JP2022002521A - 抗d因子抗体及びコンジュゲート - Google Patents
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Abstract
【課題】抗D因子抗体及びコンジュゲートならびにその使用方法を提供する。【解決手段】D因子に結合する単離抗体であって、前記抗体が、(a)アミノ酸配列SYYMYを含むHVR−H1、(b)アミノ酸配列X4INPX5X6GX7TNFNEKFKSを含むHVR−H2(式中、X4が、E及びWから選択され、X5が、T及びYから選択され、X6が、N、S、及びQから選択され、X7が、G、D、及びEから選択される)、(c)アミノ酸配列EGGFAYを含むHVR−H3、(d)アミノ酸配列KASQNVDTDVAを含むHVR−L1、(e)アミノ酸配列SASSRX1Sを含むHVR−L2(式中、X1が、Y、K、及びRから選択される)、ならびに(f)アミノ酸配列QQYX3NYPLTを含むHVR−L3(式中、X3が、N及びEから選択される)を含む、前記抗体である。【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2015年10月30日に出願された米国仮出願第62/249,166号、及び2015年11月4日に出願された米国仮出願第62/250,995号の優先権の利益を主張するものであり、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2015年10月30日に出願された米国仮出願第62/249,166号、及び2015年11月4日に出願された米国仮出願第62/250,995号の優先権の利益を主張するものであり、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、抗D因子抗体及びコンジュゲートならびにその使用方法に関する。
補体系は、免疫複合体のクリアランス、ならびに感染性媒体、外来抗原、ウイルス感染細胞、及び腫瘍細胞に対する免疫反応において、中心的な役割を果たしている。しかしながら、補体は、病的炎症及び自己免疫疾患にも関与する。したがって、補体カスケードの過度なまたは制御されていない活性化の阻害は、かかる疾患及び症状に罹患している患者への臨床的利点を提供し得る。
補体系は、古典的なマンノース結合レクチン及び代替経路と呼ばれる、3つの異なる活性化経路を包含する。V.M.Holers In Clinical Immunology:Principles and Practice,ed.R.R.Rich,Mosby Press;1996,363−391。古典的な経路は、カルシウム/マグネシウム依存性カスケードであり、通常は抗原−抗体複合体の形成によって活性化される。マンノース結合レクチン(MBL)経路は、病原体上でのMBLの炭水化物構造への結合によって始まり、C2とC4を切断して、活性型C2a、C2b、C4a、及びC4bを形成する、MBLプロテアーゼ(MASP)の活性化をもたらす。代替経路は、マグネシウム依存性カスケードであり、ある特定の感受性表面(例えば、酵母及びバクテリアの細胞壁多糖ならびにある特定の生体高分子材料)上でのC3の沈着及び活性化によって活性化される。補体経路の活性化は、例えば、C3a、C4a、及びC5aアナフィラトキシンならびにC5b−9膜侵襲複合体(MAC)のような、補体タンパク質の生物学的に活性な断片を形成し、白血球走化性、マクロファージ、好中球、血小板、マスト細胞、及び内皮細胞の活性化、血管透過性、細胞溶解、及び組織傷害を含む炎症活性を誘発する。
D因子は、代替補体経路の活性化に不可欠で特異性が高いセリンプロテアーゼである。それは、C3bと結合したB因子を切断し、代替経路C3/C5コンバターゼの活性要素であるC3b/Bb酵素を生成する。D因子は、ヒトにおける血漿濃度が極めて低く(1.8μg/ml)、代替補体経路の活性化の律速酵素であることが示されているため、阻害に好適な標的となり得る。P.H.Lesavre and H.J.Muller−Eberhard.(1978)J.Exp.Med.148:1498−1510、J.E.Volanakis et al.(1985)New Eng.J.Med.312:395−401。
動物モデル及びエキソビボ試験では、補体活性化の下方調節が、いくつかの疾患適応症、例えば、全身性エリテマトーデス及び糸球体腎炎、リウマチ性関節炎、心肺バイパス法及び血液透析、臓器移植における超急性拒絶反応、心筋梗塞、再灌流傷害、及び成人性呼吸促迫症候群を処置する際に有効であることが実証されている。さらに、熱傷、重度の喘息、アナフィラキシーショック、腸の炎症、蕁麻疹、血管浮腫、血管炎、多発性硬化症、重症筋無力症、膜性増殖性糸球体腎炎、及びシェーグレン症候群を含む、その他の炎症状態及び自己免疫/免疫複合体病もまた、補体活性化と密接に関連している。
加齢黄斑変性症(AMD)は、中心網膜の進行性慢性疾患であり、視力に大きな影響を与える。Lim et al.(2012)Lancet 379:1728。疾患の後期型は、先進工業国において視力低下の主要原因である。40歳以上の白人人口における、早期AMDの罹患率は、6.8%と推定され、進行型AMDでは、1.5%と推定される。de Jong(2006)N.Engl.J.Med.355:1474。後期AMDの罹患率は、年齢と共に激増して、80歳を超えると、11.8%にまで増加する。非滲出性(乾燥)及び滲出性(湿潤)AMDの2種類のAMDが存在する。さらに一般的な乾燥型AMDは、中心網膜(黄斑)の基部にある網膜色素上皮(RPE)の萎縮性及び肥大性変化、ならびにRPE上への蓄積(ドルーゼ)が含まれる。進行型乾燥型AMDは、地図状萎縮(GA)を含む重篤な網膜損傷を引き起こすことがあり得、不可逆的な視力喪失を伴う。さらに、乾燥型AMD患者は、湿潤型へと進行する可能性があり、脈絡膜新生血管膜(CNVM)と呼ばれる異常な血管が網膜の下に生じ、体液と血液が漏出し、最終的には網膜中及び網膜下に失明にいたる円盤状の瘢痕が生じる。
新血管形成(血管新生)を標的としている薬物が湿潤型AMD治療の中核となっている。ラニビズマブは、抗VEGFA抗体断片であり、湿潤型AMDに罹患している患者の視力改善に非常に有効であることが証明されている。最近の研究は、AMDと補体カスケードにおける重要なタンパク質との間に関係があるとされており、乾燥型AMDを治療するために特定の補体要素を標的とする多数の治療法が開発されている。D因子上の非活性部位への結合を介して、D因子と代替補体経路を強力に阻害するヒト化抗D因子Fab断片(野生型aFD、ランパリズマブ、FCFD4514S)が、現在、乾燥型AMDと関連するGAの治療のために臨床開発されている。Katschke et al.(2012)J.Biol.Chem.287:12886.最近の第II相治験は、ランパリズマブの毎月の硝子体内注射が進行型乾燥型AMD患者におけるGA病変の進行を効果的に遅らせたことを示している。
眼は、多数の独自の生物物理学的及び解剖学的特徴を有し、眼球薬物送達をより困難にする。例えば、血液眼球関門は、眼を感染から守るための防御機構であるが、同時に、薬物が、特に後眼部の疾患のための薬物が透過することを困難にする。その結果、有効性を改善するために薬物のその場での生物学的利用能(例えば、眼球滞留時間)を達成及び維持する高用量投与が望ましいことが多い。一方、眼球後部の限られた空間は、送達される薬物の体積を抑制し、次に、薬物が高濃度製剤で送達されることを要求する。
眼疾患を有する患者はまた、治療薬の長期作用性/徐放性送達から利益を得ることもあり得る。より低い投与頻度は、改善された利便性を患者にもたらし、感染率の低下と臨床的有効性の増加という潜在的な利益を有し得る。高用量薬品の制御放出はまた、薬物の副作用を最小限にし得る。長期作用性送達のための2つの有望な系は、PLGA系固体移植物及び移植可能ポート送達系(PDS)である。両方の系が、長期間にわたってほぼゼロ次放出動力学を提供する潜在力を有する。PLGA移植物について、タンパク質薬物が疎水性ポリマーマトリックスにカプセル化され、そのポリマーのゆっくりとした加水分解を介して薬品放出が達成される。その放出速度は、薬物負荷量、ポリマー疎水性、またはポリマー分子量を変えることによって制御され得る。PDSは、硝子体への放出がチタンフリットを含む多孔性金属膜によって制御される再充填可能なデバイスである。そのリザーバーは低容量であるので、高タンパク質濃度が、そのPDSを用いる効果的な送達に必要である。
高濃度及び長期作用性送達に加えて、またはそれらの代わりに、薬物の生物学的利用能(例えば、眼球滞留時間)の上昇が、そのタンパク質薬物が天然または合成ポリマーと共有結合でコンジュゲートされるポリシアル化、HES化(ヒドロキシエチルデンプンとのコンジュゲーション)及びPEG化等の翻訳後修飾によって達成または促進され得る。Chen et al(2011)Expert.Opin.Drug Deliv.8:1221−36、Kontermann(2009)BioDrugs 23:93−109。PEG化は、ポリマーポリエチレングリコール(PEG)のタンパク質への共有結合であり、抗体断片治療薬の半減期の延長に特に有用な確立された技術である。Jevsevar et al.(2010)Biotech.J.5:113−128。
薬物が曝露される状態は、使用される送達系に応じて異なる。固体PLGA移植物については、凍結乾燥薬またはスプレー乾燥薬が使用される。薬物が90℃に近づいている温度に曝露される時間がわずかであるように、移植物は、ホットメルト射出プロセスを用いて生成される。その薬物は放出期間にわたって固体状態のままであるが、PLGAの分解によって低pH環境に曝露され得る。対照的に、PDSで送達される薬物は、液体状態で高濃度に維持され、生理学的イオン強度及びpHにおいて還元的環境として特徴付けられる硝子体に曝露される。
したがって、改善された安定性を有する、好ましくは高濃度製剤及び/または長期作用性送達に適している抗D因子抗体の大きな必要性が存在する。
ランパリズマブは、現在、進行型の乾燥型AMDである地図状萎縮(GA)の治療のために、第III相治験中である。GAにおけるヒト治験は、治療効果がランパリズマブの毎月の硝子体内注射により得られることが示されているが、さらに良好な有効性を達成するためにより高い薬物用量を使用する動機が存在する。さらに、より低い投与頻度は、改善された利便性を患者にもたらし、感染率の低下と臨床的有効性の増加という潜在的な利益を有し得、低進行型の乾燥型AMDの患者の治療を促進し得る。より高い薬物投与または長期間作用型送達に適している改善された溶解性及び化学的安定性を有する抗D因子抗体を開発するために、抗D因子変異体が研究されている。抗D因子変異体は、改善された溶解性及び化学的安定性を有することが確認されている。抗D因子抗体の効果をさらに拡大するために、PEG等のポリオールへのコンジュゲーションが、有益であり得る。改善された溶解性及び化学的安定性を有する抗D因子変異体は、高濃度溶液中のPEGにコンジュゲートされた場合に非常に粘性があることが見出されたが、硝子体内注入にはあまり適さなくなった。本発明者らは、ヒトD因子に対してランパリズマブと同等の親和性、カニクイザルD因子に対して改善された親和性、ならびに改善された溶解性及び化学安定性を有し、かつPEGにコンジュゲートされた場合にあまり粘性がなく、長時間作用型治療剤としてさらに適している、さらなる抗D因子抗体を開発した。
本発明は、改善された抗D因子抗体及びコンジュゲートならびにその使用方法を提供する。
いくつかの実施形態において、D因子に結合する単離抗体であって、(a)アミノ酸配列SYYMY(配列番号15)を含むHVR−H1、(b)アミノ酸配列X4INPX5X6GX7TNFNEKFKS(配列番号111)を含むHVR−H2(式中、X4が、E及びWから選択され、X5が、T及びYから選択され、X6が、N、S、及びQから選択され、X7が、G、D、及びEから選択される)、(c)アミノ酸配列EGGFAY(配列番号25)を含むHVR−H3、(d)アミノ酸配列KASQNVDTDVA(配列番号9)を含むHVR−L1、(e)アミノ酸配列SASSRX1S(配列番号108)を含むHVR−L2(式中、X1が、Y、K、及びRから選択される)、ならびに(f)アミノ酸配列QQYX3NYPLT(配列番号110)を含むHVR−L3(式中、X3が、N及びEから選択される)を含む、抗体が提供される。
いくつかの態様において、抗体は、配列X2SASSRX1S(配列番号109)を含み、式中、X1は、Y、K、及びRから選択され、X2は、Y、R、S、K、及びQから選択される。いくつかの実施形態において、X2は、Rである。他の態様において、X1は、Yである。
いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号16〜24から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号10〜12から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び配列番号13または14のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む。
ある特定の実施形態において、抗体は、
a.配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、
b.配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号20のアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、
c.配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、
d.配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号18のアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、
e.配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号19のアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、
f.配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号21のアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、
g.配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号22のアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、
h.配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号23のアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、
i.配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−L2、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、
j.配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号12のアミノ酸配列を含むHVR−L2、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、
k.配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3、または
l.配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号24のアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、を含む。
a.配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、
b.配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号20のアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、
c.配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、
d.配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号18のアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、
e.配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号19のアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、
f.配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号21のアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、
g.配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号22のアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、
h.配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号23のアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、
i.配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−L2、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、
j.配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号12のアミノ酸配列を含むHVR−L2、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、
k.配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3、または
l.配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号24のアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、を含む。
いくつかの実施形態において、軽鎖の49位のアミノ酸は、アルギニン(R)である。
ある特定の態様において、抗体は、配列番号27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、及び63から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
他の態様において、抗体は、配列番号26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、及び62から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
抗体は、
配列番号35のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号34のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号39のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号38のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号33のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号32のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号45のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号44のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号46のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号49のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号48のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号29のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号28のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号31のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号30のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号37のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号36のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号41のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号40のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号61のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号60のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号43のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号42のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号57のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号56のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号51のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号50のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号53のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号52のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号55のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号59のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
配列番号63のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号62のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含み得る。
配列番号35のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号34のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号39のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号38のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号33のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号32のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号45のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号44のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号46のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号49のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号48のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号29のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号28のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号31のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号30のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号37のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号36のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号41のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号40のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号61のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号60のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号43のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号42のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号57のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号56のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号51のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号50のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号53のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号52のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号55のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
配列番号59のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
配列番号63のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号62のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含み得る。
いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号35のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号34のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むか、または抗体は、配列番号39のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号38のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、もしくはキメラ抗体、またはモノクローナル、ヒト化、及びキメラの任意の組み合わせであり得る。
いくつかの実施形態において、抗体は、D因子に結合する。
ある特定の態様において、抗体は、断片である。いくつかの実施形態において、断片は、Fab断片である。
いくつかの実施形態において、抗体軽鎖は、配列番号112の配列を含む軽鎖定常領域を含む。
いくつかの実施形態において、抗体重鎖は、配列番号113、128〜132、134〜137、及び154〜156から選択される配列を含む重鎖定常領域を含む。
ある特定の態様において、抗体は、
配列番号71、118〜122、及び140〜146から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、ならびに配列番号70のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号75、123〜127、及び147〜153から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、ならびに配列番号74のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号65のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号64のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号65のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号64のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号67のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号66のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号69のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号68のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号73のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号72のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号77のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号76のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号79のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号78のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号81のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号80のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号83のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号82のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号85のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号84のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号87のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号86のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号89のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号88のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号91のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号93のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号92のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号95のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号94のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号97のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号96のアミノ酸配列を含む軽鎖、または
配列番号99のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号98のアミノ酸配列を含む軽鎖、を含む。
配列番号71、118〜122、及び140〜146から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、ならびに配列番号70のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号75、123〜127、及び147〜153から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、ならびに配列番号74のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号65のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号64のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号65のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号64のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号67のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号66のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号69のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号68のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号73のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号72のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号77のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号76のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号79のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号78のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号81のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号80のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号83のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号82のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号85のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号84のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号87のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号86のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号89のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号88のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号91のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号93のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号92のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号95のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号94のアミノ酸配列を含む軽鎖、
配列番号97のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号96のアミノ酸配列を含む軽鎖、または
配列番号99のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号98のアミノ酸配列を含む軽鎖、を含む。
いくつかの態様において、抗体は、
配列番号71、118〜122、及び140〜146から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、ならびに配列番号70のアミノ酸配列を含む軽鎖、または
配列番号75、123〜127、及び147〜153から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、ならびに配列番号74のアミノ酸配列を含む軽鎖、を含む。
配列番号71、118〜122、及び140〜146から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、ならびに配列番号70のアミノ酸配列を含む軽鎖、または
配列番号75、123〜127、及び147〜153から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、ならびに配列番号74のアミノ酸配列を含む軽鎖、を含む。
いくつかの実施形態において、抗体は、操作システインを含む。操作システインは、重鎖内のT110C、A136C、L170C、L175C、T183C、またはT205C変異、ならびに軽鎖内のI106C、R108C、R142C、K149C、及びV205C突然変異から選択され得、残基番号は、Kabat番号付けに従う。
ある特定の態様において、D因子は、配列番号106のアミノ酸配列を含むヒトD因子である。
いくつかの実施形態において、抗体は、カニクイザルD因子に結合する。カニクイザルD因子は、配列番号107のアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの態様において、抗体は、ヒトD因子のKDよりも10倍未満、または7倍未満、または5倍未満、または3倍未満高いKDでカニクイザルD因子に結合する。
本明細書に記載される抗体のうちのいずれかをコードする単離核酸が包含される。核酸を含む宿主細胞が提供される。
いくつかの実施形態において、本発明は、抗体が産生されるように、宿主細胞を培養することを含む、本明細書に開示される抗体のうちのいずれかを産生する方法を包含する。
本明細書に開示される抗体のうちのいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的製剤が、包含される。薬学的に許容される担体は、約5.5〜約8.0のpHを有する緩衝液を含んでもよい。抗体は、少なくとも150mg/ml、少なくとも160mg/ml、少なくとも170mg/ml、少なくとも180mg/ml、少なくとも190mg/ml、少なくとも200mg/ml、または少なくとも210mg/ml、または少なくとも220mg/ml、または少なくとも230mg/ml、または少なくとも240mg/ml、または少なくとも250mg/ml、または少なくとも260mg/ml、または少なくとも270mg/ml、または少なくとも280mg/ml、または少なくとも290mg/ml、または少なくとも300mg/mlの濃度で薬学的製剤中に存在し得る。
抗体は、150mg/ml〜350mg/ml、または150mg/ml〜300mg/ml、または170mg/ml〜300mg/ml、または200mg/ml〜300mg/mlの濃度で薬学的製剤中に存在し得る。
いくつかの実施形態において、薬学的製剤は、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも4週間、少なくとも6週間、少なくとも8週間、少なくとも12週間、少なくとも16週間、少なくとも20週間、少なくとも24週間、または少なくとも28週間、4℃にて保存後に、目に見える沈殿物を含まない。
いくつかの実施形態において、25℃で、組成物の粘度が、30cP未満、25cP未満、20cP未満、15cP未満、または10cP未満である。
いくつかの態様において、組成物中の抗D因子抗体の濃度は、100mg/ml〜300mg/ml、または150mg/ml〜300mg/mlである。
いくつかの実施形態において、薬学的製剤は、狭口径針を通した硝子体内投与に適している。狭口径針は、約30、29、28、27、26、25、24、23、または22ゲージであり得る。
本発明は、1つ以上のポリオールに共有結合している、本明細書に記載される少なくとも1つの抗体を含む、コンジュゲートをさらに含む。いくつかの実施形態において、ポリオールは、多アーム型ポリオールである。いくつかの態様において、コンジュゲートは、多アーム型ポリオールに共有結合している少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、または少なくとも6つの抗体を含む。
コンジュゲートのポリオールは、システインアミノ酸の遊離スルフヒドリル基を通して少なくとも1つの抗体に共有結合し得る。システインアミノ酸は、操作システインであり得る。システインアミノ酸は、抗体の定常領域内にあり得る。システインアミノ酸は、抗体の重鎖または軽鎖のC末端にあり得る。
いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、リジンアミノ酸の遊離アミノ基を通して少なくとも1つの抗体に共有結合しているポリオールを含む。リジンアミノ酸は、抗体の定常領域内にあり得る。リジンアミノ酸は、抗体の重鎖または軽鎖のC末端にあり得る。
いくつかの実施形態において、ポリオールは、二量体、四量体、六量体、及び八量体から選択される多アーム型ポリオールである。
いくつかの態様において、多アーム型ポリオールは、八量体である。
いくつかの実施形態において、ポリオールは、ポリエチレングリコールである。いくつかの態様において、ポリエチレングリコールは、約500D〜約300,000Dの重量平均分子量を有する。他の態様において、ポリエチレングリコールは、約20,000D〜約60,000Dの重量平均分子量を有する。他の態様において、ポリエチレングリコールは、約40,000Dの重量平均分子量を有する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるコンジュゲートは、一般式(Ia)の構造を有するポリエチレングリコールを有し、
式中、各mが、独立して、45〜1000または3〜250または50〜200または100〜250の整数であり、nが、1〜10の整数であり、各R1が、独立して、不在であるか、または連結基であり、各R2が、独立して、水素または末端反応基であり、少なくとも1つのR2が、末端反応基であり、かつ抗D因子抗体または抗体変異体に共有結合している。
式中、各mが、独立して、45〜1000または3〜250または50〜200または100〜250の整数であり、nが、1〜10の整数であり、各R1が、独立して、不在であるか、または連結基であり、各R2が、独立して、水素または末端反応基であり、少なくとも1つのR2が、末端反応基であり、かつ抗D因子抗体または抗体変異体に共有結合している。
いくつかの実施形態において、ポリエチレングリコールは、一般式(Ib)の構造を有し、
(Ib)
式中、各mが、独立して、45〜1000または3〜250または50〜200または100〜250の整数であり、各R1が、独立して、不在であるか、または連結基であり、各R2が、独立して、水素または末端反応基であり、少なくとも1つのR2が、末端反応基であり、かつ抗D因子抗体または抗体変異体に共有結合している。
(Ib)
式中、各mが、独立して、45〜1000または3〜250または50〜200または100〜250の整数であり、各R1が、独立して、不在であるか、または連結基であり、各R2が、独立して、水素または末端反応基であり、少なくとも1つのR2が、末端反応基であり、かつ抗D因子抗体または抗体変異体に共有結合している。
いくつかの実施形態において、ポリエチレングリコールは、一般式(IIa)の構造を有し、
式中、各mが、独立して、45〜1000または3〜250または50〜200または100〜250の整数であり、nが、1〜10の整数であり、各R1が、独立して、不在であるか、または連結基であり、各R2が、独立して、水素または末端反応基であり、少なくとも1つのR2が、末端反応基であり、かつ抗D因子抗体または抗体変異体に共有結合している。いくつかの実施形態において、nは、4である。
式中、各mが、独立して、45〜1000または3〜250または50〜200または100〜250の整数であり、nが、1〜10の整数であり、各R1が、独立して、不在であるか、または連結基であり、各R2が、独立して、水素または末端反応基であり、少なくとも1つのR2が、末端反応基であり、かつ抗D因子抗体または抗体変異体に共有結合している。いくつかの実施形態において、nは、4である。
いくつかの態様において、ポリエチレングリコールは、一般式(IIIa)の構造を有し、
式中、各mが、独立して、45〜1000または3〜250または50〜200または100〜250の整数であり、nが、1〜10の整数であり、各R1が、独立して、不在であるか、または連結基であり、各R2が、独立して、水素または末端反応基であり、少なくとも1つのR2が、末端反応基であり、かつ抗D因子抗体または抗体変異体に共有結合している。いくつかの実施形態において、nは、4である。
式中、各mが、独立して、45〜1000または3〜250または50〜200または100〜250の整数であり、nが、1〜10の整数であり、各R1が、独立して、不在であるか、または連結基であり、各R2が、独立して、水素または末端反応基であり、少なくとも1つのR2が、末端反応基であり、かつ抗D因子抗体または抗体変異体に共有結合している。いくつかの実施形態において、nは、4である。
いくつかの態様において、ポリエチレングリコールは、一般式(IVa)の構造を有し、
式中、各mが、独立して、45〜1000または3〜250または50〜200または100〜250の整数であり、各R1が、独立して、不在であるか、または連結基であり、各R2が、独立して、水素または末端反応基であり、少なくとも1つのR2が、末端反応基であり、かつ抗D因子抗体または抗体変異体に共有結合している。いくつかの実施形態において、mは、50〜200の整数である。他の実施形態において、mは、100〜150の整数である。
式中、各mが、独立して、45〜1000または3〜250または50〜200または100〜250の整数であり、各R1が、独立して、不在であるか、または連結基であり、各R2が、独立して、水素または末端反応基であり、少なくとも1つのR2が、末端反応基であり、かつ抗D因子抗体または抗体変異体に共有結合している。いくつかの実施形態において、mは、50〜200の整数である。他の実施形態において、mは、100〜150の整数である。
いくつかの実施形態において、少なくとも1つのR1は、連結基であり、式中、R1及びR2が、1つにまとめると、
ならびにこれらの組み合わせから選択され、式中、各iが、独立して、0〜10の整数であり、jが、0〜10の整数である。
ならびにこれらの組み合わせから選択され、式中、各iが、独立して、0〜10の整数であり、jが、0〜10の整数である。
いくつかの実施形態において、R2が、独立して、チオール反応基、アミノ反応基、及びこれらの組み合わせから選択される。
いくつかの実施形態において、各R2が、独立して、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフルオロメタンスルホネート、トシレート、アジリジン、エポキシド、ピリジルジスルフィド、スクシンイミジルエステル、−NH2、アルデヒド、ハロアセテート、ハロアセトアミド、及びパラ−ニトロフェニルカルボネートから選択される。
いくつかの態様において、R2は、マレイミドである。
いくつかの実施形態において、R2基のうちの少なくとも7つは、抗D因子抗体または抗体変異体のうちの1つに共有結合している。
いくつかの実施形態において、R2基のうちの少なくとも8つは、抗D因子抗体または抗体変異体のうちの1つに共有結合している。
いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、本明細書に記載される少なくとも1つの抗体を多アーム型ポリオールに共有結合することによって調製される。
本明細書に記載されるコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む薬学的製剤が、包含される。抗体の濃度は、少なくとも100mg/ml、または少なくとも150mg/ml、または少なくとも200mg/ml、または少なくとも300mg/mlである。他の実施形態において、抗D因子抗体または抗体変異体の濃度は、約50mg/ml〜約300mg/mlである。
いくつかの実施形態において、25℃で、薬学的製剤または組成物の粘度は、1000cP未満、900cP未満、800cP未満、700cP未満、600cP未満、500cP未満、400cP未満、または300cP未満である。
いくつかの実施形態において、製剤または組成物中の抗D因子抗体の濃度は、少なくとも100mg/mlまたは少なくとも150mg/mlである。
本明細書に記載される薬学的製剤を含む眼内送達のための送達デバイス、及び製剤を患者の硝子体内に送達するための手段も、包含される。
いくつかの実施形態において、送達デバイス製剤は、その場で長期間効果を持続する。
いくつかの実施形態において、対象に、有効量の、本明細書に記載される抗体、コンジュゲート、または薬学的製剤を投与することを含む、対象における補体媒介性障害を治療する方法が、包含される。
いくつかの実施形態において、補体媒介性障害は、全身性である。
別の実施形態において、補体媒介性障害は、補体関連の眼の症状である。
いくつかの態様において、補体関連の眼の症状は、乾燥及び湿潤(非滲出性及び滲出性)型を含む加齢性黄斑変性症(AMD)、脈絡膜血管新生(CNV)、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、虚血関連網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症(CRVO)、角膜血管新生、及び網膜血管新生から選択される。
いくつかの実施形態において、補体関連の眼の症状は、中期乾燥型AMDまたは地図状萎縮(GA)から選択される。
いくつかの態様において、本方法は、移植可能ポート送達系を用いて、当該抗体、コンジュゲート、または薬学的製剤を投与することを含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、硝子体内投与によって、当該抗体、コンジュゲート、または薬学的製剤を投与することを含む。硝子体内投与は、狭口径針を通す投与であり得る。いくつかの実施形態において、狭口径針は、約30、29、28、27、26、25、24、23、または22ゲージである。
いくつかの態様において、追加の治療剤を個体に投与することをさらに含む治療する方法。いくつかの実施形態において、追加の治療剤は、ANG2拮抗薬、TIE2拮抗薬、VEGF拮抗薬、及び第2の補体成分拮抗薬から選択される。
いくつかの実施形態において、追加の治療剤は、抗ANG2抗体である。
他の実施形態において、追加の治療剤は、抗TIE2抗体である。
いくつかの態様において、追加の治療剤は、VEGFトラップ及び抗VEGF抗体から選択される。
他の態様において、追加の治療剤は、第2の補体成分拮抗薬であり、当該第2の補体成分拮抗薬は、C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、及びC9から選択される補体成分を阻害する。
対象における補体媒介性障害を治療するための薬剤の調製のために、本明細書に記載される抗体またはコンジュゲートの使用が、包含される。いくつかの実施形態において、補体媒介性障害は、補体関連の眼の症状である。他の実施形態において、補体媒介性障害は、全身性である。いくつかの態様において、補体関連の眼の症状は、乾燥及び湿潤(非滲出性及び滲出性)型を含む加齢性黄斑変性症(AMD)、脈絡膜血管新生(CNV)、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、虚血関連網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症(CRVO)、角膜血管新生、及び網膜血管新生から選択される。補体関連の眼の症状は、中期乾燥型AMDまたは地図状萎縮(GA)から選択され得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載される抗体またはコンジュゲートは、治療法で用いるためのものである。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体またはコンジュゲートは、対象における補体媒介性障害を治療する方法で用いるためのものである。
いくつかの実施形態において、抗体、コンジュゲート、または製剤は、対象における全身性補体媒介性障害を治療する方法で用いるためのものである。いくつかの実施形態において、補体媒介性障害は、補体関連の眼の症状である。いくつかの態様において、補体関連の眼の症状は、乾燥及び湿潤(非滲出性及び滲出性)型を含む加齢性黄斑変性症(AMD)、脈絡膜血管新生(CNV)、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、虚血関連網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症(CRVO)、角膜血管新生、及び網膜血管新生から選択される。いくつかの実施形態において、補体関連の眼の症状は、中期乾燥型AMDまたは地図状萎縮(GA)から選択される。
これより本発明のある特定の実施形態を詳細に参照するが、それらの例は、添付の構造及び式に例示されている。本発明は、列挙される実施形態と併せて説明されるが、それらは、本発明をこれらの実施形態に限定することを意図するものではないことを理解されたい。反対に、本発明は、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に含まれ得る、全ての代替例、修正、及び均等物を網羅することを意図するものである。当業者であれば、本発明の実施に使用することができる、本明細書に記載されるものに類似または同等である多数の方法及び材料を理解するであろう。本発明は、決して記載される方法及び材料に限定されるものではない。
本開示全体で引用される全ての参照文献は、参照によりそれら全体が本明細書に明示的に組み込まれる。組み込まれる文献、特許、及び同様の資料のうちの1つ以上が、本出願(定義される用語、用語の用法、記載される技法等を含むがそれらに限定されない)と異なるか、または矛盾する場合は、本出願が優先される。
I.定義
「comprise(含む)」、「comprising(含むこと)」、「include(含む)」、「including(含むこと)」、及び「includes(含む)」という語は、本明細書及び特許請求の範囲内で使用される場合、述べられる特徴、整数、成分、または工程の存在を特定することを意図するものであるが、それらは、1つ以上の他の特徴、整数、成分、工程、またはそれらの群の存在または追加を排除するものではない。
「comprise(含む)」、「comprising(含むこと)」、「include(含む)」、「including(含むこと)」、及び「includes(含む)」という語は、本明細書及び特許請求の範囲内で使用される場合、述べられる特徴、整数、成分、または工程の存在を特定することを意図するものであるが、それらは、1つ以上の他の特徴、整数、成分、工程、またはそれらの群の存在または追加を排除するものではない。
本明細書の目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下に定義される、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する、軽鎖可変ドメイン(VL)フレームワークまたは重鎖可変ドメイン(VH)フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含み得るか、またはそれは、アミノ酸配列変化を含有し得る。いくつかの実施形態において、アミノ酸変化の数は、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下、または2以下である。いくつかの実施形態において、VLアクセプターヒトフレームワークの配列は、VLヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
「親和性」とは、分子(例えば、抗体)とその結合パートナー(例えば、抗原)との単一結合部位の間の非共有結合相互作用の合計の強度を指す。別途示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」とは、結合対のメンバー(例えば、抗体及び抗原)間の1:1の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子XのそのパートナーYに対する親和性は、一般に、解離定数(Kd)で表され得る。親和性は、本明細書に記載される方法を含む当該技術分野で既知の一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例証的かつ例示的な実施形態が、以下に記載される。
「親和性成熟」抗体とは、改変を有しない親抗体と比較して、1つ以上の超可変領域(HVR)に1つ以上の改変を有し、かかる改変により抗体の抗原に対する親和性が改善される抗体を指す。
「抗D因子抗体」、「aFD抗体」、「AFD.Ab」、及び「D因子に結合する抗体」という用語は、抗体がD因子の標的化において診断薬及び/または治療剤として有用になるように十分な親和性でD因子に結合することができる抗体を指す。いくつかの実施形態において、抗D因子抗体が非関連非D因子タンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ(RIA)によって測定される、抗体のD因子への結合の約10%未満である。ある特定の実施形態において、D因子に結合する抗体は、1μM以下、100nM以下、10nM以下、5nm以下、4nM以下、3nM以下、2nM以下、1nM以下、0.1nM以下、0.01nM以下、または0.001nM以下(例えば、10−8M以下、例えば、10−8M〜10−13M、例えば、10−9M〜10−13M)の解離定数(Kd)を有する。ある特定の実施形態において、抗D因子抗体は、異なる種からのD因子間で保存されるD因子のエピトープに結合する。抗D因子抗体としては、AFD.v#変異体及びhu20D12.v#変異体が挙げられるが、これらに限定されず、#は特定の変異体を特定するために使用される数である。
