聚物。在另一實施例中，該多臂PEG具有通式(I)之結構，其中n係2，及該多臂PEG係六聚物。在另一實施例中，該多臂PEG具有通式(I)之結構，其中n係3，及該多臂PEG係八聚物。
在另一態樣中，用以製備本發明結合物之多臂PEG具有通式(II)之結構：
其中各m指示多元醇(PEG)之特定臂之長度或大小且獨立地係約45至約1000、約3至於250或約50至約200或約100至約150之整數；及n係約1至約10之整數。
在一些實施例中，該多臂PEG具有通式(II)之結構，其中n係2，及該 多臂PEG係四聚物。在另一實施例中，該多臂PEG具有通式(II)之結構，其中n係4，及該多臂PEG係六聚物。在另一實施例中，該多臂PEG具有通式(II)之結構，其中n係6，及該多臂PEG係八聚物。
在另一態樣中，用以製備本發明結合物之多臂PEG具有通式(III)之結構：
其中各m指示多元醇(PEG)之特定臂之長度或大小且獨立地係約45至約1000、約3至約250或約50至約200或約100至約150之整數；及n係約1至約10之整數。
在一些實施例中，該多臂PEG具有通式(III)之結構，其中n係2，及該多臂PEG係四聚物。在另一實施例中，該多臂PEG具有通式(III)之結構，其中n係4，及該多臂PEG係六聚物。在另一實施例中，該多臂PEG具有通式(III)之結構，其中n係6，及該多臂PEG係八聚物。
在另一態樣中，用以製備本發明結合物之多臂PEG具有通式(IV)之結構：
其中各m指示多元醇(PEG)之特定臂之長度或大小且獨立地係約45至約1000、約3至約250或約50至約200或約100至約150之整數。
具有通式(I)至(IV)中之任何一者之結構之多臂PEG可經官能化以(例如)結合適用於使用上文描述之技術中之任何一者而與抗體(例如，抗體片段)反應或結合至抗體(例如，抗體片段)之末端反應性基團以產生官能化多臂PEG。在其他實施例中，然而，該多臂PEG可透過與PEG及待連接之抗體或抗體變體之一或多個胺基酸殘基反應之多官能交聯劑共價連接至抗因子D抗體，如描述例如於美國專利案第7,122,636號中，該案以全文引用之方式併入本文中。
在其他態樣中，用以製備本發明結合物之多臂PEG係包含至少一個末端反應性基團之官能化多臂PEG。該末端反應性基團可直接結合至抗因子D抗體以形成本發明結合物。在一些實施例中，該官能化多臂PEG具有通式(Ia)之結構：
其中各m指示多元醇(PEG)之特定臂之長度或大小且獨立地係約45至約1000、約3至約250或約50至約200或約100至約150之整數；及n係約1至約10之整數；各R1獨立地係不存在或係連接基團；及各R2獨立地係氫或末端反應性基團；其中至少一個R2係末端反應性基團。在一些實施例中，R2係獨立地選自硫醇基反應性基團、胺基反應性基團及其組合。
在一些實施例中，該官能化多臂PEG具有通式(Ia)之結構，其中n係1至3之整數。在一些實施例中，該官能化多臂PEG具有通式(Ia)之結構，其中n係1，及該多臂PEG係四聚物。在另一實施例中，該官能化多臂PEG具有通式(Ia)之結構，其中n係2，及該多臂PEG係六聚物。在另一實施例 中，該官能化多臂PEG具有通式(Ia)之結構，其中n係3，及該多臂PEG係八聚物。在此等實施例中，該八聚物具有通式(Ib)之結構：
其中m、R1及R2係如上文定義。
具有通式(Ib)之結構之多臂PEG具有三季戊四醇(TP)核結構及本文亦將其稱為TP八聚物。
在一些實施例中，該官能化多臂PEG具有通式(Ia)或(Ib)之結構，其中各R1當存在時係相同或不同，及R1及R2當在一起時係選自 ；；及 ；及其組合；其中各i獨立地係0至10之整數；j係0至10之整數；及R2係如本文定義。在一些實施例中，各R1係連接基團。
在一些實施例中，該官能化多臂PEG具有通式(Ia)或(Ib)之結構，其中R1及R2當在一起時係，其中i、j及R2係如本文定義。在一些實施例中，R1及R2當在一起時係，其中i係2；j係2或3，及R2係如本文定義。
在一些實施例中，該官能化多臂PEG具有通式(Ia)或(Ib)之結構，其中各R2係獨立地選自順丁烯二醯亞胺、巰基、巰、硫醇基、三氟甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、氮丙啶、環氧化物、二硫吡啶、琥珀醯亞胺酯、-NH2、醛、鹵代乙酸酯、鹵代乙醯胺及碳酸對硝基苯基酯。在一些實施例中，各R2獨立地係選自溴乙酸酯、碘乙酸酯、氯乙酸酯及其組合之鹵代乙酸酯。在一些實施例中，各R2獨立地係選自溴乙醯胺、碘乙醯胺、氯乙醯胺及其組合之鹵代乙醯胺。在一些實施例中，R2係順丁烯二醯亞胺。
在一些實施例中，該官能化多臂PEG具有通式(Ia)或(Ib)之結構，其中各R2係順丁烯二醯亞胺。在一些實施例中，該官能化多臂PEG具有通式(Ia)或(Ib)之結構，其中R1及R2當在一起時係，其中i及j係如上文定義。在一些實施例中， 該官能化多臂PEG具有通式(Ia)或(Ib)之結構，其中R1及R2當在一起時係，其中i係2及j係2。
在另一態樣中，用以製備本發明結合物之官能化多臂PEG具有通式(IIa)之結構：
其中各m指示多元醇(PEG)之特定臂之長度或大小且獨立地係約45至約1000、約3至約250或約50至約200或約100至約150之整數；及n係約1至約10之整數；各R1獨立地係不存在或係連接基團；及各R2獨立地係氫或末端反應性基團；其中至少一個R2係末端反應性基團。在一些實施例中，R2係獨立地選自硫醇基反應性基團、胺基反應性基團及其組合。
在一些實施例中，該官能化多臂PEG具有通式(IIa)之結構，其中n係2至6之整數。在一些實施例中，該官能化多臂PEG具有通式(IIa)之結構，其中n係2，及該多臂PEG係四聚物。在一些實施例中，該官能化多臂PEG具有通式(IIa)之結構，其中n係3。在另一實施例中，該官能化多臂PEG具有通式(IIa)之結構，其中n係4，及該多臂PEG係六聚物。在另一實施例中，該官能化多臂PEG具有通式(IIa)之結構，其中n係6，及該多臂PEG係八聚物。具有通式(IIa)之結構之八聚物具有六聚丙三醇(HG)核結構及本文亦將其稱為HG八聚物。
在一些實施例中，該官能化多臂PEG具有通式(IIa)之結構，其中各 R1當存在時係相同或不同，及R1及R2當在一起時係選自； ；及；及其組合；其中各i獨立地係0至10之整數；j係0至10之整數；及R2係如本文定義。在一些實施例中，各R1係連接基團。
在一些實施例中，該官能化多臂PEG具有通式(IIa)之結構，其中R1及R2當在一起時係，其中i、j及R2係如本文定義。在一些實施例中，R1及R2當在一起時係，其中i係2；j係2或3，及R2係如本文定義。
在一些實施例中，該官能化多臂PEG具有通式(IIa)之結構，其中各R2係獨立地選自順丁烯二醯亞胺、巰基、硫醇基、三氟甲磺酸酯、甲苯磺 酸酯、氮丙啶、環氧化物、二硫吡啶、琥珀醯亞胺酯、-NH2、醛、鹵代乙酸酯、鹵代乙醯胺及碳酸對硝基苯基酯。在一些實施例中，各R2獨立地係選自溴乙酸酯、碘乙酸酯、氯乙酸酯及其組合之鹵代乙酸酯。在一些實施例中，各R2獨立地係選自溴乙醯胺、碘乙醯胺、氯乙醯胺及其組合之鹵代乙醯胺。在一些實施例中，R2係順丁烯二醯亞胺。
在一些實施例中，該官能化多臂PEG具有通式(IIa)之結構，其中各R2係順丁烯二醯亞胺。在一些實施例中，該官能化多臂PEG具有通式(IIa) 之結構，其中R1及R2當在一起時係，其中i及j係如上文定義。在一些實施例中，該官能化多臂PEG具有通式(IIa)之結構， 其中R1及R2當在一起時係，其中i係2及j係2。
在另一態樣中，該官能化多臂PEG具有通式(IIIa)之結構：
其中各m指示多元醇(PEG)之特定臂之長度或大小且獨立地係約45至約1000或約3至約250或約50至約200或約100至約150之整數；及n係約1至約10之整數；各R1獨立地係不存在或係連接基團；及各R2獨立地係氫 或末端反應性基團；其中至少一個R2係末端反應性基團。在一些實施例中，R2係獨立地選自硫醇基反應性基團、胺基反應性基團及其組合。
在一些實施例中，該官能化多臂PEG具有通式(IIIa)之結構，其中n係2至6之整數。在一些實施例中，該官能化多臂PEG具有通式(IIIa)之結構，其中n係2，及該多臂PEG係四聚物。在另一實施例中，該官能化多臂PEG具有通式(IIIa)之結構，其中n係4，及該多臂PEG係六聚物。在另一實施例中，該官能化多臂PEG具有通式(IIIa)之結構，其中n係6，及該多臂PEG係八聚物。具有通式(IIIa)之結構之八聚物具有六聚甘油(HGEO)核結構，及本文亦將其稱為HGEO八聚物。
在一些實施例中，該官能化多臂PEG具有通式(IIIa)之結構，其中各R1當存在時係相同或不同，及R1及R2當在一起時係選自； ；及；及其組合；其中各i獨立地係0至10之整數；j係0至10之整數；及R2係如本文定義。在一些實施例中，各R1係連接基團。
在一些實施例中，該官能化多臂PEG具有通式(IIIa)之結構，其中R1 及R2當在一起時係，其中i、j及R2係如本文定義。在 一些實施例中，R1及R2當在一起時係，其中i係2；j係2或3，及R2係如本文定義。
在一些實施例中，該官能化多臂PEG具有通式(IIIa)之結構，其中各R2係獨立地選自順丁烯二醯亞胺、巰基、硫醇基、三氟甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、氮丙啶、環氧化物、二硫吡啶、琥珀醯亞胺酯、-NH2、醛、鹵代乙酸酯、鹵代乙醯胺及碳酸對硝基苯基酯。在一些實施例中，各R2獨立地係選自溴乙酸酯、碘乙酸酯、氯乙酸酯及其組合之鹵代乙酸酯。在一些實施例中，各R2獨立地係選自溴乙醯胺、碘乙醯胺、氯乙醯胺及其組合之鹵代乙醯胺。在一些實施例中，R2係順丁烯二醯亞胺。
在一些實施例中，該官能化多臂PEG具有通式(IIIa)之結構，其中各R2係順丁烯二醯亞胺。在一些實施例中，該官能化多臂PEG具有通式 (IIIa)之結構，其中R1及R2當在一起時係，其中i及j係如上文定義。在一些實施例中，該官能化多臂PEG具有通式(IIIa)之結 構，其中R1及R2當在一起時係，其中i係3及j係2。
在另一態樣中，該官能化多臂PEG具有通式(IVa)之結構：
其中各m指示多元醇(PEG)之特定臂之長度或大小且獨立地係約45至約1000或約3至約250或約50至約200或約100至約150之整數；各R1獨立地係不存在或係連接基團；及各R2獨立地係氫或末端反應性基團；其中至少一個R2係末端反應性基團。在一些實施例中，R2係獨立地選自巰基反應性基團、胺基反應性基團及其組合。
具有通式(IVa)之結構之多臂PEG具有丁二醇核結構，及本文亦將其稱為DX八聚物。
在一些實施例中，該官能化多臂PEG具有通式(IVa)之結構，其中各R1當存在時係相同或不同，及R1及R2當在一起時係選自； ；；及 ；及其組合；其中各i獨立地係0至10之整數；j係0至10之整數；及R2係如本文定義。在一些實施例中，各R1係連接基團。
在一些實施例中，該官能化多臂PEG具有通式(IVa)之結構，其中R1 及R2當在一起時係，其中i、j及R2係如本文定義。在一 些實施例中，R1及R2當在一起時係，其中i係2；j係2或3，及R2係如本文定義。
在一些實施例中，各R2係獨立地選自順丁烯二醯亞胺、巰基、硫醇基、三氟甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、氮丙啶、環氧化物、二硫吡啶、琥珀醯亞胺酯、-NH2、醛、鹵代乙酸酯、鹵代乙醯胺及碳酸對硝基苯基酯。在一些實施例中，各R2獨立地係選自溴乙酸酯、碘乙酸酯、氯乙酸酯及其組合之鹵代乙酸酯。在一些實施例中，各R2獨立地係選自溴乙醯胺、碘乙醯胺、氯乙醯胺及其組合之鹵代乙醯胺。在一些實施例中，R2係順丁烯二醯亞胺。
在一些實施例中，該官能化多臂PEG具有通式(IVa)之結構，其中各R2係順丁烯二醯亞胺。在一些實施例中，該官能化多臂PEG具有通式(IVa)之結構，其中R1及R2當在一起時係，其中i及j係如上文定義。在一些實施例中，該官能化多臂PEG具有通式(IVa)之結 構，其中R1及R2當在一起時係，其中i係3及j係2。
適用於本發明中之其他官能化多臂PEG係描述於美國專利公開案第2011/0286956號及美國專利公開案第2015/0073155號中，該等案件中之兩者均以全文引用之方式併入本文中。
適用於本發明中之官能化多臂PEG亦可購買自許多供應商。例如，JenKem Technology,USA出售經順丁烯二醯亞胺官能化之PEG八聚物(例如，8臂(TP)-PEG-MAL及8臂(HG)-PEG-MAL)及四聚物。NOF America Corp.亦出售經順丁烯二醯亞胺官能化之PEG八聚物(例如，Sunbright® HGEO-400MA；Sunbright® DX-400MA)及四聚物(例如，Sunbright® PTE-400MA)。可獲得具有各種分子量(包括40,000D之重量平均分子量)之此等八聚物及四聚物。
2.結合物
在一些實施例中，本發明係關於包含一或多個本文揭示之抗因子D抗體或抗體變體及一或多個多臂多元醇之結合物，其中該結合物係藉由將至少一個抗因子D抗體或抗體變體共價連接至該多元醇製得。在一些實施例中，該多臂多元醇係PEG。在一些實施例中，該PEG係八聚物。在一些實施例中，該PEG具有通式(Ia)、(Ib)、(IIa)、(IIIa)或(IVa)之結構。
本發明結合物可藉由結合至各多臂PEG之抗因子D抗體之數量來表徵。本文亦將此稱為「Fab化」或「Fab化之程度」。結合至各PEG之抗因子D抗體之數量取決於各種因素而變化，該等因素包括：1)PEG中之臂之數量；2)PEG上之末端反應性基團之數量及/或反應性；3)PEG之核結構；及/或4)聚乙二醇化反應條件。在一些實施例中，用以製備該結合物之多臂PEG之高多分散性會複雜化最終結合物之分析，特定言之使每個PEG中抗體(例如，Fab)之數量的精確測定變得更困難及不確定。因此，用以形成該結合物之PEG通常具有介於約1至約1.35之範圍內之多分散性(使用此項技術中已知的方法測得)，及在各種實施例中係具有約1至約1.25、約1至約1.2、約1至約1.15、約1至約1.1、約1.05或甚至約1之多分散性。
在一些實施例中，本發明結合物包含八臂PEG，其中至少一個抗因子D抗體或抗體變體係共價連接至該PEG。在另一實施例中，本發明結合 物包含八臂PEG，其中至少兩個抗因子D抗體係共價連接至該PEG。在另一實施例中，本發明結合物包含八臂PEG，其中至少三個抗因子D抗體係共價連接至該PEG。在另一實施例中，本發明結合物包含八臂PEG，其中至少四個抗因子D抗體係共價連接至該PEG。在另一實施例中，本發明結合物包含八臂PEG，其中至少五個抗因子D抗體係共價連接至該PEG。在另一實施例中，本發明結合物包含八臂PEG，其中至少六個抗因子D抗體係共價連接至該PEG。在另一實施例中，該結合物包含八臂PEG，其中至少七個抗因子D抗體係共價連接至該PEG。在另一實施例中，本發明結合物包含八臂PEG，其中八個抗因子D抗體係共價連接至該PEG。在一些實施例中，本發明結合物包含八臂PEG，其中5至8個抗因子D抗體係共價連接至該PEG。在另一實施例中，本發明結合物包含八臂PEG，其中6至8個抗因子D抗體係共價連接至該PEG。在另一實施例中，本發明結合物包含八臂PEG，7至8個抗因子D抗體係共價連接至該PEG。
在一些實施例中，本發明結合物包含具有通式(Ia)、(Ib)、(IIa)、(IIIa)或(IVa)中之任何一者之結構之多臂PEG。在此等實施例中，至少一個R2係共價連接至本文描述之抗因子D抗體或抗體變體。在一些實施例中，具有通式(Ia)、(Ib)、(IIa)、(IIIa)或(IVa)中之任何一者之結構之多臂PEG係八聚物，及至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個或所有八個R2基團係共價連接至本文描述之抗因子D抗體或抗體變體。
在一些實施例中，本發明結合物包括其中多臂多元醇係共價連接至親代抗體上之特異性位點之種類；即，聚合物結合係靶向親代抗體或抗體片段中之特定區域或特定胺基酸殘基。標準誘變技術可用以改變親代抗體 或抗體片段中之潛在聚乙二醇化位點之數量及/或位置。因此，為達到胺基酸取代引入或置換諸如半胱胺酸及離胺酸之胺基酸之程度，本發明之抗因子D抗體及其變體可含有比天然序列抗因子D更多或更少之潛在聚乙二醇化位點之數量(示於圖1A至C中)。
如上文討論，聚合物之位點特異性結合最通常係藉由結合至親代抗體或抗體片段中之半胱胺酸殘基達成。在此等實施例中，偶合化學可(例如)利用半胱胺酸殘基之游離巰基而非親代抗體之雙硫鍵中之游離巰基。
在一些實施例中，使用天然存在於親代抗體中之一或多個半胱胺酸殘基作為用於聚合物結合之結合位點。在其他實施例中，抗體或抗體變體上之游離胺基可經2-亞胺基-四氫噻吩(Traut氏試劑)硫醇化及然後偶合至(例如)經順丁烯二醯亞胺官能化之PEG，如描述於Pedley等人，Br.J.Cancer，第70卷，第1126至1130頁(1994)中。在另一實施例中，一或多個半胱胺酸殘基係出於為聚合物提供特異性結合位點之目的而工程改造至親代抗體中之選定位點或位點中。
先前已描述經半胱胺酸工程改造之抗體(美國專利公開案第2007/0092940號及Junutula,J.R.等人，J.Immunol Methods，第332(1-2)卷，第41至52頁(2008)，該等案件以全文引用之方式全部併入本文中)。在一些實施例中，經半胱胺酸工程改造之抗體可為親代抗體。此等適用於產生在特定位置中(通常在恆定區，例如，CL或CH1中)具有游離半胱胺酸之抗體片段。經工程改造以含有半胱胺酸之親代抗體被稱為「ThioMab」及產生自(無關產生方法)此等經半胱胺酸工程改造之抗體之Fab片段被稱為「ThioFab」。如先前描述(參見，例如，U.S.Pat.Pub.No.2007/0092940及Junutula,J.R.等人，J.Immunol Methods，第332(1-2) 卷，第41至52頁(2008))，評估具有經置換之(「經工程改造之」)半胱胺酸(Cys)殘基之突變體之新引入經工程改造之半胱胺酸硫醇基之反應性。硫醇反應性值係在0至1.0之範圍內之相對數值術語及可針對任何經半胱胺酸工程改造之抗體進行量測。除具有反應性硫醇基外，應選擇ThioMab使得其等保留抗原結合能力。先前詳細描述經半胱胺酸工程改造之抗體之設計、選擇及製備(參見，例如，WO 2011/069104，該案以引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，將經工程改造之半胱胺酸引入重鏈或輕鏈之恆定域內。因此，經半胱胺酸工程改造之抗體保留其等野生型親代抗體對應物之抗原結合能力，因此可特異性結合至抗原。
在一些實施例中，本發明係關於抗體片段-聚合物結合物，其中該抗體片段係Fab，及該聚合物係結合至Fab片段之輕鏈或重鏈中之一或多個半胱胺酸殘基，其將通常形成連接輕鏈及重鏈之鏈間雙硫鍵。
在另一態樣中，本發明係關於抗體片段-聚合物結合物，其中該抗體片段係Fab-C，及該聚合物結合係靶向Fab-C片段之鉸鏈區。在一些實施例中，使用天然存在於抗體片段之鉸鏈區中之一或多個半胱胺酸殘基以結合聚合物。在另一實施例中，一或多個半胱胺酸殘基係出於為聚合物提供特異性結合位點或位點之目的而工程改造至Fab-C片段之鉸鏈區中。在一些實施例中，本文揭示之抗因子D抗體變體Fab片段係藉由出於為聚合物結合提供一個結合位點之目的而在C’末端添加一個半胱胺酸來修飾。在另一實施例中，本文描述之抗因子D抗體變體Fab片段係出於為聚合物結合提供兩個結合位點之目的而在C’末端添加四個額外殘基(Cys-Pro-Pro-Cys(SEQ ID NO：162))來修飾。在又另一實施例中，本文描述之抗因子D抗體變體Fab片段係出於為聚合物結合提供一個結合位點之目的而在C’末端 添加四個額外殘基(Ser-Pro-Pro-Cys(參見，例如，SEQ ID NO：121))來修飾。
聚乙二醇化之程度及位點亦可藉由調整反應條件(諸如官能化PEG及蛋白質之相對濃度及pH)來操控。適用於聚乙二醇化之所需程度之條件可藉由變化標準聚乙二醇化反應之參數來經驗性地測定。
抗因子D抗體及抗體變體之聚乙二醇化係藉由任何便利方法進行。合適之聚乙二醇化條件係闡述於WO 2011/069104及WO 03/029420中，該等案件中之兩者均以全文引用之方式併入本文中。
3.表徵
聚乙二醇化蛋白質可藉由SDS-PAGE、凝膠過濾、NMR、肽圖譜分析、液相層析術-質譜分光光度法(mass spectrophotometry)及活體外生物分析表徵。Fab化之程度通常首先藉由SDS-PAGE顯示。於10% SDS中之聚丙烯醯胺凝膠電泳係通常運行於作為溶離緩衝劑之10mM Tris-HCl pH 8.0、100mM NaCl中。為顯示聚乙二醇化殘基，可進行使用諸如胰蛋白酶及Lys-C蛋白酶之蛋白酶進行之肽圖譜分析。因此，聚乙二醇化抗體之樣品及非聚乙二醇化抗體之樣品可用諸如Lys-C蛋白酶之蛋白酶消化且藉由諸如逆相HPLC之技術分離所得肽消化。產生之肽之層析模式可與先前針對抗因子D多肽測定之肽譜圖比較。
各峰可然後藉由質譜分析術分析以證實峰中之結合物之大小。取決於結合中使用之PEG及峰中之結合物之大小，可評估結合至PEG之抗體或其變體之數量。結合至PEG基團之片段在注射後通常不保留於HPLC管柱上並自該層析圖消失。此自該層析圖之消失係用含有至少一個可聚乙二醇化胺基酸殘基之該特定片段上之聚乙二醇化之指示。使用此項技術中已知 的方法可進一步分析聚乙二醇化抗因子D抗體及抗體變體與因子D相互作用之能力及其他生物活性。
聚乙二醇化改變抗體藥物之物理及化學性質，且可導致改善之藥物動力學行為，諸如改善之穩定性、減小之免疫原性、延長之循環壽命及增加之眼部停留時間。
在一些實施例中，與相應未結合抗因數D抗體或抗體變體相比，在經由單一玻璃體內注射投與哺乳動物(例如，人類)眼部內後，本發明結合物具有經增加半衰期。在一些實施例中，半衰期之增加係相應未結合抗因子D抗體或抗體變體之半衰期之至少1.4倍或至少1.8倍或至少2倍。
在一些實施例中，該結合物在整個延長之時間週期內係穩定的，及在生理學條件下，每月因子D結合能力之損失小於20%、小於15%或小於10%。
在一些實施例中，該結合物具有使其適用於透過窄孔針投與之黏度。在一些實施例中，在150至250mg/mL之濃度下，該結合物之黏度係小於800cP、小於700cP、小於600cP、小於500cP、小於400cP或小於300cP。在一些實施例中，在200mg/mL之濃度下，該結合物之黏度係小於300cP。
在一些實施例中，RH在3至30nM之範圍內。
E.用於診斷及偵測之方法及組合物
在某些實施例中，本文提供之抗因子D抗體中之任何一者適用於偵測生物樣品中因子D之存在。如本文使用之術語「偵測」涵蓋定量或定性偵測。「生物樣品」包含(例如)細胞或組織。
在一些實施例中，提供用於診斷或偵測之方法中之抗因子D抗體。在 另一態樣中，提供偵測生物樣品中因子D之存在之方法。在某些實施例中，該方法包括使生物樣品與如本文描述之抗因子D抗體在允許該抗因子D抗體結合至因子D之條件下接觸，並偵測是否於抗因子D抗體與生物樣品中之因子D之間形成複合體。此方法可為活體外或活體內方法。在一些實施例中，抗因子D抗體係用以選擇勝任使用抗因子D抗體之療法之個體，例如，在因子D係用於選擇患者之生物標誌物之情況中。在另一實施例中，該生物樣品係細胞或組織。
在其他實施例中，診斷或偵測之方法包含使固定於基板之第一抗因子D抗體與待測試因子D之存在之生物樣品接觸，將該基板曝露於第二抗因子D抗體，及偵測該第二抗因子D是否結合至第一抗因子D抗體與該生物樣品中之因子之D間之複合體。基板可為任何支持媒介，例如，玻璃、金屬、陶瓷、聚合珠、劃片、晶片及其他基板。在某些實施例中，生物樣品包含細胞或組織。在某些實施例中，第一或第二抗因子D抗體係本文描述之抗體中之任何一者。
在某些實施例中，提供經標記之抗因子D抗體。標記包括(但不限於)直接偵測之標記或部分(諸如螢光、色基、電子緻密、化學發光及放射性標記)及間接偵測(例如，透過酶反應或分子相互作用)之部分(諸如酶或配位體)。例示性標記包括(但不限於)放射性同位素(32P、14C、125I、3H及131I)、螢光團(諸如稀土螯合物或螢光素及其衍生物、玫瑰紅及其衍生物)、丹磺醯基、繖形酮、螢光素酶(例如，螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶(美國專利案第4,737,456號)、螢光素、2,3-二氫酞嗪二酮、山葵過氧化酶(HRP)、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖澱粉酶、溶菌酶、醣氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸酯脫氫酶)、雜環 氧化酶(諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶)與採用過氧化氫以氧化染料前驅物之酶(諸如HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶)之偶合、生物素/抗生物素蛋白、自旋標記、細菌噬菌體標記、穩定自由基及類似物。在另一實施例中，標記係正電子發射體。正電子發射體包括但不限於68Ga、18F、64Cu、86Y、76Br、89Zr及124I。在一特定實施例中，正電子發射係89Zr。
F.醫藥調配物
如本文描述之抗因子D抗體或結合物之醫藥調配物係藉由將具有所需純度之此抗體與一或多種可選醫藥上可接受之載劑(Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.編(1980))混合成凍乾調配物或水溶液之形式來製備。醫藥上可接受之載劑通常在採用之劑量及濃度下對接受者無毒，且包括(但不限於)：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲雙銨；氯化苄二甲烴銨；氯化本索寧；苯酚；丁醇或苄醇；對羥苯甲酸烷基酯(諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯)；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚(乙烯基吡咯啶酮)；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑(諸如EDTA)；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、岩藻糖或山梨糖醇；形成鹽之相對離子(諸如鈉)；金屬錯合物(例如，Zn-蛋白質錯合物)及/或非離子表面活性劑(諸如聚乙二醇(PEG))。本文之例示性醫藥上可接受之載劑進一步包括間質性藥物分散劑，諸如可溶性中性-活性玻尿酸酶醣蛋白(sHASEGP)，例如，人類可溶性PH-20玻尿 酸酶醣蛋白，諸如rHuPH20(HYLENEX®，Baxter International,Inc.)。某些例示性sHASEGP(包括rHuPH20)及使用方法描述於美國專利公開案第2005/0260186及2006/0104968號中。在一些實施例中，sHASEGP係組合一或多種額外醣胺聚醣酶(諸如軟骨素酶)。
例示性凍乾抗體或結合物調配物係描述於美國專利案第6,267,958號中。水性抗體或結合物調配物包括彼等描述於美國專利案第6,171,586及WO2006/044908號中者，後者調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝劑。
本文之調配物亦可含有超過一種針對治療中之特定適應症而言所必需之活性成分。在一些實施例中，該等活性成分具有不會不利地影響彼此之互補活性。
可將活性成分包埋於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合分別於膠狀藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)中或於巨乳液中所製備之微膠囊(例如，羥基甲基纖維素或明膠-微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中。此等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.編(1980)中。
