KR20130020765A - Ｈｓａ-관련 조성물 및 사용방법 - Google Patents

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차이티 차우두리
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Abstract

천연 HSA에 대해 개선된 특성을 가지는 인간 혈청 알부민(HSA)이 제공된다.

Description

ＨＳＡ-관련 조성물 및 사용방법{HSA-RELATED COMPOSITIONS AND METHODS OF USE}
1. 관련 출원과의 상호 참조
이 출원은 2010년 2월 16일 출원된 미국 가특허출원 제61/304,954호; 및 2010년 7월 15일 출원된 제61/364,503호에 대한 우선권을 주장하며, 이 기초출원은 둘 다 그것의 전문이 참조로 포함된다.
2. 서열 목록에 대한 언급
이 출원은 2010년 2월 14일 만들어졌으며, 38.5 킬로바이트 용량을 가지는 텍스트 파일명 "MED0554_PCT_ST25"로 EFS-Web을 통해 이 출원과 함께 제출된 서열 목록을 참고로 포함한다.
3. 배경기술
신생아 Fc 수용체(FcRn)는 IgG와 인간 혈청 알부민(human serum albumin: HSA) 둘 다의 수명을 엔도좀의 산성 pH에서 분자 둘 다를 특이적으로 결합시키고, 그것들을 세포 표면으로 되돌리는 재순환하는 pH 의존적 메커니즘에 의해 연장시키며, 따라서 두 분자를 모두 디폴트 리소좀 분해 경로로부터 다른 곳으로 돌려놓는다. FcRn 결합 능력은 알부민의 도메인-III에 대해 고유한 것으로 나타났다.
4. 발명의 내용
본 명세서는 HSA-관련 조성물 및 사용방법을 제공한다. 본 명세서는 신생아 FcRn 결합 단편 및 이것의 이종성 폴리펩타이드 또는 생활성 단편을 포함하는 인간 혈청 알부민(HSA)을 포함하는 키메라 폴리펩타이드뿐만 아니라 키메라 폴리펩타이드와 약제학적 담체의 조합을 포함하는 조성물을 제공한다. 또한 이러한 키메라 폴리펩타이드를 생성하는데 유용한 구성체가 개시된다. 추가로, 본 명세서는 그것들을 암호화하는 키메라 폴리펩타이드 및 구성체의 제조 방법을 교시한다. 본 명세서는 인간 혈청 알부민(HSA) 부분을 포함하는 폴리펩타이드를 추가로 제공하는데, HSA 부분은 HSA 도메인 III, 또는 이것의 신생아 Fc 수용체(FcRn) 결합 단편을 포함하되, HSA 도메인 III은 대조군 폴리펩타이드에 비해 FcRn에 대한 친화도 및 폴리펩타이드의 혈청 반감기 중 하나 또는 둘 다를 증가시키는 1 내지 18개의 아미노산 치환을 포함하고, 이때 HSA 부분은 상기 아미노산 치환을 포함하지 않는다. 본 명세서는 또한 인간 혈청 알부민(HSA) 부분을 포함하는 키메라 폴리펩타이드를 제공하며, HSA 부분은 HSA 도메인 III, 또는 이것의 신생아 Fc 수용체(FcRn) 결합 단편, 및 이종성 단백질을 포함하되, 키메라 폴리펩타이드는 이종성 단백질의 기능적 활성을 보유하고, FcRn에 결합할 수 있으며, HSA 도메인 III은 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하여 대조군 키메라 폴리펩타이드에 비해 FcRn에 대한 친화도 및 키메라 폴리펩타이드의 혈청 반감기 중 하나 또는 둘 다를 증가시키는데, 이때 HSA 부분은 상기 아미노산 치환을 포함하지 않는다. 추가적으로, 예를 들어 단백질의 혈청 반감기를 증가시키기 위하여 키메라 폴리펩타이드를 사용하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 또한 폴리펩타이드의 거대하고 다양한 집단을 스크리닝하는데 유용한 아데노바이러스 라이브러리의 발생에 유용한 방법 및 벡터가 개시된다. 이러한 방법은 FcRn 및 혈청 반감기에 대한 친화도 중 하나 또는 둘 다를 증가시키는 HSA 도메인 III 아미노산 치환의 스크리닝 및 확인에 유용하다.
특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드는 HSA 부분을 포함하지 않는 대조군 폴리펩타이드에 비해 FcRn에 대해 증가된 친화도 및 증가된 혈청 반감기 중 하나 또는 둘 다를 가진다. 특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드는 증가된 혈청 반감기를 가진다. 특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드는 FcRn에 대한 증가된 친화도와 증가된 혈청 반감기를 둘 다 가진다. 특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드는 산성 pH(예를 들어 대략 5.5의 pH)에서 FcRn에 대해 증가된 친화도를 가진다. 다른 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드는 산성 pH(예를 들어 대략 5.5의 pH)에서 FcRn에 대해 증가된 친화도를 가지며, 중성 pH(예를 들어, 대략 7.4의 pH)에서 FcRn에 대해 키메라 폴리펩타이드의 친화도는 실질적으로 변경되지 않는다.
본 명세서는 임의의 앞서 언급한 양태 및 실시형태의 모든 조합뿐만 아니라 상세한 설명 및 실시예에서 설명하는 임의의 실시형태와 조합을 생각한다.
5. 도면의 간단한 설명
본 발명을 예시하기 위한 목적을 위하여, 도면에서 본 발명의 특정 실시형태를 도시한다. 그러나, 본 발명은 도면에 설명된 실시형태의 정확한 배열 및 수단으로 제한되지 않는다.
도 1은 인간 혈청 알부민(HSA)의 도메인 III에 인간 FcRn 결합의 역학적 및 평형상태 분석. pH 5.5에서 고정된 도메인 III에 인간 FcRn 결합을 위한 SPR-유래 결합, 해리 역학 및 평형 결합 상수가 본 명세서에 제공된다. 도 1a는 피키아 파스토리스(Pichia Pastoris)(화살표로 표시)로부터 HSA의 도메인 III의 성공적 발현 및 정제를 입증하는 쿠마씨 염색 PAGE 겔. 도 1b는 CM5 칩 상에 고정된 도메인 III에 걸쳐 FcRn 농도의 범위를 주입함으로써 만들어진 결합 센서그램(sensorgram). 도 1c는 정상상태 친화도 모델에 대한 평형상태에서 결합 반응 대 FcRn 농도 적합의 플롯.
도 2는 HSA에 융합된 IgG 및 도메인 III에 융합된 IgG의 다양한 구성체 설계뿐만 아니라 정제 및 특징화에 대한 정보의 개략적 표현. 도 2a는 재조합 IgG-HSA 또는 IgG-도메인 III 융합 단백질뿐만 아니라 YTE 변이체의 중쇄 DNA 구성체. 도 2b는 환원 및 비환원 조건 하에서 정제된 융합 단백질(5㎍/레인)의 SDS PAGE 분석. 도 2c는 정제된 IgG-융합 단백질의 분석적 크기 배제 크로마토그래피.
도 3은 HSA와 융합된 IgG 및 도메인 III과 융합된 IgG에 대한 인간 FcFn 결합을 위한 SPR-유래 평형상수를 제공. 각 FcRn 주입에 대한 평형상태(Req)에서 RU를 인간 FcRn 농도에 대해 플롯팅하였고, 데이터를 정상상태 친화도 모델로 적합화하여 고정된 IgG(패널 a), HSA에 융합된 IgG(패널 b) 및 도메인 III에 융합된 IgG(패널 c)에 대해 KD를 계산하였다. 삽도의 센서그램은 블랭크 차감 후 Y축 상에 고정된 리간드와 결합한 FcRn의 질량(공명 단위) 대 X축 상의 시간을 나타낸다.
도 4는 HSA 상의 에피토프가 입체형태적 에피토프인 것을 나타내는 증거를 제공. 상이한 3가지 방법으로 처리한 세파로스 (S)-HSA, S-IgG 또는 S-Tris를 pH 5.5에서 인간 FcRn과 함께 인큐베이션하였다. 결합된 FcRn을 용리시켰고, 항-β2마이크로글로불린 항체로 면역블로팅(immunoblotting)함으로써 정량화하였다. 분자량 마커(M, kD)의 위치를 나타낸다. 레인 1은 20 ㎍ 인간 FcRn을 함유하였고, 그 양으로 모든 흡착제 샘플에 첨가하였다.
도 5는 FITC 컨쥬게이트된 항HSA 항체를 사용하여 효모 세포(사카로마이세스 세레비시에(S. Cerevisiae))의 표면 디스플레이 플라스미드상에 나타낸 HSA 및 도메인 III이 FcRn 결합 용량을 보유한다는 것을 도시. 도 5a는 갈락토스 유도성 pYD1 세포 표면과 함께 형질전환된 사카로마이세스 세레비시에 상의 HSA 또는 도메인 II의 유세포 분석기 검출. 표시한 시간 동안 갈락토스에 의해 세포를 유도하였다. 패널 b는 48시간 동안 유도된 사카로마이세스 세레비시에 세포 상에서 나타내고 유세포 분석기를 사용하여 항-스트렙타비딘 피코에리트린에 의해 시각화한 HSA 또는 도메인 III에 대한 바이오틴화된 인간 FcRn의 결합. scfv와 함께 형질변환된 효모 세포를 FITC뿐만 아니라 피코에리트린에 대한 배경 형광성에 대해 대조군으로 사용하였다. 실험을 형광 강도(로그 스케일) 대 세포 수의 히스토그램으로 표현한다.
도 6은 상이한 종(인간, 돼지, 래트, 마우스, 개, 토끼, 소, 닭, 당나귀, 모래쥐, 양, 고양이 및 말)으로부터 도메인 III의 아미노산 서열 배열을 제공. 패널 a 내지 d의 얼라인먼트(alignment)는 닭을 포함하지만, 패널 e 내지 h는 닭을 제외한다. 상이한 종 중에서 보존된 아미노산 잔기는 실선으로 표시하며, 보존적 시스테인 잔기는 점선으로 표시한다. 음영처리된 아미노산 잔기는 종들 중에서 보존되지 않는다. 도 6의 아미노산 넘버링은 전장 성숙 HSA에 대해 도메인 III의 넘버링에 관하여 나타내기 보다는 단지 인간 도메인에 대한 것이다.
도 7은 야생형을 가지는 IgG에 대한 HSA의 융합이 IgG-YTE 변이체에 대해 나타낸 것과 유사한 수준으로 혈청 지속성을 증가시킴을 도시. 혈청 내 남아있는 주사 샘플의 %를 시간에 걸쳐(1 내지 240시간) 플롯팅.
도 8은 scFv-Fc 세포 표면의 플라스미드 맵이 라이브러리 유입 벡터를 나타낸다는 것을 도시. 패널 a는 프로모터(본 명세서에서 CMV 프로모터)에 작동가능하게 연결된 scFv-Fc-GPI-앵커(anchor) 카세트를 함유하고 폴리A 서열(본 명세서에서 BGH 폴리A 서열)로 종결하는 pENDisplay 벡터의 플라스미드 맵을 도시. scFv 부분은 다양한 scFv 서열의 클로닝을 용이하게 하기 위한 Sfi I 및 Not I 제한 효소 자리 옆에 있다. attL1 및 attL2 자리는 scFv-Fc-GPI-앵커 발현 카세트 옆에 있다. 패널 b는 패널 a에서 나타낸 벡터에 기반하지만 scFv-Fc-GPI-앵커 카세트의 폴리A 꼬리 뒤 OriP 서열을 포함하는(도 9c를 참조) pENDisplay-OriP 벡터의 플라스미드 맵을 도시한다.
도 9는 대표적인 EBNA-1 및 OriP을 제공. EBNA-1에 대한 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열은 각각 패널 a 및 b에서 제공된다. OriP의 서열은 패널 c에서 제공된다.
도 10은 관심 단백질(들)의 발현을 위한 대표적인 일반적 아데노바이러스 발현 벡터의 개략도를 제공. 도시한 벡터는 관심의 하나 이상의 단백질을 암호화하는 관심의 DNA 서열; OriP 서열 및 선택적으로 EBNA-1 암호화 영역을 포함한다. 이 성분은 선택적으로 벡터의 구성을 위해 사용될 수 있는 att 재조합 자리 옆에 있다. 이 성분은 E1 및/또는 E3 유전자의 결실을 가지는 이런 경우에 아데노바이러스 게놈에 한 자리 옆에, ITR 서열 옆에 있다. 3' 및 5' ITR 서열을 표시한다. 벡터는 또한 구성, 전파 및 선택의 용이성을 위해 박테리아 세포에서 복제를 위한 서열(예를 들어 대장균(E. coli) 기원) 및 항생물질 선택(예를 들어, 암피실린 내성)을 제공하며, 이 성분은 그것들이 구조된 아데노바이러스에 포함되지 않도록 위치된다.
도 11은 포유류 세포(293F 세포)의 표면 상에 나타낸 HSA가 FcRn 결합 능력을 보유한다는 것을 도시. 패널 a는 CMV(굵은 선), 신호 서열(굵은 점선), N-말단의 플래그 태그(얇은 점선), HSA 부분(빗금친 박스) 옆에 있는 (G4S)3 링커(얇은 실선) 및 DAF-GPI 서열을 포함하는 포유류 발현 구성체 지정 pEN-HSA-GPI를 도시. 패널 b는 16 및 24시간 후 pEN-HSA-GPI로부터 발생된 아데노바이러스로 감염시킨 표면 293-F 세포 상에서 HSA의 유세포 분석기 검출, 또는 FITC 컨쥬게이트된 항-HSA 항체(패널 a)를 사용하여 대조군 scFv-Fc 융합 단백질을 암호화하는 대조군 플라스미드를 도시. 패널 c 및 d는 유세포 분석기를 사용하여 항-스트렙타비딘 피코에리트린에 의해 시각화한 293F 세포 상에 나타낸 바이오틴화된 인간 FcRN(각각 25 ㎍/㎖ 및 5 ㎍/㎖)의 HSA에 대한 결합을 도시. 실험은 형광 강도(로그 스케일) 대 세포 수의 히스토그램으로 표현한다.
도 12는 293F 세포 상에 나타낸 야생형 HSA(HSA-wt) 및 2개의 HSA 돌연변이체 라이브러리(HSA-DIII-lib1 및 HSA-DIII-lib2)에 바이오틴화된 인간 FcRn의 결합 프로파일의 변화를 도시. 패널 a는 야생형 및 돌연변이체 HSA-DIII 라이브러리로 감염시킨 293-F 세포의 표면 상에 HSA의 유세포 분석기 검출을 도시. 패널 b는 항스트렙타비딘 피코에리트린에 의해 시각화된 세포 표면 상에서 바이오틴화된 인간 FcRn 결합 HSA의 유세포 분석기 검출을 도시. 형광 강도(로그 스케일) 대 세포 수의 히스토그램으로 실험을 표현한다.
도 13은 항스트렙타비딘 피코에리트린으로 검출한 야생형 HSA(HSA-wt, 패널 a) 및 2개의 HSA 돌연변이체 라이브러리(각각 HSA-DIII-lib1 및 HSA-DIII-lib2, 패널 b 및 c) 염색된 바이오틴화 인간 FcRn(10 ㎍/㎖)을 발현시키는 세포의 FACS 소팅(sorting) 프로파일.
도 14는 바이오틴화된 인간 FcRn을 293F 세포에 대해 소팅 전 및 소팅의 제1 및 제2 라운드 후 그것의 세포 표면 야생형 HSA(HSA-wt), HSA-DIII-lib1 돌연변이체 라이브러리 상에서 발현하는 결합 프로파일의 변화를 도시. 패널 a는 소팅 전 및 제1 및 제2 라운드의 소팅 후 야생형, HSA-DIII-lib1을 발현시키는 293F 세포 상의 HSA의 유세포 분석기 검출을 나타낸다. 패널 b 및 c는 유세포분석기를 사용하여 항스트렙타비딘 피코에리트린에 의해 시각화한 세포의 동일한 설정에 바이오틴화된 인간 FcRn(각각 1 ㎍/㎖ 및 0.1 ㎍/㎖)의 결합을 나타낸다. 실험을 형광 강도(로그 스케일) 대 세포 수의 히스토그램으로 표현한다.
도 15는 세포 표면 상에 나타낸 돌연변이체 HSA에 대한 FcRn의 결합이 pH 의존적이라는 것을 도시. 패널 a 및 b는 pH 5.5(0.1 ㎍/㎖ FcRn, 패널 a) 및 pH 7.2(10 ㎍/㎖, 패널 b)에서 대조군 scFv-Fc 융합 단백질, 야생형 HSA, 및 3개의 대표적 돌연변이(표 5)를 발현시키는 293F 세포의 표면 상에서 항스트렙타비딘 피코에리트린으로 검출한 바이오틴화된 인간 FcRn의 유세포 분석기 검출을 나타낸다. 패널 c는 FITC 컨쥬게이트된 항-HSA 항체를 사용하여 이 세포의 표면 상에서 HSA의 유세포 분석기 검출을 나타낸다.
도 16은 대부분의 분리된 HSA 돌연변이가 유세포분석기에 의해 측정한 FcRn에 대해 더 높은 친화도를 가지는 것을 도시. 야생형 HSA 및 선택한 돌연변이의 패널을 유세포 분석기에 의해 상이한 농도에서 결합 바이오틴화된 인간 FcRn을 결합시키기 위해 분석하였다. 데이터를 FcRn 농도에 따라 MFI로 플롯팅한다.
도 17은 HSA(PDB 등록 번호 1BM0)의 풀어진 구조 상에서 다수의 변이체의 위치를 도시. 구조의 벌크는 막대로 표현하고 화살표로 표시한 잔기 L463, E495, T508, 1523 및 K534에 의한 리본 다이아그램으로 나타낸다. 잔기 492-536를 포함하는 루프 6 및 7 및 나선구조 7 및 8을 원으로 표시한다. 대다수의 핫 스팟(hot spot) 및 선호되는 스팟(preferred spot)을 이 영역에서 찾는다.
6.1 도입
신생아 Fc 수용체(FcRn)는 IgG와 인간 혈청 알부민(HSA) 둘 다의 수명을 엔도좀의 산성 pH에서 분자 둘 다를 특이적으로 결합시키고, 그것들을 세포 표면으로 되돌리는 재순환하는 pH 의존적 메커니즘에 의해 연장시키며, 따라서 두 분자를 모두 디폴트 리소좀 분해 경로로부터 다른 곳으로 돌려놓는다. FcRn 결합 능력은 알부민의 도메인-III에 본질적인 것으로 나타났다. 본 명세서에서 증명되는 바와 같이, HSA의 FcRn 결합 단편의 부가는 단백질의 혈청 반감기 및/또는 항체, 항체 대체물, 단백질, 단백질 스캐폴드 및 펩타이드와 같은 치료제의 FcRn 결합 친화도를 증가시키기 위하여 사용될 수 있다. 특히, 본 명세서에서 증명되는 바와 같이 산성 pH(예를 들어 대략 5.5의 pH)에서 FcRn 결합 친화도는 증가된 한편 중성 pH(예를 들어 대략 7.4의 pH)는 실질적으로 변경되지 않는다. 본 명세서의 FcRn 결합 도메인 변이체를 포함하는 키메라 폴리펩타이드는 야생형 FcRn 결합 도메인보다 훨씬 더 혈청 반감기 또는 단백질의 FcRn 결합 친화도를 증가시킬 수 있다. 본 발명의 HSA 변이체 폴리펩타이드는 치료적 표적에 결합을 위한 스캐폴드로 작용할 수 있고, 또는 치료제에 커플링될 수도 있다.
본 명세서는 도메인 III의 변이체를 제공한다. 도메인 III의 이러한 변이체는 단독으로 사용될 수 있고, 또는 부가적인 HSA 서열의 맥락에서 사용되어 이종성 단백질 및/또는 비단백질제(non-protein agent)의 혈청 반감기 및/또는 FcRn 결합 친화도를 증가시킬 수 있다.
본 명세서에 개시된 키메라 폴리펩타이드 및 HSA 변이체는 수많은 용도를 가진다. 단백질 및 다른 분자는 때때로 인간 또는 동물 신체로부터 상대적으로 빠르게 클리어런스(clearance)된다. 빠른 클리어런스는 동물 모델에서 단백질 및 다른 분자를 연구하기 위한 능력을 약화시킬 수 있고, 치료적 목적을 위해 그것들을 효과적으로 사용하기 위한 능력을 약화시킬 수 있다. 일부 예에서, 단백질은 너무 빠르게 클리어런스되어 치료효과를 가지지 못한다. 다른 예에서, 단백질은 빈번한 투여를 필요하게 만드는 속도로 클리어런스된다. 빈번한 투여는 치료와 관련된 비용에 부가되며, 또한 치료 섭생과 불순응의 위험을 증가시킨다. 일부 예에서, 단백질은 더 큰 용량을 투여할 필요가 있는 속도로 클리어런스된다. 활성제의 더 큰 용량은 면역 반응을 포함하는 부작용의 위험을 증가시킬 수 있다.
본 명세서의 키메라 폴리펩타이드 및 변이체 HSA 폴리펩타이드는 혈청 반감기 및/또는 FcRn에 대한 친화도를 증가시킴으로써 빠른 또는 상대적으로 빠른 단백질 클리어런스와 관련된 문제를 처리하게 한다. 유사하게, 비단백질제는 혈청 반감기 및/또는 FcRn에 대한 친화도를 증가시키도록 본 명세서의 변이체 HSA 폴리펩타이드와 컨쥬게이트될 수 있다.
6.2 용어
더욱 상세하게 본 발명의 설명을 계속하기 전에, 본 발명은 예컨대 다양할 수 있는 특정 조성물 또는 공정 단계로 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 본 명세서 및 첨부하는 특허청구범위에서 사용하는 바와 같은 단수의 형태는 달리 맥락에서 명확하게 지시되지 않는다면 복수의 지시물을 포함하는 것임에 주의하여야 한다.
달리 정의되지 않는다면, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 관련된 기술분야의 당업자에 의해 보통 이해되는 것과 동일한 의미를 가질 것이다. 예를 들어, 문헌[Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; 및 the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]은 본 발명에 사용된 다수의 용어의 일반적인 용어를 당업자에게 제공한다.
아미노산은 IUPAC-IUB 생화학 명칭 협회(Biochemical Nomenclature Commission)에 의해 추천된 흔히 알려진 3글자 기호 또는 1 글자 기호에 의해 본 명세서에서 언급될 수 있다. 마찬가지로 뉴클레오타이드는 보통 허용되는 1 글자 암호에 의해 언급될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "아미노산 치환"은 모 폴리펩타이드 서열 내 특정 위치에서 아미노산이 다른 아미노산으로 대체되는 것을 의미한다. 예를 들어, 치환 L463N은 위치 463의 류신이 아스파라긴으로 대체되는 변이체 폴리펩타이드를 말한다.
항체의 가변성 도메인, 상보적 결정 영역(complementarity determining region: CDR) 및 프레임워크 영역(framework regions: FR) 내 아미노산의 넘버링은, 달리 표시되지 않는다면 문헌[Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]에서 설명하는 것과 같은 카바트(Kabat) 정의를 따른다. 이 넘버링 시스템을 사용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변성 도메인의 FR 또는 CDR의 단축 또는 FR 또는 CDR에 삽입에 대응하는 소수의 또는 부가적인 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어 중쇄 가변성 도메인은 H2의 잔기 52 다음의 단일 아미노산 삽입(카바트에 따르는 잔기 52a) 및 중쇄 FR 잔기 82 다음의 삽입된 잔기(예를 들어 카바트에 따르는 잔기 82a, 82b, 및 82c)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 "표준" 카바트 넘버링된 서열을 가지는 항체 서열의 상동성 영역에 얼라인먼트에 의해 제공된 항체에 대해 결정될 수 있다. 프레임워크 잔기의 최대 얼라인먼트는 Fv 영역에 대해 사용되도록 넘버링 시스템 내 "스페이서" 잔기의 삽입을 필요로 한다. 추가로 임의의 주어진 카바트 자리 수에서 특정 개개 잔기의 동일성은 이종간 또는 대립유전자 차이에 기인하여 항체 쇄로부터 항체 쇄까지 다를 수 있다.
또한 면역글로불린으로 알려진 본 명세서에서 사용되는 용어 "항체" 및 "항체"는 단클론성 항체(전장 단클론성 항체를 포함), 다클론성 항체, 적어도 2개의 상이한 에피토프 결합 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이성 항체), 인간 항체, 인간화된 항체, 카멜화된(camelised) 항체, 키메라 항체, 단일쇄 Fv(scFv), 단일쇄 항체, 단일 도메인 항체, 도메인 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 요망되는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 부분), 이황화 연결된 Fv(dsFv), 및 항유전자형(항-Id) 항체(예를 들어, 본 발명의 항체에 항-Id 항체를 포함), 인트라바디(intrabody) 및 상기 중 임의의 에피토프 결합 단편을 포함한다. 특히 항체들은 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 단편, 즉 적어도 하나의 항원-결합 자리를 함유하는 분자를 포함한다. 면역글로불린 분자는 임의의 아이소타입(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 서브아이소타입(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 알로타입(예를 들어, Gm, 예를 들어, G1m(f, z, a 또는 x), G2m(n), G3m(g, b, 또는 c), Am, Em, 및 Km(1, 2 또는 3))을 가질 수 있다. 항체는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 인간, 원숭이, 돼지, 말, 토끼, 개, 고양이, 마우스 등 또는 새와 같은 다른 동물(예를 들어, 닭)을 포함하는 임의의 동물로부터 유래될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "전장 HSA"는 이러한 단백질을 암호화하는 성숙 전장 인간 혈청 알부민 단백질 또는 뉴클레오타이드 서열을 말한다. 전장 HSA 단백질은 대략 585개의 아미노산이다(N-말단의 프로- 및 프레프로-서열의 제거 후). 성숙 전장 HSA(또한 성숙 전장 HSA로 언급됨) 단백질은 서열 번호 2에서 제시된다. 특정 실시형태에서, 전장 HSA는 프로 서열이 없는 HSA의 성숙 전장 형태를 말한다. 프레프로 HSA의 서열은(N-말단의 프로 및 프레프로 서열의 제거 전) 609개의 아미노산이며, GenBank 등록번호 NP_000468에서 설명된다. 추가로, 특정 개개 잔기의 동일성은 대립유전자 차이에 기인하여 서열 번호 2에서 제공되는 것으로부터 다양할 수 있다. HSA의 도메인 III에서 생기는 대립유전자 변이는 전장 성숙 HSA의 위치에 대해 넘버링한 것과 같이 잔기 410에서 R→ C ; 잔기 466에서 K→ E; 잔기 479에서 E→ K; 잔기 494에서 D→ N; 잔기 501에서 E→ K; 잔기 505에서 E→ K; 잔기 533에서 V→ M; 잔기 536에서 K→ E; 잔기 541에서 K→ E; 잔기 550에서 D→ A 또는 D→ G; 잔기 560에서 K→ E; 잔기 563에서 D→ N; 잔기 565에서 E→ K; 잔기 570에서 E→ K; 잔기 573에서 K→ E; 잔기 574에서 K→ E; 잔기 572-585에서 GKKLVAASQAALGL→ PTMRIRERK; 및 LVAASQAALGL→ TCCCKSSCLRLITSHLKASQ PTMRIRERK 575-585을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "HSA의 도메인 III"은 대략 205개의 아미노산인 전장 성숙 HSA의 HSA 확장 아미노산 381-585 중 통상적인 도메인 III, 또는 이러한 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 말한다. HSA의 도메인 III은 본 명세서에서 또한 도메인 III 또는 간단히 DIII로 약칭된다. 도메인 III 폴리펩타이드에 대한 아미노산 서열은 서열 번호 1에서 제시한다. 상기 논의한 바와 같은 특정 개개 잔기의 동일성은 대립유전자 차이에 기인하여 서열 번호 1에서 제공되는 것으로부터 다양할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "키메라 폴리펩타이드"는 서로에 대하여 이종성이 아닌 적어도 2 부분을 포함하는 폴리펩타이드를 말한다. 예를 들어, 융합 폴리펩타이드 또는 융합 단백질로 언급되는 키메라 폴리펩타이드는 이종성 단백질 부분에 결합된 적어도 HSA 부분을 포함한다. HSA 부분 및 이종성 단백질 부분은, 예를 들어 Fc 또는 다른 모이어티에 그 자체가 융합될 수 있다. HSA 부분 및 이종성 단백질 부분은 공유 또는 비공유 상호작용을 통해 결합될 수 있다. 예로서, HSA 부분 및 이종성 단백질 부분은 서로 화학적으로 컨쥬게이트될 수 있고 또는 재조합적으로 융합될 수 있다(예를 들어 프레임 내 번역 융합).