「抗体」という用語は、本明細書で最も広義に使用され、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、及び抗体断片を含むが、これらに限定されない、種々の抗体構造を包含する。
「抗体断片」は、無傷抗体の一部分を含み、無傷抗体が結合する抗原に結合する、無傷抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、Fv、Fab、Fab−SH、Fab’−SH、Fab’、Fab−C、Fab’−C、Fab’−C−SH、Fab−C−SH、scFv、ダイアボディ、またはF(ab’)2;ダイアボディ;線状抗体;単鎖抗体分子(例えばscFv);及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「Fab」は、CH1ドメイン、または軽鎖定常領域でジスルフィド結合を形成するために十分なCH1ドメインの一部を含むが、CH2ドメインまたはCH3ドメインを含まない、重鎖定常領域を含む抗体を指す。本明細書で使用される場合、Fabは、ヒンジ領域の1つ以上のアミノ酸を含み得る。それ故に、本明細書で使用される場合、「Fab」という用語は、Fab’抗体を包含する。Fabは、C末端システイン等のさらなる非天然アミノ酸を含み得、この場合、それは、Fab−Cと称され得る。以下に論じられるように、Fab−Cという用語はまた、C末端で天然システインを含む、ヒンジ領域の天然アミノ酸を含むFabも包含する。いくつかの実施形態において、Fabは、操作システインを含む(すなわち、Fabは、THIOMABであり得る)。
「Fab−C」は、C末端システインを含むFabを指し、これは、その残基位置で生じる天然システイン(ヒンジ領域からのシステイン等)であり得るか、または天然システインに対応しないC末端に付加されたシステインであり得る。抗D因子抗体としては、AFD.C抗体及びhu20D12.C抗体が挙げられるが、これらに限定されず、「C」は、抗体がC末端システインを含むFabであることを示す。非限定的な例示のFab−C重鎖定常領域には、配列番号129、130、132、154、155、156、157、及び158の配列が含まれる。
「Fab−SH」は、遊離チオール基を有するFabを指す。いくつかの実施形態において、遊離チオール基は、FabのC末端の最後の10のアミノ酸に位置している。Fab−C抗体はまた、典型的には、Fab−SH抗体である。配列番号131のアミノ酸配列を有するさらに非限定的な例示のFab−SH重鎖定常領域。典型的には、操作システインを含むFab(すなわち、THIOMABであるFab)は、Fab−SHである。
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいて、参照抗体のその抗原への結合を50%以上遮断する抗体、及び逆に、競合アッセイにおいて、抗体のその抗原への結合を50%以上遮断する参照抗体を指す。例示的な競合アッセイが本明細書に提供される。
「補体関連障害」という用語は、最も広義に使用され、過度のまたは制御されていない補体活性化と関連する障害を含む。それらは、心肺バイパス手術中の補体活性化;急性心筋梗塞、動脈瘤、卒中、出血性ショック、圧挫外傷、多臓器不全、循環血液量減少性ショック、腸虚血、または虚血を生じる他の事象後の虚血再灌流のための補体活性化を含む。補体活性化はまた、炎症性症状、例えば、重度の熱傷、内毒素血症、敗血症性ショック、成人性呼吸促迫症候群、血液透析等の炎症状態;アナフィラキシーショック、重度の喘息、血管性浮腫、クローン病、鎌状赤血球貧血、レンサ球菌感染後糸球体腎炎、及び膵炎と関連することも示されている。障害は、薬物の副作用、薬物アレルギー、IL−2誘導性血管漏出症候群、またはX線撮影造影剤アレルギーの結果であり得る。それはまた、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、リウマチ性関節炎、アルツハイマー病、及び多発性硬化症のような自己免疫疾患も含む。補体活性化はまた、移植片拒絶とも関連する。補体活性化はまた、眼疾患、例えば、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、及び他の虚血関連網膜症、脈絡膜血管新生(CNV)、ブドウ膜炎、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症(CRVO)、角膜血管新生、及び網膜血管新生とも関連する。
「補体関連の眼の症状」という用語は、最も広義に使用され、全ての眼の症状を含み、この病理学は、補体を含み、古典的かつ代替経路、具体的には、補体の代替経路を含む。補体関連の眼の症状としては、乾燥及び湿潤(非滲出性及び滲出性)型を含む加齢性黄斑変性症(AMD)の全ての病期、脈絡膜血管新生(CNV)、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症及び他の虚血関連網膜症のような、黄斑変性疾患、ならびに糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症(CRVO)、角膜血管新生、及び網膜血管新生のような他の眼内血管新生性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。一例において、補体関連の眼の症状には、非滲出性(例えば、中期乾燥型AMDまたは地図状萎縮(GA))及び滲出性(例えば、湿潤型AMD(脈絡膜血管新生(CNV))AMD、糖尿病性網膜症(DR)、眼内炎、及びブドウ膜炎を含む、加齢性黄斑変性症(AMD)が含まれる。さらなる例において、非滲出性AMDは、硬性ドルーゼ、軟性ドルーゼ、地図状萎縮、及び/または色素クランピングの存在を含み得る。一例において、補体関連の眼の症状には、早期AMD(例えば、複数の小型から1つ以上の広範囲に及ばない中型ドルーゼを含む)、中期AMD(例えば、広範囲に及ぶ中型ドルーゼから1つ以上の大型ドルーゼを含む)、及び進行型AMD(例えば、地図状萎縮または進行型湿潤型AMD(CNV)を含む、加齢性黄斑変性症(AMD)が含まれる(Ferris et al.,AREDS Report No.18、Sallo et al.,Eye Res.,34(3):238−40(2009)、Jager et al.,New Engl.J.Med.,359(1):1735(2008))。さらなる例において、中期乾燥型AMDは、大きなコンフルエントなドルーゼを含み得る。さらなる例において、地図状萎縮は、光受容体及び/または網膜色素上皮(RPE)の喪失を含み得る。さらなる例において、地図状萎縮の領域は、小さくても大きくてもよく、及び/または黄斑領域内もしくは周辺網膜内にあり得る。一例において、補体関連の眼の症状は、中期乾燥型AMDである。一例において、補体関連の眼の症状は、地図状萎縮である。一例において、補体関連の眼の症状は、湿潤型AMD(脈絡膜血管新生(CNV))である。
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び/または軽鎖の一部が特定の源または種に由来し、一方で重鎖及び/または軽鎖の残りが異なる源または種に由来する抗体を指す。
抗体の「クラス」は、その重鎖によって保有される定常ドメインまたは定常領域の型を指す。5つの主要なクラスの抗体IgA、IgD、IgE、IgG、及びIgMが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2にさらに分類され得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
「ポリオール」という用語は、概して、本明細書で使用される場合、多価アルコール化合物を指す。ポリオールは、例えば、任意の水溶性ポリ(アルキレンオキシド)ポリマーであり得、直鎖または分岐鎖を有し得る。好ましいポリオールには、1つ以上のヒドロキシル位置に化学基、例えば1〜4個の炭素を有するアルキル基が置換されているものが含まれる。典型的には、ポリオールは、ポリ(アルキレングリコール)、好ましくはポリエチレングリコール(PEG)である。しかしながら、当業者であれば、他のポリオール、例えば、ポリ(プロピレングリコール)及びポリエチレン−ポリプロピレングリコールコポリマーを、PEGについて本明細書に記載されるコンジュゲートのための技術を使用して用いることができることが理解されよう。本開示のポリオールには、当該技術分野で公知であるもの及び公的に入手可能なもの、例えば商業的に利用可能な供給源からのものが含まれる。
「コンジュゲート」という用語は、本明細書ではその最も広い定義で使用され、共に接合(joined)または結合(linked)されていることを意味する。分子は、接合されているように作用または機能する場合、「コンジュゲート」されている。特定の実施形態において、「コンジュゲート」は、多アーム型ポリオールに共有結合している抗体(例えば、本明細書に詳述される、抗体断片)を指す。
「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより異なる抗体のFc領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、C1q結合及び補体依存性細胞傷害(CDC)、Fc受容体結合、抗体依存性細胞媒介細胞傷害(ADCC)、食作用、細胞表面受容体(例えば、B細胞受容体)の下方調節、及びB細胞の活性化が挙げられる。
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」とは、標的疾患または症状、例えば、補体関連の眼の症状等、例えば、病理において、必要な投与量で必要な期間にわたって、測定可能な改善などの所望の治療または予防結果を達成するのに有効な量を指す。
「エピトープ」という用語は、抗体が結合する抗原分子上の特定の部位を指す。
「フレームワーク」または「FR」とは、超可変領域(HVR)残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのFRは、一般に、4つのFRドメイン:FR1、FR2、FR3、及びFR4からなる。したがって、HVR及びFR配列は、一般に、VH(またはVL)において次の配列:FR1−H1(L1)−FR2−H2(L2)−FR3−H3(L3)−FR4で出現する。
「完全長抗体」、「無傷抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書で、天然抗体構造と実質的に同様の構造を有するか、または本明細書に定義されるFc領域を含有する重鎖を有する抗体を指すように同義に使用される。
「D因子のグリコシル化型」という用語は、炭水化物残基の付加によって翻訳後修飾されている、D因子の自然発生型を指す。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は、同義に使用され、外因性核酸が中に導入されている細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞及び継代の数に関わらずそれに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸含有量が親細胞と完全に同一ではない場合があるが、突然変異を含み得る。最初に形質転換された細胞についてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物活性を有する変異子孫が、本明細書に含まれる。
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生された抗体、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンVLまたはVHフレームワーク配列の選択において最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンVLまたはVH配列の選択は、可変ドメイン配列の下位群からである。一般に、配列の下位群は、Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,NIH Publication 91−3242,Bethesda MD(1991),vols.1−3にあるような下位群である。いくつかの実施形態において、VLの場合、下位群は、Kabat et al.(上記参照)に見られるような下位群カッパIである。いくつかの実施形態において、VHの場合、下位群は、Kabat et al.(上記参照)に見られるような下位群IIIである。
「ヒト化」抗体は、非ヒトHVRからのアミノ酸残基及びヒトFRからのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある特定の実施形態において、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含み、そのHVR(例えば、CDR)の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、FRの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化型」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
本明細書で使用される「超可変領域」または「HVR」という用語は、配列中で超可変であり、及び/または構造的に定義されたループ(「超可変ループ」)を形成する、抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般に、天然4本鎖抗体は、6つのHVRを含み、3つはVH(H1、H2、H3)中にあり、3つはVL(L1、L2、L3)中にある。HVRは、一般に、超可変ループ及び/または「相補性決定領域」(CDR)からのアミノ酸残基を含み、後者は、最も高い配列可変性を有し、及び/または抗原認識に関与する。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基26〜32(L1)、50〜52(L2)、91〜96(L3)、26〜32(H1)、53〜55(H2)、及び96〜101(H3)において生じる(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901−917(1987)。)例示的なCDR(CDR−L1、CDR−L2、CDR−L3、CDR−H1、CDR−H2、及びCDR−H3)は、アミノ酸残基L1の24〜34、L2の50〜56、L3の89〜97、H1の31〜35B、H2の50〜65、及びH3の95〜102において生じる(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)。)VH内のCDR1を除いて、CDRは、一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。CDRは、抗原と接触する残基である「特異性決定残基」または「SDR」も含む。SDRは、短縮(abbreviated)−CDR、またはa−CDRと呼ばれるCDRの領域内に収容される。例示的なCDR(CDR−L1、CDR−L2、CDR−L3、CDR−H1、CDR−H2、及びCDR−H3)は、アミノ酸残基31〜34(L1)、50〜55(L2)、89〜96(L3)、31〜35B(H1)、50〜58(H2)、及び95〜102(H3)に生じる。(Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619−1633(2008)を参照のこと。)別途指示されない限り、可変ドメイン(例えば、FR残基)におけるHVR残基及び他の残基は、本明細書において上記のKabat et al.に従って番号付けされる。
抗体を含むタンパク質は、無傷立体配座構造及び生物学的活性を本質的に保持する場合に、「安定している」と言われる。タンパク質安定性を測定するための様々な分析技術が当該技術分野で利用可能であり、例えば、Peptide and Protein Drug Delivery,247−301,Vincent Lee Ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)及びJones(1993)Adv.Drug Delivery Rev.10:29−90において概説されている。「改善された安定性」を有する抗体変異体は、出発参照抗体と比較してより安定的な抗体変異体を指す。好ましくは、改善された安定性を有する抗体変異体は、物理的安定性及び/または化学的安定性及び/または生物学的活性の改善、及び/または天然抗体の免疫原性の低減を目的として特定のアミノ酸残基が変更されている天然(野生型)抗体の変異体である。Walsh(2000)Nat.Biotech.18:831−3。
「異性化」という用語は、一般的に、化学化合物がその異性体型、すなわち、同じ化学的組成を有しているが異なる構造または構成を有しており、したがって、一般的に異なる物理的及び化学的特性を有している型のうちのいずれかに変換される化学的過程を指す。具体的には、ポリペプチドの1つ以上のアスパラギン酸(DまたはAsp)残基(複数可)がイソアスパラギン酸残基(複数可)に変換されている過程であるアスパラギン酸異性化が本明細書において使用される。Geiger and Clarke(1987)J.Biol.Chem.262:785−94。
「脱アミド」という用語は、一般に、有機化合物からアミド官能基が除去される化学反応を指す。具体的には、ポリペプチドの1つ以上のアスパラギン(NまたはAsn)残基(複数可)がアスパラギン酸(DまたはAsp)に転換されている過程、すなわち、中性アミド側鎖が全体的に酸性の特性を有する残基に転換されている過程であるアスパラギン脱アミド化が本明細書において使用される。Xie and Schowen(1999)J.Pharm.Sci.88:8−13。
「コンジュゲート」は、ポリオールを含むがこれに限定されない、1つ以上の異種分子(複数可)にコンジュゲートされる抗体である。
「患者」または「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、家畜(例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ)、霊長類(例えば、ヒト、及びサル等の非ヒト霊長類)、ウサギ、及び齧歯類(例えば、マウス及びラット)が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、患者、個体、または対象は、ヒトである。
「単剤療法」とは、一連の治療期間中に、例えば、補体関連の眼の症状等の標的疾患または症状の治療のために単一治療剤のみを含む治療レジメンを意味する。
「維持療法」とは、疾患再発または進行の可能性を低減するために付与される治療レジメンを意味する。維持療法は、対象の寿命までの長期間を含む、任意の期間にわたって提供され得る。維持療法は、初期療法後に提供されるか、または初期療法もしくは追加療法と併せて提供され得る。維持療法に使用される投薬量は異なる場合があり、他の種類の療法に使用される投薬量と比較して低減した投薬量を含み得る。
「単離抗体」は、その天然環境の構成成分から分離された抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、例えば、電気泳動法(例えば、SDS−PAGE、等電点電気泳動(IEF)、キャピラリー電気泳動)、またはクロマトグラフ法(例えば、イオン交換または逆相HPLC)によって決定される場合、95%または99%を超える純度まで精製される。抗体純度の評価のための方法の概説に関して、例えばFlatman et al.,J.Chromatogr.B 848:79−87(2007)を参照のこと。
「単離核酸」は、その天然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、通常は核酸分子を含有する細胞内に含有される核酸分子を含むが、その核酸分子が染色体外に、またはその天然染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
「抗D因子抗体をコードする単離核酸」とは、抗体重鎖及び軽鎖(またはそれらの断片)をコードする1つ以上の核酸分子を指し、単一のベクターまたは別個のベクター内のかかる核酸分子(複数可)を含み、かかる核酸分子(複数可)は、宿主細胞内の1つ以上の場所に存在する。
本明細書で使用される、「D因子」及び「fD」及び「FD」という用語は、細胞内のD因子前駆体タンパク質の処理からもたらされる任意の天然の成熟D因子を指す。この用語には、別途指定されない限り、霊長類(例えば、ヒト及びカニクイザル)及び齧歯類(例えば、マウス及びラット)等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源からのD因子が含まれる。この用語はまた、D因子の自然発生変異体、例えば、スプライス変異体または対立遺伝子変異体も含む。例示のヒトD因子のプレプロペプチドのアミノ酸配列を、配列番号104に示す。例示的な成熟ヒトD因子のアミノ酸配列は、配列番号104(配列番号106)のアミノ酸26〜253である。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団を含む個々の抗体は、同一であり、及び/または同じエピトープに結合するが、例えば、天然に存在する突然変異を含有するか、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に発生する可能な変異型抗体を除き、かかる変異体は、一般的に、少量で存在する。異なる決定基(エピトープ)に対して指向される異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体の集団から得られるときの抗体の特徴を示しており、いかなる特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない、多様な技法によって作製されてもよく、モノクローナル抗体を作製するためのかかる方法及び他の例示的な方法が、本明細書に記載されている。
「裸の抗体」は、異種性部分(例えば、細胞傷害性部分)または放射標識に複合されていない抗体を指す。裸の抗体は、薬学的製剤中に存在してもよい。
「天然抗体」とは、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然IgG抗体は、ジスルフィド結合されている2つの同一の軽鎖及び2つの同一の重鎖から構成される、約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。N末端からC末端まで、各重鎖は、可変重ドメイン(variable heavy domain)または重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(VH)と、その後に3つの定常ドメイン(CH1、CH2、及びCH3)とを有する。同様に、N末端からC末端まで、各軽鎖は、可変軽ドメイン(variable light domain)または軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(VL)と、その後に定常軽(CL)ドメインとを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる2つの型うちの1つに割り当てられ得る。
「バイアル」は、液体または凍結乾燥調製物を保有するのに好適な容器である。いくつかの実施形態において、バイアルは、単回使用バイアル、例えば、栓を有する20ccの単回使用バイアルである。
「ポート送達系」または「PDS」は、長期間にわたって治療剤の送達を可能にする詰め替え可能なリザーバーを用いる眼用の移植可能なデバイスである。リザーバー及び眼への薬物放出の速度を決定する放出制御要素と連通するリフィルポートを有する移植が、行われる。例えば、米国特許公開第2010/0174272号、同第8,277,830号、同第8,399,006号、同第8,795,712号、及び同第8,808,727号を参照のこと。
「小穴針」は、30ゲージ針等の約30、29、28、27、26、25、24、23、または22ゲージもしくはそれ以上の液体成分の注射用針を指す。いくつかの実施形態において、小穴針は、標準サイズの壁を有する。別の実施形態において、小穴針は、粘性溶液に好ましくあり得る、薄壁を有する。
「添付文書」という用語は、かかる治療薬の適応症、使用法、投薬量、投与、併用療法、禁忌症についての情報、及び/またはその使用に関する警告を含有する、治療剤製品の市販パッケージに通例含まれる指示書を指すように使用される。
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント(%)」は、いずれの保存的置換も配列同一性の一部として考慮しない、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して、最大配列同一性パーセントを達成した後の、参照ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一の候補配列におけるアミノ酸残基の割合と定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するための整列は、当該技術分野の技術範囲内の様々な方法で、例えば、BLAST、BLAST−2、ALIGN、またはMegalign(DNASTAR)ソフトウェア等の公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成され得る。当業者であれば、比較される配列の全長にわたる最大整列を達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、配列の整列に適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のために、アミノ酸配列同一性%値は、配列比較コンピュータプログラムALIGN−2を使用して生成される。ALIGN−2配列比較コンピュータプログラムは、Genentech,Inc.が作成したものであり、ソースコードは、米国著作権局(Washington D.C.,20559)においてユーザ文書と共に申請されており、これは、米国著作権登録番号TXU510087として登録されている。ALIGN−2プログラムは、Genentech,Inc.(South San Francisco,California)から公的に入手可能であり、またはソースコードからコンパイルされ得る。ALIGN−2プログラムは、デジタルUNIX V4.0Dを含むUNIXオペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ALIGN−2プログラムによって設定されており、変動しない。
ALIGN−2がアミノ酸配列比較に用いられる状況下で、所与のアミノ酸配列Bへの、それとの、またはそれに対する所与のアミノ酸配列Aのアミノ酸配列同一性%(代替的に、所与のアミノ酸配列Bへの、それとの、またはそれに対するある特定のアミノ酸配列同一性%を有するか、または含む所与のアミノ酸配列Aと表現され得る)は、以下のように計算される:
100×分数X/Y
式中、Xは、配列整列プログラムALIGN−2によってそのプログラムのAとBとの整列において完全な一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Yは、Bにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、AのBに対するアミノ酸配列同一性%は、BのAに対するアミノ酸配列同一性%とは等しくないことが理解される。別途具体的に示されない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性%値は、直前の段落に記載されるようにALIGN−2コンピュータプログラムを使用して得られる。
100×分数X/Y
式中、Xは、配列整列プログラムALIGN−2によってそのプログラムのAとBとの整列において完全な一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Yは、Bにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、AのBに対するアミノ酸配列同一性%は、BのAに対するアミノ酸配列同一性%とは等しくないことが理解される。別途具体的に示されない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性%値は、直前の段落に記載されるようにALIGN−2コンピュータプログラムを使用して得られる。
「薬学的製剤」という用語は、調製物の中に含有される活性成分の生物学的活性が有効になるような形態であり、かつ製剤が投与される対象にとって許容できないほど有毒である追加の構成成分を何ら含有しない調製物を指す。
「薬学的に許容される担体」は、対象にとって無毒である、活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝液、賦形剤、安定剤、または保存剤が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「治療」(及び「治療する」または「治療すること」等のその文法上の変形)とは、治療されている個体の自然経過を変更することを目的とした臨床介入を指し、予防のために、または臨床病理過程中に実施され得る。治療の望ましい効果には、疾患の発生または再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的病理学的帰結の縮小、疾患進行速度の減少、病状の回復または寛解、及び緩解または予後の改善が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の抗体を使用して、疾患の発達を遅延させるか、または疾患の進行を減速させる。免疫関連疾患の治療では、治療剤は、直接的に免疫反応の成分の反応の大きさを変え、または他の治療剤、例えば、抗生物質、抗真菌剤、抗炎症剤、化学療法剤等による治療に対する疾患に対してより敏感にすることができる。
補体関連の眼の症状等の疾患の「病理」には、患者の健康状態を損なう全ての現象が含まれる。これには、異常または無制御の細胞増殖(好中球、好酸球、単球、リンパ球細胞)、抗体産生、自己抗体産生、補体産生、隣接する細胞の正常な機能の妨害、異常なレベルでのサイトカインまたは他の分泌性産物の放出、任意の炎症応答または免疫応答の抑制または悪化、炎症細胞(好中球、好酸球、単球、リンパ球)の細胞空間への浸潤等が含まれるが、これらに限定されない。
1つ以上のさらなる治療薬剤と「組み合わせた」投与は、同時(同時期)及び任意の順序の連続した投与を含む。
1つ以上の他の薬物と「同時に」投与される薬物は、同一治療サイクル中、1つ以上の他の薬物と同じ治療日に、任意に1つ以上の他の薬物と同じ時間に投与される。
「治療上有効量」は、標的疾患または症状、例えば、補体関連の眼の症状等の症状、例えば、病理において測定可能な改善を達成するのに必要なD因子拮抗薬の量である。
「長期間作用型送達」、「持続放出」、及び「制御放出」という用語は、一般的に、治療薬物の長期または持続性の放出または生物学的利用能を達成するために製剤、剤形、デバイスまたは他の種類の技術を使用する送達機構を説明するために使用される。その用語は、全身循環または対象に対して、または細胞、組織、器官、関節、領域等を含むが、これらに限定されない、対象における局所的作用部位に対して薬物の長期または持続性の放出または生物学的利用能を提供する技術を指す。さらに、これらの用語は、製剤または剤形からの薬物の放出を長期化または延長するために使用される技術を指してもよく、またはそれらは、対象に対する薬物の生物学的利用能または薬物動態または作用期間を延長または長期化するために使用される技術を指してもよく、またはそれらは、製剤によって引き出される薬力学効果を延長または長期化するために使用される技術を指してもよい。「長期作用性製剤」、「持続放出性製剤」、または「制御放出製剤」は、長期作用性送達をもたらすために使用される薬学的製剤、剤形、または他の技術である。いくつかの実施形態において、制御放出は、薬物の局所的生物学的利用能、眼球送達の文脈においては具体的に眼球滞留時間を改善するために用いられる。「眼球滞留時間の増加」は、送達された眼内薬物が質の点(活性)でも量の点(有効量)でも有効であり続ける送達後の期間を指す。高用量及び制御放出に加えて、またはその代わりに、インビボ半減期の増加を達成するためにPEG化等を介して翻訳後に薬物を修飾することができる。
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン(それぞれ、VH及びVL)は、一般に類似の構造を有し、各ドメインが4つの保存フレームワーク領域(FR)及び3つの超可変領域(HVR)を含む。(例えば、Kindt et al.Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,page 91(2007)を参照のこと)。単一のVHドメインまたはVLドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、VHドメインまたはVLドメインを使用して抗原に結合する抗体から単離されて、それぞれ、相補的VLドメインまたはVHドメインのライブラリーをスクリーニングすることができる。例えば、Portolano et al.,J.Immunol.150:880−887(1993)、Clarkson et al.,Nature 352:624−628(1991)を参照のこと。
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それが結合している別の核酸を運搬することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、及びそれが導入される宿主細胞のゲノム内に組み込まれたベクターを含む。ある特定のベクターは、それらが作動可能に結合している核酸の発現を誘導することができる。かかるベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称される。
II.組成物及び方法
いくつかの実施形態において、本発明は、部分的に、D因子に結合する抗体及びかかる抗体を含むコンジュゲートに基づく。本発明の抗体及びコンジュゲートは、例えば、補体関連の眼の症状等の補体関連障害の治療に有用である。
いくつかの実施形態において、本発明は、部分的に、D因子に結合する抗体及びかかる抗体を含むコンジュゲートに基づく。本発明の抗体及びコンジュゲートは、例えば、補体関連の眼の症状等の補体関連障害の治療に有用である。
A.例示的な抗D因子抗体
D因子に結合する単離抗体が、本明細書において提供される。具体的には、100pM未満、または75pM未満、または50pM未満、または10pM未満のKDを有するような非常に高い親和性を有するD因子に結合する抗体が、本明細書において提供される。さらに、高溶解性であるFab等の抗体が、本明細書において提供される。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書に提供される高濃度の抗体を含む薬学的製剤は、4℃で、少なくとも20週間保存後に目に見る沈殿物がない。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される高濃度の抗体を含む薬学的製剤は、少なくとも200mg/ml、または少なくとも230mg/ml、または少なくとも250mg/ml、または少なくとも270mg/mlの抗体(Fab等)を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される抗体は、少なくとも150mg/ml等の高濃度で製剤化され得、25℃で、30cP未満、または20cP未満、または15cP未満、または10cP未満の粘度を有する。本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。いくつかの実施形態において、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であってもよい。本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、抗体は、Fab断片であってもよい。
D因子に結合する単離抗体が、本明細書において提供される。具体的には、100pM未満、または75pM未満、または50pM未満、または10pM未満のKDを有するような非常に高い親和性を有するD因子に結合する抗体が、本明細書において提供される。さらに、高溶解性であるFab等の抗体が、本明細書において提供される。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書に提供される高濃度の抗体を含む薬学的製剤は、4℃で、少なくとも20週間保存後に目に見る沈殿物がない。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される高濃度の抗体を含む薬学的製剤は、少なくとも200mg/ml、または少なくとも230mg/ml、または少なくとも250mg/ml、または少なくとも270mg/mlの抗体(Fab等)を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される抗体は、少なくとも150mg/ml等の高濃度で製剤化され得、25℃で、30cP未満、または20cP未満、または15cP未満、または10cP未満の粘度を有する。本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。いくつかの実施形態において、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であってもよい。本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、抗体は、Fab断片であってもよい。
いくつかの実施形態において、本発明は、(a)アミノ酸配列SYYMY(配列番号15)を含むHVR−H1、(b)アミノ酸配列X4INPX5X6GX7TNFNEKFKS(配列番号111)を含むHVR−H2(式中、X4が、E及びWから選択され、X5が、T及びYから選択され、X6が、N、S、及びQから選択され、X7が、G、D、及びEから選択される)、(c)アミノ酸配列EGGFAY(配列番号25)を含むHVR−H3、(d)アミノ酸配列KASQNVDTDVA(配列番号9)を含むHVR−L1、(e)アミノ酸配列SASSRX1S(配列番号108)を含むHVR−L2(式中、X1が、Y、K、及びRから選択される)、ならびに(f)アミノ酸配列QQYX3NYPLT(配列番号110)を含むHVR−L3(式中、X3が、N及びEから選択される)、から選択される少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのHVRを含む抗D因子抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、配列X2SASSRX1S(配列番号109;すなわち、HVR−L2を直接先行するアミノ酸X2を含む)(式中、X1が、Y、K、及びRから選択され、X2が、Y、R、S、K、及びQから選択される)を含む抗D因子抗体を提供する。いくつかの実施形態において、X2は、Rである。いくつかの実施形態において、X1は、Yである。
いくつかの実施形態において、本発明は、(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号16〜24から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H2、(c)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、(d)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(e)配列番号10〜12から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(f)配列番号13または14のアミノ酸配列を含むHVR−L3、から選択される、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのHVRを含む抗D因子抗体を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、(a)アミノ酸配列SYYMY(配列番号15)を含むHVR−H1、(b)アミノ酸配列X4INPX5X6GX7TNFNEKFKS(配列番号111)を含むHVR−H2(式中、X4が、E及びWから選択され、X5が、T及びYから選択され、X6が、N、S、及びQから選択され、X7が、G、D、及びEから選択される)、(c)アミノ酸配列EGGFAY(配列番号25)を含むHVR−H3、から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH HVR配列を含む抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号16〜24から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのHVRを含む抗D因子抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのHVRを含む抗D因子抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのHVRを含む抗D因子抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号18のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのHVRを含む抗D因子抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号19のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのHVRを含む抗D因子抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号20のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのHVRを含む抗D因子抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号21のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのHVRを含む抗D因子抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号22のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのHVRを含む抗D因子抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号23のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのHVRを含む抗D因子抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号24のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのHVRを含む抗D因子抗体を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、(a)アミノ酸配列KASQNVDTDVA(配列番号9)を含むHVR−L1、(b)アミノ酸配列SASSRX1S(配列番号108)を含むHVR−L2(式中、X1が、Y、K、及びRから選択される)、及び(c)アミノ酸配列QQYX3NYPLT(配列番号110)を含むHVR−L3(式中、X3が、N及びEから選択される)、から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL HVR配列を含む抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、(a)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号10〜12から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号13または14のアミノ酸配列を含むHVR−L3、から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのHVRを含む抗D因子抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、(a)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのHVRを含む抗D因子抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、(a)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのHVRを含む抗D因子抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、(a)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号12のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのHVRを含む抗D因子抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、(a)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3、から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのHVRを含む抗D因子抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、(a)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのHVRを含む抗D因子抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、(a)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3、から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのHVRを含む抗D因子抗体を提供する。上述の実施形態のうちのいずれかにおいて、HVR−L2を直接先行するアミノ酸は、Y、R、S、K、及びQから選択され得る。いくつかの実施形態において、HVR−L2を直接先行するアミノ酸は、Rである。
いくつかの実施形態において、抗D因子抗体が提供され、本抗体は、(a)(i)アミノ酸配列SYYMY(配列番号15)を含むHVR−H1、(ii)アミノ酸配列X4INPX5X6GX7TNFNEKFKS(配列番号111)を含むHVR−H2(式中、X4が、E及びWから選択され、X5が、T及びYから選択され、X6が、N、S、及びQから選択され、X7が、G、D、及びEから選択される)、ならびに(iii)アミノ酸配列EGGFAY(配列番号25)を含むHVR−H3から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH HVR配列を含むVHドメインと、(b)(i)アミノ酸配列KASQNVDTDVA(配列番号9)を含むHVR−L1、(ii)アミノ酸配列SASSRX1S(配列番号108)を含むHVR−L2(式中、X1が、Y、K、及びRから選択される)から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL HVR配列を含むVLドメインと、(c)アミノ酸配列QQYX3NYPLT(配列番号110)を含むHVR−L3(式中、X3が、N及びEから選択される)と、を含む。
いくつかの実施形態において、抗D因子抗体が提供され、本抗体は、(a)(i)アミノ酸配列SYYMY(配列番号15)を含むHVR−H1、(ii)アミノ酸配列X4INPX5X6GX7TNFNEKFKS(配列番号111)を含むHVR−H2(式中、X4が、E及びWから選択され、X5が、T及びYから選択され、X6が、N、S、及びQから選択され、X7が、G、D、及びEから選択される)、ならびに(iii)アミノ酸配列EGGFAY(配列番号25)を含むHVR−H3から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH HVR配列を含むVHドメインと、(b)(i)アミノ酸配列KASQNVDTDVA(配列番号9)を含むHVR−L1、(ii)アミノ酸配列SASSRX1S(配列番号108)を含むHVR−L2(式中、X1が、Y、K、及びRから選択される)から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL HVR配列を含むVLドメインと、(c)アミノ酸配列QQYX3NYPLT(配列番号110)を含むHVR−L3(式中、X3が、N及びEから選択される)と、を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、配列X2SASSRX1S(式中、X1が、Y、K、及びRから選択され、X2が、Y、R、S、K、及びQから選択される)を含む(すなわち、HVR−L2を直接先行するアミノ酸X2を含む)抗D因子抗体を提供する。いくつかの実施形態において、X2は、Rである。いくつかの実施形態において、X1は、Yである。
いくつかの実施形態において、抗D因子抗体が提供され、本抗体は、(a)(i)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(iii)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH HVR配列を含むVHドメインと、(b)(i)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL HVR配列を含むVLドメインと、(c)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3と、を含む。
いくつかの実施形態において、抗D因子抗体が提供され、本抗体は、(a)(i)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号20のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(iii)配列番号25から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H3から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH HVR配列を含むVHドメインと、(b)(i)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL HVR配列を含むVLドメインと、(c)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3と、を含む。
いくつかの実施形態において、抗D因子抗体が提供され、本抗体は、(a)(i)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(iii)配列番号25から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H3から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH HVR配列を含むVHドメインと、(b)(i)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL HVR配列を含むVLドメインと、(c)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3と、を含む。
いくつかの実施形態において、抗D因子抗体が提供され、本抗体は、(a)(i)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号18のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(iii)配列番号25から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H3から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH HVR配列を含むVHドメインと、(b)(i)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL HVR配列を含むVLドメインと、を含む。
いくつかの実施形態において、抗D因子抗体が提供され、本抗体は、(a)(i)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号19のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(iii)配列番号25から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H3から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH HVR配列を含むVHドメインと、(b)(i)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL HVR配列を含むVLドメインと、を含む。
いくつかの実施形態において、抗D因子抗体が提供され、本抗体は、(a)(i)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号21のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(iii)配列番号25から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H3から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH HVR配列を含むVHドメインと、(b)(i)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL HVR配列を含むVLドメインと、(c)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3と、を含む。
いくつかの実施形態において、抗D因子抗体が提供され、本抗体は、(a)(i)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号22のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(iii)配列番号25から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H3から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH HVR配列を含むVHドメインと、(b)(i)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL HVR配列を含むVLドメインと、(c)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3と、を含む。
いくつかの実施形態において、抗D因子抗体が提供され、本抗体は、(a)(i)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号23のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(iii)配列番号25から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H3から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH HVR配列を含むVHドメインと、(b)(i)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL HVR配列を含むVLドメインと、(c)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3と、を含む。
いくつかの実施形態において、抗D因子抗体が提供され、本抗体は、(a)(i)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号24のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(iii)配列番号25から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H3から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH HVR配列を含むVHドメインと、(b)(i)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL HVR配列を含むVLドメインと、(c)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3と、を含む。
いくつかの実施形態において、抗D因子抗体が提供され、本抗体は、(a)(i)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(iii)配列番号25から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H3から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH HVR配列を含むVHドメインと、(b)(i)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−L2から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL HVR配列を含むVLドメインと、(c)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3と、を含む。
いくつかの実施形態において、抗D因子抗体が提供され、本抗体は、(a)(i)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1,(ii)配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(iii)配列番号25から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H3から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH HVR配列を含むVHドメインと、(b)(i)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号12のアミノ酸配列を含むHVR−L2から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL HVR配列を含むVLドメインと、(c)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3と、を含む。
いくつかの実施形態において、抗D因子抗体が提供され、本抗体は、(a)(i)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(iii)配列番号25から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H3から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVH HVR配列を含むVHドメインと、(b)(i)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのVL HVR配列を含むVLドメインと、(c)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3と、を含む。