可製備緩釋製劑。緩釋製劑之合適實例包括含有該抗體或結合物之固體疏水性聚合物之半滲透性基質，其中基質係以成型物件之形式(例如，薄膜或微膠囊)。緩釋基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美國專利案第3,773,919號)、L-麩胺酸及L-麩胺酸乙酯之共聚物、非可降解乙烯-乙酸乙烯酯、可降解乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林組成之可注射微球)及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。儘管聚合物(諸如乙烯-乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸)可釋放分子達100天以上，但某些水凝膠在 較短時間內釋放蛋白質。當囊封抗體於體內保留較長時間時，其等可因在37℃下曝露於水分而變性或凝集，導致生物活性之損失及免疫原性之可能變化。可取決於所涉及之機制設計合理對策以獲得穩定化。例如，若發現凝集機制係透過硫代-二硫化物互換之分子間S--S鍵形成，則穩定化可藉由修飾巰基殘基；自酸性溶液凍乾；控制水分含量；使用適當添加劑及開發特異性聚合物基質組合物達成。
待用於活體內投與之調配物通常係無菌的。無菌可容易地例如藉由透過無菌過濾膜過濾達成。
本文描述之用於預防或治療眼疾病或病症之抗體及結合物係通常藉由眼、眼內及/或玻璃體內注射及/或近鞏膜注射及/或結膜下注射及/或超脈絡膜注射投與及/或以滴眼液及/或藥膏之形式局部投與。本發明之此等化合物可藉由各種方法遞送，例如，呈容許將該化合物緩釋至玻璃體內之裝置及/或貯存物形式(包括彼等描述於諸如Intraocular Drug Delivery，Jaffe、Jaffe、Ashton及Pearson編，Taylor & Francis(March 2006)之參考文獻中者)玻璃體內遞送。在一個實例中，裝置可呈小型泵及/或基質及/或被動擴散系統及/或囊封元件之形式，其等可在延長之時間內釋放該化合物(Intraocular Drug Delivery，Jaffe、Jaffe、Ashton及Pearson編，Taylor & Francis(March 2006)。亦可使用其他投與方法，該等方法包括但不限於局部、非經腸、皮下、腹腔內、肺內、鼻內及病灶內投與。非經腸輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹腔內或皮下投與。
用於眼、眼內或玻璃體內投與之調配物可藉由此項技術中已知的方法及使用此項技術中已知的成分來製備。有效治療之主要要求係透過眼部之適當滲透。不同於眼部前方之疾病，在藥物可經局部遞送之情況下，視 網膜疾病要求更具位點特異性方法。滴眼液及藥膏很難滲透眼部之後方，及血-眼屏障阻礙全身投與之藥物滲透至眼組織內。因此，選擇用於藥物遞送以治療視網膜疾病(諸如AMD及CNV)之方法通常係直接玻璃體內注射。玻璃體內注射通常以視病患之病症及所遞送藥物之性質及半衰期而定之時間間隔重複。就眼內(例如，玻璃體內)滲透而言，通常具有較小尺寸之分子係較佳。
就眼投與而言，在一些實施例中，本文描述之抗體及結合物可以pH5.5調配於醫藥上可接受之載劑中。
在一些實施例中，本文描述之抗體及結合物可經調配以供使用可植入口遞送系統(PDS)之遞送。如先前指示，該PDS係可再填充裝置，其中進入玻璃體內之釋放係藉由包含鈦熔塊之多孔金屬膜控制。由於貯存槽具有較小體積，因此在一些實施例中，需要高蛋白濃度以使PDS進行有效遞送。因此，在一些實施例中，本文描述之抗體及結合物係以高濃度調配。在一些實施例中，本文描述之抗體及結合物可以至少150mg/mL、至少160mg/mL、至少170mg/mL、至少180mg/mL、至少190mg/mL、至少200mg/mL或至少210mg/mL或至少220mg/mL或至少230mg/mL或至少240mg/mL或至少250mg/mL或至少260mg/mL或至少270mg/mL或至少280mg/mL或至少290mg/mL或至少300mg/mL之濃度調配。在一些實施例中，本文描述之抗體及結合物可以在150mg/mL至350mg/mL或150mg/mL至300mg/mL或170mg/mL至300mg/mL或200mg/mL至300mg/mL之間之濃度調配。
治療補體相關眼部病症(AMD或CNV)之療效可藉由評估眼內疾病中常用之各種終點衡量。例如，可評估視力損失。視力損失可藉由(但不限 於)以下進行評估：例如，藉由最佳糾正視力(BCVA)自基線至所需時間點之平均變化衡量(例如，其中該BCVA係基於早期治療糖尿病視網膜病變研究(ETDRS)視力表及在4米之測試距離下之評估)；量測在所需時間點下相較於基線在視力方面損失小於15個字母之個體之比例；量測在所需時間點下相較於基線在視力方面獲得大於或等於15個字母之個體之比例；量測在所需時間點下具有20/2000之視力Snellen當量或更差之個體之比例；量測NEI視覺功能調查問卷；量測在所需時間點下之CNV之大小及CNV之滲漏物之量，例如，藉由螢光素血管攝影術等。眼評估可藉由以下完成，例如，其等包括但不限於例如進行眼部檢查；量測眼內壓；評估視力；量測裂隙燈壓力；評估眼內炎症等。
在一些實施例中，抗因子D抗體或其結合物係以每隻眼約0.3mg至約30mg之劑量玻璃體內投與。
用於投與之給藥方案取決於許多臨床因素可自每月一次至每日一次變化，該等臨床因素包括疾病之類型、疾病之嚴重性及個體對治療劑之敏感性。
G.治療方法及組合物
本文提供之抗因子D抗體或結合物之任何一者可用於方法(例如，治療方法)中。
根據本文之實施例中之任何一者之「個體(individual)」、「病患」或「個體(subject)」可為人類。
本發明之抗因子D抗體及結合物可用以治療哺乳動物。在一些實施例中，舉例而言，為了獲得臨床前的資料目的，該抗因子D抗體或結合物係投與給非人類哺乳動物。例示性待治療之非人類哺乳動物包括其中進行臨 床前研究之非人類靈長類動物、夠、貓、嚙齒類動物及其他哺乳動物。此等哺乳動物可為針對欲用該抗體治療之疾病建立之動物模型或可用以研究感興趣之抗體之毒性。在此等實施例之各者中，劑量漸增研究可在哺乳動物上進行。
該抗因子D抗體或結合物可藉由任何合適之方式投與，該等方式包括非經腸、皮下、腹腔內、玻璃體內、肺內及鼻內，及若需要局部免疫抑制治療，則以病灶內投與。非經腸輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹腔內、玻璃體內及皮下投與。另外，該結合物適宜藉由脈衝輸注投與，特定言之利用遞減劑量之抗體或其抗體變體或其片段(例如，抗原結合片段)。在一些實施例中，給藥係藉由注射給定，諸如靜脈內或皮下注射，其部分取決於該投與係短期還是長期的。
為預防或治療疾病，抗因子D抗體或結合物之適當劑量將取決於待治療之疾病之類型；該疾病之嚴重性及病程；出於預防抑或治療目的投與該抗體；先前治療；病患之臨床歷史及對該抗體之反應及主治醫師之自由裁量權。
取決於疾病之類型及嚴重性，約1至25mg/眼(0.015mg/kg至0.36mg/kg每隻眼)之抗體係向病患投與之初始候選劑量，無論(例如)藉由一或多次分別投與，或藉由連續輸注。就歷時數天或更長之重複投與而言，取決於病症，持續治療直至出現對疾病症狀之所需抑制。然而，其他劑量方案可為有用的。此療法之過程易於藉由習知技術及分析監測。例示性給藥方案係揭示於WO 94/04188中。
結合物組合物可以與良好醫學實務一致之方式調配、給藥及投與。此內文中考慮之因素包括治療中之特定失調症；治療中之特定哺乳動物； 個別病患之臨床病症；失調症之起因；遞送藥劑之位點；投與之方法；投與之時間安排表；及執業醫師已知的其他因素。待投與之結合物之「治療有效量」將藉由此等考量控制，及係預防、減輕或治療疾病或失調症所需之最小量。該結合物無需但視需要與一或多種當前用以預防或治療留待討論之失調症之藥劑調配。此等其他藥劑之有效量取決於存在於調配物中之抗體或其抗體變體或其片段(例如，抗原結合片段)之量；失調症或治療之類型；及上文討論之其他因素。此等係通常以相同劑量及以如上文使用之投與途徑或迄今為止採用之劑量之約1至99%使用。
本文揭示之抗體(將因子D識別為其等目標)及包含此等抗體之結合物可用以治療經補體介導之失調症。此等失調症係與過度及不受控之補體活化相關聯。該等失調症包括：心肺分流手術期間之補體活化；因急性心肌梗塞、動脈瘤、中風、失血性休克、擠壓損傷、多器官功能衰竭、低血容量性休克及腸缺血後之缺血-再灌注引起之補體活化。此等失調症亦可包括疾病或病症，其係炎性病症，諸如嚴重燒傷、內毒血症、敗血性休克、成人呼吸窘迫症候群、血液透析、過敏性休克、嚴重哮喘、血管性水腫、克隆氏病、鐮狀細胞貧血症、鏈球菌感染後腎絲球腎炎及胰臟炎。該失調症可為不良藥物反應、藥物過敏、IL-2誘導之血管滲漏症候群或放射線造影劑過敏症之結果。其亦包括自體免疫疾病，諸如全身性紅斑狼瘡、重症肌無力、類風濕性關節炎、阿茲海默症及多發性硬化症。補體活化亦係與移植排斥反應相關聯。近期，在補體活化與諸如以下之眼部疾病之間顯示強相關性：年齡相關性黃斑變性、糖尿病視網膜病變及其他缺血相關視網膜病變、脈絡膜新生血管性疾病(CNV)、眼色素層炎、糖尿病性黃斑水腫、病理性近視、逢希伯-林道失調症、眼組織胞漿菌病、中央視網膜靜 脈阻塞(CRVO)、角膜新生血管形成及視網膜新生血管形成。
結合物之抗因子D抗體可單獨投與或組合至少第二治療化合物投與。結合物及任何第二治療化合物之投與可使用相同或不同投與途徑(例如)作為單一組合物或作為兩種或多種不同組合物同時完成。或者或另外，該投與可以任何順序循序完成。在某些實施例中，介於分鐘至天、至週至月之範圍內之時間間隔可存在於兩種或多種組合物之投與之間。例如，包含因子D拮抗劑之結合物可首先投與，接著投與第二治療化合物。然而，亦預期同時投與或在投與結合物前投與投與第二治療化合物。在一些實施例中，該第二治療化合物係選自HTRA1拮抗劑、ANG2拮抗劑(諸如抗ANG2抗體，如揭示(例如)於US20090304694 A1中)、TIE2拮抗劑(諸如抗TIE2抗體，如揭示(例如)於美國專利案第6,376,653號中)、VEGF拮抗劑(諸如VEGF拮抗劑，如揭示(例如)於2015年2月26日發證之美國專利案第6,884,879及WO98/45331中(貝伐單抗及其他人類化抗VEGF抗體)；WO2005/012359及WO2005/044853(G6或B20系列抗體(例如，G6-31、B20-4.1)；WO98/45331(蘭尼單抗)及第二補體組分拮抗劑。在一些實施例中，該HTRA1拮抗劑係抗HTRA1抗體。在一些實施例中，該ANG2拮抗劑係抗ANG2抗體。在一些實施例中，該TIE2拮抗劑係抗TIE2抗體。在一些實施例中，VEGF拮抗劑係選自VEGF捕獲劑(諸如阿柏西普(Eylea®)及抗VEGF抗體(諸如貝伐單抗(Avastin®)或蘭尼單抗(Lucentis®))。在一些實施例中，該第二補體組分拮抗劑抑制經典或替代補體途徑(補體抑制劑)之各種成員，其選自C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9補體組分。
在一些實施例中，用於患有經補體介導之失調症的人類個體之本發 明之治療包括向個體投與有效量之治療化合物(諸如結合物之抗因子D抗體)及進一步包括向該個體投與有效量之第二治療化合物。在一些實施例中，該第二治療化合物係HTRA1拮抗劑。在一些實施例中，該第二治療化合物係ANG2拮抗劑。在一些實施例中，該第二治療化合物係TIE2拮抗劑。在一些實施例中，該第二治療化合物係VEGF拮抗劑。在一些實施例中，該第二治療化合物係第二補體組分拮抗劑。在一些實施例中，該經補體介導之失調症係與補體相關眼部病症。在一些實施例中，該眼失調症係年齡相關性黃斑變性(AMD)，其包括非滲出性(例如，中度乾性AMD或地圖狀萎縮(GA))及滲出性(例如，濕性AMD(脈絡膜新生血管性疾病(CNV))AMD、糖尿病視網膜病變(DR)、眼內炎及眼色素層炎。在一個實例中，該補體相關眼部病症係中度乾性AMD。在一些實施例中，該補體相關眼部病症係地圖狀萎縮。在一些實施例中，該補體相關眼部病症係濕性AMD(脈絡膜新生血管性疾病(CNV))。
本文之組合投與包括使用各自調配物或單一醫藥調配物共投與，及以任意順序連續投與，其中通常存在某一時間週期，在該時間週期中兩種(或所有)活性劑同時發揮其等生物活性。
在另一態樣中，本發明提供包含本文提供之抗因子D抗體或結合物中之任何一者之醫藥調配物，例如，其等用於上文治療方法中之任何一者中。在一些實施例中，醫藥調配物包含本文提供之抗因子D抗體或結合物中之任何一者及醫藥上可接受之載劑。在另一實施例中，醫藥調配物包含本文提供之抗因子D抗體或結合物中之任何一者及至少一種額外治療劑。
應瞭解上文調配物或治療方法中之任何一者可使用本發明結合物及/或抗因子D抗體中之一者或兩者進行。
H.製品
提供適用於本文之治療方法之包含本文描述之抗因子D抗體之製品或「套組」。在一些實施例中，該套組包含一容器，其包含抗因子D抗體。該套組可進一步包含在該容器上或與該容器相關聯之標籤或包裝插頁。術語「包裝插頁」係用以係指通常包括於治療產品之商業包裝中之說明書，其等含有關於適應症、使用方法、劑量、投與、禁忌及/或涉及使用此等治療產品之警告之資訊。合適之容器包括(例如)瓶子、小瓶、注射器、泡罩包裝等。該容器可形成自各種材料，諸如玻璃或塑膠。該容器可裝載有效用於本文之治療方法中之本文描述之抗因子D抗體或其調配物，且可具有無菌入孔(例如，該容器可為具有可藉由皮下注射針刺破之塞子之小瓶)。該標籤或包裝插頁指示用於如本文描述及本文主張之治療方法中之組合物。製品亦可含有另一容器，其包含醫藥上可接受之緩衝劑，諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝生理鹽水、林格氏溶液(Ringer’s solution)及葡萄糖溶液。其可進一步包括商業及使用者立場所需之其他材料，其等包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
該套組可進一步包含用於投與本文描述之抗因子D抗體之用法說明書。在一些實施例中，該標籤或包裝插頁指示該組合物係用於治療補體相關失調症，諸如，例如，先前列舉之病症中之任何一者，包括眼部失調症，例如，年齡相關性黃斑變性(AMD)。該標籤或包裝插頁可進一步包含用於向病患投與抗體組合物之說明書。一些實施例中，若該套組包含含有抗因子D抗體之第一組合物及第二醫藥調配物，則該套組可進一步包含用於向有需要病患同時、順序或分別投與第一及第二醫藥組合物之用法說明。
根據一些實施例，套組可包含本文描述之抗因子D抗體及包含醫藥上可接受之緩衝劑(諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝生理鹽水、林格氏溶液(Ringer’s solution)及葡萄糖溶液)之容器。其可進一步包括商業及使用者立場所需之其他材料，其等包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
在一些實施例中，套組包含可植入口遞送系統(PDS)及包含本文描述之抗因子D抗體或結合物之組合物。在一些實施例中，該套組包含用於植入該PDS及用抗體或結合物填充容器之說明書。在一些實施例中，套組包含含有經調配以再填充PDS之抗因子D抗體或結合物之組合物。
在另一實施例中，亦提供適用於各種目的(例如用於治療、預防及/或診斷補體相關失調症，用於補體相關溶血分析，用於自細胞純化或免疫沈澱因子D多肽)之套組。為分離及純化因子D多肽，該套組可含有偶合至珠(例如，瓊脂糖珠)之抗因子D抗體。可提供含有用於(例如，在ELISA或西方墨點轉漬法中)活體外偵測及定量因子D多肽之抗體之套組。如同製品，該套組包含容器及在該容器上或與該容器相關聯之標籤或包裝插頁。該容器裝載包含含有至少一個抗因子抗體之本發明結合物之組合物。可包括含有(例如)稀釋劑及緩衝劑、對照抗體之額外容器。該標籤或包裝插頁提供組合物之說明書及於預期活體外或偵測用途之說明書。該標籤或包裝插頁提供用於向個體投與之說明書(例如，抗體或其抗體片段(例如，抗原結合片段))。
III.實例
下列係本發明之方法及組合物之實例。應瞭解鑒於上文提供之一般描述，可實踐各種其他實施例。
實例1：抗因子D人類化抗體之產生
蘭帕珠單抗(有時亦稱為「aFD.WT」或「FCFD4515S」)(透過結合至因子D上之外部位點潛在抑制因子D及替代補體途徑之人類化抗因子DFab片段)係當前臨床開發中用於治療地圖狀萎縮(GA)、乾性AMD之晚期形式。蘭帕珠單抗包含214個殘基輕鏈(SEQ ID NO：102)及223個殘基重鏈(SEQ ID NO：103)。
儘管GA之II期人類臨床試驗之結果指示憑藉aFD.WT之每月玻璃體內注射會獲得治療效果，但需要使用較高藥物劑量以達成甚至更佳療效。同時，較低頻率給藥將提供給病患經改善的便利性；具有感染率減小及增加之臨床療效之潛在利益及可促進患有乾性AMD之較不晚期形式之病患之治療。
為開發可以高濃度調配之具有較低黏度且可儲存而無沈澱之因子D抑制劑，基於抗因子D鼠類抗體20D12開發新穎人類化抗因子D抗體。參見PCT公開案第2008/147883 A1號。簡而言之，將來自鼠類20D12之VL及VH域(SEQ ID NO：8之VH及SEQ ID NO：7之VL)與人類VL κ I(VLKI)及人類VH子群I(VHI)共同序列比對。如下文描述，將來自鼠類20D12抗體之高度可變區(HVR)工程改造至VLKI及VHI受體框架中以產生CDR移植變體。
將20D12 VL域中的位置24-34(L1)、50-56(L2)及89-97(L3)移植至VLKI內。將20D12 VH域中的位置31-35(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)移植至VHI內。HVR定義係由其等序列高度可變性(Wu,T.T.& Kabat,E.A.(1970))、其等結構位置(Chothia,C.& Lesk,A.M.(1987))及其等於抗原-抗體接觸之涉及(MacCallum等人J.Mol.Biol.262：732-745(1996)) 來定義。使某些游標位置(vernier position)突變回鼠類序列，包括VL中之位置36及46及VH中之位置67、69及71。參見圖1A至C及2A至C。
產生編碼抗體20D12之初始人類化版本hu20D12.v1之可變域(圖1A至C及2A至C；SEQ ID NO：29之VH，SEQ ID NO：28之VL)之合成基因並選殖至載體內以表現為全長IgG。抗體係暫態表現於CHO細胞中及如先前描述純化(Kelley及Meng(2012)Methods Mol Biol 901：277-93)。針對人類因子D之結合親和性係使用用於鼠類20D12(捕獲套組#BR-1008-38)及hu20D12.v1 IgG(捕獲套組#BR-1008-39)之抗Fc捕獲物於Biacore®T200儀器上藉由表面電漿子共振(SPR)量測進行測定。如下文於表3中所示，鼠類20D12及hu20D12.v1具有針對人類因子D之可比較親和性。
如下，亦於溶血分析中分析該等抗體之因子D抑制。先前已描述使用兔紅細胞(Er)之AP溶血分析(Pangburn(1998)Methods.Enzymol.162：639；Katschke等人(2009)J.Biol.Chem.284：10473)。Er(科羅拉多血清)用含於佛羅那緩衝劑(GVB)中之0.5%胎牛皮膚明膠清洗三次及重懸浮。抗因子D抗體之稀釋物係以2X濃度製備並添加至96孔聚丙烯板。將Er懸浮液與GVB/0.1M EGTA/0.1M MgCl2混合並添加至該等板。補體活化係藉由添加C1q耗盡之人類血清啟始以避免透過經典途徑之任何補體活化(CompTech；以1：3稀釋於GVB中)。在室溫下培養30分鐘後，該反應藉由添加含於GVB中之10mM EDTA停止。離心該等板及轉移上清液。上清液之吸光度係於412nM下讀取。引起半最大抑制(IC50)之AFD.Ab濃度係藉由非線性回歸分析測定。該分析之結果示於表3中。
表3：IgG格式小鼠(IgG-formateed mouse)及人類化20D12之人類因
如表3中所示，人類化抗體hu20D12.v1之親和性係堪比親代鼠類抗體之親和性。Hu20D12.v1在溶血分析中亦保留針對因子D之抑制活性。
實例2：hu20D12 Fab片段之產生及表徵
將編碼hu20D12.v1之Fab片段之基因之部分次選殖至與先前描述之載體類似之大腸桿菌表現載體內(Carter等人(1992)BioTechnology 10：163)。就小規模表現及純化而言，將DNA轉形至大腸桿菌菌株64B4中。將單一菌落挑選至含有50μg/mL羧芐青黴素(培養基製備編碼A3232)之5mL LB培養基(培養基製備編碼A2008)內及在Innova培養器中在37℃下以200RPM搖晃培養於14mL培養管中生長整夜。此等培養物係用於將250mL完全大豆渣培養基(培養基製備碼A4564)、50μg/mL羧芐青黴素接種於1L擋板式搖瓶中。將培養物在30℃下伴隨200RPM之搖晃生長整夜及然後藉由離心收穫。使用PopCulture培養基(invitrogen)溶解細胞集結粒，及於Gravitrap蛋白G管柱(GE Healthcare)上純化Fab，此等操作遵循製造商供應之方案。就大規模生產Fab而言，將自轉形細胞之10L發酵物之細胞漿懸浮於萃取緩衝劑中及使用微流化器均質化。Fab係藉由在κappa-select樹脂上之免疫親和性層析進行捕獲及用低pH緩衝劑溶離。溶離物用1M TRIS(pH 8.0)立即中和及使用Amicon centricon過濾裝置(EMD Millipore)將緩衝劑交換成PBS。此池係使用疏水性相互作用層析術(HIC)進一步純化。該溶液係藉由透過添加乙酸將pH調整至6.5及添加硫酸銨至2.5M之最終濃度來製備以供HIC。HIC係於已用25mM NaPO4、2.5M硫酸銨(pH 6.5)平衡之3mL ProPac HIC-10管柱(Thermo Scientific)上。用25mM NaPO4、25%異丙醇(pH 6.5)溶離緩衝劑之兩個步驟梯度係用以溶離經結合之蛋白質。溶離份係使用完整Fab液相層析術質譜分析術(LCMS)分析以測定峰同一性。將含有Fab蛋白質之溶離份交換至PBS緩衝劑中。
實例3：hu20D12之穩定性及分子評估
為模擬hu20D12.v1曝露於長效遞送系統所見之條件，在37℃下，該抗體Fab以溶於PBS中濃度100mg/mL進行壓力測試達四週。PBS係用作人類玻璃體之pH及離子強度之模擬物。Hu20D12.v1對此壓力條件顯示具有良好抗凝集性，損失僅0.6%之單體，但使用胰蛋白酶肽圖譜分析顯示有Asn-54(CDR-H2)之脫醯胺。
如上文指示，hu20D12.v1包括位於HVR-H2中之NG脫醯胺位點。因此，使HVR-H2中之N54突變至S(N54S)或Q(N54Q)以移除NG脫醯胺位點。點突變係藉由使用QuikChangeII®(Agilent)誘變套組遵循與套組一起供應之方案藉由定點誘變引入。合成指定所需密碼子變化之寡核苷酸引子。識別具有經設計之變化之質體並藉由DNA定序證實。變體Fab係表現於大腸桿菌中及如上文針對hu20D12.v1描述純化。在圖1A至C及2A至C中，hu20D12.v1(SEQ ID NO：29之VH，SEQ ID NO：28之VL)顯示無N54突變之CDR移植抗體及hu20D12.v2.0顯示具有N54S突變之CDR移植抗體(SEQ ID NO：33之VH，SEQ ID NO：32之VL)及hu20D12.v1.1顯示具有N54Q突變之CDR移植抗體(SEQ ID NO：31之VH，SEQ ID NO：30之VL)。兩個變體Fab及親代hu20D12.v1 Fab針對因子D之結合親和性(KD)係使用本文描述之抗huFab捕獲方案(參見，例如，實例5)藉由表面電漿子共振(SPR)評估。亦在溶血分析中分析該等Fab之因子D抑制。表4顯 示在溶血分析中hu20D12.v1之N54S及N54Q變體之親和性及各抗體之IC50。
如表4中顯示，hu20D12.v1之N54S變體(hu20D12.v2.0)具有針對因子D之可比較親和性。N54S及N54Q變體在溶血分析中亦保留針對因子D之抑制活性。Hu20D12.v2.0係經選擇以供其他分析及親和性改善。
對hu20D12.v2.0進行分子評估(MA)以測定該抗體供進一步開發之適用性。在此等實驗中，分子係在涉及在37℃或40℃下之培養之加速穩定性測試中測試。化學穩定性係使用肽圖譜分析評估，使用SEC以測定對凝集之敏感性，及在一些情況下，使用抗原結合之SPR量測以評估活性之保留時間。此等測試指示該分子是否對製造、調配或遞送之標準方法提出任何挑戰。表5顯示壓力測試之結果。
類似於hu20D12.v1，37℃下，當hu20D12.v2.0濃度係為溶於PBS中100mg/mL達4週的壓力情況不會凝集。不同於hu20D12.v1，hu20D12.v2.0在此濃度壓力條件下未顯示脫醯胺位點，此表明N54S取代作用消除了脫醯胺且該變體在生理pH及離子強度下具有較高穩定性。Hu20D12.v2.0在適用於眼藥物之pH 5.5調配物中亦顯示良好穩定性。
實例4：hu20D12.v2.0：因子D複合體之結構測定
為更好瞭解hu20D12.v2.0如何結合人類因子D，測定hu20D12.v2.0 Fab與因子D所形成之複合體之結構。將人類因子D蛋白質及hu20D12.v2.0 Fab以1：1莫耳比混合並在用20mM Hepes pH 7.2及150mM NaCl預平衡之Superdex 200管柱上純化。將含有該複合體之峰溶離份匯集，濃縮至32mg/mL並用於結晶試驗中。晶體係藉由將蛋白質以2：1(v/v)與含有0.1M二甲胂酸鈉pH 6.5及1M檸檬酸鈉之貯存槽溶液混合，使用氣相擴散方法在4℃下生長。將該等晶體低溫保護於含有20%乙二醇之人造母液中及並快速冷凍於液氮中。2.9Å資料集係在ALS 5.0.2下收集且結構藉由分子置換方法解決。與先前解決的另一抗因子D Fab：因子D複合體之對比(Katschke等人(2012)J.Biol.Chem.287,12886)係顯示於圖3A至C之覆蓋圖中。儘管此等兩個抗體具有不同CDR序列，但其等結合至因子D上之近乎相同抗原決定基。先前因子D抗體(蘭帕珠單抗)與hu20D12.v2.0(「hu20D12.v1.N54S」)之比對係顯示於圖4中。
實例5：較高親和性抗因子D人類化抗體變體之設計
藉由習知篩選方法(諸如噬菌體展示技術)改善抗體之親和性(以pM親和性計)通常非常困難的。因此，使用20D12與因子D結合之基於結構之分析(使用上文描述之結晶結構)以識別可經突變以改善親和性之特異性胺基酸殘基。
識別hu20D12.v2.0與因子D之間之某些接觸為潛在次優的且彼等殘基係經選擇以突變成相應蘭帕珠單抗胺基酸，其可提供針對抗原之較佳親和性。fD：hu20D12.v2.0複合體結構之檢查指示儘管Asp-173之側鏈係與hu20D12.v2.0接觸，但該fD Asp不與抗體Fab形成鹽橋或完全氫鍵。參見圖3C。於抗體上引入帶正電荷殘基(諸如Arg或Lys)可滿足用於Asp之離子配對要求。hu20D12.v2.0上顯示足夠近以至於可建立此相互作用之位置係輕鏈之FR2中之位置49。此位置係hu20D12.v2.0中之Tyr，因此吾人測試此位置之Lys或Arg是否將增加fD-結合親和性。另外，蘭帕珠單抗以比hu20D12.v2.0更高之親和性結合至fD(<10pM相比於39pM，參見圖11)及在界面內於主要接觸處具有不同殘基。例如，hu20D12.v2.0 CDR-H2殘基Glu-50、Thr-53、Gly56係蘭帕珠單抗中之Trp-50、Tyr-53及Glu-56。參見圖3B。蘭帕珠單抗重鏈之位置50之色胺酸(W)可與因子D形成疏水性相互作用，而hu20D12.v2.0於該位置具有麩胺酸(E)。蘭帕珠單抗重鏈之位置53之酪胺酸亦可比hu20D12.v2.0中之該位置之蘇胺酸(T)更好地與因子D中附近之殘基堆疊。在輕鏈中，hu20D12.v2.0中之CDR-L2 Tyr-55及CDR-L3-Asn92係蘭帕珠單抗中之CDR-L2 Arg-55及CDR-L3-Asp92。此等殘基中之各者顯示在因子D：蘭帕珠單抗複合體結構中接觸因子D，及CDR-L-Asp92與因子D之Lys223a形成帶電相互作用。Lys223a編號參見Katschke等人(2012)。