본 명세서에서 사용되는 용어 "이종성 단백질"은 HSA가 아닌 단백질의 모두 또는 일부를 말한다. 유전자 용어 "이종성 단백질"이 본 명세서에서 사용되지만, 용어 다양한 길이의 생활성 펩타이드뿐만 아니라 항체 또는 항체 단편을 포함하는 전장 또는 실질적으로 전장인 단백질을 포함하는 것으로 의도된다. 바람직한 이종성 단백질은 치료적 목적을 위해 사용되거나 연구될 수 있다. 이종성 단백질의 예시적 분류는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 효소, 사이토카인 및 성장 인자를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 HSA 폴리펩타이드는 다양한 생활성 단편 및 변이체, 융합 단백질 및 야생형 HSA 폴리펩타이드의 변형된 형태를 포함한다. HSA 폴리펩타이드의 이러한 생활성 단편 또는 변이체, 융합 단백질, 및 변형된 형태는 천연 HSA 단백질에 대해 실질적 서열 동일성이 있는 아미노산 서열의 적어도 일부를 가지며, 천연 HSA 단백질의 적어도 FcRn 결합 활성을 보유한다. 특정 실시형태에서, HSA 폴리펩타이드의 생활성 단편, 변이체 또는 융합 단백질은 HSA 폴리펩타이드와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 "단편"은 FcRn 결합 활성을 나타내는 생활성 단편 또는 생활성 변이체를 포함하는 것으로 이해된다. 적합한 생활성 단편은 키메라 폴리펩타이드를 만들기 위하여 사용될 수 있고, 이러한 키메라 폴리펩타이드는 본 명세서에 설명된 임의의 방법으로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "돌연변이된", "돌연변이체" 등은 자리 지정 돌연변이유발 또는 임의의 다른 통상적인 방법에 대해 잘 알려진 방법을 사용하여 하나 이상의 아미노산의 결실, 첨가 또는 치환을 받은 분자, 특히 HSA 폴리펩타이드를 말한다.
6.3 HSA 도메인 III
특정 양태에서, 본 명세서는 HSA 도메인 III, 또는 이것의 신생아 Fc 수용체(FcRn) 결합 단편을 포함하는 인간 혈청 알부민(HSA) 변이체 폴리펩타이드를 제공하되, 상기 변이체는 FcRn에 결합될 수 있으며, 상기 HSA 도메인 III은 1 내지 18개의 아미노산 치환을 포함하여 상기 아미노산 치환이 없는 대조군 HSA 폴리펩타이드에 비해 혈청 반감기를 증가시키거나 또는 FcRn에 대해 상기 변이체 폴리펩타이드의 친화도를 증가시킨다.
특정 실시형태에서, 1 내지 18개의 아미노산 치환은 FcRn에 대해 HSA 변이체 폴리펩타이드의 친화도를 증가시킨다. 특정 실시형태에서, 1 내지 18개의 아미노산 치환은 HSA 변이체 폴리펩타이드의 혈청 반감기를 증가시킨다. 특정 실시형태에서, 1 내지 18개의 아미노산 치환은 FcRn에 대한 HSA 변이체 폴리펩타이드의 친화도와 HSA 변이체 폴리펩타이드의 혈청 반감기를 둘 다 증가시킨다. 특정 실시형태에서, 1 내지 18개의 아미노산 치환은 산성 pH(예를 들어 대략 5.5의 pH)에서 FcRn에 대해 HSA 변이체 폴리펩타이드의 친화도를 증가시킨다. 특정 실시형태에서 산성 pH(예를 들어 대략 5.5의 pH)에서 FcRn에 대한 HSA 변이체 폴리펩타이드의 친화도는 증가하지만, 중성 pH(예를 들어 대략 7.4의 pH)에서 FcRn에 대한 HSA 변이체 폴리펩타이드의 친화도는 실질적으로 변경되지 않는다.
특정 실시형태에서, HSA 변이체는 FcRn에 결합하며, 상기 대조군 HSA 폴리펩타이드의 그것과 다른 해리 속도(off rate) 및 결합 속도(on rate)를 가진다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, HSA 변이체는 FcRn에 결합하며 더 빠른 결합 속도 및/또는 더 느린 해리 속도를 가진다. 다른 실시형태에서, 결합 속도는 더 느리며 및/또는 해리 속도는 더 빠르다.
특정 실시형태에서, 본 명세서는 HSA 부분을 포함하는 키메라 폴리펩타이드를 제공하는데, HSA 부분은 도메인 III, 또는 이것의 FcRn 결합 부분, 및 이종성 단백질을 포함하되, 키메라 폴리펩타이드는 이종성 단백질의 기능적 작용을 보유한다. 특정 실시형태에서, HSA 부분은 전체 HSA 폴리펩타이드 또는 HSA 도메인 III을 포함하는 생활성 단편, 또는 이것의 신생아 Fc 수용체(FcRn) 결합 단편을 포함한다. 특정 실시형태에서, HSA 부분은 HSA 도메인 III, 또는 이것의 신생아 Fc 수용체(FcRn) 결합 단편 및 HSA의 다른 도메인의 적어도 일부, 예를 들어 HSA 도메인 I의 적어도 일부, 또는 HSA 도메인 II의 적어도 일부, HSA 도메인 I 및 II의 적어도 일부를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는, HSA 도메인 I는 잔기 1-197를 포함하며; HSA 도메인 II는 잔기 189-385를 포함하고; HSA 도메인 III는 전장 성숙 HSA 내 위치에 대해 넘버링된 잔기 381-585를 포함한다.
특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드는 FcRn에 대해 증가된 친화도 및 HSA 부분을 포함하지 않는 대조군 폴리펩타이드에 대해 증가된 혈청 반감기 중 하나 또는 둘 다를 가진다. 특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드는 FcRn에 대해 증가된 친화도를 가진다. 특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드는 증가된 혈청 반감기를 가진다. 특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드는 FcRn에 대해 증가된 친화도와 증가된 반감기를 둘 다 가진다. 특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드는 산성 pH(예를 들어 대략 5.5의 pH)에서 FcRn에 대해 증가된 친화도를 가진다. 다른 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드는 산성 pH(예를 들어 대략 5.5의 pH)에서 증가된 FcRn를 가지며, 중성 pH(예를 들어, 대략 7.4의 pH)에서 FcRn에 대해 키메라 폴리펩타이드의 친화도는 실질적으로 변경되지 않는다.
더 나아가, 본 명세서에서 설명되는 특정 실시형태에서, 폴리펩타이드의 HSA 부분의 도메인 III(예를 들어 HSA 변이체 또는 키메라 폴리펩타이드)은 대조군 키메라 폴리펩타이드에 비해 FcRn에 대한 친화도 및 키메라 폴리펩타이드의 반감기 중 하나 또는 둘 다를 증가시키기 위한 1 내지 18개의 아미노산 치환을 포함하며, 이때 HSA 부분은 상기 아미노산 치환을 포함하지 않는다. 특정 실시형태에서, 1 내지 18개의 아미노산 치환은 FcRn에 대해 키메라 폴리펩타이드의 친화도를 증가시킨다. 특정 실시형태에서, 1 내지 18개의 아미노산 치환은 키메라 폴리펩타이드의 혈청 반감기를 증가시킨다. 특정 실시형태에서, 1 내지 18개의 아미노산 치환은 FcRn에 대한 키메라 폴리펩타이드의 친화도와 키메라 폴리펩타이드의 혈청 반감기를 둘 다 증가시킨다.
특정 실시형태에서, 폴리펩타이드의 HSA 부분의 도메인 III(예를 들어 HSA 변이체 폴리펩타이드 또는 키메라 폴리펩타이드)는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18개의 아미노산 치환을 포함한다. 유사하게, 도메인 III을 포함하는 HSA 변이체 폴리펩타이드, 또는 이것의 FcRn 결합 부분의 맥락에서, 도메인 III은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18개의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시형태에서, 아미노산 치환은 단지 대립유전자에 존재하는 단일 아미노산의 다른 잔기의 치환이 아니다.
특정 실시형태에서, 폴리펩타이드(예를 들어 HSA 변이체 폴리펩타이드 또는 키메라 폴리펩타이드)의 HSA 부분의 도메인 III은 전장 성숙 HSA 내 위치에 대해 넘버링된 다음 위치 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다: 잔기 381, 잔기 383, 잔기 391, 잔기 401, 잔기 402, 잔기 407, 잔기 411, 잔기 413, 잔기 414, 잔기 415, 잔기 416, 잔기 424, 잔기 426, 잔기 434, 잔기 442, 잔기 445, 잔기 447, 잔기 450, 잔기 454, 잔기 455, 잔기 456, 잔기 457, 잔기 459, 잔기 463, 잔기 495, 잔기 506, 잔기 508, 잔기 509, 잔기 511, 잔기 512, 잔기 515, 잔기 516, 잔기 517, 잔기 519, 잔기 521, 잔기 523, 잔기 524, 잔기 525, 잔기 526, 잔기 527, 잔기 531, 잔기 535, 잔기 538, 잔기 539, 잔기 541, 잔기 557, 잔기 561, 잔기 566, 잔기 569.
특정 실시형태에서, 폴리펩타이드의 HSA 부분의 도메인 III(예를 들어 HSA 변이체 폴리펩타이드 또는 키메라 폴리펩타이드)은 전장 성숙 HSA 내 위치에 대해 넘버링된 다음 위치 중 어느 하나에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다: (a) 잔기 383 및 413; (b) 잔기 401 및 523; (c) 잔기 407 및 447; (d) 잔기 407 및 447 및 539; (e) 잔기 407 및 509; (f) 잔기 407 및 526; (g) 잔기 411 및 535; (h) 잔기 414 및 456; (i) 잔기 415 및 569; (j) 잔기 426 및 526; (k) 잔기 442 및 450 및 459; (l) 잔기 463 및 508; (m) 잔기 508 및 519 및 525; (n) 잔기 509 및 527; (o) 잔기 523 및 538; (p) 잔기 526 및 557; 및 (q) 잔기 541 및 561.
특정 실시형태에서, FcRn 및/또는 혈청 반감기에 대해 증가된 친화도는 상이한 대조군에 대해 평가된다. 예를 들어, 키메라 폴리펩타이드의 특성은 HSA 부분의 부재하에서 이종성 단백질의 특성에 대해 평가될 수 있고 또는 아미노산 치환의 부재하에서, 및/또는 이종성 단백질의 부재하에서 동일 또는 유사한 HSA 부분의 특성에 대해 평가될 수 있다. 유사하게, HSA 변이체 폴리펩타이드는 HSA의 분자의 폴리펩타이드에 대해 평가될 수 있고 아미노산 치환을 가지지 않는다.
특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드/HSA 변이체 폴리펩타이드는 상기 대조군 폴리펩타이드 보다 더 높은 친화도로 FcRn에 결합한다. 특정 실시형태에서, 1 내지 18개의 아미노산 치환은 산성 pH(예를 들어 대략 5.5의 pH)에서 FcRn에 대해 키메라 폴리펩타이드/HSA 변이체 폴리펩타이드의 친화도를 증가시킨다. 특정 실시형태에서, 1 내지 18개의 아미노산 치환은 산성 pH(예를 들어 대략 5.5의 pH)에서 FcRn에 대해 키메라 폴리펩타이드/HSA 변이체 폴리펩타이드의 친화도를 증가시키지만, 중성 pH(예를 들어 대략 7.4의 pH)에서 FcRn에 대한 키메라 폴리펩타이드의 친화도를 실질적으로 변경시키지 않는다. 특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드는 산성 pH에서 더 높은 친화도로 FcRn과 결합하며 증가된 혈청 반감기를 가진다.
특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드/HSA 변이체 폴리펩타이드는 FcRn에 결합하며, 상기 대조군 폴리펩타이드의 그것과 다른 해리 속도 또는 결합 속도를 가진다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드/HSA 변이체 폴리펩타이드는 FcRn과 결합하며, 더 빠른 결합 속도 및/또는 더 느린 해리 속도를 가진다. 다른 실시형태에서, 결합 속도는 더 느리며 및/또는 해리 속도는 더 빠르다.
특정 실시형태에서, 폴리펩타이드의 HSA 도메인 III(예를 들어 HSA 변이체 또는 HSA 부분이 있는 키메라 폴리펩타이드)는 1 내지 10개의 아미노산 치환을 포함하여 FcRn에 대한 폴리펩타이드의 친화도를 증가시키며 및/또는 대조군 폴리펩타이드에 대해 폴리펩타이드의 혈청 반감기를 증가시키고, 이때 HSA 부분은 상기 아미노산 치환을 포함하지 않는다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III은 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III은 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18개의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III은 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III은 적어도 10개의 아미노산 치환을 포함한다.
예시적인 아미노산 치환은 (i) 알라닌으로 대체; (ii) 보존적 아미노산 치환; (iii) 비보존적 아미노산 치환을 포함한다. 본 명세서는 주어진 폴리펩타이드의 도메인 III에서 모든 아미노산 치환이 이런 치환 카테고리 중 하나의 구성원 일 수 있다는 것을 생각하며, 또한 주어진 폴리펩타이드(예를 들어 HSA 변이체 및 HSA 부분이 있는 키메라 폴리펩타이드)의 도메인 III에서 각 아미노산 치환은 이 카테고리로부터 개별적이고 독립적으로 선택될 수 있다.
특정 실시형태에서, 치환(적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 등 HSA 도메인 III 치환)은 알라닌에 HSA 중의 잔기로부터 유래한다. 특정 실시형태에서, 치환(적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 등 HSA 도메인 III 치환)은 HSA 내 주어진 중성 아미노산 잔기를 다른 중성 아미노산 잔기로 대체한다. 특정 실시형태에서, 치환(적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 등 HSA 도메인 III 치환)은 HSA 내 주어진 산성 아미노산 잔기를 다른 산성 아미노산 잔기로 대체한다. 특정 실시형태에서, 치환(적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 등 HSA 도메인 III 치환)은 HSA 내 염기성 아미노산 잔기를 다른 염기성 아미노산 잔기로 대체한다. 본 명세서는 각 치환이 앞서 언급한 부류의 치환 중으로부터 독립적으로 선택된 실시형태를 생각한다. 앞서 언급한 범주의 치환 중 임의의 조합을 포함하는 폴리펩타이드(예를 들어 HSA 변이체 및 HSA 부분이 있는 키메라 폴리펩타이드)가 구체적으로 고려된다.
특정 실시형태에서, 치환(적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 등 HSA 도메인 III 치환)은 하나의 아미노산을 다음의 그룹 내에 있는 다른 것으로 대체한다: 리신(K; Lys), 아르기닌(R; Arg); 히스티딘(H; His). 특정 실시형태에서, 치환(적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 등 HSA 도메인 III 치환)은 하나의 아미노산을 다음의 그룹 내에 있는 다른 것으로 치환한다: 아스파르테이트(D; Asp; 아스파르트산) 및 글루타메이트(E; Glu; 글루탐산). 특정 실시형태에서, 치환(적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 등 HSA 도메인 III 치환)은 하나의 아미노산을 다음의 그룹 내에 있는 다른 것으로 치환한다: 아스파라긴(N; Asn), 글루타민(Q; Gln), 세린(S; Ser), 트레오닌(T; Thr), 및 티로신(Y; Tyr). 특정 실시형태에서, 치환(적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 등 HSA 도메인 III 치환)은 하나의 아미노산을 다음의 그룹 내에 있는 다른 것으로 치환한다: 알라닌 (A; Ala), 발린(V; Val), 아이소류신(I; Ile), 류신(L; Leu), 프롤린(P; Pro), 페닐알라닌 (F; Phe), 트립토판(W; Trp), 메티오닌(M; Met), 시스테인(C; Cys) 및 글리신(G; Gly). 특정 실시형태에서, 치환(적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 등 HSA 도메인 III 치환)은 하나의 아미노산을 다음의 그룹 내에 있는 다른 것으로 치환한다: 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신. 특정 실시형태에서, 치환(적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 등 HSA 도메인 III 치환)은 하나의 아미노산을 다음의 그룹 내에 있는 다른 것으로 치환한다: 시스테인, 세린, 및 트레오닌. 특정 실시형태에서, 치환(적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 등 HSA 도메인 III 치환)은 하나의 아미노산을 다음의 그룹 내에 있는 다른 것으로 치환한다: 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르테이트, 글루타메이트. 특정 실시형태에서, 치환(적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 등 HSA 도메인 III 치환)은 하나의 아미노산을 다음의 그룹 내에 있는 다른 것으로 치환한다: 글라이신, 세린, 트레오닌, 알라닌, 발린, 류신, 및 아이소류신. 본 명세서는 각 치환이 앞서 언급한 부류의 치환 중으로부터 독립적으로 선택된 실시형태를 생각한다. 앞서 언급한 범주의 치환 중 임의의 조합을 포함하는 폴리펩타이드(예를 들어 HSA 변이체 및 HSA 부분이 있는 키메라 폴리펩타이드)가 구체적으로 고려된다. 구체적 실시형태에서, FcRn에 대해 증가된 친화도 및/또는 증가된 혈청 반감기를 가지는 폴리펩타이드의 HSA 부분의 도메인 III(예를 들어, HSA 변이체 폴리펩타이드 또는 키메라 폴리펩타이드)은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다:
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특정 실시형태에서, 도메인 III 내의 하나 이상의 아미노산 치환(예를 들어, 2, 3, 4, 5...) 또는 심지어 아미노산 치환 모두는 앞서 언급한 치환으로부터 선택된다.
다른 구체적 실시형태에서, 폴리펩타이드의 HSA 부분의 도메인 III(예를 들어, HSA 변이체 폴리펩타이드 또는 키메라 폴리펩타이드)은 V381N, E383G, N391V, Y401E, K402A, L407N, L407Y, Y411Q, K414S, K413S, V415T, V415C, Q416P, V424I, V424Q, V426E, V426H, G434C, E442K, R445W, P447S, E450D, S454C, V455N, V456N, L457F, Q459R, L463N, E495D, T506Y, T508R, T508S, F509I, F509M, F509W, A511F, D512Y, T515P, T515Q, T515S, L516T, L516W, S517C, S517W, K519I, R521W, I523D, I523E, I523Q, I523K, I523G, I523R, I523Y, K524L, K524V, K525V, Q526T, Q526M, Q526Y, T527Y, E531I, H535N, H535P, K538Y, A539I, K541F, K557G, A561F, T566W, 및 A569P로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시형태에서, 도메인 III 내의 하나 이상의 아미노산 치환(예를 들어, 2, 3, 4, 5...) 또는 심지어 아미노산 치환 모두는 앞서 언급한 치환으로부터 선택된다.
다른 구체적 실시형태에서, 폴리펩타이드의 HSA 부분의 도메인 III(예를 들어, HSA 변이체 폴리펩타이드 또는 키메라 폴리펩타이드)은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다: L407N, L407Y, V415T, V424I, V424Q, V426E, V426H, P447S, V455N, V456N, L463N, E495D, T506Y, T508R, F509M, F509W, A511F, D512Y, T515Q, L516T, L516W, S517W, R521W, I523D, I523E, I523G, I523K, I523R, K524L, Q526M, T527Y, H535P 및 K557G. 특정 실시형태에서, 도메인 III의 하나 이상의 아미노산 치환(예를 들어, 2, 3, 4, 5...) 또는 심지어 아미노산 치환 모두는 앞서 언급한 치환으로부터 선택된다.
다른 구체적 실시형태에서, 폴리펩타이드의 HSA 부분의 도메인 III(예를 들어, HSA 변이체 폴리펩타이드 또는 키메라 폴리펩타이드)은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다: L407Y, V415T, V424I, V424Q, P447S, V455N, V456N, L463N, E495D, T506Y, T508R, S517W, I523D, I523E, I523G, I523K, I523R, K524L, Q526M, T527Y, H535P 및 K557G. 특정 실시형태에서, 도메인 III의 하나 이상의 아미노산 치환(예를 들어, 2, 3, 4, 5...) 또는 심지어 아미노산 치환 모두는 앞서 언급한 치환으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 폴리펩타이드의 HSA 부분의 도메인 III(예를 들어, HSA 변이체 폴리펩타이드 또는 키메라 폴리펩타이드)은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다: (a) E383G/K413S; (b) Y401E/I523G; (c) L407N/P447S; (d) L407N/P447S/A539I; (e) L407N/F509M; (f) L407Y/Q526T; (g) Y411Q/H535N; (h) K414S/V456N; (i) V415T/A569P; (j) V426H/Q526Y; (k) E442K/E450D/Q459R; (l) L463N/T508R; (m) T508R/K519I/K525V; (n) F509I/T527Y; (o) I523Q/K538Y; (p) Q526M/K557G; 및 (q) K541F/A561F. 특정 실시형태에서, 도메인 III의 하나 이상의 아미노산 치환(예를 들어, 2, 3, 4, 5...) 또는 심지어 아미노산 치환 모두는 앞서 언급한 치환으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 폴리펩타이드의 HSA 부분의 도메인 III(예를 들어, HSA 변이체 폴리펩타이드 또는 키메라 폴리펩타이드)은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다: (a) L407N/P447S; (b) L407N/P447S/A539I; (c) L407N/F509M; (d) Y411Q/H535N; (e) K414S/V456N; (f) V426H/Q526Y; (g) L463N/T508R; (h) F509I/T527Y; (i) I523Q/K538Y; (j) Q526M/K557G; 및 (k) K541F/A561F.
추가로, 단편 또는 변이체는 통상적인 메리필드(Merrifield) 고체상 f-Moc 또는 t-Boc 화학과 같은 당업계에 알려진 기술을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 단편 또는 변이체는 예를 들어 천연 HSA 단백질로 작용할 수 있을 뿐만 아니라 이것과 실질적으로 유사하게 작용할 수 있는 단편 또는 변이체를 확인하기 위하여 (재조합적으로 또는 화학적으로) 생성되고 시험될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 치료적 또는 예방적 효능, 또는 안정성을 향상시키는 이러한 목적을 위하여 HSA 폴리펩타이드의 구조를 변형시키는 것을 생각한다(예를 들어 혈청 반감기, 생체 밖 저장 수명 및 생체 내 단백질 분해에 대한 저항성). 이러한 변형된 HSA 폴리펩타이드는 자연적으로 발생하는(즉, 천연 또는 야생형) HSA 폴리펩타이드와 동일한 또는 실질적으로 동일한 생활성을 가진다. 변형된 HSA 폴리펩타이드는 본 명세서에서 설명되는 다른 치료적 모이어티(예를 들어 단백질 및 비단백질제)에 컨쥬게이트될 수 있다. 변형된 폴리펩타이드는, 예를 들어 아미노산 치환, 결실 또는 첨가에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 류신을 아이소류신 또는 발린으로, 아스파르테이트를 글루타메이트로, 트레오닌을 세린으로 분리된 치환, 또는 구조적으로 관련된 아미노산으로 아미노산의 유사한 치환(예를 들어, 보존적 아미노산 치환)은 결과 분자의 생물학적 활성 상의 주된 효과를 가지지 않을 것이다. 보존적 치환은 그것의 측쇄에서 관련된 아미노산의 패밀리 내에서 일어나는 것이다.
특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내의 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 다양한 종에 걸쳐 보존된 잔기를 가진다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내의 상기 아미노산 치환 모두는 다양한 종에 걸쳐 보존된 잔기를 가진다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 인간, 돼지, 래트, 마우스, 개, 토끼, 소, 닭, 당나귀, 모래쥐, 양, 고양이 및 말로부터의 혈청 알부민 단백질 중에서 보존된 잔기를 가진다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 인간, 돼지, 래트, 마우스, 개, 토끼, 소, 닭, 당나귀, 모래쥐, 양, 고양이 및 말로부터의 혈청 알부민 단백질 중에서 보존된 잔기를 가진다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 유인원 및 원숭이와 같이 인간에게 매우 보존된 종으로부터의 혈청 알부민 단백질 중에서 보존된 잔기를 가진다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 중의 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 비포유류 동물로부터 혈청 알부민 단백질 중에서 보존된 잔기를 가진다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내의 상기 아미노산 치환 모두는 유인원 및 원숭이와 같이 인간에게 매우 보존된 종으로부터의 혈청 알부민 단백질 중에서 보존된 잔기를 가진다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 비포유류 동물로부터 혈청 알부민 단백질 중에서 보존된 잔기를 가진다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 인간, 돼지, 래트, 마우스, 개, 토끼, 소, 닭, 당나귀, 모래쥐, 양, 고양이 및 말의 대다수로부터 유래된 혈청 알부민 단백질 중에서 보존된 잔기를 가진다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 인간, 돼지, 래트, 마우스, 개, 토끼, 소, 닭, 당나귀, 모래쥐, 양, 고양이 및 말로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2가지의 종으로부터 유래된 혈청 알부민 단백질 중에서 보존된 잔기를 가진다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 인간, 돼지, 래트, 마우스, 개, 토끼, 소, 닭, 당나귀, 모래쥐, 양, 고양이 및 말로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 3가지 종으로부터 유래된 혈청 알부민 단백질 중에서 보존된 잔기를 가진다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 인간, 돼지, 래트, 마우스, 개, 토끼, 소, 닭, 당나귀, 모래쥐, 양, 고양이 및 말로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 4가지 종으로부터 유래된 혈청 알부민 단백질 중에서 보존된 잔기를 가진다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 인간, 돼지, 래트, 마우스, 개, 토끼, 소, 닭, 당나귀, 모래쥐, 양, 고양이 및 말로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 5가지 종으로부터 유래된 혈청 알부민 단백질 중에서 보존된 잔기를 가진다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 인간, 돼지, 래트, 마우스, 개, 토끼, 소, 닭, 당나귀, 모래쥐, 양, 고양이 및 말로 이루어진 군으로부터 선택된 2 내지 5가지 종으로부터 유래된 혈청 알부민 단백질 중에서 보존된 잔기를 가진다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 인간, 돼지, 래트, 마우스, 개, 토끼, 소, 닭, 당나귀, 모래쥐, 양, 고양이 및 말로 이루어진 군으로부터 선택된 종의 대다수로부터 유래된 혈청 알부민 단백질 중에서 보존된 잔기를 가진다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 인간, 돼지, 래트, 마우스, 개, 토끼, 소, 닭, 당나귀, 모래쥐, 양, 고양이 및 말로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2가지의 종으로부터 유래된 혈청 알부민 단백질 중에서 보존된 잔기를 가진다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 인간, 돼지, 래트, 마우스, 개, 토끼, 소, 닭, 당나귀, 모래쥐, 양, 고양이 및 말로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 3가지의 종으로부터 유래된 혈청 알부민 단백질 중에서 보존된 잔기를 가진다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 인간, 돼지, 래트, 마우스, 개, 토끼, 소, 닭, 당나귀, 모래쥐, 양, 고양이 및 말로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 4가지의 종으로부터 유래된 혈청 알부민 단백질 중에서 보존된 잔기를 가진다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 인간, 돼지, 래트, 마우스, 개, 토끼, 소, 닭, 당나귀, 모래쥐, 양, 고양이 및 말로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 5가지의 종으로부터 유래된 혈청 알부민 단백질 중에서 보존된 잔기를 가진다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 인간, 돼지, 래트, 마우스, 개, 토끼, 소, 닭, 당나귀, 모래쥐, 양, 고양이 및 말로 이루어진 군으로부터 선택된 2 내지 5가지의 종으로부터 유래된 혈청 알부민 단백질 중에서 보존된 잔기를 가진다. 아미노산 치환의 앞서 언급한 범주의 임의의 조합을 포함하는 폴리펩타이드(예를 들어, HSA 변이체 및 키메라 폴리펩타이드)가 또한 생각된다.