いくつかの実施形態において、抗D因子抗体が提供され、本抗体は、(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−H2、(c)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、(d)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(e)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(f)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む。
いくつかの実施形態において、抗D因子抗体が提供され、本抗体は、(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号20のアミノ酸配列を含むHVR−H2、(c)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、(d)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(e)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(f)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む。
いくつかの実施形態において、抗D因子抗体が提供され、本抗体は、(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR−H2、(c)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、(d)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(e)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(f)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む。
いくつかの実施形態において、抗D因子抗体が提供され、本抗体は、(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号18のアミノ酸配列を含むHVR−H2、(c)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、(d)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(e)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(f)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む。
いくつかの実施形態において、抗D因子抗体が提供され、本抗体は、(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号19のアミノ酸配列を含むHVR−H2、(c)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、(d)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(e)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(f)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む。
いくつかの実施形態において、抗D因子抗体が提供され、本抗体は、(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号21のアミノ酸配列を含むHVR−H2、(c)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、(d)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(e)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(f)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む。
いくつかの実施形態において、抗D因子抗体が提供され、本抗体は、(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号22のアミノ酸配列を含むHVR−H2、(c)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、(d)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(e)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(f)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む。
いくつかの実施形態において、抗D因子抗体が提供され、本抗体は、(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号23のアミノ酸配列を含むHVR−H2、(c)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、(d)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(e)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(f)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む。
いくつかの実施形態において、抗D因子抗体が提供され、本抗体は、(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−H2、(c)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、(d)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(e)配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(f)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む。
いくつかの実施形態において、抗D因子抗体が提供され、本抗体は、(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−H2、(c)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、(d)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(e)配列番号12のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(f)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む。
いくつかの実施形態において、抗D因子抗体が提供され、本抗体は、(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−H2、(c)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、(d)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(e)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(f)配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む。
いくつかの実施形態において、抗D因子抗体が提供され、本抗体は、(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号24のアミノ酸配列を含むHVR−H2、(c)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、(d)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(e)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(f)配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む。
本実施形態のうちのいずれかにおいて、抗D因子抗体は、ヒト化であり得る。いくつかの実施形態において、抗D因子抗体は、上記の実施形態のうちのいずれかにあるようなHVRを含み、ヒトアクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。ある特定の実施形態において、ヒトアクセプターフレームワークは、ヒトVLカッパIコンセンサス(VLKI)フレームワーク及び/またはVHフレームワークVH1である。ある特定の実施形態において、ヒトアクセプターフレームワークは、本明細書に記載される突然変異のうちのいずれか1つを含む、ヒトVLカッパIコンセンサス(VLKI)フレームワーク及び/またはVHフレームワークVH1である。
別の態様において、抗D因子抗体は、配列番号27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、及び63から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン(VH)配列を含む。ある特定の実施形態において、配列番号27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、及び63から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するVH配列は、参照配列と比較して、置換(例えば、保存的置換)、挿入、または欠失を含有するが、その配列を含む抗D因子抗体は、D因子に結合する能力を保持する。ある特定の実施形態において、配列番号27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、及び63において合計で1〜10個のアミノ酸が置換、挿入、及び/または欠失している。ある特定の実施形態において、配列番号27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、及び63において合計で1〜5個のアミノ酸が置換、挿入、及び/または欠失している。ある特定の実施形態において、置換、挿入、または欠失は、HVRの外側の領域で(すなわち、FR内で)生じる。任意に、抗D因子抗体は、配列番号27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、及び63のVH配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態において、VHは、(a)アミノ酸配列SYYMY(配列番号15)を含むHVR−H1、(b)アミノ酸配列X4INPX5X6GX7TNFNEKFKS(配列番号111)を含むHVR−H2(式中、X4が、E及びWから選択され、X5が、T及びYから選択され、X6が、N、S、及びQから選択され、X7が、G、D、及びEから選択される)、及び(c)アミノ酸配列EGGFAY(配列番号25)を含むHVR−H3、から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つのHVRを含む。いくつかの実施形態において、VHは、(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(b)配列番号16または20のアミノ酸配列を含むHVR−H2、及び(c)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、から選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つのHVRを含む。
別の態様において、抗D因子抗体が提供され、本抗体は、配列番号26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、及び62から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン(VL)を含む。ある特定の実施形態において、配列番号26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、及び62から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するVL配列は、参照配列と比較して、置換(例えば、保存的置換)、挿入、または欠失を含有するが、その配列を含む抗D因子抗体は、D因子に結合する能力を保持する。ある特定の実施形態において、配列番号26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、及び62において合計で1〜10個のアミノ酸が置換、挿入、及び/または欠失している。ある特定の実施形態において、配列番号26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、及び62において合計で1〜5個のアミノ酸が置換、挿入、及び/または欠失している。ある特定の実施形態において、置換、挿入、または欠失は、HVRの外側の領域で(すなわち、FR内で)生じる。任意に、抗D因子抗体は、配列番号26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、及び62のVL配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態において、VLは、(a)アミノ酸配列KASQNVDTDVA(配列番号9)を含むHVR−L1、(b)アミノ酸配列SASSRX1S(配列番号108)を含むHVR−L2(式中、X1が、Y、K、及びRから選択される)、及び(c)アミノ酸配列QQYX3NYPLT(配列番号110)を含むHVR−L3(式中、X3が、N及びEから選択される)、から選択される、1つ、2つ、または3つのHVRを含む。いくつかの実施形態において、VLは、(a)配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(b)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び(c)配列番号13のアミノ酸配列、から選択される、1つ、2つ、または3つのHVRを含む。上述の実施形態のうちのいずれかにおいて、HVR−L2を直接先行するアミノ酸は、Y、R、S、K、及びQから選択され得る。いくつかの実施形態において、HVR−L2を直接先行するアミノ酸は、Rである。
別の態様において、抗D因子抗体が提供され、本抗体は、上記に提供される実施形態のうちのいずれかにあるようなVH、及び上記に提供される実施形態のうちのいずれかにあるようなVLを含む。
いくつかの実施形態において、本抗体は、それぞれ、配列番号35及び配列番号34におけるVH配列及びVL配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。いくつかの実施形態において、本抗体は、それぞれ、配列番号39及び配列番号38におけるVH配列及びVL配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。
さらなる態様において、抗D因子抗体と同じエピトープに結合する抗体が、本明細書において提供される。例えば、ある特定の実施形態において、配列番号35のVH配列及び配列番号34のVL配列をそれぞれ含む抗D因子抗体と同じエピトープに結合する抗体が、提供される。ある特定の実施形態において、配列番号39のVH配列及び配列番号38のVL配列をそれぞれ含む抗D因子抗体と同じエピトープに結合する抗体が、提供される。
図1A〜Cに示されるKabat番号付けに従うHVR1−LC、HVR2−LC、及びHVR3−LC配列を含む軽鎖可変ドメインと、図2A〜Cに示されるKabat番号付けに従うHVR1−HC、HVR2−HC、及びHVR3−HC配列を含む重鎖可変ドメインと、を含む抗体が、本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、本抗体は、図1A〜Cに示されるHVR1−LC、HVR2−LC、及び/またはHVR3−LC配列、ならびにFR1−LC、FR2−LC、FR3−LC、及び/またはFR4−LC配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態において、本抗体は、図2A〜Cに示されるHVR1−HC、HVR2−HC、及び/またはHVR3−HC配列、ならびにFR1−HC、FR2−HC、FR3−HC、及び/またはFR4−HC配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
本発明のさらなる態様において、上記実施形態のうちのいずれかによる抗D因子抗体は、ヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、抗D因子抗体は、抗体断片、例えば、Fv、Fab、Fab−SH、Fab’−SH、Fab’、Fab−C、Fab’−C、Fab’−C−SH、Fab−C−SH、scFv、ダイアボディ、またはF(ab’)2断片である。別の実施形態において、本抗体は、実質的に完全長の抗体、例えば、本明細書に定義されるIgG1抗体、IgG2a抗体、または他の抗体クラスもしくはアイソタイプである。いくつかの実施形態において、抗D因子抗体は、Fabである。
さらなる態様において、上記の実施形態のうちのいずれかによる抗D因子抗体は、以下に記載される特長のうちのいずれかを、単独でまたは組み合わせて組み込むことができる。
1.抗体親和性
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、1μM以下、100nM以下、50nM以下、10nM以下、5nM以下、1nM以下、0.1nM以下、0.01nM以下、または0.001nM以下を有し、任意に、10−13M以上(例えば、10−8M以下、例えば、10−8M〜10−13M、例えば、10−9M〜10−13M)の解離定数(Kd)を有する。
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、1μM以下、100nM以下、50nM以下、10nM以下、5nM以下、1nM以下、0.1nM以下、0.01nM以下、または0.001nM以下を有し、任意に、10−13M以上(例えば、10−8M以下、例えば、10−8M〜10−13M、例えば、10−9M〜10−13M)の解離定数(Kd)を有する。
いくつかの実施形態において、Kdは、以下のアッセイによって説明されるように、目的とする抗体のFabバージョン及びその抗原を用いて行われる放射性標識抗原結合アッセイ(RIA)によって測定される。抗原に対するFabの溶液結合親和性は、Fabを、未標識抗原の一連の滴定の存在下で、最小濃度の(125I)標識抗原と平衡化し、次いで抗Fab抗体コーティングプレートと結合した抗原を捕捉することによって測定される(例えば、Chen et al.,J.Mol.Biol.293:865−881(1999)を参照のこと)。アッセイの条件を確立するために、MICROTITER(登録商標)マルチウェルプレート(Thermo Scientific)を、50mMの炭酸ナトリウム(pH9.6)中の5μg/mlの捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)で一晩コーティングし、その後、PBS中の2%(w/v)ウシ血清アルブミンで2〜5時間室温(約23℃)で遮断する。非吸着性プレート(Nunc番号269620)中、100pMまたは26pMの[125I]−抗原を、目的とするFabの段階希釈液と混合する(例えば、Presta et al.,Cancer Res.57:4593−4599(1997)における抗VEGF抗体Fab−12の評価と一貫する)。その後、目的とするFabを一晩インキュベートするが、インキュベーションをより長い期間(例えば、約65時間)続けて、平衡に達することを確実にすることができる。その後、室温でのインキュベーション(例えば、1時間)のために混合物を捕捉プレートに移す。次いで、溶液を除去し、PBS中0.1%ポリソルベート20(TWEEN−20(登録商標))を用いてプレートを8回洗浄する。プレートが乾燥したら、150μL/ウェルのシンチラント(scintillant)(MICROSCINT−20(商標)、Packard)を添加し、TOPCOUNT(商標)ガンマ計数器(Packard)上でプレートを10分間、計数する。最大結合の20%以下をもたらす各Fabの濃度を競合結合アッセイでの使用に選択する。
別の実施形態によれば、Kdは、約10応答単位(RU)で固定化された抗原CM5チップと共に、25℃においてBIACORE(登録商標)−2000またはBIACORE(登録商標)−3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)を用いた表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定される。簡潔には、供給業者の指示に従って、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5、BIACORE,Inc.)を、N−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド塩酸塩(EDC)及びN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)で活性化する。抗原を10mMの酢酸ナトリウム(pH4.8)で5μg/mL(約0.2μM)になるまで希釈した後に、5μL/分の流量で注入して、およそ10応答単位(RU)のカップリングしたタンパク質を得る。抗原の注入後、1Mのエタノールアミンを注入して、未反応基を遮断する。反応速度測定のために、Fabの2倍段階希釈液(0.78nM〜500nM)を、25℃の0.05%ポリソルベート20(TWEEN−20(商標))界面活性剤(PBST)を含むPBS中におよそ25μL/分の流量で注入する。会合速度(kon)及び解離速度(koff)は、単純な1対1のラングミュア結合モデル(BIACORE(登録商標)Evaluation Softwareバージョン3.2)を使用して、会合センサグラムと解離センサグラムとを同時に当てはめることによって計算される。平衡解離定数(Kd)をkoff/kon比として計算する。例えば、Chen et al.,J.Mol.Biol.293:865−881(1999)を参照のこと)。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによるオンレートが106M−1s−1を超える場合、オンレートは、ストップフローを備えた分光光度計(Aviv Instruments)、または撹拌キュベットを備えた8000シリーズSLM−AMINCO(商標)分光光度計(ThermoSpectronic)等の分光計で測定される場合に、増加する抗原濃度の存在下で、25℃で、PBS中20nMの抗−抗原抗体(Fab型)(pH7.2)の蛍光発光強度(励起=295nm、発光=340nm、16nm帯域通過)の増加または減少を測定する蛍光消光技法を使用することによって決定することができる。
2.抗体断片
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片としては、Fv、Fab、Fab−SH、Fab’−SH、Fab’、Fab−C、Fab’−C、Fab’−C−SH、Fab−C−SH、scFv、ダイアボディ、またはF(ab’)2断片、及び本明細書に記載される、その他の断片が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の抗体断片の概説については、Hudson et al.Nat.Med.9:129−134(2003)に記載されている。scFv抗体断片の概説については、例えば、Pluckthun,in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,(Springer−Verlag,New York),pp.269−315(1994)を参照されたく、またWO93/16185及び米国特許第5,571,894号及び同第5,587,458号も参照のこと。エピトープ残基を結合し、増加したインビボ半減期を有するサルベージ受容体を含むFab及びF(ab’)2断片の考察については、米国特許第5,869,046号を参照のこと。遊離チオール基を持つ抗体断片は、「−SH」で示され得る。例えば、Fab−SH(Fab−C−SHを含む)は、定常ドメインの少なくとも1つのシステイン残基が遊離チオール基を持つFabの呼称である。
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片としては、Fv、Fab、Fab−SH、Fab’−SH、Fab’、Fab−C、Fab’−C、Fab’−C−SH、Fab−C−SH、scFv、ダイアボディ、またはF(ab’)2断片、及び本明細書に記載される、その他の断片が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の抗体断片の概説については、Hudson et al.Nat.Med.9:129−134(2003)に記載されている。scFv抗体断片の概説については、例えば、Pluckthun,in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,(Springer−Verlag,New York),pp.269−315(1994)を参照されたく、またWO93/16185及び米国特許第5,571,894号及び同第5,587,458号も参照のこと。エピトープ残基を結合し、増加したインビボ半減期を有するサルベージ受容体を含むFab及びF(ab’)2断片の考察については、米国特許第5,869,046号を参照のこと。遊離チオール基を持つ抗体断片は、「−SH」で示され得る。例えば、Fab−SH(Fab−C−SHを含む)は、定常ドメインの少なくとも1つのシステイン残基が遊離チオール基を持つFabの呼称である。
いくつかの実施形態において、Fab断片の重鎖のC末端は、アミノ酸「CDKTHT」(配列番号165)、「CDKTHL」(配列番号166)、「CDKTH」(配列番号167)、「CDKT」(配列番号168)、「CDK」、または「CD」で終了する。いくつかの実施形態において、Fab断片の重鎖のC末端は、配列
(配列番号169)で終了し、式中、
は、Tを除いた任意のアミノ酸である。C末端での切断及び/または突然変異は、熱安定性または発現を損なうことなく、Fabに対してAHA−反応性を軽減または排除することが可能であり得る。いくつかの実施形態において、Fab断片の重鎖のC末端は、アミノ酸「CDKTHTC」(配列番号170)、「CDKTHTCPPC」(配列番号171)、「CDKTHTCPPS」(配列番号172)、「CDKTHTSPPC」(配列番号173)、「CDKTHTAPPC」(配列番号174)、「CDKTHTSGGC」(配列番号175)、または「CYGPPC」(配列番号176)で終了する。いくつかのかかる実施形態において、C末端アミノ酸中の遊離システインは、コンジュゲーション、例えば、PEG等のポリマーの影響を受け得る。いくつかの実施形態において、Fab断片は、配列番号113(CDKTHT(配列番号165))、128〜132(CDKTHL(配列番号166)、CDKTHTC(配列番号170)、CDKTHTCPPC(配列番号171)、CDKTHTCPPS(配列番号172)、CDKTHTSPPC(配列番号173))、154〜156(APPC(配列番号177)、SGGC(配列番号178)、CYGPPC(配列番号176))、及び134〜137(CDKTH(配列番号167)、CDKT(配列番号168)、CDK、CD)から選択される重鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態において、Fabは、配列番号138(VERK(配列番号179))の重鎖定常領域を含むIgG2 Fab断片または配列番号157(VERKC(配列番号180))の重鎖定常領域を含むIgG2 Fab−C断片である。いくつかの実施形態において、Fabは、配列番号139(KYGPP(配列番号181))、配列番号163(KYGP(配列番号182))、及び159〜161(KYG、KY、K)から選択される重鎖定常領域を含むIgG4 Fab断片、または配列番号158(KYGPPC(配列番号183))の重鎖定常領域を含むIgG4 Fab−C断片である。C末端での切断及び/または突然変異の代用として、既存の抗ヒンジ抗体(PE−AHA)反応を避けるために、IgG2またはIgG4 Fab断片がPE−AHA反応を示さないため、これらを使用してもよい。
(配列番号169)で終了し、式中、
は、Tを除いた任意のアミノ酸である。C末端での切断及び/または突然変異は、熱安定性または発現を損なうことなく、Fabに対してAHA−反応性を軽減または排除することが可能であり得る。いくつかの実施形態において、Fab断片の重鎖のC末端は、アミノ酸「CDKTHTC」(配列番号170)、「CDKTHTCPPC」(配列番号171)、「CDKTHTCPPS」(配列番号172)、「CDKTHTSPPC」(配列番号173)、「CDKTHTAPPC」(配列番号174)、「CDKTHTSGGC」(配列番号175)、または「CYGPPC」(配列番号176)で終了する。いくつかのかかる実施形態において、C末端アミノ酸中の遊離システインは、コンジュゲーション、例えば、PEG等のポリマーの影響を受け得る。いくつかの実施形態において、Fab断片は、配列番号113(CDKTHT(配列番号165))、128〜132(CDKTHL(配列番号166)、CDKTHTC(配列番号170)、CDKTHTCPPC(配列番号171)、CDKTHTCPPS(配列番号172)、CDKTHTSPPC(配列番号173))、154〜156(APPC(配列番号177)、SGGC(配列番号178)、CYGPPC(配列番号176))、及び134〜137(CDKTH(配列番号167)、CDKT(配列番号168)、CDK、CD)から選択される重鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態において、Fabは、配列番号138(VERK(配列番号179))の重鎖定常領域を含むIgG2 Fab断片または配列番号157(VERKC(配列番号180))の重鎖定常領域を含むIgG2 Fab−C断片である。いくつかの実施形態において、Fabは、配列番号139(KYGPP(配列番号181))、配列番号163(KYGP(配列番号182))、及び159〜161(KYG、KY、K)から選択される重鎖定常領域を含むIgG4 Fab断片、または配列番号158(KYGPPC(配列番号183))の重鎖定常領域を含むIgG4 Fab−C断片である。C末端での切断及び/または突然変異の代用として、既存の抗ヒンジ抗体(PE−AHA)反応を避けるために、IgG2またはIgG4 Fab断片がPE−AHA反応を示さないため、これらを使用してもよい。
ダイアボディは、二価または二重特異性であり得る2つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、EP404,097、WO1993/01161、Hudson et al.,Nat.Med.9:129−134(2003)、及びHollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444−6448(1993)を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディも、Hudson et al.,Nat.Med.9:129−134(2003)に記載されている。
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部、または軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部を含む、抗体断片である。ある特定の実施形態において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である(Domantis,Inc.,Waltham,MA;例えば、米国特許第6,248,516B1号を参照のこと)。
抗体断片は、本明細書に記載される、無傷抗体のタンパク分解、ならびに組換え宿主細胞(例えば、E.coliまたはファージ)の産生を含むが、これらに限定されない、様々な技法によって作製され得る。
3.キメラ抗体及びヒト化抗体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、キメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体が、例えば、米国特許第4,816,567号、及びMorrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851−6855(1984))に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、または非ヒト霊長類、例えば、サル由来の可変領域)及びヒト定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のクラスまたはサブクラスから変化した「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合断片が含まれる。
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、キメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体が、例えば、米国特許第4,816,567号、及びMorrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851−6855(1984))に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、または非ヒト霊長類、例えば、サル由来の可変領域)及びヒト定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のクラスまたはサブクラスから変化した「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合断片が含まれる。
ある特定の実施形態において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、非ヒト親抗体の特異性及び親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低減させるために、ヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、1つ以上の可変ドメインを含み、そのHVR、例えば、CDR(またはそれらの部分)は、非ヒト抗体に由来し、そのFR(またはそれらの部分)は、ヒト抗体配列に由来する。ヒト化抗体はまた、任意に、ヒト定常領域の少なくとも一部も含むであろう。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体におけるいくつかのFR残基は、例えば、抗体特異性または親和性を復元または改善するように、非ヒト抗体(例えば、HVR残基が由来する抗体)からの対応する残基で置換される。
ヒト化抗体及びそれらの作製方法は、例えば、Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619−1633(2008)で概説され、また、例えば、Riechmann et al.,Nature 332:323−329(1988)、Queen et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029−10033(1989)、米国特許第5,821,337号、同第7,527,791号、同第6,982,321号、及び同第7,087,409号、Kashmiri et al.,Methods 36:25−34(2005)(SDR(a−CDR)移植を記載する)、Padlan,Mol.Immunol.28:489−498(1991)(「リサーフェイシング(resurfacing)」を記載する)、Dall’Acqua et al.,Methods 36:43−60(2005)(「FRシャフリング」を記載する)、ならびにOsbourn et al.,Methods 36:61−68(2005)及びKlimka et al.,Br.J.Cancer,83:252−260(2000)(FRシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記載する)にさらに記載されている。
ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域には、「ベストフィット」法を使用して選択されるフレームワーク領域(例えば、Sims et al.J.Immunol.151:2296(1993)を参照のこと)、軽鎖または重鎖可変領域の特定の下位群のヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域(例えば、Carter et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)、及びPresta et al.J.Immunol.,151:2623(1993)を参照のこと)、ヒト成熟(体細胞変異された)フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系フレームワーク領域(例えば、Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619−1633(2008)を参照のこと)、ならびにFRライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域(例えば、Baca et al.,J.Biol.Chem.272:10678−10684(1997)及びRosok et al.,J.Biol.Chem.271:22611−22618(1996)を参照のこと)が含まれるが、これらに限定されない。
4.ヒト抗体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で既知の様々な技法を使用して産生することができる。ヒト抗体は、概して、van Dijk and van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368−74(2001)及びLonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450−459(2008)に記載されている。
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で既知の様々な技法を使用して産生することができる。ヒト抗体は、概して、van Dijk and van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368−74(2001)及びLonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450−459(2008)に記載されている。
ヒト抗体は、抗原投与に応答して、無傷ヒト抗体またはヒト可変領域を有する無傷抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製され得る。かかる動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置き換えるか、または染色体外に存在するかもしくは動物の染色体内にランダムに組み込まれているヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含有する。かかるトランスジェニックマウスにおいて、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般に、不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Lonberg,Nat.Biotech.23:1117−1125(2005)を参照のこと。例えば、米国特許第6,075,181号及び同第6,150,584号(XENOMOUSE(商標)技術について記載する)、米国特許第5,770,429号(HUMAB(登録商標)技術について記載する)、米国特許第7,041,870号(K−M MOUSE(登録商標)技術について記載する)、ならびに米国特許出願公開第2007/0061900号(VELOCIMOUSE(登録商標)技術について記載する)も参照のこと。かかる動物によって生成された無傷抗体からのヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによってさらに改変され得る。
ヒト抗体は、ハイブリドーマベースの方法によって作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が記載されている(例えば、Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)、Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51−63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)、及びBoerner et al.,J.Immunol.,147:86(1991)を参照のこと)。ヒトB細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体もまた、Li et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557−3562(2006)に記載されている。さらなる方法としては、例えば、米国特許第7,189,826号(ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトIgM抗体の産生を記載する)及びNi,Xiandai Mianyixue,26(4):265−268(2006)(ヒト−ヒトハイブリドーマを記載する)に記載されるものが挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術(トリオーマ技術)はまた、Vollmers and Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927−937(2005)及びVollmers and Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185−91(2005)にも記載されている。
ヒト抗体はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるFvクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成することもできる。次いで、かかる可変ドメイン配列は、所望のヒト定常ドメインと組み合わせることができる。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技法は、以下に記載されている。
5.ライブラリー由来抗体
本発明の抗体は、所望の活性(複数可)を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離され得る。例えば、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を保有する抗体についてかかるライブラリーをスクリーニングするための多様な方法が、当該技術分野で既知である。かかる方法は、例えば、Hoogenboom et al.in Methods in Molecular Biology 178:1−37(O’Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2001)で概説されており、例えば、McCafferty et al.,Nature 348:552−554、Clackson et al.,Nature 352:624−628(1991)、Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581−597(1992)、Marks and Bradbury,Methods in Molecular Biology 248:161−175(Lo,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2003)、Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338(2):299−310(2004)、Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5):1073−1093(2004)、Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467−12472(2004)、及びLee et al.,J.Immunol.Methods 284(1−2):119−132(2004)にさらに記載されている。
本発明の抗体は、所望の活性(複数可)を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離され得る。例えば、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を保有する抗体についてかかるライブラリーをスクリーニングするための多様な方法が、当該技術分野で既知である。かかる方法は、例えば、Hoogenboom et al.in Methods in Molecular Biology 178:1−37(O’Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2001)で概説されており、例えば、McCafferty et al.,Nature 348:552−554、Clackson et al.,Nature 352:624−628(1991)、Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581−597(1992)、Marks and Bradbury,Methods in Molecular Biology 248:161−175(Lo,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2003)、Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338(2):299−310(2004)、Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5):1073−1093(2004)、Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467−12472(2004)、及びLee et al.,J.Immunol.Methods 284(1−2):119−132(2004)にさらに記載されている。
ある特定のファージディスプレイ法では、VH及びVL遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって別個にクローン化され、ファージライブラリー中で無作為に組み換えられ、それは次いでWinter et al.,Ann.Rev.Immunol.,12:433−455(1994)に記載される抗原結合ファージについてスクリーニングされ得る。ファージは、典型的には、一本鎖Fv(scFv)断片またはFab断片のいずれかとして抗体断片をディスプレイする。免疫化源由来のライブラリーは、ハイブリドーマの構築を必要とすることなく、免疫原に高親和性抗体を提供する。あるいは、Griffiths et al.,EMBO J,12:725−734(1993)によって記載されるように、ナイーブレパートリーは、クローン化され(例えば、ヒトから)、いかなる免疫化も伴わずに、幅広い非自己抗原また自己抗原に対する抗体の単一の源を提供することができる。最後に、ナイーブレパートリーは、Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381−388(1992)に記載されるように、幹細胞から再配列されていないV遺伝子セグメントをクローン化し、ランダム配列を含有するPCRプライマーを使用して高度に可変性のCDR3領域をコードし、かつインビトロで再配列を達成することによって合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーについて記載する特許公報としては、例えば、米国特許第5,750,373号、ならびに米国特許公開第2005/0079574号、同第2005/0119455号、同第2005/0266000号、同第2007/0117126号、同第2007/0160598号、同第2007/0237764号、同第2007/0292936号、及び同第2009/0002360号が挙げられる。
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体断片は、本明細書においてヒト抗体またはヒト抗体断片と見なされる。
6.多重特異性抗体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態において、結合特異性の一方はD因子に対するものであり、他方は任意の他の抗原に対するものである。ある特定の実施形態において、二重特異性抗体は、D因子の2つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体はまた、D因子を発現する細胞に細胞傷害性剤を局在化するために使用してもよい。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片として調製することができる。
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態において、結合特異性の一方はD因子に対するものであり、他方は任意の他の抗原に対するものである。ある特定の実施形態において、二重特異性抗体は、D因子の2つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体はまた、D因子を発現する細胞に細胞傷害性剤を局在化するために使用してもよい。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片として調製することができる。
多重特異性抗体を作製するための技法としては、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現(Milstein and Cuello,Nature 305:537(1983))、WO93/08829、及びTraunecker et al.,EMBO J.10:3655(1991)を参照のこと)、ならびに「ノブ・イン・ホール」操作(例えば、米国特許第5,731,168号を参照のこと)が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に使用される「ノブ・イン・ホール」または「KnH」技術という用語は、2つのポリペプチドを、それらが相互作用する界面において一方のポリペプチドに隆起(ノブ)を導入し、他方のポリペプチドに空洞(ホール)を導入することにより、インビトロまたはインビボで一緒に対合することを誘導する技術を指す。例えば、KnHは、抗体のFc:Fc結合界面、CL:CH1界面、またはVH/VL界面に導入されている(例えば、US2011/0287009、US2007/0178552、WO96/027011、WO98/050431、Zhu et al.,1997,Protein Science 6:781−788、及びWO2012/106587を参照のこと)。いくつかの実施形態において、KnHにより、多重特異性抗体の製造中に2つの異なる重鎖を一緒に対合することが促進される。例えば、Fc領域内にKnHを有する多重特異性抗体は、各Fc領域に連結された単一可変ドメインをさらに含むことができるか、または同様のもしくは異なる軽鎖可変ドメインと対合する異なる重鎖可変ドメインをさらに含むことができる。KnH技術はまた、2つの異なる受容体の細胞外ドメインを一緒に対合するか、または異なる標的認識配列を含む任意の他のポリペプチド配列(例えば、アフィボディ、ペプチボディ、及び他のFc融合体を含む)を対合するためにも使用することができる。
本明細書で使用される「ノブ突然変異」という用語は、ポリペプチドが別のポリペプチドと相互作用する界面において、突起(ノブ)をポリペプチドに導入する突然変異を指す。いくつかの実施形態において、他のポリペプチドは、ホール突然変異を有する。
本明細書で使用される「ホール突然変異」という用語は、ポリペプチドが別のポリペプチドと相互作用する界面において、空洞(ホール)をポリペプチドに導入する突然変異を指す。いくつかの実施形態において、他のポリペプチドは、ノブ突然変異を有する。
簡潔な非限定的考察が、以下に提供される。
「隆起」とは、第1のポリペプチドの界面から突出し、それ故に隣接した界面(すなわち、第2のポリペプチドの界面)の補償空洞内に位置付け可能になり、これにより、例えば、ヘテロ多量体を安定させ、それによりホモ多量体形成よりもヘテロ多量体形成が好都合になる、少なくとも1つのアミノ酸側鎖を指す。隆起は、元の界面に存在し得るか、または合成的に(例えば、界面をコードする核酸を改変することによって)導入され得る。いくつかの実施形態において、第1のポリペプチドの界面をコードする核酸は、突起をコードするように変化する。これを達成するために、第1のポリペプチドの界面の少なくとも1つの「元の」アミノ酸残基をコードする核酸が、元のアミノ酸残基よりも大きい側鎖体積を有する少なくとも1つの「移入」アミノ酸残基をコードする核酸で置き換えられる。2つ以上の元の残基及び対応する移入残基が存在し得ることが理解される。様々なアミノ残基の側鎖体積は、例えば、US2011/0287009の表1に示される。「突起」を導入する突然変異は、「ノブ突然変異」と称され得る。
いくつかの実施形態において、隆起の形成のための移入残基は、アルギニン(R)、フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、及びトリプトファン(W)から選択される天然のアミノ酸残基である。いくつかの実施形態において、移入残基は、トリプトファンまたはチロシンである。いくつかの実施形態において、突起の形成のための元の残基は、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、セリン、トレオニン、またはバリン等の小さい側鎖体積を有する。
「空洞」とは、第2のポリペプチドの界面から凹んでおり、それ故に隣接する第1のポリペプチドの界面上の対応する隆起を収容する少なくとも1つのアミノ酸側鎖を指す。空洞は、元の界面に存在し得るか、または合成的に(例えば、界面をコードする核酸を改変することによって)導入され得る。いくつかの実施形態において、第2のポリペプチドの界面をコードする核酸は、空洞をコードするように変化する。これを達成するために、第2のポリペプチドの界面の少なくとも1つの「元の」アミノ酸残基をコードする核酸が、元のアミノ酸残基よりも小さい側鎖体積を有する少なくとも1つの「移入」アミノ酸残基をコードするDNAで置き換えられる。2つ以上の元の残基及び対応する移入残基が存在し得ることが理解される。いくつかの実施形態において、空洞の形成のためのインポート残基は、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)、及びバリン(V)から選択される、自然発生するアミノ酸残基である。いくつかの実施形態において、インポート残基は、セリン、アラニン、またはトレオニンである。いくつかの実施形態において、空洞の形成のための元の残基は、チロシン、アルギニン、フェニルアラニン、またはトリプトファン等の大きい側鎖体積を有する。「空洞」を導入する突然変異は、「ホール突然変異」と称され得る。
隆起は、空洞内で「位置付け可能」であり、これは、それぞれ、第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドの界面の隆起及び空洞の空間的位置、ならびに隆起及び空洞の大きさが、界面での第1のポリペプチドと第2のポリペプチドとの正常な会合を著しく乱すことなく隆起が空洞内に位置し得るようなものであることを意味する。Tyr、Phe、及びTrp等の突起は、典型的に界面の軸から垂直に延出せず、好ましい構造を有さず、対応する空洞を有する突起のアラインメントは、場合によっては、X線結晶学または核磁気共鳴(NMR)によって得られるもの等の3次元構造に基づいて、突起/空洞の対をモデル化することに依存する。これは、当該技術分野で広く受け入れられている技法を使用して達成され得る。
いくつかの実施形態において、IgG1定常領域内のノブ突然変異は、T366W(EU番号付け)である。いくつかの実施形態において、IgG1定常領域内のホール突然変異は、T366S、L368A、及びY407V(EU番号付け)から選択される1つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、IgG1定常領域内のホール突然変異は、T366S、L368A、及びY407V(EU番号付け)を含む。
いくつかの実施形態において、IgG4定常領域内のノブ突然変異は、T366W(EU番号付け)である。いくつかの実施形態において、IgG4定常領域内のホール突然変異は、T366S、L368A、及びY407V(EU番号付け)から選択される1つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、IgG4定常領域内のホール突然変異は、T366S、L368A、及びY407V(EU番号付け)を含む。
多重特異性抗体はまた、抗体Fcヘテロ二量体分子を作製するために静電式ステアリング効果を遺伝子操作すること(WO2009/089004A1)、2つ以上の抗体または断片を架橋すること(例えば、米国特許第4,676,980号及びBrennan et al.,Science,229:81(1985)を参照のこと)、二重特異性抗体を作製するためのロイシンジッパーを使用すること(例えば、Kostelny et al.,J.Immunol.,148(5):1547−1553(1992)を参照のこと)、二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術を使用すること(例えば、Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444−6448(1993)を参照のこと)、一本鎖Fv(sFv)二量体を使用すること(例えば、Gruber et al.,J.Immunol.,152:5368(1994)を参照のこと)、ならびに例えば、Tutt et al.J.Immunol.147:60(1991)に記載されるように三重特異性抗体を調製することによっても作製され得る。
「オクトパス抗体」を含む3つ以上の機能的抗原結合部位を有する操作された抗体も、本明細書に含まれる(例えば、US2006/0025576A1を参照のこと)。