基於此等及其他觀察結果，設計額外20D12變體。用於20D12變體之輕鏈及重鏈序列分別示於圖1A至C及2A至C中。測試該等變體之針對結合至fD之效應。將突變引入大腸桿菌Fab表現質體內，及變體Fab係如上文描述般經表現及純化。
藉由表面電漿子共振(SPR)量測量測因子D結合親和性
因子D結合至固定化hu20D12版本之動力學及結合常數KD係於Biacore®T200儀器上藉由表面電漿子共振(SPR)量測進行測定。使用抗huFab捕獲套組(GE healthcare Cat.# 28-9583-25)遵循由製造商描述之方案將抗體Fab片段固定於Series S CM5感測器晶片上。結合之動力學係計算自針對注射60μL分液的介於0.39nM至25nM之濃度以2倍增量變化之人類因子D溶液所記錄之感測圖。流動速率係30μL/min，運行緩衝劑係HBS-P+(GE Healthcare cat#BR-1006-71)，分析之溫度係25℃，採用即時參考細胞減除，及因子D注射後之解離繼續10分鐘。就一些具有高親和性及慢解離速率之變體而言，監測解離2小時以獲得對解離速率之更精確量測。在減除針對注射運行緩衝劑所觀察之感測圖之後，資料係根據1：1模型使用BiaEval軟體v4.1(GE Healthcare)分析以提取動力學及親和性常數。
輕鏈殘基Tyr-49以Arg(hu20D12.v2.1)之置換導致對fD之結合改善4倍。參見圖11。增加之親和性係用於解離之較慢解離速率之結果。Tyr-49以Ser(hu20D12.v2.6)、Lys(hu20D12.v2.7)或Gln(hu20D12.v2.8)之置換不增加對fD之親和性。CDR-H2 Glu-50以Trp(hu20D12.v2.9)或CDR-L2 Tyr-55以Lys(hu20D12.v2.10)或Arg(hu20D12.v2.11)之取代導致對fD之親和性大幅減小。CDR-L2 Gly-56以Asp(hu20D12.v2.2)或Glu (hu20D12.v2.4)或Thr-53以Tyr(hu20D12.v2.5)之個別置換未顯示導致增加之親和性；然而，變體(hu20D12.v2.12、v2.14、v2.15、v2.3)中此等變化與Y49R之組合未顯示進一步增加親和性。hu20D12之序列與蘭帕珠單抗之比較指示置換CDR-L2上之Tyr-55將導致具有增加之親和性之變體，因為預期其與fD Asp-173相互作用。然而，晶體結構指示Tyr-49以Arg(Y49R)之置換係用於增加親和性之更佳選擇。儘管非個別測試，但CDR-L3取代N92E顯示在變體(hu20D12.v2.13)中與Y49R組合以產生結合親和性之有利增加。
hu20D12變體v2.1、v2.3、v2.12-v2.15及亦蘭帕珠單抗之針對人類因子D(hFD)之因子D結合親和性係處於當前SPR技術之偵測極限(KD~10pM)。hu20D12變體v2.1、v2.3、v2.14及v2.15中之數種結合至食蟹猴因子D(cyfD)，且hu20D12.v2.1具有最高親和性(KD=17pM)。另外，hu20D12.v2.1對食蟹猴因子D之結合親和性係相對於hu20D12.v2.0改善近10倍及相對於蘭帕珠單抗改善2倍。食蟹猴係常用於治療候選者之臨床前安全及療效評估中，使得對cFD之高結合親和性係所需性質。藉由示差掃描熱析法(DSC)測試Fab之熱穩定性。表6顯示熱穩定性分析之結果。
經測試之hu20D12變體均顯示高熱穩定性，且熔點高於針對AFD.v8及AFD.v14(蘭帕珠單抗之兩種變體)所觀察之熔點。
實例6：hu20D12變體之抑制因子D之效力
hu20D12變體及經結合之hu20D12 Fab-C版本之抑制因子D之效力係於因子D-依賴性因子B活化之時差式螢光能量轉移(TR-FRET)分析中來測定。hu20D12 Fab、經結合之hu20D12 Fab-C版本或對照之稀釋物係以4x濃度製備於酶反應緩衝劑(ERB；75mM NaCl、1mM MgCl2、25mM Tris、0.005%聚山梨醇酯20、pH 7.3)中並與0.5nM或0.2nM因子D(fD,Complement Technology；Tyler,TX)或ERB(無酶對照)等體積組合。蘭尼單抗(抗VEGF)係用作陰性對照。將因子D/AFD.Ab混合物(7μl/孔)添加至364孔Proxiplate F plus黑板(Perkin Elmer Health Sciences；Waltham,MA)中，接著添加7μl/孔之受質。該受質由7μg/mL(40nM)之C3b(Complement Technology)及1μg/mL(15nM)之因子B(Complement Technology)之混合物組成。將Fab或經結合之Fab-C版本、酶、輔因子及受質在室溫下伴隨輕輕攪動培養45min。該反應係用7μl/孔由8nM生物素化抗因子Bb(2F12,GNE PRO282909)、4nM結合銪抗因子Ba(1C3之自定義結合，藉由Life Technologies；Madison,WI之GNE PRO282908)及25nM鏈霉親和素-Alexa 647組成之偵測試劑雞尾酒混合物停止。將該板在室溫下在黑暗中培養30min。時差式螢光能量轉移係用PHERAstar FS酶標儀(BMG LabTech；Cary,NC)藉由在337nM下激發及於620nM下偵測銪發射及於665nM下偵測Alexa螢光發射進行偵測。引起半最大抑制(IC50)之AFD.Ab濃度係藉由非線性回歸分析使用四參數擬合模型(KaleidaGraph Synergy軟體；Reading,PA)測定。
用於TR-FRET分析之抑制曲線示於圖5A、圖5B(及表7)及圖11(用於此分析之條件係50pM因子D、15nM因子B(fB)及40nM因子C3b)中。蘭帕珠單抗針對因子D依賴性fB活化之抑制具有24pM之IC50，及IC50之 標準誤差係±25%(圖5B(表7)及圖11)。分析之靈敏度排除在低於50pM之因子D濃度下之測試。因此，可量測之最低IC50(等於其中50%之因子D係經抑制之濃度，及假設抑制劑及因子D以1：1相互作用)係25pM。hu20D12.v2.0之IC50係比針對蘭帕珠單抗所量測之IC50高約2倍。參見圖5B(表7)及圖11。經測試之變體(v2.1、2.14、2.15、2.3)均相對於hu20D12.v2.0具有增加之效力，且IC50值與針對蘭帕珠單抗所量測之值相等或接近。參見圖5A、5B(表7)及圖11。
實例7：親和性成熟hu20D12之穩定性及分子評估
對hu20D12.v2.1及hu20D12.v2.3進行分子評估。對hu20D12.v2.1未識別需要非標準實務之問題。對比之下，蘭帕珠單抗針對調配及長效遞送具有若干風險(表8中用於蘭帕珠單抗之壓力測試之結果)。針對hu20D12.v2.1之黏度之濃度依賴性係經測定，及指示此Fab在用於眼調配物之緩衝劑中具有低黏度及係適用於高濃度調配物。Hu20D12.v2.0可以 至少與所測試之濃度一樣高之濃度(292mg/mL)溶於PBS中，然而蘭帕珠單抗在227mg/mL下會顯示沈澱。參見圖6A及6B。另外，hu20D12.v2.0溶液在4℃下於27週後保持澄清且無沈澱跡象。此指示適用於具有改善之療效之較低頻率給藥之Fab之高濃度調配物相較於蘭帕珠單抗更易於獲得20D12之人類化變體。表8顯示hu20D12.v2.1之壓力測試之結果。
為模擬hu20D12.v2.1 Fab於長效遞送系統中經歷之條件，將hu20D12.v2.1 Fab之高濃度樣品在37℃下在兩種調配條件下保持一個月：(1)~200mg/mL，PBS，pH 7.4，及(2)~170mg/mL，20mM組胺酸鹽酸鹽，pH 5.5。PBS係經選擇以模擬人類玻璃體液之pH及離子強度。組胺酸鹽酸鹽被選為用於液體眼科治療劑之典型調配物。該調配物濃度(170mg/mL至200mg/mL)係經選擇以反映用於抗因子D之長效遞送之臨床相關劑量調配物。分子穩定性係經由針對化學穩定性之離子交換層析術(IEC)及針對凝集傾向之尺寸排阻層析術(SEC)評估。抗原結合之表面電漿子共振(SPR)量測係用以評估活性保留時間。
以200mg/mL調配於PBS pH 7.4中或以170mg/mL調配於20mM HisHCl pH 5.5中之Hu20D12.v2.1係使用0.22μm SteriFlip單元(EMD Millipore)無菌過濾，等分(100μL)，並在37℃下培養0、2或4週。培養完成後，將樣品稀釋於含有蔗糖之調配物緩衝劑中並在-20℃下冷凍。如下文描述，解凍後，樣品係藉由IEC、SEC及SPR分析。
藉由離子交換層析術進行之化學穩定性評估。hu20D12.v2.1之化學穩定性係使用離子交換層析術(IEC)進行監測。IEC係於具有同軸二極體陣列偵測器(DAD)之Agilent 1200 HPLC上進行。經解凍之蛋白質樣品係藉由用PBS稀釋至1mg/mL來製備以供IEC。在注射至管柱上前將樣品保持在2至8℃以維持穩定性。20μg蛋白質注射液之分離係使用ProPac SAX-10 2x250mm管柱(Dionex)在40℃下進行。溶劑A係20mM Tris pH 8.2及溶劑B係含於溶劑A中之250mM氯化鈉。納入PBS緩衝劑空白以減除緩衝劑對UV信號之貢獻。用於化學降解之分離之鹽梯度示於表10中。
資料係使用Chromeleon 6.8軟體(Thermo Scientific)處理以積分對蛋白質有貢獻之所有層析圖峰。百分率峰面積係使用方程式1計算及針對所有感興趣峰、所謂之酸變體、主峰及鹼性變體進行報告。若未偵測到酸或鹼性變體之峰，則將峰面積百分率報告為零。
hu20D12.v2.1之37℃高濃度穩定性樣品之IEC結果係報告於表11A至B中。
藉由尺寸排阻層析術進行之分子粒徑分佈評估。hu20D12.v2.1之分子粒徑分佈係使用尺寸排阻層析術(SEC)進行監測。SEC係於具有同軸二極體陣列偵測器(DAD)之Agilent 1200 HPLC上進行。經解凍之蛋白質樣品係藉由用PBS稀釋至1mg/mL來製備以供SEC。在注射至管柱上前將樣品保持在2至8℃以維持穩定性。100μg蛋白質注射液之分離係使用TSKgel G3000SWxl管柱(Tosoh Biosciences,part no.08541)在周圍溫度下進行。移動相由0.20M磷酸鉀、0.25M氯化鉀，pH 6.2±0.1組成。UV樣品信號係於280nM下經監測。納入PBS緩衝劑空白以減除緩衝劑對UV信號之貢獻。
資料係使用Chromeleon 6.8軟體(Thermo Scientific)處理以積分對蛋白質有貢獻之所有層析圖峰。百分率峰面積係使用上述等式1計算及針對所有感興趣峰、所謂之高分子量物種(HMWS)、主峰(單體)及低分子量物種(LMWS)進行報告。若未觀察到HMWS或LMWS之峰，則將峰面積百分率報告為零。將hu20D12.v2.1之37℃高濃度穩定性樣品之SEC結果報告於表12A至B中。
表12A：藉由尺寸排阻層析術測定之hu20D12.v2.1之37℃高濃度穩
藉由表面電漿子共振量測獲得之因子D結合能力。表面電漿子共振(SPR)量測係使用BIAcore®T200儀器(GE Healthcare)進行以測定經壓力之hu20D12.v2.1樣品之結合能力。系列S羧甲基化聚葡萄糖(CM5)感測器晶片係藉由使用胺偶合套組(GE Healthcare)遵循由製造商描述之方案固定化人類因子D(目標RU~3,000)來製備。未施加壓力之hu20D12.v2.1之標準溶液係用HBS-P+運行緩衝劑(GE Healthcare)自106.5nM兩倍稀釋至3.31nM來製備並以10μL/min注射180秒以產生標準曲線。經施加壓力之樣品係用HBS-P+緩衝劑稀釋至~40nM並以10μL/min注射180秒。在各注射後，感測器晶片表面用10mM甘胺酸-HCl(pH 2.1)以30μL/min再生，歷時30秒。濃度分析係使用BIAcore®T200分析軟體(GE Healthcare)進行。此類型之分析具有±10%之標準誤差，使得具有90至110%之結合能力之樣品被認為係完全活性的。hu20D12.v2.1之37℃高濃度穩定性樣品之SPR因子D結合能力之結果示於表13A至B中。
整體而言，此等結果指示hu20D12.v2.1係非常適宜高濃度調配於PBS及20mM His-HCl pH 5.5兩者中。SEC及IEC兩者之主峰僅存在低率之損失，及在37℃下歷時至少4週之熱壓力，因子D結合相對於初始樣品具有極小的降低。
實例8：hu20D12變體之聚合物結合
玻璃體半衰期可藉由增加抗體Fab之流體力學半徑範圍而延長。Fab之流體力學半徑範圍可藉由諸如聚乙二醇(PEG)之聚合物之共價結合增加。此修飾以位點特異性方式(在自抗原結合區移除之位點)完成可為有利的，以便於使結合對生物活性之影響最小化。出於此目的需要游離半胱胺酸殘基用於修飾之有效性。可採用單一或多個游離半胱胺酸以實現單一或多個結合位點。重鏈之C端之單一半胱胺酸係經包括於Fab中以供修飾。抗體之Fab-C版本係藉由將Fab重鏈延長一個殘基以包括Cys-226(EU編號)製得。在IgG1分子中，Cys-226形成鉸鏈之第一重鏈間雙硫鍵。寡核苷酸-定向誘變係如上文描述進行以產生hu20D12.v2.1.C(SEQ ID NO：119)及hu20D12.v2.3.C(SEQ ID NO：124)之Fab-C版本之基因構築體。可使用類似誘變程序以產生額外Fab-C構築體，例如，針對hu20D12.v2.1.C之SEQ ID NO：71、118至122及140至146及針對hu20D12.v2.3.C之SEQ ID NO：75、123、125至127及147至153。
hu20D12.v2.1(「hu20D12.v2.1.C」)及hu20D12.v2.3 (「hu20D12.v2.3.C」)之Fab-C版本係表現於大腸桿菌中及大體上如下經純化。該等Fab-C變體係使用Gamma Plus樹脂捕獲，用6.5mM GSH pH 8.5沖洗5份管柱體積以去阻斷C端半胱胺酸及破壞Fab-C二聚物形成，接著溶離至0.1M乙酸pH 2.9內。該等Fab-C單體係使用來自GE之SP瓊脂糖高性能強陽離子交換樹脂於25mM乙酸鈉pH 5.0中經進一步分離，用0.05% Triton X-100+0.05% Triton X-114沖洗19小時以移除內毒素。溶離係以在0至20% 25mM乙酸鈉pH 5.0+1M NaCl之間之梯度用20份管柱體積進行。Hu20D12.v2.1.C或hu20D12.v2.3.C係於25mM乙酸鈉pH 6.5、150mM NaCl、4mM EDTA中在約5mg/mL之濃度下結合至PEG八聚物。該等Fab-C未經進一步濃縮以最小化因Fab-C二聚化造成之半胱胺酸反應性損失。在平衡至室溫後，將來自JenKem之40K TP PEG粉末重懸浮於25mM乙酸鈉pH 5.0中至10mg/mL之濃度。使pH保持低於pH 6以避免順丁烯二醯亞胺開環。PEG一經溶解，則將其以PEG相比於Fab-C之0.1125：1之莫耳比添加至Fab-C池中。然後使該混合物保持在室溫下及輕輕搖晃整夜。第二天，結合效率係藉由SEC-MALS檢查。結合後，hu20D12.v2.1.C+TP-Oct係於Sephacryl S-300 HR(GE Healthcare)管柱上使用20mM His-乙酸鹽(pH 5.5)、50mM NaCl(等度梯度)，使用尺寸排阻層析術(SEC)純化，接著使用來自GE之SP瓊脂糖高性能強陽離子交換樹脂進行陽離子交換(CEX)以富集8個Fabs/PEG。CEX步驟係於25mM乙酸鈉pH 5.0中運行及使用10至20% 1M NaCl梯度用50CV溶離。呈現CEX層析圖(圖8A)及S300池(圖8B)中之Fab分佈之實例。針對不同溶離份之資料示於圖8C中。
就所有過程而言，Fab/PEG之比率係在等度條件下使用磷酸鹽緩衝 生理鹽水(PBS)pH 7.2、150mM NaCl，使用以0.8mL/min運行之300 x 8mm Shodex OH pak SB-804 HQ藉由尺寸排阻層析術(SEC)測定。莫耳質量係使用Wyatt Technology的同軸靜電多角度雷射光散射(MALS)測定。經結合之hu20D12.v2.1.C+TP-Oct之典型SEC-MALS曲線示於圖7A中。光子相關光譜係使用亦為Wyatt Technology的準彈性光散射(QELS)(一種在99.0°下偵測之單一光子計數模組)以測定流體動力學半徑(RH)。參見圖7B。原始資料係使用Wyatt的專有Astra軟體分析，其中莫耳質量及RH常數係使用利妥昔單抗標準物設定。用於hu20D12.v2.1.C+TP-Oct之RH值係10.3nM。參見圖7C。
尺寸排阻層析術(SEC)亦係用以測定抗因子D結合物之尺寸變體分佈。抗因子D結合物(300μg)之溶液係用pH 7.0緩衝劑20mM磷酸鈉、300mM氯化鈉稀釋至2mg/mL。就分析而言，使用具有在280nM下之UV偵測之可梯度流動之HPLC系統。層析管柱係Tosoh G4000 SWxl(8μm,450Å，7.8mmID x 30cm)，其在0.5ml/min下操作。將五十微升稀釋於移動相中之2mg/mL抗因子D注射至HPLC系統內。管柱溫度係周圍溫度，自動進樣器係在2至8℃下，移動相係以等度模式。管柱係經平衡直至獲得穩定基線及注射參考材料直至針對最小兩次連續注射觀察到一致層析曲線。基於此尺寸變體之分析可分辨來自結合物之未結合Fab形式及凝集形式(圖20)。
hu20D12.v2.1.C+TP-Oct及hu20D12.v2.3.C+TP-Oct兩者在結合至八聚物-PEG後於TR-FRET抑制分析中保留完全活性。參見圖5A。位點特異性結合呈現保持活性。另外，將Fab配置於多聚體支架上不顯著影響抑制劑效力。
調配物之黏度係用於判定注射適用性之重要參數。因此，黏度量測係針對聚乙二醇化Fab-C進行。黏度量測係於TA Instruments錐形及板流變計在25℃恆溫下使用1000s-1之剪切速率進行。就對Fab之量測而言，蛋白質係製備於pH 5.5低鹽緩衝劑中。對聚乙二醇化Fab-C材料進行之黏度量測採用20mM His-乙酸鹽、50mM NaCl之緩衝劑(pH 6.5)及量測溫度係20℃。hu20D12.v2.1.C(「hu20D12.v2.1.C+TP-Oct」)及hu20D12.v2.3.C(「hu20D12.v2.3.C+TP-Oct」)兩者之PEG-八聚物結合物顯示低黏度及黏度之濃度依賴性，其係適用於高濃度調配物之注射。參見圖9A。對比之下，AFD.v14.C之PEG-八聚物結合物(「AFD.v14.C+TP-Oct」)(其係蘭帕珠單抗之變體)顯示較高黏度及黏度之濃度依賴性，其對高濃度調配物之注射具有更大挑戰。參見圖9A。亦對與40K-四聚物-PEG(Sunbright®PTE-400 MA，參見表15)結合之Fab-C蛋白質完成黏度量測。hu20D12.v2.3.C(「hu20D12.v2.3.C+PEG四聚物」)之PEG四聚物結合物顯示低黏度及黏度之濃度依賴性，其係適用於高濃度調配物之注射。參見圖9B。對比之下，AFD.v8.C之PEG-四聚物結合物(「AFD.v8.C+PEG四聚物」)(其係蘭帕珠單抗之變體)顯示較高黏度及黏度之濃度依賴性，其對高濃度調配物之注射具有更大挑戰。參見圖9B。
使用具有陽極化鋁幾何結構20mm直徑、1°角度(零件#513204.905)之AR-G2高級流變計對hu20D12.v2.1.C+TP-Oct進行黏度量測。量測係對由20mM His-HCl(pH 5.5)、0.02%聚山梨醇酯-20組成之緩衝劑中之變化蛋白濃度之溶液進行。溫度係25℃及剪切速率係1000s-1。如顯示於表14中，此調配物就黏度對蛋白濃度之依賴性而言具有極佳曲線及在所測試之最高Fab濃度(235mg/mL)下，該黏度係僅203厘泊(cP)。
PEG製法：將PEG粉末用水復原至10mg/mL。使用10mM三氟乙酸鈉溶液作為陽離子化劑。採用溶解於50%乙腈：0.1%三氟乙酸中之20mg/mL α-氰基-4-羥基肉桂酸基質溶液。將PEG溶液、三氟乙酸鈉及50%乙腈：0.1%三氟乙酸以3：3：4比率混合。將一微升PEG混合物沈積於MALDI目標板上。將一微升基質添加至斑點上及容許在周圍溫度下乾燥。分析係於配備355nM、200Hz Nd：Yag雷射之4800 MALDI TOF/TOF儀器(Sciex,Framingham,MA)上於具有介於5000至100000之間之範圍內之m/z及5000雷射功率之線性模式下進行。
外部校準係使用尺寸介於2000至40000道耳頓之間之範圍內之PEG標準物(Sigma,St.Louis,MO)在類似樣品條件下進行。質量讀數報告為未解析光譜之最高點，在其中存在不止一個峰之情況下，將讀數報告為各峰之頂點。峰係使用資料探測軟體(Sciex,Framingham,MA)可視化。
經復原之PEG溶液亦係藉由經由Nanomate(Advion,Ithaca,NY)直接輸注於Exactive Plus EMR(經擴大之質量範圍)orbitrap儀器(EMR,Thermo,San Jose,CA)上加以分析。使用溶解於70% H2O：30%二甲亞碸(DMSO)中之1%(10mg/1ml)1,8-雙(四甲基胍基)萘(Sigma,St.Louis,MO)溶液作為電荷還原劑。使10ul之10mg/mL PEG溶液與10ul 1% 1,8-雙(四甲基胍基)萘混合，及在下列獲取參數下直接輸注至EMR上：噴霧氣體壓力，1.0psi；施加噴霧電壓1.50kV；毛細管溫度，325℃，離子透鏡 RF水平，100；掃描範圍，1000至20000 m/z；片段化，內部資源CID 200Ev，CE 200；解析度，17500；極性，陽性；Microscans,10；AGC目標，3e6；最大注射時間，50；AGC模式，固定；平均化，100；源DC偏置，25V；Injection Flatapole DC，8V；Inter Flatapole透鏡，7V；Bent Flatapole DC，6V，轉移多極DC調整偏置，0V；C-Trap入口透鏡調整偏置，0V；捕獲氣體壓力設定，8。光譜係使用Thermo Xcalibur Qual Browser可視化，然後手動注釋。
其中結合物之核PEG結構及數量隨樣品類型變化之PEG-Fab結合物可於4800 MALDI TOF/TOF上於線性模式下分析。將四微升PEG-Fab結合物與四微升三氟乙酸鈉及兩微升50%乙腈：0.1%三氟乙酸混合。將等體積PEG-Fab溶液及20mg/mL芥子酸(於50%乙腈：0.1%三氟乙酸中，Agilent,Santa Clara,CA)基質沈積於MALDI目標板上以用於分析。m/z範圍係設定自100000至500000，及目標質量設定至400000。光譜係使用資料探測可視化，然後手動注釋。
實例9：聚合物結合物之熱穩定性
為模擬hu20D12結合物曝露於長效遞送系統中所發現之條件，在37℃下在兩個不同pH及鹽條件下向hu20D12.v2.1.C及hu20D12.v2.3.C TP結合物(如上文製備)之樣品施加壓力數週。具體言之，結合物係於下列調配物中評估：調配物1：~25mg/mL，PBS，調配物2：~25mg/mL，20mM組胺酸HCl、50mM NaCl、在pH 6.5下。
PBS係用作對人類玻璃體之pH及離子強度之模擬物。hu20D12.v2.1 或hu20D12.v2.3結合物(以25mg/mL調配於PBS或20mM His-Ac pH 6.5、50mM NaCl中)之溶液之分液(100μL)係使用0.22μm Costar® Spin-X離心管(Corning)藉由離心過濾加以無菌過濾及然後在37℃下培養0、2、4或8週。培養係藉由在-70℃下冷凍終止。解凍後，樣品係藉由SEC-MALS、CE-SDS分析，及藉由biacore評估因子D-結合能力(下文描述之方法)。針對在37℃下培養該結合物，未測得大於量測中之標準誤差(±10%)之結合能力變化。參見圖10A，其顯示hu20D12.v2.1.C+TP-Oct之熱穩定性(37℃)，其藉由結合能力(SPR)進行分析。交叉陰影區顯示±10%之標準誤差。結合能力在37℃下於PBS中甚至在4週後及在pH 6.5下在4週後仍保持穩定。hu20D12.v2.1.C+TP-Oct結合物之CE-SDS分析在兩種調配物中均顯示良好熱穩定性(37℃)。參見圖10B。觀察到結合物之%峰面積之損失僅為~1%/週。
a.FQ標記程序
根據下列程序標記樣品。hu20D12.2.1-C+TP-Oct(300μg)之溶液係使用NAP-5凝膠過濾管柱(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)交換至0.5mL磷酸鈉反應緩衝劑內以移除潛在競爭調配物成分。將脫鹽結合物之250μL分液與溶解於4% SDS中之30μL之150mM N-乙基順丁烯二醯亞胺混合及在70℃下培養5min以控制變性條件下之二硫化物改組。將十微升之各2.5mM FQ及30mM KCN試劑添加至SDS-hu20D12.2.1-C+TP-Oct溶液中，及最終溶液在50℃下培養10min，接著用1% SDS三倍稀釋以終止反應。就還原分析而言，稀釋樣品之分液用50mM DTT在70℃下培養10min。
b.CE-SDS分析
聚乙二醇化Fab樣品之分離係用包裝於40℃熱控制匣中之具有50μm ID之31.2cm(21cm有效長度)熔融石英毛細管(Polymicro technologies,Phoenix,AZ,USA)進行。完全自動化Beckman PA800+系統(Beckman Coulter,Brea,CA,USA)係配備LIF偵測及使用32 Karat版本9.1以控制儀器。LIF偵測器使用具有在488nM下之激發之3.5mW氬離子雷射；發射係透過600±20nM帶通濾波器(Edmund Optics,Barrington,NJ,USA)收集。電壓係以陰性模式(反極性)施加。樣品溶液係在5kV下電動引入25秒及在17kV下分離。在運行之間，該毛細管係使用0.1M NaOH、0.1M HCl及Beckman凝膠緩衝劑分別清洗5min、1min、1min及10min。參見，例如，Michels等人，2007,Anal.Chem.,79：5963-71；Michels等人，2012,Electrophoresis,33：815-26。hu20D12.2.1-C+TP-Oct之非還原樣品之實例電泳圖示於圖21中。
c.表面電漿子共振分析
將系列S，CM5感測器晶片連接至Biacore® T200儀器(GE Healthcare)內，以1X運行緩衝劑啟動及用70%甘油遵循由製造商供應之方案標準化。該感測器晶片表面係使用具有提供之材料及製造商建議之方案之胺偶合套組針對抗原之胺偶合活化。人類因子D(fD)係藉由注射含有100μg/mL藉由用10mM乙酸鈉pH 5稀釋fD(PUR#20491,2.4mg/mL)製得之抗原之溶液共價固定化。流動速率係10μL/min及使用70μL之注射體積。此針對fD產生跨具有約5000個共振單元(RU)之多個實驗之典型偶合密度。未反應之胺偶合位點係藉由注射70μL 1M乙醇胺阻斷。
抗體Fab之抗原-結合活性濃度係使用Biacore® T200評估軟體之校準依賴性濃度分析程序測定。hu20D12.v2.1.C+TP-Oct之標準曲線係透過 將原液重力稀釋至5μg/mL，接著連續2倍稀釋以產生2.5、1.25、0.625、0.313、0.156及0.078μg/mL之樣品來製備。測試樣品係藉由重力稀釋以獲得約0.5、1.0或1.5μg/mL之蛋白質濃度來製備。所有樣品(200μL體積)係使用1X流動緩衝劑來製備。使用10μL/min之流動速率將60μL分液注射於特異性抗原表面上且將感測器晶片維持在25℃下及用1X流動緩衝劑啟動。結合至特異性抗原之抗體係自接近樣品注射端之SPR信號測定。經結合之抗體係在各結合循環之末端透過注射30μL之10mM Gly-HCl pH 2.1溶離以引起抗體-抗原複合體之解離。hu20D12.2.1-C+TP-Oct之標準曲線係用以使用四參數函數分析資料以測定SPR信號對抗體濃度之關係。計算自標準曲線之參數係用以基於可見SPR信號計算測試樣品之抗原-結合濃度。藉由吸光度量測測定之此濃度相比於蛋白濃度之比率給出分數或百分率結合。