특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 전장 성숙 HSA 내 위치에 대해 넘버링된 다음 위치 중 어느 하나에 있다: 잔기 383, 잔기 389, 잔기 391, 잔기 410, 잔기 417, 잔기 425, 잔기 442, 잔기 465, 잔기 467, 잔기 468, 잔기 486, 잔기 499, 잔기 502, 잔기 520, 잔기 532, 잔기 536, 잔기 543, 및 잔기 571. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 전장 성숙 HSA 내 위치에 대해 넘버링된 다음 위치 중 어느 하나에 있다: 잔기 417, 잔기 442, 잔기 499, 및 잔기 502. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 전장 성숙 HSA 내 위치에 대해 넘버링된 다음 위치 중 어느 하나에 있다: 잔기 392, 잔기 399, 잔기 403, 잔기 411, 잔기 412, 잔기 414, 잔기 416, 잔기 418, 잔기 420, 잔기 423, 잔기 434, 잔기 437, 잔기 438, 잔기 445, 잔기 448, 잔기 450, 잔기 453, 잔기 461, 잔기 476, 잔기 477, 잔기 484, 잔기 485, 잔기 487, 잔기 488, 잔기 494, 잔기 497, 잔기 507, 잔기 509, 잔기 514, 잔기 529, 잔기 534, 잔기 537, 잔기 540, 잔기 551, 잔기 558, 잔기 559, 잔기 567, 잔기 568, 잔기 572. 특정 실시형태에서, 도메인 III 내 하나 이상의 아미노산 치환(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18) 또는 심지어 도메인 III 내 아미노산 치환 모두는 앞서 언급한 잔기에 있다. 앞서 언급한 잔기 중 임의의 하나 이상에서 아미노산 치환의 모든 조합을 포함하는 폴리펩타이드(예를 들어, HSA 변이체 및 키메라 폴리펩타이드)가 구체적으로 생각된다.
특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 아미노산 치환 중 적어도 하나는 다음 위치 중 어느 하나에 있으며, 전장 성숙 HSA 도메인 III 내 위치에 대해 넘버링된다: 잔기 383, 잔기 391, 잔기 411, 잔기 414, 잔기 416, 잔기 434, 잔기 442, 잔기 445, 잔기 450 및 잔기 509.
특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 아미노산 치환 중 적어도 하나는 E383A, E383G, E383I, E383L, E383V, N391A, N391G, N391I, N391L, N391V, Y411Q, Y41IN, K414S, K414T, Q416H, Q416P, G434C, G434S, G434T, E442K, E442R, R445F, R445W, R445Y, E450D, E450E, F509C, F509I, F509L, F509M, F509V, F509W 및 F509Y로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산 치환(예를 들어, 2, 3, 4, 5...) 또는 심지어 도메인 III 내 아미노산 치환 모두는 앞서 언급한 치환으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 아미노산 치환 중 적어도 하나는 전장 성숙 HSA 내 위치에 대해 넘버링된 다음 위치 중 어느 하나에 있다: 잔기 380, 잔기 381, 잔기 384, 잔기 387, 잔기 396, 잔기 401, 잔기 404, 잔기 405, 잔기 406, 잔기 409, 잔기 419, 잔기 421, 잔기 422, 잔기 424, 잔기 428, 잔기 430, 잔기 431, 잔기 433, 잔기 441, 잔기 457, 잔기 458, 잔기 463, 잔기 464, 잔기 466, 잔기 469, 잔기 470, 잔기 474, 잔기 475, 잔기 480, 잔기 481, 잔기 489, 잔기 491, 잔기 495, 잔기 500, 잔기 508, 잔기 510, 잔기 515, 잔기 516, 잔기 524, 잔기 525, 잔기 526, 잔기 528, 잔기 531, 잔기 535, 잔기 539, 잔기 544, 잔기 547, 잔기 576. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산 치환(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18) 또는 심지어 도메인 III 내 아미노산 치환 모두는 앞서 언급한 치환으로부터 선택된다. 임의의 하나 이상의 앞서 언급한 잔기에서 아미노산 치환의 모든 조합을 포함하는 폴리펩타이드(예를 들어, HSA 변이체 및 키메라 폴리펩타이드)가 구체적으로 생각된다.
특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 아미노산 치환 중 적어도 하나는 다음 위치 중 어느 하나에 있으며, 전장 성숙 HSA 도메인 III 내 위치에 대해 넘버링된다: 잔기 381, 잔기 401, 잔기 424, 잔기 457, 잔기 463, 잔기 495, 잔기 508, 잔기 515, 잔기 516, 잔기 524, 잔기 525, 잔기 526, 잔기 531, 잔기 535 및 잔기 539.
특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 아미노산 치환 중 적어도 하나는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: V381N, V381Q, Y401D, Y401E, V242A, V242G, V424I, V424L, V424N, V424Q, V424V, L457F, L457W, L457Y, L463N, L463Q, E495D, T508K, T508R, T508S, T515C, T515H, T515N, T515P, T515Q, T515S, L516F, L516S, L516T, L516W, L516Y, K524A, K524G, K524I, K524L, K524V, K525A, K525G, K525I, K525L, K525V, Q526C, Q526M, Q526S, Q526T, Q526Y, E531A, E531G, E531I, E531L, E531V, H535D, H535E, H535P, A539I, A539L 및 A539V. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산 치환(예를 들어, 2, 3, 4, 5...) 또는 심지어 도메인 III 내 아미노산 치환 모두는 앞서 언급한 치환으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 다양한 종에 걸쳐 보존되지 않은 잔기를 가진다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 다양한 종에 걸쳐 보존되지 않은 잔기를 가진다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 인간, 래트, 개, 토끼 및 소로부터의 혈청 알부민 단백질 중에서 보존되지 않은 잔기를 가진다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 인간, 래트, 개, 토끼 및 소로부터의 혈청 알부민 단백질 중에서 보존되지 않은 잔기를 가진다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 인간, 래트, 개, 토끼 및 소로부터의 혈청 알부민 단백질 중에서 보존되지 않은 잔기를 가진다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 인간, 래트, 개, 토끼 및 소로부터의 혈청 알부민 단백질 중에서 보존되지 않은 잔기를 가진다. 앞서 언급한 카테고리의 아미노산 치환의 임의의 조합을 포함하는 폴리펩타이드(예를 들어, HSA 변이체 및 HSA 부분이 있는 키메라 폴리펩타이드)가 또한 생각된다.
특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 전장 성숙 HSA 내 위치에 대해 넘버링된 다음 위치 중 어느 하나에 있다: 잔기 382, 잔기 385, 잔기 390, 잔기 397, 잔기 400, 잔기 402, 잔기 415, 잔기 429, 잔기 432, 잔기 435, 잔기 439, 잔기 440, 잔기 443, 잔기 444, 잔기 446, 잔기 447, 잔기 459, 잔기 471, 잔기 472, 잔기 478, 잔기 479, 잔기 483, 잔기 490, 잔기 492, 잔기 493, 잔기 503, 잔기 511, 잔기 517, 잔기 518, 잔기 519, 잔기 521, 잔기 538, 잔기 541, 잔기 542, 잔기 546, 잔기 549, 잔기 550, 잔기 552, 잔기 554, 잔기 556, 잔기 560, 잔기 562, 잔기 563, 잔기 565, 및 잔기 566. 특정 실시형태에서, 도메인 III 내 하나 이상의 아미노산 치환(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18) 또는 심지어 아미노산 치환 모두는 앞서 언급한 잔기 내에 있다. 임의의 하나 이상의 앞서 언급한 잔기 내에서 아미노산 치환의 임의의 조합을 포함하는 폴리펩타이드(예를 들어, HSA 변이체 및 HSA 부분이 있는 키메라 폴리펩타이드)가 구체적으로 생각된다.
특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 전장 성숙 HSA 내 위치에 대해 넘버링된 다음 위치 중 어느 하나에 있다: 잔기 402, 잔기 415, 잔기 447, 잔기 459, 잔기 511, 잔기 517, 잔기 519, 잔기 521, 잔기 538, 잔기 541, 및 잔기 566.
특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: K402A, K402G, K402I, K402L, K402V, V415C, V415S, V415T, P447S, P447T, Q459K, Q459R, L463N, L463Q, A511F, A511W, A511Y, S517C, S517F, S517M, S517T, S517W, S517Y, K519A, K519G, K519I, K519L, K519V, R521F, R521W, R521Y, K538F, K538W, K538Y, K541F, K541W, K541Y, T566F, T566W, 및 T566Y. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산 치환(예를 들어, 2, 3, 4, 5...) 또는 심지어 아미노산 치환 모두는 앞서 언급한 치환으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 표면 접근가능한 잔기를 가진다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 표면 접근가능한 잔기를 가진다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 다양한 종에 걸쳐 표면 접근가능하고 보존되는 잔기를 가진다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 다양한 종에 걸쳐 표면 접근가능하고 보존된 잔기를 둘 다 가진다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 적어도 하나의 아미노산 치환은 전장 성숙 HSA 내 위치에 대해 넘버링된 다음 위치 중 어느 하나에 있다: 잔기 383, 잔기 389, 잔기 391, 잔기 410, 잔기 417, 잔기 425, 잔기 442, 잔기 465, 잔기 467, 잔기 468, 잔기 486, 잔기 499, 잔기 502, 잔기 520, 잔기 532, 잔기 536, 잔기 543, 및 잔기 571. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 적어도 하나의 아미노산 치환은 전장 성숙 HSA 내 위치에 대해 넘버링된 다음 위치 중 어느 하나에 있다: 잔기 417, 잔기 442, 잔기 499, 및 잔기 502. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 적어도 하나의 아미노산 치환은 전장 성숙 HSA 내 위치에 대해 넘버링된 다음 위치 중 어느 하나에 있다: 잔기 383, 잔기 391, 및 잔기 442. 특정 실시형태에서, 도메인 III 내 하나 이상의 아미노산 치환(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18) 또는 심지어 아미노산 치환 모두는 앞서 언급한 잔기 내에 있다. 아미노산 치환의 앞서 언급한 카테고리의 임의의 조합을 포함하는 폴리펩타이드(예를 들어, HSA 변이체 및 키메라 폴리펩타이드)가 구체적으로 생각된다.특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 아미노산 치환 중 적어도 하나는 E383A, E383G, E383I, E383L, E383V, N391A, N391G, N391I, N391L, N391V, E442K, E442R로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산 치환(예를 들어, 2, 3, 4, 5...) 또는 심지어 도메인 III 내 아미노산 치환 모두는 앞서 언급한 치환으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 적어도 하나의 아미노산 치환은 단지 R410C; K466E; E479K; D494N; E501K; E505K; V533M; K536E536; K541E; D550A 또는 D550G; K560E; D563N; E565K; E570K; K573E; 또는 K574E의 치환이 아니다.
특정 실시형태에서, 폴리펩타이드(예를 들어, HSA 변이체 및 HSA 부분이 있는 키메라 폴리펩타이드)는 서열 번호 1과 적어도 80%, 85%, 또는 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HSA 도메인 III을 포함한다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III은 서열 번호 1과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III은 서열 번호 1과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, HSA 부분은 서열 번호 2의 대응하는 부분과 적어도 80%, 85%, 또는 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, HSA 부분은 서열 번호 2의 대응하는 부분과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, HSA 부분은 서열 번호 2의 대응하는 부분과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서는 HSA 도메인 III 내 하나 이상의 아미노산 치환에 더하여, 폴리펩타이드(예를 들어, HSA 변이체 및 HSA 부분이 있는 키메라 폴리펩타이드)는 도메인 III의 바깥쪽 HSA 부분에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서는 HSA 도메인 III 내 하나 이상의 아미노산 치환에 더하여 폴리펩타이드(예를 들어, HSA 변이체 및 HSA 부분이 있는 키메라 폴리펩타이드)가 또한 도메인 III 내에서 하나 이상의 아미노산 결실 및/또는 삽입(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8)을 포함할 수 있다는 것을 생각한다. HSA 부분이 하나 이상의 아미노산 결실 및/또는 삽입을 함유할 때, 이러한 삽입된 또는 결실된 잔기는 천연 HSA에 대한 잔기의 넘버링을 방해하지 않도록 글자를 사용하여 표시될 수 있다는 것을 주목한다. 예를 들어, 아미노산 잔기가 잔기 414와 415 사이에 삽입된다면, 이러한 잔기는 414a로 나타낼 수 있었다. 특정 실시형태에서, 삽입된 아미노산 잔기는 표면 접근가능 루프에 삽입되어 이러한 루프의 크기를 증가시킨다. 특정 실시형태에서, 삽입된 아미노산 잔기는 나선에 삽입되어 이러한 나선의 크기를 증가시키고 및/또는 구조를 변경시킨다.
특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 루프 2에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 HSA 도메인 III의 루프 2에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III은 1 내지 5개(1, 2, 3, 4, 5) 아미노산 치환을 포함하되, 상기 1 내지 5개 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 루프 2에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III은 HSA 도메인 III의 루프 2 내 1 내지 5개(1, 2, 3, 4, 또는 5) 아미노산 치환을 포함하며, 루프 2에 있지 않은 HSA 도메인 III 내 하나 이상의 부가적인 아미노산을 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 루프 3에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 HSA 도메인 III의 루프 3에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III은 1 내지 5개(1, 2, 3, 4, 5) 아미노산 치환을 포함하되, 상기 1 내지 5개 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 루프 3에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III은 HSA 도메인 III의 루프 3에서 1 내지 5개(1, 2, 3, 4, 또는 5) 아미노산 치환을 포함하며, 추가로 루프 3에 있지 않은 HSA 도메인 III에서 하나 이상의 부가적인 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 루프 6에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III의 상기 아미노산 치환 모두는 HSA 도메인 III의 루프 6에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III은 1 내지 18개(1, 2, 3, 4, 5, 6 등) 아미노산 치환을 포함하되, 상기 1 내지 18개 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 루프 6에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III은 HSA 도메인 III의 루프 6에서 1 내지 18개(1, 2, 3, 4, 5, 6 등) 아미노산 치환을 포함하며, 추가로 루프 6 내에 있지 않은 HSA 도메인 III 내 하나 이상의 추가적인 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 나선 7에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III의 상기 아미노산 치환 모두는 HSA 도메인 III의 나선 7에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III은 1 내지 6개(1, 2, 3, 4, 5, 또는 6) 아미노산 치환을 포함하되, 상기 1 내지 6개 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 나선 7에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III은 HSA 도메인 III의 나선 7에서 1 내지 6개(1, 2, 3, 4, 5, 또는 6) 아미노산 치환을 포함하며, 추가로 나선 7에 있지 않은 HSA 도메인 III 내 하나 이상의 부가적이 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 루프 7에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III의 상기 아미노산 치환 모두는 HSA 도메인 III의 루프 7에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III은 1 내지 3개(1, 2, 또는 3) 아미노산 치환을 포함하되, 상기 1 내지 3개의 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 루프 7 내에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III은 HSA 도메인 III의 루프 7 내 1 내지 3개(1, 2, 또는 3) 아미노산 치환을 포함하며, 추가로 루프 7 내에 있지 않은 HSA 도메인 III 내 하나 이상의 부가적인 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 나선 8에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 HSA 도메인 III의 나선 8에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III은 1 내지 18개(1, 2, 3, 4, 5, 6 등) 아미노산 치환을 포함하되, 상기 1 내지 18개 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 나선 8에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III은 HSA 도메인 III의 나선 8에서 1 내지 6개(1, 2, 3, 4, 5, 6 등) 아미노산 치환을 포함하며, 추가로 나선 8에 있지 않은 HSA 도메인 III 내 하나 이상의 부가적인 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 루프 8에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 HSA 도메인 III의 루프 8에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III은 1 내지 5개(1, 2, 3, 4, 5)의 아미노산 치환을 포함하되, 상기 1 내지 5개 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 루프 8 내에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III은 HSA 도메인 III의 루프 8 내에 1 내지 5개(1, 2, 3, 4, 또는 5) 아미노산 치환을 포함하며, 추가로 루프 8에 있지 않은 HSA 도메인 III 내 하나 이상의 부가적인 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 루프 9에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 HSA 도메인 III의 루프 9에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III은 1 내지 4개의 아미노산 치환을 포함하되, 상기 1 내지 4(1, 2, 3, 4) 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 루프 9에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III은 HSA 도메인 III의 루프 9에서 1 내지 5개(1, 2, 3, 4) 아미노산 치환을 포함하며, 추가로 루프 9에 있지 않은 HSA 도메인 III 내 하나 이상의 부가적인 아미노산 치환을 포함한다. 상기 논의한 바와 같이, 각 위치에서 독립적으로 잠재적인 아미노산 치환은 상기 설명한 임의의 치환 부류로부터 선택된다(예를 들어, 알라닌, 보존적 치환 등). 앞서 언급한 카테고리의 아미노산 치환의 임의의 조합을 포함하는 폴리펩타이드(예를 들어, HSA 변이체 및 키메라 폴리펩타이드)가 또한 생각된다.
특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 루프 2에 있지 않다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 루프 3 내에 있지 않다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 루프 6 내에 있지 않다. 특정 실시형태에서, 상기 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 나선 7에 있지 않다. 특정 실시형태에서, 상기 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 루프 7에 있지 않다. 특정 실시형태에서, 상기 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 나선 8에 있지 않다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 루프 8에 있지 않다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 루프 9에 있지 않다.
특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환은 루프 2, 3, 6, 7, 8 및 9로 이루어진 군으로부터 선택된 HSA 도메인 III의 적어도 2개의 루프에 있지 않다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환은 루프 2, 3, 6, 7, 8 및 9로 이루어진 군으로부터 선택된 HSA 도메인 III의 적어도 3개의 루프 내에 있지 않다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환은 루프 2, 3, 6, 7, 8 및 9로 이루어진 군으로부터 선택된 HSA 도메인 III의 적어도 4개의 루프 내에 있지 않다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환은 나선 7 또는 8에 있지 않다.
특정 실시형태에서, 도메인 III은 적어도 2개의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환은 루프 2, 3, 6, 7, 8 및 9 및 나선 7 및 8로 이루어진 군으로부터 선택된 HSA 도메인 III의 루프 및/또는 나선 중 적어도 2개에 있다. 특정 실시형태에서, 도메인 III은 적어도 3개의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환은 루프 2, 3, 6, 7, 8 및 9 및 나선 7 및 8로 이루어진 군으로부터 선택된 HSA 도메인 III의 루프 및/또는 나선 중 적어도 3개에 있다. 특정 실시형태에서, 도메인 III은 적어도 4개의 아미노산 치환을 포함하며 상기 아미노산 치환은 루프 2, 3, 6, 7, 8 및 9 및 나선 7 및 8로 이루어진 군으로부터 선택된 HSA 도메인 III의 루프 및/또는 나선 중 적어도 4개에 있다. 특정 실시형태에서, 도메인 III은 적어도 5개의 아미노산 치환을 포함하며 상기 아미노산 치환은 루프 2, 3, 6, 7, 8 및 9 및 나선 7 및 8로 이루어진 군으로부터 선택된 HSA 도메인 III의 루프 및/또는 나선 중 적어도 5개에 있다. 특정 실시형태에서, 도메인 III은 적어도 6개의 아미노산 치환을 포함하며 상기 아미노산 치환은 루프 2, 3, 6, 7, 8 및 9 및 나선 7 및 8로 이루어진 군으로부터 선택된 HSA 도메인 III의 루프 및/또는 나선 중 적어도 6개에 있다. 특정 실시형태에서, 도메인 III은 적어도 5개의 아미노산 치환을 포함하며 상기 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 각각의 루프 2, 3, 6, 7, 8 및 9에 있다. 특정 실시형태에서, 도메인 III은 적어도 6개의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환은 각각의 HSA 도메인 III의 루프 2, 3, 6, 7, 8 및 9에 있다. 특정 실시형태에서, 도메인 III은 적어도 2개의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환은 각각의 HSA 도메인 III의 나선 7 및 8에 있다.
특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 루프 2에 있고, 잔기 415, 잔기 416, 잔기 417, 잔기 418, 및 잔기 419로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 (2, 3, 4, 5) 아미노산 치환은 루프 2에 있고, 잔기 415, 잔기 416, 잔기 417, 잔기 418, 및 잔기 419로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 루프 2는 V415C, V415S, V415T, Q416H, 및 Q416P로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 루프 3에 있고, 잔기 439, 잔기 440, 잔기 441, 잔기 442, 및 잔기 443로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 하나 이상(2, 3, 4, 5)의 아미노산 치환은 루프 3에 있고, 잔기 439, 잔기 440, 잔기 441, 잔기 442, 및 잔기 443로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 루프 3 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 E442K, 및 E442R로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 루프 6에 있고, 잔기 492, 잔기 493, 잔기 494, 잔기 495, 잔기 496, 잔기 497, 잔기 498, 잔기 499, 잔기 500, 잔기 501, 잔기 502, 잔기 503, 잔기 504, 잔기 505, 잔기 506, 잔기 507, 잔기 508, 및 잔기 509로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 등) 아미노산 치환은 루프 6에 있고, 잔기 492, 잔기 493, 잔기 494, 잔기 495, 잔기 496, 잔기 497, 잔기 498, 잔기 499, 잔기 500, 잔기 501, 잔기 502, 잔기 503, 잔기 504, 잔기 505, 잔기 506, 잔기 507, 잔기 508, 및 잔기 509로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 루프 6 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 T506F, T506W, T506Y, T508K, T508R, T508S, F509C, F509I, F509L, F509M, F509V, F509W 및 F509Y로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 나선 7에 있고, 잔기 510, 잔기 511, 잔기 512, 잔기 513, 잔기 514, 및 잔기 515로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의(2, 3, 4, 5, 6) 아미노산 치환은 나선 7에 있고, 잔기 510, 잔기 511, 잔기 512, 잔기 513, 잔기 514, 및 잔기 515로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 루프 7 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 A51IF, A511W, A511Y, D512F, D512W, D512Y, T515C, T515H, T515N, T515P, T515Q, 및 T515S로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 루프 7에 있고, 잔기 516, 잔기 517, 및 잔기 518로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의(2, 3) 아미노산 치환은 루프 7에 있고, 잔기 516, 잔기 517, 및 잔기 518로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 루프 7 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 L516F, L516S, L516T, L516W, L516Y, S517C, S517F, S517M, S517T, S517W, 및 S517Y로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 나선 8에 있고, 잔기 519, 잔기 518, 잔기 519, 잔기 520, 잔기 521, 잔기 522, 잔기 523, 잔기 524, 잔기 525, 잔기 526, 잔기 527, 잔기 528, 잔기 529, 잔기 530, 잔기 531, 잔기 532, 잔기 533, 잔기 534, 잔기 535, 및 잔기 536으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의(2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 등) 아미노산 치환은 나선 8에 있고, 잔기 519, 잔기 518, 잔기 519, 잔기 520, 잔기 521, 잔기 522, 잔기 523, 잔기 524, 잔기 525, 잔기 526, 잔기 527, 잔기 528, 잔기 529, 잔기 530, 잔기 531, 잔기 532, 잔기 533, 잔기 534, 잔기 535, 및 잔기 536으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 나선 8 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 K519A, K519G, K519I, K519L, K519V, R521F, R521W, R521Y, I523A, I523D, I523E, I523F, I523G, I523I, I523K, I523L, I523N, I523Q, I523R, I523V, I523W, I523Y, K524A, K524G, K524I, K524L, K524V, K525A, K525G, K525I, K525L, K525V, Q526C, Q526M, Q526S, Q526T, Q526Y, T527F, T527W, T527Y, E531A, E531G, E531I, E531L, E531V, H535D, H535E, 및 H535P로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 루프 8에 있고, 잔기 537, 잔기 538, 잔기 539, 잔기 540, 및 잔기 541로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의(2, 3, 4, 5) 아미노산 치환은 루프 8에 있고, 잔기 537, 잔기 538, 잔기 539, 잔기 540, 잔기 541로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 루프 9에 있고, 잔기 561, 잔기 562, 잔기 563, 잔기 564로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 루프 8 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 K538F, K538W, K538Y, A539I, A539L, A539V, K541F, K541W, K541Y로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의(2, 3, 4) 아미노산 치환은 루프 9에 있고, 잔기 561, 잔기 562, 잔기 563, 잔기 564로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 루프 9 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 A561F, A561W, 및 A561Y로부터 선택된다.
예를 들어 HSA 도메인 III 루프의 길이를 증가시키거나 감소시키는 도메인 III 내 삽입 또는 결실이 추가적으로 생각된다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 삽입 또는 결실은 루프 2의 길이를 변경시킨다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 삽입 또는 결실은 루프 3의 길이를 변경시킨다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 삽입 또는 결실은 루프 6의 길이를 변경시킨다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 삽입 또는 결실은 나선 7의 길이를 변경시킨다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 삽입 또는 결실은 루프 7의 길이를 변경시킨다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 삽입 또는 결실은 나선 8 길이를 변경시킨다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 삽입 또는 결실은 루프 8 길이를 변경시킨다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 삽입 또는 결실은 루프 9의 길이를 변경시킨다. 특정 실시형태에서, 도메인 III 내 상기 삽입 또는 결실은 루프 2, 3, 6, 7, 8 및 9 및 나선 7 및 8로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 루프 및/또는 나선의 길이를 변경시킨다. 특정 실시형태에서, 도메인 III 내 상기 삽입 또는 결실은 루프 2, 3, 6, 7, 8 및 9 및 나선 7 및 8로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 3개의 루프 및/또는 나선의 길이를 변경시킨다. 특정 실시형태에서, 도메인 III 내 상기 삽입 또는 결실은 루프 2, 3, 6, 7, 8 및 9 및 나선 7 및 8로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 4개의 루프 및/또는 나선의 길이를 변경시킨다. 특정 실시형태에서, 도메인 III 내 상기 삽입 또는 결실은 루프 2, 3, 6, 7, 8 및 9 및 나선 7 및 8로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 5개의 루프 및/또는 나선의 길이를 변경시킨다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 삽입 또는 결실은 HSA 도메인 III의 각각의 루프 2, 3, 6, 7, 8 및 9의 길이를 변경시킨다. 다중 루프 및/또는 나선이 변경될 때, 본 명세서는 루프 및/또는 나선이 독립적으로 변경되며, 하나 이상의 루프/나선이 삽입에 의해 증가될 수도 있고, 하나 이상의 루프/나선이 결실에 의해 감소될 수도 있다는 것을 주목한다.