本明細書の抗体または断片には、D因子ならびに別の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用(Dual Acting)FAb」または「DAF」も含まれる(例えば、US2008/0069820を参照のこと)。
7.抗体変異体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び/または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適切な改変を導入することによって、またはペプチド合成によって調製され得る。かかる改変には、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基からの欠失、及び/またはそこへの挿入、及び/またはその置換が含まれる。最終構築物に到達するために欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを行うことができるが、但し、その最終構築物が所望の特性、例えば、抗原結合を保有することを条件とする。
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び/または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適切な改変を導入することによって、またはペプチド合成によって調製され得る。かかる改変には、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基からの欠失、及び/またはそこへの挿入、及び/またはその置換が含まれる。最終構築物に到達するために欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを行うことができるが、但し、その最終構築物が所望の特性、例えば、抗原結合を保有することを条件とする。
a)置換、挿入、及び欠失変異体
ある特定の実施形態において、1つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換型変異誘発の目的の部位には、HVR及びFRが含まれる。保存的置換が表1の「好ましい置換」の見出しの下に示される。より実質的な変化が表1の「例示的な置換」の見出しの下に示され、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下にさらに記載されている。アミノ酸置換が目的の抗体中に導入され得、所望の活性、例えば、抗原結合の保持/改善、免疫原性の低減、またはADCCもしくはCDCの改善について生成物がスクリーニングされ得る。
表1
ある特定の実施形態において、1つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換型変異誘発の目的の部位には、HVR及びFRが含まれる。保存的置換が表1の「好ましい置換」の見出しの下に示される。より実質的な変化が表1の「例示的な置換」の見出しの下に示され、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下にさらに記載されている。アミノ酸置換が目的の抗体中に導入され得、所望の活性、例えば、抗原結合の保持/改善、免疫原性の低減、またはADCCもしくはCDCの改善について生成物がスクリーニングされ得る。
表1
アミノ酸は、一般的な側鎖特性に従って群分けされ得る:
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。
ある種類の置換変異体は、親抗体(例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体)の1つ以上の超可変領域残基を置換することを伴う。一般に、さらなる試験のために選択される結果として生じる変異体(複数可)は、親抗体と比較したある特定の生物学的特性(例えば、親和性の増加、免疫原性の低減)の改変(例えば、改善)を有し、及び/または実質的に保持された親抗体のある特定の生物学的特性を有するであろう。例示的な置換型変異体は、例えば、本明細書に記載される技法等のファージディスプレイに基づく親和性成熟技法を使用して好都合に生成され得る親和性成熟抗体である。簡潔には、1つ以上のHVR残基が変異され、変異型抗体がファージ上にディスプレイされ、特定の生物学的活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。
改変(例えば、置換)がHVRで行われて、例えば、抗体親和性を改善することができる。かかる変化は、HVR「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で突然変異を受けるコドンによってコードされる残基(例えば、Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179−196(2008)を参照のこと)、及び/またはSDR(a−CDR)において行われてもよく、結果として生じる変異体VHまたはVLが、結合親和性について試験される。二次ライブラリーを構築し、それから再選択することによる親和性成熟については、例えば、Hoogenboom et al.Methods in Molecular Biology 178:1−37(O’Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,(2001))に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施形態において、多様性が、様々な方法(例えば、エラープローンPCR、鎖シャフリング、またはオリゴヌクレオチド指向性変異誘発)のうちのいずれかによって、成熟させるために選択された可変遺伝子に導入される。次いで、二次ライブラリーが作製される。次いで、ライブラリーがスクリーニングされ、所望の親和性を有する任意の抗体変異型を特定する。多様性を導入する別の方法は、数個のHVR残基(例えば、一度に4〜6個の残基)が無作為化されるHVR指向性アプローチを伴う。抗原結合に関与するHVR残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発またはモデリングを使用して、特異的に特定され得る。特に、CDR−H3及びCDR−L3が、しばしば標的化される。
ある特定の実施形態において、置換、挿入、または欠失は、かかる改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低減させない限り、1つ以上のHVR間で生じ得る。例えば、結合親和性を実質的に低減しない保存的改変(例えば、本明細書に提供される保存的置換)がHVRで行われ得る。かかる改変は、HVR「ホットスポット」またはSDRの外側であり得る。上述の変異体VH配列及びVL配列のある特定の実施形態では、各HVRは、改変されないか、または1つ、2つ、もしくは3つ以下のアミノ酸置換を含有するかのいずれかである。
変異誘発のために標的とされ得る抗体の残基または領域の特定に有用な方法は、Cunningham and Wells(1989)Science,244:1081−1085によって説明される「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、残基または標的残基群(例えば、arg、asp、his、lys、及びglu等の荷電残基)が特定され、中性または負荷電アミノ酸(例えば、アラニンまたはポリアラニン)によって置き換えられて、抗体と抗原との相互作用に影響が及ぼされたかを決定する。さらなる置換が最初の置換に対する機能感受性を示すアミノ酸位置に導入され得る。代替的に、または追加的に、抗原−抗体複合体の結晶構造を使用して、抗体と抗原との間の接触点が特定される。かかる接触残基及び隣接する残基が置換の候補として標的とされ得るか、または排除され得る。変異体がスクリーニングされて、それらが所望の特性を有するかを決定することができる。
アミノ酸配列挿入には、長さが1残基から100以上の残基を含有するポリペプチドの範囲であるアミノ末端及び/またはカルボキシル末端の融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例としては、N末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異体には、酵素(例えば、ADEPTのための)またはポリペプチドへの抗体のN末端もしくはC末端の融合が挙げられ、これは抗体の血清半減期を増加させる。
b)グリコシル化変異体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるように変化させる。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、1つ以上のグリコシル化部位が作製または除去されるようにアミノ酸配列を変化させることによって好都合に達成され得る。
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるように変化させる。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、1つ以上のグリコシル化部位が作製または除去されるようにアミノ酸配列を変化させることによって好都合に達成され得る。
抗体がFc領域を含む場合、それに結合した炭水化物が変化させ得る。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は、典型的には、N結合によってFc領域のCH2ドメインのAsn297に一般に結合される分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Wright et al.TIBTECH 15:26−32(1997)を参照のこと。オリゴ糖としては、様々な炭水化物、例えば、マンノース、N−アセチルグルコサミン(GlcNAc)、ガラクトース、及びシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「幹」のGlcNAcに結合したフコースが挙げられ得る。いくつかの実施形態において、本発明の抗体中におけるオリゴ糖の改変は、特定の特性の改善を有する抗体変異体を作製するために行われ得る。
いくつかの実施形態において、Fc領域に(直接または間接的に)結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体変異体が提供される。例えば、かかる抗体中のフコースの量は、1%〜80%、1%〜65%、5%〜65%、または20%〜40%であり得る。フコースの量は、例えば、WO2008/077546に記載されるMALDI−TOF質量分析法によって測定される、Asn297に結合した全ての糖構造(例えば、複合体、ハイブリッド、及び高マンノース構造)の合計に対する、Asn297での糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Asn297は、Fc領域の約297位(Fc領域残基のEu番号付け)に位置するアスパラギン残基を指すが、Asn297もまた、抗体の軽微な配列変異に起因して、297位の上流または下流の約±3アミノ酸に、すなわち294〜300位の間に位置してもよい。かかるフコシル化変異体は、改善されたADCC機能を有し得る。例えば、米国特許公開第2003/0157108号(Presta,L.)、同第2004/0093621号(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)を参照のこと。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体変異体に関する刊行物の例としては、US2003/0157108、WO2000/61739、WO2001/29246、US2003/0115614、US2002/0164328、US2004/0093621、US2004/0132140、US2004/0110704、US2004/0110282、US2004/0109865、WO2003/085119、WO2003/084570、WO2005/035586、WO2005/035778、WO2005/053742、WO2002/031140、Okazaki et al.J.Mol.Biol.336:1239−1249(2004)、Yamane−Ohnuki et al.Biotech.Bioeng.87:614(2004)が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生することが可能な細胞株の例としては、タンパク質フコシル化が欠損したLec13 CHO細胞(Ripka et al.Arch.Biochem.Biophys.249:533−545(1986)、米国特許出願第2003/0157108A1号、Presta,L、及びWO2004/056312A1、Adams et al.、特に実施例11)、ならびにアルファ−1,6−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、FUT8、ノックアウトCHO細胞等のノックアウト細胞株(例えば、Yamane−Ohnuki et al.Biotech.Bioeng.87:614(2004)、Kanda,Y.et al.,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680−688(2006)、及びWO2003/085107)が挙げられる。
例えば、抗体のFc領域に結合した二分岐オリゴ糖がGlcNAcによって二分される、二分されたオリゴ糖を有する抗体変異体がさらに提供される。かかる抗体変異体は、低減されたフコシル化及び/または改善されたADCC機能を有し得る。かかる抗体変異体の例は、例えば、WO2003/011878(Jean−Mairet et al.)、米国特許第6,602,684号(Umana et al.)、及び米国特許公開第2005/0123546号(Umana et al.)に記載されている。Fc領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも1つのガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。かかる抗体変異体は、改善されたCDC機能を有し得る。かかる抗体変異体は、例えば、WO1997/30087(Patel et al.)、WO1998/58964(Raju,S.)、及びWO1999/22764(Raju,S.)に記載されている。
c)Fc領域変異体
ある特定の実施形態において、1つ以上のアミノ酸改変が、本明細書に提供される抗体のFc領域に導入され、それによりFc領域変異体が生成され得る。Fc領域変異体は、1つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸改変(例えば、置換)を含むヒトFc領域配列(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4 Fc領域)を含み得る。
ある特定の実施形態において、1つ以上のアミノ酸改変が、本明細書に提供される抗体のFc領域に導入され、それによりFc領域変異体が生成され得る。Fc領域変異体は、1つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸改変(例えば、置換)を含むヒトFc領域配列(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4 Fc領域)を含み得る。
ある特定の実施形態において、本発明は、全てではないが、いくつかのエフェクター機能を有することにより、インビボでの抗体の半減期が重要であるが、ある特定のエフェクター機能(補体及びADCC等)が不要または有害である用途に望ましい候補となる抗体変異体を企図する。インビトロ及び/またはインビボ細胞傷害性アッセイを行って、CDC及び/またはADCC活性の低減/欠乏を確認することができる。例えば、Fc受容体(FcR)結合アッセイを行って、抗体がFcγR結合を欠く(故にADCC活性を欠く可能性が高い)が、FcRn結合能力を保持していることを確実にすることができる。ADCCを媒介するための初代細胞であるNK細胞が、Fc(RIIIのみを発現する一方で、単球は、Fc(RI、Fc(RII、及びFc(RIIIを発現する。造血細胞でのFcR発現は、Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457−492(1991)の464頁の表3に要約されている。目的の分子のADCC活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第5,500,362号(例えば、Hellstrom,I.et al.Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059−7063(1986)を参照のこと)及びHellstrom,I et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82:1499−1502(1985)、同第5,821,337号(Bruggemann,M.et al.,J.Exp.Med.166:1351−1361(1987)を参照のこと)に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いてもよい(例えば、フローサイトメトリーのためのACTI(商標)非放射性細胞傷害性アッセイ(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA、及びCytoTox 96(登録商標)非放射性細胞傷害性アッセイ(Promega,Madison,WI)を参照のこと)。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞(PBMC)及びナチュラルキラー(NK)細胞が挙げられる。代替的に、または追加的に、目的の分子のADCC活性は、インビボで、例えば、Clynes et al.Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652−656(1998)に開示されるもの等の動物モデルにおいて評価されてもよい。C1q結合アッセイを実行して、抗体がC1qに結合することができず、それ故にCDC活性を欠くことを確認することもできる。例えば、WO2006/029879及びWO2005/100402におけるC1q及びC3c結合ELISAを参照のこと。補体活性化を評価するために、CDCアッセイを行ってもよい(例えば、Gazzano−Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996)、Cragg,M.S.et al.,Blood 101:1045−1052(2003)、及びCragg,M.S.and M.J.Glennie,Blood 103:2738−2743(2004)を参照のこと)。FcRn結合及びインビボクリアランス/半減期決定もまた、当該技術分野で既知の方法を使用して行うことができる(例えば、Petkova,S.B.et al.,Int’l.Immunol.18(12):1759−1769(2006)を参照のこと)。
いくつかの実施形態において、新生児Fc受容体へのIgG結合を増加させるために、1つ以上のアミノ酸改変が、本明細書に提供される抗体のFc部分に導入されてもよい。ある特定の実施形態において、抗体は、EU番号付けに従って3つの突然変異:M252Y、S254T、及びT256E(「YTE突然変異」)を含む(米国特許第8,697,650号、Dall’Acqua et al.,Journal of Biological Chemistry 281(33):23514−23524(2006)も参照のこと)。ある特定の実施形態において、YTE突然変異は、抗体がその同族抗原に結合する能力に影響を及ぼさない。ある特定の実施形態において、YTE突然変異は、抗体の血清半減期を、天然(すなわち、非YTE突然変異体)抗体と比較して増加させる。いくつかの実施形態において、YTE突然変異は、抗体の血清半減期を、天然(すなわち、非YTE突然変異体)抗体と比較して3倍増加させる。いくつかの実施形態において、YTE変異は、抗体の血清半減期を、天然(すなわち、非YTE突然変異体)抗体と比較して2倍増加させる。いくつかの実施形態において、YTE突然変異は、抗体の血清半減期を、天然(すなわち、非YTE突然変異体)抗体と比較して4倍増加させる。いくつかの実施形態において、YTE突然変異は、抗体の血清半減期を、天然(すなわち、非YTE突然変異体)抗体と比較して少なくとも5倍増加させる。いくつかの実施形態において、YTE突然変異は、抗体の血清半減期を、天然(すなわち、非YTE突然変異体)抗体と比較して少なくとも10倍増加させる。例えば、米国特許第8,697,650号を参照のこと。また、Dall’Acqua et al.,Journal of Biological Chemistry 281(33):23514−23524(2006)も参照のこと。
ある特定の実施形態において、YTE変異は、抗体の抗体依存的細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)活性を調節する手段を提供する。ある特定の実施形態において、YTEO変異は、ヒト抗原に対するヒト化IgG抗体のADCC活性を調節する手段を提供する。例えば、米国特許第8,697,650号を参照のこと。また、Dall’Acqua et al.,Journal of Biological Chemistry 281(33):23514−23524(2006)も参照のこと。
ある特定の実施形態において、YTE変異は、血清半減期、組織分布、及び抗体活性(例えば、IgG抗体のADCC活性)の同時調節を可能にする。例えば、米国特許第8,697,650号を参照のこと。また、Dall’Acqua et al.,Journal of Biological Chemistry 281(33):23514−23524(2006)も参照のこと。
低減したエフェクター機能を有する抗体としては、Fc領域残基238、265、269、270、297、327、及び329のうちの1つ以上の置換を有する抗体が挙げられる(米国特許第6,737,056号)。かかるFc変異には、残基265及び297のアラニンへの置換を有するいわゆる「DANA」Fc変異体を含む、アミノ酸265位、269位、270位、297位、及び327位のうちの2つ以上における置換を有するFc変異体が含まれる(米国特許第7,332,581号)。
ある特定の実施形態において、野生型ヒトFc領域の329位(EU番号付け)(P329)におけるプロリンは、グリシンもしくはアルギニン、またはFcのP329とFcγRIIIのトリプトファン残基W87及びW110との間に形成されるFc/Fcγ受容体界面内でプロリンサンドイッチを破壊するのに十分に大きいアミノ酸残基で置換される(Sondermann et al.:Nature 406,267−273(20 July 2000))。さらなる実施形態において、Fc変異体内の少なくとも1つのさらなるアミノ酸置換は、S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D、またはP331Sであり、さらに別の実施形態において、該少なくとも1つのさらなるアミノ酸置換は、ヒトIgG1 Fc領域のL234A及びL235A、またはヒトIgG4 Fc領域のS228P及びL235Eであり、これらは全て、EU番号付けに従うものである(米国特許第8,969,526号であり、これは参照によりその全体が組み込まれる)。
ある特定の実施形態において、ポリペプチドは、野生型ヒトIgG Fc領域のFc変異体を含み、このポリペプチドは、グリシンで置換されたヒトIgG Fc領域のP329を有し、Fc変異体は、ヒトIgG1 Fc領域のL234A及びL235A、またはヒトIgG4 Fc領域のS228P及びL235Eにおいて少なくとも2つのさらなるアミノ酸置換を含み、残基は、EU番号付けに従って番号付けされる(米国特許第8,969,526号であり、これは参照によりその全体が組み込まれる)。ある特定の実施形態において、P329G、L234A、及びL235A(EU番号付け)置換を含むポリペプチドでは、野生型ヒトIgG Fc領域を含むポリペプチドによりADCCが少なくともその20%に下方調節される場合、及び/またはADCPが下方調節される場合は、ヒトFcγRIIIA及びFcγRIIAに対する親和性の低下が示される(米国特許第8,969,526号であり、これは参照によりその全体が組み込まれる)。
特定の実施形態において、野生型ヒトFcポリペプチドのFc変異体を含むポリペプチドは、三重突然変異、EU番号付け(P329/LALA)に従いPro329、L234A、及びL235A位にアミノ酸置換を含む(米国特許第8,969,526号であり、これは参照によりその全体が組み込まれる)。特定の実施形態において、ポリペプチドは、以下のアミノ酸置換、すなわち、EU番号付けに従いP329G、L234A、及びL235Aを含む。
FcRへの結合が改善または低減されたある特定の抗体変異体が記載されている(例えば、米国特許第6,737,056号;WO2004/056312、及びShields et al.,J.Biol.Chem.9(2):6591−6604(2001)を参照のこと)。
ある特定の実施形態において、抗体変異体は、ADCCを改善する1つ以上のアミノ酸置換、例えば、Fc領域の298位、333位、及び/または334位(残基のEU番号付け)での置換を有するFc領域を含む。
いくつかの実施形態において、例えば、米国特許第6,194,551号、WO99/51642、及びIdusogie et al.J.Immunol.164:4178−4184(2000)に記載されるように、改変はFc領域内で行われ、C1q結合及び/または補体依存性細胞傷害性(CDC)の改変(すなわち、改善または低減)をもたらす。
増加した半減期、及び母体のIgG類を胎児に移行させる役割を負う新生児型Fc受容体(FcRn)(Guyer et al.,J.Immunol.117:587(1976)及びKim et al.,J.Immunol.24:249(1994))は、US2005/0014934A1(Hinton et al.)に記載されている。それらの抗体は、Fc領域のFcRnへの結合を改善する1つ以上の置換を有するFc領域を含む。かかるFc変異体には、Fc領域残基238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、または434のうちの1つ以上での置換、例えば、Fc領域残基434の置換を有するものを含む(米国特許第7,371,826号)。
Fc変異型の他の例に関して、Duncan&Winter,Nature 322:738−40(1988)、米国特許第5,648,260号、米国特許第5,624,821号、及びWO94/29351も参照のこと。
d)システイン操作抗体変異体
ある特定の実施形態において、抗体の1個以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作抗体、例えば、「THIOMAB(商標)」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施形態において、置換残基は、コンジュゲーションに利用可能な抗体の部位において生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性のチオール基がそれにより抗体の利用しやすい部位に位置付けられ、それを使用して、他の部分に抗体を複合体化して、本明細書にさらに記載されるように、コンジュゲートを作製することができる。ある特定の実施形態において、以下の残基、軽鎖のK149(Kabat番号付け)、軽鎖のV205(Kabat番号付け)、重鎖のA118(EU番号付け)、重鎖のA140(EU番号付け)、重鎖のL174(EU番号付け)、重鎖のY373(EU番号付け)、及び重鎖Fc領域のS400(EU番号付け)のうちの任意の1個以上が、システインで置換されてもよい。特定の実施形態において、本明細書に記載される抗体は、HC−A140C(EU番号付け)システイン置換を含む。特定の実施形態において、本明細書に記載される抗体は、LC−K149C(Kabat番号付け)システイン置換を含む。特定の実施形態において、本明細書に記載される抗体は、HC−A118C(EU番号付け)システイン置換を含む。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第7,521,541号に記載されるように生成され得る。
ある特定の実施形態において、抗体の1個以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作抗体、例えば、「THIOMAB(商標)」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施形態において、置換残基は、コンジュゲーションに利用可能な抗体の部位において生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性のチオール基がそれにより抗体の利用しやすい部位に位置付けられ、それを使用して、他の部分に抗体を複合体化して、本明細書にさらに記載されるように、コンジュゲートを作製することができる。ある特定の実施形態において、以下の残基、軽鎖のK149(Kabat番号付け)、軽鎖のV205(Kabat番号付け)、重鎖のA118(EU番号付け)、重鎖のA140(EU番号付け)、重鎖のL174(EU番号付け)、重鎖のY373(EU番号付け)、及び重鎖Fc領域のS400(EU番号付け)のうちの任意の1個以上が、システインで置換されてもよい。特定の実施形態において、本明細書に記載される抗体は、HC−A140C(EU番号付け)システイン置換を含む。特定の実施形態において、本明細書に記載される抗体は、LC−K149C(Kabat番号付け)システイン置換を含む。特定の実施形態において、本明細書に記載される抗体は、HC−A118C(EU番号付け)システイン置換を含む。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第7,521,541号に記載されるように生成され得る。
重鎖内の、抗体Fab断片中のシステイン置換に好適な残基は、110、136、170、175、183、及び205位(Kabat番号付け)を含む。
e)抗体誘導体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、当該技術分野で既知であり、かつ容易に入手可能な追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに改変され得る。抗体の誘導体化に好適な部分には、水溶性ポリマーが含まれるが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−1,3−ジオキソラン、ポリ−1,3,6−トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか)、及びデキストランまたはポリ(n−ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造において有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量であり得、分岐状または非分岐状であり得る。抗体に結合するポリマーの数は異なり得、1つ以上のポリマーが結合する場合、それらは同じ分子であっても異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び/または種類は、改善される抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が規定の条件下で使用されるかどうか等を含むがこれらに限定されない検討事項に基づいて決定され得る。
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、当該技術分野で既知であり、かつ容易に入手可能な追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに改変され得る。抗体の誘導体化に好適な部分には、水溶性ポリマーが含まれるが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−1,3−ジオキソラン、ポリ−1,3,6−トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか)、及びデキストランまたはポリ(n−ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造において有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量であり得、分岐状または非分岐状であり得る。抗体に結合するポリマーの数は異なり得、1つ以上のポリマーが結合する場合、それらは同じ分子であっても異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び/または種類は、改善される抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が規定の条件下で使用されるかどうか等を含むがこれらに限定されない検討事項に基づいて決定され得る。
別の実施形態において、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る抗体及び非タンパク質性部分の複合体が提供される。いくつかの実施形態において、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである(Kam et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600−11605(2005))。放射線は、任意の波長のものであり得、通常の細胞を傷つけないが、抗体−非タンパク質性部分に隣接する細胞が殺滅される温度まで非タンパク質性部分を加熱する波長を含むが、これらに限定されない。
B.組換え法及び組成物
抗体は、例えば、米国特許第4,816,567号に記載されるような組換え法及び組成物を使用して産生され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗D因子抗体をコードする単離核酸が提供される。かかる核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列及び/または抗体のVHを含むアミノ酸配列(例えば、抗体の軽鎖及び/または重鎖)をコードし得る。さらなる実施形態において、かかる核酸を含む1つ以上のベクター(例えば、発現ベクター)が提供される。さらなる実施形態において、かかる核酸を含む宿主細胞が提供される。1つのかかる実施形態において、宿主細胞は、(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列及び抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクター、及び抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクターを含む(例えば、それらで形質転換されている)。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞またはリンパ系細胞(例えば、Y0、NS0、Sp20細胞)である。いくつかの実施形態において、抗D因子抗体を作製する方法が提供され、上記に提供される抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、その抗体の発現に好適な条件下で培養することと、任意で、抗体を宿主細胞(または宿主細胞培養培地)から回収することとを含む、方法が提供される。
抗体は、例えば、米国特許第4,816,567号に記載されるような組換え法及び組成物を使用して産生され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗D因子抗体をコードする単離核酸が提供される。かかる核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列及び/または抗体のVHを含むアミノ酸配列(例えば、抗体の軽鎖及び/または重鎖)をコードし得る。さらなる実施形態において、かかる核酸を含む1つ以上のベクター(例えば、発現ベクター)が提供される。さらなる実施形態において、かかる核酸を含む宿主細胞が提供される。1つのかかる実施形態において、宿主細胞は、(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列及び抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクター、及び抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクターを含む(例えば、それらで形質転換されている)。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞またはリンパ系細胞(例えば、Y0、NS0、Sp20細胞)である。いくつかの実施形態において、抗D因子抗体を作製する方法が提供され、上記に提供される抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、その抗体の発現に好適な条件下で培養することと、任意で、抗体を宿主細胞(または宿主細胞培養培地)から回収することとを含む、方法が提供される。
抗D因子抗体の組換え産生のために、例えば、上述のもの等の抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び/または発現のために、1つ以上のベクター中に挿入される。かかる核酸は、従来の手順を使用して(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって)、容易に単離され、配列決定され得る。
抗体をコードするベクターのクローン化または発現に好適な宿主細胞には、本明細書に記載される原核生物細胞または真核生物細胞が含まれる。例えば、抗体は、特に、グリコシル化及びFcエフェクター機能が必要とされない場合に、細菌中で産生され得る。細菌内での抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第5,648,237号、同第5,789,199号、及び同第5,840,523号を参照のこと。(E.coliにおける抗体断片の発現について記載するCharlton,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ,2003),pp.245−254も参照のこと。)発現後、抗体は、可溶性画分中で細菌細胞ペーストから単離され得、さらに精製され得る。
原核生物に加えて、糸状菌または酵母等の真核微生物は、抗体をコードするベクターに好適なクローニングまたは発現宿主であり、そのグリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的または完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす、真菌及び酵母株を含む。Gerngross,Nat.Biotech.22:1409−1414(2004)、及びLi et al.,Nat.Biotech.24:210−215(2006)を参照のこと。
グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物(無脊椎動物及び脊椎動物)からも得られる。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。特にSpodoptera frugiperda細胞のトランスフェクションのために昆虫細胞と併せて使用され得る、多数のバキュロウイルス株が特定されている。
植物細胞培養物も宿主として利用することができる。例えば、米国特許第5,959,177号、同第6,040,498号、同第6,420,548号、同第7,125,978号、及び同第6,417,429号(トランスジェニック植物で抗体を産生するための、PLANTIBODIES(商標)技術について記載する)を参照のこと。
脊椎動物細胞も宿主として使用することができる。例えば、懸濁液中で成長するように適合された哺乳動物細胞株が、有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40により形質転換されたサル腎臓CV1株(COS−7)、ヒト胚性腎臓株(例えば、Graham et al.,J.Gen Virol.36:59(1977)に記載されるような293または293細胞);ベビーハムスター腎臓細胞(BHK);マウスセルトリ細胞(例えば、Mather,Biol.Reprod.23:243−251(1980)に記載されるTM4細胞)、サル腎臓細胞(CV1)、アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO−76)、ヒト子宮頚部癌細胞(HELA)、イヌ腎臓細胞(MDCK、バッファローラット肝臓細胞(BRL 3A)、ヒト肺細胞(W138)、ヒト肝臓細胞(Hep G2)、マウス乳房腫瘍(MMT 060562)、例えば、Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44−68(1982)に記載される、TRI細胞、MRC 5細胞、及びFS4細胞である。他の有用な哺乳類宿主細胞株には、DHFR−CHO細胞(Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))を含む、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞ならびにY0、NS0、及びSp2/0等の骨髄腫細胞株が含まれる。抗体産生に好適なある特定の哺乳類宿主細胞株の概説については、例えば、Yazaki and Wu,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ),pp.255−268(2003)を参照のこと。
C.アッセイ
本明細書に提供される抗D因子抗体は、それらの物理的/化学的特性及び/または生物学的活性について、当該技術分野で既知の様々なアッセイによって、特定され得るか、スクリーニングされ得るか、または特徴付けられ得る。
本明細書に提供される抗D因子抗体は、それらの物理的/化学的特性及び/または生物学的活性について、当該技術分野で既知の様々なアッセイによって、特定され得るか、スクリーニングされ得るか、または特徴付けられ得る。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、その抗原結合活性について、例えば、ELISA、BIACore(登録商標)、FACS、またはウェスタンブロット等の既知の方法によって試験される。
別の態様において、競合アッセイは、D因子への結合について本明細書に記載される抗体のいずれかと競合する抗体を特定するために使用され得る。ある特定の実施形態において、かかる競合抗体は、本明細書に記載される抗体によって結合されるのと同じエピトープ(例えば、線状または立体構造エピトープ)に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示の方法が、Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)に提供されている。
例示的な競合アッセイにおいて、固定化されたD因子は、D因子に結合する第1の標識抗体(例えば、本明細書に記載される抗体のいずれか)、及びD因子への結合について第1の抗体と競合するその能力について試験されている第2の未標識の抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第2の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在し得る。対照として、固定化されたD因子を、第1の標識抗体を含むが第2の未標識の抗体を含まない溶液中でインキュベートする。第1の抗体のD因子への結合を許容する条件下でのインキュベーションの後、過剰な非結合抗体を除去し、固定化されたD因子に関連する標識の量を測定する。固定化されたD因子に関連する標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に低減される場合、それは、第2の抗体がD因子への結合について第1の抗体と競合していることを示す。Harlow and Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)を参照のこと。
抗D因子抗体、またはその変異体もしくは断片(例えば、抗原結合断片)は、D因子への結合及び生物学的効果、例えば、代替の生物学的経路溶血の阻害を発揮することができるかどうかを決定するために、溶血性阻害アッセイ、例えば、ウサギRBCを用いて使用され得る。かかる溶血性阻害は、標準的なアッセイを用いて決定され得る(Kostavasili et al.(1997)J of Immunology 158:1763−72、Wiesmann et al.(2006)Nature 444:159−60)。かかるアッセイにおける補体活性化は、血清または血漿から開始され得る。血清または血漿中のD因子の適切な濃度(Pascual et al.(1998)Kidney International 34:529−536、Complement Facts Book,Bernard J.Morley and Mark J.Walport,editors,Academic Press(2000)、Barnum et al.(1984)J.Immunol.Methods,67:303−309)は、当該技術分野で既知の方法に従って日常的に決定することができ、これには、Pascual et al.(1998)Kidney International 34:529−536及びBarnum et al.(1984)J.Immunol.Methods 67:303−309等の参照文献に記載されているものが含まれる。本開示は、概して、D因子と関連する生物学的活性を阻害することができる抗体に関する。例えば、18μg/mlの濃度(血液中のヒトD因子のモル濃度の約1.5倍に相当する;約1.5:1の抗D因子抗体対D因子のモル比)で、抗体による代替の補体の活性の有意な阻害が観察され得る(例えば、米国特許第6,956,107号を参照のこと)。
いくつかの実施形態において、本開示は、抗D因子抗体及びそのコンジュゲートを対象とし、かかる抗体のFab断片は、30nM未満、または15nM未満、または10nM未満、または5nM未満のIC50値で代替経路溶血を阻害する。いくつかの実施形態において、本開示は、抗D因子抗体及びそのコンジュゲートを対象とし、かかる抗体のFab断片は、30nM〜2nM、または25nM〜2nM、または20nM〜2nM、または10nM〜2nM、または7nM〜2nMのIC50値で代替経路溶血を阻害する。
いくつかの実施形態において、本開示は、抗D因子抗体及びそのコンジュゲートを対象とし、かかる抗体のFab断片は、80nM未満、または50nM未満、または40nM未満、または20nM未満、または15nM未満のIC90値で代替経路溶血を阻害する。いくつかの実施形態において、本開示は、抗D因子抗体及びそのコンジュゲートを対象とし、かかる抗体のFab断片は、80nM〜5nM、または75nM〜5nM、または70nM〜5nM、または65nM〜5nM、または60nM〜5nM、または55nM〜5nM、または50nM〜5nM、または50nM〜10nMのIC90値で代替経路溶血を阻害する。
いくつかの実施形態において、本開示は、抗D因子抗体及びそのコンジュゲートを対象とし、かかる抗体のFab断片は、約0.05:1(0.05)〜約10:1(10)、または約0.09:1(0.09)〜約8:1(8)、または約0.1:1(0.1)〜約6:1(6)、または約0.15:1(0.15)〜約5:1(5)、または約0.19:1(0.19)〜約4:1(4)、または約0.2:1(0.2)〜約3:1(3)、または約0.3:1(0.3)〜約2:1(2)、または約0.4:1(0.4)〜約1:1(1)、または約0.5:1(0.5)〜約1:2(0.5)、または約0.6:1(0.6)〜約1:3(0.33)、または約0.7:1(0.7)〜約1:4(0.25)、または約0.8:1(0.8)〜約1:5(0.2)、または約0.9:1(0.9)〜約1:6(0.17)の抗体対D因子のモル比で代替経路溶血を阻害する。
いくつかの実施形態において、本開示は、抗D因子抗体、及びヒト化抗D因子抗体の断片(例えば、抗原結合断片)を含むコンジュゲートを対象とする。本開示の抗体断片は、例えば、Fv、Fab、Fab−SH、Fab’−SH、Fab’、Fab−C、Fab’−C、Fab’−C−SH、Fab−C−SH、scFv、ダイアボディ、またはF(ab’)2、dAb、相補性決定領域(CDR)断片、線状抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、または抗体断片から形成される多特異的抗体であり得る。さらなる実施形態において、本開示は、全ての網膜を実質的に貫通することができるヒト化抗D因子抗体断片またはそのコンジュゲート(例えば、抗原結合断片)を対象とする。なおさらなる実施形態において、本開示は、全ての網膜を実質的に貫通することができるヒト化抗D因子抗体断片またはそのコンジュゲート(例えば、抗原結合断片)を対象とする。
いくつかの実施形態において、本開示は、抗D因子抗体を含むコンジュゲートを対象とし、かかる抗体のコンジュゲートされていないFab断片は、単一の硝子体内注入を介しての哺乳動物の眼(例えばヒト)中への投与後、少なくとも3、5、7、10、または12日の半減期を有する。いくつかの実施形態において、本開示は、ヒト化抗D因子抗体を含むコンジュゲートを対象とし、かかる抗体のコンジュゲートされていないFab断片は、単一の硝子体内注入を介しての哺乳動物の眼(例えばヒト)中への投与後、少なくとも40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、または115日間、代替経路(AP)の補体活性化を阻害する。別の実施形態において、本開示は、ヒト化抗D因子抗体を含むコンジュゲートを対象とし、代替経路(AP)の補体活性化を阻害するかかる抗体のコンジュゲートされていないFab断片の濃度は、単一の硝子体内注入を介しての哺乳動物の眼(例えばヒト)中への投与後、少なくとも40、45、50、55、60、65、70、75、80、または85日間、網膜組織中に維持される。別の実施形態において、本開示は、ヒト化抗D因子抗体を含むコンジュゲートを対象とし、代替経路(AP)の補体活性化を阻害するかかる抗体のコンジュゲートされていないFab断片の濃度は、単一の硝子体内注入を介しての哺乳動物の眼(例えばヒト)中への投与後、少なくとも80、85、90、95、100、105、110、または115日間、硝子体液中に維持される。
D.コンジュゲート
本発明はまた、ポリオール等の1つ以上の異種分子にコンジュゲートされる本明細書に提供される任意の抗D因子抗体を含むコンジュゲートも提供する。
本発明はまた、ポリオール等の1つ以上の異種分子にコンジュゲートされる本明細書に提供される任意の抗D因子抗体を含むコンジュゲートも提供する。
1.多アーム型ポリマー
いくつかの実施形態において、本開示のコンジュゲートは、多アーム型ポリマーで抗体またはその変異体をコンジュゲートすることによって、本明細書に記載される抗D因子抗体を誘導体化することによって行われ得る。所望のサイズでコンジュゲートを提供するか、または本明細書に記載される選択された平均分子量を有するいずれの多アーム型ポリマーが、本開示の抗体−ポリマーコンジュゲートの構築に用いるのに適していると理解されよう。
いくつかの実施形態において、本開示のコンジュゲートは、多アーム型ポリマーで抗体またはその変異体をコンジュゲートすることによって、本明細書に記載される抗D因子抗体を誘導体化することによって行われ得る。所望のサイズでコンジュゲートを提供するか、または本明細書に記載される選択された平均分子量を有するいずれの多アーム型ポリマーが、本開示の抗体−ポリマーコンジュゲートの構築に用いるのに適していると理解されよう。
多くのポリマーは、医薬品で用いるのに適している。例えば、Davis et al.,Biomedical Polymers:Polymeric Materials and Pharmaceuticals for Biomedical Use,pp.441−451(1980)を参照のこと。本開示の全ての実施形態において、非タンパク質ポリマーは、本開示のコンジュゲートを形成するために使用される。非タンパク質ポリマーは、通常、親水性合成ポリマー、すなわち、実際には見出されないポリマーである。しかしながら、実際に存在し、組換えまたはインビトロ方法によって生成される、ポリマーはまた、天然源から単離されるポリマーであるように、有用であり得る。
いくつかの実施形態において、抗D因子抗体は、多アーム型ポリオールに、抗体またはその変異体をコンジュゲートすること(例えば、共有結合すること)によって誘導体化される。それ故に、いくつかの態様において、本開示は、1つ以上の多アーム型ポリオールに共有結合している、本明細書に開示される1つ以上の抗D因子抗体または抗体変異体を含むコンジュゲートを対象とする。用いられるポリオールは、任意の水溶性ポリ(アルキレンオキシド)ポリマーであり得、直鎖または分岐鎖を有し得る。好適なポリオールには、1つ以上のヒドロキシル位置に化学基、例えば1〜4個の炭素を有するアルキル基が置換されているものが含まれる。典型的には、ポリオールは、ポリ(アルキレングリコール)、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)であり、それ故に、説明を簡略化するために、考察の残りの部分は、例示の実施形態に関し、用いられるポリオールがPEGであり、ポリペプチドへのポリオールをコンジュゲートするプロセスは、「ペグ化」と称される。しかしながら、当業者であれば、他のポリオール、例えば、ポリ(プロピレングリコール)及びポリエチレン−ポリプロピレングリコールコポリマーを、PEGについて本明細書に記載されるコンジュゲートのための技術を使用して用いることができることが理解されよう。
本開示のコンジュゲートを形成するために使用されるポリオールは、多アーム型ポリオールである。本明細書で使用される場合、「多アーム型ポリオール」は、少なくとも2つのアームを結合するコア構造を含むポリオールを指す。多アーム型ポリオールは、例えば、二量体(2つのアーム)、四量体(4つのアーム)、六量体(6つのアーム)、八量体(8つのアーム)等であり得る。いくつかの態様において、多アーム型ポリオールは、多アーム型PEGである。
抗D因子抗体及び抗体変異体のペグ化に使用される多アーム型PEGの重量平均分子量は、異なり得、典型的には、約500〜約300,000ダルトン(D)の範囲に及び得る。いくつかの実施形態において、多アーム型PEGの重量平均分子量は、約1,000〜約100,000Dであり、いくつかの態様において、約20,000〜約60,000Dである。いくつかの実施形態において、ペグ化は、約40,000Dの重量平均分子量を有する多アームPEGで行われる。
タンパク質をペグ化するための様々な方法は、当該技術分野で既知である。PEGにコンジュゲートされたタンパク質を生成する特定の方法は、米国特許第4,179,337号、米国特許第4,935,465号、米国特許第5,849,535号に記載されており、これらの全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。典型的には、タンパク質は、タンパク質のアミノ酸残基のうちの1つ以上を介してポリマー上の末端反応基と共有結合している。反応基(複数可)を有するポリマーは、活性化または官能性化ポリマー(例えば、官能性化PEG)として本明細書に示される。反応基は、抗体または抗体変異体上の遊離スルフヒドリルまたはアミノまたは他の反応基と選択的に反応する。多アーム型PEGポリマーは、ランダムまたは部位特異的様式のいずれかで抗体または抗体変異体上のスルフヒドリルまたはアミノまたは他の反応基と結合し得る。しかしながら、最適結果を得るために、選択される反応基の型及び量、ならびに用いられるポリマーの型及び量が、抗体上の多すぎる活性基と反応する反応基を有することを制限し、好ましくは実質的には回避するために用いられる特定の抗体または抗体変異体に応じて異なることが理解されよう。場合によっては、これを十分に制限または回避することが可能でない場合があるため、典型的には、約0.05〜約1000モル、またはいくつかの実施形態において、抗体濃度に応じて、抗体の1モル当たり約0.05〜約200モルの官能化ポリマーが、用いられ得る。抗体の1モル当たりの官能化ポリマーの最終量は、最適活性を維持するための平衡であるが、可能であれば、抗体の硝子体液、網膜、及び/または房水半減期を同時に最適化する。
N末端アミノ酸基等の残基が、抗体または抗体変異体上の任意の反応アミノ酸であり得るが、いくつかの実施形態において、反応性アミノ酸はシステインであり、これは官能化ポリマーの反応基にその遊離チオール基を通して結合しており、これらは、例えば、WO99/03887、WO94/12219、WO94/22466、米国特許第5,206,344号、米国特許第5,166,322、及び米国特許第5,206,344号に記載されており、これらの全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。かかる実施形態において、ポリマーは、親抗体上の遊離スルフヒドリルまたはチオール基(複数可)と特異的に反応することができる少なくとも1つの末端反応基を含み得る。かかる基としては、とりわけ、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフルオロメタンスルホネート、トシレート、アジリジン、エポキシド、ピリジルジスルフィド、スクシンイミジルエステル、−NH2、アルデヒド、ハロアセテート、ハロアセトアミド、及びパラ−ニトロフェニルカルボネートが挙げられるが、これらに限定されない。ポリマーは、米国特許第4,179,337号、米国特許第7,122,636号、及びJevsevar,et al.,Biotech J.,Vol.5,pp.113−128(2010)に記載される、プロトコル及びシステム等の選択されるカップリング系の化学に適している任意のプロトコルを用いて、親抗体と結合し得る。あるいは、反応アミノ酸は、リジン(その遊離エプシロン−アミノ基を介して官能化ポリマーの反応基に連結される)(例えば、WO93/00109を参照されたく、これは参照により本明細書に組み込まれる)であり得るか、またはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸(アミド結合を介して重合体に連結される)であり得る。次いで、ポリマーの反応基は、例えば、共有結合を形成するために、タンパク質のα(アルファ)及びε(エプシロン)アミンまたはスルフヒドリル基と反応させることができる。本開示が、抗体または抗体断片とポリマーとの間の任意の特定のタイプの連結を使用するコンジュゲートに限定されないことが理解されよう。
本開示のコンジュゲートを調製するのに用いるために好適な官能化多アーム型PEGは、多くの従来の反応によって生成され得る。例えば、PEGのN−ヒドロキシスクシンイミドエステル(M−NHS−PEG)は、Buckmann and Merr,Makromol.Chem.,Vol.182,pp.1379−1384(1981)の方法に従って、PEG−モノメチルエーテルから、N,N’−ジクロロヘキシルカルボジイミド(DCC)及びN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)との反応によって調製することができる。加えて、PEG末端ヒドロキシ基は、例えば、臭化チオニルと反応させて、PEG−Brを形成した後、過剰のアンモニアでアミノ分解して、PEG−NH2を形成することによって、アミノ基に転換することができる。次いで、PEG−NH2は、ウッドワード試薬K等の標準的なカップリング試薬を用いて、目的の抗体または抗体変異体にコンジュゲートされ得る。さらに、PEG末端CH2OH基は、例えば、MnO2での酸化によってアルデヒド基に転換することができる。アルデヒド基は、水素化シアノホウ素等の試薬を用いる還元性アルキル化によって抗体または抗体変異体にコンジュゲートされ得る。