實例10：用於聚合物結合之額外抗因子D抗體變體
如上文討論，在抗因子D Fab之恆定區中包括游離半胱胺酸可改善結合及最少程度地干擾與抗原之結合。除重鏈Fab C端「CDKTHTC」外，Fab片段之重鏈亦可藉由添加來自Fab-C對應體之鉸鏈區之前四個殘基來修飾，以產生C端「CDKTHTCPPC」。亦可使用C端「CDKTHTCPPS」、「CDKTHTSPPC」、「CDKTH」、「CDKT」、「CDK」、「CD」、「APPC」、「SGGC」或「CYGPPC」。在一些實施例中，「CDKTHTCPPC」端容許兩個PEG分子之結合。所得Fab可與多臂PEG結合。
實例11：抗因子D抗體結合物之製法
具有重鏈Fab端「CDKTHTC」「CDKTHTCPPC」、 「CDKTHTSPPC」、「CDKTHTCPPS」、「CDKTH」、「CDKT」、「CDK」、「CD」、「APPC」、「SGGC」或「CYGPPC」之人類化抗因子D Fab變體係與市售具有變化核結構之順丁烯二醯亞胺-官能化多臂PEG結合。
a.順丁烯二醯亞胺-官能化多臂PEG
詳細列於下表15中之順丁烯二醯亞胺-官能化多臂PEG係用於結合反應中：
8臂(TP)-PEG-MAL(JenKem Technology,USA)及Sunbright® HGEO-400MA(NOF America,Corp.)係使用MALDI分析以比較含有TP核或者HGEO核之PEG八聚物之均質性。圖12A及12B中顯示該等結果。 如從彼等圖式中可見，含有TP核之8臂(TP)-PEG-MAL比含有HGEO核之Sunbright® HGEO-400MA更均質。
b.Fab與順丁烯二醯亞胺-官能化多臂PEG之結合
經半胱胺酸修飾之Fab係使用Gamma Plus樹脂捕獲，用6.5mM GSH pH 8.5清洗5份管柱體積以去阻斷C端半胱胺酸及破壞Fab-C二聚物形成，接著溶離至0.1M乙酸pH 2.9內。經半胱胺酸修飾之Fab單體係進一步使用來自GE之SP瓊脂糖高性能強陽離子交換樹脂於25mM乙酸鈉pH 5.0中分離，用0.05% Triton X-100+0.05% Triton X-114沖洗19小時以移除內毒素。溶離係以在0至20% 25mM乙酸鈉pH 5.0+1M NaCl之間之梯度用20份管柱體積進行。具有經去阻斷之c端半胱胺酸之單體Fab-C係然後藉由使用1M HEPES pH 7.2滴定至pH 6.5來製備以供聚乙二醇化。然後，Fab-C係在25mM乙酸鈉pH 6.5、150mM NaCl、4mM EDTA中以約5mg/mL之濃度結合至PEG八聚物。Fab-C係未經進一步濃縮以使因Fab-C二聚化造成之半胱胺酸反應性損失最小化。在平衡至室溫後，將來自JenKem之40K TP PEG粉末重懸浮於25mM乙酸鈉pH 5.0中以達成10mg/mL之濃度。使pH保持低於pH 6以避免順丁烯二醯亞胺開環。PEG一經溶解，則將其以0.1125：1 PEG相比於Fab-C之莫耳比添加至Fab-C池。然後將混合物留在室溫下及輕微搖晃整夜。第二天，結合效率係藉由SEC-MALS檢查。
實例12：結合物之例示性純化及表徵
實例10中製備之結合物係使用SEC-MALS純化及分析以證實聚乙二醇化及測定針對不同PEG核結構之結合效率。結合效率係藉由使用在等度條件下使用磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)pH 7.2、150mM NaCl以0.8 mL/min運行之300 x 8mm Shodex OH pak SB-804 HQ之尺寸排阻層析術(SEC)測定。莫耳質量係使用Wyatt Technology的同軸靜電多角度雷射光散射(MALS)測定。光子相關光譜係使用亦為Wyatt Technology的準彈性光散射(QELS)(一種在99.0°下偵測之單一光子計數模組)以測定流體動力學半徑(RH)。原始資料係使用Wyatt專有的Astra軟體分析，其中莫耳質量及RH常數係使用利妥昔單抗標準物設定。
a.經Cys修飾之Fab-8臂(TP)-PEG-MAL結合物(「Fab TP結合物」)
該等結合物係使用尺寸排阻層析術(SEC)於Sephacryl S-300 HR(GE Healthcare)管柱上在20mM His-乙酸鹽(pH 5.5)、50mM NaCl(等度梯度)中純化。莫耳質量係使用Wyatt Technology的同軸靜電多角度雷射光散射(MALS)及Shodex OHpak SB804(13C)測定。原始資料係使用Wyatt的專有Astra軟體分析，其中莫耳質量常數係使用利妥昔單抗標準物設定。莫耳質量係用以評估結合至各PEG之Fab之平均數量。Fab化係藉由自經MALS量測之質量中減除40g/mol(PEG八聚物之平均質量)，然後除以經半胱胺酸修飾之Fab之平均質量測定。8 Fab’s+40K PEG八聚物之理論莫耳質量係416,056g/mol。表16中顯示例示性資料。
agg=凝集物
經半胱胺酸修飾之Fab與具有TP核之多臂PEG八聚物之結合產生包含 8個Fab/PEG之結合物，此證實可以包含TP核之PEG八聚物可達成良好之結合效率。
b.經Cys修飾之Fab-8臂-PEG-MAL結合物(「Fab HG結合物」)
實例10中製備之經Cys修飾之Fab-8臂-PEG-MAL結合物(含有HG核結構(JenKem)；在下文中稱為「Fab HG結合物」)係於Sephacryl S-300 HR(GE Healthcare)管柱上使用SEC用20mM His-乙酸鹽(pH 5.5)、50mM NaCl(等度梯度)純化。含有該結合物之溶離份係經匯集，及進一步於Sephacryl S-300 HR(GE Healthcare)管柱上使用SEC用20mM His-乙酸鹽(pH 5.5)、50mM NaCl(等度梯度)純化。莫耳質量係使用Tosoh G3000PW管柱及Wyatt Technology的同軸靜電MALS測定。光子相關光譜係使用亦為Wyatt Technology的準彈性光散射(QELS)(一種在99°下偵測之單一光子計數模組)以測定流體動力學半徑(RH)。原始資料係使用Wyatt的專有Astra軟體分析，其中莫耳質量及RH常數係使用利妥昔單抗標準物設定。莫耳質量係用以評估結合至各PEG之Fab之數量。表17中顯示例示性結果。
agg=凝集物
n/d=未測定
如自表17中可見，經Cys修飾之Fab與包含HG核之PEG八聚物之結合產生包含8個Fab/PEG之結合物。與HG核之結合亦產生比用TP核可見更多之包含5至7個Fab/PEG之結合物。
在努力改善Fab化評估及RH量測中，上文製備之HG最終池或者可於10/300 Sephacryl S-400 HR(GE Healthcare)管柱上使用SEC-MALS用PBS(pH 7.4，以0.25mL/min運行)分析。莫耳質量及RH係如上文描述測定。在例示性實驗中，使用8臂-PEG-MAL(HG核)製備且在Sephacryl S-400 HR上純化之結合物具有12.2nM(±4.5%)之平均RH、340.3kDa(±8.9%)之平均莫耳質量及6.4 Fab/PEG之平均值。
c.經Cys修飾之Fab-HGEO-400MA結合物(「Fab-HGEO1結合物」)
實例4中製備之經Cys修飾之Fab-HGEO-400MA結合物(含有Sunbright® HGEO-400MA PEG；下文中亦稱為「Fab HGEO1結合物」)係於Sephacryl S-400 HR(GE Healthcare)管柱上使用SEC用20mM His-乙酸鹽(pH 5.5)、50mM NaCl(等度梯度)純化。莫耳質量及RH係使用Sephacryl S-400 HR(用PBS pH 7.4以0.25mL/min運行)測定。
在例示性實驗中，使用Sunbright® HGEO-400MA PEG(HGEO核)製備之結合物具有15.2nM(±4.5%)之平均RH、423.8kDa(±10.6%)之平均莫耳質量及8.2個Fab/PEG之平均值。
d.經Cys修飾之Fab-8臂(HGEO)-PEG-MAL結合物(「Fab HGEO2結合物」)
如上文製備之經Cys修飾之Fab-8臂(HGEO)-PEG-MAL結合物(含有 HGEO核結構(JenKem)；下文中稱為「Fab HGEO2結合物」)係於Sephacryl S-300 HR(GE Healthcare)管柱上使用SEC用20mM His-乙酸鹽(pH 5.5)、50mM NaCl(等度梯度)純化。莫耳質量係如上文描述測定。莫耳質量係用以評估結合至各PEG之Fab之數量。表18中列舉例示性結果。
如自表18中可見，經Cys修飾之Fab與包含HGEO2核之PEG八聚物之結合產生包含8個Fab/PEG之結合物。與HGEO2核之結合亦產生比用TP核可見更多之包含5至6個Fab/PEG之結合物。
實例13：結合物之富集
一種用於增加玻璃體內調配物中之Fab濃度而不顯著增加調配物黏度之方式係增加調配物中之高度Fab化結合物之百分率。在此實例中，使用陽離子交換層析術以富集高度Fab化結合物。
匯集含有來自上文描述之Fab TP結合物之SEC純化之8個Fab/PEG之經評估之Fab化之溶離份，並使用(例如)GE之SP瓊脂糖高性能強陽離子交換樹脂對其進行陽離子交換層析術，用0.05% Triton X-100+0.05% Triton X-114清洗19小時以移除內毒素，接著用50管柱體積(CV)進行在10至20% 1M NaCl之間之梯度溶離。莫耳質量係如上文描述測定。表19中列舉例示性結果。
匯集含有結合物之溶離份，並在等度條件下，使用磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)(pH 7.4)、150mM NaCl，使用以0.8mL/min運行之300 x 8mm Shodex OH pak SB-804 HQ進一步純化。莫耳質量及RH係如上文描述測定。
富集後，獲得使用8臂(TP)-PEG-MAL(TP核)製備之結合物，其等具有10.5nM(±2.5%)之平均RH、407.1kDa(±0.2%)之平均莫耳質量及7.8個Fab/PEG之平均值。
實例14：食蟹猴之全身性替代補體途徑活性之量測
蘭帕珠單抗先前已顯示暫時抑制食蟹猴之全身性補體功能(參見Loyet等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.,2014，第351卷，第527至537頁)。在當前實例中，在食蟹猴中評估抗因子D抗體變體或AFD.Ab結合物之玻璃體內投與對全身性替代補體途徑(AP)活性之影響。
a.食蟹猴之藥物動力學/藥效學研究
AFD.Ab變體及結合物係藉由向中國起源之雄性食蟹猴(雄性食蟹猴(M.fascicularis))單劑量IVT或靜脈內注射以評估分子之藥物動力學(PK)及藥效學(PD)。此等研究係在Covance Laboratories(Madison,WI)進行。所有程序係遵循美國農業部動物福利法條例(9 CFR 3)、實驗動物之護理及使用指南及實驗動物福利辦公室進行。
進行四個研究。在第一個(對照)研究(研究1，n=10)中，向兩隻眼睛 投與蘭帕珠單抗，以兩個50μL IVT劑量，間隔15分鐘。此等動物接受10mg/眼，總計20mg/動物。在給藥前(第-2天)及給藥後的以下列時間點收集血液：45分鐘及2、6、10、24、34、48、96、120、154、192、288及384小時。在24、48、120、192及384小時收集血液後，每組兩個動物係自該研究移除及經安樂死以收集眼基質。該蘭帕珠單抗對照研究先前已描述於Loyet等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.,2014,351：527-537中。
在研究2(n=3)中，向兩隻眼睛投與AFD.v14，以兩個50μL IVT劑量，間隔15分鐘。此等動物接受25mg/眼，總計50mg/動物。在給藥前(天第-1天及第-3天)及給藥後的以下列時間點收集血液：30分鐘及2、8、24、48及96小時。
在研究3(n=10)中，向兩隻眼睛投與AFD.v14.C+TP八聚物，以兩個50μL IVT劑量，間隔15分鐘，以提供AFD.v14之3.9mg/眼，總計AFD.v14之7.8mg/動物。在給藥前(第-1週及第-2週)及給藥後的以下列時間點收集血液：1、6、24、48、72、96、144、192、288及480小時。每組兩個動物在各時間點(在24、96、192、288及480小時)下自該研究移除及經安樂死以收集眼基質。
在研究4中，向兩隻眼睛投與AFD.v14.C+HG八聚物，以兩個50μL IVT劑量，間隔15分鐘，以提供AFD.v14(n=2)之7.1mg/眼或者AFD.v14(n=1)之11.8mg/眼，總計AFD.v14之14.2mg/動物或23.6mg/動物。在給藥前(第-7天及第-1天)及給藥後的以下列時間點收集血液：1、6、24、96及168小時。
就所有研究而言，給藥前及給藥後血清樣品係經由股靜脈自各動物收集以供PK及PD分析。在各時間點下，將全血收集至血清分離器管中， 容許在周圍溫度下凝結至少20分鐘，然後在冷凍離心機中在介於2℃至8℃之溫度範圍下離心。血清係在離心之20內收集並在-60℃至-80℃下儲存直至分析。
b.總AFD.v14/結合物分析
使用Gyrolab XP分析以定量食蟹猴血清中之AFD.v14、AFD.v14.C+TP八聚物及AFD.v14.C+HG八聚物。將樣品1：4至1：3000稀釋於樣品緩衝劑(磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)、0.5%胎牛血清白蛋白(BSA)、15ppm Proclin(Sigma-Aldrich)、0.05% Tween 20、0.25% CHAPS、50μg/mL muIgG(Equitech Bio,Cat.#SLM66)、5mM EDTA(pH 7.4))中。AFD.v14及AFD.v14 TP及HG結合物標準曲線係藉由將AFD.v14、AFD.v14.C+TP八聚物或AFD.v14.C+HG八聚物自2.06-1500ng/mL連續稀釋於樣品緩衝劑中加以製備。捕獲及偵測試劑係以含於PBS/0.01% Tween 20/0.02% NaN3中之100μg/mL經生物素結合之山羊抗人類IgG(HC+LC,Bethyl,Cat#A80-319B)及以含於Rexxip F(Gyrolab)中之25nM Alexa-抗CDR(純系234，Genentech)施用。該分析係於Gyrolab Bioaffy 200 CD上運行，及清洗步驟使用PBS/0.01% Tween 20/0.02% NaN3，接著使用Gyros pH 11清洗緩衝劑。如製造商以1% PMT設定描述，運行儀器及分析資料。AFD.v14、AFD.v14.C+TP八聚物及AFD.v14.C+HG八聚物之濃度係自其標準曲線之五參數擬合測定。AFD.v14、AFD.v14.C+TP八聚物及AFD.v14.C+HG八聚物於食蟹猴血清中之最小可定量濃度係8.24ng/mL(0.16nM)。
c.針對食蟹猴血清中之因子D之藥效學分析
使用夾心ELISA以定量食蟹猴血清中之因子D(fD)。將小鼠抗人類 因子D純系4676(Genentech)用塗覆緩衝劑(0.05M碳酸鈉，pH 9.6)稀釋至1μg/mL及在4℃下於384孔Maxisorp板(Thermo Scientific,Cat#.464718)上培養整夜。板係用PBS加0.05% Tween 20清洗及在2小時培養期間用PBS加0.5%胎牛血清白蛋白(BSA)阻斷。此及所有後續培養係在室溫下伴隨輕輕攪動進行。食蟹猴fD標準曲線係藉由將fD自0.04至5ng/mL連續稀釋於樣品緩衝劑(經500ng/mL之AFD.v14治療劑及50μg/mL小鼠IgG補充之分析緩衝劑)中加以製備。將該等血清樣品及對照於樣品緩衝劑中稀釋至1：100之最小濃度。然後，將經稀釋之標準物、對照及樣品在該等板上培養2小時，及未結合板之fD/AFD.Ab複合體使用針對AFD.Ab之經生物素結合之小鼠-抗CDR mAb(純系242，1μg/mL)偵測一小時，接著使用高靈敏度SA-HRP(3ng/mL,Pierce Cat.#21130)亦偵測一小時。在最終清洗後，添加四甲基聯苯胺(Moss,Cat.# TMBE-1000)及顯色10至15分鐘，及反應用1M磷酸停止。該等板係以620nM為參考使用微孔板讀數器於450nm下讀取。fD之濃度係自標準曲線之四參數擬合測定。食蟹猴血清中之最小可定量濃度係3.9ng/mL(0.16nM)。
d.AP溶血分析
於溶血分析中評估AFD.v14及AFD.v14.C+TP八聚物抑制AP活性之能力，在該溶血分析中，使血清(人類或者猴)與兔紅細胞組合，如由Pangburn(Methods Enzymol,1988,162：639-653)及Katschke等人(J.Biol.Chem.,2009,284：10473-10479)設計及描述。為確保補體活化在整個經典補體途徑(CP)中不發生，使用C1q耗盡之人類血清(Complement Technologies,Tyler,TX)，及緩衝劑包括EGTA以螯合鈣(用於CP活性所必需之陽離子)。
C1q耗盡之人類血清係用以活化AP。存在於10% C1q耗盡之人類血清中之fD之濃度係9.6nM於孔中，該值與先前報告之血清中之fD水平(Barnum等人，J.Immunol.Methods,1984,67：303-309；Loyet等人，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,2012,53：6628-6637)一致。
e.經AFD.v14.C+HG八聚物治療之食蟹猴血清中之全身性AP活性之抑制之測定
為評估以AFD.v14.C+HG八聚物或AFD.v14.C+TP八聚物給藥後之全身性AP活性之任何潛在抑制之時間過程及劑量依賴性，進行基於板之WIESLAB補體系統AP ELISA或者活體外分析。
為評估以AFD.v14.C+HG八聚物或AFD.v14.C+TP八聚物給藥後之全身性AP活性之任何潛在抑制之時間過程及劑量依賴性，進行基於板之WIESLAB補體系統AP ELISA(來自此分析之資料在圖13及14中稱為「% AP補體活性」)或者類似於上文描述之活體外AP溶血分析之活體外分析(來自此分析之資料在圖14中稱為「%相對溶血」)。然而，在此分析中，取代向血清樣品添加外源性AFD.v14.C+HG八聚物或AFD.v14.C+TP八聚物之稀釋曲線，該等樣品本身係經連續稀釋，及溶血活性之任何抑制歸因於AFD.v14.C+HG八聚物或AFD.v14.C+TP八聚物之注射劑量。
如本文描述，針對具有下列修改之AP溶血分析製備紅細胞及進行分析。為測定對應於最大細胞溶解之吸光度，總細胞溶解對照係以無菌水(80μl/孔)製備，而GVB係添加至所有其他孔(50μl)中。將食蟹猴血清樣品連續1：1.5稀釋超過六個點及連同陰性對照(僅緩衝劑)添加至96孔U底聚丙烯板(30μl/孔)。總細胞溶解對照表示最大(100%)溶血。一式三份收集 資料點，及平均百分率最大溶血係針對分析中之最終血清稀釋之倒數繪製。定義為50%最大溶血之50%最大溶血(AH50)值係藉由非線性回歸分析使用四參數擬合模型測定。就彼等未達成飽和之曲線而言，AH50係使用其中上漸近線係固定於100%之曲線擬合估算。百分率相對溶血係針對個別時間點計算為[(針對個別時間點之給藥後AH50)/(給藥前AH50)]×100。針對來自各個別正常食蟹猴之血清之AH50值可自AH50值之整體平均值變化多達2倍。因此，來自各研究動物之給藥前及給藥後樣品係於相同分析板上運行以確保AP活性之給藥後變化係直接與個別動物之基線補體活性相比較。
相較於總fD及治療活性之百分率相對溶血示於圖13A(蘭帕珠單抗，10mg/眼)、13B(AFD.v14，25mg/眼)及14A(AFD.v14.C+TP八聚物，3.9mg/眼)中。蘭帕珠單抗資料(圖33A)係在IVT投與10mg/眼之蘭帕珠單抗後獲得之比較資料，如描述於Loyet等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.,2014,351：527-537)中。如自圖13B中可見，25mg/眼之AFD.v14之投與暫時抑制全身性AP活性，及投與24小時後活性恢復至基線，類似於先前針對蘭帕珠單抗(圖13A)觀察之結果。對比之下，在投與3.9mg/眼之AFD.v14.C+TP八聚物(圖14A)後未觀察到全身性AP抑制。不希望受任何特定理論之限制，據信使用該結合物相較於Fab(例如，蘭帕珠單抗及AFD.v14)獲得之來自眼部之較慢廓清率容許fD在較早時間點飽含AFD.Ab，防止全身性補體抑制。
相較於fD及總結合物之百分率相對AP補體活性示於圖14B(AFD.v14.C+HG八聚物，7.1mg/眼)及14C(AFD.v14.C+HG八聚物，11.8mg/眼)中。如自此等圖式中可見，針對用於IVT劑量之AFD.v14.C+ HG八聚物可見之可忽略之全身性補體抑制係多達11.8mg/眼。因為來自眼部之較慢廓清率，所以結合物濃度保持低於fD之莫耳濃度，特定言之在早於10小時之時間點。此係與AFD.Ab Fab之類似眼部劑量濃度對比，其中在此等早期時間點，莫耳濃度超過莫耳fD濃度及導致全身性AP抑制。
預期20D12.v2.1、20D12.v2.1.C、20D12.v2.3及20D12.v2.3.C之PEG八聚物藉由相較於20D12.v2.1、20D12.v2.1.C、20D12.v2.3及20D12.v2.3.C之未結合版本顯示減小之全身性補體抑制水平而具有與AFD.v14.C+TP-Oct及AFD.v14.C+HG-Oct結合物類似的表現。
實例15：AFD.Ab變體及結合物之食蟹猴PK
一種評估AFD.Ab變體或結合物之活體內PK曲線之方式係於食蟹猴中進行之單一劑量實驗。用於AFD.v14+TP-Oct結合物之活體內PK研究係於食蟹猴中進行。PK參數係測定自單一劑量實驗。未經結合、未經修飾之AFD.v14(SIESD.N103S)係用作對照。對動物之護理係根據基因技術機構動物護理及使用委員會指南。
a.研究參數
將食蟹猴(28隻雄性動物，在給藥時係2kg至4kg及約2至7歲)分配至四個給藥組中之一者。組1(對照)動物(4隻動物)透過30號針規的針(100μl劑量體積)接受雙側玻璃體內劑量為5mg/眼(10mg/動物)之AFD.v14。組2及組3動物(每組10隻動物)透過30號針規的針(100μl劑量體積)分別接受雙側玻璃體內劑量為基於Fab重量之1或4mg/眼(2或8mg/動物)之AFD.v14.C+TP-Oct結合物。給動物服用鎮靜劑(10mg/kg克他命HCl，0.5mg/kg地西泮)及在注射前用局部丙美卡因治療。然後，該AFD.v14或AFD.v14.C+TP-Oct結合物係透過鞏膜及睫狀體扁平部(角膜緣後部4 mm)投與，其中針直接向後穿過晶狀體進入玻璃體中間。組4動物(4隻動物)以0.4mg/動物接受單一IV推注(1mL)之AFD.v14.C+TP-Oct結合物。就IV投與而言，將AFD.v14.C+TP-Oct結合物調配為10mM琥珀酸鈉、10%岩藻糖及0.05% Tween-20(pH 5.0)。
眼組織係收集自所有組。在給藥後的以下時間，針對組1，每組一隻動物(2個眼睛)係經安樂死及針對組2及組3，每組兩隻動物(4個眼睛)係經安樂死：組1-天數1(24小時)、2、4及8；組2及3-天數1(24小時)、4、8、12及20。安樂死後，兩隻眼睛均被摘除，及在玻璃體及眼房液及視網膜組織中測定AFD.v14及AFD.v14.C+TP-Oct結合物濃度。在快速冷凍眼睛後，過濾紙係稍後用以收集整個視網膜層。
所有血液樣品(約1mL)係經由股靜脈或頭部靜脈收集。在IVT或IV給藥後，在下列時間點抽取樣品：組1-1小時、6小時及天數1(24小時)、2、3、4、5及7；組2及3-1小時、6小時及天數1(24小時)、2、4、6、8、12及20；組4-1小時、6小時及天數1(24小時)、2、4、7、11、14、17、21、24及28。在血液收集之一小時內，使樣品在室溫下凝結，及血清係藉由離心分離及在-60℃至-80℃下儲存。研究方案之細節係闡述於表20中。
b.AFD.v14及AFD.v14.C+TP-Oct結合物之藥物動力學分析
使用Gyrolab XP分析以定量食蟹猴血清、玻璃體液、眼房液及視網膜勻漿中之AFD.v14及AFD.v14.C+TP-Oct結合物。將樣品1：4-1：3000稀釋於樣品緩衝劑(磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)、0.5%胎牛血清白蛋白(BSA)、15ppm Proclin(Sigma-Aldrich)、0.05% Tween 20、0.25% CHAPS、50μg/mL muIgG(Equitech Bio,Cat.#SLM66)、5mM EDTA(pH 7.4))中。AFD.v14及AFD.v14.C+TP-Oct結合物標準曲線係藉由將AFD.v14或AFD.v14.C+TP-Oct結合物自2.06至1500ng/mL連續稀釋於樣品緩衝劑中加以製備。捕獲及偵測試劑係以含於PBS/0.01% Tween 20/0.02% NaN3中之100μg/mL經生物素結合之山羊抗人類IgG(HC+LC,Bethyl,Cat#A80-319B)及以含於Rexxip F(Gyrolab)中之25nM Alexa-抗CDR(純系234,Genentech)施加。分析係於Gyrolab Bioaffy 200 CD上運行，及清洗步驟使用PBS/0.01% Tween 20/0.02% NaN3，接著使用Gyros pH 11清洗緩衝劑。如由製造商以1% PMT設定描述，運行儀器及分析資料。AFD.v14及AFD.v14.C+TP-Oct結合物之濃度係自其標準曲線之五參數擬合測定。AFD.v14及AFD.v14.C+TP-Oct結合物在食蟹猴血清、玻璃體液、眼房液及視網膜勻漿中之最小可定量濃度係8.24ng/mL(0.16nM)。
玻璃體液、眼房液及視網膜PK結果係闡述於下表21至23中，及圖17A(玻璃體)、17B(玻璃體，標準化)、18A(眼房液)、18B(眼房液，標準化)、19A(視網膜)及19B(視網膜，標準化)。
如自表21及圖17A至B中可見，經結合之AFD.v14組(組2及3)兩者之玻璃體終末半衰期均長於未結合AFD.v14對照(組1)之玻璃體終末半衰期，及長於未結合蘭帕珠單抗及蘭尼單抗Fab之平均半衰期(約2.34天)。經結合之AFD.v14組2及3之平均AUC/mg-劑量(約2040)係高於未結合蘭帕珠單抗Fab之平均AUC/mg-劑量(約1733)。基於玻璃體終末半衰期，4.0mg/眼劑量比1.0mg/眼劑量廓清更慢。如自表22及23及圖18及19可見，如相較於未結合Fab，針對組2及組3(經結合之AFD.v14)，較長之終末半衰期亦可見於眼房液及視網膜中。
組2及組3之血清PK結果係闡述於圖15A及15B(標準化)中，針對組4之血清PK結果係闡述於圖15C中。組2及組3(AFD.v14.C+TP-Oct結合物)之血清PK曲線係彼此平行，及在劑量標準化後重疊。參見圖15A及15B。組2及組3之血清AUC係劑量成比例，直至最後經量測之時間點。
組4(AFD.v14.C+TP-Oct結合物；IV劑量)之終末半衰期係7.5天， 及廓清率係15.8mL/天(5.64mL/kg/天(組4猴子之平均重量係2.8kg))。在量測天數21、24及28時，就4隻組4猴子中之三隻而言，血清濃度下降至偵測之臨限值以下。
c.食蟹猴血清中之因子D之藥效學分析