도메인 III이 아미노산의 삽입 또는 결실을 포함하는 실시형태에 대해, 본 명세서는 하나의 아미노산의 삽입 또는 결실을 고려한다. 또한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 아미노산과 같은 1 초과의 아미노산의 삽입 또는 결실이 고려된다. 특정 실시형태에서, 본 명세서는 10개 이상의 아미노산 잔기, 예컨대 10-20, 20-40, 40-50, 50-100개 아미노산의 삽입을 고려한다. 본 명세서의 키메라 폴리펩타이드 및 HSA 변이체 폴리펩타이드와 일치하고, 삽입 또는 결실을 포함하는 조성물은 그것들이 FcRn 결합 활성을 보유하는지를 확인하기 위하여 시험한다. 바람직한 조성물은 대조군에 대해 개선된 FcRn 결합 및/또는 혈청 반감기를 제공하는 조성물이다.
명확성의 목적을 위해, 본 명세서는 임의의 앞서 언급한 것 또는 다음의 양태 및 실시형태의 조합을 구체적으로 고려한다. HSA 부분을 포함하는 키메라 폴리펩타이드뿐만 아니라 HSA 부분을 포함하는 변이체 HSA 폴리펩타이드의 맥락에서, 예컨대 HSA 부분은 도메인 III, 또는 이것의 FcRn 결합 부분을 포함한다. 추가로 본 명세서에서 설명하는 바와 같이, HSA 부분의 도메인 III은 1 내지 18개의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시형태에서, HSA 부분의 도메인 III은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18개 아미노산 치환을 포함한다. 예시적인 아미노산 치환은 (i) 알라닌으로 대체; (ii) 보존적 아미노산 치환; (iii) 비보존적 아미노산 치환을 포함한다. 본 명세서는 주어진 폴리펩타이드의 도메인 III 내 모든 아미노산 치환이 아미노산 치환의 이 카테고리 중 하나의 구성원이 될 수 있고, 또한 주어진 폴리펩타이드의 도메인 III 내 각 아미노산 치환이 이 카테고리로부터 개별적이고 독립적으로 선택될 수 있다는 것을 고려한다. 특정 실시형태에서, 도메인 III 내 천연 시스테인 잔기는 유지되며 치환되지 않는다. 특정 실시형태에서, 도메인 III 내 천연 프롤린 잔기는 유지되며 치환되지 않는다. 특정 실시형태에서, 도메인 III 내 천연 시스테인 잔기 및 천연 프롤린 잔기는 유지되며 치환되지 않는다. 특정 실시형태에서, 시스테인 잔기는 치환되지 않는다(예를 들어, 시스테인은 천연 잔기를 대신하여 사용되지 않는다). 특정 실시형태에서, 프롤린 잔기는 치환되지 않는다(예를 들어, 프롤린은 천연 잔기를 대신하여 사용되지 않는다). 다른 실시형태에서, 20개의 아미노산 중 임의의 하나는 주어진 천연 잔기에 대해 치환되도록 사용된다.
아미노산 치환의 앞서 언급한 부류의 임의의 조합을 포함하는 HSA 변이체 및 키메라 폴리펩타이드가 또한 생각된다.
본 발명은 본 명세서에서 설명한 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 서열 내 아미노산을 포함하는 HSA 부분이 있는 변이체 및 키메라 폴리펩타이드를 포함한다. 본 명세서에서 설명된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열은 보존적 아미노산 치환뿐만 아니라 아미노산 결실 및/또는 삽입을 포함하는 서열을 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 제1 아미노산과 유사한 화학적 및/또는 물리적 특성(예를 들어, 전하, 구조, 극성, 소수성/친수성)을 가지는 제2 아미노산에 의한 제1 아미노산의 대체를 말한다. 보존적 아미노산 치환은 하나의 아미노산의 다음의 그룹 내의 다른 것에 의한 대체를 포함한다: 리신(K), 아르기닌(R) 및 히스티딘(H); 아스파르테이트(D) 및 글루타메이트(E); 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 티로신(Y), K, R, H, D 및 E; 알라닌(A), 발린(V), 류신(L), 아이소류신(I), 프롤린(P), 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 메티오닌(M), 시스테인(C) 및 글라이신(G); F, W 및 Y; C, S 및 T.
특정 실시형태에서, 상기 HSA 변이체 폴리펩타이드는 실질적으로 정제된다. 특정 실시형태에서, 상기 키메라 폴리펩타이드는 실질적으로 정제된다. 특정 양태에서, 본 발명은 본 명세서의 HSA 변이체 또는 키메라 폴리펩타이드, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 실시형태에서, 조성물은 멸균 조성물이다. 특정 실시형태에서, 조성물을 비발열성이다.
6.4 조합 도메인 III 돌연변이체
이 발명은 도메인 III을 포함하는 HSa 부분의 조합 돌연변이체뿐만 아니라 절단 돌연변이의 생성 집합을 추가로 고려하며, 이는 생활성 변이체 서열을 확인하는데 특히 유용하다. 조합적으로 유래된 변이체는 자연적으로 발생하는 HSA 폴리펩타이드에 대해 선택적인 효능을 가지도록 생성될 수 있다. 마찬가지로, 돌연변이유발은 대응하는 야생형 HSA 폴리펩타이드보다 극적으로 상이한 세포내 반감기를 가지는 변이체를 생기게 할 수 있다. 예를 들어, 변경된 단백질은 단백질 분해 또는 관심 단백질의 파괴 또는 다른 불활성화를 초래하는 다른 세포 처리로 더 안정한 또는 덜 안정하게 제공될 수 있다. 이러한 변이체는 그것의 반감기를 조절함으로써 HSA 폴리펩타이드 수준을 변경시키도록 이용될 수 있다. 잠재적 HSA 변이체 서열의 라이브러리가, 예를 들어 축퇴 올리고뉴클레오타이드 서열로부터 생성될 수 있는 다양한 방법이 있다. 축퇴 유전자 서열의 화학적 합성은 자동 DNA 신시사이저에서 수행될 수 있고, 다음으로 합성 유전자는 발현을 위해 적절한 유전자에 결찰된다. 한 혼합물에서 유전자의 축퇴 설정 목적은 원하는 설정의 잠재적 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 모든 서열을 제공하는 것이다. 축퇴 올리고뉴클레오타이드의 합성은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al, (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp273-289; Itakura et al, (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al, (1984) Science 198: 1056; Ike et al, (1983) Nucleic Acid Res. 11:477]을 참조). 이러한 기법은 다른 단백질의 방향진화(directed evolution)에 사용되었다(예를 들어, 문헌[Scott et al, (1990) Science 249:386-390; Roberts et al, (1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin et al, (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al, (1990) PNAS USA 87: 6378-6382]뿐만 아니라; 미국특허 제5,223,409호, 제5,198,346호 및 제5,096,815호를 참조).
대안으로, 다른 형태의 돌연변이유발이 조합 라이브러리를 만들기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, HSA 폴리펩타이드 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 등을 사용하여 스크리닝 함으로써(Ruf et al, (1994) Biochemistry 33: 1565-1572; Wang et al, (1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balint et al, (1993) Gene 137: 109-118; Grodberg et al, (1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601; Nagashima et al, (1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892; Lowman et al, (1991) Biochemistry 30: 10832-10838; 및 Cunningham et al, (1989) Science 244: 1081-1085); 링커 스캐닝 돌연변이 유발에 의해(Gustin et al, (1993) Virology 193:653-660; Brown et al, (1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnight et al, (1982) Science 232:316); 포화 돌연변이에 의해(Meyers et al, (1986) Science 232:613); PCR 돌연변이유발에 의해(Leung et al., (1989) Method Cell Mol Biol 1: 11-19); 또는 화학적 돌연변이유발 등을 포함하는 무작위 돌연변이유발에 의해(Miller et al, (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; 및 Greener et al, (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34) 라이브러리로부터 변이체가 만들어지고, 분리될 수 있다. 특히 조합 설정에서 링커 스캐닝 돌연변이유발은 HSA 폴리펩타이드의 절단된(생활성) 형태를 확인하기 위한 매력적인 방법이다. HSA 폴리펩타이드 변이체의 라이브러리를 발생시키고 스크리닝하기 위한 부가적인 방법은 본 명세서에서 제공되며, 예를 들어 문헌[Section 8entitled "Exemplifications"]에서 제공된다. 특히 조합 HSA 도메인 III 돌연변이체 라이브러리의 발생 및 스크리닝에 유용한 구체적 방법에 대해 섹션 8.10 및 8.11 참조.
본 명세서의 폴리펩타이드에서 아미노산 치환을 위해 상기 설명한 임의의 실시형태는 펩타이드의 라이브러리를 만들기 위하여 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 조합적으로 유래된 변이체는 HSA 도메인 III 내 잔기에서 발생된다. 특정 실시형태에서, 도메인 III 돌연변이는 다음 중 하나 이상의 맥락에서 도입되고 스크리닝된다: (i) 변이체 도메인 III 구성체 단독; (ii) 전장 HSA의 맥락에서 존재하는 변이체 도메인 III 구성체; 또는 (iii) 절단된 HSA의 맥락에서 또는 적어도 도메인 III의 포함하는 키메라 폴리펩타이드. 특정 실시형태에서, 펩타이드의 라이브러리는 FcRn에 대해 증가된 친화도 및 출발 폴리펩타이드에 대해 증가된 혈청 반감기 중 하나 또는 둘 다를 가지는 변이체에 대해 스크리닝된다. 특정 실시형태에서, 변이체는 적용에서 설명한 표준 시험관 내 분석을 사용하여 평가한다(예를 들어, 유세포 분석기). 특정 실시형태에서, FcRn에 대해 개선된 친화도를 나타내는 변이체(들)이 확인된다. 다른 실시형태에서, FcRn에 대해 개선된 친화도가 중성 pH(예를 들어 대략 7.4의 pH)가 아닌 단지 산성 pH(예를 들어, 대략 5.5의 pH)에서만 생기는지 여부를 결정하기 위하여 변이체가 스크리닝된다.
특정 실시형태에서, 조합적으로 유래된 변이체는 전장 성숙 HSA의 위치에 대해 넘버링된 다음 위치 중 어느 하나에서 적어도 2개의 아미노산 치환을 포함한다: 잔기 407, 잔기 415, 잔기 463, 잔기 495, 잔기 508, 잔기 509, 잔기 511, 잔기 512, 잔기 515, 잔기 516, 잔기 517, 잔기 521, 잔기 523, 잔기 524, 잔기 526, 잔기 527 및 잔기 557.
특정 실시형태에서, 조합적으로 유래된 변이체는 L407N, L407Y, V415T, L463N, L463F, E495D, T508R, T508S, F509M, F509W, F509I, A511F, D512Y, D512M, T515Q, L516T, L516W, S517W, R521W, I523D, I523E, I523F, I523G, I523K, I523R, K524L, Q526A, Q526M, Q526Y, T527Y, 및 T557G로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 아미노산 치환을 포함한다.
특정 실시형태에서, 조합적으로 유래된 변이체는 (a) 잔기 383 및 413; (b) 잔기 401 및 523; (c) 잔기 407 및 447; (d) 잔기 407 및 447 및 539; (e) 잔기 407 및 509; (f) 잔기 407 및 526; (g) 잔기 411 및 535; (h) 잔기 414 및 456; (i) 잔기 415 및 569; (j) 잔기 426 및 526; (k) 잔기 442 및 450 및 459; (l) 잔기 463 및 508; (m) 잔기 508 및 519 및 525; (n) 잔기 509 및 527; (o) 잔기 523 및 538; (p) 잔기 526 및 557; 및 (q) 잔기 541 및 561로 이루어진 군으로부터 선택된 전장 성숙 HSA 내 위치에 대해 넘버링된 위치에서 HSA 도메인 III 내 아미노산 치환을 포함한다.
특정 실시형태에서, 조합적으로 유래된 변이체는 다양한 종에 걸쳐 보존된 잔기 내에서 생성된다. 특정 실시형태에서, 조합적으로 유래된 변이체는 표면 접근가능한 잔기 중에서 발생된다. 특정 실시형태에서, 조합적으로 유래된 변이체는 다양한 종에 걸쳐 표면 접근가능하고 보존된 잔기 중에서 발생된다. 특정 실시형태에서, 조합적으로 유래된 변이체는 다양한 종에 걸쳐 보존되지만 닭 HSA에서 보존되지 않는 잔기 중에서 발생된다.
특정 양태에서, 본 명세서는 다수의 폴리펩타이드를 포함하는 라이브러리를 제공하되, 각각의 상기 다수의 폴리펩타이드는 HSA 도메인 III 또는 이것의 FcRn 결합 단편을 포함하고, 각각의 상기 다수의 폴리펩타이드는 인간, 돼지, 래트, 마우스, 개, 토끼, 소, 닭, 당나귀, 모래쥐, 양, 고양이 및 말로부터의 혈청 알부민 단백질 중에서 보존된 상기 HSA 도메인 III 내 잔기 중 적어도 하나의 아미노산 치환을 독립적으로 포함한다.
특정 양태에서, 본 명세서는 다수의 폴리펩타이드를 포함하는 라이브러리를 제공하되, 각각의 상기 다수의 폴리펩타이드는 HSA 도메인 III 또는 이것의 FcRn 결합 단편을 포함하며, 각각의 상기 다수의 폴리펩타이드는 인간, 돼지, 래트, 마우스, 개, 토끼, 소, 당나귀, 모래쥐, 양, 고양이 및 말로부터의 혈청 알부민 단백질 중에서 보존되고, 닭의 혈청 알부민에서 보존되지 않는 상기 HSA 도메인 III 내 잔기 중 적어도 하나의 아미노산 치환을 독립적으로 포함한다.
특정 양태에서, 본 명세서는 다수의 폴리펩타이드를 포함하는 라이브러리를 제공하되, 각각의 상기 다수의 폴리펩타이드는 HSA 도메인 III, 또는 이것의 FcRn 결합 단편을 포함하고, 각각의 상기 다수의 폴리펩타이드는 표면 접근가능 잔기인 상기 HSA 도메인 III 내 잔기 중 적어도 하나의 아미노산 치환을 독립적으로 포함한다.
특정 양태에서, 본 명세서는 다수의 폴리펩타이드를 포함하는 라이브러리를 제공하되, 각각의 상기 다수의 폴리펩타이드는 HSA 도메인 III, 또는 이것의 FcRn 결합 단편을 포함하고, 각각의 상기 다수의 폴리펩타이드는 (i) 표면 접근가능 잔기이고 (ii) 인간, 돼지, 래트, 마우스, 개, 토끼, 소, 당나귀, 모래쥐, 양, 고양이 및 말로부터의 혈청 알부민 단백질 중에서 보존된 상기 HSA 도메인 III 내 잔기 중 적어도 하나의 아미노산 치환을 독립적으로 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 표면 접근가능 잔기는 HSA 도메인 III의 루프 2에 있다. 특정 실시형태에서, 상기 표면 접근가능 잔기는 HSA 도메인 III의 루프 3에 있다. 특정 실시형태에서, 상기 표면 접근가능 잔기는 HSA 도메인 III의 루프 6에 있다. 특정 실시형태에서, 상기 표면 접근가능 잔기는 HSA 도메인 III의 나선 7에 있다. 특정 실시형태에서, 상기 표면 접근가능 잔기는 HSA 도메인 III의 루프 7에 있다. 특정 실시형태에서, 상기 표면 접근가능 잔기는 HSA 도메인 III의 나선 8에 있다. 특정 실시형태에서, 상기 표면 접근가능 잔기는 HSA 도메인 III의 루프 8에 있다. 특정 실시형태에서, 상기 표면 접근가능 잔기는 HSA 도메인 III의 루프 9에 있다.
특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 적어도 하나의 아미노산 치환은 전장 성숙 HSA 내 위치에 대해 넘버링된 다음 위치 중 어느 하나에 있다: 잔기 383, 잔기 389, 잔기 391, 잔기 410, 잔기 417, 잔기 425, 잔기 442, 잔기 465, 잔기 467, 잔기 468, 잔기 486, 잔기 499, 잔기 502, 잔기 520, 잔기 532, 잔기 536, 잔기 543, 및 잔기 571. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 적어도 하나의 아미노산 치환은 전장 성숙 HSA 내 위치에 대해 넘버링된 다음 위치 중 어느 하나에 있다: 잔기 417, 잔기 442, 잔기 499, 및 잔기 502.
특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 적어도 하나의 아미노산 치환은 전장 성숙 HSA 내 위치에 대해 넘버링된 다음 위치 중 어느 하나에 있다: 잔기 392, 잔기 399, 잔기 403, 잔기 411, 잔기 412, 잔기 414, 잔기 416, 잔기 418, 잔기 420, 잔기 423, 잔기 434, 잔기 437, 잔기 438, 잔기 445, 잔기 448, 잔기 450, 잔기 453, 잔기 461, 잔기 476, 잔기 477, 잔기 484, 잔기 485, 잔기 487, 잔기 488, 잔기 494, 잔기 497, 잔기 507, 잔기 509, 잔기 514, 잔기 529, 잔기 534, 잔기 537, 잔기 540, 잔기 551, 잔기 558, 잔기 559, 잔기 567, 잔기 568, 잔기 572. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 적어도 하나의 아미노산 치환은 전장 성숙 HSA 내 위치에 대해 넘버링된 다음 위치 중 어느 하나에 있다: 잔기 380, 잔기 381, 잔기 384, 잔기 387, 잔기 396, 잔기 401, 잔기 404, 잔기 405, 잔기 406, 잔기 409, 잔기 419, 잔기 421, 잔기 422, 잔기 424, 잔기 428, 잔기 430, 잔기 431, 잔기 433, 잔기 441, 잔기 457, 잔기 458, 잔기 463, 잔기 464, 잔기 466, 잔기 469, 잔기 470, 잔기 474, 잔기 475, 잔기 480, 잔기 481, 잔기 489, 잔기 491, 잔기 495, 잔기 500, 잔기 508, 잔기 510, 잔기 515, 잔기 516, 잔기 524, 잔기 525, 잔기 526, 잔기 528, 잔기 531, 잔기 535, 잔기 539, 잔기 544, 잔기 547, 잔기 576.
특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 루프 2에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 HSA 도메인 III의 루프 2에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 루프 2에 있고, 루프 2에 있지 않은 HSA 도메인 III 내 하나 이상의 추가적인 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 루프 3에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 HSA 도메인 III의 루프 3에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III은 HSA 도메인 III의 루프 3 내 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하며, 추가로 루프 3 내에 있지 않은 HSA 도메인 III 내 하나 이상의 부가적인 치환을 포함한다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 루프 6에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 HSA 도메인 III의 루프 6 내에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인은 HSA 도메인 III의 루프 6 내 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하며, 추가로 루프 6 내에 있지 않은 HSA 도메인 III 내 하나 이상의 부가적인 치환을 포함한다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 나선 7 내에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 HSA 도메인 III의 나선 7에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인은 HSA 도메인 III의 나선 7 내에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하며, 추가로 나선 7 내에 있지 않은 HSA 도메인 III 내 하나 이상의 부가적인 치환을 포함한다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 루프 7에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 HSA 도메인 III의 루프 7 내에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인은 HSA 도메인 III의 루프 7 내에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, 추가로 루프 7에 있지 않은 HSA 도메인 III 내 하나 이상의 부가적인 아님노산 치환을 포함한다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 나선 8에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 HSA 도메인 III의 나선 8에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인은 HSA 도메인 III의 나선 8 내 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하며, 추가로 나선 8 내에 있지 않은 HSA 도메인 III 내 하나 이상의 부가적인 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 루프 8에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 HSA 도메인 III의 루프 8 내에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III은 HSA 도메인 III의 루프 8 내 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, 추가로 루프 8 내에 있지 않은 HSA 도메인 내 하나 이상의 부가적인 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 루프 9에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 HSA 도메인 III의 루프 9에 있다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III은 HSA 도메인 III 내 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, 추가로 루프 9 내에 있지 않은 HSA 도메인 III 내 하나 이상의 부가적인 아미노산 치환을 포함한다.
임의의 앞서 언급한 것 또는 다음의 양태 또는 실시형태의 특정 실시형태에서, 아미노산 치환은 잔기의 알라닌으로 변경일 수 있다. 임의의 앞서 언급한 것 또는 다음의 양태 또는 실시형태의 특정 실시형태에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환일 수 있되, 잔기는 유사한 전하 및 다른 특성을 가지는 잔기로 대체된다. 임의의 앞서 언급한 것 또는 다음의 양태 또는 실시형태의 특정 실시형태에서, 아미노산 치환은 비보존적 아미노산 치환일 수 있되, 잔기는 유사한 전하 또는 다른 특성을 가지지 않는 잔기로 대체된다. 임의의 앞서 언급한 것 또는 다음의 양태 또는 실시형태의 특정 실시형태에서, 아미노산 치환은 잔기의 임의의 다른 잔기로 변경일 수 있다. HSA 부분이 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함할 때, 치환은 아미노산 치환의 앞서 언급한 카테고리 중 임의의 하나 또는 임의의 조합에 속할 수 있다. 예를 들어, 모든 치환은 알라닌으로 변경될 수 있고, 또는 보존적 아미노산 치환일 수 있고 또는 비보존적 아미노산 치환일 수 있다. 대안으로 아미노산 치환은 예를 들어 알라닌으로 하나의 변경, 하나의 보존적 아미노산 치환, 및 하나의 비보존적 아미노산 치환과 같은 임의의 조합을 포함할 수 있다.
점 돌연변이 및 절단에 의해 만들어진 조합 라이브러리의 유전자 생성물을 스크리닝하기 위해, 그것에 대하여 특정 특성을 가지는 유전자 생성물에 대해 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 광범위한 기법이 알려져 있다. 이러한 기법은 HSA 폴리펩타이드의 조합 돌연변이에 의해 생성된 유전자 라이브러리의 빠른 스크리닝에 일반적으로 적용가능할 것이다. 거대 유전자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 대부분의 널리 사용된 기법은 전형적으로 복제가능한 발현 벡터에 유전자 라이브러리를 클로닝하는 단계, 벡터의 결과 라이브러리와 함께 적절한 세포를 형질변환시키는 단계, 및 원하는 활성의 검출이 생성물이 검출된 유전자를 암호화하는 벡터의 상대적으로 용이한 분리를 가능하게 하는 조건 하에서 조합 유전자를 발현시키는 단계를 포함한다. 이하에 설명하는 각각의 예시적 분석은 조합 돌연변이유발 기법에 의해 만들어진 상당수의 축퇴 서열을 스크리닝하기 위한 필요로서 고속대량(through-put) 분석으로 처리가능하다.
특정 실시형태에서, HSA 폴리펩타이드는 펩타이드 및 펩티도미메틱(peptidomimetic)을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "펩티도미메틱"은 자연적으로 발생하지 않는 아미노산, 펩토이드 등을 함유하는 화학적으로 변형된 펩타이드 및 펩타이드 유사 분자를 포함한다. 펩티도미메틱은 피험자에게 투여될 때 향상된 안정성을 포함하여, 펩타이드 이상의 다양한 이점을 제공한다. 펩티도미메틱을 확인하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며 잠재적 펩티도미메틱의 라이브러리를 함유하는 데이터베이스의 스크리닝을 포함한다. 예를 들어, 캠브릿지 구조 데이터베이스는 알려진 결정 구조를 가지는 300,000개 초과의 화합물의 수집을 포함한다(Allen et al., Acta Crystallogr. Section B, 35:2331 (1979)). 표적 분자의 결정 구조가 이용가능하지 않을 경우, 예를 들어 프로그램 CONCORD(Rusinko et al, J. Chem. Inf. Comput. Sci. 29:251 (1989))를 사용하여 구조가 만들어질 수 있다. 다른 데이터베이스인 Available Chemicals Directory(Molecular Design Limited, Informations Systems; San Leandro Calif)는 상업적으로 이용가능하고 또한 HSA 폴리펩타이드의 잠재적 펩티도미메틱을 확인하기 위하여 조사될 수 있는 약 100,000개의 화합물을 포함한다.
특정 실시형태에서, HSA 폴리펩타이드는 번역 후 변형을 추가로 포함할 수 있다. 예시적인 번역 후 단백질 변형은 인산화, 아세틸화, 메틸화, ADP-리보실화, 유비퀴틴화, 글라이코실화, 카보닐화, 스모화(sumoylation), 바이오틴화, 또는 폴리펩타이드 측쇄 또는 소수성 기의 부가를 포함한다. 결과로서, 변형된 HSA 폴리펩타이드는 지질, 다당류 또는 단당류, 및 인산염와 같은 비아미노산 구성요소를 함유할 수 있다. HSA 폴리펩타이드의 작용기 상에 이러한 비아미노산 구성요소의 효과는 그것의 생물학적 활성, 예를 들어 그것의 FcRn과 결합하는 능력에 대해 시험될 수 있다. 천연 HSA 폴리펩타이드는 글라이코실화될 수 있도록 주어지며, 특정 실시형태에서 본 명세서에 따르는 키메라 폴리펩타이드에 사용된 HSA 폴리펩타이드는 글라이코실화된다. 특정 실시형태에서, 글라이코실화의 수준 및 패턴은 천연 HSA 폴리펩타이드의 그것과 동일하거나 또는 실질적으로 동일하다. 다른 실시형태에서, 글라이코실화의 수준 및/또는 패턴은 천연 HSA 폴리펩타이드의 그것과 다르다(예를 들어, 저글라이코실화, 과글라이코실화, 글라이코실화되지 않음).
본 발명의 특정 실시형태에서, HSA 부분을 포함하는 폴리펩타이드(예를 들어, HSA 변이체 또는 키메라 폴리펩타이드)는 비단백질제에 컨쥬게이트될 수 없다. 이러한 비단백질제는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 핵산 분자, 화학작용제, 유기 분자 등을 포함하며, 이것의 각각은 예를 들어 천연 생성물 스크리닝과 같이 천연 공급원으로부터 유래될 수 있고, 또는 화학적으로 합성될 수 있다. 특정 실시형태에서, HSA 부분은 비단백질제에 화학적으로 컨쥬게이트된다.
본 발명의 한 구체적 실시형태에서, HSA 폴리펩타이드는 비단백질성 폴리머로 변형될 수 있다. 한 구체적 실시형태에서, 미국특허 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호 또는 제4,179,337호에서 설명되는 방식으로 폴리머는 폴리에틸렌 글라이콜("PEG"), 폴리프로필렌 글라이콜, 또는 폴리옥시알킬렌이다. PEG는 잘 알려진 상업적으로 이용가능한 수용성 폴리머이며, 또는 당업계에 잘 알려진 방법에 따라서 에틸렌 글라이콜의 고리 열림 폴리머화에 의해 제조될 수 있다(Sandler and Kara, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161).