いくつかの実施形態において、本開示のコンジュゲートを調製するために使用される多アーム型PEGは、一般式(I)の構造を有し、
式中、各mは、ポリオール(PEG)の特定のアームの長さまたはサイズを示し、独立して、約45〜約1000、約3〜約250、または約50〜約200、または約100〜約150の整数であり、nは、約1〜約10の整数である。
式中、各mは、ポリオール(PEG)の特定のアームの長さまたはサイズを示し、独立して、約45〜約1000、約3〜約250、または約50〜約200、または約100〜約150の整数であり、nは、約1〜約10の整数である。
いくつかの実施形態において、多アーム型PEGは、一般式(I)の構造を有し、式中、nは、1であり、多アーム型PEGは、四量体である。別の実施形態において、多アーム型PEGは、一般式(I)の構造を有し、式中、nは、2であり、多アーム型PEGは、六量体である。別の実施形態において、多アーム型PEGは、一般式(I)の構造を有し、式中、nは、3であり、多アーム型PEGは、八量体である。
別の態様において、本開示のコンジュゲートを調製するために使用される多アーム型PEGは、一般式(II)の構造を有し、
式中、各mは、ポリオール(PEG)の特定のアームの長さまたはサイズを示し、独立して、約45〜約1000、約3〜約250、または約50〜約200、または約100〜約150の整数であり、nは、約1〜約10の整数である。
式中、各mは、ポリオール(PEG)の特定のアームの長さまたはサイズを示し、独立して、約45〜約1000、約3〜約250、または約50〜約200、または約100〜約150の整数であり、nは、約1〜約10の整数である。
いくつかの実施形態において、多アーム型PEGは、一般式(II)の構造を有し、式中、nは、2であり、多アーム型PEGは、四量体である。別の実施形態において、多アーム型PEGは、一般式(II)の構造を有し、式中、nは、4であり、多アーム型PEGは、六量体である。別の実施形態において、多アーム型PEGは、一般式(II)の構造を有し、式中、nは、6であり、多アーム型PEGは、八量体である。
別の態様において、本開示のコンジュゲートを調製するために使用される多アーム型PEGは、一般式(III)の構造を有し、
式中、各mは、ポリオール(PEG)の特定のアームの長さまたはサイズを示し、独立して、約45〜約1000、約3〜約250、または約50〜約200、または約100〜約150の整数であり、nは、約1〜約10の整数である。
式中、各mは、ポリオール(PEG)の特定のアームの長さまたはサイズを示し、独立して、約45〜約1000、約3〜約250、または約50〜約200、または約100〜約150の整数であり、nは、約1〜約10の整数である。
いくつかの実施形態において、多アーム型PEGは、一般式(III)の構造を有し、式中、nは、2であり、多アーム型PEGは、四量体である。別の実施形態において、多アーム型PEGは、一般式(III)の構造を有し、式中、nは、4であり、多アーム型PEGは、六量体である。別の実施形態において、多アーム型PEGは、一般式(III)の構造を有し、式中、nは、6であり、多アーム型PEGは、八量体である。
別の態様において、本開示のコンジュゲートを調製するために使用される多アーム型PEGは、一般式(IV)の構造を有し、
(IV)
式中、各mは、ポリオール(PEG)の特定のアームの長さまたはサイズを示し、独立して、約45〜約1000、約3〜約250、または約50〜約200、または約100〜約150の整数である。
(IV)
式中、各mは、ポリオール(PEG)の特定のアームの長さまたはサイズを示し、独立して、約45〜約1000、約3〜約250、または約50〜約200、または約100〜約150の整数である。
一般式(I)〜(IV)のうちのいずれかの構造を有する多アーム型PEGは、例えば、官能化多アーム型PEGを生成するために上述の技術のうちのいずれかを用いて、抗体(例えば、抗体断片)と反応するか、またはこれにコンジュゲートするのに適している末端反応基と結合するように官能化され得る。他の実施形態において、しかしながら、多アーム型PEGは、例えば、米国特許第7,122,636号(これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載されるように、PEG及び連結される抗体または抗体変異体の1つ以上のアミノ酸残基と反応する多機能性架橋剤を通して抗D因子抗体に共有結合され得る。
他の態様において、本開示のコンジュゲートを調製するために使用される多アーム型PEGは、少なくとも1つの末端反応基を含む官能化多アーム型PEGである。末端反応基は、本開示のコンジュゲートを形成するために、抗D因子抗体に直接コンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(Ia)の構造を有し、
式中、各mは、ポリオール(PEG)の特定のアームの長さまたはサイズを示し、独立して、約45〜約1000、約3〜約250、または約50〜約200、または約100〜約150の整数であり、nは、約1〜約10の整数であり、各R1は、独立して、不在であるか、または連結基であり、各R2は、独立して、水素または末端反応基であり、かつ少なくとも1つのR2は、末端反応基である。いくつかの実施形態において、R2は、独立して、チオール反応基、アミノ反応基、及びこれらの組み合わせから選択される。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(Ia)の構造を有し、式中、nは、1〜3の整数である。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(Ia)の構造を有し、式中、nは、1であり、多アーム型PEGは、四量体である。別の実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(Ia)の構造を有し、式中、nは、2であり、多アーム型PEGは、六量体である。別の実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(Ia)の構造を有し、式中、nは、3であり、多アーム型PEGは、八量体である。かかる実施形態において、八量体は、一般式(Ib)の構造を有し、
(Ib)
式中、m、R1、及びR2は、上に定義されるとおりである。
(Ib)
式中、m、R1、及びR2は、上に定義されるとおりである。
一般式(Ib)の構造を有する多アーム型PEGは、トリペンタエリトリトール(TP)コア構造を有し、本明細書において、TP八量体とも称される。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(Ia)または(Ib)の構造を有し、式中、各R1は、存在する場合、同じであるか、または異なり、R1及びR2は、1つにまとめると、
ならびにこれらの組み合わせから選択され、式中、各iは、独立して、0〜10の整数であり、jは、0〜10の整数であり、R2は、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、各R1は、連結基である。
ならびにこれらの組み合わせから選択され、式中、各iは、独立して、0〜10の整数であり、jは、0〜10の整数であり、R2は、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、各R1は、連結基である。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(Ia)または(Ib)の構造を有し、式中、R1及びR2は、1つにまとめると、
であり、式中、i、j、及びR2は、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、R1及びR2は、1つにまとめると、
であり、式中、iは、2であり、jは、2または3であり、R2は、本明細書に定義されるとおりである。
であり、式中、i、j、及びR2は、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、R1及びR2は、1つにまとめると、
であり、式中、iは、2であり、jは、2または3であり、R2は、本明細書に定義されるとおりである。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(Ia)または(Ib)の構造を有し、式中、各R2は、独立して、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフルオロメタンスルホネート、トシレート、アジリジン、エポキシド、ピリジルジスルフィド、スクシンイミジルエステル、−NH2、アルデヒド、ハロアセテート、ハロアセトアミド、及びパラ−ニトロフェニルカルボネートから選択される。いくつかの実施形態において、各R2は、独立して、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸、及びこれらの組み合わせから選択される、ハロアセテートである。いくつかの実施形態において、各R2は、独立して、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸、及びこれらの組み合わせから選択される、ハロアセトアミドである。いくつかの実施形態において、R2は、マレイミドである。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(Ia)または(Ib)の構造を有し、式中、各R2は、マレイミドである。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(Ia)または(Ib)の構造を有し、式中、R1及びR2は、一緒にまとめると、
であり、式中、i及びjは、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(Ia)または(Ib)の構造を有し、式中、R1及びR2は、一緒にまとめると、
であり、式中、iは、2であり、jは、2である。
であり、式中、i及びjは、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(Ia)または(Ib)の構造を有し、式中、R1及びR2は、一緒にまとめると、
であり、式中、iは、2であり、jは、2である。
式中、各mは、ポリオール(PEG)の特定のアームの長さまたはサイズを示し、独立して、約45〜約1000、約3〜約250、または約50〜約200、または約100〜約150の整数であり、nは、約1〜約10の整数であり、各R1は、独立して、不在であるか、または連結基であり、各R2は、独立して、水素または末端反応基であり、かつ少なくとも1つのR2は、末端反応基である。いくつかの実施形態において、R2は、独立して、チオール反応基、アミノ反応基、及びこれらの組み合わせから選択される。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(IIa)の構造を有し、式中、nは、2〜6の整数である。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(IIa)の構造を有し、式中、nは、2であり、多アーム型PEGは、四量体である。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(IIa)の構造を有し、式中、nは、3である。別の実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(IIa)の構造を有し、式中、nは、4であり、多アーム型PEGは、六量体である。別の実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(IIa)の構造を有し、式中、nは、6であり、多アーム型PEGは、八量体である。一般式(IIa)の構造を有する八量体は、ヘキサグリセリン(HG)コア構造を有し、本明細書において、HG八量体とも称される。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(IIa)の構造を有し、式中、各R1は、存在する場合、同じであるか、または異なり、R1及びR2は、一緒にまとめると、
ならびにこれらの組み合わせから選択され、式中、各iは、独立して、0〜10の整数であり、jは、0〜10の整数であり、R2は、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、各R1は、連結基である。
ならびにこれらの組み合わせから選択され、式中、各iは、独立して、0〜10の整数であり、jは、0〜10の整数であり、R2は、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、各R1は、連結基である。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(IIa)の構造を有し、式中、R1及びR2は、一緒にまとめると、
であり、式中、i、j、及びR2は、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、R1及びR2は、1つにまとめると、
であり、式中、iは、2であり、jは、2または3であり、R2は、本明細書に定義されるとおりである。
であり、式中、i、j、及びR2は、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、R1及びR2は、1つにまとめると、
であり、式中、iは、2であり、jは、2または3であり、R2は、本明細書に定義されるとおりである。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(IIa)の構造を有し、式中、各R2は、独立して、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフルオロメタンスルホネート、トシレート、アジリジン、エポキシド、ピリジルジスルフィド、スクシンイミジルエステル、−NH2、アルデヒド、ハロアセテート、ハロアセトアミド、及びパラ−ニトロフェニルカルボネートから選択される。いくつかの実施形態において、各R2は、独立して、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸、及びこれらの組み合わせから選択される、ハロアセテートである。いくつかの実施形態において、各R2は、独立して、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸、及びこれらの組み合わせから選択される、ハロアセトアミドである。いくつかの実施形態において、R2は、マレイミドである。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(IIa)の構造を有し、式中、各R2は、マレイミドである。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(IIa)の構造を有し、式中、R1及びR2は、一緒にまとめると
、
であり、式中、i及びjは、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(IIa)の構造を有し、式中、R1及びR2は、一緒にまとめると、
であり、式中、iは、2であり、jは、2である。
、
であり、式中、i及びjは、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(IIa)の構造を有し、式中、R1及びR2は、一緒にまとめると、
であり、式中、iは、2であり、jは、2である。
式中、各mは、ポリオール(PEG)の特定のアームの長さまたはサイズを示し、独立して、約45〜約1000、または約3〜約250、または約50〜約200、または約100〜約150の整数であり、nは、約1〜約10の整数であり、各R1は、独立して、不在であるか、または連結基であり、各R2は、独立して、水素または末端反応基であり、かつ少なくとも1つのR2は、末端反応基である。いくつかの実施形態において、R2は、独立して、チオール反応基、アミノ反応基、及びこれらの組み合わせから選択される。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(IIIa)の構造を有し、式中、nは、2〜6の整数である。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(IIIa)の構造を有し、式中、nは、2であり、多アーム型PEGは、四量体である。別の実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(IIIa)の構造を有し、式中、nは、4であり、多アーム型PEGは、六量体である。別の実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(IIIa)の構造を有し、式中、nは、6であり、多アーム型PEGは、八量体である。一般式(IIIa)の構造を有する八量体は、ヘキサグリセロール(HGEO)コア構造を有し、本明細書において、HGEO八量体とも称される。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(IIIa)の構造を有し、式中、各R1は、存在する場合、同じであるか、または異なり、R1及びR2は、一緒にまとめると、
ならびにこれらの組み合わせから選択され、式中、各iは、独立して、0〜10の整数であり、jは、0〜10の整数であり、R2は、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、各R1は、連結基である。
ならびにこれらの組み合わせから選択され、式中、各iは、独立して、0〜10の整数であり、jは、0〜10の整数であり、R2は、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、各R1は、連結基である。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(IIIa)の構造を有し、式中、R1及びR2は、一緒にまとめると、
であり、式中、i、j、及びR2は、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、R1及びR2は、1つにまとめると、
であり、式中、iは、2であり、jは、2または3であり、R2は、本明細書に定義されるとおりである。
であり、式中、i、j、及びR2は、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、R1及びR2は、1つにまとめると、
であり、式中、iは、2であり、jは、2または3であり、R2は、本明細書に定義されるとおりである。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(IIIa)の構造を有し、式中、各R2は、独立して、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフルオロメタンスルホネート、トシレート、アジリジン、エポキシド、ピリジルジスルフィド、スクシンイミジルエステル、−NH2、アルデヒド、ハロアセテート、ハロアセトアミド、及びパラ−ニトロフェニルカルボネートから選択される。いくつかの実施形態において、各R2は、独立して、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸、及びこれらの組み合わせから選択される、ハロアセテートである。いくつかの実施形態において、各R2は、独立して、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸、及びこれらの組み合わせから選択される、ハロアセトアミドである。いくつかの実施形態において、R2は、マレイミドである。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(IIIa)の構造を有し、式中、各R2は、マレイミドである。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(IIIa)の構造を有し、式中、R1及びR2は、一緒にまとめると、
であり、式中、i及びjは、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(IIIa)の構造を有し、式中、R1及びR2は、一緒にまとめると、
であり、式中、iは、3であり、jは、2である。
であり、式中、i及びjは、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(IIIa)の構造を有し、式中、R1及びR2は、一緒にまとめると、
であり、式中、iは、3であり、jは、2である。
別の態様において、官能化多アーム型PEGは、一般式(IVa)の構造を有し、
式中、各mは、ポリオール(PEG)の特定のアームの長さまたはサイズを示し、独立して、約45〜約1000、または約3〜約250、または約50〜約200、または約100〜約150の整数であり、各R1は、独立して、不在であるか、または連結基であり、各R2は、独立して、水素または末端反応基であり、かつ少なくとも1つのR2は、末端反応基である。いくつかの実施形態において、R2は、独立して、チオール反応基、アミノ反応基、及びこれらの組み合わせから選択される。
式中、各mは、ポリオール(PEG)の特定のアームの長さまたはサイズを示し、独立して、約45〜約1000、または約3〜約250、または約50〜約200、または約100〜約150の整数であり、各R1は、独立して、不在であるか、または連結基であり、各R2は、独立して、水素または末端反応基であり、かつ少なくとも1つのR2は、末端反応基である。いくつかの実施形態において、R2は、独立して、チオール反応基、アミノ反応基、及びこれらの組み合わせから選択される。
一般式(IVa)の構造を有する多アーム型PEGは、ブタンジオールコア構造を有し、本明細書において、DX八量体とも称される。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(IVa)の構造を有し、式中、各R1は、存在する場合、同じであるか、または異なり、R1及びR2は、一緒にまとめると、
ならびにこれらの組み合わせから選択され、式中、各iは、独立して、0〜10の整数であり、jは、0〜10の整数であり、R2は、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、各R1は、連結基である。
ならびにこれらの組み合わせから選択され、式中、各iは、独立して、0〜10の整数であり、jは、0〜10の整数であり、R2は、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、各R1は、連結基である。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(IVa)の構造を有し、式中、R1及びR2は、一緒にまとめると、
であり、式中、i、j、及びR2は、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、R1及びR2は、1つにまとめると、
であり、式中、iは、2であり、jは、2または3であり、R2は、本明細書に定義されるとおりである。
であり、式中、i、j、及びR2は、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、R1及びR2は、1つにまとめると、
であり、式中、iは、2であり、jは、2または3であり、R2は、本明細書に定義されるとおりである。
いくつかの実施形態において、各R2が、独立して、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフルオロメタンスルホネート、トシレート、アジリジン、エポキシド、ピリジルジスルフィド、スクシンイミジルエステル、−NH2、アルデヒド、ハロアセテート、ハロアセトアミド、及びパラ−ニトロフェニルカルボネートから選択される。いくつかの実施形態において、各R2は、独立して、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸、及びこれらの組み合わせから選択される、ハロアセテートである。いくつかの実施形態において、各R2は、独立して、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸、及びこれらの組み合わせから選択される、ハロアセトアミドである。いくつかの実施形態において、R2は、マレイミドである。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(IVa)の構造を有し、式中、各R2は、マレイミドである。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(IVa)の構造を有し、式中、R1及びR2は、一緒にまとめると、
であり、式中、i及びjは、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(IVa)の構造を有し、式中、R1及びR2は、一緒にまとめると、
であり、式中、iは、3であり、jは、2である。
であり、式中、i及びjは、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型PEGは、一般式(IVa)の構造を有し、式中、R1及びR2は、一緒にまとめると、
であり、式中、iは、3であり、jは、2である。
本開示で用いるのに適している他の官能化多アーム型PEGは、米国特許出願公開第2011/0286956号、及び米国特許出願公開第2015/0073155号に記載されており、これらの両方は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本開示で用いるのに適している官能化多アーム型PEGはまた、多くの製造供給元から購入することができる。例えば、JenKem Technology,USAは、マレイミドで官能化されたPEG八量体(例えば、8ARM(TP)−PEG−MAL及び8ARM(HG)−PEG−MAL)ならびに四量体を販売している。NOF America Corp.もまた、マレイミドで官能化されたPEG八量体(例えば、Sunbright(登録商標)HGEO−400MA、Sunbright(登録商標)DX−400MA)、及び四量体(例えば、Sunbright(登録商標)PTE−400MA)を販売している。かかる八量体及び四量体は、40,000Dの重量平均分子量を含む、様々な分子量において利用可能である。
2.コンジュゲート
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に開示される1つ以上の抗D因子抗体または抗体変異体及び1つ以上の多アーム型ポリオールを含むコンジュゲートを対象とし、該コンジュゲートは、少なくとも1つの抗D因子抗体または抗体変異体をポリオールに共有結合することによって調整される。いくつかの実施形態において、多アーム型ポリオールは、PEGである。いくつかの実施形態において、PEGは、八量体である。いくつかの実施形態において、PEGは、一般式(Ia)、(Ib)、(IIa)、(IIIa)、または(IVa)の構造を有する。
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に開示される1つ以上の抗D因子抗体または抗体変異体及び1つ以上の多アーム型ポリオールを含むコンジュゲートを対象とし、該コンジュゲートは、少なくとも1つの抗D因子抗体または抗体変異体をポリオールに共有結合することによって調整される。いくつかの実施形態において、多アーム型ポリオールは、PEGである。いくつかの実施形態において、PEGは、八量体である。いくつかの実施形態において、PEGは、一般式(Ia)、(Ib)、(IIa)、(IIIa)、または(IVa)の構造を有する。
本開示のコンジュゲートは、各多アーム型PEGにコンジュゲートされた抗D因子抗体の数によって特徴付けられ得る。これは、本明細書において、「fab化」または「fab化度」と称される。各PEGにコンジュゲートされた抗D因子抗体の数は、以下を含む、様々な要因に応じて異なり得る:1)PEG内のアームの数、2)PEG上の末端反応基の数及び/または反応性、3)PEGのコア構造、及び/または、4)ペグ化反応条件。コンジュゲートを調製するために使用される高い多分散性の多アーム型PEGは、場合によっては、最終コンジュゲートの分析を複雑にし、具体的には、1PEG当たりの抗体(例えば、Fab)の数の精密測定をさらに困難かつ不明確にし得る。したがって、コンジュゲートを形成するために使用されるPEGは、典型的には、約1〜約1.35の範囲内で多分散性(当該技術分野で既知の方法を用いて決定される)を有し、様々な実施形態において、約1〜約1.25、約1〜約1.2、約1〜約1.15、約1〜約1.1、約1.05、またはさらに約1の多分散性を有する。
いくつかの実施形態において、本開示のコンジュゲートは、8アーム型PEGを含み、少なくとも1つの抗D因子抗体または抗体変異体は、PEGに共有結合している。別の実施形態において、本開示のコンジュゲートは、8アーム型PEGを含み、少なくとも2つの抗D因子抗体は、PEGに共有結合している。別の実施形態において、本開示のコンジュゲートは、8アーム型PEGを含み、少なくとも3つの抗D因子抗体は、PEGに共有結合している。別の実施形態において、本開示のコンジュゲートは、8アーム型PEGを含み、少なくとも4つの抗D因子抗体は、PEGに共有結合している。別の実施形態において、本開示のコンジュゲートは、8アーム型PEGを含み、少なくとも5つの抗D因子抗体は、PEGに共有結合している。別の実施形態において、本開示のコンジュゲートは、8アーム型PEGを含み、少なくとも6つの抗D因子抗体は、PEGに共有結合している。別の実施形態において、該コンジュゲートは、8アーム型PEGを含み、少なくとも7つの抗D因子抗体は、PEGに共有結合している。別の実施形態において、本開示のコンジュゲートは、8アーム型PEGを含み、少なくとも8つの抗D因子抗体は、PEGに共有結合している。いくつかの実施形態において、本開示のコンジュゲートは、8アーム型PEGを含み、5〜8つの抗D因子抗体は、PEGに共有結合している。別の実施形態において、本開示のコンジュゲートは、8アーム型PEGを含み、6〜8つの抗D因子抗体は、PEGに共有結合している。別の実施形態において、本開示のコンジュゲートは、8アーム型PEGを含み、7〜8つの抗D因子抗体は、PEGに共有結合している。
いくつかの実施形態において、本開示のコンジュゲートは、一般式(Ia)、(Ib)、(IIa)、(IIIa)、または(IVa)のうちのいずれか1つの構造を有する多アーム型PEGを含む。かかる実施形態において、少なくとも1つのR2は、本明細書に記載される抗D因子抗体または抗体変異体に共有結合している。いくつかの実施形態において、一般式(Ia)、(Ib)、(IIa)、(IIIa)、または(IVa)のうちのいずれか1つの構造を有する多アーム型PEGは、八量体であり、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、または8つ全てのR2基は、本明細書に記載される抗D因子抗体または抗体変異体に共有結合している。
いくつかの実施形態において、本開示のコンジュゲートは、多アーム型ポリオールが親抗体上の特異的部位(複数可)に共有結合している、すなわち、ポリマー結合が、親抗体または抗体断片中の特定の領域または特定のアミノ酸残基(複数可)を標的としている種を含む。標準的な変異誘発技術は、親抗体または抗体断片中の潜在的なペグ化部位の数及び/または位置を変化させるために使用することができる。それ故に、アミノ酸置換がシステイン及びリジン等のアミノ酸を導入または置換する範囲内において、本開示の抗D因子抗体及びその変異体は、天然配列抗D因子よりも多いまたは少ない数の潜在的なペグ化部位を含有し得る(図1A〜Cに示される)。
上に論じられるように、ポリマーの部位特異的コンジュゲーションは、最も一般的には、親抗体または抗体断片中のシステイン残基への結合によって達成される。かかる実施形態において、そのカップリング化学は、例えば、親抗体においてジスルフィド架橋の中にないシステイン残基の遊離スルフヒドリル基を利用することができる。
いくつかの実施形態において、親抗体中に天然に存在する1つ以上のシステイン残基(複数可)は、ポリマーコンジュゲーションのための結合部位(複数可)として使用される。他の実施形態において、この抗体または抗体変異体の遊離アミノ基は、Pedley,et al.,Br.J.Cancer,Vol.70,pp.1126−1130(1994)に記載されるように、2−イミノ−チオラン(Traut試薬)とチオール化し、次いで、マレイミドに官能化されたPEGに結合させることができる。別の実施形態において、1つ以上のシステイン残基(複数可)は、ポリマーの特定の結合部位(複数可)を提供するために親抗体中の選択された部位(複数可)に操作されている。
システイン操作抗体は、上述されている(米国特許公開第2007/0092940号及びJunutula,J.R.,et al,J.Immunol Methods,Vol.332(l−2),pp.41−52(2008)に記載されており、全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる)。いくつかの実施形態において、システイン操作抗体は、親抗体であり得る。これらは、特定の位置、典型的には、定常領域内で、例えば、CLまたはCH1において、遊離システインを有する抗体断片を生成するために有用である。システインを含むように操作された親抗体は、本明細書において、「チオMab」と称され、かかるシステイン操作抗体から産生されたFab断片は、産生の方法に関わらず、本明細書において、「チオFab」と称される。上述のように(例えば、米国特許公開第2007/0092940号及びJunutula,J.R.,et al,J.Immunol Methods,Vol.332(l−2),pp.41−52(2008)を参照のこと)、置き換えられた(「操作」)システイン(Cys)残基を有する突然変異体は、新しく導入された、操作システインチオール基の反応性について評価される。チオール反応性値は、0〜1.0の範囲内の相対的な数値であり、任意のシステイン操作抗体について測定され得る。反応性チオール基を有することに加えて、チオMabは、それらが抗原結合能力を保持されるよう選択されるべきである。システイン操作抗体の設計、選択、及び調製は、以前に詳述されている(例えば、WO2011/069104を参照されたく、これは参照により本明細書に組み込まれる)。いくつかの実施形態において、操作システインは、重鎖または軽鎖の定常ドメインに導入される。したがって、システイン操作抗体は、それらの野生型の親抗体対応物の抗原結合能力を保持し、したがって、抗原に特異的に結合可能である。
いくつかの実施形態において、本開示は、抗体断片−ポリマーコンジュゲートに関し、該抗原断片は、Fabであり、ポリマーは、軽鎖及び重鎖を連結する鎖間ジスルフィド結合を通常形成し得るFab断片の軽鎖または重鎖内の1つ以上のシステイン残基に結合している。
別の態様において、本開示は、抗体断片−ポリマーコンジュゲートに関し、該抗原断片は、Fab−Cであり、ポリマー結合は、Fab−C断片のヒンジ領域を標的としている。いくつかの実施形態において、抗体断片のヒンジ領域中に天然に存在する1つ以上のシステイン残基(複数可)は、ポリマーを結合するために使用される。別の実施形態において、1つ以上のシステイン残基(複数可)は、ポリマーの特定の結合部位(複数可)を提供するためにFab−C断片のヒンジ領域に操作されている。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される抗D因子抗体変異体Fab断片は、ポリマーコンジュゲーションの1つの結合部位を提供するためにC’末端に1つのシステインを付加することによって改変される。別の実施形態において、本明細書に記載される抗D因子抗体変異体Fab断片は、ポリマーコンジュゲーションの2つの結合部位を提供するためにC’末端に4つのさらなる残基、Cys−Pro−Pro−Cys(配列番号162)を付加することによって改変される。さらに別の実施形態において、本明細書に記載される抗D因子抗体変異体Fab断片は、ポリマーコンジュゲーションの1つの結合部位を提供するためにC’末端に4つのさらなる残基、Ser−Pro−Pro−Cys(例えば、配列番号121を参照のこと)を付加することによって改変される。
ペグ化の度合い及び部位はまた、官能化されたPEG及びタンパク質の濃度ならびにpHのような反応条件を調節することによって操作され得る。ペグ化の所望の度合いに適している条件は、標準的なペグ化反応のパラメータを変動させることによって実験的に決定され得る。
抗D因子抗体及び抗体変異体のペグ化は、任意の便宜的方法によって行われる。好適なペグ化条件は、WO2011/069104及びWO03/029420に記載されており、これらの両方は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
3.特徴付け
ペグ化タンパク質は、SDS−PAGE、ゲル濾過、NMR、ペプチドマッピング、液体クロマトグラフィー−質量分析法、及びインビトロ生物学的アッセイによって特徴付けすることができる。fab化の度合いは、典型的には、まず、SDS−PAGEによって示される。10% SDS中のポリアクリルアミドゲル電気泳動は、溶出緩衝液として10mMのTris−HC1 pH8.0、100mMのNaCl中で実施される。どの残基がペグ化されているかを示すために、トリプシン及びLys−Cプロテアーゼ等のプロテアーゼを用いたペプチドマッピングを実施することができる。それ故に、ペグ化及び非ペグ化抗体の試料を、Lys−Cプロテアーゼ等のプロテアーゼで消化させ、得られたペプチドを、逆相HPLC等の技術によって分離することができる。生成されたペプチドのクロマトグラフィーパターンを、抗D因子ポリペプチドに対してこれまでに決定されたペプチドマップと比較することができる。
ペグ化タンパク質は、SDS−PAGE、ゲル濾過、NMR、ペプチドマッピング、液体クロマトグラフィー−質量分析法、及びインビトロ生物学的アッセイによって特徴付けすることができる。fab化の度合いは、典型的には、まず、SDS−PAGEによって示される。10% SDS中のポリアクリルアミドゲル電気泳動は、溶出緩衝液として10mMのTris−HC1 pH8.0、100mMのNaCl中で実施される。どの残基がペグ化されているかを示すために、トリプシン及びLys−Cプロテアーゼ等のプロテアーゼを用いたペプチドマッピングを実施することができる。それ故に、ペグ化及び非ペグ化抗体の試料を、Lys−Cプロテアーゼ等のプロテアーゼで消化させ、得られたペプチドを、逆相HPLC等の技術によって分離することができる。生成されたペプチドのクロマトグラフィーパターンを、抗D因子ポリペプチドに対してこれまでに決定されたペプチドマップと比較することができる。
次いで、各ピークをピーク中のコンジュゲートのサイズを証明するために質量分析法によって分析することができる。コンジュゲーションに使用されるPEG、及びピーク中のコンジュゲートのサイズに応じて、PEGにコンジュゲートされた抗体またはその変異体の数を推測することができる。PEG基にコンジュゲートされた断片(複数可)は、通常、注入後にはHPLCカラムに保持されておらず、クロマトグラフから消失している。クロマトグラフからのそのような消失は、少なくとも1つのペグ化可能なアミノ酸残基を含んでいるに違いない特定の断片に対するペグ化を示している。ペグ化された抗D因子抗体及び抗体変異体は、D因子と相互作用する能力、及び当該技術分野で既知の方法を用いて他の生物学的活性についてさらにアッセイすることができる。
ペグ化は、抗体薬物の物理的及び化学的特性を変化させ、改善された安定性、免疫原性の低減、循環寿命の延長、ならびに眼の滞留時間の増加のような改善された薬物動態挙動をもたらし得る。
いくつかの実施形態において、本開示のコンジュゲートは、対応するコンジュゲートされていない抗D因子抗体または抗体変異体と比較して、単一の硝子体内注入を介しての哺乳動物の眼(例えばヒト)中への投与後、半減期の増加を有する。いくつかの実施形態において、半減期の増加は、対応するコンジュゲートされていない抗D因子抗体または抗体変異体の半減期の少なくとも1.4倍、または少なくとも1.8倍、または少なくとも2倍である。
いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、延長期間にわたって安定しており、生理学的条件で、D因子の結合能力を1カ月当たり20%未満、15%未満、または10%未満喪失する。
いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、狭口径針を通す投与に適している粘度を有する。いくつかの実施形態において、コンジュゲートの粘度は、150〜250mg/mlの濃度で800cP未満、700cP未満、600cP未満、500cP未満、400cP未満、または300cP未満である。いくつかの実施形態において、コンジュゲートの粘度は、200mg/mlの濃度で300cP未満である。
いくつかの実施形態において、RHは、3〜30nMの範囲に及ぶ。
E.診断及び検出のための方法及び組成物
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗D因子抗体はいずれも、生物学的試料中のD因子の存在の検出に有用である。本明細書で使用される場合、「検出すること」という用語は、定量または定性検出を包含する。「生物学的試料」は、例えば、細胞または組織を含む。
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗D因子抗体はいずれも、生物学的試料中のD因子の存在の検出に有用である。本明細書で使用される場合、「検出すること」という用語は、定量または定性検出を包含する。「生物学的試料」は、例えば、細胞または組織を含む。
いくつかの実施形態において、診断または検出方法に使用するための抗D因子抗体が提供される。さらなる態様において、生物学的試料中のD因子の存在を検出する方法が提供される。ある特定の実施形態において、本方法は、生物学的試料と、本明細書に記載される抗D因子抗体とを、D因子に抗D因子抗体が結合することを許容する条件下で接触させることと、複合体が、生物学的試料中で、抗D因子抗体とD因子との間で形成されるかどうかを検出することと、を含む。かかる方法は、インビトロ方法またはインビボ方法であり得る。いくつかの実施形態において、例えば、D因子が患者の選択のためのバイオマーカーである場合、抗D因子抗体は、抗D因子抗体での療法に適格な対象を選択するために使用される。さらなる実施形態において、生物学的試料は、細胞または組織である。
さらなる実施形態において、診断または検出方法は、基質に固定化された第1の抗D因子抗体を、D因子の存在について試験されるべき生物学的試料と接触させることと、その基質を第2の抗D因子抗体に曝露することと、その第2の抗D因子抗体が、生物学的試料中で、第1の抗D因子抗体とD因子との間の複合体に結合されるかどうかを検出することとを含む。基質は、任意の支持培地、例えば、ガラス、金属、セラミック、ポリマービーズ、スライド、チップ、及び他の基質であってもよい。ある特定の実施形態において、生物学的試料は、細胞または組織を含む。ある特定の実施形態において、第1または第2の抗D因子抗体は、本明細書に記載される抗体のいずれかである。
ある特定の実施形態において、標識された抗D因子抗体が提供される。標識としては、直接検出される標識または部分(蛍光標識、発色団標識、電子密度の高い標識、化学発光標識、及び放射性標識等)、ならびに間接的に、例えば、酵素反応または分子相互作用により検出される酵素またはリガンド等の部分が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な標識としては、放射性同位体32P、14C、125I、3H、及び131I、希土類キレートまたはフルオレセイン等のフルオロフォア及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ(米国特許第4,737,456号)、ルシフェリン、2,3−ジヒドロフタラジンジオン類、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、複素環式オキシダーゼ、例えば、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、HRP等の、染料前駆体を酸化するために過酸化水素を利用する酵素と結合したもの、ラクトペルオキシダーゼまたはミクロペルオキシダーゼ、ビオチン/アビジン、スピン標識物質、バクテリオファージ標識物質、安定フリーラジカル等が含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態において、標識は、陽電子放出体である。陽電子放出体としては、68Ga、18F、64Cu、86Y、76Br、89Zr、及び124Iが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、陽電子放出体は、89Zrである。
F.薬学的製剤
本明細書に記載される抗D因子抗体またはコンジュゲートの薬学的製剤は、所望の純度を有する抗体またはコンジュゲートを、1つ以上の任意の薬学的に許容される担体と混合することによって(Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980))、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製される。薬学的に許容される担体は、一般的に、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、これには、緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸;アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤;保存剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;及びm−クレゾール);低分子量(約10残基未満)のポリペプチド;タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン;単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物;キレート剤、例えば、EDTA;糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール;塩形成対イオン、例えば、ナトリウム;金属錯体(例えば、Zn−タンパク質錯体);及び/または非イオン性界面活性、例えばポリエチレングリコール(PEG)が含まれるが、これらに限定されない。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体は、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)、例えば、rHuPH20(HYLENEX(登録商標)、Baxter International,Inc.)等のヒト可溶性PH−20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質等の介在性薬物分散剤をさらに含む。rHuPH20を含む、ある特定の例示的なsHASEGP及び使用方法は、米国特許公開第2005/0260186号及び同第2006/0104968号に記載されている。いくつかの実施形態において、sHASEGPは、コンドロイチナーゼ等の1つ以上のさらなるグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
本明細書に記載される抗D因子抗体またはコンジュゲートの薬学的製剤は、所望の純度を有する抗体またはコンジュゲートを、1つ以上の任意の薬学的に許容される担体と混合することによって(Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980))、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製される。薬学的に許容される担体は、一般的に、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、これには、緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸;アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤;保存剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;及びm−クレゾール);低分子量(約10残基未満)のポリペプチド;タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン;単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物;キレート剤、例えば、EDTA;糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール;塩形成対イオン、例えば、ナトリウム;金属錯体(例えば、Zn−タンパク質錯体);及び/または非イオン性界面活性、例えばポリエチレングリコール(PEG)が含まれるが、これらに限定されない。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体は、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)、例えば、rHuPH20(HYLENEX(登録商標)、Baxter International,Inc.)等のヒト可溶性PH−20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質等の介在性薬物分散剤をさらに含む。rHuPH20を含む、ある特定の例示的なsHASEGP及び使用方法は、米国特許公開第2005/0260186号及び同第2006/0104968号に記載されている。いくつかの実施形態において、sHASEGPは、コンドロイチナーゼ等の1つ以上のさらなるグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
例示的な凍結乾燥抗体またはコンジュゲート製剤は、米国特許第6,267,958号に記載されている。水性抗体またはコンジュゲート製剤には、米国特許第6,171,586号及びWO2006/044908に記載されるものが含まれ、後者の製剤は、ヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
本明細書における製剤はまた、必要に応じて、治療されている特定の適応症に対する1つを超える活性成分を含有してもよい。いくつかの実施形態において、活性成分は、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有する。
活性成分は、例えば、コアセルベーション技法もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセル及びポリ−(メチルメタシレート(methylmethacylate))マイクロカプセル中、コロイド薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル)中、またはマクロエマルジョン中に封入され得る。かかる技法は、Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)に開示されている。
徐放性調製物が調製され得る。持続放出調製物の好適な例としては、抗体またはコンジュゲートを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、これらのマトリックスは、成形物品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態である。持続放出性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(2−ヒドロキシエチル−メタクリレート)、またはポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号)、L−グルタミン酸とエチル−L−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、例えばLUPRON DEPOT(商標)等の分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー(乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なマイクロスフェア)、ならびにポリ−D−(−)−3−ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸等のポリマーが100日間にわたる分子の放出を可能にする一方で、ある特定のヒドロゲルは、より短い期間にわたってタンパク質を放出する。カプセル化された抗体は、長期間にわたって体内に残存する場合、それらは、37℃の水分への曝露の結果として変性または凝集し、生物学的活性の損失、及び免疫原性の変化の可能性をもたらし得る。関与する機構に応じて、安定化のための合理的な戦略が講じられ得る。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド相互交換を介した分子間S−S結合形成であることが発見される場合、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾すること、酸性溶液から凍結乾燥すること、水分含有量を制御すること、適切な添加剤を使用すること、及び特的なポリマーマトリックス組成物を開発することによって達成され得る。
インビボ投与に使用される製剤は、一般に、滅菌のものである。滅菌性は、例えば、滅菌濾過膜を介する濾過によって容易に達成され得る。
眼疾患または症状の予防または治療のための本明細書に記載される抗体及びコンジュゲートは、典型的には、眼、眼内、及び/または硝子体内注射、及び/または強膜近傍注射、及び/またはテノン嚢下注射、及び/または上脈絡叢(superchoroidal)注射、及び/または点眼剤及び/または軟膏の形態での局所投与によって投与される。本発明のかかる化合物は、様々な方法、例えば、Intraocular Drug Delivery,Jaffe,Jaffe,Ashton,and Pearson,editors,Taylor & Francis(March 2006)のような参照文献に記載されているものを含む、化合物の硝子体液中への遅い放出を可能にするデバイス及び/またはデポーとして硝子体内に送達され得る。一例において、デバイスは、ミニポンプ及び/またはマトリックス及び/または受動拡散システム及び/または長い時間の間、化合物を放出するカプセル化細胞(Intraocular Drug Delivery,Jaffe,Jaffe,Ashton,and Pearson,editors,Taylor & Francis(March 2006)の形態であり得る。局所、非経口、皮下、腹腔内、肺内、鼻腔内、及び病巣内投与を含むが、これらに限定されない、他の投与方法もまた、使用されてもよい。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が含まれる。
眼、眼内、または硝子体内投与のための製剤は、当該技術分野で既知の方法によって、既知の成分を使用して調製することができる。効果的な治療のための主たる必要条件は、眼を通る適切な透過である。薬剤が局所的に送達され得る眼球の前面の疾患と異なり、網膜疾患は、より部位特異的なアプローチを必要とする。点眼剤及び軟膏は、眼底まで浸透することは滅多になく、血液眼関門が全身投与された薬物の眼組織中への浸透を妨害する。したがって、通常、AMDやCNV等の網膜疾患を治療するための薬物送達の最適な方法は、直接の硝子体内注射である。硝子体内注射は、通常、患者の症状、及び送達される薬物の特性及び半減期に依存する間隔で繰り返される。眼内(例えば硝子体内)浸透のためには、通常、より小さいサイズの分子が好ましい。
眼への投与のために、いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体及びコンジュゲートは、薬学的に許容される担体中で、pH5.5で製剤化され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体及びコンジュゲートは、移植可能ポート送達系(PDS)を用いて送達のために製剤化され得る。上述のように、PDSは、硝子体への放出がチタンフリットを含む多孔性金属膜によって制御される再充填可能なデバイスである。そのリザーバーは低容量であるので、いくつかの実施形態において、高タンパク質濃度が、そのPDSを用いる効果的な送達に必要である。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体及びコンジュゲートは、高濃度で製剤化される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体及びコンジュゲートは、少なくとも150mg/ml、少なくとも160mg/ml、少なくとも170mg/ml、少なくとも180mg/ml、少なくとも190mg/ml、少なくとも200mg/ml、または少なくとも210mg/ml、または少なくとも220mg/ml、または少なくとも230mg/ml、または少なくとも240mg/ml、または少なくとも250mg/ml、または少なくとも260mg/ml、または少なくとも270mg/ml、または少なくとも280mg/ml、または少なくとも290mg/ml、または少なくとも300mg/mlの濃度で製剤化され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体及びコンジュゲートは、150mg/ml〜350mg/ml、または150mg/ml〜300mg/ml、または170mg/ml〜300mg/ml、または200mg/ml〜300mg/mlの濃度で製剤化され得る。
AMDまたはCNV等の補体関連の眼の症状の治療の有効性は、眼内疾患を評価するのに一般的に使用される様々なエンドポイントによって測定することができる。例えば、視力喪失を評価することができる。視力喪失は、限定しないが、例えば、ベースラインから所望の時点までの最高矯正視力(BCVA)の平均変化を測定することによって(例えば、BCVAが糖尿病網膜症の早期治療研究(ETDRS)に基づく場合、視力チャート及び4メートルの検査距離での判定)、ベースラインと比較して所望の時点で15文字より少ない視力を失う患者の割合を測定することによって、ベースラインと比較して所望の時点で15文字以上を獲得する患者の割合を測定することによって、所望の時点で20/2000もしくはそれより悪いスネレン等価視力を持つ患者の割合を測定することによって、NEI視覚機能質問票を測定することによって、所望の時点でのCNVのサイズ及びCNVの漏出量を、例えば、蛍光眼底血管造影法によって測定すること等によって、評価することができる。例えば、眼の検査に実施、眼内圧の測定、視力評価、スリットランプ圧の測定、眼内炎症の評価等を、例えば、含むが、これらに限定されない、眼球評価を行うことができる。
いくつかの実施形態において、抗D因子抗体またはそのコンジュゲートは、1眼当たりの約0.3mg〜約30mgの用量で硝子体内投与される。
投与のための投与スケジュールは、疾患の種類、疾患の重症度、及び治療剤に対する対象の感受性を含む、多くの臨床因子に応じて、月1回から毎日まで異なり得る。
G.治療法及び組成物
本明細書に提供される抗D因子抗体またはコンジュゲートのいずれも、方法、例えば、治療方法において使用され得る。
本明細書に提供される抗D因子抗体またはコンジュゲートのいずれも、方法、例えば、治療方法において使用され得る。
本明細書において実施形態のいずれかによる「個体」、「患者」、または「対象」は、ヒトであり得る。