使用夾心ELISA以定量食蟹猴血清、玻璃體液、眼房液及視網膜勻漿中之因子D(fD)。將小鼠抗人類因子D純系4676(Genentech)用塗覆緩衝劑(0.05M碳酸鈉，pH 9.6)稀釋至1μg/mL並在4℃下於384孔Maxisorp板(Thermo Scientific,Cat#.464718)上培養整夜。板係用PBS加0.05% Tween 20清洗及在2小時培養期間用PBS加0.5%胎牛血清白蛋白(BSA)阻斷。此及所有後續培養係在室溫下伴隨輕輕攪動進行。食蟹猴fD標準曲線係藉由將fD自0.04至5ng/mL連續稀釋於樣品緩衝劑(以AFD.v14治療劑之500ng/mL及50μg/mL小鼠IgG補充之分析緩衝劑)中加以製備。將血清樣品及對照用樣品緩衝劑稀釋至最小1：100。將玻璃體液、眼房液及視網膜勻漿樣品及對照用樣品緩衝劑稀釋至最小1：10。然後，將稀釋標準物、對照及樣品在板上培養2小時，及經板結合之fD/AFD.Ab複合體係使用針對AFD.Ab之經生物素結合之小鼠-抗CDR mAb(純系242,1μg/mL)偵測一小時及藉由高靈敏度SA-HRP(3ng/mL,Pierce Cat.#21130)亦偵測一小時。最終清洗後，添加四甲基聯苯胺(Moss,Cat.# TMBE-1000)及顯色10至15分鐘，及反應係用1M磷酸停止。該等板係以620nM為參考使用微孔板讀數器於450nM下讀取。fD之濃度係自標準曲線之四參數擬合測定。食蟹猴血清中之最小可定量濃度係3.9ng/mL(0.16nM)。食蟹猴玻璃體液、眼房液及視網膜勻漿中之最小可定量濃度係0.39ng/ml(0.016nM)。
組2、3及4之平均血清fD及AFD.v14.C+TP-Oct結合物濃度係闡述 於圖16中。圖16A顯示血清fD濃度在經測試之所有時間點下均高於AFD.Ab濃度。此等結果指示全身性AP補體活性係維持於所有組中。
組2及組3之平均眼fD及AFD.v14.C+TP-Oct結合物濃度係闡述於圖16B中，圖16B顯示玻璃體液、眼房液及視網膜勻漿中之AFD.Ab濃度在經測試之所有時間點下均超過fD濃度。
基於此實例中針對IVT投與AFD.v14.C+TP-Oct結合物後之PK參數所闡述之資料，AFD.v14之結合導致該等結合物於眼部之玻璃體液及眼房液中之持續水平。然而，雖然玻璃體液、眼房液及視網膜勻漿中之AFD.Ab濃度在經測試之所有時間點下均超過fD濃度，但是就以IVT給藥之血清樣品而言，針對任何時間點均不可見此結果。可使用與彼等此實例中描述之方法類似之方法以評估20D12.v2.1、20D12.v2.1.C、20D12.v2.3及20D12.v2.3.C之PEG八聚物。預期當IVT給藥時，經結合之20D12.v2.1、20D12.v2.1.C、20D12.v2.3及20D12.v2.3.C應具有與經結合之AFD.v14.C+TP-Oct類似之表現。
實例16：hu20D12.v2.1.C+TP-Oct及hu20D12.v2.1.C之食蟹猴PK
為評估hu20D12.v2.1.C+TP-Oct及hu20D12.v2.1.C之活體內藥物動力學(PK)曲線，使用經放射性碘化之hu20D12.v2.1.C+TP-Oct(125I-hu20D12.v2.1.C+TP-Oct)及hu20D12.v2.1.C(125I-20D12.v2.1.C)於食蟹猴中進行活體內PK研究。在經收集之各組織中將放射性信號轉化為μg-當量/mL或公克濃度後，PK參數係測定自單一劑量實驗。動物之護理係根據基因技術機構動物護理及使用委員會指南。
a.研究參數
將食蟹猴(43隻雌性動物，在給藥時係2kg至4kg及約3至4歲)分配至 五個給藥組中之一者。組1、2及3動物(n=10/group)透過27號針規的針(100μl劑量體積)分別接受雙側玻璃體內劑量為1mg/眼(2mg/動物)、7.5mg/眼(15mg/動物)或15mg/眼(30mg/動物)之125I-hu20D12.v2.1.C+TP-Oct。組4動物(n=10)透過27號針規的針(100μl劑量體積)接受雙側玻璃體內劑量為15mg/眼(30mg/動物)之未結合125I-hu20D12.v2.1.C。給動物服用鎮靜劑(5至15mg/kg克他命HCl及異氟烷以吸入作用)及在注射前經局部0.5%丙美卡因HCl、2.5%苯腎上腺素HCl及1%托吡卡胺處理。然後，透過鞏膜投與125I-hu20D12.v2.1.C+TP-Oct或未結合125I-hu20D12.v2.1.C，用針直接穿過眼球之後軸並進入玻璃體中間。
眼組織係收集自所有組。每組兩隻動物(4個眼睛)在給藥後之下列時間下經安樂死：天數1(給藥後4小時)、3、8、13及29。安樂死後，兩個眼睛均被摘除，及在玻璃體液、眼房液及視網膜中測定125I-hu20D12.v2.1.C+TP-Oct及未結合125I-hu20D12.v2.1放射活性水平。研究方案之細節係闡述於表24中。
b.125I-hu20D12.v2.1.C+TP-Oct及未結合125I-hu20D12.v2.1.C之藥物動力學反射性分析
使用放射性偵測分析以偵測食蟹猴玻璃體液、眼房液及視網膜勻漿中之放射活性之數量。玻璃體係使用陶瓷珠均勻化及然後將0.025至0.05 g之一式三份稱重分液自勻漿移除以供γ計數。眼房液按原樣針對放射性活性計數。均質化視網膜及然後計數其整體之放射活性。所有基質中之放射活性係使用Wallac Wizard 1470γ計數器進行偵測。放射活性偵測後，125I-hu20D12.v2.1.C+TP-Oct及未結合125I-hu20D12.v2.1.C之濃度係藉由針對各臂使用劑量溶液之特異性活性(以μCi/mL之單位)將每mL組織之反射性活性轉化為每mL組織之μg-當量進行計算。在該轉化期間施用1g等於1mL之假定。
玻璃體液、眼房液及視網膜PK結果係闡述於下表25至27及圖22(玻璃體)、23(眼房液)及24(視網膜)中。
如自表25及圖22中可見，hu20D12.v2.1.C+TP-Oct組(組1、2及3)之 玻璃體終末半衰期係統計學顯著長於未結合hu20D12.v2.1.C對照(組4)之玻璃體終末半衰期，及長於未結合蘭帕珠單抗及蘭尼單抗Fab之平均半衰期(約2.34天)。hu20D12.v2.1.C+TP-Oct組之平均AUC/mg-劑量係高於未結合hu20D12.v2.1.C對照(約2067天*μg/mL/mg劑量)及未結合蘭帕珠單抗Fab之平均AUC/mg-劑量(約1733天)。如自表26及27及圖23及24中可見，亦觀察到於眼房液及視網膜中，hu20D12.v2.1.C+TP-Oct組相較於未結合hu20D12.v2.1.C具有更長終末半衰期。
儘管已藉助於圖解及實例出於清晰瞭解之目的在一些細節中描述前述本發明，但描述及實例不應以任何方式視為對本發明之範圍之限制。所有專利案及科學參考文獻之揭示內容以全文引用之方式明確併入本文中。
序列表
<110> 美商建南德克公司
<120> 抗因子D抗體及結合物
<130> 01146-0054-00PCT
<150> US 62/249,166
<151> 2015-10-30
<150> US 62/250,995
<151> 2015-11-04
<160> 183
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 家鼷鼠
<400> 1
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 家鼷鼠
<400> 2
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 家鼷鼠
<400> 3
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 家鼷鼠
<400> 4
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 家鼷鼠
<400> 5
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 家鼷鼠
<400> 6
<210> 7
<21,1> 107
<212> PRT
<213> 家鼷鼠
<400> 7
<210> 8
<211> 115
<212> PRT
<213> 家鼷鼠
<400> 8
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 以下抗體之HVR-L1：hu20D12.v1；hu20D12.v1.1；hu20D12.v2.0； hu20D12.v2.1；hu20D12.v2.2；hu20D12.v2.3；hu20D12.v2.4； hu20D12.v2.5；hu20D12.v2.6；hu20D12.v2.7；hu20D12.v2.8； hu20D12.v2.9；hu20D12.v2.10；hu20D12.v2.11；hu20D12.v2.12
<400> 9
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 以下抗體之HVR-L2：hu20D12.v1；hu20D12.v1.1；hu20D12.v2.0； hu20D12.v2.1；hu20D12.v2.2；hu20D12.v2.3；hu20D12.v2.4； hu20D12.v2.5；hu20D12.v2.6；hu20D12.v2.7；hu20D12.v2.8； hu20D12.v2.9；hu20D12.v2.12hu20D12.v2.13；hu20D12.v2.14
<400> 10
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.10 HVR-L2
<400> 11
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.11 HVR.L2
<400> 12
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 以下抗體之HVR-L3：hu20D12.v1；hu20D12.v1.1；hu20D12.v2.0； hu20D12.v2.1；hu20D12.v2.2；hu20D12.v2.3；hu20D12.v2.4； hu20D12.v2.5；hu20D12.v2.6；hu20D12.v2.7；hu20D12.v2.8； hu20D12.v2.9；hu20D12.v2.10；hu20D12.v2.11；hu20D12.v2.12
<400> 13
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.13 HVR-L3
<400> 14
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 以下抗體之HVR-H1：hu20D12.v1；hu20D12.v1.1；hu20D12.v2.0； hu20D12.v2.1；hu20D12.v2.2；hu20D12.v2.3；hu20D12.v2.4； hu20D12.v2.5；hu20D12.v2.6；hu20D12.v2.7；hu20D12.v2.8； hu20D12.v2.9；hu20D12.v2.10；hu20D12.v2.11；hu20D12.v2.12
<400> 15
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 以下抗體之HVR-H2：hu20D12.v2.0；hu20D12.v2.1；hu20D12.v2.6； hu20D12.v2.7；hu20D12.v2.8；hu20D12.v2.10；hu20D12.v2.11； hu20D12.v2.13
<400> 16
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v1 HVR-H2
<400> 17
<210> 18
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v1.1 HVR-H2
<400> 18
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.2 HVR-H2
<400> 19
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.3 HVR-H2
<400> 20
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.4 HVR-H2；hu20D12.v2.14 HVR-H2
<400> 21
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.5 HVR-H2；hu20D12.v2.12 HVR-H2
<400> 22
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.9 HVR-H2
<400> 23
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.15 HVR-H2
<400> 24
<210> 25
<211> 6
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 以下抗體之HVR-H3：hu20D12.v1；hu20D12.v1.1；hu20D12.v2.0； hu20D12.v2.1；hu20D12.v2.2；hu20D12.v2.3；hu20D12.v2.4； hu20D12.v2.5；hu20D12.v2.6；hu20D12.v2.7；hu20D12.v2.8； hu20D12.v2.9；hu20D12.v2.10；hu20D12.v2.11；hu20D12.v2.12
<400> 25
<210> 26
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 26
<210> 27
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 27
<210> 28
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v1 VL
<400> 28
<210> 29
<211> 115
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v1 VH
<400> 29
<210> 30
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v1.1 VL
<400> 30
<210> 31
<211> 115
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v1.1 VH
<400> 31
<210> 32
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.0 VL
<400> 32
<210> 33
<211> 115
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.0 VH
<400> 33
<210> 34
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.1 VL
<400> 34
<210> 35
<211> 115
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.1 VH
<400> 35
<210> 36
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.2 VL
<400> 36
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<211> 115
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.2 VH
<400> 37
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.3 VL
<400> 38
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<211> 115
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.3 VH
<400> 39
<210> 40
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<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.4 VL
<400> 40
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<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.4 VH
<400> 41
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<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.5 VL
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<211> 115
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.5 VH
<400> 43
<210> 44
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.6 VL
<400> 44
<210> 45
<211> 115
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.6 VH
<400> 45
<210> 46
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.7 VL
<400> 46
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<211> 115
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.7 VH
<400> 47
<210> 48
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.8 VL
<400> 48
<210> 49
<211> 115
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.8 VH
<400> 49
<210> 50
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.9 VL
<400> 50
<210> 51
<211> 115
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.9 VH
<400> 51
<210> 52
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.10 VL
<400> 52
<210> 53
<211> 115
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.10 VH
<400> 53
<210> 54
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.11 VL
<400> 54
<210> 55
<211> 115
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.11 VH
<400> 55
<210> 56
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.12 VL
<400> 56
<210> 57
<211> 115
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.12 VH
<400> 57
<210> 58
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.13 VL
<400> 58
<210> 59
<211> 115
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.13 VH
<400> 59
<210> 60
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.14 VL
<400> 60
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<211> 115
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.14 VH
<400> 61
<210> 62
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.15 VL
<400> 62
<210> 63
<211> 115
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.15 VH
<400> 63
<210> 64
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v1輕鏈(LC)
<400> 64
<210> 65
<211> 223
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v1重鏈Fab(HC Fab)
<400> 65
<210> 66
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v1.1 LC
<400> 66
<210> 67
<211> 223
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v1.1 HC Fab
<400> 67
<210> 68
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.0 LC
<400> 68
<210> 69
<211> 223
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.0 HC Fab
<400> 69
<210> 70
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.1 LC
<400> 70
<210> 71
<211> 223
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.1 HC Fab("CDKTHT")
<400> 71
<210> 72
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.2 LC
<400> 72
<210> 73
<211> 223
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.2 HC Fab
<400> 73
<210> 74
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.3 LC
<400> 74
<210> 75
<211> 223
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.3 HC Fab("CDKTHT")
<400> 75
<210> 76
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.4 LC
<400> 76
<210> 77
<211> 223
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.4 HC Fab
<400> 77
<210> 78
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.5 LC
<400> 78
<210> 79
<211> 223
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.5 HC Fab
<400> 79
<210> 80
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.6 LC
<400> 80
<210> 81
<211> 223
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.6 HC Fab
<400> 81
<210> 82
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.7 LC
<400> 82
<210> 83
<211> 223
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.7 HC Fab
<400> 83
<210> 84
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.8 LC
<400> 84
<210> 85
<211> 223
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.8 HC Fab
<400> 85
<210> 86
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.9 LC
<400> 86
<210> 87
<211> 223
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.9 HC Fab
<400> 87
<210> 88
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.10 LC
<400> 88
<210> 89
<211> 223
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.10 HC Fab
<400> 89
<210> 90
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.11 LC
<400> 90
<210> 91
<211> 223
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.11 HC Fab
<400> 91
<210> 92
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.12 LC
<400> 92
<210> 93
<211> 223
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.12 HC Fab
<400> 93
<210> 94
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.13 LC
<400> 94
<210> 95
<211> 223
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.13 HC Fab