특정 실시형태에서, HSA 폴리펩타이드의 단편 또는 변이체는 바람직하게는 천연 HSA 폴리펩타이드와 관련된 생물학적 활성의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%를 보유할 것이다. 특정 실시형태에서, HSA 폴리펩타이드의 단편 또는 변이체는 천연 단백질의 반감기에 비해 향상된 반감기(t1 /2)를 가진다. 반감기가 향상된 실시형태에 대해, HSA 단편 또는 변이체의 반감기는 천연 HSA 단백질의 반감기에 비해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 400% 또는 500%, 또는 심지어 1000%로 향상된다. 일부 실시형태에서, 단백질 반감기는 완충염 용액 또는 혈청에서와 같이 시험관 내에서 결정된다. 다른 실시형태에서, 단백질 반감기는 생체내 반감기, 예컨대 동물의 혈청 또는 다른 체액 내 단백질의 반감기이다.
특정 양태에서, HSA 부분을 포함하는 폴리펩타이드는 하나 이상의 융합 도메인을 추가로 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 이러한 융합 도메인의 잘 알려진 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 폴리히스티딘, Glu-Glu, 글루타티온 S 트랜스퍼라제(GST), 티오레독신, 단백질 A, 단백질 G 및 면역글로불린 중쇄 불변 영역(Fc), 말토스 결합 단백질(MBP)를 포함하는데, 이는 친화도 크로마토그래피에 의해 융합 단백질의 분리에 특히 유용하다. 친화도 정제의 목적을 위해, 글루타티온-, 아밀라제- 및 니켈- 또는 코발트- 컨쥬게이트된 수지와 같은 친화도 크로마토그래피를 위해 적절한 기질이 사용된다. 융합 도메인은 또한 "에피토프 태그"를 포함하는데, 이는 보통 특이적 항체에 대해 이용가능한 짧은 펩타이드 서열이다. 특이적 단클론성 항체에 대해 용이하게 이용가능한 잘 알려진 에피토프 태그는 플래그(FLAG), 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA), 및 c-myc 태그를 포함한다. 일부 경우에, 융합 도메인은 인자 Xa 또는 트롬빈과 같은 프로테아제 절단 자리를 가지는데, 이는 융합 단백질을 부분적으로 분해하기 위한 적절한 프로테아제를 허용하고, 이것에 의해 그것으로부터 재조합 단백질을 유리시킨다. 다음으로 유리된 단백질은 후속의 크로마토그래피 분리에 의해 융합 도메인으로부터 분리될 수 있다. 특정 실시형태에서, HSA 폴리펩타이드는 폴리펩타이드를 안정화할 수 있는 하나 이상의 변형을 함유할 수 있다. 예를 들어, 이러한 변형은 폴리펩타이드의 시험관 내 반감기를 향상시키고, 폴리펩타이드의 순환 반감기를 향상시키거나 또는 폴리펩타이드의 단백질 분해를 감소시킨다. 유사하게, 키메라 폴리펩타이드의 맥락에서, 앞서 언급한 유형의 변형은 키메라 폴리펩타이드의 이종성 단백질 부분에 부가적으로 또는 대안으로 덧붙여질 수 있다.
일부 실시형태에서, HSA 부분을 포함하는 폴리펩타이드는 면역글로불린의 Fc 영역의 모두 또는 일부와 함께 융합 단백질이 될 수 있다. 특정 실시형태에서, 융합 단백질은 IgG 또는 이것의 단편의 FcRn 결합 도메인을 포함한다. 유사하게, 특정 실시형태에서, 면역글로불린의 Fc 영역의 모두 또는 일부는 이종성 단백질에 HSA 부분을 연결하기 위한 링커로서 사용될 수 있다. 알려진 바와 같이, 각각의 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 4 또는 5개의 도메인을 포함한다. 도메인은 다음과 같이 순차적으로 명명된다: CH1-힌지-CH2-CH3(-CH4). 중쇄 도메인의 DNA 서열은 면역글로불린 부류 중에서 교차 상동성을 가지며, 예를 들어 IgG의 CH2 도메인은 IgA 및 IgD의 CH2 도메인, IgM 및 IgE의 CH3 도메인에 상동성이다. 본 명세서에서 사용된 용어 "면역글로불린 Fc 영역"은 면역글로불린 쇄 불변 영역, 바람직하게는 면역글로불린 중쇄 불변 영역, 또는 그것의 일부의 카복실-말단 부분을 의미하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 면역글로불린 Fc 영역은 1) CH1 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인, 2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, 또는 5) 2 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역의 조합을 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서 면역글로불린 Fc 영역은 적어도 면역글로불린 힌지 영역 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하며, 바람직하게는 CH1 도메인이 없다. 한 실시형태에서, 중쇄 불변 영역이 유래된 면역글로불린의 부류는 IgG(Igγ) (γ 하위부류 1, 2, 3, 또는 4)이다. 면역글로불린의 다른 부류 IgA(Igα), IgD (Igδ), IgE(Igε) 및 IgM(Igμ)가 사용될 수 있다. 적절한 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 선택은 미국특허 제5,541,08호 및 제5,726,044호에서 상세히 논의된다. 특정 결과를 달성하기 위해 어떤 면역글로불린 부류 및 하위부류로부터 특정 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열의 선택은 당업자의 수준 내인 것으로 고려된다. 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 DNA 구성체의 부분은 바람직하게는 힌지 도메인의 적어도 일부, 및 바람직하게는 Fc γ의 CH3의 적어도 일부 또는 IgA, IgD, IgE, 또는 IgM 중 어떤 것에서 상동성 도메인을 포함한다. 더 나아가, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 내 아미노산의 치환 또는 결실은 본 발명의 실행에 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 한 예는 상부 CH2 영역 내 아미노산 치환을 도입하여 Fc 수용체에 대해 감소된 친화도를 가지는 Fc 변이체를 만든다(Cole et al. (1997) J. IMMUNOL. 159:3613). 당업자는 잘 알려진 분자 생물학 기법을 사용하여 이러한 구성체를 제조할 수 있다. 유사하게, 키메라 폴리펩타이드의 맥락에서, 앞서 언급한 변형의 유형은 키메라 폴리펩타이드의 이종성 단백질 부분에 부가적으로 또는 대안으로 첨부될 수 있다.
특정 양태에서, HSA 폴리펩타이드는 스캐폴드일 수 있다. 특정 실시형태에서, 단백질은 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 프레임워크를 선택하거나 설계하기 위해 사용된다. 스캐폴드로부터 단백질을 설계할 때, 프레임워크의 바람직한 특성을 위해 중요한 아미노산 잔기가 보유되는 한편, 다른 잔기를 다를 수 있다. 특정 실시형태에서, 스캐폴드는 상이한 특성을 가지는 단백질 유도체 간에 다른 아미노산 잔기의 50%로 동일하거나 미만 및 이러한 유도체 간에 일정한 잔기의 50%로 동일하거나 초과일 수 있다. 특정 실시형태에서, 스캐폴드는 상이한 특성을 가지는 단백질 유도체 간에 다른 아미노산 잔기의 45%, 40%, 35, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5%로 동일하거나 미만, 및 이러한 유도체 간에 일정한 잔기의 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%로 동일하거나 초과일 수 있다. 특정 실시형태에서, 스캐폴드는 상이한 특성을 가지는 단백질 유도체 간에 다른 아미노산 잔기의 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%로 동일하거나 초과, 및 이러한 유도체 간에 일정한 잔기의 45%, 40%, 35, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5%로 동일하거나 미만일 수 있다. 특정 실시형태에서, 이러한 불변 잔기는 그것의 특성에도 불구하고 모든 변이체 도메인에 대해 동일한 전반적인 3차원 폴딩을 부여한다. 특정 실시형태에서, HSA 폴리펩타이드 스캐폴드는 본 명세서의 다른 양태 및 실시형태에서 논의하는 바와 같이 변형되거나 치환될 수 있다. 특정 실시형태에서, HSA 폴리펩타이드 스캐폴드는 치료적일 수 있다. 특정 실시형태에서, HSA 폴리펩타이드 스캐폴드는 표적에 아고니스트적(antagonistic)일 수 있다. 특정 실시형태에서, HSA 폴리펩타이드 스캐폴드는 표적에 안타고니스트적(antagonistic)일 수 있다.
6.5 키메라 폴리펩타이드
본 명세서의 HSA 변이체를 포함하는 HSA 부분을 포함하는 폴리펩타이드는 임의의 이종성 단백질에 컨쥬게이트될 수 있다. 특정 실시형태에서, 이종성 단백질은 치료제이다. 특정 실시형태에서, 치료제는 항체 또는 펩타이드이다. 특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드의 이종성 단백질 부분은 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드는 IgG 면역글로불린의 불변 영역을 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 이종성 단백질은 비항체 치료적 단백질을 포함한다. 특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드의 이종성 단백질 부분은 성장인자 또는 사이토카인을 포함한다. 특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드는 에피토프를 추가로 포함한다. 예를 들어 검출 및/또는 정제에 유용한 에피토프(예를 들어, His 태그, 플래그 태그 등).
특정 실시형태에서, HSA 부분은 이종성 단백질에 화학적으로 컨쥬게이트된다. 특정 실시형태에서, HSA 부분은 이종성 단백질에 재조합적으로 컨쥬게이트된다. 특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드는 HSA 부분과 이종성 단백질을 둘 다 암호화하는 재조합 벡터를 사용하여 생성된다.
특정 실시형태에서, HSA 변이체는 원핵 또는 진핵 세포 내에서 생성된다. 특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드는 원핵 또는 진핵 세포 내에서 생성된다. 특정 실시형태에서, 진핵 세포는 효모 세포, 조류 세포, 곤충 세포, 또는 포유류 세포로부터 선택된다.
본 발명의 키메라 폴리펩타이드는 다양한 방식으로 만들어질 수 있다. 특정 실시형태에서, HSA 부분의 C-말단은 이종성 단백질(예를 들어, 항체 또는 치료적 펩타이드)의 N-말단에 연결될 수 있다. 대안으로 이종성 단백질(예를 들어, 항체 또는 치료적 펩타이드)의 C-말단은 HSA 부분의 N-말단에 연결될 수 있다. 특정 실시형태에서, HSA 부분은 이종성 단백질의 내부 아미노산에 컨쥬게이트된다. 특정 실시형태에서, 부착된 HSA 부분 및/또는 부착된 이종성 단백질의 기능적 통합을 유지하는데 필요하다면 잠재적인 입체배치는 항체의 중쇄 및 경쇄 서열의 절단된 부분의 사용을 포함한다. 특정의 다른 실시형태에서, HSA 부분은 HSA 도메인 III, 또는 이것의 신생아 Fc 수용체(FcRn) 결합 단편, 및 HSA 도메인 I, 또는 HSA 도메인 II, 또는 HSA 도메인 I 및 II의 적어도 일부를 포함한다. 또한 추가로, 이종성 단백질은 HSA 부분 또는 이것의 변이체의 노출된 내부(비 말단) 잔기에 연결될 수 있다. 추가 실시형태에서, HSA-이종성 단백질 입체배치의 임의의 조합이 사용될 수 있고, 이것에 의해 1:1 초과의 HSA:이종성 단백질 비(예를 들어, 1개의 이종성 단백질에 대해 2개의 HSA 분자)를 초래한다.
HSA 부분 및 이종성 단백질은 서로 직접적으로 컨쥬게이트될 수 있다. 대안으로, 그것들은 링커 서열을 통해 서로 연결될 수 있는데, 이는 충분한 거리로 HSA 부분과 이종성 단백질을 분리시켜 각 도메인이 그것의 2차 및 3차 구조로 적절하게 폴딩되는 것을 보장한다. 특정 실시형태에서, 링커는 절단가능한 링커이다. 바람직한 링커는 (1) 가요성의 연장된 입체구조를 채택하여야 하고, (2) HSA 폴리펩타이드 또는 이종성 단백질의 기능성 도메인과 상호작용할 수 있는 규칙적 2차 구조를 발생시키기 위한 경향을 나타내지 않아야 하며, (3) 기능성 단백질 도메인과 상호작용을 촉진할 수 있는 최소의 소수성 또는 하전된 특징을 가져야 한다.
특정 실시형태에서, 링커 길이는 적어도 80 옹스트롬(Å), 또는 적어도 100 Å, 또는 적어도 120 Å, 또는 적어도 140 Å, 또는 적어도 160 Å, 또는 적어도 180 Å, 또는 적어도 200 Å이다. 특정 실시형태에서, 링커 길이는 약 80 Å 내지 약 200 Å, 또는 약 100 Å 내지 약 180 Å 또는 약 120 Å 내지 약 160 Å이다.
특정 실시형태에서, 링커는 펩타이드 링커이다. 특정 실시형태에서, 링커는 펩타이드 링커이며 펩타이드 링커는 다음의 특징 중 하나 이상을 가진다: a) 서로에 대해 이종성 단백질 서열 및 HSA 부분의 로테이션을 허용한다; b) 프로테아제에 의한 분해에 저항성이 있다; 및 c) 이종성 단백질 서열 또는 HSA 부분과 상호작용하지 않는다. 가요성 단백질 영역 내 전형적인 표면 아미노산은 Gly, Asn 및 Ser를 포함한다. Gly, Asn 및 Ser을 함유하는 아미노산 서열의 치환은 링커 서열에 대해 상기 기준을 만족시키는 것으로 예상되었다. 다른 비슷한 중성 아미노산, 예컨대 Thr 및 Ala은 또한 링커 서열 중에서 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 펩타이드 링커 내 각각의 아미노산은 Gly, Ser, Asn, Thr 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서 펩타이드 링커는 Gly-Ser 구성요소를 포함한다. 특정 실시형태에서, 펩타이드 링커는 하나 이상의 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser 반복체를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser 반복체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 더 긴 또는 더 짧은 링커 서열이 사용될 수도 있지만 약 20개 아미노산의 링커 서열 길이가 기능적 단백질 도메인의 적합한 분리를 제공하기 위하여 사용될 수 있다. HSA 폴리펩타이드 및 이종성 단백질을 분리시키는 링커 서열의 길이는 길이로 5 내지 500개의 아미노산, 또는 더 바람직하게는 길이로 5 내지 100개의 아미노산일 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커 서열은 길이로 약 5-60개 또는 약 5-30개 아미노산이다. 특정 실시형태에서, 링커ㅓ 서열은 약 5 내지 약 20개의 아미노산이며, 유리하게는 약 10개 내지 약 30개의 아미노산이다. 다른 실시형태에서, 이종성 단백질에 HSA 부분을 결합시키는 링커는 항체의 불변 도메인(예를 들어, 항체의 Fc 영역의 모두 또는 일부)일 수 있다. 특정 실시형태에서, 링커는 절단가능한 링커이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 키메라 폴리펩타이드는 잘 알려진 교차 결합 시약 및 프로토콜을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 당업자에게 공지되어 있고 이종성 단백질(예를 들어 항체)과 HSA 폴리펩타이드의 가교에 유용한 다수의 화학적 가교제가 있다. 예를 들어, 가교제는 헤테로 2작용성(heterobifunctional) 가교제인데, 이는 단계적 방법에서 분자를 연결하기 위하여 사용될 수 있다. 헤테로 2작용성 가교제는 단백질을 컨쥬게이트하기 위한 더 특이적인 커플링 방법을 설계하기 위한 능력을 제공하며, 이것에 의해 호모 단백질 폴리머와 같은 원치않는 부반응의 발생을 감소시킨다. 매우 다양한 헤테로 2작용성 가교제가 당업계에 알려져 있으며, 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스터(MBS); N-숙신이미딜(4-요오도아세틸) 아미노벤조에이트(SIAB), 숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐) 부티레이트(SMPB), 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필) 카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC); 4-숙신이미딜옥시카보닐-a-메틸-a-(2-피리딜다이티오)-톨루엔(SMPT), N-숙신이미딜 3-(2-피리딜다이티오) 프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜 6-[3-(2-피리딜다이티오)프로피오네이트]헥사노에이트(LC-SPDP)를 포함한다. N-하이드록시숙신이미드 모이어티를 가지는 가교제는 N-하이드록시설폰숙신이미드 유사체로 얻을 수 있으며, 이는 일반적으로 더 큰 물 용해도를 가진다. 추가로, 연결 쇄 내에 이황화물 브릿지를 가지는 가교제는 생체내 링커 절단의 양을 감소시키기 위하여 알킬 유도체로서 대신 합성될 수 있다. 헤테로 2작용성 가교제에 더하여, 호모 2작용성 및 광반응성 가교제를 포함하는 다수의 다른 가교제가 존재한다. 다이숙신이미딜 서브크레이트(DSS), 비스말레이미도헥산(BMH) 및 다이메틸피멜리미데이트.2 HC1 (DMP)은 유용한 호모 2작용성 가교제의 예이며, 비스-[B-(4-아지도살리실아미도)에틸] 다이설파이드(BASED) 및 N-숙신이미딜-6(4'-아지도-2'-나이트로페닐아미노)헥사노에이트(SANPAH)는 본 발명에서 사용을 위한 유용한 광반응성 가교제의 예이다. 단백질 커플링 기법의 최근의 검토에 대해, 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Means et al. (1990) Bioconjugate Chemistry. 1:2-12]을 참조한다.
상기 포함된 헤테로 2작용성 가교제의 하나의 특히 유용한 부류는 1차 아미노 반응기, N-하이드록시숙신이미드(NHS), 또는 그것의 수용성 유사체 N-하이드록시설포숙신이미드(설포-NHS)를 함유한다. 알칼리 pH에서 1차 아민(리신 엡실론 기)은 비양자화되며, NHSA 또는 설포-NHS 에스터 상의 친핵성 공격에 의해 반응한다. 이 반응은 아미드 결합의 형성, 및 부산물로 NHS 또는 설포-NHS의 방출을 초래한다. 헤테로 2작용성 가교제의 부분으로서 유용한 다른 반응기는 티올 반응기이다. 통상적인 티올 반응기는 말레이미드, 할로겐, 및 피리딜 이황화물을 포함한다. 말레이미드는 약간 산성 내지 중성(pH 6.5-7.5) 조건 하에서 유리 설프하이드릴과 몇 분내에 특이적으로 반응한다. 할로겐(요오도아세틸 작용)은 생리적 pH에서 --SH 기와 반응한다. 반응기는 둘 다 안정한 티오에터 결합의 형성을 초래한다. 헤테로 2작용성 가교제의 제3 성분은 스페이서 암(arm) 또는 브릿지이다. 브릿지는 2개의 반응성 말단과 연결되는 구조이다. 브릿지의 가장 분명한 특성은 입체 장애에서 그것의 효과이다. 일부 예에서, 더 긴 브릿지는 2개의 복합체 생체분자를 연결하는데 필요한 거리를 더 용이하게 확장시킬 수 있다.
헤테로 2작용성 시약을 사용하여 단백질 컨쥬게이트를 제조하는 것은 아민 반응 및 설프하이드릴 반응을 수반하는 2단계 공정이다. 제1 단계를 위해, 아민 반응, 선택된 단백질은 1차 아민을 함유하여야 한다. 이는 대부분의 단백질의 N-말단에서 발견되는 리신 엡실론 아민 또는 1차 알파 아민일 수 있다. 단백질은 유리 설프하이드릴 기를 함유하지 않아야 한다. 컨쥬게이트되는 단백질이 둘 다 자유 설프하이드릴 기를 함유하는 경우, 모든 설프하이드릴이 예를 들어 N-에틸말레이미드를 사용하여 차단되도록 한 단백질은 변형될 수 있다(본 명세서에 참조로 포함된 문헌 [Partis et al. (1983) J. Pro. Chem. 2:263]을 참조한다). 엘만 시약은 특정 단백질에서 설프하이드릴의 양을 계산하기 위하여 사용될 수 있다(예를 들어, 본 명세서에 참조로 포함된 문헌[Ellman et al. (1958) Arch. Biochem. Biophys. 74:443 and Riddles et al. (1979) Anal. Biochem. 94:75]을 참조).
특정 실시형태에서, 본 발명의 키메라 폴리펩타이드는 문헌[Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993) and Grant G. A. (ed.), Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman and Company, New York (1992)]에서 설명되는 것과 같은 표준 단백질 화학 기법을 사용하여 생성될 수 있다. 추가로, 자동화된 펩타이드 신시사이저가 상업적으로 이용가능하다(예를 들어, Advanced ChemTech Model 396; Milligen/Biosearch 9600). 이종성 단백질에 HSA의 화학적 컨쥬게이션을 위한 임의의 앞서 언급한 가교 방법에서, 절단가능한 도메인 또는 절단가능한 링커가 사용될 수 있다. 절단은 이종성 단백질과 HSA 폴리펩타이드의 분리를 허용할 것이다. 예를 들어, 키메라 폴리펩타이드에 의한 세포의 침투 후, 절단가능한 링커의 절단은 이종성 단백질로부터 HSA의 분리를 허용한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 키메라 폴리펩타이드는 HSA 부분 및 이종성 단백질(예를 들어, 항체 또는 치료적 펩타이드)을 함유하는 융합 단백질로 발생될 수 있으며, 하나의 연속적 폴리펩타이드 쇄로 발현된다. 이러한 키메라 폴리펩타이드는 본 명세서에서 재조합적으로 컨쥬게이트된 것으로 언급된다. 이러한 융합 단백질의 제조에서, 융합 유전자는 HSA 부분 및 이종성 단백질을 암호화하는 핵산, 및 선택적으로 HSA 부분 및 이종성 단백질을 확장시키기 위한 펩타이드 링커 서열을 포함하여 구성된다. 번역 생성물이 요망되는 융합 단백질이 되도록 하는 융합 유전자를 만들기 위한 재조합 DNA 기법의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 유전자의 암호화 서열과 그것의 조절 영역은 둘 다 재설계되어 단백질 생성물의 기능적 특성, 만들어진 단백질의 양, 또는 단백질이 생성되는 세포 유형을 변경시킬 수 있다. 유전자의 암호화 서열은, 예를 들어 상이한 유전자의 암호화 서열에 그것의 부분을 융합시켜 융합 단백질을 암호화하는 신규 혼성 유전자를 만드는 것에 의해 광범위하게 변형될 수 있다. 융합 단백질을 생성하기 위한 방법의 예는 본 명세서에 참조로 포함된 국제특허출원 PCT/US87/02968, PCT/US89/03587 및 PCT/US90/07335뿐만 아니라 문헌[Traunecker et al. (1989) Nature 339:68]에서 설명된다. 본질적으로, 상이한 폴리펩타이드 서열에 대해 다양한 DNA 단편 암호화의 결합은 결찰을 위한 두 가닥 말단(blunt-ended) 또는 스태거 말단(stagger-ended)의 말단, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 분해, 적절한 경우 외가닥 말단의 채움, 원치 않는 결합을 회피하기 위한 알칼리 포스파타제 처리, 및 효소적 결찰을 사용하는 통상적인 기법에 따라서 수행된다. 대안으로 융합 유전자는 자동화된 DNA 신시사이저를 포함하는 통상적인 기법에 의해 합성될 수 있다. 다른 방법에서, 유전자 단편의 PCR 증폭은 2개의 연속적 유전자 단편 사이의 보존적 돌출부를 생기게 하고, 후속하여 어닐링되어 키메라 유전자 서열을 발생시킬 수 있는 앵커 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다(예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992]을 참조). 융합 유전자에 의해 암호화된 키메라 폴리펩타이드는 당업계에 잘 알려진 다양한 발현 시스템을 사용하여 재조합적으로 생성될 수 있다(또한 이하를 참조).
재조합적으로 컨쥬게이트된 키메라 폴리펩타이드는 HSA 부분이 이종성 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 컨쥬게이트되는 실시형태를 포함한다.
일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드를 확장시키는 접합 영역 내에서 후보 T-세포 에피토프를 확인하고, 미국 특허 공개 2003/0166877호에서 설명된 바와 같은 접합 내 아미노산을 변경시킴으로써 키메라 폴리펩타이드의 면역원성은 감소될 수 있다.
용어 키메라 단백질은 이 부분이 상호 연결된 방법(예를 들어, 화학적으로 컨쥬게이트, 재조합적으로 컨쥬게이트)과 관계없이, HSA 부분(예컨대 HSA 변이체 폴리펩타이드) 및 이종성 단백질을 포함하는 단백질을 말하는 것으로 사용될 수 있다. 이와 같이, 용어 키메라 단백질, 융합 단백질 및 컨쥬게이트된 단백질은 상호 호환적으로 사용될 것이다.
이종성 단백질의 예시적 카테고리는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 효소, 성장 인자, 및 사이토카인을 포함한다. 특정 실시형태에서, 이종성 단백질은 항체이다.
HSA 부분을 포함하는 키메라 폴리펩타이드에서 사용을 위한 이종성 단백질은 치료적 단백질, 이것의 단편, 예컨대 성장 인자, 효소, 뼈 형태형성 단백질 및 가용성 수용체 단편일 수 있다. 예시적인 이종성 폴리펩타이드는 생장인자, 예컨대 간세포생장인자(hepatocyte growth factor: HGF), 신경생장인자(nerve growth factor: NGF), 표피생장인자(epidermal growth factor: EGF; 생장 인자의 EFG 패밀리의 구성원), 섬유아세포 생장 인자(fibroblast growth factor: FGF; 생장 인자의 FGF 패밀리의 구성원), 형질전환 생장 인자(transforming growth factor, 예를 들어 TGF-알파, TGF-베타, TGF-베타2, TGF-베타3), 혈관생성인자(vascular endothelial growth factor: VEGF; 예를 들어 VEGF-2), 인터페론(예를 들어, INF-알파, INF-베타), 인터류킨(예를 들어, IL-1, IL-2), 사이토카인, 및 인슐린을 포함한다. 다른 예시적인 이종성 단백질은 효소를 포함한다. 다른 예시적인 이종성 폴리펩타이드는 뼈 형태형성 단백질(BMP; 단백질의 BMP 패밀리의 구성원), 에리트로포이에틴(EPO), 마이오스타틴(myostatin), 및 종양 괴사 인자(예를 들어 TNF-a)를 포함한다. 다른 예시적인 이종성 폴리펩타이드는 막관통 수용체의 세포밖 도메인을 포함하며, 임의의 자연적으로 발생하는 세포 수용체의 세포밖 도메인뿐만 아니라 이것의 임의의 변이체(돌연변이체, 단편 및 펩티도미메틱 형태를 포함)를 포함한다.
HSA 부분을 포함하는 키메라 폴리펩타이드 내 사용을 위한 이종성 단백질은 치료적 단백질, 또는 이것의 단편일 수 있고, 항체 또는 이것의 항원 결합 부분을 포함한다. 예시적인 항체 및 항체 단편은, 이에 제한되는 것은 아니지만, Humira(등록상표), Remicade(등록상표), Simponi(등록상표), Rituxan(등록상표), Herceptin(등록상표), Avastin(등록상표), Erbitux(등록상표); Synagis(등록상표), Mylotarg(등록상표), Campath(등록상표), TheraClM(등록상표), Vectibix(등록상표), Tysabri(등록상표), ReoPro(등록상표), Lucentis(등록상표), Cimzia(등록상표) 등을 포함한다.
6.6 HSA -관련 핵산 및 발현
특정 양태에서, 본 명세서는 본 명세서의 임의의 폴리펩타이드(예를 들어, HSA 변이체 및 HSA 부분이 있는 키메라 폴리펩타이드)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 구성체를 제공한다. 추가로, 본 발명은 키메라 폴리펩타이드 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드(예를 들어, HSA 부분 - 이것의 생활성 단편, 변이체 및 융합을 포함)를 생성하기 위한 이러한 핵산을 사용하게 한다. 특정 구체적 실시형태에서, 핵산은 본 발명의 재조합 키메라 단백질을 만들기 위한 이종성 단백질(예를 들어 항체 또는 치료적 펩타이드)을 암호화하는 DNA를 추가로 포함할 수 있다. 모든 이런 핵산은 총괄적으로 HSA 핵산으로 언급된다.