本開示の抗D因子抗体及びコンジュゲートは、哺乳動物を治療するために使用され得る。いくつかの実施形態において、抗D因子抗体またはコンジュゲートは、例えば、前臨床データを得るために、非ヒト哺乳動物に投与される。治療される例示的な非ヒト哺乳動物には、前臨床試験が行われる、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、齧歯類、及び他の哺乳類動物が含まれる。そのような哺乳類動物は、抗体で治療される疾患の確立された動物モデルであり得、または目的の抗体の毒性を試験するために使用され得る。これらの実施形態の各々において、用量増加試験は、哺乳類動物に対して実施してもよい。
抗D因子抗体またはコンジュゲートは、非経口、皮下、腹腔内、硝子体内、肺内、及び経鼻投与を含む任意の好適な手段(局所免疫抑制治療が所望される場合、病巣内投与)によって投与され得る。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、硝子体内、または皮下投与が含まれる。加えて、コンジュゲートは、パルス注入によって、特に抗体またはその抗体変異体またはその断片(例えば、抗原結合断片)の用量を低下させながら好適に投与される。いくつかの実施形態において、投薬は、投与が短時間であるか慢性的であるかに部分的に応じて、静脈内または皮下注射等の注射によって行われる。
疾患の予防または治療のため、抗D因子抗体またはコンジュゲートの適切な投与量は、治療される疾患の種類、その疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的または治療目的で投与されるかどうか、これまでの治療法、患者の臨床歴及び抗体への反応、ならびに主治医の判断に応じて異なる。
疾患の種類及び重症度に応じて、例えば、1回以上の別個の投与によって、または連続注入によって、約1〜25mg/眼(1眼当たり0.015mg/kg〜0.36mg/kg)の抗体が、患者への投与のための初回候補投薬量である。数日間またはそれ以上にわたる反復投与については、病態に応じて、疾患症状の所望の抑制が生じるまで治療が継続される。しかしながら、他の投薬量レジメンも有用であり得る。この療法の進行は、従来の技法及びアッセイによって容易に監視される。例示の投薬レジメンは、WO94/04188において開示されている。
コンジュゲート組成物は、良好な医療行為と一致する様式で、製剤化され、投薬され、及び投与され得る。この文脈において考慮する要因には、治療されている特定の障害、治療されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジューリング、及び医師に既知である他の要因が含まれる。投与されるコンジュゲートの「治療上有効量」は、このような考慮によって決定され、疾患または障害を予防、改善、または治療するために必要な最小の量である。コンジュゲートは、必ずしもそうである必要はないが、任意に、問題の障害を予防または治療するために現在使用されている1つ以上の薬剤と共に製剤化される。かかる他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する、抗体またはその抗体変異体またはその断片(例えば、抗原結合断片)の量、障害または治療の種類、及び上記で考察される他の因子に応じて異なる。これらは、概して、それまでに使用されたのと同じ投与量及び投与経路で、またはそれまでに用いられた投与量の約1〜99%で使用される。
これらの抗体を含むそれらの標的及びコンジュゲートとしてD因子を認識する本明細書に開示される抗体は、補体媒介性障害を治療するために使用され得る。これらの障害は、過度のまたは制御されていない補体活性化と関連する。それらは、心肺バイパス手術中の補体活性化;急性心筋梗塞、動脈瘤、卒中、出血性ショック、圧挫外傷、多臓器不全、循環血液量減少性ショック、及び腸虚血後の虚血再灌流のための補体活性化を含む。これらの障害はまた、炎症性症状、例えば、重度の熱傷、内毒素血症、敗血症性ショック、成人性呼吸促迫症候群、血液透析、アナフィラキシーショック、重度の喘息、血管性浮腫、クローン病、鎌状赤血球貧血、レンサ球菌感染後糸球体腎炎、及び膵炎等である疾患または症状も含まれ得る。障害は、薬物の副作用、薬物アレルギー、IL−2誘導性血管漏出症候群、またはX線撮影造影剤アレルギーの結果であり得る。それはまた、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、リウマチ性関節炎、アルツハイマー病、及び多発性硬化症のような自己免疫疾患も含む。補体活性化はまた、移植片拒絶とも関連する。近年、補体活性化と、眼疾患、例えば、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、及び他の虚血関連網膜症、脈絡膜血管新生(CNV)、ブドウ膜炎、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症(CRVO)、角膜血管新生、及び網膜血管新生との間に強い相関関係が示されている。
コンジュゲートの抗D因子抗体は、単独で、または少なくとも第2の治療化合物と組み合わせて投与することができる。コンジュゲート及び任意の第2の治療化合物の投与は、同時に、例えば単一の組成物として、または2つ以上の異なる組成物として、同じまたは異なる投与経路を使用して行うことができる。代替的に、または追加的に、投与は、順次、任意の順序で行うことができる。ある特定の実施形態において、分単位から日単位、週単位、月単位に及ぶ間隔が、2つ以上の組成物の投与間に存在し得る。例えば、D因子拮抗薬を含むコンジュゲートがまず投与され、続いて第2の治療化合物が投与されてもよい。しかしながら、同時投与、またはコンジュゲートの前の第2の治療化合物の投与もまた企図される。いくつかの実施形態において、第2の治療化合物は、HTRA1拮抗薬、ANG2拮抗薬(例えば、US2009/0304694A1に開示される、抗ANG2抗体等)、TIE2拮抗薬(例えば、米国特許第6,376,653号に開示される抗TIE2抗体等)、VEGF拮抗薬(例えば、2015年2月26日に発行された米国特許第6,884,879号、及びWO98/45331(ベバシズマブ及び他のヒト化抗VEGF抗体)に開示されるVEGF拮抗薬等;WO2005/012359及びWO2005/044853(G6またはB20シリーズ抗体(例えば、G6−31,B20−4.1);WO98/45331(ラナビズマブ)、ならびに第2の補体成分拮抗薬から選択される。いくつかの実施形態において、HTRA1拮抗薬は、抗HTRA1抗体である。いくつかの実施形態において、ANG2拮抗薬は、抗ANG2抗体である。いくつかの実施形態において、TIE2拮抗薬は、抗TIE2抗体である。いくつかの実施形態において、VEGF拮抗薬は、VEGFトラップ(アフリベルセプト(Eylea(登録商標)等)及び抗VEGF抗体(ベバシズマブ(Avastin(登録商標)等)またはラナビズマブ(Lucentis(登録商標)))から選択される。いくつかの実施形態において、第2の補体成分拮抗薬は、C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9補体成分から選択される、古典的または代替補体経路(補体阻害剤)の様々なメンバーを阻害する。
いくつかの実施形態において、補体媒介性障害に罹患しているヒト対象における補体媒介性障害のための本開示の治療は、対象に、有効量の治療化合物、例えば、コンジュゲートの抗D因子抗体を投与することを含み、対象に、有効量の第2の治療化合物を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、第2の治療化合物は、HTRA1拮抗薬である。いくつかの実施形態において、第2の治療化合物は、ANG2拮抗薬である。いくつかの実施形態において、第2の治療化合物は、TIE2拮抗薬である。いくつかの実施形態において、第2の治療化合物は、VEGF拮抗薬である。いくつかの実施形態において、第2の治療化合物は、第2の補体成分拮抗薬である。いくつかの実施形態において、補体媒介性障害は、補体関連の眼の症状である。いくつかの実施形態において、眼の障害は、非滲出性(例えば、中期乾燥型AMDまたは地図状萎縮(GA))及び滲出性(例えば、湿潤型AMD(脈絡膜血管新生(CNV))AMD、糖尿病性網膜症(DR)、眼内炎、及びブドウ膜炎を含む、加齢性黄斑変性症(AMD)である。一例において、補体関連の眼の症状は、中期乾燥型AMDである。いくつかの実施形態において、補体関連の眼の症状は、地図状萎縮である。いくつかの実施形態において、補体関連の眼の症状は、湿潤型AMD(脈絡膜血管新生(CNV))である。
本明細書における併用投与には、別個の製剤または単一の薬学的製剤を使用する共投与と、いずれかの順序における連続投与とが含まれ、概して、両方(または全て)の活性剤がそれらの生物活性を同時に発揮する期間が存在する。
さらなる態様において、本発明は、例えば、上記の治療法のいずれかにおける使用のための、本明細書に提供される抗D因子抗体またはコンジュゲートのいずれかを含む薬学的製剤を提供する。いくつかの実施形態において、薬学的製剤は、本明細書に提供される抗D因子抗体またはコンジュゲートのいずれかと、薬学的に許容される担体と、を含む。別の実施形態において、薬学的製剤は、本明細書に提供される抗D因子抗体またはコンジュゲートと、少なくとも1つのさらなる治療剤と、を含む。
上記製剤または治療方法のうちのいずれも、本発明のコンジュゲート及び/または抗D因子抗体のいずれかまたはその両方を使用して行われ得ることが理解される。
H.製品
本明細書における治療方法に有用な、本明細書に記載される抗D因子抗体を含有する、製品または「キット」が提供される。いくつかの実施形態において、このキットは、抗D因子抗体を含む容器を含む。このキットは、容器上の、または容器と関連したラベルまたは添付文書をさらに含んでもよい。「添付文書」という用語は、かかる治療薬の適応症、使用法、投薬量、投与、禁忌症についての情報、及び/またはその使用に関する警告を含む、治療薬の商用のパッケージに通例含まれる説明書を指すように使用される。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ブリスター包装等が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチック等の多様な材料から形成されてもよい。容器は、本明細書において治療方法で用いるのに有効な本明細書に記載される抗D因子抗体またはその製剤を保持してもよく、滅菌アクセスポートを有してもよい(例えば、容器は、皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有するバイアルであってもよい)。ラベルまたは添付文書は、組成物が本明細書に記載されて特許請求される治療方法で使用されることを表示する。製品は、薬学的に許容される緩衝剤、例えば、注入用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液を含む容器をさらに含んでもよい。それは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的観点及びユーザの観点から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。
本明細書における治療方法に有用な、本明細書に記載される抗D因子抗体を含有する、製品または「キット」が提供される。いくつかの実施形態において、このキットは、抗D因子抗体を含む容器を含む。このキットは、容器上の、または容器と関連したラベルまたは添付文書をさらに含んでもよい。「添付文書」という用語は、かかる治療薬の適応症、使用法、投薬量、投与、禁忌症についての情報、及び/またはその使用に関する警告を含む、治療薬の商用のパッケージに通例含まれる説明書を指すように使用される。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ブリスター包装等が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチック等の多様な材料から形成されてもよい。容器は、本明細書において治療方法で用いるのに有効な本明細書に記載される抗D因子抗体またはその製剤を保持してもよく、滅菌アクセスポートを有してもよい(例えば、容器は、皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有するバイアルであってもよい)。ラベルまたは添付文書は、組成物が本明細書に記載されて特許請求される治療方法で使用されることを表示する。製品は、薬学的に許容される緩衝剤、例えば、注入用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液を含む容器をさらに含んでもよい。それは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的観点及びユーザの観点から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。
本キットは、本明細書に記載される抗D因子抗体の投与のための指示書をさらに備えてもよい。いくつかの実施形態において、ラベルまたは添付文書は、組成物が、眼の障害、例えば、加齢性黄斑変性症(AMD)を含む、例えば、以前に列挙された症状のうちのいずれかのような補体関連の障害を治療するために使用されることを示す。ラベルまたは添付文書は、抗体組成物を患者に投与するための説明書をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、キットが、抗D因子抗体を含む第1の組成物及び第2の薬学的製剤を含む場合、キットは、第1及び第2の薬学的組成物を、それを必要とする患者に同時に、順次に、または別個に投与するための指示書をさらに含んでもよい。
いくつかの実施形態によれば、キットは、本明細書に記載される抗D因子抗体、及び薬学的に許容される緩衝剤、例えば、注入用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液を含む容器をさらに含んでもよい。それは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的観点及びユーザの観点から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。
いくつかの実施形態において、キットは、移植可能ポート送達系(PDS)、及び本明細書に記載される抗D因子抗体またはコンジュゲートを含む組成物を含む。いくつかの実施形態において、キットは、PDSを移植し、抗体またはコンジュゲートを入れるリザーバーを充填させるための指示書を含む。いくつかの実施形態において、キットは、PDSを詰め替えるために製剤化された抗D因子抗体またはコンジュゲートを含む組成物を含む。
別の実施形態において、様々な目的に、例えば、補体関連の障害の治療、予防、及び/または診断のために、補体関連の溶血アッセイのために、細胞からのD因子ポリペプチドの精製もしくは免疫沈降のために有用なキットもまた、提供される。D因子ポリペプチドの単離及び精製のために、キットは、ビーズ(例えば、セファロースビーズ)に結合した抗D因子抗体を含み得る。例えば、ELISAまたはウェスタンブロットにおいてD因子ポリペプチドをインビトロで検出及び定量化するために抗体を含むキットが、提供され得る。製品と同様に、キットは、容器とその容器上の、またはその容器に添えられたラベルまたは添付文書を含む。その容器は、少なくとも1つの抗因子抗体を含む本開示のコンジュゲートを含む組成物を保持する。例えば、希釈剤及び緩衝液、対照抗体を含む追加の容器が含まれてもよい。そのラベルまたは添付文書は、その組成物の説明ならびに意図されているインビトロまたは検出用途についての指示書を提供してもよい。そのラベルまたは添付文書は、対象への投与(例えば、抗体またはその抗体断片(例えば抗原結合断片)についての指示書を提供してもよい。
III.実施例
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上述の概要を得ると、様々な他の実施形態が実施され得ることが理解される。
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上述の概要を得ると、様々な他の実施形態が実施され得ることが理解される。
実施例1:抗D因子ヒト化抗体の作製
D因子上の非活性部位への結合を介してD因子及び代替補体経路を強力に阻害するヒト化抗D因子Fab断片であるランパリズマブ(「野生型aFD」または「FCFD4515S」とも称される場合がある)が、現在、進行型乾燥型AMDである地図状萎縮(GA)の治療のために臨床開発されている。ランパリズマブは、214残基の軽鎖(配列番号102)及び223残基の重鎖(配列番号103)を含む。
D因子上の非活性部位への結合を介してD因子及び代替補体経路を強力に阻害するヒト化抗D因子Fab断片であるランパリズマブ(「野生型aFD」または「FCFD4515S」とも称される場合がある)が、現在、進行型乾燥型AMDである地図状萎縮(GA)の治療のために臨床開発されている。ランパリズマブは、214残基の軽鎖(配列番号102)及び223残基の重鎖(配列番号103)を含む。
GAにおける第II相ヒト治験は、治療効果が野生型aFDの毎月の硝子体内注射により得られることが示されているが、さらに良好な有効性を達成するためにより高い薬物用量を使用する動機が存在する。一方、より低い投与頻度は、改善された利便性を患者にもたらし、感染率の低下と臨床的有効性の増加という潜在的な利益を有し得、低進行型乾燥型AMD患者の治療を促進し得る。
より低い粘度を有し、かつ沈殿することなく保存され得る、高濃度で製剤化され得るD因子阻害剤を開発するために、新規のヒト化抗D因子抗体は、抗D因子マウス抗体20D12に基づいて開発された。PCT公開第2008/147883A1号を参照のこと。簡潔に言えば、マウス20D12からのVL及びVHドメイン(配列番号8のVH及び配列番号7のVL)を、ヒトVLカッパI(VLKI)及びヒトVHサブグループI(VHI)コンセンサス配列とアライメントさせた。マウス20D12抗体からの超可変領域(HVR)は、以下に論じられるように、CDR移植した変異体を作製するために、VLKI及びVHI受容体フレームワークに操作された。
20D12 VLドメインから、24〜34位(L1)、50〜56位(L2)、及び89〜97位(L3)を、VLKIに移植した。20D12 VHドメインから、31〜35位(H1)、50〜65位(H2)、及び95〜102位(H3)を、VHIに移植した。HVR定義は、それらの配列超可変性(Wu,T.T.& Kabat,E.A.(1970))、それらの構造的位置(Chothia,C.& Lesk,A.M.(1987))、及び抗原−抗体接触におけるそれらの関与(MacCallum et al.J.Mol.Biol.262:732−745(1996))によって定義される。VLにおける36位及び46位、ならびにVHにおける67位、69位、及び71位を含む、ある特定のバーニア位置を突然変異して、マウス配列に戻した。図1A〜C及び2A〜Cを参照のこと。
抗体20D12、hu20D12.v1(図1A〜C及び2A〜C;配列番号29のVH、配列番号28のVL)の初期ヒト化されたバージョンの可変ドメインをコードする合成遺伝子を生成し、完全長IgGとして発現のためにベクターにクローン化した。抗体を、CHO細胞において一過性に発現させ、上述のように精製した(Kelley & Meng(2012) Methods Mol Biol 901:277−93)。ヒトD因子への結合親和性は、マウス20D12(捕捉キット#BR−1008−38)及びhu20D12.v1 IgG(捕捉キット#BR−1008−39)における抗Fc捕捉を用いて、Biacore(登録商標)T200装置上の表面プラズモン共鳴(SPR)測定によって決定された。下表3に示されるように、マウス20D12及びhu20D12.v1は、ヒトD因子に対する比較親和性を有する。
抗体は、以下のように、溶血アッセイにおいてD因子阻害についてもアッセイされた。ウサギ赤血球(Er)を用いたAP溶血アッセイは、上述されている(Pangburn(1998)Methods.Enzymol.162:639、Katschke et al.(2009)J.Biol.Chem.284:10473)。Er(Colorado血清)を、0.5%のウシ皮膚ゼラチンベロナール緩衝液(GVB)で3回洗浄し、再懸濁した。抗D因子抗体の希釈を、2倍濃度で調製し、96ウェルポリプロピレンプレートに添加した。Er懸濁液を、GVB/0.1M EGTA/0.1M MgCl2と混合し、プレートに添加した。補体活性化が、古典的な経路を介したいかなる補体活性化(CompTech;GVB中で1:3に希釈)も回避するように、C1q−欠乏ヒト活性の添加から開始した。室温で30分間インキュベートした後、GVB中で10mMのEDTAを添加することによって反応を停止した。プレートを遠心分離し、上清を移した。上清の吸収度を、412nmで読み込んだ。半最大阻害(IC50)を生じるAFD.Ab濃度は、非線形回帰分析によって決定された。その分析の結果を、表3に示す。
表3:IgGフォーマット(formateed)のマウス及びヒト化20D12におけるヒトD因子結合動力学的データ
表3:IgGフォーマット(formateed)のマウス及びヒト化20D12におけるヒトD因子結合動力学的データ
表3に示されるように、ヒト化抗体hu20D12.v1の親和性は、親マウス抗体の親和性に相当する。Hu20D12.v1もまた、溶血アッセイにおけるD因子に対して阻害活性を保持した。
実施例2:hu20D12 Fab断片の生成及び特徴付け
hu20D12.v1のFab断片をコードする遺伝子の部分は、上述のものと同様に、E.coli発現ベクターにサブクローン化した(Carter et al.(1992)BioTechnology 10:163)。小規模な発現及び精製のために、DNAを、E.coli株64B4に形質転換した。単一のコロニーを、50μg/mLのカルベニシリン(media prepコードA3232)を含有する5mLのLB培地(media prepコードA2008)に選択され、インキュベーター中で、37℃にて200RPMで振とうしながら、14mLの培養チューブ中で一晩成長させた。これらの培地を使用して、1Lのバッフル付き振盪フラスコ中で、250mLの完全大豆crap培地(media prepコードA4564)、50μg/mLのカルベニシリンを植え付けた。培養物を、200RPMで振とうしながら、30℃で一晩成長させ、遠心分離によって収穫した。細胞ペレットを、PopCulture培地(invitrogen)を用いて溶解し、Fabを、Gravitrap Protein Gカラム(GE Healthcare)上で精製し、続いて、プロトコルは製造業者によって供給された。Fabの大規模生産のために、形質転換細胞の10Lの発酵からの細胞ペーストを、抽出緩衝液中に懸濁し、マイクロフルダイザーを用いて均質化した。Fabを、カッパ選択の免疫親和性クロマトグラフィーによって捕捉し、低pH緩衝液で溶出した。溶出物を、1M TRIS(pH8.0)で直ちに中和し、緩衝液を、Amiconセントリコン濾過デバイス(EMD Millipore)を用いてPBSに交換した。このプールを、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)を用いて、さらに精製した。この溶液は、酢酸を添加することによってpHを6.5に調節し、硫酸アンモニウムを2.5Mの最終濃度になるまで添加することによってHICのために調製した。HICは、25mMのNaPO4、2.5Mの硫酸アンモニウム(pH6.5)で平衡化している3mLのProPac HIC−10カラム(Thermo Scientific)上にあった。25mMのNaPO4、25%イソプロピルアルコール(pH6.5)溶出緩衝液を用いた2ステップの勾配を用いて、結合タンパク質を溶出した。画分を、無傷Fab液体クロマトグラフィー質量分析法(LCMS)を用いて分析して、ピーク同定を決定した。Fabタンパク質を含有する画分は、PBSに交換された緩衝液であった。
hu20D12.v1のFab断片をコードする遺伝子の部分は、上述のものと同様に、E.coli発現ベクターにサブクローン化した(Carter et al.(1992)BioTechnology 10:163)。小規模な発現及び精製のために、DNAを、E.coli株64B4に形質転換した。単一のコロニーを、50μg/mLのカルベニシリン(media prepコードA3232)を含有する5mLのLB培地(media prepコードA2008)に選択され、インキュベーター中で、37℃にて200RPMで振とうしながら、14mLの培養チューブ中で一晩成長させた。これらの培地を使用して、1Lのバッフル付き振盪フラスコ中で、250mLの完全大豆crap培地(media prepコードA4564)、50μg/mLのカルベニシリンを植え付けた。培養物を、200RPMで振とうしながら、30℃で一晩成長させ、遠心分離によって収穫した。細胞ペレットを、PopCulture培地(invitrogen)を用いて溶解し、Fabを、Gravitrap Protein Gカラム(GE Healthcare)上で精製し、続いて、プロトコルは製造業者によって供給された。Fabの大規模生産のために、形質転換細胞の10Lの発酵からの細胞ペーストを、抽出緩衝液中に懸濁し、マイクロフルダイザーを用いて均質化した。Fabを、カッパ選択の免疫親和性クロマトグラフィーによって捕捉し、低pH緩衝液で溶出した。溶出物を、1M TRIS(pH8.0)で直ちに中和し、緩衝液を、Amiconセントリコン濾過デバイス(EMD Millipore)を用いてPBSに交換した。このプールを、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)を用いて、さらに精製した。この溶液は、酢酸を添加することによってpHを6.5に調節し、硫酸アンモニウムを2.5Mの最終濃度になるまで添加することによってHICのために調製した。HICは、25mMのNaPO4、2.5Mの硫酸アンモニウム(pH6.5)で平衡化している3mLのProPac HIC−10カラム(Thermo Scientific)上にあった。25mMのNaPO4、25%イソプロピルアルコール(pH6.5)溶出緩衝液を用いた2ステップの勾配を用いて、結合タンパク質を溶出した。画分を、無傷Fab液体クロマトグラフィー質量分析法(LCMS)を用いて分析して、ピーク同定を決定した。Fabタンパク質を含有する画分は、PBSに交換された緩衝液であった。
実施例3:hu20D12の安定性及び分子的評価
長期作用送達系で見出され得る条件でhu20D12.v1の曝露を刺激するために、PBS中の100mg/mLで抗体Fabは、37℃で4週間加圧された。PBSは、ヒト硝子体のpH及びイオン強度の模倣体として使用された。Hu20D12.v1は、この応力条件に対する凝集に対して、モノマーの0.6%のみ喪失する良好な耐性を示し、Asn−54(CDR−H2)の脱アミドは、トリプシンペプチドマッピングを使用することによって示された。
長期作用送達系で見出され得る条件でhu20D12.v1の曝露を刺激するために、PBS中の100mg/mLで抗体Fabは、37℃で4週間加圧された。PBSは、ヒト硝子体のpH及びイオン強度の模倣体として使用された。Hu20D12.v1は、この応力条件に対する凝集に対して、モノマーの0.6%のみ喪失する良好な耐性を示し、Asn−54(CDR−H2)の脱アミドは、トリプシンペプチドマッピングを使用することによって示された。
上述のように、hu20D12.v1は、HVR−H2においてNG脱アミド部位を含む。したがって、HVR−H2におけるN54は、S(N54S)またはQ(N54Q)に対して突然変異して、NG脱アミド部位を除去した。点突然変異を、キットで供給されたプロトコルに従ってQuikChangeII(登録商標)(Agilent)変異誘発キットを用いて部位特異的突然変異誘発法によって導入した。必要とされるコドン変化を特定するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。設計された変化を有するプラスミドを特定し、DNA配列決定によって確認した。変異体Fabは、hu20D12.v1において上述のようにE.coliに発現させ、精製した。図1A〜C及び2A〜Cにおいて、hu20D12.v1(配列番号29のVH、配列番号28のVL)は、N54突然変異を有さないCDR移植した抗体を示し、hu20D12.v2.0は、N54S突然変異を有するCDR移植した抗体(配列番号33のVH、配列番号32のVL)を示し、hu20D12.v1.1は、N54Q突然変異を有するCDR移植した抗体(配列番号31のVH、配列番号30のVL)を示す。D因子に対する2つの変異体Fab及び親hu20D12.v1 Fabの結合親和性(KD)は、本明細書に記載される抗huFab捕捉プロトコルを用いて、表面プラズモン共鳴(SPR)測定によって評価された(例えば、実施例5を参照のこと)。Fabはまた、溶血アッセイにおいてD因子阻害についてもアッセイされた。表4は、hu20D12.v1のN54S及びN54Q変異体の親和性ならびに溶血アッセイにおける各抗体のIC50を示す。
表4:ヒトD因子のためのFabフォーマットの抗体の相対的結合親和性
表4:ヒトD因子のためのFabフォーマットの抗体の相対的結合親和性
表4に示されるように、hu20D12.v1(hu20D12.v2.0)のN54S変異体は、D因子に対する比較親和性を有した。N54S及びN54Q変異体もまた、溶血アッセイにおけるD因子に対して阻害活性を保持した。Hu20D12.v2.0は、さらなる分析及び親和性改善に対して選択された。
分子的評価(MA)は、さらなる開発のために抗体の適合性を決定するために、hu20D12.v2.0において行われた。これらの実験では、分子は、37℃または40℃でインキュベーションを含む加速安定性試験において試験される。化学安定性は、ペプチドマッピングを用いて評価され、SECは、凝集への感受性を決定するために使用され、いくつかの条件には、抗体結合のSPR測定は、活性の保持を評価するために使用される。これらの試験は、分子が、標準的な製造、製剤、または送達の方法への任意の難題をもたらすかどうかを示す。表5は、応力試験の結果を示す。
表5:hu20D12.v2.0の応力試験
表5:hu20D12.v2.0の応力試験
hu20D12.v1と同様に、hu20D12.v2.0は、PBS中の100mg/mLで、37℃で4週間応力する場合に凝集しなかった。hu20D12.v1とは異なり、hu20D12.v2.0は、この応力条件下で脱アミド部位を示さず、N54S置換が脱アミドをなくし、変異体が生理学的pH及びイオン強度でより高い安定性を有し得ることを示唆した。Hu20D12.v2.0はまた、眼薬に適しているpH5.5の製剤中に良好な安定性を示した。
実施例4:hu20D12.v2.0:D因子複合体の構造決定
どのようにhu20D12.v2.0がヒトD因子と結合するのかをより良好に理解するために、D因子と複合したhu20D12.v2.0 Fabの構造が決定された。ヒトD因子タンパク質及びhu20D12.v2.0 Fabを、1:1のモル比で混合し、20mMのHepes(pH7.2)及び150mMのNaClと前平衡されたSuperdex 200カラム上に精製した。複合体を含むピーク画分をプールし、32mg/mlまで濃縮し、結晶化試験において使用した。結晶は、0.1Mのカコジル酸ナトリウム(pH6.5)及び1Mのクエン酸ナトリウムを含有するリザーバー溶液とタンパク質を2:1(v/v)で混合することによって蒸気核酸方法を用いて、4℃で成長させた。結晶は、20%のエチレングリコールを含有する人工的な母液中で凍結保護され、液体窒素中で急速冷凍された。2.9Åデータセットを、ALS 5.0.2で収集し、分子置換法によって解かれた。これまでに解かれた別の抗D因子Fab:D因子複合体との比較(Katschke et al.(2012)J.Biol.Chem.287,12886)を、図3A〜Cの重ね合わせで示す。これらの2つの抗体が異なるCDR配列を有するが、それらは、D因子上のほぼ同じエピトープに結合する。hu20D12.v2.0(「hu20D12.v1.N54S」)を含む前D因子抗体(ランパリズマブ)のアラインメントを図4に示す。
どのようにhu20D12.v2.0がヒトD因子と結合するのかをより良好に理解するために、D因子と複合したhu20D12.v2.0 Fabの構造が決定された。ヒトD因子タンパク質及びhu20D12.v2.0 Fabを、1:1のモル比で混合し、20mMのHepes(pH7.2)及び150mMのNaClと前平衡されたSuperdex 200カラム上に精製した。複合体を含むピーク画分をプールし、32mg/mlまで濃縮し、結晶化試験において使用した。結晶は、0.1Mのカコジル酸ナトリウム(pH6.5)及び1Mのクエン酸ナトリウムを含有するリザーバー溶液とタンパク質を2:1(v/v)で混合することによって蒸気核酸方法を用いて、4℃で成長させた。結晶は、20%のエチレングリコールを含有する人工的な母液中で凍結保護され、液体窒素中で急速冷凍された。2.9Åデータセットを、ALS 5.0.2で収集し、分子置換法によって解かれた。これまでに解かれた別の抗D因子Fab:D因子複合体との比較(Katschke et al.(2012)J.Biol.Chem.287,12886)を、図3A〜Cの重ね合わせで示す。これらの2つの抗体が異なるCDR配列を有するが、それらは、D因子上のほぼ同じエピトープに結合する。hu20D12.v2.0(「hu20D12.v1.N54S」)を含む前D因子抗体(ランパリズマブ)のアラインメントを図4に示す。
実施例5:より高い親和性抗D因子ヒト化抗体変異体の設計
ファージディスプレイ等の従来のスクリーニング方法によってpM親和性を有する抗体の親和性の改善は、典型的には、非常に困難である。それ故に、記載される結晶構造を用いて、20D12のD因子への結合の構造系分析は、親和性を改善するために突然変異され得る特異的アミノ酸残基を特定するために使用された。
ファージディスプレイ等の従来のスクリーニング方法によってpM親和性を有する抗体の親和性の改善は、典型的には、非常に困難である。それ故に、記載される結晶構造を用いて、20D12のD因子への結合の構造系分析は、親和性を改善するために突然変異され得る特異的アミノ酸残基を特定するために使用された。
hu20D12.v2.0とD因子との間でのある特定の接触は、潜在的に準最適であるように特定され、これらの残基は、対応するランパリズマブのアミノ酸の突然変異のために選択され、抗原に対するより高い親和性を提供し得る。fD:hu20D12.v2.0複合体構造の試験は、Asp−173の側鎖がhu20D12.v2.0と接触しているが、fD Aspは、抗体Fabとの塩橋または完全水素結合を作製しない。図3Cを参照のこと。ArgまたはLys等の抗体上で陽性に荷電した残基の導入は、Aspのためのイオン対の必要条件を満たし得る。このような相互作用を構築するのにほぼ十分であるように思われるhu20D12.v2.0上の位置は、軽鎖のFR2内の49位である。この位置は、hu20D12.v2.0中のTyrであり、そのため、この位置でのLysまたはArg置換がfD結合親和性を増加し得るかどうかを試験した。加えて、ランパリズマブは、hu20D12.v2.0(10pM未満対39pM、図11を参照のこと)よりもより高い親和性でfDと結合し、界面内の主要接触での異なる残基を有する。例えば、hu20D12.v2.0 CDR−H2残基Glu−50、Thr−53、Gly56は、ランパリズマブにおいてTrp−50、Tyr−53、及びGlu−56である。図3Bを参照のこと。ランパリズマブ重鎖の50位でのトリプトファン(W)は、D因子で疎水性相互作用を形成し得るが、hu20D12.v2.0は、その位置でグルタミン酸(E)を有する。ランパリズマブ重鎖の53位でのチロシンはまた、hu20D12.v2.0中のその位置でスレオニン(T)よりもD因子に隣接する残基と共により良好に収容され得る。軽鎖内で、hu20D12.v2.0におけるCDR−L2 Tyr−55及びCDR−L3−Asn92は、ランパリズマブにおいてCDR−L2 Arg−55及びCDR−L3−Asp92である。これらの残基のそれぞれが、D因子:ランパリズマブ複合体構造においてD因子に接触すると見られ、CDR−L−Asp92がD因子のLys223aと荷電相互作用する。Lys223a番号付けについては、Katschke et al.(2012)を参照のこと。
これらの観察等に基づいて、さらなる20D12変異体が設計された。20D12変異体の軽鎖及び重鎖配列を、それぞれ、図1A〜C及び2A〜Cに示す。変異体は、fDへの結合における効果について試験した。突然変異は、E.coli Fab発現プラスミドに導入され、変異体Fabは、上述のように発現させ、精製した。
表面プラズモン共鳴(SPR)測定によるD因子結合親和性
固定化hu20D12バージョンへのD因子についての動力学的及び結合定数KDは、Biacore(登録商標)T200装置で表面プラズモン共鳴(SPR)測定によって決定した。抗体Fab断片を、製造業者によって記載されるプロトコルに従って、抗huFab捕捉キット(GE healthcare カタログ番号28−9583−25)を用いてシリーズS CM5センサ上に固定化した。結合動力学を、2倍単位で0.39nM〜25nMの濃度で変化させた、60μLのアリコートのヒトD因子の溶液の注射後に記録されたセンサグラムから計算した。この流量は、30μL/分であり、泳動用緩衝液は、HBS−P+(GE Healthcareカタログ番号BR−1006−71)であり、分析温度は、25℃であり、リアルタイム参照セル減算が用いられ、D因子の注射後に10分間解離した。高親和性及び遅いオフ速度を有するいくつかの変異体については、解離速度のより正確な測定値を得るために、解離を2時間モニタリングした。センサグラムの減算が、泳動用緩衝液の注射に対して観察された後、動力学的及び親和性定数を抽出するために、BiaEvalソフトウェアv4.1(GE Healthcare)を用いて、1:1のモデルに従って、データを分析した。
固定化hu20D12バージョンへのD因子についての動力学的及び結合定数KDは、Biacore(登録商標)T200装置で表面プラズモン共鳴(SPR)測定によって決定した。抗体Fab断片を、製造業者によって記載されるプロトコルに従って、抗huFab捕捉キット(GE healthcare カタログ番号28−9583−25)を用いてシリーズS CM5センサ上に固定化した。結合動力学を、2倍単位で0.39nM〜25nMの濃度で変化させた、60μLのアリコートのヒトD因子の溶液の注射後に記録されたセンサグラムから計算した。この流量は、30μL/分であり、泳動用緩衝液は、HBS−P+(GE Healthcareカタログ番号BR−1006−71)であり、分析温度は、25℃であり、リアルタイム参照セル減算が用いられ、D因子の注射後に10分間解離した。高親和性及び遅いオフ速度を有するいくつかの変異体については、解離速度のより正確な測定値を得るために、解離を2時間モニタリングした。センサグラムの減算が、泳動用緩衝液の注射に対して観察された後、動力学的及び親和性定数を抽出するために、BiaEvalソフトウェアv4.1(GE Healthcare)を用いて、1:1のモデルに従って、データを分析した。
軽鎖残基Tyr−49のArg(hu20D12.v2.1)への置換は、fDへの結合において、4倍以上の改善をもたらす。図11を参照のこと。親和性の増加は、解離においてより遅いオフ速度の結果である。Tyr−49のSer(hu20D12.v2.6)、Lys(hu20D12.v2.7)、またはGln(hu20D12.v2.8)への置換は、fDに対する親和性を増加させない。CDR−H2 Glu−50のTrp(hu20D12.v2.9)への置換、またはCDR−L2 Tyr−55のLys(hu20D12.v2.10)もしくはArg(hu20D12.v2.11)への置換は、fDに対する親和性の大幅な減少をもたらす。CDR−L2 Gly−56のAsp(hu20D12.v2.2)もしくはGlu(hu20D12.v2.4)への、またはThr−53のTyr(hu20D12.v2.5)への個々の置換は、親和性の増加をもたらすとは思われないが、変異体におけるY49Rを用いたこれらの変化の組み合わせ(hu20D12.v2.12、v2.14、v2.15、v2.3)は、親和性をさらに増加すると思われる。hu20D12の配列とランパリズマブとの比較は、CDR−L2上のTyr−55の置換が、fD Asp−173との予測された相互作用により、親和性の増加を有する変異体をもたらし得ることを示す。しかしながら、結晶構造は、Tyr−49のArgとの置換(Y49R)が、親和性を増加させるためのより良好な選択であることを示す。個別に試験されていないが、CDR−L3置換N92Eは、結合親和性において好ましい増加を生じるために、変異体(hu20D12.v2.13)においてY49Rと混合すると思われる。
hu20D12変異体v2.1、v2.3、v2.12〜v2.15、またランパリズマブのヒトD因子(hFD)に対するD因子の結合親和性は、現在のSPR技術における検出の限界(KD約10pM)である。hu20D12変異体v2.1、v2.3、v2.14、及びv2.15のいくつかは、最も高い親和性(KD=17pM)を有するhu20D12.v2.1を有するカニクイザルD因子(cyfD)に結合する。加えて、hu20D12.v2.1のカニクイザルD因子への結合親和性は、hu20D12.v2.0と比較して約10倍改善され、ランパリズマブと比較して約2倍改善した。カニクイザルは、しばしば、治療候補の前臨床安全性及び有効性評価において使用され、そのため、cFDへの高い結合親和性は、望ましい特性である。Fabは、示差走査熱量測定(DSC)によって熱安定性について試験された。表6は、熱安定性分析の結果を示す。
表6:DSCによる融解温度
表6:DSCによる融解温度
試験されたhu20D12変異体の全てが、ランパリズマブの2つの変異体であるAFD.v8及びAFD.v14について観察されたものよりも高い融点を有する高い熱安定性を示した。
実施例6:D因子の阻害のためのhu20D12変異体の有効性
D因子の阻害のためのhu20D12変異体及びコンジュゲート化hu20D12 Fab−Cバージョンの有効性が、D因子依存的なB因子の活性化の時間分解蛍光エネルギー移動(TR−FRET)アッセイにおいて決定された。hu20D12 Fab、コンジュゲートされたhu20D12 Fab−Cバージョン、または対照の希釈を、4倍濃度で酵素反応緩衝液(ERB;75mMのNaCl、1mMのMgCl2、25mMのTris、0.005% ポリソルベート20、pH7.3)中で調製し、0.5nMまたは0.2nMのD因子(fD、Complement Technology;Tyler、TX)またはERB(酵素対照なし)と等体積で混合した。ラニビズマブ(抗VEGF)を、陰性対照として用いた。D因子/AFD.Ab混合物(7μl/ウェル)を、364ウェルProxiplate F+黒色プレート(Perkin Elmer Health Sciences;Waltham,MA)に添加し、続いて、7μl/ウェルの基質に添加した。基質は、7μg/mL(40nM)のC3b(Complement Technology)及び1μg/mL(15nM)のB因子(Complement Technology)の混合物から成った。Fabまたはコンジュゲート化Fab−Cバージョン、酵素、補因子、及び基質を、穏やかに撹拌しながら室温で45分間インキュベートした。反応は、8nMのビオチン化抗Bb因子(2F12、GNE PRO282909)、4nMのユウロピウムコンジュゲート化抗Ba因子(1C3のカスタムコンジュゲーション、Life Technologies;Madison,WIによるGNE PRO282908)、及び25nMのストレプトアビジン−Alexa 647から成る、7μl/ウェルの検出試薬カクテル混合物で停止させた。プレートを室温にて30分間暗室中でインキュベートした。時間分解蛍光エネルギー移動は、337nmでの励起、620nmでユウロピウム発光及び665nmでAlexa蛍光によって、PHERAstar FSマイクロプレートリーダー(BMG LabTech;Cary,NC)で検出された。半最大阻害(IC50)を生じるAFD.Ab濃度は、4パラメータフィットモデル(KaleidaGraph相乗効果ソフトウェア;Reading,PA)を用いて非線形回帰分析によって決定された。
D因子の阻害のためのhu20D12変異体及びコンジュゲート化hu20D12 Fab−Cバージョンの有効性が、D因子依存的なB因子の活性化の時間分解蛍光エネルギー移動(TR−FRET)アッセイにおいて決定された。hu20D12 Fab、コンジュゲートされたhu20D12 Fab−Cバージョン、または対照の希釈を、4倍濃度で酵素反応緩衝液(ERB;75mMのNaCl、1mMのMgCl2、25mMのTris、0.005% ポリソルベート20、pH7.3)中で調製し、0.5nMまたは0.2nMのD因子(fD、Complement Technology;Tyler、TX)またはERB(酵素対照なし)と等体積で混合した。ラニビズマブ(抗VEGF)を、陰性対照として用いた。D因子/AFD.Ab混合物(7μl/ウェル)を、364ウェルProxiplate F+黒色プレート(Perkin Elmer Health Sciences;Waltham,MA)に添加し、続いて、7μl/ウェルの基質に添加した。基質は、7μg/mL(40nM)のC3b(Complement Technology)及び1μg/mL(15nM)のB因子(Complement Technology)の混合物から成った。Fabまたはコンジュゲート化Fab−Cバージョン、酵素、補因子、及び基質を、穏やかに撹拌しながら室温で45分間インキュベートした。反応は、8nMのビオチン化抗Bb因子(2F12、GNE PRO282909)、4nMのユウロピウムコンジュゲート化抗Ba因子(1C3のカスタムコンジュゲーション、Life Technologies;Madison,WIによるGNE PRO282908)、及び25nMのストレプトアビジン−Alexa 647から成る、7μl/ウェルの検出試薬カクテル混合物で停止させた。プレートを室温にて30分間暗室中でインキュベートした。時間分解蛍光エネルギー移動は、337nmでの励起、620nmでユウロピウム発光及び665nmでAlexa蛍光によって、PHERAstar FSマイクロプレートリーダー(BMG LabTech;Cary,NC)で検出された。半最大阻害(IC50)を生じるAFD.Ab濃度は、4パラメータフィットモデル(KaleidaGraph相乗効果ソフトウェア;Reading,PA)を用いて非線形回帰分析によって決定された。
TR−FRETアッセイの阻害曲線を、図5A、図5B(及び表7)、及び図11(このアッセイにおける条件は、50pMのD因子、15nMのB因子(fB)、及び40nMのC3b因子であった)に示す。ランパリズマブは、24pMのD因子依存的なfBの活性化の阻害のためのIC50を有し、IC50における標準誤差は、±25%である(図5B(表7)及び図11)。アッセイの感度は、50pMより低いD因子濃度での試験を除外する。それ故に、D因子の50%が阻害される濃度と同等であり、阻害剤及びD因子の相互作用が1:1であると仮定すれば、測定することができる最も低いIC50は、25pMである。hu20D12.v2.0のIC50は、ランパリズマブに対して測定されたものよりも約2倍高い。図5B(表7)及び図11を参照のこと。試験された変異体の全て(v2.1、2.14、2.15、2.3)が、ランパリズマブに対して測定された値と同じ、またはそれに近いIC50値を有するhu20D12.v2.0と比較して、有効性が増加した。図5A、5B(表7)、及び図11を参照のこと。
表7:IC50
表7:IC50
実施例7:親和性成熟hu20D12の安定性及び分子的評価
分子的評価は、hu20D12.v2.1及びhu20D12.v2.3において行われた。非標準的技法を必要とする問題は、hu20D12.v2.1においては特定されなかった。対照的に、ランパリズマブは、製剤及び長期作用送達においていくつかのリスクを有する(表8中のランパリズマブにおける応力試験の結果)。hu20D12.v2.1に対する粘度の濃度依存性が決定され、このFabが眼製剤のために用いられた緩衝液中の低い粘度を有し、高濃度製剤に適していることを示した。Hu20D12.v2.0は、試験された少なくとも同じ高さの292mg/mlの濃度で、PBS中で溶解し、一方、ランパリズマブは、227mg/mlで沈殿を示す。図6A及び6Bを参照のこと。加えて、hu20D12.v2.0溶液は、4℃で27週間後に沈殿の痕跡がなく、透明のままであった。これは、改善された有効性を有するより低い投与頻度に有用であるFabの高濃度製剤が、ランパリズマブよりも20D12のヒト化変異体においてより容易に得られることを示す。表8は、hu20D12.v2.1の応力試験の結果を示す。
表8:ランパリズマブの応力試験
表9:hu20D12.v2.1の応力試験
分子的評価は、hu20D12.v2.1及びhu20D12.v2.3において行われた。非標準的技法を必要とする問題は、hu20D12.v2.1においては特定されなかった。対照的に、ランパリズマブは、製剤及び長期作用送達においていくつかのリスクを有する(表8中のランパリズマブにおける応力試験の結果)。hu20D12.v2.1に対する粘度の濃度依存性が決定され、このFabが眼製剤のために用いられた緩衝液中の低い粘度を有し、高濃度製剤に適していることを示した。Hu20D12.v2.0は、試験された少なくとも同じ高さの292mg/mlの濃度で、PBS中で溶解し、一方、ランパリズマブは、227mg/mlで沈殿を示す。図6A及び6Bを参照のこと。加えて、hu20D12.v2.0溶液は、4℃で27週間後に沈殿の痕跡がなく、透明のままであった。これは、改善された有効性を有するより低い投与頻度に有用であるFabの高濃度製剤が、ランパリズマブよりも20D12のヒト化変異体においてより容易に得られることを示す。表8は、hu20D12.v2.1の応力試験の結果を示す。
表8:ランパリズマブの応力試験
表9:hu20D12.v2.1の応力試験
長期作用送達系におけるhu20D12.v2.1 Fabによって経験され得る症状を模擬実験するために、hu20D12.v2.1 Fabの高濃度試料を、以下の2つの製剤条件下、37℃で1カ月間保持した:(1)約200mg/mL、PBS、pH7.4、及び(2)約170mg/mL、20mMのヒスチジン塩酸塩、pH5.5。PBSは、ヒト硝子体液のpH及びイオン強度を模倣するために選択された。ヒスチジン塩酸塩は、液体眼科学的治療薬用の代表的な製剤として選択された。製剤濃度(170mg/mL〜200mg/mL)は、抗D因子の長期作用送達のための臨床的に関連する投与製剤に反映するように選択された。分子安定性は、化学安定性についてはイオン交換クロマトグラフィー(IEC)及び凝集傾向についてはサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を介して評価された。抗原結合の表面プラズモン共鳴(SPR)測定は、活性保持を評価するために使用された。
PBS(pH7.4)中の200mg/mLでまたは20mMのHisHCl(pH5.5)中の170mg/mLで製剤化されたHu20D12.v2.1を、0.22μmのSteriFlipユニット(EMD Millipore)を用いて滅菌濾過し、アリコートし(100μL)、37℃で0、2、または4週間インキュベートした。インキュベーションの完了時に、試料を、スクロース含有製剤緩衝液中で希釈し、−20℃で冷凍した。解凍後、試料を、以下に記載されるように、IEC、SEC、及びSPRによって分析した。
イオン交換クロマトグラフィーによる化学安定性評価。hu20D12.v2.1の化学安定性は、イオン交換クロマトグラフィー(IEC)を用いてモニタリングした。IECを、直列ダイオードアレイ検出器(DAD)を備えたAgilent 1200 HPLCにおいて行った。解凍したタンパク質試料を、PBS中で1mg/mLに希釈させることによってIECのために調製した。カラム上に注射する前に、試料を、2〜8℃で保持して、安定性を維持した。20μgのタンパク質注射の分離を、40℃でProPac SAX−10 2x250mmカラム(Dionex)を用いて行った。溶媒Aは、20mMのTris(pH8.2)であり、溶媒Bは、溶媒A中の250mMの塩化ナトリウムであった。PBS緩衝液ブランクを、UVシグナルへの緩衝液の貢献の減算のために含んだ。化学的分解の分離のために使用された塩勾配を、表10に示す。
表10.hu20D12.v2.1におけるイオン交換クロマトグラフィー勾配
表10.hu20D12.v2.1におけるイオン交換クロマトグラフィー勾配
データは、タンパク質に起因する全てのクロマトグラムピークを統合するために、Chromeleon 6.8ソフトウェア(Thermo Scientific)を用いて処理された。ピーク面積の割合を、等式1を用いて計算し、酸性変異体、主ピーク、及び塩基性変異体と称される、目的の全てのピークについて報告した。酸性または塩基性変異体におけるピークが検出されなかった場合、ピーク面積の割合は、ゼロとして報告された。
hu20D12.v2.1の37℃での高濃度安定性試料についてのIECの結果を、表11A〜Bに報告する。
表11A.イオン交換クロマトグラフィーによるhu20D12.v2.1の37℃での高濃度安定性試料(PBS)の化学安定性
表11B.イオン交換クロマトグラフィーによるhu20D12.v2.1の37℃での高濃度安定性試料(His−HCl pH5.5)の化学安定性
表11A.イオン交換クロマトグラフィーによるhu20D12.v2.1の37℃での高濃度安定性試料(PBS)の化学安定性
表11B.イオン交換クロマトグラフィーによるhu20D12.v2.1の37℃での高濃度安定性試料(His−HCl pH5.5)の化学安定性
サイズ排除クロマトグラフィーによる分子サイズ分布評価。hu20D12.v2.1の分子サイズ分布は、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を用いてモニタリングした。SECを、直列ダイオードアレイ検出器(DAD)を備えたAgilent 1200 HPLCにおいて行った。解凍したタンパク質試料を、PBS中で1mg/mLに希釈させることによってSECのために調製した。カラム上に注射する前に、試料を、2〜8℃で保持して、安定性を維持した。100μgのタンパク質注射の分離を、周囲温度でTSKgel G3000SWxlカラム(Tosoh Biosciences、部品番号08541)を用いて行った。移動相は、0.20Mのリン酸カリウム、0.25Mの塩化カリウム(pH 6.2±0.1)から成った。UV試料シグナルを、280nmでモニタリングした。PBS緩衝液ブランクを、UVシグナルへの緩衝液の貢献の減算のために含んだ。
データは、タンパク質に起因する全てのクロマトグラムピークを統合するために、Chromeleon 6.8ソフトウェア(Thermo Scientific)を用いて処理された。ピーク面積の割合を、上の等式1を用いて計算し、高分子量種(HMWS)、主ピーク(モノマー)、及び低分子量種(LMWS)と称される、目的の全てのピークについて報告した。HMWSまたはLMWSにおけるピークが検出されなかった場合、ピーク面積の割合は、ゼロとして報告された。hu20D12.v2.1の37℃での高濃度安定性試料についてのSECの結果を、表12A〜Bに報告する。
表12A.サイズ排除クロマトグラフィーによるhu20D12.v2.1の37℃での高濃度安定性試料(PBS)の分子サイズ分布
表12B.サイズ排除クロマトグラフィーによるhu20D12.v2.1の37℃での高濃度安定性試料(His−HCl pH5.5)の分子サイズ分布
表12A.サイズ排除クロマトグラフィーによるhu20D12.v2.1の37℃での高濃度安定性試料(PBS)の分子サイズ分布
表12B.サイズ排除クロマトグラフィーによるhu20D12.v2.1の37℃での高濃度安定性試料(His−HCl pH5.5)の分子サイズ分布
表面プラズモン共鳴測定によるD因子結合親和性。表面プラズモン共鳴(SPR)測定は、応力hu20D12.v2.1試料の結合能力を決定するために、BIAcore(登録商標)T200装置(GE Healthcare)を用いて行われた。シリーズSカルボキシメチル化デキストラン(CM5)センサチップを、製造業者によって説明されるプロトコルに従ってアミンカップリングキット(GE Healthcare)を用いてヒトD因子(標的RU約3,000)を固定化することによって調製した。非応力hu20D12.v2.1の標準溶液を、2倍希釈で106.5nM〜3.31nMのHBS−P+泳動用緩衝液(GE Healthcare)中で調製し、10μL/分で180秒間注射して、標準曲線を作成した。応力試料を、HBS−P+緩衝液中で約40nMまで希釈し、10μL/分で180秒間注射した。各注射後、センサチップ表面を、10mMのグリシン−HCl(pH2.1)を用いて、30μL/分で30秒間再生した。濃度分析を、BIAcore(登録商標)T200分析ソフトウェア(GE Healthcare)を用いて行った。この種の分析は、±10%の標準誤差を有し、そのため、90〜110%の結合能力を有する試料は、完全に活性であると見なされる。hu20D12.v2.1の37℃での高濃度安定性試料についてのSPR D因子の結合能力の結果を、表13A〜Bに示す。
表13A.表面プラズモン共鳴測定によるhu20D12.v2.1の37℃での高濃度安定性試料(PBS)のD因子の結合能力
表13B.表面プラズモン共鳴測定によるhu20D12.v2.1の37℃での高濃度安定性試料(His−HCl pH5.5)のD因子の結合能力
全体的に、これらの結果は、hu20D12.v2.1がPBS及び20mMのHis−HCl(pH5.5)中の高濃度製剤に適していることを示す。37℃で少なくとも4週間の熱応力において、初期試料と比較して、SEC及びIECの両方によって主ピークのわずかに遅い喪失率があり、D因子の結合のごくわずかな減少がある。
表13A.表面プラズモン共鳴測定によるhu20D12.v2.1の37℃での高濃度安定性試料(PBS)のD因子の結合能力
表13B.表面プラズモン共鳴測定によるhu20D12.v2.1の37℃での高濃度安定性試料(His−HCl pH5.5)のD因子の結合能力
全体的に、これらの結果は、hu20D12.v2.1がPBS及び20mMのHis−HCl(pH5.5)中の高濃度製剤に適していることを示す。37℃で少なくとも4週間の熱応力において、初期試料と比較して、SEC及びIECの両方によって主ピークのわずかに遅い喪失率があり、D因子の結合のごくわずかな減少がある。
実施例8:hu20D12変異体のポリマーコンジュゲーション
硝子体の半減期は、抗体Fabの流体力学的半径を増加させることによって延長させ得る。Fabの流体力学的半径は、ポリエチレングリコール(PEG)等のポリマーの共有結合によって増加し得る。この改変においては、生物学的活性におけるコンジュゲーションの影響を最小限に抑えるために、抗原結合領域から除去された部位で、部位特異的様式で行われることは有益であり得る。改変のために遊離システイン残基の使用は、この目的のために望ましい。単一または複数の遊離システインは、単一または複数の部位の結合を可能にするために使用することができる。重鎖のC末端で単一のシステインは、改変のためにFabに含まれた。抗体のFab−Cバージョンは、Cys−226(EU番号付け)を含むように、1つの残基によってFab重鎖を延長することによって作製された。IgG1分子において、Cys−226は、ヒンジの第1の鎖内重鎖ジスルフィド結合を形成する。オリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発を、hu20D12.v2.1.C(配列番号119)及びhu20D12.v2.3.C(配列番号124)のFab−Cバージョンのための遺伝子構築体を生成するために上述のように行った。同様の突然変異誘発の手順は、さらなるFab−C構築体、例えば、hu20D12.v2.1.Cにおいては配列番号71、118〜122、及び140〜146、ならびにhu20D12.v2.3.Cにおいては配列番号75、123、125〜127、及び147〜153を作製するために使用することができる。