<400> 95
<210> 96
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.14 LC
<400> 96
<210> 97
<211> 223
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.14 HC Fab
<400> 97
<210> 98
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.15 LC
<400> 98
<210> 99
<211> 223
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.15 HC Fab
<400> 99
<210> 100
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 蘭帕珠單抗VL
<400> 100
<210> 101
<211> 115
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 蘭帕珠單抗VH
<400> 101
<210> 102
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 蘭帕珠單抗LC
<400> 102
<210> 103
<211> 223
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 蘭帕珠單抗HC Fab
<400> 103
<210> 104
<211> 253
<212> PRT
<213> 智人
<400> 104
<210> 105
<211> 234
<212> PRT
<213> 智人
<400> 105
<210> 106
<211> 227
<212> PRT
<213> 智人
<400> 106
<210> 107
<211> 253
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 107
<210> 108
<211> 7
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12共同HVR-L2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X係選自Y、K及R
<400> 108
<210> 109
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12共同延伸HVR-L2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X係選自Y、K及R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X係選自Y、R、S、K及Q
<400> 109
<210> 110
<211> 9
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12共同HVR-L3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X係選自N及E
<400> 110
<210> 111
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12共同HVR-H2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X係選自E及W
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X係選自T及Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X係選自N、S及Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X係選自G、D及E
<400> 111
<210> 112
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab輕鏈恆定區
<400> 112
<210> 113
<211> 108
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab重鏈恆定區(「CDKTHT」)
<400> 113
<210> 114
<211> 214
<212> PRT
<.213> 人造序列
<220>
<223> AFD.v8 LC
<400> 114
<210> 115
<211> 223
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> AFD.v8 HC Fab
<400> 115
<210> 116
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> AFD.v14 LC
<400> 116
<210> 117
<211> 223
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> AFD.v14 HC Fab
<400> 117
<210> 118
<211> 223
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.1 HC Fab("CDKTHL")
<400> 118
<210> 119
<211> 224
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.1 HC Fab("CDKTHTC")
<400> 119
<210> 120
<211> 227
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.1 HC Fab("CDKTHTCPPC")
<400> 120
<210> 121
<211> 227
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.1 HC Fab("CDKTHTSPPC")
<400> 121
<210> 122
<211> 227
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.1 HC Fab("CDKTHTCPPS")
<400> 122
<210> 123
<211> 223
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.3 HC Fab("CDKTHL")
<400> 123
<210> 124
<211> 224
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.3 HC Fab("CDKTHTC")
<400> 124
<210> 125
<211> 227
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.3 HC Fab("CDKTHTCPPC")
<400> 125
<210> 126
<211> 227
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.3 HC Fab("CDKTHTSPPC")
<400> 126
<210> 127
<211> 227
<21.2> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.3 HC Fab("CDKTHTCPPS")
<400> 127
<210> 128
<211> 108
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab重鏈恆定區(「CDKTHL」)
<400> 128
<210> 129
<211> 109
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab重鏈恆定區(「CDKTHTC」)；實例中之「Fab-C」 係指此序列
<400> 129
<210> 130
<211> 112
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab重鏈恆定區(「CDKTHTCPPS」)
<400> 130
<210> 131
<211> 112
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab重鏈恆定區(「CDKTHTCPPS」)
<400> 131
<210> 132
<211> 112
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab重鏈恆定區(「CDKTHTSPPC」)
<400> 132
<210> 133
<211> 224
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> AFD.v14 HC Fab("CDKTHTC")
<400> 133
<210> 134
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab重鏈恆定區(「CDKTH」)
<400> 134
<210> 135
<211> 106
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<2.23> Fab重鏈恆定區(「CDKT」)
<400> 135
<210> 136
<211> 105
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab重鏈恆定區(「CDK」)
<400> 136
<210> 137
<211> 104
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab重鏈恆定區(「CD」)
<400> 137
<210> 138
<211> 101
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab重鏈恆定區(IgG2)
<400> 138
<210> 139
<211> 105
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab重鏈恆定區(IgG4)(「KYGPP」)
<400> 139
<210> 140
<211> 222
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.1 HC Fab("CDKTH")
<400> 140
<210> 141
<211> 221
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.1 HC Fab("CDKT")
<400> 141
<210> 142
<211> 220
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.1 HC Fab("CDK")
<400> 142
<210> 143
<211> 219
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.1 HC Fab("CD")
<400> 143
<210> 144
<211> 221
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.1 HC Fab("APPC")
<400> 144
<210> 145
<211> 221
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.1 HC Fab("SGGC")
<400> 145
<210> 146
<211> 223
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.1 HC Fab("CYGPPC")
<400> 146
<210> 147
<211> 222
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.3 HC Fab("CDKTH")
<400> 147
<210> 148
<211> 221
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.3 HC Fab("CDKT")
<400> 148
<210> 149
<211> 220
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.3 HC Fab("CDK")
<400> 149
<210> 150
<211> 219
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.3 HC Fab("CD")
<400> 150
<210> 151
<211> 221
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.3 HC Fab("APPC")
<400> 151
<210> 152
<211> 221
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.3 HC Fab("SGGC")
<400> 152
<210> 153
<211> 223
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> hu20D12.v2.3 HC Fab("CYGPPC")
<400> 153
<210> 154
<211> 112
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab重鏈恆定區(「CDKTHTAPPC」)
<400> 154
<210> 155
<211> 112
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab重鏈恆定區(「CDKTHTSGGC」)
<400> 155
<210> 156
<211> 108
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab重鏈恆定區(「CYGPPC」)
<400> 156
<210> 157
<211> 102
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab重鏈恆定區(IgG2 Fab-C)(「VERKC」)
<400> 157
<210> 158
<211> 106
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab重鏈恆定區(IgG4 Fab-C)(「KYGPPC」)
<400> 158
<210> 159
<211> 103
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab重鏈恆定區(IgG4)(「KYG」)
<400> 159
<210> 160
<211> 102
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab重鏈恆定區(IgG4)(「KY」)
<400> 160
<210> 161
<211> 101
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab重鏈恆定區(IgG4)(「K」)
<400> 161
<210> 162
<211> 4
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> CPPC
<400> 162
<210> 163
<211> 104
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab重鏈恆定區(IgG4)(「KYGP」)
<400> 163
<210> 164
<211> 108
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab重鏈恆定區(「CDKTHX」)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (108)..(108)
<223> X係選自除T外之任何胺基酸
<400> 164
<210> 165
<211> 6
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab片段之重鏈之C端
<400> 165
<210> 166
<211> 6
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab片段之重鏈之C端
<400> 166
<210> 167
<211> 5
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab片段之重鏈之C端
<400> 167
<210> 168
<211> 4
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab片段之重鏈之C端
<400> 168
<210> 169
<211> 6
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab片段之重鏈之C端
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X係除T外之任何胺基酸
<400> 169
<210> 170
<211> 7
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab片段之重鏈之C端
<400> 170
<210> 171
<211> 10
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab片段之重鏈之C端
<400> 171
<210> 172
<211> 10
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab片段之重鏈之C端
<400> 172
<210> 173
<211> 10
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab片段之重鏈之C端
<400> 173
<210> 174
<211> 10
<212> PRT
<.213> 人造序列
<220>
<223> Fab片段之重鏈之C端
<400> 174
<210> 175
<211> 10
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab片段之重鏈之C端
<400> 175
<210> 176
<211> 6
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab片段之重鏈之C端
<400> 176
<210> 177
<211> 4
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab片段之重鏈之C端
<400> 177
<210> 178
<211> 4
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab片段之重鏈之C端
<400> 178
<210> 179
<211> 4
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab片段之重鏈之C端
<400> 179
<210> 180
<211> 5
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab片段之重鏈之C端
<400> 180
<210> 181
<211> 5
<212> PRT
<.213> 人造序列
<220>
<223> Fab片段之重鏈之C端
<400> 181
<210> 182
<211> 4
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab片段之重鏈之C端
<400> 182
<210> 183
<211> 6
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> Fab片段之重鏈之C端
<400> 183

Claims (110)

  1. 一種結合至因子D之分離抗體，其中該抗體包含(a)包含胺基酸序列SYYMY(SEQ ID NO：15)之HVR-H1；(b)包含胺基酸序列X4INPX5X6GX7TNFNEKFKS(SEQ ID NO：111)之HVR-H2，其中X4係選自E及W；X5係選自T及Y；X6係選自N、S及Q；及X7係選自G、D及E；(c)包含胺基酸序列EGGFAY(SEQ ID NO：25)之HVR-H3；(d)包含胺基酸序列KASQNVDTDVA(SEQ ID NO：9)之HVR-L1；(e)包含胺基酸序列SASSRX1S(SEQ ID NO：108)之HVR-L2，其中X1係選自Y、K及R；及(f)包含胺基酸序列QQYX3NYPLT(SEQ ID NO：110)之HVR-L3，其中X3係選自N及E。
  2. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含序列X2SASSRX1S(SEQ ID NO：109)，其中X1係選自Y、K及R；X2係選自Y、R、S、K及Q。
  3. 如請求項2之抗體，其中X2係R。
  4. 如前述請求項中任一項之抗體，其中X1係Y。
  5. 如前述請求項中任一項之抗體，其中該抗體包含以下：包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；包含選自SEQ ID NO：16至24之胺基酸序列之HVR-H2；包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3；包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；包含選自SEQ ID NO：10至12之 胺基酸序列之HVR-L2；及包含SEQ ID NO：13或14之胺基酸序列之HVR-L3。
  6. 如前述請求項中任一項之抗體，其中該抗體包含：a)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H2；包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3；包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2；包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3；b)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之HVR-H2；包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3；包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2；包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3；c)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-H2；包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3；包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2；包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3；d)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2；包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3；包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2；包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR- L3；e)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之HVR-H2；包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3；包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2；包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3；f)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列之HVR-H2；包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3；包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2；包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3；g)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2；包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3；包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2；包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3；h)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H2；包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3；包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2；包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3；i)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H2；包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR- H3；包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列之HVR-L2；包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3；j)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H2；包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3；包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-L2；包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3；k)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H2；包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3；包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2；包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-L3；或1)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1；包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-H2；包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-H3；包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1；包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2；包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L3。