특정 양태에서, 본 명세서는 (i) 인간 혈청 알부민(HSA) 부분(HSA 부분은 HSA 도메인 III을 포함한다), 또는 이것의 FcRn 결합 단편(HSA 도메인 III은 1 내지 18개의 아미노산 치환을 포함한다)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 (ii) 이종성 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(핵산 구성체는 이종성 단백질의 기능적 활성을 보유하며, FcRn에 결합할 수 있다)에 작동가능하게 연결되도록 포함하며, 상기 키메라 폴리펩타이드는 대조군 키메라 폴리펩타이드에 비해 증가된 혈청 반감기 및/또는 FcRn에 증가된 친화도를 가지고, 이때 HSA 부분은 상기 아미노산 치환을 포함하지 않는 핵산 구성체를 제공한다.
특정 실시형태에서, 핵산 구성체에 의해 암호화된 키메라 폴리펩타이드는 상기 대조군 키메라 폴리펩타이드보다 더 높은 친화도로 FcRn과 결합한다. 특정 실시형태에서, 핵산 구성체에 의해 암호화된 키메라 폴리펩타이드는 상기 대조군 키메라 폴리펩타이드에 비해 증가된 혈청 반감기를 가진다. 특정 실시형태에서, 핵산 구성체에 의해 암호화된 키메라 폴리펩타이드는 이 특성을 둘 다 가진다.
특정 실시형태에서, (i) 인간 혈청 알부민(HSA) 부분을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, HSA 부분은 HSA 도메인 III, 또는 이것의 FcRn 결합 단편을 포함하고, HSA 도메인 III은 1 내지 18개(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18)의 아미노산 치환을 포함한다.
특정 실시형태에서, 핵산 구성체에 의해 암호화된 HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 다양한 종에 걸쳐 보존된 잔기를 가진다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 다양한 종에 걸쳐 보존된 잔기를 가진다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 인간, 돼지, 래트, 마우스, 개, 토끼, 소, 닭, 당나귀, 모래쥐, 양, 고양이 및 말로부터 혈청 알부민 단백질 중에서 보존된 잔기를 가진다. 특정 실시형태에서, 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 인간, 돼지, 래트, 마우스, 개, 토끼, 소, 닭, 당나귀, 모래쥐, 양, 고양이 및 말로부터 혈청 알부민 단백질 중에서 보존된 잔기를 가진다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 표면 접근가능한 잔기를 가진다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 표면 접근가능한 잔기를 가진다. 특정 실시형태에서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 표면 접근가능하고, 다양한 종에 걸쳐 보존된 잔기를 둘 다 가진다. 특정 실시형태에서 HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 표면 접근가능하고 다양한 종에 걸쳐 보존된 잔기를 가진다.
특정 실시형태에서, (i) 서열 번호 1과 적어도 90% 동일한 HSA 도메인 III을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, (i) 서열 번호 1과 적어도 95% 동일한 HSA 도메인 III을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, (i) 서열 번호 1과 적어도 98% 동일한 HSA 도메인 III을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 루프 2 내에 있다. 특정 실시형태에서, 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 루프 3 내에 있다. 특정 실시형태에서, 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 루프 6 내에 있다. 특정 실시형태에서, 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 나선 7 내에 있다. 특정 실시형태에서, 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 루프 7 내에 있다. 특정 실시형태에서, 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 나선 8 내에 있다. 특정 실시형태에서, 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 루프 8 내에 있다. 특정 실시형태에서, 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 루프 9 내에 있다.
특정 실시형태에서, (ii) 이종성 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 이종성 단백질은 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 실시형태에서, (ii) 이종성 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 이종성 단백질은 치료적 단백질을 포함한다.
특정 실시형태에서, 뉴클레오타이드 서열은 IgG 면역글로불린의 불변 영역을 추가로 암호화한다.
특정 실시형태에서, (ii) 이종성 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 이종성 단백질은 성장 인자 또는 사이토카인을 포함한다. 특정 실시형태에서, 핵산 구성체는 링커를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다.
핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥, DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 명세서는 HSA 서열(예를 들어, 서열 번호 1 및 2)의 동일 영역과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 HSA 부분을 암호화하는 분리된 또는 재조합 핵산 서열에 관한 것이다. 추가 실시형태에서, HSA 핵산 서열은 분리된 재조합체일 수 있고 및/또는 이종성 뉴클레오타이드 서열과 함께, 또는 DNA 라이브러리에서 융합될 수 있다.
특정 실시형태에서, HSA 핵산은 또한 임의의 상기 언급된 천연 HSA 뉴클레오타이드 서열, 또는 이것의 상보적 서열에 매우 엄중한 조건 항에서 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 당업자는 DNA 혼성화를 촉진하는 적절한 엄중한 조건이 다를 수 있다는 것을 용이하게 이해할 것이다. 예를 들어, 당업자는 약 45 ℃에서 6.0 x 염화나트륨/시트르산 나트륨(SSC)에서 혼성화 후, 50 ℃에서 2.0 x SSC의 세척을 수행할 수 있다. 예를 들어 세척 단계의 염 농도는 50 ℃에서 약 2.0 x SSC의 낮은 엄중조건으로부터 50 ℃에서 약 0.2 x SSC의 매우 엄중조건으로 선택될 수 있다. 추가로, 세척 단계의 온도는 실온, 약 22℃에서 낮은 엄중 조건으로부터 약 65℃의 높은 엄중 조건으로 증가될 수 있다. 온도와 염은 둘 다 변할 수 있고, 또는 온도 또는 염 농도는 일정하게 보유될 수 있는 한편 다른 변수가 변할 수 있다. 한 실시형태에서, 본 발명은 실온에서 6 x SSC의 낮은 엄중 조건 하에 혼성화된 후 실온에서 2 x SSC에서 세척된 핵산을 제공한다.
유전자 암호의 축퇴에 기인하여 천연 HSA 핵산과 다른 분리된 핵산은 또한 본 발명의 범주 내에 있다. 예를 들어, 다수의 아미노산이 하나 이상의 3염기연쇄(triplet)에 의해 설계된다. 동일 아미노산을 구체화하는 코돈, 또는 동의어(예를 들어 CAU 및 CAC는 히스티딘에 대한 동의어이다)는 단백질의 아미노산 서열에 영향을 미치지 않는 "침묵" 돌연변이를 초래할 수 있다. 그러나, 대상 단백질의 아미노산 서열 내 변화를 야기하는 DNA 서열 다형성은 포유류 세포 중에 존재할 것으로 기대된다. 당업자는 특정 단백질을 암호화하는 핵산의 하나 이상(뉴클레오타이드의 약 3-5%까지)의 뉴클레오타이드 내 이런 변형이 천연 대립유전자 변형에 기인하여 주어진 종의 개체 중에 존재할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 임의의 및 모든 이러한 뉴클레오타이드 변형 및 결과 아미노산 다형성은 본 발명의 범주 내에 있다.
특정 실시형태에서, 재조합 HSA 핵산은 발현 구성체 내 하나 이상의 조절 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 조절 뉴클레오타이드 서열은 일반적으로 발현을 위해 사용된 숙주 세포에 적절할 것이다. 수많은 유형의 적절한 발현 벡터 및 적합한 조절 서열은 다양한 숙주 세포에 대해 당업계에 알려져 있다. 전형적으로 상기 하나 이상의 조절 뉴클레오타이드 서열은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 프로모터 서열, 리더 또는 신호 서열, 리보솜 결합 자리, 전사 출발 및 종결 서열, 번역 출발 및 종결 서열, 및 인핸서 또는 액티베이터 서열을 포함할 수 있다. 당업계에 알려진 구성적 또는 유동성 프로모터가 본 발명에 의해 생각된다. 프로모터는 자연적으로 발생하는 프로모터, 또는 하나 이상의 프로모터의 구성요소를 결합하는 혼성 프로모터 중 하나일 수 있다. 발현 구성체는 에피솜, 예컨대 플라스미드 상의 세포에 존재할 수 있고, 또는 발현 구성체는 염색체 내에 삽입될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 발현 벡터는 형질전환된 숙주 세포의 선택을 허용하는 선택가능한 마커 유전자를 함유한다. 선택가능한 마커 유전자는 당업계에 잘 알려져 있고, 사용된 숙주 세포에 의해 다를 것이다. 특정 양태에서, 본 발명은 HSA 폴리펩타이드를 암호화하며 적어도 하나의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다. 조절 서열은 당업계에 인식되어 있고, 암호화된 폴리펩타이드의 직접 발현을 위해 선택된다. 따라서, 용어 조절 서열은 프로모터, 인핸서, 및 다른 발현 제어 구성요소를 포함한다. 예시적인 조절 서열은 문헌[Goeddel; Gene Expression Technology : Methods in Enzymology , Academic Press, San Diego, CA (1990)]에서 설명된다. 발현 벡터의 설계는 형질전환된 숙주 세포 및/또는 발현되도록 요망된 단백질의 유형의 선택으로서 이러한 인자에 의존할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 게다가, 벡터의 복제 수, 복제수를 제어하는 능력 및 항생물질 마커와 같이 벡터에 의해 암호화된 임의의 다른 단백질의 발현이 또한 생각되어야 한다.
본 발명은 또한 본 발명의 HSA 폴리펩타이드 또는 키메라 폴리펩타이드를 암호화하는 재조합 유전자로 트랜스펙션된 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들어, HSA 폴리펩타이드 또는 키메라 폴리펩타이드는 박테리아 세포, 예컨대 대장균, 곤충세포(예를 들어, 바큐로바이러스 발현 시스템을 사용), 효모 또는 포유류 세포 내에서 발현될 수 있다. 다른 적합한 숙주 세포가 당업자에게 알려져 있다.
본 발명은 추가로 본 발명의 HSA 폴리펩타이드, 이종성 단백질, 및/또는 키메라 폴리펩타이드를 생성하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어 HSA 폴리펩타이드 또는 키메라 폴리펩타이드를 암호화하는 발현 벡터로 트랜스펙션된 숙주 세포는 적절한 조건 하에서 배양되어 폴리펩타이드가 생기도록 할 수 있다. 폴리펩타이드는 세포 및 폴리펩타이드를 함유하는 배지로부터 분비되고 분리될 수 있다. 대안으로, 폴리펩타이드는 세포직 또는 막 분획 내에 보유될 수 있고, 세포는 채취되고, 용해되며, 단백질이 분리된다. 세포 배양물은 숙주 세포, 배지 및 다른 부산물을 포함한다. 세포 배양물에 대한 적합한 배지는 당업계에 잘 알려져 있다. 폴리펩타이드는 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 초미세여과, 전기영동법 및 폴리펩타이드(예를 들어, HSA 폴리펩타이드)의 특정 에피토프에 특이적인 항체에 의한 면역 친화도 정제를 포함하는, 단백질을 정제하기 위한 당업계에 알려진 방법을 사용하여 세포 배양물 배지, 숙주 세포 또는 둘 다로부터 분리될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 폴리펩타이드는 그것의 정제를 용이하게 할 수 있는 도메인을 함유하는 융합 단백질이다.
재조합 HSA 핵산은 원핵 세포, 진핵 세포(효모, 조류, 곤충 또는 포유류) 중 하나에서 또는 둘 다에서 발현에 적합한 벡터에 클로닝된 유전자 또는 이것의 부분을 결찰시킴으로써 생성될 수 있다. 재조합 폴리펩타이드의 생성을 위한 발현 비히클은 플라스미드 및 다른 벡터를 포함한다. 예를 들어, 적합한 벡터는 다음 유형의 플라스미드를 포함한다: 원핵세포, 예컨대 대장균에서 발현을 위한 pBR322-유래 플라스미드, pEMBL-유래 플라스미드, pEX-유래 플라스미드, pBTac-유래 플라스미드 및 pUC-유래 플라스미드. 바람직한 포유류 발현 벡터는 박테리아 내 벡터의 증식을 용이하게 할 수 있는 원핵 서열과 진핵 세포 내에서 발현된 하나 이상의 진핵 전이 단위를 둘 다 함유한다. pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo 및 pHyg 유래 벡터는 진핵 세포의 트랜스펙션에 적합한 포유류 발현 벡터의 예이다. 이 벡터들 중 일부는 pBR322와 같은 박테리아 플라스미드로부터의 서열로 변형되어 원핵세포와 진핵세포 둘 다에서 복제 및 약물 저항성 선택을 용이하게 한다. 대안으로 소 유두종 바이러스(BPV-1), 또는 엡스타인 바르(Epstein-Barr) 바이러스(pHEBo, pREP-유래 및 p205)와 같은 바이러스의 유도체가 진핵 세포 내 단백질의 일시적 발현을 위해 사용될 수 있다. 플라스미드의 제조 및 숙주 유기체의 형질전환에 사용된 다양한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 원핵 및 진핵 세포 둘 다에 대해서뿐만 아니라 일반적 재조합 공정을 위한 다른 적합한 발현 시스템에 대해, 문헌[Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) Chapters 16 and 17]을 참조한다. 일부 예에서, 바큐로바이러스 발현 시스템의 사용에 의해 재조합 폴리펩타이드를 발현시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 바큐로바이러스 발현 시스템의 예는 pVL-유래 벡터(예컨대 pVL1392, pVL1393 및 pVL941), pAcUW-유래 벡터(예컨대 pAcUW1), 및 pBlueBac-유래 벡터(예컨대 β-gal 함유 pBlueBac III)을 포함한다.
융합 유전자를 제조하기 위한 기법은 잘 알려져 있다. 본질적으로 상이한 폴리펩타이드 서열에 대해 암호화하는 다양한 DNA 단편의 결합은 통상적인 기법에 따라서 수행되며, 결찰을 위한 두 가닥 말단 는 스태거 말단의 말단, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 분해, 적절한 경우 외가닥 말단의 채움, 원치 않는 결합을 회피하기 위한 알칼리 포스파타제 처리, 및 효소적 결찰을 사용하는 통상적인 기법에 따라서 수행된다. 다른 구체예에서, 융합 유전자는 자동화된 DNA 신시사이저를 포함하는 통상적인 기법에 의해 합성될 수 있다. 대안으로, 유전자 단편의 PCR 증폭은 2개의 연속적 유전자 단편 사이의 보존적 돌출부를 생기게 하고, 후속하여 어닐링되어 키메라 유전자 서열을 발생시킬 수 있는 앵커 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다(예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992]을 참조).
6.7 처리 방법
특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서의 키메라 융합의 이종성 단백질을 사용하여 처리가능한 조건의 처리방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서는 HSA 부분을 상기 단백질에 컨쥬게이트하는 단계를 포함하는 혈청 반감기를 증가시키고 및/또는 피험자 내 단백질의 FcRn에 대한 결합 친화도를 증가시키는 방법을 제공하며, HSA 부분은 도메인 III 또는 이것의 신생아 Fc 수용체(FcRn) 결합 단편을 포함한다. 특정 실시형태에서 HSA 도메인 III은 대조군 폴리펩타이드 결과에 비해 FcRn에 대한 친화도 및 상대적 키메라 폴리펩타이드의 혈청 반감기 중 하나 또는 둘 다를 증가시키는 1 내지 18개의 아미노산 치환을 포함한다. 이 방법은 상기 설명한 바와 같이 키메라 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드의 치료적으로 유효한 양을 필요한 개체에 투여하는 단계를 수반한다. 특정 실시형태에서, 본 방법은 (a) HSA 부분 또는 그것의 생활성 단편 및 (b) 이종성 단백질을 포함하는 키메라 폴리펩타이드 투여단계를 포함한다. 이 방법은 동물, 및 더 구체적으로는 인간의 치료적 및 예방적 처리에 특히 도움이 된다.
처리될 수 있는 특정 질병 및 질환이 키메라 단백질의 이종성 단백질 부분에 의존한다는 것을 주목한다. 추가로, 본 명세서는 특정 질병 또는 질환을 처리하는데 적절한 이종성 단백질을 포함하는 키메라 폴리펩타이드가 특정 질병 또는 질환을 처리하는데 적절한 하나 이상의 다른 화합물 또는 다른 치료적 양상과 함께 치료적 섭생의 부분으로서 투여될 수 있다는 것을 생각한다. 추가로, 본 명세서는 키메라 투여된 폴리펩타이드가 주어진 환자의 연령, 체중, 건강, 병의 중증도 등에 의학적으로 적절한 치료와 일치되는 방식이라는 것을 생각한다.
예로서, 상동성 단백질이 Humira라면, 키메라 폴리펩타이드는, 예를 들어 류마티스 관절염, 건선, 소아관절염, 및 크론병의 치료에 사용될 수 있다. 이종성 단백질이 인슐린이라면, 키메라 폴리펩타이드는 인슐린 치료에 사용될 수 있다.
용어 "치료", "치료하는" 등은 요망되는 약동학적 및/또는 생리적 효과를 얻는 것을 일반적으로 의미하는 것으로 본 명세서에서 사용된다. 효과는 질병, 질환 또는 이것의 증상을 완전히 또는 부분적으로 방지하는 것에 관하여 예방적일 수 있고, 및/또는 질병 또는 질환의 부분적 또는 완전한 치유 및/또는 질병 또는 질환에 기여할 수 있는 부작용에 대해 치료적일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "치료"는 포유류, 특히 인간의 질병 또는 질환의 어떤 치료를 다루며, (a) 질병 또는 질환에 취약할 수 있지만 그것을 가지는 것으로 아직 진단되지 않은 피험자에서 질병 또는 질환이 생기는 것을 방지하는 것; (b) 질병 또는 질환을 억제하는 것(예를 들어, 그것의 발생을 막는 것); 또는 (c) 질병 또는 질환을 경감하는 것(예를 들어 질병 또는 질환의 퇴보를 야기하고, 하나 이상의 증상의 개선을 제공하는 것)을 포함한다. 임의의 질환에서 개선은 표준 방법 및 당업계에 알려진 기법에 따라서 용이하게 평가될 수 있다. 질병이 본 방법에 의해 치료되는 피험자의 집단은 원치 않는 질환 또는 질병에 걸린 피험자뿐만 아니라 질환 또는 질병의 개선의 위험에 있는 피험자를 포함한다.
용어 "치료적으로 유효한 양" 또는 "유효량"은 투여되는 동안 요망되는 효과를 만드는 용량을 의미한다. 정확한 용량은 치료의 목적에 의존할 것이며, 알려진 기법을 사용하여 당업자에 의해 확인될 것이다(예를 들어, 문헌[Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding]을 참조).
특정 실시형태에서, 본 발명의 하나 이상의 키메라 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드는 함께(동시에) 또는 상이한 시간에(순차적으로) 투여될 수 있다. 추가로, 본 발명의 키메라 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드는 동일한 질병 또는 증상을 치료하기 위한 하나 이상의 추가적인 화합물 또는 치료제와 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 키메라 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드는 하나 이상의 치료적 화합물과 함께 공동 투여될 수 있다. 조합 치료제는 동시 또는 대안의 투여를 포함할 수 있다. 추가로, 조합은 급성 또는 만성 투여를 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키메라 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드 및 추가적인 화합물은 질병 또는 증상을 치료하기 위한 부가적인 또는 상승적 방식으로 작용한다. 치료제와 조합하여 사용되는 부가적인 화합물은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 소분자, 폴리펩타이드, 항체, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 siRNA 분자를 포함한다. 추가로, 조합 치료제는 또한 다른 비약제 치료제와 함께 본 명세서에 개시된 방법을 포함한다. 조합 치료제의 특성에 의존하여, 다른 치료제가 투여되는 동안 및/또는 그 이후에 본 발명의 키메라 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드의 투여가 지속될 수 있다. 키메라 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드의 투여는 1회 용량 또는 다수회 용량으로 만들어질 수 있다. 일부 예에서, 키메라 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드의 투여는 다른 치료제의 적어도 며칠 전에 시작되는 한편, 다른 예에서, 투여는 다른 치료제 투여 바로 전 또는 투여시 시작된다.
6.8 투여 방법
특정 실시형태에서, 상기 피험자에 투여는 HSA 변이체 또는 키메라 폴리펩타이드를 전신으로 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 피험자에 투여는 HSA 변이체 또는 키메라 폴리펩타이드를 구강으로 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 피험자에 투여하는 단계는 상기 HSA 변이체 또는 키메라 폴리펩타이드를 정맥내로 투여하는 단계를 포함한다.
특정 양태에서, 본 명세서는 본 명세서의 HSA 변이체 또는 키메라 폴리펩타이드, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 실시형태에서, 조성물은 멸균 조성물이다. 특정 실시형태에서, 조성물은 비발열성이다.
다양한 전달 시스템이 알려져 있고, 본 명세서의 키메라 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드, 예를 들어 리포좀 내 캡슐화, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 화합물을 발현시킬 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개 엔도시토시스(endocytosis)를 투여하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432]을 참조). 도입 방법은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 피내, 경피, 근육내, 복강내, 정맥내, 혈관내, 심막내, 피하, 폐, 비강내, 안내, 경막외, 외용 및 구강을 포함하는 장용 또는 비경구일 수 있다. 특정 구체예에서, 비경구 도입은 근육내, 피하, 정맥내, 혈관내 및 심막내 투여를 포함한다.
키메라 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드는 임의의 편리한 경로, 예를 들어 인퓨전 또는 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 점막피부 내벽(예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡착에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소일 수 있다. 폐 투여가 또한, 예를 들어 흡입기 또는 네뷸라이저의 사용에 의해, 및 에어로졸화제가 있는 조제물에 의해 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 치료가 필요한 면적에 국소적으로(예를 들어, 근육) 본 발명의 키메라 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드를 투여하는 것이 바람직할 수 있고; 이는, 예를 들어 제한의 방법에 의하지 않고, 수술 동안 국소적 인퓨전, 외용 도포에 의해, 예를 들어 주사, 카테터에 의해, 또는 임플란트에 의해 달성될 수 있으며, 임플란트는 실라스틱 막, 섬유 또는 상업적 피부 치환체와 같은 막을 포함하는 다공성, 비다공성, 또는 젤라틴질 재료이다.
다른 실시형태에서, 본 명세서의 키메라 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드는 소포, 특히 리포좀 내에서 전달될 수 있다(문헌[anger, 1990, Science 249: 1527-1533]를 참조). 또 다른 실시형태에서, 본 명세서의 키메라 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드는 제어된 방출 시스템 중에서 전달될 수 있다. 다른 실시형태에서, 펌프가 사용될 수 있다(문헌[Langer, 1990, supra]을 참조). 다른 구체예에서, 폴리머 재료가 사용될 수 있다(문헌[Howard et al, 1989, J. Neurosurg. 71: 105]을 참조). 어떤 구체적 실시형태에서, 본 명세서의 키메라 또는 변이체 폴리펩타이드는 정맥내로 전달될 수 있다.
특정 실시형태에서, 키메라 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드는 정맥내 인퓨전에 의해 투여된다. 특정 실시형태에서, 키메라 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드는 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 또는 적어도 30분의 기간 동안 주입된다. 다른 구체예에서, 키메라 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드는 적어도 60, 90, 또는 120분의 기간에 걸쳐 주입된다. 주입 기간에 상관없이, 본 명세서는 키메라 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드가 정기적 스케줄에 따라서(예를 들어 매주, 매월 등) 투여되는 경우 각각의 주입이 전반적인 치료 계획의 부분이라는 것을 생각한다.
6.9 평가 방법
본 명세서의 키메라 폴리펩타이드는 (i) 이종성 단백질의 기능을 실질적으로 보유하고 (ii) FcRn에 대해 증가된 친화도 및/또는 비변형 HSA 부분에 컨쥬게이트된 키메라 폴리펩타이드에 대해 또는 다른 적절한 대조군에 대해 증가된 혈청 반감기를 가지는 것을 기반으로 특징지어진다. 본 명세서의 HSA 변이체 폴리펩타이드는 FcRn에 대해 증가된 친화도 및/또는 천연 HSA 부분에 대해 또는 다른 적절한 대조군에 대해 증가된 혈청 반감기를 가지는 것을 기반으로 특징지어진다. 키메라 폴리펩타이드 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드의 특성은 시험관내 또는 생체내 임의의 하나 이상의 적합한 분석에서 평가될 수 있다.
예로서, FcRn에 대한 친화도(Ka 및/또는 Kd)는 실시예에서 설명된 분석 또는 다른 결합 분석 중 임의의 하나 이상을 사용하여 시험관 내에서 평가될 수 있다. 유사하게 koff 및/또는 kon은 예를 들어 실시예에서 설명되는 분석 또는 다른 결합 분석 중 임의의 하나 이상을 사용하여 시험관 내에서 평가될 수 있다.
항원과 항체 사이 결합의 친화도 상수 및 특이성의 측정은 항-HSA 항체를 사용하는 치료적, 진단적 및 연구 방법의 효능을 결정하는 것에서 중심이 되는 요소이다. "결합 친화도"는 일반적으로 분자의 단일 결합 자리(예를 들어, 항체, HSA 부분)와 그것의 결합 상대(예를 들어, 항원, FcRn)의 비공유적 상호작용의 전체 합의 강도를 말한다. 달리 표시되지 않는다면, 본 명세서에서 사용되는 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원(예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 본질적 결합 친화도를 말한다. 분자 X의 그것의 상대 Y에 대한 친화도는 평형 해리 상수(Kd 또는 KD)에 의해 표시되는데, 이는 koff/kon 비로 계산된다. 예를 들어, 문헌[Chen, Y., et al, (1999) J. Mol Biol 293: 865-881]을 참조한다. 친화도는 BIAcore와 같이 본 명세서에 설명되고 예시된 것을 포함하여 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 측정될 수 있다. 낮은 친화도 항체는 일반적으로 서서히 항원에 결합하며, 용이하게 해리되는 경향이 있는 반면, 높은 친화도는 일반적으로 더 빠르게 항원과 결합하고, 더 길게 결합된 채로 유지되는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법은 당업계에 알려져 있으며, 이중 어떤 것은 본 발명의 목적을 위하여 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드 또는 변이체 HSA 폴리펩타이드는 대조군에 비해 대략 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 또는 대략 5배로 개선된 FcRn에 대한 친화도를 가진다. 특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드는 대조군에 비해 5배 초과, 또는 10배 초과로 개선된 친화도를 가진다. 특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드는 대조군에 비해 20, 25, 40, 또는 50배 초과로 개선된 친화도를 가진다. 특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드는 대조군에 비해 대략 5-10 배, 대략 10-20 배, 대략 25-40 배, 대략 40-50 배, 대략 50-75, 또는 대략 75-100 배로 개선된 친화도를 가진다. 친화도가 Ka를 계산함으로써 평가될 때, 친화도의 이러한 개선은 Ka의 증가로 번역한다(예를 들어, 상기 약술한 바와 같이 2배, 5배, 10배 등). 친화도가 Kd를 계산하는 것에 의해 평가될 때, 친화도의 이러한 개선은 Kd의 감소로 번역한다(예를 들어, 상기 약술한 바와 같이 2배, 5배, 10배 등).