硝子体の半減期は、抗体Fabの流体力学的半径を増加させることによって延長させ得る。Fabの流体力学的半径は、ポリエチレングリコール(PEG)等のポリマーの共有結合によって増加し得る。この改変においては、生物学的活性におけるコンジュゲーションの影響を最小限に抑えるために、抗原結合領域から除去された部位で、部位特異的様式で行われることは有益であり得る。改変のために遊離システイン残基の使用は、この目的のために望ましい。単一または複数の遊離システインは、単一または複数の部位の結合を可能にするために使用することができる。重鎖のC末端で単一のシステインは、改変のためにFabに含まれた。抗体のFab−Cバージョンは、Cys−226(EU番号付け)を含むように、1つの残基によってFab重鎖を延長することによって作製された。IgG1分子において、Cys−226は、ヒンジの第1の鎖内重鎖ジスルフィド結合を形成する。オリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発を、hu20D12.v2.1.C(配列番号119)及びhu20D12.v2.3.C(配列番号124)のFab−Cバージョンのための遺伝子構築体を生成するために上述のように行った。同様の突然変異誘発の手順は、さらなるFab−C構築体、例えば、hu20D12.v2.1.Cにおいては配列番号71、118〜122、及び140〜146、ならびにhu20D12.v2.3.Cにおいては配列番号75、123、125〜127、及び147〜153を作製するために使用することができる。
hu20D12.v2.1(「hu20D12.v2.1.C」)及びhu20D12.v2.3(「hu20D12.v2.3.C」)のFab−Cバージョンは、E.coliに発現させ、実質的には以下のように精製した。Fab−C変異体は、Gamma Plus樹脂を用いて捕捉し、5カラム体積において6.5mMのGSH(pH8.5)で洗浄し、c末端システインを非ブロック化し、Fab−Cの二量体の形成を崩壊させ、続いて、0.1Mの酢酸(pH2.9)に溶出した。Fab−Cモノマーを、SPセファロース高性能強陽イオン性交換樹脂を用いて25mMの酢酸ナトリウム(pH5.0)中のGEからさらに単離し、0.05%Triton X−100+0.05%Triton X−114を用いて、内毒素を19時間除去した。溶出を、20カラム体積にわたって0〜20%25mMの酢酸ナトリウム(pH5.0)+1MのNaClの勾配を用いて行った。Hu20D12.v2.1.Cまたはhu20D12.v2.3.Cを、約5mg/mLの濃度で、25mMのNaAcetate(pH6.5)、150mMのNaCl、4mMのEDTA中のPEG八量体にコンジュゲートした。Fab−Cは、Fab−C二量化によるシステイン反応性の喪失を最小限に抑えるために、さらに濃縮されなかった。室温に平衡化した後、JenKemからの40K TP PEG粉末を、10mg/mLの濃度まで25mMのNaAcetate(pH5.0)に再懸濁した。pHは、pH6以下に維持して、マレイミド開環を回避した。一旦PEGを可溶化してから、それを、0.1125:1のPEG対Fab−Cのモル比でFab−Cプールに添加した。次いで、混合物を、穏やかに一晩撹拌しながら室温で放置した。翌日、コンジュゲーション効率を、SEC−MALSによって確認した。コンジュゲーション後、hu20D12.v2.1.C+TP−Octを、20mMのHis−アセテート(pH5.5)、50mMのNaCl(アイソクラチック勾配)中のSephacryl S−300 HR(GE Healthcare)カラム上でサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を用いて精製し、続いて、SPセファロース高性能強陽イオン性交換樹脂を用いてGEから陽イオン性交換(CEX)をし、8つのFab/PEGに濃縮した。CEXステップは、25mMの酢酸ナトリウム(pH5.0)中で実施され、50CVにわたって10〜20%1M NaCl勾配を用いて溶出した。CEXクロマトグラム(図8A)、及びS300プール中のFab分布(図8B)の一例を示す。異なる画分のためのデータを図8Cに示す。
全てのプロセスのために、Fab/PEGの比は、アイソクラチック条件下で、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(pH7.2)、150mMのNaClを用いて、0.8mL/分で実施される300×8mm Shodex OH pak SB−804 HQを用いたサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって決定された。モル質量を、Wyatt Technologyによるインライン静的な多角度レーザー光散乱(MALS)を用いて決定した。コンジュゲートしたhu20D12.v2.1.C+TP−Octのために典型的なSEC−MALSプロファイルを、図7Aに示す。光子相関分光法は、99.0°での検出のために単一の光子計数モジュールである準弾性光散乱(QELS)を用いて、また、Wyatt Technologyによって、流体力学半径(RH)を決定するために使用した。図7Bを参照のこと。生データを、モル質量及びRH定数は、リツキシマブ標準物質を用いて設定された、Wyatt特許Astraソフトウェアを用いて分析した。hu20D12.v2.1.C+TP−OctにおけるRH値は、10.3nmである。図7Cを参照のこと。
サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)はまた、抗D因子コンジュゲートのサイズ変異体分布を決定するためにも使用される。抗D因子コンジュゲート(300μg)の溶液を、20mMのリン酸ナトリウム、300mMの塩化ナトリウム(pH7.0)緩衝液を用いて2mg/mlになるまで希釈する。分析のために、UV検出を280nmで勾配流を可能にするHPLC系を使用する。クロマトグラフィーカラムは、Tosoh G4000 SWxl(8μm、450Å、7.8mmID×30cm)であり、0.5ml/分で操作される。移動相で希釈した50マイクロリットルの2mg/mlの抗D分子を、HPLC系に注入する。カラム温度は、周囲温度であり、オートサンプラーは、2〜8℃であり、移動相は、アイソクラチックモードである。安定したベースラインが得られるまで、カラムは平衡化し、一致したクロマトグラフィープロファイルが、最低2つの連続注入で観察されるまで、参照材料が注入される。このサイズ変異体に基づいたアッセイは、コンジュゲートされていないFab形態を、コンジュゲート及び凝集形態から分離することができる(図20)。
hu20D12.v2.1.C+TP−Oct及びhu20D12.v2.3.C+TP−Octの両方は、八量体−PEGへのコンジュゲーション後に、TR−FRET阻害アッセイにおける完全活性を保持した。図5Aを参照のこと。部位特異的なコンジュゲーションは、活性を保つと思われた。さらに、多重結合の骨格におけるFabの配列は、阻害剤の潜在力に著しく影響を及ぼさない。
製剤の粘度は、注入のための適合を決定するために重要なパラメータである。したがって、粘度測定は、PEG化Fab−Cのために行われた。粘度測定は、1000s−1の剪断速度を用いて、25℃のサーモスタットでTA装置円錐平板レオメーターにおいて行われた。Fabの測定のために、タンパク質を、pH5.5の低塩緩衝液中で調製した。PEG化Fab−C材料における粘度測定は、20mMのHis−アセテートの緩衝液、50mMのNaCl(pH6.5)を用い、測定温度は、20℃であった。hu20D12.v2.1.C(「hu20D12.v2.1.C+TP−Oct」)及びhu20D12.v2.3.C(「hu20D12.v2.3.C+TP−Oct」)の両方のPEG−八量体コンジュゲートは、低粘度及び粘度の濃度依存性を示し、これは高濃度製剤の注射に適している。図9Aを参照のこと。対照的に、ランパリズマブの変異体である、AFD.v14.C(「AFD.v14.C+TP−Oct」)のPEG−八量体コンジュゲートは、より高い粘度及び粘度の濃度依存性を示し、これは高濃度製剤の注射に対してさらに難題をもたらす。図9Aを参照のこと。粘度測定はまた、40K−四量体−PEG(Sunbright(登録商標)PTE−400 MA、表15を参照のこと)にコンジュゲートしたFab−Cタンパク質においても行われた。hu20D12.v2.3.C(「hu20D12.v2.3.C+PEG四量体」)のPEG四量体コンジュゲートは、低粘度及び粘度の濃度依存性を示し、これは高濃度製剤の注射に適している。図9Bを参照のこと。対照的に、ランパリズマブの変異体である、AFD.v8.C(「AFD.v8.C+PEG四量体」)のPEG−四量体コンジュゲートは、より高い粘度及び粘度の濃度依存性を示し、これは高濃度製剤の注射に対してさらに難題をもたらす。図9Bを参照のこと。
粘度測定はまた、陽極酸化アルミ形状の20mm直径、1°角度を有するAR−G2新型レオメーター(部品番号513204.905)を用いてhu20D12.v2.1.C+TP−Octにおいても行われた。測定は、20mMのHis−HCl(pH5.5)、0.02%ポリソルベート−20から成る緩衝液中の変化したタンパク質濃度の溶液において行われた。温度は、25℃であり、剪断速度は、1000s−1であった。表14に示されるように、この製剤化は、タンパク質濃度における粘度の依存性で非常に良好なプロファイルを有し、試験した最高Fab濃度(235mg/mL)で、粘度は、わずかに203センチポアズ(cP)であった。
表14.変化したタンパク質濃度で、20mMのHis−HCl(pH5.5)、0.02%ポリソルベート−20中に製剤化されたhu20D12.v2.1−C+TP−Octの粘度。
表14.変化したタンパク質濃度で、20mMのHis−HCl(pH5.5)、0.02%ポリソルベート−20中に製剤化されたhu20D12.v2.1−C+TP−Octの粘度。
PEGの調製:PEG粉末は、水を用いて10mg/mLになるまで再構成した。10mMのトリフルオロ酢酸ナトリウム溶液は、陽イオン化剤として使用された。50%アセトニトリル:0.1%トリフルオロ酢酸に溶解した、20mg/mlのα−シアノ−4−ヒドロキシ桂皮酸マトリックス溶液が、用いられた。PEG溶液、トリフルオロ酢酸ナトリウム、及び50%アセトニトリル:0.1%トリフルオロ酢酸を、3:3:4の比で混合した。1マイクロリットルのPEG混合物を、MALDI標的プレート上に沈着させた。1マイクロリットルのマトリックスを、スポットに添加し、周囲温度で乾燥させた。分析を、5000〜100000の範囲のm/z及び5000のレーザー出力を有する、線形モードにおいて、355nm、200Hz Nd:Yagレーザーで備えた4800 MALDI TOF/TOF装置(Sciex,Framingham,MA)において行われた。
外部較正を、同様の試料条件下で、サイズが2000〜40000ダルトンの範囲に及ぶPEG標準物質(Sigma,St.Louis,MO)を用いて行われた。質量の読み込みは、分解されないスペクトルにおいて最高点として報告され、1つを超えるピークが存在した場合、読み込みは、各ピークの頂点として報告された。ピークを、Data Explorerソフトウェア(Sciex,Framingham,MA)を用いて視覚化した。
再構成したPEG溶液はまた、Exactive Plus EMR(Extended Mass Range)オービトラップ装置(EMR,Thermo,San Jose,CA)上のNanomate(Advion,Ithaca,NY)を介して直接注入によって分析された。70%H2O:30%ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解した、1%(10mg/1ml)1,8−ビス(テトラメチルグアニジノ)ナフタレン(Sigma,St.Louis,MO)溶液を、電荷還元試薬として使用した。10ulの10mg/mL PEG溶液を、10ul 1%1,8−ビス(テトラメチルグアニジノ)ナフタレンと混合し、以下の捕捉パラメータでEMRに直接注入された:スプレーガス圧、1.0psi;1.50kVに印加するためのスプレー電圧;キャピラリー温度、325℃;SレンズRFレベル、100;走査範囲、1000〜20000m/z;インソースフラグメンテーション、CID 200Ev、CE200;解像度、17500;陽極性;マイクロスキャン、10;AGC targe、3e6;最大射出時間、50;AGCモード、固定;平均化、100;電流源DCオフセット、25V;Injection Flatapole DC、8V;Inter Flatapoleレンズ、7V;Bent Flatapole DC、6V、Transfer多極DCチューンオフセット、0V;C−Trapエントランスレンズチューンオフセット、0V;Trappingガス圧設定、8。スペクトルを、Thermo Xcalibur Qual Browserを用いて視覚化し、手動で注釈を付けた。
コアPEG構造及びコンジュゲートの数が試料タイプによって変化したPEG−Fabコンジュゲートは、線形モードにおいて、4800 MALDI TOF/TOFにおいて分析され得る。4マイクロリットルのPEG−Fabコンジュゲートを、4マイクロリットルのトリフルオロ酢酸ナトリウム、及び2マイクロリットルの50%アセトニトリル:0.1%トリフルオロ酢酸と混合する。等体積のPEG−Fab溶液及び20mg/mLのシナピン酸(50%アセトニトリル:0.1%トリフルオロ酢酸中、Santa Clara,CA)マトリックスを、分析のために、MALDI標的プレート上に沈着させた。m/z範囲は、100000〜500000で設定し、標的質量を、400000に設定した。スペクトルを、Data Explorerを用いて視覚化し、手動で注釈を付けた。
実施例9:ポリマーコンジュゲートの熱安定性
長期作用送達系で見出され得る条件でhu20D12コンジュゲートの曝露を刺激するために、hu20D12.v2.1.C及びhu20D12.v2.3.C TPコンジュゲート(上述のように調製された)の試料を、2つの異なるpH及び塩条件下で37℃で数週間加圧した。具体的には、コンジュゲートを以下の製剤において評価した:
製剤1:約25mg/mL、PBS、
製剤2:約25mg/mL、20mMのヒスチジンHCl、50mMのNaCl(pH6.5)。
長期作用送達系で見出され得る条件でhu20D12コンジュゲートの曝露を刺激するために、hu20D12.v2.1.C及びhu20D12.v2.3.C TPコンジュゲート(上述のように調製された)の試料を、2つの異なるpH及び塩条件下で37℃で数週間加圧した。具体的には、コンジュゲートを以下の製剤において評価した:
製剤1:約25mg/mL、PBS、
製剤2:約25mg/mL、20mMのヒスチジンHCl、50mMのNaCl(pH6.5)。
PBSは、ヒト硝子体のpH及びイオン強度の模倣体として使用された。PBS中の25mg/mLまたは20mMのHis−Ac(pH6.5)、50mMのNaClで製剤化されたhu20D12.v2.1またはhu20D12.v2.3コンジュゲートの溶液のアリコート(100μL)を、0.22μmのCostar(登録商標)Spin−X遠心分離チューブ(Corning)を用いて遠心分離濾過によって滅菌濾過し、次いで、37℃で0、2、4、または8週間インキュベートした。インキュベーションを、−70℃で冷凍することによって終了した。解凍後、試料を、SEC−MALS、CE−SDS、及びD因子結合能力を評価するためにbiacore(下述のような方法)によって分析した。測定における標準誤差(±10%)よりも結合能力の変化は、37℃でのコンジュゲートのインキュベーションにおいて決定された。結合能力(SPR)によって分析されるhu20D12.v2.1.C+TP−Octの熱安定性(37℃)を示す、図10Aを参照のこと。斜交平行領域は、±10%の標準誤差を示す。結合能力は、PBS中の37℃で4週間後、及びpH6.5で4週間後でさえ一定に保たれた。CE−SDSによるhu20D12.v2.1.C+TP−Octコンジュゲートの分析は、両方の製剤中で良好な熱安定性(37℃)を示した。図10Bを参照のこと。わずかに約1%/週のコンジュゲートのピーク領域の喪失(%)が観察された。
a.FQ標識手順
試料を、以下の手順に従って標識した。hu20D12.2.1−C+TP−Oct(300μg)の溶液を、潜在的に競合する製剤構成物質を除去するために、NAP−5ゲル濾過カラム(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)を用いて、0.5mLのリン酸ナトリウム反応緩衝液中で交換した。250μLのアリコートの脱塩コンジュゲートを、4%SDSに溶解した30μLの150mM N−エチルマレイミドと混合し、70℃で5分間インキュベートして、変性条件下でジスルフィド入れ替えをした。10マイクロリットルの各2.5mMのFQ及び30mMのKCN試薬を、SDS−hu20D12.2.1−C+TP−Oct溶液に添加し、1%SDSで3倍希釈する前に、最終溶液を、50℃で10分間インキュベートし、反応を停止した。還元分析のために、希釈試料のアリコートを、50mMのDTTで70℃にて10分間インキュベートした。
試料を、以下の手順に従って標識した。hu20D12.2.1−C+TP−Oct(300μg)の溶液を、潜在的に競合する製剤構成物質を除去するために、NAP−5ゲル濾過カラム(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)を用いて、0.5mLのリン酸ナトリウム反応緩衝液中で交換した。250μLのアリコートの脱塩コンジュゲートを、4%SDSに溶解した30μLの150mM N−エチルマレイミドと混合し、70℃で5分間インキュベートして、変性条件下でジスルフィド入れ替えをした。10マイクロリットルの各2.5mMのFQ及び30mMのKCN試薬を、SDS−hu20D12.2.1−C+TP−Oct溶液に添加し、1%SDSで3倍希釈する前に、最終溶液を、50℃で10分間インキュベートし、反応を停止した。還元分析のために、希釈試料のアリコートを、50mMのDTTで70℃にて10分間インキュベートした。
b.CE−SDS分析
PEG化Fab試料の分離が、40℃の熱制御されたカートリッジに入れられた50μmのID(Polymicro technologies,Phoenix,AZ,USA)の31.2cm(21cmの有効長)の溶融シリカキャピラリーで行われた。完全自動化したBeckman PA800+系(Beckman Coulter,Brea,CA,USA)を、LIF検出で装備し、32 Karatバージョン9.1を用いて、装置を制御した。LIF検出器を、488nmで励起を有する3.5mW アルゴンイオンレーザーを使用し、発光は、600±20nmのバンドパスフィルター(Edmund Optics,Barrington,NJ,USA)を通して収集した。電圧を、陰性モード(逆極性)において適用した。試料溶液を、5kVで25秒間電気動力学的に導入し、17kVで分離した。泳動の間に、キャピラリーを、それぞれ、0.1MのNaOH、0.1MのHCl、及びBeckmanゲル緩衝液で5分間、1分間、1分間、及び10分間洗浄した。例えば、Michels et al.,2007,Anal.Chem.,79:5963−71、Michels et al.,2012,Electrophoresis,33:815−26を参照のこと。hu20D12.2.1−C+TP−Octの非還元試料の一例の電気泳動を図21に示す。
PEG化Fab試料の分離が、40℃の熱制御されたカートリッジに入れられた50μmのID(Polymicro technologies,Phoenix,AZ,USA)の31.2cm(21cmの有効長)の溶融シリカキャピラリーで行われた。完全自動化したBeckman PA800+系(Beckman Coulter,Brea,CA,USA)を、LIF検出で装備し、32 Karatバージョン9.1を用いて、装置を制御した。LIF検出器を、488nmで励起を有する3.5mW アルゴンイオンレーザーを使用し、発光は、600±20nmのバンドパスフィルター(Edmund Optics,Barrington,NJ,USA)を通して収集した。電圧を、陰性モード(逆極性)において適用した。試料溶液を、5kVで25秒間電気動力学的に導入し、17kVで分離した。泳動の間に、キャピラリーを、それぞれ、0.1MのNaOH、0.1MのHCl、及びBeckmanゲル緩衝液で5分間、1分間、1分間、及び10分間洗浄した。例えば、Michels et al.,2007,Anal.Chem.,79:5963−71、Michels et al.,2012,Electrophoresis,33:815−26を参照のこと。hu20D12.2.1−C+TP−Octの非還元試料の一例の電気泳動を図21に示す。
c.表面プラズモン共鳴分析
シリーズS、CM5センサチップを、Biacore(登録商標)T200装置(GE Healthcare)にドックし、1X泳動緩衝液でプライムし、製造業者によって供給されるプロトコルに従って70%グリセロールで正規化した。センサチップ表面を、提供された材料及び製造業者によって示唆されたプロトコルを有するアミンカップリングキットを用いて抗原のアミンカップリングにおいて活性化された。ヒトD因子(fD)を、10mMの酢酸ナトリウム(pH5)を用いてfD(PUR#20491、2.4mg/mL)の希釈によって調製された100μg/mLの抗原を含有する溶液を注入することによって共有結合で固定化した。流量は、10μL/分であり、70μLの注入体積を使用した。これにより、fDにおいて約5000共鳴ユニット(RU)の複数の実験にわたって典型的なカップリング密度を生じた。未反応アミンカップリング部位は、70μLの1M エタノールアミンの注入によってブロックした。
シリーズS、CM5センサチップを、Biacore(登録商標)T200装置(GE Healthcare)にドックし、1X泳動緩衝液でプライムし、製造業者によって供給されるプロトコルに従って70%グリセロールで正規化した。センサチップ表面を、提供された材料及び製造業者によって示唆されたプロトコルを有するアミンカップリングキットを用いて抗原のアミンカップリングにおいて活性化された。ヒトD因子(fD)を、10mMの酢酸ナトリウム(pH5)を用いてfD(PUR#20491、2.4mg/mL)の希釈によって調製された100μg/mLの抗原を含有する溶液を注入することによって共有結合で固定化した。流量は、10μL/分であり、70μLの注入体積を使用した。これにより、fDにおいて約5000共鳴ユニット(RU)の複数の実験にわたって典型的なカップリング密度を生じた。未反応アミンカップリング部位は、70μLの1M エタノールアミンの注入によってブロックした。
抗体Fabの抗原結合活性濃度は、Biacore(登録商標)T200評価ソフトウェアの較正依存性の濃度分析を用いて決定した。hu20D12.v2.1.C+TP−Octの標準曲線を、ストック溶液の重量希釈を通じて5μg/mLになるまで調製し、続いて、連続2倍希釈して、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、及び0.078μg/mLの試料を生成した。試験試料を、約0.5、1.0、または1.5μg/mLのタンパク質濃度を得るために重量希釈によって調製した。全ての試料(200μLの体積)を、1X泳動緩衝液を用いて調製した。60μLのアリコートを、10μL/分の流量を用いて特異的抗原表面にわたって注入し、センサチップを25℃で維持し、1X泳動緩衝液でプライムした。特異的抗原に結合する抗体は、試料注入の終了に近づいたときにSPRシグナルから決定した。結合抗体は、30μLの10mM Gly−HCl(pH2.1)の注入を通じて各結合サイクルの終了時に溶出され、抗体−抗原複合体の解離を生じた。hu20D12.2.1−C+TP−Octの標準曲線は、データを分析するために4つのパラメータ機能を用いて、SPRシグナルの抗体濃度への関係を決定するために使用された。標準曲線から計算されたパラメータは、観察されたSPRシグナルに基づいて試験試料の抗原結合濃度を計算するために使用された。吸光速度によって決定されたタンパク質濃度に対するこの濃度の比は、画分またはパーセント結合を得る。
実施例10:ポリマーコンジュゲーションのためのさらなる抗D因子抗体変異体
上に論じられるように、抗D因子Fabの定常領域内の遊離システイン等は、コンジュゲーションを改善し、抗原への結合障害を最小限に抑えることができる。重鎖Fab C末端「CDKTHTC」に加えて、Fab断片の重鎖はまた、Fab−C対照物のヒンジ領域から初めの4つの残基を添加することによって改変され、C末端「CDKTHTCPPC」を得てもよい。C末端「CDKTHTCPPS」、「CDKTHTSPPC」、「CDKTH」、「CDKT」、「CDK」、「CD」、「APPC」、「SGGC」、または「CYGPPC」も、使用してもよい。いくつかの実施形態において、「CDKTHTCPPC」末端は、2つのPEG分子の結合を可能にする。得られるFabは、多アーム型PEGとコンジュゲートされ得る。
上に論じられるように、抗D因子Fabの定常領域内の遊離システイン等は、コンジュゲーションを改善し、抗原への結合障害を最小限に抑えることができる。重鎖Fab C末端「CDKTHTC」に加えて、Fab断片の重鎖はまた、Fab−C対照物のヒンジ領域から初めの4つの残基を添加することによって改変され、C末端「CDKTHTCPPC」を得てもよい。C末端「CDKTHTCPPS」、「CDKTHTSPPC」、「CDKTH」、「CDKT」、「CDK」、「CD」、「APPC」、「SGGC」、または「CYGPPC」も、使用してもよい。いくつかの実施形態において、「CDKTHTCPPC」末端は、2つのPEG分子の結合を可能にする。得られるFabは、多アーム型PEGとコンジュゲートされ得る。
実施例11:抗D因子抗体コンジュゲートの調製
重鎖Fab末端「CDKTHTC」、「CDKTHTCPPC」、「CDKTHTSPPC」、「CDKTHTCPPS」、「CDKTH」、「CDKT」、「CDK」、「CD」、「APPC」、「SGGC」、または「CYGPPC」を有するヒト化抗D因子Fab変異体は、変動するコア構造を有する市販のマレイミド官能化多アーム型PEGとコンジュゲートされる。
重鎖Fab末端「CDKTHTC」、「CDKTHTCPPC」、「CDKTHTSPPC」、「CDKTHTCPPS」、「CDKTH」、「CDKT」、「CDK」、「CD」、「APPC」、「SGGC」、または「CYGPPC」を有するヒト化抗D因子Fab変異体は、変動するコア構造を有する市販のマレイミド官能化多アーム型PEGとコンジュゲートされる。
8ARM(TP)−PEG−MAL(JenKem Technology,USA)及びSunbright(登録商標)HGEO−400MA(NOF America,Corp.)を、MALDI用いて分析して、TPコアまたはHGEOコアのいずれかを含有するPEG八量体の均一性を比較した。これらの結果を、図12A及び12Bに示す。これらの図に示されるように、TPコアを含有する8ARM(TP)−PEG−MALは、HGEOコアを含有するSunbright(登録商標)HGEO−400MAよりもより均一であった。
b.マレイミド官能化多アーム型PEGによるFabのコンジュゲーション
システイン改変Fabは、Gamma Plus樹脂を用いて捕捉し、5カラム体積において6.5mMのGSH(pH8.5)で洗浄し、C末端システインを非ブロック化し、Fab−Cの二量体の形成を崩壊させ、続いて、0.1Mの酢酸(pH2.9)に溶出した。システイン改変Fabモノマーを、SPセファロース高性能強陽イオン性交換樹脂を用いて25mMの酢酸ナトリウム(pH5.0)中のGEからさらに単離し、0.05%Triton X−100+0.05%Triton X−114を用いて、内毒素を19時間除去した。溶出を、20カラム体積にわたって0〜20%25mMの酢酸ナトリウム(pH5.0)+1MのNaClの勾配を用いて行う。次いで、非ブロック化c末端システインを有する単量体のFab−Cを、1M HEPES(pH7.2)を用いてpH6.5になるまで滴定することによってPEG化のために調製する。次いで、Fab−Cを、約5mg/mLの濃度で、25mMのNaAcetate(pH6.5)、150mMのNaCl、4mMのEDTA中のPEG八量体にコンジュゲートする。Fab−Cは、Fab−C二量化によるシステイン反応性の喪失を最小限に抑えるために、さらに濃縮されない。室温に平衡化した後、JenKemからの40K TP PEG粉末を、10mg/mLの濃度まで25mMのNaAcetate(pH5.0)に再懸濁する。pHは、pH6以下に維持して、マレイミド開環を回避する。一旦PEGを可溶化してから、それを、0.1125:1のPEG対Fab−Cのモル比でFab−Cプールに添加する。次いで、混合物を、穏やかに一晩撹拌しながら室温で放置する。翌日、コンジュゲーション効率を、SEC−MALSによって確認する。
システイン改変Fabは、Gamma Plus樹脂を用いて捕捉し、5カラム体積において6.5mMのGSH(pH8.5)で洗浄し、C末端システインを非ブロック化し、Fab−Cの二量体の形成を崩壊させ、続いて、0.1Mの酢酸(pH2.9)に溶出した。システイン改変Fabモノマーを、SPセファロース高性能強陽イオン性交換樹脂を用いて25mMの酢酸ナトリウム(pH5.0)中のGEからさらに単離し、0.05%Triton X−100+0.05%Triton X−114を用いて、内毒素を19時間除去した。溶出を、20カラム体積にわたって0〜20%25mMの酢酸ナトリウム(pH5.0)+1MのNaClの勾配を用いて行う。次いで、非ブロック化c末端システインを有する単量体のFab−Cを、1M HEPES(pH7.2)を用いてpH6.5になるまで滴定することによってPEG化のために調製する。次いで、Fab−Cを、約5mg/mLの濃度で、25mMのNaAcetate(pH6.5)、150mMのNaCl、4mMのEDTA中のPEG八量体にコンジュゲートする。Fab−Cは、Fab−C二量化によるシステイン反応性の喪失を最小限に抑えるために、さらに濃縮されない。室温に平衡化した後、JenKemからの40K TP PEG粉末を、10mg/mLの濃度まで25mMのNaAcetate(pH5.0)に再懸濁する。pHは、pH6以下に維持して、マレイミド開環を回避する。一旦PEGを可溶化してから、それを、0.1125:1のPEG対Fab−Cのモル比でFab−Cプールに添加する。次いで、混合物を、穏やかに一晩撹拌しながら室温で放置する。翌日、コンジュゲーション効率を、SEC−MALSによって確認する。
実施例12:コンジュゲートの例示的な精製及び特徴付け
実施例10に調製されたコンジュゲートを、PEG化を確認し、異なるPEGコア構造におけるコンジュゲーション効率を決定するために、SEC−MALSを用いて、精製し、分析する。コンジュゲーション効率は、アイソクラチック条件下で、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(pH7.2)、150mMのNaClを用いて、0.8mL/分で実施される300×8mm Shodex OH pak SB−804 HQを用いたサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって決定される。モル質量を、Wyatt Technologyによるインライン静的な多角度レーザー光散乱(MALS)を用いて決定する。光子相関分光法は、99.0°での検出のために単一の光子計数モジュールである準弾性光散乱(QELS)を用いて、また、Wyatt Technologyによって、流体力学半径(RH)を決定するために使用した。生データを、モル質量及びRH定数は、リツキシマブ標準物質を用いて設定される、Wyatt特許Astraソフトウェアを用いて分析する。
実施例10に調製されたコンジュゲートを、PEG化を確認し、異なるPEGコア構造におけるコンジュゲーション効率を決定するために、SEC−MALSを用いて、精製し、分析する。コンジュゲーション効率は、アイソクラチック条件下で、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(pH7.2)、150mMのNaClを用いて、0.8mL/分で実施される300×8mm Shodex OH pak SB−804 HQを用いたサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって決定される。モル質量を、Wyatt Technologyによるインライン静的な多角度レーザー光散乱(MALS)を用いて決定する。光子相関分光法は、99.0°での検出のために単一の光子計数モジュールである準弾性光散乱(QELS)を用いて、また、Wyatt Technologyによって、流体力学半径(RH)を決定するために使用した。生データを、モル質量及びRH定数は、リツキシマブ標準物質を用いて設定される、Wyatt特許Astraソフトウェアを用いて分析する。
a.Cys改変Fab−8ARM(TP)−PEG−MALコンジュゲート(「Fab TPコンジュゲート」)
コンジュゲートを、20mMのHis−アセテート(pH5.5)、50mMのNaCl(アイソクラチック勾配)中のSephacryl S−300 HR(GE Healthcare)カラム上でサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を用いて精製する。モル質量を、Wyatt Technology及びShodex OHpak SB804(13C)によるインライン静的な多角度レーザー光散乱(MALS)を用いて決定する。生データを、モル質量定数は、リツキシマブ標準物質を用いて設定された、Wyatt特許Astraソフトウェアを用いて分析する。モル質量は、各PEGに結合するFabの平均数を推定するために使用される。Fab化は、MALS測定質量から40g/モル(PEG八量体の平均質量)を減算し、次いで、システイン改変Fabの平均質量で除算することによって決定される。8つのFab+40K PEG八量体の理論上のモル質量は、416,056g/モルである。例示的なデータを表16に示す。
表16
agg=凝集体
コンジュゲートを、20mMのHis−アセテート(pH5.5)、50mMのNaCl(アイソクラチック勾配)中のSephacryl S−300 HR(GE Healthcare)カラム上でサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を用いて精製する。モル質量を、Wyatt Technology及びShodex OHpak SB804(13C)によるインライン静的な多角度レーザー光散乱(MALS)を用いて決定する。生データを、モル質量定数は、リツキシマブ標準物質を用いて設定された、Wyatt特許Astraソフトウェアを用いて分析する。モル質量は、各PEGに結合するFabの平均数を推定するために使用される。Fab化は、MALS測定質量から40g/モル(PEG八量体の平均質量)を減算し、次いで、システイン改変Fabの平均質量で除算することによって決定される。8つのFab+40K PEG八量体の理論上のモル質量は、416,056g/モルである。例示的なデータを表16に示す。
表16
agg=凝集体
TPコアを有する多アーム型PEG八量体によるシステイン改変PEG八量体のコンジュゲーションは、8つのFab/PEGを含むコンジュゲートを生成し、これは、良好なコンジュゲーションがTPコアを含むPEG八量体で達成することができることを示す。
b.Cys改変Fab−8ARM−PEG−MALコンジュゲート(「Fab HGコンジュゲート」)
実施例10において調製されたCys改変Fab−8ARM−PEG−MALコンジュゲート(HGコア構造(JenKem)を含み、以下、「Fab HGコンジュゲート」)を、20mMのHis−アセテート(pH5.5)、50mMのNaCl(アイソクラチック勾配)中のSephacryl S−300 HR(GE Healthcare)カラム上でSECを用いて精製する。画分を含むコンジュゲートをプールし、20mMのHis−アセテート(pH5.5)、50mMのNaCl(アイソクラチック勾配)中のSephacryl S−300 HR(GE Healthcare)カラム上でSECを用いてさらに精製する。モル質量を、Tosoh G3000PWカラム、及びWyatt Technologyによるインライン静的なMALSを用いて決定する。光子相関分光法は、99°での検出による単一の光子計数モジュールである準弾性光散乱(QELS)を用いて、また、Wyatt Technologyによって、流体力学半径(RH)を決定するために使用される。生データを、モル質量及びRH定数は、リツキシマブ標準物質を用いて設定される、Wyatt特許Astraソフトウェアを用いて分析する。モル質量は、各PEGに結合するFabの数を推定するために使用される。例示的な結果を表17に示す。
表17
agg=凝集体
n/d=決定されず
実施例10において調製されたCys改変Fab−8ARM−PEG−MALコンジュゲート(HGコア構造(JenKem)を含み、以下、「Fab HGコンジュゲート」)を、20mMのHis−アセテート(pH5.5)、50mMのNaCl(アイソクラチック勾配)中のSephacryl S−300 HR(GE Healthcare)カラム上でSECを用いて精製する。画分を含むコンジュゲートをプールし、20mMのHis−アセテート(pH5.5)、50mMのNaCl(アイソクラチック勾配)中のSephacryl S−300 HR(GE Healthcare)カラム上でSECを用いてさらに精製する。モル質量を、Tosoh G3000PWカラム、及びWyatt Technologyによるインライン静的なMALSを用いて決定する。光子相関分光法は、99°での検出による単一の光子計数モジュールである準弾性光散乱(QELS)を用いて、また、Wyatt Technologyによって、流体力学半径(RH)を決定するために使用される。生データを、モル質量及びRH定数は、リツキシマブ標準物質を用いて設定される、Wyatt特許Astraソフトウェアを用いて分析する。モル質量は、各PEGに結合するFabの数を推定するために使用される。例示的な結果を表17に示す。
表17
agg=凝集体
n/d=決定されず
表17に見られるように、HGコアを含むPEG八量体によるCys改変Fabのコンジュゲーションは、8つのFab/PEGを含むコンジュゲートを生成する。HGコアによるコンジュゲーションはまた、TPコアで観察されたよりも5〜7つのFab/PEGを含むさらなるコンジュゲートも生成した。
Fab化の推定及びRH測定を改善するために、上で調製されたHG最終プールは、代替的には、PBS中の10/300 Sephacryl S−400 HR(GE Healthcare)カラム(pH7.4)上でSEC−MALSを用いて分析し、0.25mL/分で実施され得る。モル質量及びRHを、上述のように決定する。例示的な実験において、8ARM−PEG−MAL(HGコア)を用いて調製され、Sephacryl S−400 HR上で精製されたコンジュゲートは、12.2nm(±4.5%)の平均RH、340.3kDa(±8.9%)の平均モル質量、及び6.4のFab/PEGの平均を有する。
c.Cys改変Fab−HGEO−400MAコンジュゲート(「Fab−HGEO1 コンジュゲート」)
実施例4において調製されたCys改変Fab−HGEO−400MAコンジュゲート(Sunbright(登録商標)HGEO−400MA PEGを含み、以下、「Fab HGEO1コンジュゲート」)を、20mMのHis−アセテート(pH5.5)、50mMのNaCl(アイソクラチック勾配)中のSephacryl S−400 HR(GE Healthcare)カラム上でSECを用いて精製する。モル質量及びRHを、Sephacryl S−400 HRを用いて決定し、PBS(pH7.4)中の0.25mL/分で実施する。
実施例4において調製されたCys改変Fab−HGEO−400MAコンジュゲート(Sunbright(登録商標)HGEO−400MA PEGを含み、以下、「Fab HGEO1コンジュゲート」)を、20mMのHis−アセテート(pH5.5)、50mMのNaCl(アイソクラチック勾配)中のSephacryl S−400 HR(GE Healthcare)カラム上でSECを用いて精製する。モル質量及びRHを、Sephacryl S−400 HRを用いて決定し、PBS(pH7.4)中の0.25mL/分で実施する。
例示的な実験において、Sunbright(登録商標)HGEO−400MA PEG(HGEOコア)を用いて調製されたコンジュゲートは、15.2nm(±4.5%)の平均RH、423.8kDa(±10.6%)の平均モル質量、及び8.2のFab/PEGの平均を有する。
d.Cys改変Fab−8ARM(HGEO)−PEG−MALコンジュゲート(「Fab HGEO2コンジュゲート」)
上述のように調製されたCys改変Fab−8ARM(HGEO)−PEG−MALコンジュゲート(HGEOコア構造(JenKem)を含み、以下、「Fab HGEO2コンジュゲート」)を、20mMのHis−アセテート(pH5.5)、50mMのNaCl(アイソクラチック勾配)中のSephacryl S−300 HR(GE Healthcare)カラム上でSECを用いて精製する。モル質量を、上述のように決定する。モル質量は、各PEGに結合するFabの数を推定するために使用される。例示的な結果を表18に記載する。
表18
上述のように調製されたCys改変Fab−8ARM(HGEO)−PEG−MALコンジュゲート(HGEOコア構造(JenKem)を含み、以下、「Fab HGEO2コンジュゲート」)を、20mMのHis−アセテート(pH5.5)、50mMのNaCl(アイソクラチック勾配)中のSephacryl S−300 HR(GE Healthcare)カラム上でSECを用いて精製する。モル質量を、上述のように決定する。モル質量は、各PEGに結合するFabの数を推定するために使用される。例示的な結果を表18に記載する。
表18
表18に見られるように、HGEO2コアを含むPEG八量体によるCys改変Fabのコンジュゲーションは、8つのFab/PEGを含むコンジュゲートを生成する。HGEO2コアによるコンジュゲーションはまた、TPコアで観察されたよりも5〜6つのFab/PEGを含むさらなるコンジュゲートも生成する。
実施例13:コンジュゲートの濃縮
著しく製剤粘度を増加させることなく、硝子体内製剤中のFab濃度を増加させるための1つの方法は、製剤中の高度にfab化したコンジュゲートの割合を増加させることである。この例において、陽イオン交換クロマトグラフィーは、高度にfab化したコンジュゲートを濃縮するために使用される。
著しく製剤粘度を増加させることなく、硝子体内製剤中のFab濃度を増加させるための1つの方法は、製剤中の高度にfab化したコンジュゲートの割合を増加させることである。この例において、陽イオン交換クロマトグラフィーは、高度にfab化したコンジュゲートを濃縮するために使用される。
上述のようにFab TPコンジュゲートのSEC精製から推定されたfab化の8つのFab/PEGを含有する画分をプールし、例えば、SPセファロース高性能強陽イオン交換樹脂を用いて、GEから陽イオン交換クロマトグラフィーに供し、0.05%Triton X−100+0.05%Triton X−114を用いて、19時間洗浄し、内毒素を除去し、続いて、50カラム体積(CV)にわたって10〜20% 1M NaCl間で勾配溶出する。モル質量を、上述のように決定する。例示的な結果を表19に記載する。
表19
表19
コンジュゲートを含有する画分をプールし、アイソクラチック条件下で、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(pH7.4)、150mMのNaClを用いて、0.8mL/分で実施される300×8mm Shodex OH pak SB−804 HQを用いてさらに精製する。モル質量及びRHを、上述のように決定する。
濃縮後、10.5nm(±2.5%)の平均RH、407.1kDa(±0.2%)の平均モル質量、及び7.8のFab/PEGの平均を有する、8ARM(TP)−PEG−MAL(TPコア)を用いて調製されたコンジュゲートを得る。
実施例14:カニクイザルにおける全身性の代替補体経路活性の測定
ランパリズマブは、カニクイザルにおける全身性補体機能を一時的に阻害することがこれまでに示されている(Loyet,et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,2014,Vol.351,pp.527−537を参照のこと)。本例では、全身性の代替補体経路(AP)活性における抗D因子抗体変異体またはAFD.Abコンジュゲートの硝子体内投与の効果は、カニクイザルにおいて評価された。
ランパリズマブは、カニクイザルにおける全身性補体機能を一時的に阻害することがこれまでに示されている(Loyet,et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,2014,Vol.351,pp.527−537を参照のこと)。本例では、全身性の代替補体経路(AP)活性における抗D因子抗体変異体またはAFD.Abコンジュゲートの硝子体内投与の効果は、カニクイザルにおいて評価された。
a.カニクイザルにおける薬物動態学的/薬力学的試験
AFD.Ab変異体及びコンジュゲートを、分子の薬力学的(PK)及び薬力学的(PD)を評価するために、中国産雄カニクイザル(M.fascicularis)への単回投与または静脈内注入によって投与した。これらの試験は、Covance Laboratories(Madison,WI)で行われた。全ての手順を、米国農務省動物福祉法規制(US Department of Agriculture Animal Welfare Act Regulations)(9 CFR 3)、実験動物のケアと使用に関する指針(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)、及び実験動物福祉局(Office of Laboratory Animal Welfare)に従って行った。
AFD.Ab変異体及びコンジュゲートを、分子の薬力学的(PK)及び薬力学的(PD)を評価するために、中国産雄カニクイザル(M.fascicularis)への単回投与または静脈内注入によって投与した。これらの試験は、Covance Laboratories(Madison,WI)で行われた。全ての手順を、米国農務省動物福祉法規制(US Department of Agriculture Animal Welfare Act Regulations)(9 CFR 3)、実験動物のケアと使用に関する指針(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)、及び実験動物福祉局(Office of Laboratory Animal Welfare)に従って行った。
4つの試験を行った。第1の(対照)試験(試験1、n=10)では、ランパリズマブを、15分間隔で、2回の50μLのIVT用量で両眼に投与した。これらの動物に、合計20mg/動物を10mg/眼で施した。血液は、45分、2、6、10、24、34、48、96、120、154、192、288、及び384時間の時点で投与前(2日前)及び投与後に採血した。24、48、120、192、及び384時間で採血した後、1群当たり2匹の動物を、この試験から取り出し、眼マトリックスを収集するために殺処分した。ランパリズマブ対照試験は、Loyet,et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,2014,351:527−537においてこれまでに記載されている。
試験2(n=3)では、AFD.v14を、15分間隔で、2回の50μLのIVT用量で両眼に投与した。これらの動物に、合計50mg/動物を25mg/眼で施した。血液は、30分、2、8、24、48、及び96時間の時点で投与前(1日前及び3日前)及び投与後に採血した。
試験3(n=10)では、AFD.v14.C+TP八量体を、15分間隔で、2回の50μLのIVT用量で両眼に投与し、合計7.8mg/動物のAFD.v14を3.9mg/眼のAFD.v14で施した。血液は、1、6、24、48、72、96、144、192、288、及び480時間の時点で投与前(1週間前及び2週間前)及び投与後に採血した。各時点(24、96、192、288、及び480時間)で1群当たり2匹の動物を、この試験から取り出し、眼マトリックスを収集するために殺処分した。
試験4では、AFD.v14.C+HG八量体を、15分間隔で、2回の50μLのIVT用量で両眼に投与し、合計14.2mg/動物または23.6mg/動物のAFD.v14を7.1mg/眼のAFD.v14(n=2)または11.8mg/眼のAFD.v14(n=1)のいずれかで施した。血液は、1、6、24、96、及び168時間の時点で投与前(7日前及び1日前)及び投与後に採血した。
全ての試験においては、投与前及び投与後の血清試料は、PK及びPD分析のために大腿静脈を介して各動物から収集した。各時点で、全血は、血清分離チューブに採血し、周囲温度で少なくとも20分間凝血させて、2℃〜8℃の温度範囲で設定された冷凍遠心器で遠心分離した。血清は、遠心分離の20分間以内に採取し、分析まで−60℃〜−80℃で保存した。
b.全てのAFD.v14/コンジュゲート分析
Gyrolab XPアッセイは、カニクイザル血清におけるAFD.v14、AFD.v14.C+TP八量体、及びAFD.v14.C+HG八量体を定量化するために使用した。試料を、試料緩衝液(リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)、15ppm プロクリン(Sigma−Aldrich)、0.05%Tween 20、0.25%CHAPS、50μg/mLのmuIgG(Equitech Bio、カタログ番号SLM66)、5mM EDTA(pH7.4))中で1:4〜1:3000に希釈した。AFD.v14及びAFD.v14 TP及びHGコンジュゲートの標準曲線は、試料緩衝液中の2.06〜1500ng/mLのAFD.v14、AFD.v14.C+TP八量体、またはAFD.v14.C+HG八量体を連続希釈することによって調製した。捕捉及び検出試薬を、PBS/0.01%Tween 20/0.02%NaN3及びAlexa−抗CDR(クローン234,Genentech)中の100μg/mLのビオチン−コンジュゲート化ヤギ抗ヒトIgG(HC+LC、ベチル、カタログ番号A80−319B)ならびにRexxip F(Gyrolab)中の25nMで適用した。アッセイを、Gyrolab Bioaffy 200 CDにおいて実施し、洗浄ステップは、PBS/0.01%Tween 20/0.02%NaN3を使用し、続いて、Gyros pH11洗浄緩衝液を使用した。装置を起動し、データは、1%PMT設定で製造業者によって記載されるように分析した。AFD.v14、AFD.v14.C+TP八量体、及びAFD.v14.C+HG八量体の濃度は、その標準曲線の5パラメータフィットから決定された。最小限の定量化可能な濃度は、カニクイザル血清におけるAFD.v14、AFD.v14.C+TP八量体、及びAFD.v14.C+HG八量体においては8.24ng/mL(0.16nM)であった。
Gyrolab XPアッセイは、カニクイザル血清におけるAFD.v14、AFD.v14.C+TP八量体、及びAFD.v14.C+HG八量体を定量化するために使用した。試料を、試料緩衝液(リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)、15ppm プロクリン(Sigma−Aldrich)、0.05%Tween 20、0.25%CHAPS、50μg/mLのmuIgG(Equitech Bio、カタログ番号SLM66)、5mM EDTA(pH7.4))中で1:4〜1:3000に希釈した。AFD.v14及びAFD.v14 TP及びHGコンジュゲートの標準曲線は、試料緩衝液中の2.06〜1500ng/mLのAFD.v14、AFD.v14.C+TP八量体、またはAFD.v14.C+HG八量体を連続希釈することによって調製した。捕捉及び検出試薬を、PBS/0.01%Tween 20/0.02%NaN3及びAlexa−抗CDR(クローン234,Genentech)中の100μg/mLのビオチン−コンジュゲート化ヤギ抗ヒトIgG(HC+LC、ベチル、カタログ番号A80−319B)ならびにRexxip F(Gyrolab)中の25nMで適用した。アッセイを、Gyrolab Bioaffy 200 CDにおいて実施し、洗浄ステップは、PBS/0.01%Tween 20/0.02%NaN3を使用し、続いて、Gyros pH11洗浄緩衝液を使用した。装置を起動し、データは、1%PMT設定で製造業者によって記載されるように分析した。AFD.v14、AFD.v14.C+TP八量体、及びAFD.v14.C+HG八量体の濃度は、その標準曲線の5パラメータフィットから決定された。最小限の定量化可能な濃度は、カニクイザル血清におけるAFD.v14、AFD.v14.C+TP八量体、及びAFD.v14.C+HG八量体においては8.24ng/mL(0.16nM)であった。
c.カニクイザル血清中のD因子に対する薬力学的アッセイ
サンドイッチELISAは、カニクイザル血清におけるD因子(fD)を定量化するために使用した。マウス抗ヒトD因子クローン4676(Genentech)を、コーティング緩衝液(0.05Mの炭酸ナトリウム、pH9.6)中で1μg/mLになるまで希釈し、384ウェルMaxisorpプレート(Thermo Scientific、カタログ番号464718)上で4℃にて一晩インキュベートした。プレートをPBS+0.05%Tween−20で洗浄し、PBS+0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)を用いた2時間のインキュベーション中、ブロックした。この及び全てのその後のインキュベーションは、穏やかに撹拌しながら室温で行った。カニクイザルfD標準曲線を、試料緩衝液(500ng/mLのAFD.v14治療薬及び50μg/mLのマウスIgGを補充したアッセイ緩衝液)中で0.04〜5ng/mLのfDを連続希釈することによって調製した。血清試料及び対照は、試料緩衝液中の最低限の1:100になるまで希釈された。次いで、希釈した標準物質、対照、及び試料を、プレート上で2時間インキュベートし、プレート結合fD/AFD.Ab複合体を、AFD.Ab(クローン242、1μg/mL)に対してビオチン−コンジュゲート化マウス抗CDR mAbを用いて1時間検出し、続いて、高い感受性SA−HRP(3ng/mL、Pierceカタログ番号21130)も1時間検出した。最終洗浄の後に、テトラメチルベンジジン(Moss、カタログ番号TMBE−1000)を加え、10〜15分間発色させ、1Mリン酸を用いて反応を停止した。マイクロプレートリーダーを用いて、プレートを620nmの参照と共に450nmで読み取った。fDの濃度は、標準曲線の4パラメータフィットから決定された。カニクイザル血清中の最低限の定量可能な濃度は、3.9ng/mL(0.16nM)であった。
サンドイッチELISAは、カニクイザル血清におけるD因子(fD)を定量化するために使用した。マウス抗ヒトD因子クローン4676(Genentech)を、コーティング緩衝液(0.05Mの炭酸ナトリウム、pH9.6)中で1μg/mLになるまで希釈し、384ウェルMaxisorpプレート(Thermo Scientific、カタログ番号464718)上で4℃にて一晩インキュベートした。プレートをPBS+0.05%Tween−20で洗浄し、PBS+0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)を用いた2時間のインキュベーション中、ブロックした。この及び全てのその後のインキュベーションは、穏やかに撹拌しながら室温で行った。カニクイザルfD標準曲線を、試料緩衝液(500ng/mLのAFD.v14治療薬及び50μg/mLのマウスIgGを補充したアッセイ緩衝液)中で0.04〜5ng/mLのfDを連続希釈することによって調製した。血清試料及び対照は、試料緩衝液中の最低限の1:100になるまで希釈された。次いで、希釈した標準物質、対照、及び試料を、プレート上で2時間インキュベートし、プレート結合fD/AFD.Ab複合体を、AFD.Ab(クローン242、1μg/mL)に対してビオチン−コンジュゲート化マウス抗CDR mAbを用いて1時間検出し、続いて、高い感受性SA−HRP(3ng/mL、Pierceカタログ番号21130)も1時間検出した。最終洗浄の後に、テトラメチルベンジジン(Moss、カタログ番号TMBE−1000)を加え、10〜15分間発色させ、1Mリン酸を用いて反応を停止した。マイクロプレートリーダーを用いて、プレートを620nmの参照と共に450nmで読み取った。fDの濃度は、標準曲線の4パラメータフィットから決定された。カニクイザル血清中の最低限の定量可能な濃度は、3.9ng/mL(0.16nM)であった。
d.AP溶血アッセイ
AFD.v14及びAFD.v14.C+TP八量体がAP活性を阻害する能力を、Pangburn(Methods Enzymol,1988,162:639−653)及びKatschke et al.(J.Biol.Chem.,2009,284:10473−10479)によって設計され、説明されているように、(ヒトまたはサルのいずれかの)血清が、ウサギ赤血球と組み合わせられた、溶血アッセイにおいて評価した。補体活性化が古典的な補体経路(CP)を介して生じなかったことを確認するために、C1q欠乏ヒト血清(Complement Technologies,Tyler,TX)を使用し、緩衝液は、CP活性に不可欠である陽イオンのキレートカルシウムにEGTAを含んだ。
AFD.v14及びAFD.v14.C+TP八量体がAP活性を阻害する能力を、Pangburn(Methods Enzymol,1988,162:639−653)及びKatschke et al.(J.Biol.Chem.,2009,284:10473−10479)によって設計され、説明されているように、(ヒトまたはサルのいずれかの)血清が、ウサギ赤血球と組み合わせられた、溶血アッセイにおいて評価した。補体活性化が古典的な補体経路(CP)を介して生じなかったことを確認するために、C1q欠乏ヒト血清(Complement Technologies,Tyler,TX)を使用し、緩衝液は、CP活性に不可欠である陽イオンのキレートカルシウムにEGTAを含んだ。
C1q欠乏ヒト血清は、APを活性化するために使用した。10%C1q欠乏ヒト血清中に存在するfDの濃度は、血清(Barnum,et al.,J.Immunol.Methods,1984,67:303−309、Loyet et al.,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,2012,53:6628−6637)中のこれまでに報告されたfDレベルに一致する値に合う9.6nMであった。
e.AFD.v14.C+HG八量体で処置したカニクイザル血清中の全身性AP活性の阻害の決定
全身性AP活性の任意の潜在的阻害、続いて、AFD.v14.C+HG八量体またはAFD.v14.C+TP八量体の投与の時間的経過及び線量依存性を評価するために、プレートベースのWIESLAB補体系AP ELISAまたはエクスビボアッセイが行われた。
全身性AP活性の任意の潜在的阻害、続いて、AFD.v14.C+HG八量体またはAFD.v14.C+TP八量体の投与の時間的経過及び線量依存性を評価するために、プレートベースのWIESLAB補体系AP ELISAまたはエクスビボアッセイが行われた。
全身性AP活性の任意の潜在的阻害、続いて、AFD.v14.C+HG八量体またはAFD.v14.C+TP八量体の投与の時間的経過及び線量依存性を評価するために、プレートベースのWIESLAB補体系AP ELISA(このアッセイからのデータを、図13及び14中において「AP補体活性(%)」と称される)または上述のインビトロAP溶血アッセイと同様にエクスビボアッセイのいずれかが、行われた(このアッセイからのデータを、図14中において「相対溶血(%)」と称される。しかしながら、このアッセイにおいては、血清試料に外因性AFD.v14.C+HG八量体またはAFD.v14.C+TP八量体の希釈曲線を添加する代わりに、試料はそれ自体、連続希釈し、溶血性活性のいかなる阻害もAFD.v14.C+HG八量体またはAFD.v14.C+TP八量体の注入投与に起因した。