  7. 如前述請求項中任一項之抗體，其中輕鏈位置49之胺基酸係精胺酸(R)。
  8. 如前述請求項中任一項之抗體，其中該抗體包含一重鏈可變區，該 重鏈可變區包含選自SEQ ID NO：27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61及63之胺基酸序列。
  9. 如前述請求項中任一項之抗體，其中該抗體包含一輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含選自SEQ ID NO：26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60及62之胺基酸序列。
  10. 如前述請求項中任一項之抗體，其中該抗體包含：a)包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列之輕鏈可變區；b)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列之輕鏈可變區；c)包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列之輕鏈可變區；d)包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列之輕鏈可變區；e)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列之輕鏈可變區；f)包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列之輕鏈可變區；g)包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列之輕鏈可變區；h)包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列之輕鏈可變區；i)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之輕鏈可變區；j)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之輕鏈可變區；k)包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列之輕鏈可變區；l)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之輕鏈可變區；m)包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列之輕鏈可變區；n)包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列之輕鏈可變區；o)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之輕鏈可變區；p)包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之輕鏈可變區；q)包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列之輕鏈可變區；或r)包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列之輕鏈可變區。
  11. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含以下：包含SEQ ID NO：35之胺 基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列之輕鏈可變區，或其中該抗體包含以下：包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列之輕鏈可變區。
  12. 如前述請求項中任一項之抗體，其係單株抗體。
  13. 如前述請求項中任一項之抗體，其係人類化或嵌合抗體。
  14. 如前述請求項中任一項之抗體，其係可結合因子D之抗體片段。
  15. 如請求項14之抗體，其係Fab片段。
  16. 如請求項15之抗體，其中該輕鏈包含包含SEQ ID NO：112之序列之輕鏈恆定區。
  17. 如請求項15或請求項16之抗體，其中該重鏈包含一重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含選自SEQ ID NO：113、128至132、134至137及154至156之序列。
  18. 如請求項14至17中任一項之抗體，其中該抗體包含：a)包含選自SEQ ID NO：71、118至122及140至146之胺基酸序列之重鏈，及包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列之輕鏈；b)包含選自SEQ ID NO：75、123至127及147至153之胺基酸序列之 重鏈，及包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列之輕鏈；c)包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列之輕鏈；d)包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列之輕鏈；e)包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列之輕鏈；f)包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列之輕鏈；g)包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列之輕鏈；h)包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列之輕鏈；i)包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列之輕鏈；j)包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列之輕鏈；k)包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列之輕鏈；l)包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之輕鏈；m)包含SEQ ID NO：89之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：88 之胺基酸序列之輕鏈；n)包含SEQ ID NO：91之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列之輕鏈；o)包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列之輕鏈；p)包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列之輕鏈；q)包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列之輕鏈；或r)包含SEQ ID NO：99之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：98之胺基酸序列之輕鏈。
  19. 如請求項14至17中任一項之抗體，其中該抗體包含：a)包含選自SEQ ID NO：71、118至122及140至146之胺基酸序列之重鏈，及包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列之輕鏈；或b)包含選自SEQ ID NO：75、123至127及147至153之胺基酸序列之重鏈，及包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列之輕鏈。
  20. 如前述請求項中任一項之抗體，其中該抗體包含經工程改造之半胱胺酸。
  21. 如請求項20之抗體，其中該經工程改造之半胱胺酸係選自重鏈中之 T110C、A136C、L170C、L175C、T183C或T205C突變，及輕鏈中之I106C、R108C、R142C、K149C及V205C突變，其中該殘基編號係根據Kabat編號。
  22. 如請求項19之抗體，其中該抗體包含以下：包含SEQ ID NO：119之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列之輕鏈。
  23. 一種結合至因子D之分離抗體，其中該抗體包含以下：包含SEQ ID NO：119之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列之輕鏈。
  24. 一種結合至因子D之分離抗體，其中該抗體包含以下：由SEQ ID NO：119之胺基酸序列組成之重鏈及由SEQ ID NO：70之胺基酸序列組成之輕鏈。
  25. 如前述請求項中任一項之抗體，其中因子D係包含SEQ ID NO：106之胺基酸序列之人類因子D。
  26. 如前述請求項中任一項之抗體，其中該抗體可結合至食蟹猴因子D。
  27. 如請求項26之抗體，其中該食蟹猴因子D包含SEQ ID NO：107之胺基酸序列。
  28. 如請求項26或請求項27之抗體，其中該抗體以比針對人類因子D之KD高小於10倍或小於7倍或小於5倍或小於3倍之KD結合至食蟹猴因子D。
  29. 一種分離核酸，其編碼如前述請求項中任一項之抗體。
  30. 一種宿主細胞，其包含如請求項29之核酸。
  31. 一種產生如請求項1至28中任一項之抗體之方法，其包括培養如請求項30之宿主細胞使得該抗體產生。
  32. 一種醫藥調配物，其包含如請求項1至28中任一項之抗體及醫藥上可接受之載劑。
  33. 如請求項32之醫藥調配物，其中該醫藥上可接受之載劑包含具有pH介於約5.5與約8.0之間的緩衝劑。
  34. 如請求項32或請求項33之醫藥調配物，其中該抗體係以至少150mg/mL、至少160mg/mL、至少170mg/mL、至少180mg/mL、至少190mg/mL、至少200mg/mL或至少210mg/mL或至少220mg/mL或至少230mg/mL或至少240mg/mL或至少250mg/mL或至少260mg/mL或至少270mg/mL或至少280mg/mL或至少290mg/mL或至少300mg/mL之濃度存在。
  35. 如請求項32至34中任一項之醫藥調配物，其中該抗體係以介於150mg/mL與350mg/mL之間或介於150mg/mL與300mg/mL之間或介於170mg/mL與300mg/mL之間或介於200mg/mL與300mg/mL之間之濃度存在。
  36. 如請求項32至35中任一項之醫藥調配物，其中該組合物包含在4℃下儲存至少一週、至少兩週、至少四週、至少六週、至少八週、至少12週、至少16週、至少20週、至少24週或至少28週後沒有肉眼可見之沈澱。
  37. 如請求項32至36中任一項之醫藥調配物，其中該組合物在25℃下之黏度係小於30cP、小於25cP、小於20cP、小於15cP或小於10cP。
  38. 如請求項37之醫藥調配物，其中該抗因子D抗體於該組合物中之濃度係介於100mg/mL與300mg/mL之間或介於150mg/mL與300mg/mL之間。
  39. 如請求項32至38中任一項之醫藥調配物，其中該醫藥調配物係適用於透過窄孔針進行之玻璃體內投與。
  40. 如請求項36之醫藥調配物，其中該窄孔針係約30、29、28、27、26、25、24、23或22號針規。
  41. 一種結合物，其包含至少一種如請求項1至28中任一項之抗體，該抗 體經共價連接至一或多種多元醇。
  42. 如請求項41之結合物，其中該多元醇係多臂多元醇。
  43. 如請求項41或請求項42之結合物，其中該結合物包含至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或至少六個經共價連接至多臂多元醇之抗體。
  44. 如請求項41至43中任一項之結合物，其中該多元醇係透過半胱胺酸胺基酸之游離巰基共價連接至至少一種抗體。
  45. 如請求項44之結合物，其中該半胱胺酸胺基酸係經工程改造之半胱胺酸。
  46. 如請求項44或請求項45之結合物，其中該半胱胺酸胺基酸係於該抗體之恆定區中。
  47. 如請求項44之結合物，其中該半胱胺酸胺基酸係於該抗體之該重鏈或輕鏈之C端。
  48. 如請求項41至43中任一項之結合物，其中該多元醇係透過離胺酸胺基酸之游離胺基共價連接至至少一種抗體。
  49. 如請求項48之結合物，其中該離胺酸胺基酸係於該抗體之恆定區中。
  50. 如請求項48之結合物，其中該離胺酸胺基酸係於該抗體之重鏈或輕鏈之C端。
  51. 如請求項41至50中任一項之結合物，其中該多元醇係選自二聚物、四聚物、六聚物及八聚物之多臂多元醇。
  52. 如請求項51之結合物，其中該多臂多元醇係八聚物。
  53. 如請求項38至49中任一項之結合物，其中該多元醇係聚乙二醇。
  54. 如請求項53之結合物，其中該聚乙二醇具有約500D至約300,000D之重量平均分子量。
  55. 如請求項53之結合物，其中該聚乙二醇具有約20,000D至約60,000D之重量平均分子量。
  56. 如請求項53之結合物，其中該聚乙二醇具有約40,000D之重量平均分子量。
  57. 如請求項53至56中任一項之結合物，其中該聚乙二醇具有通式(Ia)之 結構： 其中各m獨立地係3至250之整數；n係1至10之整數；各R1獨立地係不存在或者係連接基團；及各R2獨立地係氫或者末端反應性基團；其中至少一個R2係末端反應性基團且係共價連接至該抗體。
  58. 如請求項53至56中任一項之結合物，其中該聚乙二醇具有通式(Ib)之結構： 其中各m獨立地係3至250之整數；各R1獨立地係不存在或者係連接基團；及各R2獨立地係氫或者末端反應性基團；其中至少一個R2係末端反應性基團且係共價連接至該抗體。
  59. 如請求項53至56中任一項之結合物，其中該聚乙二醇具有通式(IIa)之結構： 其中各m獨立地係3至250之整數；n係1至10之整數；各R1獨立地係不存在或者係連接基團；及各R2獨立地係氫或末端反應性基團；其中至少一個R2係末端反應性基團且係共價連接至該抗體。
  60. 如請求項59之結合物，其中n係4。
  61. 如請求項53至56中任一項之結合物，其中該聚乙二醇具有通式(IIIa)之結構： 其中各m獨立地係3至250之整數；n係1至10之整數；各R1獨立地係不存在或者係連接基團；及各R2獨立地係氫或者末端反應性基團；其中至少一個R2係末端反應性基團且係共價連接至該抗體。
  62. 如請求項61之結合物，其中n係4。
  63. 如請求項53至56中任一項之結合物，其中該聚乙二醇具有通式(IVa)之結構： 其中各m獨立地係3至250之整數；各R1獨立地係不存在或者係連接基團；及各R2獨立地係氫或者末端反應性基團；其中至少一個R2係末端反應性基團且係共價連接至該抗體。
  64. 如請求項57至63中任一項之結合物，其中m係50至200之整數。
  65. 如請求項64之結合物，其中m係100至150之整數。
  66. 如請求項57至65中任一項之結合物，其中至少一個R1係連接基團，其中R1及R2當共同一起時係選自；； ；及；及其組合；其中各i獨立地係0至10之整數；及j係0至10之整數。
  67. 如請求項57至66中任一項之結合物，其中各R2係獨立地選自硫醇基反應性基團、胺基反應性基團及其組合。
  68. 如請求項67之結合物，其中各R2係獨立地選自順丁烯二醯亞胺、巰基、硫醇基、三氟甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、氮丙啶、環氧化物、二硫吡啶、琥珀醯亞胺酯、-NH2、醛、鹵代乙酸酯、鹵代乙醯胺及碳酸對硝基苯基酯。
  69. 如請求項68之結合物，其中R2係順丁烯二醯亞胺。
  70. 如請求項57至69中任一項之結合物，其中R1及R2當共同一起時係，i係0至10之整數；及j係0至10之整數。
  71. 如請求項57至69中任一項之結合物，其中該等R2基團中至少七個係共價連接至該等抗體中之一者。
  72. 如請求項71之結合物，其中該等R2基團中八個係共價連接至該等抗體中之一者。
  73. 如請求項41至72中任一項之結合物，其包含至少一個如請求項22至24中任一項之抗體，該抗體共價連接至一或多個多元醇。
  74. 一種結合物，其包含至少一個如請求項22至24中任一項之抗體，該抗體共價連接至具有通式(Ib)之結構之聚乙二醇： 其中各m獨立地係3至250之整數；各R1獨立地係不存在或者係連接基團；及各R2獨立地係氫或者末端反應性基團；其中至少一個R2係末端反應性基團且係共價連接至該抗體。
  75. 如請求項74之結合物，其中m係50至200之整數。
  76. 如請求項74之結合物，其中m係100至150之整數。
  77. 如請求項41至76中任一項之結合物，其中該結合物係藉由將至少一個如請求項1至28中任一項之抗體共價連接至多臂多元醇製得。
  78. 一種醫藥調配物，其包含如請求項41至77中任一項之結合物及醫藥上可接受之載劑。
  79. 如請求項78之醫藥調配物，其中該抗體之濃度係至少100mg/mL或至少150mg/mL或至少200mg/mL或至少300mg/mL。
  80. 如請求項79之醫藥調配物，其中該抗體之濃度係約50mg/mL至約300mg/mL。
  81. 如請求項78至80中任一項之醫藥調配物，其中該組合物在25℃下之黏度係小於1000cP、小於900cP、小於800cP、小於700cP、小於600cP、小於500cP、小於400cP或小於300cP。
  82. 如請求項81之醫藥調配物，其中該抗因子D抗體於該組合物中之濃度係至少100mg/mL或至少150mg/mL。
  83. 一種用於眼遞送之遞送裝置，其包含如請求項32至40及78至82中任一項之醫藥調配物及用於向病患玻璃體內遞送該調配物之構件。
  84. 如請求項83之遞送裝置，其中該調配物在位點上一段持久時間段可保持有效。
  85. 一種治療個體中經補體介導之失調症之方法，該方法包括向該個體投與有效量之如請求項1至28中任一項之抗體、如請求項41至75中任一項之結合物或如請求項32至40及78至82中任一項之醫藥調配物。
  86. 如請求項85之方法，其中該經補體介導之失調症係全身性的。
  87. 如請求項85之方法，其中該經補體介導之失調症係補體相關眼部病症。
  88. 如請求項87之方法，其中該補體相關眼部病症係選自年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration；AMD)(包括乾性及濕性(非滲出性及滲出性)形式)、脈絡膜新生血管性疾病(choroidal neovascularization；CNV)、眼色素層炎、糖尿病視網膜病變、缺血性視網膜病變、糖尿病性黃斑水腫、病理性近視、逢希伯-林道失調症(von Hippel-Lindau disease)、眼組織胞漿菌病、中央視網膜靜脈阻塞(Central Retinal Vein Occlusion；CRVO)、角膜新生血管形成及視網膜新生血管形成。
  89. 如請求項87之方法，其中該補體相關眼部病症係選自中度乾燥形式AMD或地圖狀萎縮(geographic atrophy；GA)。
  90. 如請求項85至89中任一項之方法，其中該方法包括使用可植入口遞送系統投與該抗體、結合物或醫藥調配物。
  91. 如請求項85至89中任一項之方法，其中該方法包括藉由玻璃體內投與來投與該抗體、結合物或醫藥調配物。
  92. 如請求項91之方法，其中該玻璃體內投與係透過窄孔針。
  93. 如請求項92之方法，其中該窄孔針係約30、29、28、27、26、25、24、23或22號針規。
  94. 如請求項85至93中任一項之方法，該方法進一步包括向該個體投與額外治療劑。
  95. 如請求項94之方法，其中該額外之治療劑係選自ANG2拮抗劑、TIE2拮抗劑、VEGF拮抗劑及第二補體組分拮抗劑。
  96. 如請求項94之方法，其中該額外治療劑係抗ANG2抗體。
  97. 如請求項94之方法，其中該額外治療劑係抗TIE2抗體。
  98. 如請求項94之方法，其中該額外治療劑係選自VEGF捕獲劑及抗VEGF抗體。
  99. 如請求項94之方法，其中該額外治療劑係第二補體組分拮抗劑，其中該第二補體組分拮抗劑抑制選自C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8及C9之補體組分。
  100. 一種如請求項1至28中任一項之抗體或如請求項43至77中任一項之結合物之用途，其用於製造治療個體中經補體介導之失調症之藥劑。
  101. 如請求項100之用途，其中該經補體介導之失調症係補體相關眼部病症。
  102. 如請求項100之用途，其中該經補體介導之失調症係全身性的。
  103. 如請求項102之用途，其中該補體相關眼部病症係選自年齡相關性黃斑變性(AMD)(包括乾性及濕性(非滲出性及滲出性)形式)、脈絡膜新生血管性疾病(CNV)、眼色素層炎、糖尿病視網膜病變、缺血性視網膜病變、糖尿病性黃斑水腫、病理性近視、逢希伯-林道失調症、眼組織胞漿菌病、中央視網膜靜脈阻塞(CRVO)、角膜新生血管形成及視網膜新生血管形成。
  104. 如請求項102之用途，其中該補體相關眼部病症係選自中度乾燥形式AMD或地圖狀萎縮(GA)。
  105. 如請求項1至28中任一項之抗體或如請求項41至77中任一項之結合物，其係用於治療。
  106. 如請求項1至28中任一項之抗體或如請求項41至77中任一項之結合物，其用於治療個體中經補體介導之失調症之方法中。
  107. 如請求項1至28中任一項之抗體或如請求項41至77中任一項之結合物，其用於治療個體中全身性經補體介導之失調症之方法中。
  108. 如請求項107之抗體或結合物，其中該經補體介導之失調症係補體相關眼部病症。
  109. 如請求項108之抗體或結合物，其中該補體相關眼部病症係選自年齡相關性黃斑變性(AMD)(包括乾性及濕性(非滲出性及滲出性)形式)、脈絡膜新生血管性疾病(CNV)、眼色素層炎、糖尿病視網膜病變、缺血性視網膜病變、糖尿病性黃斑水腫、病理性近視、逢希伯-林道失調症、眼組織胞漿菌病、中央視網膜靜脈阻塞(CRVO)、角膜新生血管形成及視網膜新生血管形成。
  110. 如請求項108之抗體或結合物，其中該補體相關眼部病症係選自中度乾燥形式AMD或地圖狀萎縮(GA)。
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
CN108472382A (zh) 2015-10-30 2018-08-31 豪夫迈·罗氏有限公司 抗-因子d抗体变体缀合物及其用途
AU2016381964B2 (en) 2015-12-30 2024-02-15 Kodiak Sciences Inc. Antibodies and conjugates thereof
EP3610010A4 (en) * 2017-04-14 2021-02-24 Kodiak Sciences Inc. COMPLEMENT D-FACTOR ANTAGONIST ANTIBODIES AND THEIR CONJUGATES
CN108997497B (zh) * 2018-03-30 2022-02-25 华兰基因工程有限公司 特异结合人质膜膜泡关联蛋白pv-1的单克隆抗体及其制备方法与应用
WO2020109343A1 (en) 2018-11-29 2020-06-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy for treatment of macular degeneration
CN114786731A (zh) 2019-10-10 2022-07-22 科达制药股份有限公司 治疗眼部病症的方法
MX2022014275A (es) 2020-05-12 2022-12-07 Alexion Pharma Inc Uso de inhibidores del factor d del complemento solos o junto con anticuerpos anti-c5 para el tratamiento de la hemoglobinuria paroxistica nocturna.
CN116710135A (zh) * 2020-10-07 2023-09-05 6线生物技术公司 用于治疗眼部疾病的方法和试剂
CN116514979B (zh) * 2022-05-09 2024-05-07 华兰基因工程(河南)有限公司 特异性结合pv-1蛋白的抗体或其抗原结合片段hlpv-p09及其应用

Family Cites Families (227)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4741900A (en) 1982-11-16 1988-05-03 Cytogen Corporation Antibody-metal ion complexes
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
GB8430252D0 (en) 1984-11-30 1985-01-09 Beecham Group Plc Compounds
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
ES2054667T3 (es) 1986-04-28 1994-08-16 Cetus Oncology Corp Anticuerpos monoclonales contra c5a y des-arg74-c5a, su produccion y uso.
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2, Inc., Danville, Calif. Geänderte antikörper.