특정 실시형태에서, 낮은 pH에서 FcRn에 대한 친화도(예를 들어, pH ~5.5)가 개선된다. 특정 다른 실시형태에서, 낮은 pH에서 FcRn에 대한 친화도는 개선되며, 중성 pH(예를 들어, pH ~7.2)에서 친화도는 변하지 않는다.
추가적인 예로서, 혈청 반감기는 인간 또는 동물 모델에서 측정될 수 있다. 임의의 동물 모델에서 혈청 반감기의 증가(제한되는 것은 아니지만, 인간 FcRn을 가지는 유전자이식 동물을 포함)는 대조군에 비해 혈청 반김기의 증가를 가지는 키메라 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드를 특징화하기에 충분하다.
한 구체예에서, 키메라 폴리펩타이드 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드는 10일 이상, 바람직하게는 약 14일 이상, 및 가장 바람직하게는 천연 혈청 알부민 단백질 또는 그것의 상동체 반감기의 50% 이상으로 혈액 내 반감기를 가진다. 다른 구체예에서, 키메라 폴리펩타이드 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드의 반감기는 대조군 폴리펩타이드의 반감기에 비해 대략 1.5, 2, 2.5, 3, 4 또는 대략 5배로 증가된다. 특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드의 반감기는 대조군 폴리펩타이드에 비해 5배 초과 또는 심지어 10배 초과로 증가된다. 특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드의 반감기는 대조군 폴리펩타이드의 반감기에 비해 20, 25, 40, 또는 50배 초과로 증가된다. 특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드의 반감기는 대조군 폴리펩타이드의 반감기에 비해 대략 5-10 배, 대략 10-20 배, 대략 25-40 배, 대략 40-50 배, 대략 50-75, 또는 대략 75-100배로 증가된다.
키메라 폴리펩타이드가 이종성 단백질의 기능을 실질적으로 보유하는지 여부를 평가하기 위한 적합한 분석은 이종성 단백질 및 그것의 본래의 기능에 의존할 것이다. 그러나, 기능은 동물 모델을 포함하는 적절한 시험관 내 또는 생체 내 부석에서 평가될 수 있다. 예시적인 기능은, 이에 제한되는 것은 아니지만, (i) 특정 수용체에 결합하는 능력; (ii) 특정 신호 형질도입 경로를 통한 신호처리를 유발하거나 억제하는 능력; (iii) 아포토시스를 유발하거나 억제하는 능력; (iv) 혈관형성을 유발하거나 억제하는 능력; (v) 세포 증식을 자극하거나 억제하는 능력; (vi) 세포 분화를 촉진하거나 억제하는 능력; (vii) 세포 생존을 촉진하는 능력; 및 (viii) 다른 단백질 인자의 분비를 촉진하거나 억제하는 능력을 포함한다.
특정 실시형태에서, 생물학적으로 활성인 이종성 단백질을 포함하는 본 명세서의 키메라 폴리펩타이드는, 예를 들어 HSA 부분에 융합되지 않는 생물학적으로 활성인 이종성 단백질 그 자체보다 더 강력하다. 예를 들어, 키메라 폴리펩타이드는 생물학적으로 활성인 단백질 서열 단독보다 2배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 또는 심지어 1000배 더 활성, 예를 들어 10의 1, 2 또는 심지어 3제곱 더 활성일 수 있다. 따라서 실시형태에서 생물학적으로 활성인 펩타이드 서열은 생물학적 활성을 억제하며, 키메라 폴리펩타이드의 IC50은 생물학적으로 활성인 단백질 단독의 IC50 보다 10배 더 낮고, 100배 더 낮고, 또는 심지어 1000배 더 낮을 수 있으며, 실시형태에서, 생물학적으로 활성인 단백질 서열은 생물학적 활성을 유발하거나 촉진하고, 키메라 폴리펩타이드의 EC50은 생물학적으로 활성인 펩타이드 단독의 EC50보다 10배 더 낮고, 100배 더 낮고, 또는 심지어 1000배 더 낮을 수 있다. 실시형태에서, 생물학적으로 활성인 단백질 서열은 생물학적 분자, 예컨대 핵산, 펩타이드 또는 탄수화물에 결합되며, 그것이 결합하는 키메라 폴리펩타이드 및 생물학적 분자의 해리 상수 Ka는 생물학적 분자 및 생물학적으로 활성인 단백질 단독의 Kd보다 10배 더 낮고, 100배 더 낮고, 또는 심지어 1000배 더 낮을 수 있으며, 예를 들어 2개의 완전체의 결합은 그것의 해리에 있어 점점 더 선호된다.
6.10 약제학적 조성물
특정 실시형태에서, 본 명세서의 대상 키메라 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드는 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 조제된다. 하나 이상의 키메라 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드는 단독으로 또는 약제학적 조제물(조성물)의 성분으로서 투여될 수 있다. 키메라 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드는 인간 또는 수의학적 의약에서 사용을 위해 임의의 편리한 방법으로 투여를 위해 조제될 수 있다. 라우릴 황산나트륨 및 스테아르산 마그네슘과 같은 습윤제, 에멀젼화제 및 윤활제뿐만 아니라 착색제, 방출제, 코팅제, 감미제, 향미제 및 방향제, 보존제 및 항산화제가 또한 조성물 내에서 제공될 수 있다.
대상 키메라 또는 HSA 변이체 폴리펩티의 조제물은 구강, 비강, 외용, 비경구, 직장 및/또는 질내 투여에 적합한 것을 포함한다. 조제물은 단위 제형으로 편리하게 제공될 수 있고, 약학 업계에 잘 알려진 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 단일 제형을 만들기 위한 담체 재료와 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 처리되는 숙주 및 특정 투여 방식에 의존하여 다를 것이다. 단일 제형을 생성하기 위해 담체 재료와 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료적 효과를 생성하는 화합물의 양일 것이다.
특정 실시형태에서, 이 조제물 또는 조성물의 제조방법은 다른 유형의 치료제 및 담체 및 선택적으로 하나 이상의 부수적 성분들을 조합하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 조제물은 액체 담체, 또는 미세하게 분할된 고체 담체, 또는 둘 다와 함께 제조될 수 있고, 다음으로 필요하다면 제품을 성형할 수 있다.
경구 투여를 위한 조제물은 캡슐, 사쉐, 알약, 정제, 로젠지(가향된 베이시스를 사용, 보통 수크로스 및 아카시아 또는 트래거캔스), 분말, 과립의 형태, 또는 수성 또는 비수성 액체의 용액 또는 현탁액으로, 또는 수중유 또는 유중수 액체 에멀젼으로, 또는 엘릭시르 또는 시럽으로, 또는 패스틸(불활성 베이스, 예컨대 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로스 및 아카시아를 사용) 및/또는 마우스워시 등의 형태로 있을 수 있고, 각각은 활성 성분으로서 대상 폴리펩타이드 치료제의 사전 결정된 양을 함유한다. 활성 화합물에 더하여 현탁액은 에톡실화된 아이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨, 및 소르비탄 에스터, 미정질 셀룰로스, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 한천 및 트래거캔스, 및 이들의 혼합물과 같은 현탁제를 함유할 수 있다.
경구 투여를 위한 고체 제형에서(캡슐, 정제, 알약, 드라제, 분말, 과립 등), 본 발명의 하나 이상의 폴리펩타이드 치료제는 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 예컨대 시트르산 나트륨 또는 제2인산칼슘, 및/또는 다음 중 어떤 것과 혼합될 수 있다: (1) 충전제 또는 전색제, 예컨대 전분, 락토스, 수크로스, 글루코스, 만니톨 및/또는 규산; (2) 예들 들어 카복시메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 수크로스, 및/또는 아카시아와 같은 결합제; (3) 글리세롤과 같은 보습제; (4) 한천, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 어떤 규산염, 및 탄산나트륨과 같은 붕해제; (5) 용액 완염제, 예컨대 파라핀; (6) 흡착 가속화제, 예컨대 4가 암모늄 화합물; (7) 예를 들어 세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트와 같은 습윤제; (8) 흡수제, 예컨대 카올린 및 벤토나이트 점토; (9) 윤활제, 예컨대 활석, 스테아르산칼슘, 스테아르산 마그네슘, 고체 폴리에틸렌 글라이콜, 라우릴 황산나트륨 및 이들의 혼합물; 및 (10) 착색제. 캡슐, 정제 및 알약의 경우에, 약제학적 조성물은 또한 완충제를 포함할 수 있다. 유사한 유형의 고체 조성물이 또한 락토스 또는 유당뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글라이콜 등으로서 이러한 부형제를 사용하는 연질 및 경질 충전 젤라틴 캡슐 내 충전제로 사용될 수 있다. 구강 투여를 위한 액체 제형은 약제학적으로 허용가능한 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 활성 성분에 더하여, 액체 제형은 당업계에서 통상적으로 사용되는 불활성 희석제, 예컨대 물 또는 다른 용매, 가용화제 및 에멀젼화제, 예컨대 에틸 알코올, 아이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글라이콜, 1,3-뷰틸렌 글라이콜, 오일(특히, 면실 오일, 땅콩 오일, 옥수수 오일, 배아 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일), 글라이세롤, 테트라하이드로푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글라이콜 및 소르비탄의 지방산 에스터, 및 이들의 혼합물을 함유할 수 있다. 불활성 희석제 이외에, 구강 조성물은 또한 습윤제, 에멀젼화제 및 현탁제, 감미제, 향미제, 착색제, 방향제 및 보존제와 같은 보조제를 포함할 수 있다.
비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 멸균 등장성 수성 또는 비수성 용액, 분산물, 현탁액 또는 에멀젼, 또는 사용 바로 전 멸균 주사가능 용액 또는 분산물로 재구성될 수 있는 멸균 분말과 조합으로 하나 이상의 키메라 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드를 포함할 수 있는데, 이는 항산화제, 완충제, 세균 발육 저지제, 의도된 수용자의 혈액 또는 현탁제 또는 농후제 등장성인 조제물을 제공하는 용질을 함유할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물 중에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올(예컨대 글라이세롤, 프로필렌 글라이콜, 폴리에틸렌 글라이콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스터, 예컨대 에틸 올레이트를 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅 재료의 사용에 의해, 분산물의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
이 조성물은 또한 보존제, 습윤제, 에멀젼화제 및 분산제와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항박테리아 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로뷰탄올, 페놀 소르빈산 등의 포함에 의해 보장될 수 있다. 이는 또한 등장제, 예컨대 당, 염화나트륨 등을 조성물에 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 게다가, 주사가능한 약제학적 형태의 연장된 흡착은 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같이 흡착을 지연시키는 약제의 포함에 의해 초래될 수 있다.
특정 실시형태에서, 약제학적 조성물을 포함하는 본 명세서의 조성물은 비발열성이다. 다시 말해서, 특정 실시형태에서, 조성물은 실질적으로 파이로겐(pyrogen)이 없다. 한 실시형태에서, 본 발명의 조제물은 엔도톡신 및/또는 관련된 파이로겐 물질이 실질적으로 없는 무 파이로겐 조제물이다. 엔도톡신은 미생물 내에서 국한되고 미생물이 파괴되거나 죽을 때 방출된 독소를 포함한다. 파이로겐 물질은 또한 박테리아 및 다른 미생물의 외막으로부터의 열유발성, 열안정성 물질(글라이코단백질)을 포함한다. 이 물질 둘 다는 인간에게 투여된다면 열, 저혈압 및 쇼크를 야기할 수 있다. 잠재적인 해로운 효과에 기인하여, 낮은 양의 엔도톡신 조차도 정맥내로 투여된 약제학적 약물 용액으로부터 제거되어야 한다. Food & Drug Administration("FDA")는 정맥내 약물 용도를 위해 1회 한 시간 기간으로 5 엔도톡신 단위(EU)/용량/킬로그램 체중의 상한이 설정되었다(The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1):223 (2000)). 항체의 경우에 있을 수 있는 바와 같이, 치료적 단백질이 수 백 또는 수 천 밀리그램/킬로그램 체중의 양으로 투여될 때, 해롭고 위험한 엔도톡신의 미량조차도 제거되어야한다. 어떤 구체적 실시형태에서, 조성물 내 엔도톡신 및 파이로겐 수준은 10 EU/㎎ 미만, 또는 5 EU/㎎ 미만, 또는 1 EU/㎎ 미만, 또는 0.1 EU/㎎ 미만, 또는 0.01 EU/㎎ 미만, 또는 0.001 EU/㎎ 미만이다.
주사가능한 데포 형태는 폴리락타이드-폴리글라이콜라이드와 같은 생체분해가능한 폴리머 내 하나 이상의 폴리펩타이드 치료제의 마이크로캡슐 매트릭스를 형성하는 것에 의해 제조된다. 약물 대 폴리머의 비, 및 사용된 특정 폴리머의 특성에 의존하여 약물 방출 속도가 제어될 수 있다. 다른 생체분해가능한 폴리머의 예는 폴리(오쏘에스터) 및 폴리(무수물)을 포함한다. 데포 주사가능 조제물은 또한 신체 조직과 양립가능한 리포좀 또는 마이크로에멀젼 내 약물을 포괄(entrapping)함으로써 제조된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서의 키메라 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드는 인간에 대한 정맥 내 투여에 적합하게 된 약제학적 조성물로 일상적인 과정에 따라서 조제된다. 필요한 경우, 조성물은 또한 가용화제 및 국소 마취제, 예컨대 주사 자리에서 통증을 덜어주는 리도카인을 포함할 수 있다. 조성물이 인퓨전에 의해 투여되는 경우, 이는 멸균 약제학적 등급수 또는 식염수를 함유하는 인퓨전 보틀을 생략할 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 주사용 멸균수의 앰플 또는 식염수가 제공될 수 있고, 따라서 성분들은 투여 전에 혼합될 수 있다.
조직 관련 질환 또는 질병의 치료에 효과적일 본 명세서의 키메라 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드의 양은 표준 임상 기법에 의해 결정될 수 있다. 추가로, 시험관내 분석은 최적의 투약 범위를 확인하게 하기 위해 선택적으로 사용될 수 있다. 조제물 내 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 질환의 심각성에 의존할 것이고, 실행자의 판단 및 각 피험자의 형편에 따라서 결정되어야 한다. 그러나, 정맥 투여를 위한 적합한 투약 범위는 일반적으로 킬로그램 체중 당 활성 키메라 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드의 약 20-5000 마이크로그램이다. 비강내 투여를 위한 적합한 투약 범위는 일반적으로 약 0.01 pg/㎏ 내지 1 ㎎/㎏ 체중이다. 효과적인 용량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유도된 용량-반응 곡선으로부터 추론될 수 있다.
6.11 제조물품 및 키트
특정 실시형태에서, 본 명세서는 또한 본 명세서의 적어도 하나의 키메라 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드로 채운 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 포장 또는 키트를 제공한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서의 조제물은 다른 모이어티에 재조합적으로 융합된 또는 화학적으로 컨쥬게이트된 키메라 또는 HSA 변잉체 폴리펩타이드를 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니지만, 이종성 단백질, 이종성 폴리펩타이드, 이종성 펩타이드, 거대 분자, 소분자, 마커 서열, 진단적 또는 검출가능한 작용물질, 치료적 모이어티, 약물 모이어티, 방사성 금속 이온, 제2 항체 및 고체 지지체를 포함한다. 구체적 실시형태에서, 본 명세서의 조제물은 멸균 액체로서 1회 용량 바이알 내에서 조제된다. 본 명세서의 조제물은 3 cc USP I형 붕규산염 앰버 바이알 중에서 1.2 ㎖의 표적 부피로 공급될 수 있다(West Pharmaceutical Serices - Part No. 6800-0675). 예시적인 용기는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 바이알, 보틀, 사전에 채운 주사기, IV 백, 블리스터 팩(하나 이상의 알약을 포함)을 포함한다. 선택적으로 관련된 이러한 용기(들)는 약제 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 조절하는 정부 기관에 의해 규정된 형태로 안내문이 있을 수 있으며, 이런 안내문은 인간 진단 및/또는 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매의 기관에 의한 승인을 반영한다.
특정 실시형태에서, 키메라 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드를 포함하는 키트는 또한, 예를 들어 혈청 반감기를 증가시키거나 치료제의 FcRn 결합 친화도를 증가시키는 다양한 목적을 위해 유용하게 제공된다. 시약의 분리 및 정제를 위해, 키트는 비드(예를 들어, 세파로스 비드)에 커플링된 폴리펩타이드를 함유할 수 있다. 키트는, 예를 들어 ELISA 또는 웨스턴 블롯에서 시험관내 표적의 검출 및 정량화를 위한 폴리펩타이드를 함유하도록 제공된다. 제조물품에 의해, 키트는 용기 및 라벨 또는 용기 상의 또는 용기와 관련된 포장 삽입물을 포함한다. 용기는 적어도 하나의 본 명세서의 키메라 또는 HSA 변이체 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 보유한다. 부가적인 용기는, 예를 들어 희석제 및 완충제, 대조군 진단 시약을 함유하도록 포함될 수 있다. 표지 또는 포장 삽입물은 조성물의 설명뿐만 아니라 시험관내 또는 진단적 사용에서 의도되는 설명서를 제공할 수 있다.
6.12 아데노바이러스 벡터 및 방법
숙주 세포로부터 재조합 아데노바이러스 입자의 발생에 유용한 DNA 벡터는 당업계에 잘 알려져 있으며 상업적 시약은 용이하게 이용가능하다(예를 들어 Invitrogen제의 Catalog Nos. V493-20 및 V494-20). 본 명세서는 아데노바이러스 입자(또한 본 명세서에서 아데노바이러스 벡터로 언급됨)의 발생에 유용한 DNA 벡터로 OriP 서열을 포함함으로써 재조합 아데노바이러스의 발생을 향상시키는 방법을 제공한다. OriP 함유 아데노바이러스 벡터는 EBNA-1 단백질의 발현을 위한 서열을 추가로 포함할 수 있고 또는 대안으로 EBNA-1 단백질을 발현시키는 숙주 세포가재조합 아데노바이러스 입자의 발생을 위해 사용된다. OriP 함유 아데노바이러스 벡터는 관심의 DNA 서열(예를 들어, HSA 도메인 III 변이체를 암호화하는 DNA 서열)의 다양하고/복잡한 라이브러리를 포함하는 재조합 아데노바이러스의 집단의 발생에 특히 유용하다.
OriP 서열은 당업계에 알려진 다수의 기법을 사용하여 임의의 알려진 아데노바이러스 벡터로 용이하게 유전자조작될 수 있다. 예를 들어, Gateway 재조합 시스템이 이용된다면, OriP 서열은 유입 벡터 또는 아데노바이러스 지정 벡터의 att 재조합 자리 사이에 위치되어야 한다. 아데노바이러스 벡터에 서열이 부가될 때, 아데노바이러스 DNA의 복제 또는 조립체를 방해하는 자리에 그것들을 삽입하는 것을 회피하도록 관리되어야 한다. 대안으로, 또는 선택적으로 OriP 서열을 함유하는 아데노바이러스 벡터는 또한 유전자 조작되어 EBNA-1 단백질을 발현시킨다(도 10을 참조). 아데노바이러스 벡터로부터 직접 EBNA-1 단백질을 발현시킴으로써, 숙주 세포는 EBNA-1 유전자를 발현시킬 필요가 없다.
본 발명의 아데노바이러스 벡터는 OriP 서열 및 아데노바이러스 게놈 서열을 포함한다. 본 발명의 아데노바이러스 벡터는 다음의 구성요소 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다:
(i) 다른 벡터와 재조합 클로닝을 위한 재조합 자리(들)(예를 들어, attR1 및 attR2), 이러한 자리는 본 벡터로부터 발생된 재조합 아데노바이러스 내 발현을 위해 관심의 DNA 서열 클로닝을 달성하는 것에 유용하다;
(ii) 선택 및/또는 반대 선택에 유용한 항생물질/약물(예를 들어, 클로르암페니콜) 저항성 유전자(들) 및/또는 독소 발현 유전자(예를 들어 ccdB 유전자);
(iii) 관심의 DNA 서열을 서브클로닝하는데 유용한 클로닝 자리(는 다중 클로닝 자리일 수 있다);
(iv) 관심의 하나 이상의 단백질을 암호화하는 관심의 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있는 관심의 DNA;
(v) 넓은 범위의 포유류 세포에서 관심 유전자의 발현을 위한 프로모터(예를 들어, 인간 세포거대바이러스(CMV) 전초기 프로모터), 프로모터는 구성요소일 수 있고, 또는 유도성일 수도 있다;
(vi) 관심 단백질의 검출 및/또는 정제를 위한 에피토프 태그(예를 들어, His6X 에피토프). 에피토프 태그는 관심의 재조합 단백질의 5' 또는 3' 말단 중 하나에서 제공될 수 있다;
(vii) mRNA의 효율적인 전사 종결 및 폴리아데닐화를 위한 폴리아데닐화(폴리 A) 서열(예를 들어, Simian 40 바이러스 폴리A 서열);
(viii) 대장균에서 플라스미드의 고복제물 복제 및 유지를 위한 복제 원점;
(ix) 대장균에서 선택을 위한 항생물질 저항성 유전자;
(x) 벡터를 선형화하기 위한 제한효소 자리(들)(예를 들어, Pad), 제한 효소 자리는 구성요소 (viii) 및 (ix) 옆에 있을 수 있다; 및
(xi) EBNA-1 단백질을 암호화하는 DNA 서열.
플라스미드 DNA 합성, oriP의 엡스타인-바르 바이러스(EBV)은 다양한 더 고등의 진핵 세포에서 DNA 합성을 지지한다. 대표적인 OriP 서열은 도 9c에서 제공된다. 이 원점은 단지 하나의 바이러스 단백질, 즉 EBNA-1를 사용하는 반면, 모든 다른 인자들은 세포에 의해 제공된다. 특정 실시형태에서 EBNA-1 단백질은 숙주 세포(예를 들어, 293E 세포)에 의해 제공된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 아데노바이러스 벡터는 구성요소 (xi) EBNA-1 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 추가로 포함한다. 대표적인 EBNA-1 단백질 및 DNA 서열은 각각 도 9a 및 9b에서 제공된다.
아데노바이러스 게놈 서열(예를 들어, 인간 아데노바이러스 5형 서열)이 아데노바이러스의 적절한 포장 및 생성에 필요한 유전자 및 다른 구성요소(예를 들어 왼쪽 및 오른쪽 반전 말단 반복체(Inverted Terminal Repeat: ITR), 캡슐화 신호 서열, 후기 유전자)를 암호화한다는 것이 구체적으로 생각된다(Hitt et al, 1999, The Development of Human Gene Therapy, T. Friedmann, ed. (Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press), pp. 61-86; Russell, 2000, J. Gen. Virol. 81, 2573-2604). 아데노바이러스 게놈 서열은 완전한 아데노바이러스 게놈을 암호화할 수 있다. 대안으로 아데노바이러스 게놈 서열은 하나 이상의 단백질 및/또는 조절 구성요소를 제외하고 모든 단백질 및 다른 조절 구성요소를 암호화할 수 있는데, 이는 트랜스로 제공되어, 복제-불완전 아데노바이러스를 생성한다. 예를 들어 E1 단백질(E1a 및 E1b)을 암호화하는 E1 영역은 본 발명의 아데노바이러스 벡터로부터 제외될 수 있다(Russell, 2000, J. Gen. Virol. 81, 2573-2604). 상실 단백질 및/또는 다른 구성요소는 다음으로 일반적으로 아데노바이러스를 발생시키도록 사용된 숙주에 의해 트랜스로 제공되며, 예를 들어 293개 세포주는 E1 영역의 게놈 복제물을 함유한다. 구체적 실시형태에서, 아데노바이러스 게놈 서열은 야생형 서열 1-458 및 3513-35935에 대응하는 인간 아데노바이러스 5형 서열을 본질적으로 포함하거나, 본질적으로 이루어진다.
특정 구성요소가 조합으로 제공되고 및/또는 다른 구성요소를 포함할 수 있다는 것, 예를 들어 구성요소 (iv)는 구성요소 (v) 내지 (vii)를 포함할 수 있다는 것은 당업자에 의해 이해될 것이다. 특정 구성요소가 다른 구성요소에 대해 5' 및/또는 3'으로 제공되고, 예를 들어 구성요소 (x)는 아데노바이러스 벡터의 선형화에 유용할 수 있으며, 선형화를 위해 포함될 때 구성요소 (x)는 5'ITR에 대한 5' 및/또는 3'ITR에 대한 3'을 제공하여야 한다는 것은 추가로 이해될 것이다. 유사하게, 구성요소 (viii) 및 (ix)은 존재할 때, 그것들이 구조 아데노바이러스에 포함되지 않도록 일반적으로 위치되며, 예를 들어 이 구성요소는 5'ITR에 대한 5' 및/또는 3'ITR에 대한 3'으로 위치될 수 있다. OriP 및 구성요소(i)-(vii)는 존재한다면, 다른 면 상의 3'ITR을 포함하는 아데노바이러스 게놈 서열에 의해 및 5' ITR 서열에 의해 한 자리 옆에 위치된다(예를 들어, 도 10).
구성요소 (i), (ii), (iv), (viii) 내지 (x) 및 선택적으로 (xi)을 포함하는 본 발명의 대표적인 아데노바이러스 벡터가 도 10에 제공된다.
7 실시형태
1. (a) 인간 혈청 알부민(HSA) 부분(HSA 부분은 HSA 도메인 III, 또는 이것의 신생아 Fc 수용체(FcRn) 결합 단편을 포함한다), 및 (b) 이종성 단백질(키메라 폴리펩타이드는 이종성 단백질의 기능적 활성을 보유하고 FcRn에 결합할 수 있으며, 상기 HSA 도메인 III은 대조군 키메라 폴리펩타이드에 비해 FcRn에 대한 친화도 및 키메라 폴리펩타이드의 혈청 반감기 중 하나 또는 둘 다가 증가하도록 1 내지 18개의 아미노산 치환을 포함하며, 이때 HSA 부분은 상기 아미노산 치환을 포함하지 않는다)을 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
2. 실시형태 1에 있어서, 키메라 폴리펩타이드는 상기 대조군 키메라 폴리펩타이드보다 더 높은 친화도로 FcRn에 결합하는 키메라 폴리펩타이드.
3. 실시형태 1 또는 2에 있어서, 키메라 폴리펩타이드는 상기 대조군 키메라 폴리펩타이드보다 더 높은 친화도로 FcRn에 결합하며, 상기 친화도는 산성 pH에서 측정되는 키메라 폴리펩타이드.
4. 실시형태 3에 있어서, 산성 pH는 5.0 내지 6.0인 키메라 폴리펩타이드.
5. 실시형태 4에 있어서, 산성 pH는 5.5±0.2인 키메라 폴리펩타이드.
6. 실시형태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 키메라 폴리펩타이드는 산성 pH에서 상기 대조군 키메라 폴리펩타이드보다 더 높은 친화도로 FcRn에 결합하지만, 키메라 폴리펩타이드는 중성 pH에서 상기 대조군 키메라 폴리펩타이드보다 더 높은 친화도로 FcRn에 결합하지 않는 키메라 폴리펩타이드.
7. 실시형태 6에 있어서, 중성 pH는 6.9 내지 7.9인 키메라 폴리펩타이드.
8. 실시형태 7에 있어서, 중성 pH는 7.4 ±0.2인 키메라 폴리펩타이드.
9. 실시형태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 키메라 폴리펩타이드는 FcRn에 결합하며, 상기 대조군 키메라 폴리펩타이드와 다른 해리 속도 또는 결합 속도를 가지는 키메라 폴리펩타이드.