赤血球を調製し、以下の改変を有するAP溶血アッセイにおいて、本明細書に記載されるように、アッセイが行われた。最大の溶解に対応する吸光度を決定するために、全溶解対照を、滅菌水(80μl/ウェル)で調製し、一方、GVBを全ての他のウェル(50μl)に添加した。カニクイザル血清試料を、6つの時点にわたって1:1.5に連続希釈し、96ウェルU底ポリプロピレンプレート(30μl/ウェル)に陰性対照(緩衝液のみ)と共に添加した。全溶解対照は、最大(100%)溶血を表した。データポイントは、三重に収集し、平均パーセントの最大溶血を、アッセイ中の最終血清希釈の逆数をプロット化した。50%の最大溶血として定義される、50%の最大溶血(AH50)値を、4パラメータフィットモデルを用いて非線形回帰分析によって決定された。飽和に達しなかったような曲線においては、AH50は、上側の漸近線を100%で固定した、曲線フィットを用いて推定された。相対溶血の割合は、[(個々の時点における投与後のAH50)/(投与前のAH50)]×100として各個々の時点において計算した。各個々の正常なカニクイザルからの血清におけるAH50値は、AH50値の全平均よりも2倍高く変化し得る。したがって、各試験動物からの投与前及び投与後の試料を、AP活性の投与後の変化を個々の動物のベースラインの補体活性と直接比較することを確実にするために、同じアッセイプレート上で泳動させた。
全fD及び治療活性と比較した相対溶血の割合を、図13A(ランパリズマブ、10mg/眼)、13B(AFD.v14、25mg/眼)、及び14A(AFD.v14.C+TP八量体、3.9mg/眼)に示す。ランパリズマブデータ(図33A)は、Loyet,et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,2014,351:527−537)に記載される、10mg/眼のランパリズマブのIVT投与後に得られた比較データである。図13Bに見られるように、25mg/眼のAFD.v14の投与は、全身性AP活性を一時的に阻害し、ランパリズマブについてこれまでに観察された結果と同様に、活性が24時間後の投与によってベースラインに戻った(図13A)。相対的に、全身性AP阻害は、AFD.v14.C+TP八量体の3.9mg/眼の投与後に観察された(図14A)。いかなる特定の理論に拘束されることも望まないが、Fab(例えば、ランパリズマブ及びAFD.v14)と比較したコンジュゲートで得られた眼からのより遅いクリアランスは、fDがより早期の時点でAFD.Abを飽和状態にすることを可能にし、全身性補体阻害を防ぐと考えられている。
全fD及び全コンジュゲートと比較した相対溶血の割合を、図14B(AFD.v14.C+HG八量体、7.1mg/眼)及び14C(AFD.v14.C+HG八量体、11.8mg/眼)に示す。これらの図から見られるように、ごくわずかな全身性補体阻害が、最大11.8mg/眼のIVT投薬における、AFD.v14.C+HG八量体に対して観察された。眼からのより遅いクリアランスにより、コンジュゲート濃度は、具体的には、10時間よりも早い時点でfDのモル濃度より低いままである。これは、AFD.Ab Fabの同様の眼に投与された濃度とは対照的であり、これにより、これらの早期時点で、モル濃度がfDのモル濃度を超え、全身性AP阻害をもたらす。
20D12.v2.1、20D12.v2.1.C、20D12.v2.3、及び20D12.v2.3.CのPEG八量体は、コンジュゲートされていないバージョンの20D12.v2.1、20D12.v2.1.C、20D12.v2.3、及び20D12.v2.3.Cと比較して、全身性補体阻害のレベルの低下を示すことによって、AFD.v14.C+TP−Oct及びAFD.v14.C+HG−Octコンジュゲートと同様に挙動することが期待され得る。
実施例15:AFD.Ab変異体及びコンジュゲートにおけるカニクイザルPK
AFD.Ab変異体またはコンジュゲートのインビボPKプロファイルを評価するための1つの方法が、カニクイザルにおいて行われた単回投与実験である。AFD.v14+TP−OctコンジュゲートにおけるインビボPK試験が、カニクイザルにおいて行われた。PKパラメータを、単回投与実験から決定した。コンジュゲートされていない非改変AFD.v14(SIESD.N103S)を、対照として使用した。動物のケアは、Genentech Institutional Animal Care and Use Committeeの指針に従った。
AFD.Ab変異体またはコンジュゲートのインビボPKプロファイルを評価するための1つの方法が、カニクイザルにおいて行われた単回投与実験である。AFD.v14+TP−OctコンジュゲートにおけるインビボPK試験が、カニクイザルにおいて行われた。PKパラメータを、単回投与実験から決定した。コンジュゲートされていない非改変AFD.v14(SIESD.N103S)を、対照として使用した。動物のケアは、Genentech Institutional Animal Care and Use Committeeの指針に従った。
a.試験パラメータ
カニクイザル(28匹の雄動物;投与時、2kg〜4kg、約2〜7歳)を、4つの投与群のうちの1つに割り当てた。群1(対照)の動物(4匹の動物)は、30ゲージ針を通してAFD.v14の5mg/眼の両側の硝子体内投与(10mg/動物)を受けた(100μlの投与体積)。群2及び3の動物(各群に10匹の動物)は、それぞれ、30ゲージ針を通してAFD.v14.C+TP−OctコンジュゲートのFab重量に基づいて、1または4mg/眼の両側の硝子体内投与(2または8mg/動物)を受けた(100μlの投与体積)。動物は、鎮静状態にし(10mg/kgのケタミンHCl、0.5mg/kgのジアゼパム)、注入前にプロパラカインで局所処置した。次いで、AFD.v14またはAFD.v14.C+TP−Octコンジュゲートを、縁よりも4mmの後方に、針を水晶体よりも後方に、硝子体中央部に向けて、強膜及び扁平部を通して投与した。群4の動物(4匹の動物)は、0.4mg/動物で単回IVボーラス(1mL)のAFD.v14.C+TP−Octコンジュゲートを受けた。IV投与のために、AFD.v14.C+TP−Octコンジュゲートを、10mMのコハク酸ナトリウム、10%トレハロース、及び0.05%Tween−20(pH5.0)として製剤化した。
カニクイザル(28匹の雄動物;投与時、2kg〜4kg、約2〜7歳)を、4つの投与群のうちの1つに割り当てた。群1(対照)の動物(4匹の動物)は、30ゲージ針を通してAFD.v14の5mg/眼の両側の硝子体内投与(10mg/動物)を受けた(100μlの投与体積)。群2及び3の動物(各群に10匹の動物)は、それぞれ、30ゲージ針を通してAFD.v14.C+TP−OctコンジュゲートのFab重量に基づいて、1または4mg/眼の両側の硝子体内投与(2または8mg/動物)を受けた(100μlの投与体積)。動物は、鎮静状態にし(10mg/kgのケタミンHCl、0.5mg/kgのジアゼパム)、注入前にプロパラカインで局所処置した。次いで、AFD.v14またはAFD.v14.C+TP−Octコンジュゲートを、縁よりも4mmの後方に、針を水晶体よりも後方に、硝子体中央部に向けて、強膜及び扁平部を通して投与した。群4の動物(4匹の動物)は、0.4mg/動物で単回IVボーラス(1mL)のAFD.v14.C+TP−Octコンジュゲートを受けた。IV投与のために、AFD.v14.C+TP−Octコンジュゲートを、10mMのコハク酸ナトリウム、10%トレハロース、及び0.05%Tween−20(pH5.0)として製剤化した。
眼組織は、全ての群から収集した。投与後に以下の時点で、群1においては、1群当たり1匹の動物(2つの眼)を殺処分し、群2及び3においては、2匹の動物(4つの眼)を殺処分した。群1−1日目(24時間)、2日目、4日目、及び8日目;群2及び3−1日目(24時間)、4日目、8日目、12日目、及び20日目。殺処分後、両眼を摘出し、AFD.v14及びAFD.v14.C+TP−Octコンジュゲート濃度を、硝子体及び房水及び網膜組織において決定した。眼の瞬間冷凍後、濾紙を、全レチナール層を収集するために、後に使用した。
全ての血液試料(約1mL)を、大腿骨または橈側皮静脈を介して収集した。IVTまたはIV投与後の以下の時点で、試料を、解凍した。群1−1時間、6時間、1日目(24時間)、2日目、3日目、4日目、5日目、及び7日目;群2及び3−1時間、6時間、1日目(24時間)、2日目、4日目、6日目、8日目、12日目、及び20日目;群4−1時間、6時間、1日目(24時間)、2日目、4日目、7日目、11日目、14日目、17日目、21日目、24日目、及び28日目。血液採取から1時間以内に、試料を室温で凝血させ、血清を遠心分離によって分離し、−60℃〜−80℃で保存した。試験プロトコルの詳細を、表20に記載する。
表20:カニクイザルPK試験パラメータ
表20:カニクイザルPK試験パラメータ
b.AFD.v14及びAFD.v14.C+TP−Octコンジュゲートにおける薬物動態学的アッセイ
Gyrolab XPアッセイは、カニクイザル血清、硝子体液、房水、及び網膜ホモジネート中のAFD.v14及びAFD.v14.C+TP−Octコンジュゲートを定量化するために使用した。試料を、試料緩衝液(リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)、15ppm プロクリン(Sigma−Aldrich)、0.05%Tween 20、0.25%CHAPS、50μg/mLのmuIgG(Equitech Bio、カタログ番号SLM66)、5mM EDTA(pH7.4))中で1:4〜1:3000に希釈した。AFD.v14及びAFD.v14.C+TP−Octコンジュゲートの標準曲線は、試料緩衝液中の2.06〜1500ng/mLのAFD.v14またはAFD.v14.C+TP−Octコンジュゲートを連続希釈することによって調製した。捕捉及び検出試薬を、PBS/0.01%Tween 20/0.02%NaN3及びAlexa−抗CDR(クローン234,Genentech)中の100μg/mLのビオチン−コンジュゲート化ヤギ抗ヒトIgG(HC+LC、ベチル、カタログ番号A80−319B)ならびにRexxip F(Gyrolab)中の25nMで適用した。アッセイを、Gyrolab Bioaffy 200 CDにおいて実施し、洗浄ステップは、PBS/0.01%Tween 20/0.02%NaN3を使用し、続いて、Gyros pH11洗浄緩衝液を使用した。装置を起動し、データは、1%PMT設定で製造業者によって記載されるように分析した。AFD.v14及びAFD.v14.C+TP−Octコンジュゲートの濃度は、その標準曲線の5パラメータフィットから決定された。最小限の定量化可能な濃度は、カニクイザル血清、硝子体液、房水、及び網膜ホモジネート中のAFD.v14及びAFD.v14.C+TP−Octコンジュゲートにおいて8.24ng/mL(0.16nM)であった。
Gyrolab XPアッセイは、カニクイザル血清、硝子体液、房水、及び網膜ホモジネート中のAFD.v14及びAFD.v14.C+TP−Octコンジュゲートを定量化するために使用した。試料を、試料緩衝液(リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)、15ppm プロクリン(Sigma−Aldrich)、0.05%Tween 20、0.25%CHAPS、50μg/mLのmuIgG(Equitech Bio、カタログ番号SLM66)、5mM EDTA(pH7.4))中で1:4〜1:3000に希釈した。AFD.v14及びAFD.v14.C+TP−Octコンジュゲートの標準曲線は、試料緩衝液中の2.06〜1500ng/mLのAFD.v14またはAFD.v14.C+TP−Octコンジュゲートを連続希釈することによって調製した。捕捉及び検出試薬を、PBS/0.01%Tween 20/0.02%NaN3及びAlexa−抗CDR(クローン234,Genentech)中の100μg/mLのビオチン−コンジュゲート化ヤギ抗ヒトIgG(HC+LC、ベチル、カタログ番号A80−319B)ならびにRexxip F(Gyrolab)中の25nMで適用した。アッセイを、Gyrolab Bioaffy 200 CDにおいて実施し、洗浄ステップは、PBS/0.01%Tween 20/0.02%NaN3を使用し、続いて、Gyros pH11洗浄緩衝液を使用した。装置を起動し、データは、1%PMT設定で製造業者によって記載されるように分析した。AFD.v14及びAFD.v14.C+TP−Octコンジュゲートの濃度は、その標準曲線の5パラメータフィットから決定された。最小限の定量化可能な濃度は、カニクイザル血清、硝子体液、房水、及び網膜ホモジネート中のAFD.v14及びAFD.v14.C+TP−Octコンジュゲートにおいて8.24ng/mL(0.16nM)であった。
硝子体液、房水、及び網膜PKの結果を、下の表21〜23、図17A(硝子体)、17B(正規化された硝子体)、18A(水性)、18B(正規化された水性)、19A(網膜)、及び19B(正規化された網膜)に記載される。
表21:AFD.v14対照(群1)及びAFD.v14.C+TP−Octコンジュゲート(群2及び3)における硝子体PK
表22:AFD.v14.C+TP−Octコンジュゲートにおける水性PK
表23:網膜PK AFD.v14.C+TP−Octコンジュゲート
表21:AFD.v14対照(群1)及びAFD.v14.C+TP−Octコンジュゲート(群2及び3)における硝子体PK
表22:AFD.v14.C+TP−Octコンジュゲートにおける水性PK
表23:網膜PK AFD.v14.C+TP−Octコンジュゲート
表21及び図17A〜Bに見られるように、コンジュゲート化AFD.v14群の両方(群2及び3)において硝子体末端半減期は、コンジュゲートされていないAFD.v14対照(群1)のものよりも長く、コンジュゲートされていないランパリズマブ及びラニビズマブFabの平均半減期よりも長かった(約2.34日)。コンジュゲート化AFD.v14の群2及び3における平均AUC/mg−用量(約2040)は、コンジュゲートされていないランパリズマブFabにおける平均AUC/mg−用量よりも高かった(約1733)。硝子体末端の半減期に基づいて、4.0mg/眼の用量は、1.0mg/眼の用量よりもさらにゆっくりと除去した。表22及び23、ならびに図18及び19に見られるように、より長い末端の半減期はまた、コンジュゲートされていないFabと比較して、群2及び3(コンジュゲート化AFD.v14)における房水及び網膜においても観察された。
群2及び3における血清PKの結果を、図15A及び15B(正規化した)に記載され、群4における血清PKを、図15Cに記載する。群2及び3(AFD.v14.C+TP−Octコンジュゲート)における血清PK曲線は、互いに平行し、投与正規化後に重ね合わされる。図15A及び15Bを参照のこと。群2及び3における血清AUCは、最後に測定された時点まで用量に比例している。
群4(AFD.v14.C+TP−Octコンジュゲート;IV投与)における末端半減期は、7.5日であり、クリアランスは、15.8mL/日(5.64mL/kg/日(群4のサルの平均体重は、2.8kgであった))であった。21、24、及び28日の測定日に、血清濃度は、4群の4匹のサルのうちの3匹において検出の限界より下まで低下した。
c.カニクイザル血清中のD因子に対する薬力学的アッセイ
サンドイッチELISAが、カニクイザル血清、硝子体液、房水、及び網膜ホモジネート中のD因子(fD)を定量化するために使用された。マウス抗ヒトD因子クローン4676(Genentech)を、コーティング緩衝液(0.05Mの炭酸ナトリウム、pH9.6)中で1μg/mLになるまで希釈し、384ウェルMaxisorpプレート(Thermo Scientific、カタログ番号464718)上で4℃にて一晩インキュベートした。プレートをPBS+0.05%Tween−20で洗浄し、PBS+0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)を用いた2時間のインキュベーション中、ブロックした。この及び全てのその後のインキュベーションは、穏やかに撹拌しながら室温で行った。カニクイザルfD標準曲線を、試料緩衝液(500ng/mLのAFD.v14治療薬及び50μg/mLのマウスIgGを補充したアッセイ緩衝液)中で0.04〜5ng/mLのfDを連続希釈することによって調製した。血清試料及び対照は、試料緩衝液中の最低限の1:100になるまで希釈された。硝子体液、房水、及び網膜ホモジネート試料及び対照は、試料緩衝液中の最低限の1:10になるまで希釈された。次いで、希釈した標準物質、対照、及び試料を、プレート上で2時間インキュベートし、プレート結合fD/AFD.Ab複合体を、AFD.Ab(クローン242、1μg/mL)に対してビオチン−コンジュゲート化マウス抗CDR mAbを用いて1時間検出し、続いて、高い感受性SA−HRP(3ng/mL、Pierceカタログ番号21130)も1時間検出した。最終洗浄の後に、テトラメチルベンジジン(Moss、カタログ番号TMBE−1000)を加え、10〜15分間発色させ、1Mリン酸を用いて反応を停止した。マイクロプレートリーダーを用いて、プレートを620nmの参照と共に450nmで読み取った。fDの濃度は、標準曲線の4パラメータフィットから決定された。カニクイザル血清中の最低限の定量可能な濃度は、3.9ng/mL(0.16nM)であった。カニクイザル硝子体液、房水、及び網膜ホモジネート中の最小限の定量化可能な濃度は、0.39ng/ml(0.016nM)であった。
サンドイッチELISAが、カニクイザル血清、硝子体液、房水、及び網膜ホモジネート中のD因子(fD)を定量化するために使用された。マウス抗ヒトD因子クローン4676(Genentech)を、コーティング緩衝液(0.05Mの炭酸ナトリウム、pH9.6)中で1μg/mLになるまで希釈し、384ウェルMaxisorpプレート(Thermo Scientific、カタログ番号464718)上で4℃にて一晩インキュベートした。プレートをPBS+0.05%Tween−20で洗浄し、PBS+0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)を用いた2時間のインキュベーション中、ブロックした。この及び全てのその後のインキュベーションは、穏やかに撹拌しながら室温で行った。カニクイザルfD標準曲線を、試料緩衝液(500ng/mLのAFD.v14治療薬及び50μg/mLのマウスIgGを補充したアッセイ緩衝液)中で0.04〜5ng/mLのfDを連続希釈することによって調製した。血清試料及び対照は、試料緩衝液中の最低限の1:100になるまで希釈された。硝子体液、房水、及び網膜ホモジネート試料及び対照は、試料緩衝液中の最低限の1:10になるまで希釈された。次いで、希釈した標準物質、対照、及び試料を、プレート上で2時間インキュベートし、プレート結合fD/AFD.Ab複合体を、AFD.Ab(クローン242、1μg/mL)に対してビオチン−コンジュゲート化マウス抗CDR mAbを用いて1時間検出し、続いて、高い感受性SA−HRP(3ng/mL、Pierceカタログ番号21130)も1時間検出した。最終洗浄の後に、テトラメチルベンジジン(Moss、カタログ番号TMBE−1000)を加え、10〜15分間発色させ、1Mリン酸を用いて反応を停止した。マイクロプレートリーダーを用いて、プレートを620nmの参照と共に450nmで読み取った。fDの濃度は、標準曲線の4パラメータフィットから決定された。カニクイザル血清中の最低限の定量可能な濃度は、3.9ng/mL(0.16nM)であった。カニクイザル硝子体液、房水、及び網膜ホモジネート中の最小限の定量化可能な濃度は、0.39ng/ml(0.016nM)であった。
群2、3、及び4における平均血清fD及びAFD.v14.C+TP−Octコンジュゲート濃度を、図16に記載する。図16Aは、血清fD濃度が試験した全ての時点でAFD.Ab濃度よりも高かったことを示す。これらの結果は、全身性AP補体活性は、全ての群において維持されることを示す。
群2及び3における平均眼fD及びAFD.v14.C+TP−Octコンジュゲート濃度は、図16Bに記載され、これは、硝子体液、房水、及び網膜ホモジネート中のAFD.Ab濃度が、試験した全ての時点でfD濃度を超えたことを示す。
AFD.v14.C+TP−OctコンジュゲートのIVT投与後に、PKパラメータについて、この例に記載されるデータに基づいて、AFD.v14のコンジュゲーションは、眼の硝子体液及び房水中の持続レベルのコンジュゲートをもたらした。しかしながら、硝子体液、房水、及び網膜ホモジネート中のAFD.Ab濃度が試験した全ての時点でfD濃度を超えたが、これは、IVT投与と共に血清試料中のいかなる時点でも見られなかった。この例に記載されるものと同様の方法は、20D12.v2.1、20D12.v2.1.C、20D12.v2.3、及び20D12.v2.3.CのPEG八量体を評価するために使用することができる。IVT投与した場合に、コンジュゲート化20D12.v2.1、20D12.v2.1.C、20D12.v2.3、及び20D12.v2.3.Cがコンジュゲート化AFD.v14.C+TP−Octと同様に挙動され得ると期待される。
実施例16:hu20D12.v2.1.C+TP−Oct及びhu20D12.v2.1.CにおけるカニクイザルPK
hu20D12.v2.1.C+TP−Oct及びhu20D12.v2.1.Cのインビボ薬物動態的(PK)プロファイルを評価するために、インビボPK試験が、放射性ヨウ化hu20D12.v2.1.C+TP−Oct(125I−hu20D12.v2.1.C+TP−Oct)及びhu20D12.v2.1.C(125I−20D12.v2.1.C)を用いてカニクイザルにおいて行われた。PKパラメータを、収集された各組織中のμg−当量/mLまたはグラム濃度への放射性シグナルの変換後に、単回投与実験から決定した。動物のケアは、Genentech Institutional Animal Care and Use Committeeの指針に従った。
hu20D12.v2.1.C+TP−Oct及びhu20D12.v2.1.Cのインビボ薬物動態的(PK)プロファイルを評価するために、インビボPK試験が、放射性ヨウ化hu20D12.v2.1.C+TP−Oct(125I−hu20D12.v2.1.C+TP−Oct)及びhu20D12.v2.1.C(125I−20D12.v2.1.C)を用いてカニクイザルにおいて行われた。PKパラメータを、収集された各組織中のμg−当量/mLまたはグラム濃度への放射性シグナルの変換後に、単回投与実験から決定した。動物のケアは、Genentech Institutional Animal Care and Use Committeeの指針に従った。
a.試験パラメータ
カニクイザル(43匹の雌動物;投与時、2kg〜4kg、約3〜4歳)を、5つの投与群のうちの1つに割り当てた。群1、2、及び3の動物(n=10/群)は、それぞれ、27ゲージ針を通して125I−hu20D12.v2.1.C+TP−Octの両側の硝子体内投与の1mg/眼(2mg/動物)、7.5mg/眼(15mg/動物)、または15mg/眼(30mg/動物)を受けた(100μlの投与体積)。群4の動物(n=10)は、27ゲージ針を通してコンジュゲートされていない125I−hu20D12.v2.1.Cの両側の硝子体内投与の15mg/眼(30mg/動物を受けた(100μlの投与体積)。動物は、鎮静状態にし(5〜15mg/kgのケタミンHCl及び吸入効果へのイソフルラン)、注入前に0.5%プロポアラカインHCl、2.5%フェニレフリンHCl、及び1%トロピカミドで局所処置した。次いで、125I−hu20D12.v2.1.C+TP−Octまたはコンジュゲートされていない125I−hu20D12.v2.1.Cを、針を球の後方軸に、硝子体中央部に向けて、強膜を通して投与した。
カニクイザル(43匹の雌動物;投与時、2kg〜4kg、約3〜4歳)を、5つの投与群のうちの1つに割り当てた。群1、2、及び3の動物(n=10/群)は、それぞれ、27ゲージ針を通して125I−hu20D12.v2.1.C+TP−Octの両側の硝子体内投与の1mg/眼(2mg/動物)、7.5mg/眼(15mg/動物)、または15mg/眼(30mg/動物)を受けた(100μlの投与体積)。群4の動物(n=10)は、27ゲージ針を通してコンジュゲートされていない125I−hu20D12.v2.1.Cの両側の硝子体内投与の15mg/眼(30mg/動物を受けた(100μlの投与体積)。動物は、鎮静状態にし(5〜15mg/kgのケタミンHCl及び吸入効果へのイソフルラン)、注入前に0.5%プロポアラカインHCl、2.5%フェニレフリンHCl、及び1%トロピカミドで局所処置した。次いで、125I−hu20D12.v2.1.C+TP−Octまたはコンジュゲートされていない125I−hu20D12.v2.1.Cを、針を球の後方軸に、硝子体中央部に向けて、強膜を通して投与した。
眼組織は、全ての群から収集した。投与後に以下の時点で、1群当たり2匹の動物(4つの眼)を殺処分した。1日目(投与から4時間後)、3日目、8日目、13日目、及び29日目。殺処分後、両眼を摘出し、125I−hu20D12.v2.1.C+TP−Oct及びコンジュゲートされていない125I−hu20D12.v2.1.C放射線レベルを、硝子体液、房水、及び網膜において決定した。試験プロトコルの詳細を、表24に記載する。
表24:カニクイザル放射性PK試験パラメータ
表24:カニクイザル放射性PK試験パラメータ
b.125I−hu20D12.v2.1.C+TP−Oct及びコンジュゲートされていない125I−hu20D12.v2.1.Cにおける薬物動態学的ラジオアッセイ
ラジオ検出アッセイは、カニクイザル硝子体液、房水、及び網膜ホモジネート中の放射能の量を検出するために使用した。硝子体液を、セルマニックビーズを用いて均質化し、次いで、0.025〜0.05gの三重秤量したアリコートを、ガンマ計数のためにホモジネートから除去した。房水は、放射能においては、そのままで計数した。網膜を、均質化し、次いで、放射能においては、全体として計数した。全てのマトリックスの放射能を、Wallac Wizard 1470ガンマ計数器を用いて検出した。放射能検出後、125I−hu20D12.v2.1.C+TP−Oct及びコンジュゲートされていない125I−hu20D12.v2.1.Cの濃度を、各アーム(μCi/mLの単位で)に特異的な活性の用量溶液を用いて、1mLの組織当たりの放射能を1mLの組織当たりのμg当量に変換することによって計算した。1g=1mLの仮定を、変換時に適用した。
ラジオ検出アッセイは、カニクイザル硝子体液、房水、及び網膜ホモジネート中の放射能の量を検出するために使用した。硝子体液を、セルマニックビーズを用いて均質化し、次いで、0.025〜0.05gの三重秤量したアリコートを、ガンマ計数のためにホモジネートから除去した。房水は、放射能においては、そのままで計数した。網膜を、均質化し、次いで、放射能においては、全体として計数した。全てのマトリックスの放射能を、Wallac Wizard 1470ガンマ計数器を用いて検出した。放射能検出後、125I−hu20D12.v2.1.C+TP−Oct及びコンジュゲートされていない125I−hu20D12.v2.1.Cの濃度を、各アーム(μCi/mLの単位で)に特異的な活性の用量溶液を用いて、1mLの組織当たりの放射能を1mLの組織当たりのμg当量に変換することによって計算した。1g=1mLの仮定を、変換時に適用した。
硝子体液、房水、及び網膜PKの結果を、下の表25〜27、及び図22(硝子体)、23(水性)、及び24(網膜)に記載する。
表25:hu20D12.v2.1.C+TP−Oct及びコンジュゲートされていないhu20D12.v2.1.Cにおける硝子体液PK
表26:hu20D12.v2.1.C+TP−Oct及びコンジュゲートされていないhu20D12.v2.1.Cにおける房水PK
表27:IVT投与後に、hu20D12.v2.1.C+TP−Oct及びコンジュゲートされていないhu20D12.v2.1.Cにおける網膜PK
表25:hu20D12.v2.1.C+TP−Oct及びコンジュゲートされていないhu20D12.v2.1.Cにおける硝子体液PK
表26:hu20D12.v2.1.C+TP−Oct及びコンジュゲートされていないhu20D12.v2.1.Cにおける房水PK
表27:IVT投与後に、hu20D12.v2.1.C+TP−Oct及びコンジュゲートされていないhu20D12.v2.1.Cにおける網膜PK
表25及び図22に見られるように、hu20D12.v2.1.C+TP−Oct群(群1、2、及び3)において硝子体末端半減期は、コンジュゲートされていないhu20D12.v2.1.C対照(群4)のものよりも長く、コンジュゲートされていないランパリズマブ及びラニビズマブFabの平均半減期よりも長かった(約2.34日)。hu20D12.v2.1.C+TP−Oct群における平均AUC/mg用量は、コンジュゲートされていないhu20D12.v2.1.C対照(約2067日*μg/mL/mgの用量)及びコンジュゲートされていないランパリズマブFabにおける平均AUC/mg用量よりも高かった(約1733)。表26及び27、ならびに図23及び24に見られるように、より長い末端の半減期はまた、コンジュゲートされていないhu20D12.v2.1.Cと比較して、hu20D12.v2.1.C+TP−Oct群における房水及び網膜においても観察された。
Claims (110)
- D因子に結合する単離抗体であって、前記抗体が、(a)アミノ酸配列SYYMY(配列番号15)を含むHVR−H1、(b)アミノ酸配列X4INPX5X6GX7TNFNEKFKS(配列番号111)を含むHVR−H2(式中、X4が、E及びWから選択され、X5が、T及びYから選択され、X6が、N、S、及びQから選択され、X7が、G、D、及びEから選択される)、(c)アミノ酸配列EGGFAY(配列番号25)を含むHVR−H3、(d)アミノ酸配列KASQNVDTDVA(配列番号9)を含むHVR−L1、(e)アミノ酸配列SASSRX1S(配列番号108)を含むHVR−L2(式中、X1が、Y、K、及びRから選択される)、ならびに(f)アミノ酸配列QQYX3NYPLT(配列番号110)を含むHVR−L3(式中、X3が、N及びEから選択される)を含む、前記抗体。
- 前記抗体が、配列X2SASSRX1S(配列番号109)を含み、式中、X1が、Y、K、及びRから選択され、X2が、Y、R、S、K、及びQから選択される、請求項1に記載の抗体。
- X2が、Rである、請求項2に記載の抗体。
- X1が、Yである、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号16〜24から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号10〜12から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−L2、及び配列番号13または14のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、
a)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、
b)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号20のアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、
c)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、
d)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号18のアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、
e)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号19のアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、
f)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号21のアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、
g)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号22のアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、
h)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号23のアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、
i)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−L2、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、
j)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号12のアミノ酸配列を含むHVR−L2、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、
k)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、配列番号14のアミノ酸配列を含むHVR−L3、または
l)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1、配列番号24のアミノ酸配列を含むHVR−H2、配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−H3、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR−L1、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR−L3、を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体。 - 軽鎖の49位のアミノ酸が、アルギニン(R)である、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、配列番号27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、及び63から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、配列番号26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、及び62から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、
a)配列番号35のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号34のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
b)配列番号39のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号38のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
c)配列番号33のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号32のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
d)配列番号45のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号44のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
e)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号46のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
f)配列番号49のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号48のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
g)配列番号29のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号28のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
h)配列番号31のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号30のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
i)配列番号37のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号36のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
j)配列番号41のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号40のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
k)配列番号61のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号60のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
l)配列番号43のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号42のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
m)配列番号57のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号56のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
n)配列番号51のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号50のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
o)配列番号53のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号52のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
p)配列番号55のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
q)配列番号59のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号58のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
r)配列番号63のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号62のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体。 - 前記抗体が、配列番号35のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号34のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むか、または前記抗体が、配列番号39のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号38のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項1に記載の抗体。
- モノクローナル抗体である、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体。
- ヒト化またはキメラ抗体である、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体。
- D因子に結合する抗体断片である、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体。
- Fab断片である、請求項14に記載の抗体。
- 前記軽鎖が、配列番号112の配列を含む軽鎖定常領域を含む、請求項15に記載の抗体。
- 前記重鎖が、配列番号113、128〜132、134〜137、及び154〜156から選択される配列を含む重鎖定常領域を含む、請求項15または請求項16に記載の抗体。
- 前記抗体が、
a)配列番号71、118〜122、及び140〜146から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、ならびに配列番号70のアミノ酸配列を含む軽鎖、
b)配列番号75、123〜127、及び147〜153から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、ならびに配列番号74のアミノ酸配列を含む軽鎖、
c)配列番号65のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号64のアミノ酸配列を含む軽鎖、
d)配列番号65のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号64のアミノ酸配列を含む軽鎖、
e)配列番号67のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号66のアミノ酸配列を含む軽鎖、
f)配列番号69のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号68のアミノ酸配列を含む軽鎖、
g)配列番号73のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号72のアミノ酸配列を含む軽鎖、
h)配列番号77のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号76のアミノ酸配列を含む軽鎖、
i)配列番号79のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号78のアミノ酸配列を含む軽鎖、
j)配列番号81のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号80のアミノ酸配列を含む軽鎖、
k)配列番号83のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号82のアミノ酸配列を含む軽鎖、
l)配列番号85のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号84のアミノ酸配列を含む軽鎖、
m)配列番号87のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号86のアミノ酸配列を含む軽鎖、
n)配列番号89のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号88のアミノ酸配列を含む軽鎖、
o)配列番号91のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号90のアミノ酸配列を含む軽鎖、
p)配列番号93のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号92のアミノ酸配列を含む軽鎖、
q)配列番号95のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号94のアミノ酸配列を含む軽鎖、
r)配列番号97のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号96のアミノ酸配列を含む軽鎖、または
s)配列番号99のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号98のアミノ酸配列を含む軽鎖、を含む、請求項14〜17のいずれか一項に記載の抗体。 - 前記抗体が、
a)配列番号71、118〜122、及び140〜146から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、ならびに配列番号70のアミノ酸配列を含む軽鎖、または
b)配列番号75、123〜127、及び147〜153から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、ならびに配列番号74のアミノ酸配列を含む軽鎖、を含む、請求項14〜17のいずれか一項に記載の抗体。 - 前記抗体が、操作システインを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記操作システインが、重鎖内のT110C、A136C、L170C、L175C、T183C、またはT205C突然変異、ならびに軽鎖内のI106C、R108C、R142C、K149C、及びV205C突然変異から選択され、残基番号が、Kabat番号付けに従う、請求項20に記載の抗体。
- 前記抗体が、配列番号119のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号70のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項19に記載の抗体。
- D因子に結合する単離抗体であって、前記抗体が、配列番号119のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号70のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、前記抗体。
- D因子に結合する単離抗体であって、前記抗体が、配列番号119のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号70のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、前記抗体。
- D因子が、配列番号106のアミノ酸配列を含むヒトD因子である、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、カニクイザルD因子に結合する、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記カニクイザルD因子が、配列番号107のアミノ酸配列を含む、請求項26に記載の抗体。
- 前記抗体が、ヒトD因子のKDよりも10倍未満、または7倍未満、または5倍未満、または3倍未満高いKDでカニクイザルD因子に結合する、請求項26または請求項27に記載の抗体。
- 先行請求項のいずれか一項に記載の抗体をコードする、単離核酸。
- 請求項29に記載の核酸を含む、宿主細胞。
- 請求項1〜28のいずれか一項に記載の抗体を産生する方法であって、前記抗体が産生されるように、請求項30に記載の宿主細胞を培養することを含む、前記方法。
- 請求項1〜28のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的製剤。
- 前記薬学的に許容される担体が、約5.5〜約8.0のpHを有する緩衝液を含む、請求項32に記載の薬学的製剤。
- 前記抗体が、少なくとも150mg/ml、少なくとも160mg/ml、少なくとも170mg/ml、少なくとも180mg/ml、少なくとも190mg/ml、少なくとも200mg/ml、または少なくとも210mg/ml、または少なくとも220mg/ml、または少なくとも230mg/ml、または少なくとも240mg/ml、または少なくとも250mg/ml、または少なくとも260mg/ml、または少なくとも270mg/ml、または少なくとも280mg/ml、または少なくとも290mg/ml、または少なくとも300mg/mlの濃度で存在する、請求項32または請求項33に記載の薬学的製剤。
- 前記抗体が、150mg/ml〜350mg/ml、または150mg/ml〜300mg/ml、または170mg/ml〜300mg/ml、または200mg/ml〜300mg/mlの濃度で存在する、請求項32〜34のいずれか一項に記載の薬学的製剤。
- 前記組成物が、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも4週間、少なくとも6週間、少なくとも8週間、少なくとも12週間、少なくとも16週間、少なくとも20週間、少なくとも24週間、または少なくとも28週間、4℃にて保存後に、目に見える沈殿物を含まない、請求項32〜35のいずれか一項に記載の薬学的製剤。
- 25℃で、前記組成物の粘度が、30cP未満、25cP未満、20cP未満、15cP未満、または10cP未満である、請求項32〜36のいずれか一項に記載の薬学的製剤。
- 前記組成物中の抗D因子抗体の濃度が、100mg/ml〜300mg/ml、または150mg/ml〜300mg/mlである、請求項37に記載の薬学的製剤。
- 前記薬学的製剤が、狭口径針を通した硝子体内投与に適している、請求項32〜38のいずれか一項に記載の薬学的製剤。
- 前記狭口径針が、約30、29、28、27、26、25、24、23、または22ゲージである、請求項36に記載の薬学的製剤。
- 1つ以上のポリオールに共有結合している、請求項1〜28のいずれか一項に記載の少なくとも1つの抗体を含む、コンジュゲート。
- 前記ポリオールが、多アーム型ポリオールである、請求項41に記載のコンジュゲート。
- 前記コンジュゲートが、多アーム型ポリオールに共有結合している少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、または少なくとも6つの抗体を含む、請求項41または請求項42に記載のコンジュゲート。
- 前記ポリオールが、システインアミノ酸の遊離スルフヒドリル基を通して少なくとも1つの抗体に共有結合している、請求項41〜43のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- 前記システインアミノ酸が、操作システインである、請求項44に記載のコンジュゲート。
- 前記システインアミノ酸が、前記抗体の定常領域内にある、請求項44または請求項45に記載のコンジュゲート。
- 前記システインアミノ酸が、前記抗体の重鎖または軽鎖のC末端にある、請求項44〜46のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- 前記ポリオールが、リジンアミノ酸の遊離アミノ基を通して少なくとも1つの抗体に共有結合している、請求項41〜43のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- 前記リジンアミノ酸が、前記抗体の定常領域内にある、請求項48に記載のコンジュゲート。
- 前記リジンアミノ酸が、前記抗体の重鎖または軽鎖のC末端にある、請求項48に記載のコンジュゲート。
- 前記ポリオールが、二量体、四量体、六量体、及び八量体から選択される多アーム型ポリオールである、請求項41〜50のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- 前記多アーム型ポリオールが、八量体である、請求項51に記載のコンジュゲート。
- 前記ポリオールが、ポリエチレングリコールである、請求項38〜49のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- 前記ポリエチレングリコールが、約500D〜約300,000Dの重量平均分子量を有する、請求項53に記載のコンジュゲート。
- 前記ポリエチレングリコールが、約20,000D〜約60,000Dの重量平均分子量を有する、請求項53に記載のコンジュゲート。
- 前記ポリエチレングリコールが、約40,000Dの重量平均分子量を有する、請求項53に記載のコンジュゲート。
- nが、4である、請求項59に記載のコンジュゲート。
- nが、4である、請求項61に記載のコンジュゲート。
- mが、50〜200の整数である、請求項57〜63のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- mが、100〜150の整数である、請求項64に記載のコンジュゲート。
- 各R2が、独立して、チオール反応基、アミノ反応基、及びこれらの組み合わせから選択される、請求項57〜66のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- 各R2が、独立して、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフルオロメタンスルホネート、トシレート、アジリジン、エポキシド、ピリジルジスルフィド、スクシンイミジルエステル、−NH2、アルデヒド、ハロアセテート、ハロアセトアミド、及びパラ−ニトロフェニルカルボネートから選択される、請求項67に記載のコンジュゲート。
- R2が、マレイミドである、請求項68に記載のコンジュゲート。
- 前記R2基のうちの少なくとも7つが、前記抗体のうちの1つに共有結合している、請求項57〜69のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- 前記R2基のうちの8つが、前記抗体のうちの1つに共有結合している、請求項71に記載のコンジュゲート。
- 1つ以上のポリオールに共有結合している、請求項22〜24のいずれか一項に記載の少なくとも1つの抗体を含む、請求項41〜72のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- mが、50〜200の整数である、請求項74に記載のコンジュゲート。
- mが、100〜150の整数である、請求項74に記載のコンジュゲート。
- 前記コンジュゲートが、請求項1〜28のいずれか一項に記載の少なくとも1つの抗体を多アーム型ポリオールに共有結合することによって調製される、請求項41〜76のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- 請求項41〜77のいずれか一項に従ってコンジュゲートと、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的製剤。
- 前記抗体の濃度が、少なくとも100mg/ml、または少なくとも150mg/ml、または少なくとも200mg/ml、または少なくとも300mg/mlである、請求項78に記載の薬学的製剤。
- 前記抗体の濃度が、約50mg/ml〜約300mg/mlである、請求項79に記載の薬学的製剤。
- 25℃で、前記組成物の粘度が、1000cP未満、900cP未満、800cP未満、700cP未満、600cP未満、500cP未満、400cP未満、または300cP未満である、請求項78〜80のいずれか一項に記載の薬学的製剤。
- 前記組成物中の前記抗D因子抗体の濃度が、少なくとも100mg/mlまたは少なくとも150mg/mlである、請求項81に記載の薬学的製剤。
- 請求項32〜40及び78〜82のいずれか一項に記載の薬学的製剤を含む眼内送達のための送達デバイス、ならびに前記製剤を患者の硝子体内に送達するための手段。
- 前記製剤が、その場で長期間効果を持続する、請求項83に記載の送達デバイス。
- 対象における補体媒介性障害を治療する方法であって、前記対象に、有効量の、請求項1〜28のいずれか一項に記載の抗体、請求項41〜75のいずれか一項に記載のコンジュゲート、または請求項32〜40及び78〜82のいずれか一項に記載の薬学的製剤を投与することを含む、前記方法。
- 前記補体媒介性障害が、全身性である、請求項85に記載の方法。
- 前記補体媒介性障害が、補体関連の眼の症状である、請求項85に記載の方法。
- 前記補体関連の眼の症状が、乾燥及び湿潤(非滲出性及び滲出性)型を含む加齢性黄斑変性症(AMD)、脈絡膜血管新生(CNV)、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、虚血関連網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症(CRVO)、角膜血管新生、及び網膜血管新生から選択される、請求項87に記載の方法。
- 前記補体関連の眼の症状が、中期乾燥型AMDまたは地図状萎縮(GA)から選択される、請求項87に記載の方法。
- 前記方法が、移植可能ポート送達系を用いて、前記抗体、コンジュゲート、または薬学的製剤を投与することを含む、請求項85〜89のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、硝子体内投与によって、前記抗体、コンジュゲート、または薬学的製剤を投与することを含む、請求項85〜89のいずれか一項に記載の方法。
- 前記硝子体内投与が、狭口径針を通す投与である、請求項91に記載の方法。
- 前記狭口径針が、約30、29、28、27、26、25、24、23、または22ゲージである、請求項92に記載の方法。
- 前記個体に、追加の治療剤を投与することをさらに含む、請求項85〜93のいずれか一項に記載の方法。
- 前記追加の治療剤が、ANG2拮抗薬、TIE2拮抗薬、VEGF拮抗薬、及び第2の補体成分拮抗薬から選択される、請求項94に記載の方法。
- 前記追加の治療剤が、抗ANG2抗体である、請求項94に記載の方法。
- 前記追加の治療剤が、抗TIE2抗体である、請求項94に記載の方法。
- 前記追加の治療剤が、VEGFトラップ及び抗VEGF抗体から選択される、請求項94に記載の方法。
- 前記追加の治療剤が、第2の補体成分拮抗薬であり、前記第2の補体成分拮抗薬が、C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、及びC9から選択される補体成分を阻害する、請求項94に記載の方法。
- 対象における補体媒介性障害を治療するための薬剤の調製のために、請求項1〜28のいずれか一項に記載の抗体、または請求項43〜77のいずれか一項に記載のコンジュゲートの使用。
- 前記補体媒介性障害が、補体関連の眼の症状である、請求項100に記載の使用。
- 前記補体媒介性障害が、全身性である、請求項100に記載の使用。
- 前記補体関連の眼の症状が、乾燥及び湿潤(非滲出性及び滲出性)型を含む加齢性黄斑変性症(AMD)、脈絡膜血管新生(CNV)、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、虚血関連網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症(CRVO)、角膜血管新生、及び網膜血管新生から選択される、請求項102に記載の使用。
- 前記補体関連の眼の症状が、中期乾燥型AMDまたは地図状萎縮(GA)から選択される、請求項102に記載の使用。
- 治療剤で用いるための、請求項1〜28のいずれか一項に記載の抗体、または請求項41〜77のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- 対象における補体媒介性障害を治療する方法で用いるための、請求項1〜28のいずれか一項に記載の抗体、または請求項41〜77のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- 対象における全身性補体媒介性障害を治療する方法で用いるための、請求項1〜28のいずれか一項に記載の抗体、または請求項41〜77のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- 前記補体媒介性障害が、補体関連の眼の症状である、請求項107に記載の抗体またはコンジュゲート。
- 前記補体関連の眼の症状が、乾燥及び湿潤(非滲出性及び滲出性)型を含む加齢性黄斑変性症(AMD)、脈絡膜血管新生(CNV)、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、虚血関連網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症(CRVO)、角膜血管新生、及び網膜血管新生から選択される、請求項108に記載の抗体またはコンジュゲート。
- 前記補体関連の眼の症状が、中期乾燥型AMDまたは地図状萎縮(GA)から選択される、請求項108に記載の抗体またはコンジュゲート。
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