US5256642A (en) 1988-04-01 1993-10-26 The Johns Hopkins University Compositions of soluble complement receptor 1 (CR1) and a thrombolytic agent, and the methods of use thereof
NZ230747A (en) 1988-09-30 1992-05-26 Bror Morein Immunomodulating matrix comprising a complex of at least one lipid and at least one saponin; certain glycosylated triterpenoid saponins derived from quillaja saponaria molina
WO1990005144A1 (en) 1988-11-11 1990-05-17 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5244800A (en) 1990-04-27 1993-09-14 The Uab Research Foundation Crystals of human complement factor d that are triclinic
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
AU675916B2 (en) 1991-06-14 1997-02-27 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
WO1993000109A1 (en) 1991-06-28 1993-01-07 Genentech, Inc. Method of stimulating immune response using growth hormone
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US7018809B1 (en) 1991-09-19 2006-03-28 Genentech, Inc. Expression of functional antibody fragments
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
DE69333807T2 (de) 1992-02-06 2006-02-02 Chiron Corp., Emeryville Marker für krebs und biosynthetisches bindeprotein dafür
US5456909A (en) 1992-08-07 1995-10-10 T Cell Sciences, Inc. Glycoform fractions of recombinant soluble complement receptor 1 (sCR1) having extended half-lives in vivo
ES2112431T3 (es) 1992-08-21 1998-04-01 Genentech Inc Procedimiento para el tratamiento de un trastorno mediado por lfa-1.
JPH08506095A (ja) 1992-11-25 1996-07-02 アムジェン ボールダー インコーポレイテッド 改変インシュリン様成長因子
US5861156A (en) 1993-01-08 1999-01-19 Creative Biomolecules Methods of delivering agents to target cells
WO1994022466A1 (en) 1993-04-07 1994-10-13 Synergen, Inc. Methods of using insulin-like growth factor binding proteins
US5856300A (en) 1994-05-12 1999-01-05 T Cell Sciences, Inc. Compositions comprising complement related proteins and carbohydrates, and methods for producing and using said compositions
WO1994029351A2 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Celltech Limited Antibodies
US5679546A (en) 1993-09-24 1997-10-21 Cytomed, Inc. Chimeric proteins which block complement activation
US5627264A (en) 1994-03-03 1997-05-06 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Chimeric complement inhibitor proteins
CA2186108A1 (en) 1994-03-23 1995-09-28 Scott A. Rollins Method for reducing immune and hemostatic dysfunctions during extracorporeal circulation
US5534615A (en) 1994-04-25 1996-07-09 Genentech, Inc. Cardiac hypertrophy factor and uses therefor
US5919623A (en) 1994-04-27 1999-07-06 St. James's And Seacroft University Hospitals Nhs Trust Nucleic acid mutation assays
US6074642A (en) 1994-05-02 2000-06-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Use of antibodies specific to human complement component C5 for the treatment of glomerulonephritis
US5679345A (en) 1994-06-02 1997-10-21 The Johns Hopkins University Method for preventing complement-dependent rejection of organ or tissue transplants
WO2001004311A1 (en) 1999-07-07 2001-01-18 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
WO2000037638A2 (en) 1998-12-22 2000-06-29 Genentech, Inc. Methods and compositions for inhibiting neoplastic cell growth
US5679564A (en) 1994-10-05 1997-10-21 Antex Biologics, Inc. Methods for producing enhanced antigenic campylobacter bacteria and vaccines
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
DK1568772T3 (da) 1995-09-21 2010-10-18 Genentech Inc Varianter af humant væksthormon
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US7122636B1 (en) 1997-02-21 2006-10-17 Genentech, Inc. Antibody fragment-polymer conjugates and uses of same
US20050197285A1 (en) 1997-03-07 2005-09-08 Rosen Craig A. Human secreted proteins
US6472520B2 (en) 1997-03-21 2002-10-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Rat PEG-3 promoter
US6884879B1 (en) 1997-04-07 2005-04-26 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
DE122007000021I1 (de) 1997-04-07 2007-05-24 Genentech Inc Anti-vefg Antibodies
EP0979281B1 (en) 1997-05-02 2005-07-20 Genentech, Inc. A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
CA2293829C (en) 1997-06-24 2011-06-14 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
US5994511A (en) 1997-07-02 1999-11-30 Genentech, Inc. Anti-IgE antibodies and methods of improving polypeptides
ES2297889T3 (es) 1997-07-14 2008-05-01 Bolder Biotechnology, Inc. Derivados de hormona de crecimiento y proteinas relacionadas.
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
US6410708B1 (en) 1997-11-21 2002-06-25 Genentech, Inc. Nucleic acids encoding A-33 related antigen polypeptides
JP2001513576A (ja) 1997-08-26 2001-09-04 グリアテック インコーポレイテッド 側副経路を介する補体活性化を阻害するためのプロセス
EP1028751B1 (en) 1997-10-31 2008-12-31 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US7192589B2 (en) 1998-09-16 2007-03-20 Genentech, Inc. Treatment of inflammatory disorders with STIgMA immunoadhesins
US8007798B2 (en) 1997-11-21 2011-08-30 Genentech, Inc. Treatment of complement-associated disorders
US8088386B2 (en) 1998-03-20 2012-01-03 Genentech, Inc. Treatment of complement-associated disorders
PT1481989E (pt) 1997-11-21 2008-08-08 Genentech Inc Antigénios relacionados com a-33 e suas utilizações farmacológicas
US7419663B2 (en) 1998-03-20 2008-09-02 Genentech, Inc. Treatment of complement-associated disorders
US7282565B2 (en) 1998-03-20 2007-10-16 Genentech, Inc. PRO362 polypeptides
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
EP1034298B1 (en) 1997-12-05 2011-11-02 The Scripps Research Institute Humanization of murine antibody
US7005504B2 (en) 1998-01-22 2006-02-28 Genentech, Inc. Antibody fragment-peg conjugates
JP2002502589A (ja) 1998-02-09 2002-01-29 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド ４５個のヒト分泌タンパク質
US6956107B2 (en) 1998-02-20 2005-10-18 Tanox, Inc. Inhibitors of complement activation
US7112327B2 (en) 1998-02-20 2006-09-26 Tanox, Inc. Inhibition of complement activation
SI2033659T1 (sl) 1998-02-20 2014-03-31 Genentech, Inc. Inhibitorji komplementne aktivacije
DK1490386T3 (da) 1998-03-10 2008-12-15 Genentech Inc Nyt polypeptid og nukleinsyrer kodende for dette
JP2002510481A (ja) 1998-04-02 2002-04-09 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗体変異体及びその断片
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ES2340112T3 (es) 1998-04-20 2010-05-28 Glycart Biotechnology Ag Ingenieria de glicosilacion de anticuerpos para la mejora de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos.
AU5587799A (en) 1998-08-27 2000-03-21 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Protein transport-associated molecules
US6376653B1 (en) 1998-09-28 2002-04-23 Smithkline Beecham Plc Tie2 antagonist antibodies
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
PL209786B1 (pl) 1999-01-15 2011-10-31 Genentech Inc Przeciwciało zawierające wariant regionu Fc ludzkiej IgG1, przeciwciało wiążące czynnik wzrostu śródbłonka naczyń oraz immunoadhezyna
CA2362427A1 (en) 1999-03-08 2000-09-14 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
CZ303128B6 (cs) 1999-03-11 2012-04-18 Laboratoires Serono Sa Adhezní molekula 1 regulovaná konfluencí CRAM-1, její kódující nukleová kyselina, protilátky a použití
US6642353B1 (en) 1999-03-17 2003-11-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Peptide ligands for the erythropoietin receptor
CA2704600C (en) 1999-04-09 2016-10-25 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. A method for producing antibodies with increased adcc activity
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
DE60022369T2 (de) 1999-10-04 2006-05-18 Medicago Inc., Sainte Foy Verfahren zur regulation der transkription von fremden genen in gegenwart von stickstoff
JP4668498B2 (ja) 1999-10-19 2011-04-13 協和発酵キリン株式会社 ポリペプチドの製造方法
WO2001036102A1 (fr) 1999-11-02 2001-05-25 Uliyanovsky Gosudarstvenny Tekhnichesky Universitet Procede pour nettoyer un liquide des particules ferromagnetiques et dispositif correspondant
JP2003514541A (ja) 1999-11-19 2003-04-22 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド １８個のヒト分泌タンパク質
EP1686134A3 (en) 1999-12-01 2006-08-09 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
IL149809A0 (en) 1999-12-15 2002-11-10 Genentech Inc Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
AU2001234962A1 (en) 2000-02-10 2001-08-20 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Mixtures of caspase inhibitors and complement inhibitors and methods of use thereof
US6821775B1 (en) 2000-02-11 2004-11-23 Genvec, Inc. Viral vector encoding pigment epithelium-derived factor
DK1265929T3 (da) 2000-03-23 2009-11-16 Genentech Inc Anti-C2/C2a-inhibitorer til komplement aktivering
KR20020093029A (ko) 2000-04-11 2002-12-12 제넨테크, 인크. 다가 항체 및 그의 용도
EP2026073B1 (en) 2000-04-29 2016-03-30 University Of Iowa Research Foundation Diagnostics and therapeutics for macular degeneration-related disorders
CA2412211A1 (en) 2000-06-23 2002-01-03 Genetech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of disorders involving angiogenesis
AU2001271973A1 (en) 2000-07-20 2002-02-05 Kevin P. Baker Compositions and methods for the diagnosis and treatment of disorders involving angiogenesis
EP1331266B1 (en) 2000-10-06 2017-01-04 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Cells producing antibody compositions
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
EP3031827A1 (en) 2000-10-10 2016-06-15 Genentech, Inc. Inhibition of complement c5 activation for the treatment and prevention of delayed xenograft or acute vascular rejection
SI1324776T2 (en) 2000-10-12 2018-06-29 Genentech, Inc. Concentrated protein formulations with reduced viscosity
CA2425809A1 (en) 2000-10-13 2002-04-18 Biogen, Inc. Humanized anti-lt-.beta.-r antibodies
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
JP3523245B1 (ja) 2000-11-30 2004-04-26 メダレックス，インコーポレーテッド ヒト抗体作製用トランスジェニック染色体導入齧歯動物
CA2433353C (en) 2000-12-28 2017-03-21 Altus Biologics, Inc. Crystals of whole antibodies and fragments thereof and methods for making and using them
US20040077575A1 (en) 2002-01-11 2004-04-22 Giordano Giovan Giacomo Inhibition of pathological angiogenesis in vivo
US6867189B2 (en) 2001-07-26 2005-03-15 Genset S.A. Use of adipsin/complement factor D in the treatment of metabolic related disorders
NZ592087A (en) 2001-08-03 2012-11-30 Roche Glycart Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
EP1425042B2 (en) 2001-08-17 2016-02-10 Genentech, Inc. Complement pathway inhibitors binding to c5 and c5a without preventing the formation of c5b
WO2003029420A2 (en) 2001-10-02 2003-04-10 Genentech, Inc. Apo-2 ligand variants and uses thereof
MXPA04003798A (es) 2001-10-25 2004-07-30 Genentech Inc Composiciones de glicoproteina.
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
JPWO2003084569A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物含有医薬
ATE503829T1 (de) 2002-04-09 2011-04-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
US20040259150A1 (en) 2002-04-09 2004-12-23 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method of enhancing of binding activity of antibody composition to Fcgamma receptor IIIa
CN102911987B (zh) 2002-04-09 2015-09-30 协和发酵麒麟株式会社 基因组被修饰的细胞
AU2003236015A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing antibody composition
JP4832719B2 (ja) 2002-04-09 2011-12-07 協和発酵キリン株式会社 ＦｃγＲＩＩＩａ多型患者に適応する抗体組成物含有医薬
JP4753578B2 (ja) 2002-06-03 2011-08-24 ジェネンテック， インコーポレイテッド 合成抗体ファージライブラリー
WO2004001009A2 (en) 2002-06-24 2003-12-31 Genentech, Inc. Apo-2 ligand/trail variants and uses thereof
US20050180972A1 (en) 2002-07-31 2005-08-18 Wahl Alan F. Anti-CD20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders
TWI323265B (en) 2002-08-06 2010-04-11 Glaxo Group Ltd Antibodies
AU2003258714A1 (en) 2002-09-06 2004-03-29 Cytos Biotechnology Ag Immune modulatory compounds and methods
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
WO2004041160A2 (en) 2002-10-30 2004-05-21 University Of Kentucky Research Foundation Methods and animal model for analyzing age-related macular degeneration
US7816497B2 (en) 2002-10-30 2010-10-19 University Of Kentucky Compositions and methods for inhibiting drusen complement components C3a and C5a for the treatment of age-related macular degeneration
BRPI0316779B1 (pt) 2002-12-16 2020-04-28 Genentech Inc anticorpo humanizado que liga cd20 humano, composição, artigo manufaturado, método de indução da apoptose, método de tratamento de câncer cd20 positivo, métodos de tratamento de doenças autoimunes, ácidos nucléicos isolados, vetores de expressão, células hospedeiras, método para a produção de um anticorpo 2h7 humanizado, polipeptídeo isolado, formulação líquida, método de tratamento de artrite reumatóide (ra) e anticorpos de ligação de cd20 humanizados
US20050079574A1 (en) 2003-01-16 2005-04-14 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
AU2004216176B2 (en) 2003-02-21 2008-04-03 Genentech, Inc. Methods for preventing and treating tissue damage associated with ischemia-reperfusion injury
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
RU2232991C1 (ru) 2003-04-09 2004-07-20 Государственное учреждение "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Способ определения функциональной активности фактора d комплемента человека
KR100512483B1 (ko) 2003-05-07 2005-09-05 선바이오(주) 신규한 폴리에틸렌글리콜-말레이미드 유도체의 합성방법
US7709610B2 (en) 2003-05-08 2010-05-04 Facet Biotech Corporation Therapeutic use of anti-CS1 antibodies
EP2267028A3 (en) * 2003-06-30 2011-07-27 Domantis Limited Dual specific single domain antibodies (dAb) conjugated to PEG
ES2315664T3 (es) * 2003-06-30 2009-04-01 Domantis Limited Anticuerpos de dominio unico (dab) pegilados.
WO2005014849A2 (en) 2003-07-03 2005-02-17 Euro-Celtique, S.A. Genes associated with responses to neuropathic pain
WO2005044853A2 (en) 2003-11-01 2005-05-19 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
US20050106667A1 (en) 2003-08-01 2005-05-19 Genentech, Inc Binding polypeptides with restricted diversity sequences
US7923010B2 (en) 2003-09-11 2011-04-12 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Methods and materials for treating autoimmune diseases and conditions
US20080241884A1 (en) 2003-10-08 2008-10-02 Kenya Shitara Fused Protein Composition
CA2542125A1 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using rna inhibiting the function of .alpha.1,6-fucosyltransferase
SI2380911T1 (en) 2003-11-05 2018-07-31 Roche Glycart Ag ANTIGEN-RELATED PATIENTS WITH INCREASED ATTENTION ON THE RECEPTOR FC AND EFFECTORAL FUNCTION
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
US20050169921A1 (en) 2004-02-03 2005-08-04 Leonard Bell Method of treating hemolytic disease
US7127355B2 (en) 2004-03-05 2006-10-24 Perlegen Sciences, Inc. Methods for genetic analysis
US20090087854A1 (en) 2007-09-27 2009-04-02 Perlegen Sciences, Inc. Methods for genetic analysis
RU2386638C2 (ru) 2004-03-31 2010-04-20 Дженентек, Инк. Гуманизированные анти-тфр-бета-антитела
US7794713B2 (en) 2004-04-07 2010-09-14 Lpath, Inc. Compositions and methods for the treatment and prevention of hyperproliferative diseases
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
RU2368622C2 (ru) 2004-04-13 2009-09-27 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Антитела к р-селектину
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
AU2005286607B2 (en) 2004-09-23 2011-01-27 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
WO2006062716A2 (en) 2004-11-18 2006-06-15 Yale University Methods and compositions for treating ocular disorders
WO2006071856A2 (en) 2004-12-23 2006-07-06 Glycofi, Inc. Immunoglobulins comprising predominantly a man5glcnac2 glycoform
JP5068175B2 (ja) 2005-01-04 2012-11-07 日立化成工業株式会社 プライマー生成ローリングサークル型増幅
US8029783B2 (en) 2005-02-02 2011-10-04 Genentech, Inc. DR5 antibodies and articles of manufacture containing same
NZ595305A (en) 2005-02-14 2013-06-28 Univ Iowa Res Found Methods and reagents for treatment and diagnosis of age-related macular degeneration
CN101495651A (zh) 2005-06-08 2009-07-29 匹兹堡大学 染色体10q26上的年龄-相关黄斑病变（ARM）易感基因
DK1951279T3 (en) 2005-10-08 2017-07-31 Apellis Pharmaceuticals Inc COMPSTATIN AND ANALOGUES THEREOF FOR EYE DISEASES
WO2007056227A2 (en) 2005-11-04 2007-05-18 Genentech, Inc. Use of complement pathway inhibitors to treat ocular diseases
EP1957531B1 (en) 2005-11-07 2016-04-13 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
WO2007064919A2 (en) 2005-12-02 2007-06-07 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
US20070190057A1 (en) 2006-01-23 2007-08-16 Jian Wu Methods for modulating mannose content of recombinant proteins
AR059066A1 (es) 2006-01-27 2008-03-12 Amgen Inc Combinaciones del inhibidor de la angiopoyetina -2 (ang2) y el inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (vegf)
US20080146501A1 (en) 2006-02-13 2008-06-19 University Of Iowa Research Foundation Protective complement proteins and age-related macular degeneration
AR060871A1 (es) 2006-05-09 2008-07-16 Genentech Inc Union de polipeptidos con supercontigos optimizados
EP2364691B1 (en) 2006-06-16 2013-04-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. VEGF antagonist formulations suitable for intravitreal administration
WO2008027236A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
AU2007300221A1 (en) 2006-09-25 2008-04-03 Medimmune, Llc. Stabilized antibody formulations and uses thereof
PL2907827T3 (pl) 2006-11-02 2019-03-29 Genentech, Inc. Humanizowane przeciwciała przeciw czynnikowi D i ich zastosowanie
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CA2705500A1 (en) 2007-05-11 2008-11-20 Tufts Medical Center Polynucleotides associated with age-related macular degeneration and methods for evaluating patient risk
AR066660A1 (es) 2007-05-23 2009-09-02 Genentech Inc Prevencion y tratamiento de condiciones del ojo asociadas con su complemento
KR20120125601A (ko) 2007-05-24 2012-11-16 아블린쓰 엔.브이. Ｒａｎｋ-ｌ에 대한 아미노산 서열, 및 이를 포함하는 골 질환 및 장애 치료용 폴리펩티드
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
US20090203001A1 (en) 2007-08-24 2009-08-13 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for diagnosing and treating macular degeneration
EP2235064B1 (en) 2008-01-07 2015-11-25 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
CA2721503A1 (en) 2008-04-18 2009-12-03 Massachusetts General Hospital Polymorphisms associated with age-related macular degeneration and methods for evaluating patient risk
US20110294682A1 (en) 2008-04-28 2011-12-01 The General Hospital Corporation Polynucleotides Associated With Age-Related Macular Degeneration and Methods for Evaluating Patient Risks
CR20170001A (es) 2008-04-28 2017-08-10 Genentech Inc Anticuerpos anti factor d humanizados
CN101724144A (zh) 2008-11-03 2010-06-09 北京键凯科技有限公司 新型的多臂聚乙二醇及其制备方法和应用
EP2356250A2 (en) 2008-11-05 2011-08-17 Genentech, Inc. Genetic polymorphisms in age-related macular degeneration
WO2010075519A2 (en) 2008-12-23 2010-07-01 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Allelic variants associated with advanced age-related macular degeneration
EP2379027A1 (en) 2009-01-02 2011-10-26 Alcon Research, Ltd. In-situ refillable ophthalmic implant
WO2010085542A2 (en) 2009-01-23 2010-07-29 Novartis Ag Biomarkers related to age-related macular degeneration (amd)
SG173167A1 (en) 2009-01-29 2011-08-29 Forsight Labs Llc Posterior segment drug delivery
WO2010132459A2 (en) 2009-05-11 2010-11-18 Cleveland Clinic Foundation Biomarkers for assessment of age-related macular degeneration
US20110212433A1 (en) 2009-07-02 2011-09-01 Lanza Tech New Zealand Limited Alcohol production process
EP2963128A1 (en) 2009-07-10 2016-01-06 The Regents of the University of Michigan Compositions and methods for diagnosing and treating macular degeneration
CN102666583B (zh) * 2009-07-15 2015-11-25 Aimm医疗股份公司 革兰氏阳性细菌特异性结合化合物
US20120190578A1 (en) 2009-08-06 2012-07-26 Washington University Plasma Complement Components as Expression Markers for Age-Related Macular Degeneration and Related Phenotypes
US20110165648A1 (en) 2009-11-04 2011-07-07 Menno Van Lookeren Campagne Co-crystal structure of factor D and anti-factor D antibody
WO2011061119A1 (en) 2009-11-19 2011-05-26 Merck Serono S.A. Humanized antibodies against human il-22ra
RU2016105962A (ru) 2009-12-04 2018-11-23 Дженентек, Инк. Мультиспецифические антитела, аналоги антител, композиции и способы
CN102108119A (zh) 2009-12-25 2011-06-29 天津键凯科技有限公司 多臂聚乙二醇衍生物及其与药物的结合物和凝胶
KR20130020765A (ko) 2010-02-16 2013-02-28 메디뮨 엘엘씨 Ｈｓａ-관련 조성물 및 사용방법
EP2560683B2 (en) 2010-04-23 2022-07-20 F. Hoffmann-La Roche AG Production of heteromultimeric proteins
MX348025B (es) 2010-11-01 2017-05-24 Genentech Inc * Prediccion del paso a degeneracion macular avanzada relacionada con la edad utilizando una puntuacion poligenica.
MX355255B (es) 2011-02-04 2018-04-11 Genentech Inc Variantes de fc y métodos para su producción.
RU2607014C2 (ru) 2011-03-29 2017-01-10 Рош Гликарт Аг Fc варианты антитела
CN108373506A (zh) 2011-10-14 2018-08-07 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗HtrA1抗体及使用方法
JP6051998B2 (ja) 2012-03-30 2016-12-27 日油株式会社 マルチアーム型ポリエチレングリコール誘導体、その中間体及び製造方法
UY34887A (es) 2012-07-02 2013-12-31 Bristol Myers Squibb Company Una Corporacion Del Estado De Delaware Optimización de anticuerpos que se fijan al gen de activación de linfocitos 3 (lag-3) y sus usos
KR20210133321A (ko) * 2012-11-08 2021-11-05 클리어사이드 바이오메디컬, 인코포레이드 인간 대상체에서 안구 질병을 치료하기 위한 방법 및 장치
MX2016001854A (es) 2013-08-12 2016-09-06 Genentech Inc Composiciones y metodo para tratar condiciones asociadas con el complemento.
EP3042205B1 (en) 2013-09-06 2019-12-25 F. Hoffmann-La Roche AG Method for improving antibody stability
EP3808338A1 (en) * 2013-09-11 2021-04-21 Eagle Biologics, Inc. Liquid protein formulations containing ionic liquids
TW201623331A (zh) 2014-03-12 2016-07-01 普羅帝納生物科學公司 抗黑色素瘤細胞黏著分子（ｍｃａｍ）抗體類及使用彼等之相關方法
CA2944712A1 (en) 2014-05-01 2015-11-05 Genentech, Inc. Anti-factor d antibody variants and uses thereof

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