10. 실시형태 9에 있어서, 키메라 폴리펩타이드는 FcRn에 결합하며, 상기 대조군 폴리펩타이드에 비해 증가된 결합 속도 및/또는 감소된 해리 속도를 가지는 키메라 폴리펩타이드.
11. 실시형태 9에 있어서, 키메라 폴리펩타이드는 FcRn에 결합하며, 상기 대조군 폴리펩타이드에 비해 증가된 해리 속도를 가지는 키메라 폴리펩타이드.
12. 실시형태 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III은 1 내지 10개의 아미노산 치환을 포함하여 대조군 키메라 폴리펩타이드에 비해 키메라 폴리펩타이드의 혈청 반감기를 증가시키며, HSA 부분은 상기 아미노산 치환을 포함하지 않는 키메라 폴리펩타이드.
13. 실시형태 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 다양한 종에 걸쳐 보존된 키메라 폴리펩타이드.
14. 실시형태 13에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 다양한 종에 걸쳐 보존된 잔기를 가지는 키메라 폴리펩타이드.
15. 실시형태 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 인간, 돼지, 래트, 마우스, 개, 토끼, 소, 닭, 당나귀, 모래쥐, 양, 고양이 및 말로부터의 혈청 알부민 단백질 중에서 보존된 잔기를 가지는 키메라 폴리펩타이드.
16. 실시형태 15에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 인간, 돼지, 래트, 마우스, 개, 토끼, 소, 닭, 당나귀, 모래쥐, 양, 고양이 및 말로부터 혈청 알부민 단백질 중에서 보존된 잔기를 가지는 키메라 폴리펩타이드.
17. 실시형태 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 표 5에서 열거된 것으로부터 선택된 키메라 폴리펩타이드.
18. 실시형태 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 전장 성숙 HSA(서열 번호 2) 내 위치에 대해 넘버링된 다음의 위치 중 어느 하나에 있는 키메라 폴리펩타이드: 잔기 381, 잔기 383, 잔기 391, 잔기 401, 잔기 402, 잔기 407, 잔기 411, 잔기 413, 잔기 414, 잔기 415, 잔기 416, 잔기 424, 잔기 426, 잔기 434, 잔기 442, 잔기 445, 잔기 447, 잔기 450, 잔기 454, 잔기 455, 잔기 456, 잔기 457, 잔기 459, 잔기 463, 잔기 495, 잔기 506, 잔기 508, 잔기 509, 잔기 511, 잔기 512, 잔기 515, 잔기 516, 잔기 517, 잔기 519, 잔기 521, 잔기 523, 잔기 524, 잔기 525, 잔기 526, 잔기 527, 잔기 531, 잔기 535, 잔기 538, 잔기 539, 잔기 541, 잔기 557, 잔기 561, 잔기 566, 잔기 569.
19. 실시형태 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 키메라 폴리펩타이드는 전장 성숙 HSA 내 위치에 대해 넘버링되고, 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 HSA 도메인 III 내 아미노산 치환을 포함하는 키메라 폴리펩타이드: (a) 잔기 383 및 413; (b) 잔기 401 및 523; (c) 잔기 407 및 447; (d) 잔기 407 및 447 및 539; (e) 잔기 407 및 509; (f) 잔기 407 및 526; (g) 잔기 411 및 535; (h) 잔기 414 및 456; (i) 잔기 415 및 569; (j) 잔기 426 및 526; (k) 잔기 442 및 450 및 459; (l) 잔기 463 및 508; (m) 잔기 508 및 519 및 525; (n) 잔기 509 및 527; (o) 잔기 523 및 538; (p) 잔기 526 및 557; 및 (q) 잔기 541 및 561.
20. 실시형태 1 내지 15, 또는 18 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 V381N, V381Q, E383A, E383G, E383I, E383L, E383V, N391A, N391G, N391I, N391L, N391V, Y401D, Y401E, K402A, K402G, K402I, K402L, K402V, L407F, L407N, L407Q, L407W, L407Y, Y411Q, Y411N, K413C, K413S, K413T, K414S, K414T, V415C, V415S, V415T, Q416H, Q416P, V424A, V424G, V424I, V424L, V424N, V424Q, V426D, V426E, V426H, V426P, G434C, G434S, G434T, E442K, E442R, R445F, R445W, R445Y, P447S, P447T, E450D, E450E, S454C, S454M, S454T, V455N, V455Q, V456N, V456Q, L457F, L457W, L457Y, Q459K, Q459R, L463N, L463Q, E495D, T506F, T506W, T506Y, T508K, T508R, T508S, F509C, F509I, F509L, F509M, F509V, F509W, F509Y, A511F, A511W, A511Y, D512F, D512W, D512Y, T515C, T515H, T515N, T515P, T515Q, T515S, L516F, L516S, L516T, L516W, L516Y, S517C, S517F, S517M, S517T, S517W, S517Y, K519A, K519G, K519I, K519L, K519V, R521F, R521W, R521Y, I523A, I523D, I523E, I523F, I523G, I523I, I523K, I523L, I523N, I523Q, I523R, I523V, I523W, I523Y, K524A, K524G, K524I, K524L, K524V, K525A, K525G, K525I, K525L, K525V, Q526C, Q526M, Q526S, Q526T, Q526Y, T527F, T527W, T527Y, E531A, E531G, E531I, E531L, E531V, H535D, H535E, H535P, K538F, K538W, K538Y, A539I, A539L, A539V, K541F, K541W, K541Y, K557A, K557G, K557I, K557L, K557V, A561F, A561W, A561Y, T566F, T566W, T566Y, A569H, 및 A569P로 이루어진 군으로부터 선택된 키메라 폴리펩타이드.
21. 실시형태 1 내지 15 또는 18 또는 20 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 V381N, E383G, N391V, Y401E, K402A, L407N, L407Y, Y411Q, K414S, K413S, V415T, V415C, Q416P, V424I, V424Q, V426E, V426H, G434C, E442K, R445W, P447S, E450D, S454C, V455N, V456N, L457F, Q459R, L463N, E495D, T506Y, T508R, T508S, F509I, F509M, F509W, A511F, D512Y, T515P, T515Q, T515S, L516T, L516W, S517C, S517W, K519I, R521W, I523D, I523E, I523Q, I523K, I523G, I523R, I523Y, K524L, K524V, K525V, Q526T, Q526M, Q526Y, T527Y, E531I, H535N, H535P, K538Y, A539I, K541F, K557G, A561F, T566W, 및 A569P로 이루어진 군으로부터 선택된 키메라 폴리펩타이드.
22. 실시형태 1 내지 15 또는 18 중 어느 하나에 있어서, 키메라 폴리펩타이드는 V381N, E383G, N391V, Y401E, K402A, L407N, L407Y, Y411Q, K414S, K413S, V415T, V415C, Q416P, V424I, V424Q, V426E, V426H, G434C, E442K, R445W, P447S, E450D, S454C, V455N, V456N, L457F, Q459R, L463N, E495D, T506Y, T508R, T508S, F509I, F509M, F509W, A511F, D512Y, T515P, T515Q, T515S, L516T, L516W, S517C, S517W, K519I, R521W, I523D, I523E, I523Q, I523K, I523G, I523R, I523Y, K524L, K524V, K525V, Q526T, Q526M, Q526Y, T527Y, E531I, H535N, H535P, K538Y, A539I, K541F, K557G, A561F, T566W, 및 A569P로 이루어진 군으로부터 선택된 HSA 도메인 III 내 하나의 아미노산 치환을 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
23. 실시형태 21에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 L407N, L407Y, V415T, V424I, V424Q, V426E, V426H, P447S, V455N, V456N, L463N, E495D, T506Y, T508R, F509M, F509W, A511F, D512Y, T515Q, L516T, L516W, S517W, R521W, I523D, I523E, I523G, I523K, I523R, K524L, Q526M, T527Y, H535P 및 K557G로 이루어진 군으로부터 선택된 키메라 폴리펩타이드.
24. 실시형태 22에 있어서, 키메라 폴리펩타이드가 L407N, L407Y, V415T, V424I, V424Q, V426E, V426H, P447S, V455N, V456N, L463N, E495D, T506Y, T508R, F509M, F509W, A511F, D512Y, T515Q, L516T, L516W, S517W, R521W, I523D, I523E, I523G, I523K, I523R, K524L, Q526M, T527Y, H535P 및 K557G로 이루어진 군으로부터 선택된 HSA 도메인 III 내 하나의 아미노산 치환을 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
25. 실시형태 1 내지 14, 또는 18 중 어느 하나에 있어서, 키메라 폴리펩타이드가 (a) E383G/K413S; (b) Y401E/I523G, (c) L407N/P447S; (d) L407N/P447S/A539I; (e) L407N/F509M; (f)L407Y/Q526T; (g) Y411Q/H535N; (h) K414S/V456N; (i) V415T/A569P; (j) V426H/Q526Y; (k) E442K/E450D/Q459R; (l) L463N/T508R; (m) T508R/K519I/K525V; (n) F509I/T527Y; (o) I523Q/K538Y; (p) Q526M/K557G; 및 (q) K541F/A561F로 이루어진 군으로부터 선택된 HSA 도메인 III 내 아미노산 치환을 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
26. 실시형태 25에 있어서, 키메라 폴리펩타이드가 (a) L407N/P447S; (b) L407N/P447S/A539I; (c) L407N/F509M; (d) Y411Q/H535N; (e) K414S/V456N; (f) V426H/Q526Y; (g) L463N/T508R; (h) F509I/T527Y; (i) I523Q/K538Y; (j) Q526M/K557G; 및 (k) K541F/A561F로 이루어진 군으로부터 선택된 HSA 도메인 III 내 아미노산 치환을 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
27. 실시형태 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 인간, 돼지, 래트, 마우스, 개, 토끼, 소, 닭, 당나귀, 모래쥐, 양, 고양이 및 말로부터의 혈청 알부민 단백질 중에서 보존되지만, 닭 혈청 알부민 중에서 보존되지 않는 잔기를 가지는 키메라 폴리펩타이드.
28. 실시형태 27에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 인간, 돼지, 래트, 마우스, 개, 토끼, 소, 닭, 당나귀, 모래쥐, 양, 고양이 및 말로부터의 혈청 알부민 단백질 중에서 보존되지만, 닭 혈청 알부민 중에서 보존되지 않는 잔기를 가지는 키메라 폴리펩타이드.
29. 실시형태 15에 있어서, HSA 도메인 내 적어도 적어도 하나의 아미노산 치환은 전장 성숙 HSA(서열 번호 2) 내 위치에 대해 넘버링된 다음의 위치 중 어느 하나에 있는 키메라 폴리펩타이드: 잔기 383, 잔기 389, 잔기 391, 잔기 410, 잔기 417, 잔기 425, 잔기 442, 잔기 465, 잔기 467, 잔기 468, 잔기 486, 잔기 499, 잔기 502, 잔기 520, 잔기 532, 잔기 536, 잔기 543, 및 잔기 571.
30. 실시형태 29에 있어서, 상기 HSA 도메인 내 적어도 하나의 아미노산 치환은 전장 성숙 HSA 내 위치에 대해 넘버링된 다음의 위치 중 어느 하나에 있는 키메라 폴리펩타이드: 잔기 383, 잔기 391, 잔기 434, 잔기 442, 잔기 445, 및 잔기 450.
31. 실시형태 30에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 V381N, E383A, E383G, E383I, E383L, E383V, N391A, N391G, N391I, N391L, N391V, G434C, G434S, G434T, E442K, E442R, R445F, R445W, R445Y, E450D, 및 E450E로 이루어진 군으로부터 선택된 키메라 폴리펩타이드.
32. 실시형태 29에 있어서, 상기 HSA 도메인 III 내 적어도 하나의 아미노산 치환은 전장 성숙 HSA 내 위치에 대해 넘버링된 다음의 위치 중 어느 하나에 있는 키메라 폴리펩타이드: 잔기 417, 잔기 442, 잔기 499, 및 잔기 502.
33. 실시형태 27에 있어서, 상기 HSA 도메인 III 내 적어도 하나의 아미노산 치환은 전장 성숙 HSA 내 위치에 대해 넘버링된 다음의 위치 중 어느 하나에 있는 키메라 폴리펩타이드: 잔기 380, 잔기 381, 잔기 384, 잔기 387, 잔기 396, 잔기 401, 잔기 404, 잔기 405, 잔기 406, 잔기 409, 잔기 419, 잔기 421, 잔기 422, 잔기 424, 잔기 428, 잔기 430, 잔기 431, 잔기 433, 잔기 441, 잔기 457, 잔기 458, 잔기 463, 잔기 464, 잔기 466, 잔기 469, 잔기 470, 잔기 474, 잔기 475, 잔기 480, 잔기 481, 잔기 489, 잔기 491, 잔기 495, 잔기 500, 잔기 508, 잔기 510, 잔기 515, 잔기 516, 잔기 524, 잔기 525, 잔기 526, 잔기 528, 잔기 531, 잔기 535, 잔기 539, 잔기 544, 잔기 547, 및 잔기 576.
34. 실시형태 33에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 전장 성숙 HSA 내 위치에 대해 넘버링된 다음의 위치 중 어느 하나에 있는 키메라 폴리펩타이드: 잔기 381, 잔기 401, 잔기 424, 잔기 457, 잔기 463, 잔기 495, 잔기 508, 잔기 515, 잔기 516, 잔기 524, 잔기 525, 잔기 526, 잔기 531, 잔기 535, 및 잔기 539.
35. 실시형태 34에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나의 아미노산 치환은 V381N, V381Q, Y401D, Y401E, V424N, V424Q, L457F, L457W, L457Y, L463N, L463Q, E495D, T508K, T508R, T508S, T515C, T515H, T515N, T515P, T515Q, T515S, L516F, L516S, L516T, L516W, L516Y, K524A, K524G, K524I, K524L, K524V, K525A, K525G, K525I, K525L, K525V, Q526C, Q526M, Q526S, Q526T, Q526Y, E531A, E531G, E531I, E531L, E531V, H535D, H535E, H535P, A539I, 및 A539L, A539V로 이루어진 군으로부터 선택된 키메라 폴리펩티드.
36. 실시형태 29에 있어서, 상기 아미노산 치환 모두는 잔기 383, 잔기 389, 잔기 391, 잔기 410, 잔기 417, 잔기 425, 잔기 442, 잔기 465, 잔기 467, 잔기 468, 잔기 486, 잔기 499, 잔기 502, 잔기 520, 잔기 532, 잔기 536, 잔기 543, 및 잔기 571로 이루어진 군의 구성원 중에서 선택된 키메라 폴리펩타이드.
37. 실시형태 33에 있어서, 상기 아미노산 치환 모두는 잔기 380, 잔기 381, 잔기 384, 잔기 387, 잔기 396, 잔기 401, 잔기 404, 잔기 405, 잔기 406, 잔기 409, 잔기 419, 잔기 421, 잔기 422, 잔기 424, 잔기 428, 잔기 430, 잔기 431, 잔기 433, 잔기 441, 잔기 457, 잔기 458, 잔기 463, 잔기 464, 잔기 466, 잔기 469, 잔기 470, 잔기 474, 잔기 475, 잔기 480, 잔기 481, 잔기 489, 잔기 491, 잔기 495, 잔기 500, 잔기 508, 잔기 510, 잔기 515, 잔기 516, 잔기 524, 잔기 525, 잔기 526, 잔기 528, 잔기 531, 잔기 535, 잔기 539, 잔기 544, 잔기 547, 및 잔기 576로 이루어진 군의 구성원 중에서 선택된 키메라 폴리펩타이드.
38. 실시형태 29 또는 33에 있어서, 상기 아미노산 치환 모두는 잔기 380, 잔기 381, 잔기 384, 잔기 383, 잔기 387, 잔기 389, 잔기 391, 잔기 396, 잔기 401, 잔기 404, 잔기 405, 잔기 406, 잔기 409, 잔기 410, 잔기 417, 잔기 419, 잔기 421, 잔기 422, 잔기 424, 잔기 425, 잔기 428, 잔기 430, 잔기 431, 잔기 433, 잔기 441, 잔기 442, 잔기 457, 잔기 458, 잔기 463, 잔기 464, 잔기 465, 잔기 466, 잔기 467, 잔기 468, 잔기 469, 잔기 470, 잔기 474, 잔기 475, 잔기 480, 잔기 481, 잔기 486, 잔기 489, 잔기 491, 잔기 495, 잔기 499, 잔기 500, 잔기 502, 잔기 508, 잔기 510, 잔기 515, 잔기 516, 잔기 520, 잔기 524, 잔기 525, 잔기 526, 잔기 528, 잔기 531, 잔기 532, 잔기 535, 잔기 536, 잔기 539, 잔기 543, 잔기 544, 잔기 547, 잔기 571, 및 잔기 576로 이루어진 군의 구성원 중에서 선택된 키메라 폴리펩타이드.
39. 실시형태 38에 있어서, 상기 아미노산 치환 모두는 잔기 381, 잔기 383, 잔기 391, 잔기 401, 잔기 424, 잔기 442, 잔기 463, 잔기 495, 잔기 506, 잔기 508, 잔기 515, 잔기 516, 잔기 524, 잔기 525, 잔기 526, 잔기 531, 잔기 535, 및 잔기 539로 이루어진 군의 구성원 중에서 선택된 키메라 폴리펩타이드.
40. 실시형태 39에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 V381N, V381Q, E383A, E383G, E383I, E383L, E383V, N391A, N391G, N391I, N391L, N391V, Y401D, Y401E, V424A, V424G, V424I, V424L,V424N, V424Q, E442K, E442R, L463N, L463Q, E495D, T506F, T506W, T506Y, T508K, T508R, T508S, T515C, T515H, T515N, T515P, T515Q, T515S, L516S, L516T, L516W, L516Y, K524A, K524G, K524I, K524L, K524V, K525A, K525G, K525I, K525L, K525V, Q526C, Q526M, Q526S, Q526T, Q526Y, E531A, E531G, E531I, E531L, E531V, H535D, H535E, H535P, A539I, A539L, 및 A539V로 이루어진 군의 구성원 중에서 선택된 키메라 폴리펩타이드.
41. 실시형태 1 내지 40 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 표면 접근가능한 잔기를 가지는 키메라 폴리펩타이드.
42. 실시형태 41에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 표면 접근가능한 잔기를 가지는 키메라 폴리펩타이드.
43. 실시형태 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 표면 접근가능하고 다양한 종에 걸쳐 보존된 잔기를 가지는 키메라 폴리펩타이드.
44. 실시형태 43에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 표면 접근가능하고 다양한 종에 걸쳐 보존된 잔기를 가지는 키메라 폴리펩타이드.
45. 실시형태 43 또는 44에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 전장 성숙 HSA 내 위치에 대해 넘버링된 다음의 위치 중 어느 하나에 있는 키메라 폴리펩타이드: 잔기 383, 잔기 389, 잔기 391, 잔기 410, 잔기 417, 잔기 425, 잔기 442, 잔기 465, 잔기 467, 잔기 468, 잔기 486, 잔기 499, 잔기 502, 잔기 520, 잔기 532, 잔기 536, 잔기 543, 및 잔기 571.
46. 실시형태 45에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 전장 성숙 HSA 내 위치에 대해 넘버링된 다음의 위치 중 어느 하나에 있는 키메라 폴리펩타이드: 잔기 383, 잔기 391, 및 잔기 442.
47. 실시형태 45에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 E383A, E383G, E383I, E383L, E383V, N391A, N391G, N391I, N391L, N391V, 및 E442K, E442R로 이루어진 군으로부터 선택된 키메라 폴리펩타이드.
48. 실시형태 45에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 전장 성숙 HSA 내 위치에 대해 넘버링된 다음의 위치 중 어느 하나에 있는 키메라 폴리펩타이드: 잔기 417, 잔기 442, 잔기 499, 및 잔기 502.
49. 실시형태 1 내지 48 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III은 서열 번호 1과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
50. 실시형태 49에 있어서, HSA 도메인 III은 서열 번호 1과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
51. 실시형태 49에 있어서, HSA 도메인 III은 서열 번호 1과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
52. 실시형태 1 내지 48 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III은 서열 번호 2와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
53. 실시형태 52에 있어서, HSA 도메인 III은 서열 번호 2와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
54. 실시형태 52에 있어서, HSA 부분은 서열 번호 2와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
55. 실시형태 1 내지 54 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 루프 2 내에 있는 키메라 폴리펩타이드.
56. 실시형태 1-22, 27-29, 32, 33, 36-38, 41-45, 또는 48-55 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 HSA 도메인 III의 루프 2 내에 있는 키메라 폴리펩타이드.
57. 실시형태 55 또는 56에 있어서, HSA 도메인 III 내 1 내지 5개의 아미노산 치환을 포함하되, 상기 1 내지 5개의 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 루프 2 내에 있는 키메라 폴리펩타이드.
58. 실시형태 1 내지 55 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 루프 3 내에 있는 키메라 폴리펩타이드.
59. 실시형태 1-22, 27-33, 36-54, 또는 58 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 HSA 도메인 III의 루프 3 내에 있는 키메라 폴리펩타이드.
60. 실시형태 58 또는 59에 있어서, HSA 도메인 III 내 1 내지 5개의 아미노산 치환을 포함하되, 상기 1 내지 5개의 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 루프 3 내에 있는 키메라 폴리펩타이드.
61. 실시형태 1 내지 55 또는 58 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 루프 6 내에 있는 키메라 폴리펩타이드.
62. 실시형태 1-22, 27-29, 32, 33-45, 48-54 또는 61 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 HSA 도메인 III의 루프 6 내에 있는 키메라 폴리펩타이드.
63. 실시형태 61 또는 62에 있어서, HSA 도메인 III 내 1 내지 18개의 아미노산 치환을 포함하되, 상기 1 내지 18개의 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 루프 6 내에 있는 키메라 폴리펩타이드.
64. 실시형태 1-55, 58, 또는 61 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 나선 7에 있는 키메라 폴리펩타이드.
65. 실시형태 1-22, 27-29, 32, 33-45, 48-54 또는 64 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 HSA 도메인 III의 나선 7에 있는 키메라 폴리펩타이드.
66. 실시형태 67 또는 68에 있어서, HSA 도메인 III 내 1 내지 3개의 아미노산 치환을 포함하되, 상기 1 내지 6개의 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 나선 7 내에 있는 키메라 폴리펩타이드.
67. 실시형태 1-55, 58, 61, 64 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 루프 7 내에 있는 키메라 폴리펩타이드.
68. 실시형태 1-22, 27-29, 32, 33-45, 48-54 또는 67 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 HSA 도메인 III의 루프 7 내에 있는 키메라 폴리펩타이드.
69. 실시형태 67 또는 68에 있어서, HSA 도메인 III 내 1 내지 3개의 아미노산 치환을 포함하되, 상기 1 내지 3개의 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 루프 7 내에 있는 키메라 폴리펩타이드.
70. 실시형태 1-55, 58, 61, 64, 또는 67 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 나선 8에 있는 키메라 폴리펩타이드.
71. 실시형태 1-22, 27-28, 37, 38, 41-44, 49-54 또는 70 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 나선 8에 있는 키메라 폴리펩타이드.
72. 실시형태 70 또는 71에 있어서, HSA 도메인 III 내 1 내지 5개의 아미노산 치환을 포함하되, 상기 1 내지 18개의 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 나선 8 내에 있는 키메라 폴리펩타이드.
73. 실시형태 1-55, 58, 61, 64, 67, 또는 70 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 루프 8에 있는 키메라 폴리펩타이드.
74. 실시형태 1-22, 27-28, 37, 38, 41-44, 49-54 또는 73 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 HSA 도메인 III의 루프 8에 있는 키메라 폴리펩타이드.
75. 실시형태 73 또는 74에 있어서, HSA 도메인 III 내 1 내지 5개의 아미노산 치환을 포함하되, 상기 1 내지 5의 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 루프 8 내에 있는 키메라 폴리펩타이드.
76. 실시형태 1-55, 58, 61, 64, 67, 70, 또는 73 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 루프 9 내에 있는 키메라 폴리펩타이드.
77. 실시형태 1-22, 27-28, 41-44, 49-54 또는 76 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 HSA 도메인 III의 루프 9 내에 있는 키메라 폴리펩타이드.
78. 실시형태 76 또는 77에 있어서, HSA 도메인 III 내 1 내지 4개의 아미노산 치환을 포함하되, 상기 1 내지 4의 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 루프 9 내에 있는 키메라 폴리펩타이드.
79. 실시형태 1-78 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 아미노산 잔기의 알라닌으로 대체를 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
80. 실시형태 1-79 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 보존적 아미노산 치환을 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
81. 실시형태 1-80 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 염기성 아미노산의 다른 염기성 아미노산으로 대체를 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
82. 실시형태 1-81 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 산성 아미노산의 다른 산성 아미노산으로 대체를 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
83. 실시형태 1-83 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 중성 아미노산의 다른 중성 아미노산으로 대체를 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
84. 실시형태 1-83 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 하나의 아미노산의 다음의 군: 리신, 아르기닌, 및 히스티딘 중의 다른 것으로 대체를 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
85. 실시형태 1-84 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 하나의 아미노산의 다음의 군: 아스파르테이트 및 글루타메이트 중의 다른 것으로 대체를 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
86. 실시형태 1-85 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 하나의 아미노산의 다음의 군: 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 및 티로신 중의 다른 것으로 대체를 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
87. 실시형태 1-86 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 하나의 아미노산의 다음의 군: 알라닌, 발린, 아이소류신, 류신, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌, 시스테인 및 글라이신 중의 다른 것으로 대체를 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
88. 실시형태 1-87 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 하나의 아미노산의 다음의 군: 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신 중의 다른 것으로 대체를 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
89. 실시형태 1-88 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 하나의 아미노산의 다음의 군: 시스테인, 세린, 및 트레오닌 중의 다른 것으로 대체를 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
90. 실시형태 1-89 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 하나의 아미노산의 다음의 군: 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르테이트, 글루타메이트 중의 다른 것으로 대체를 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
91. 실시형태 1-90 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 하나의 아미노산의 다음의 군: 글라이신, 세린, 트레오닌, 알라닌, 발린, 류신, 및 아이소류신 중의 다른 것으로 대체를 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
92. 실시형태 1-91 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 비보존적 치환을 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
93. 실시형태 79에 있어서, 상기 아미노산 치환 모두는 아미노산 잔기의 알라닌으로 대체를 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
94. 실시형태 80에 있어서, 상기 아미노산 치환 모두는 각 위치에서 독립적으로 보존적 아미노산 치환을 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
95. 실시형태 81에 있어서, 상기 아미노산 치환 모두는 각 위치에서 독립적으로 염기성 아미노산의 다른 염기성 아미노산으로 대체를 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
96. 실시형태 83에 있어서, 상기 아미노산 치환 모두는 각 위치에서 독립적으로 산성 아미노산의 다른 산성 아미노산으로 대체를 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
97. 실시형태 83에 있어서, 상기 아미노산 치환 모두는 각 위치에서 독립적으로 중성 아미노산의 다른 중성 아미노산으로 대체를 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
98. 실시형태 84에 있어서, 상기 아미노산 치환 모두는 각 위치에서 독립적으로 한 아미노산의 다음의 군: 리신, 아르기닌, 및 히스티딘 중의 다른 아미노산으로 대체를 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
99. 실시형태 85에 있어서, 상기 아미노산 치환 모두는 각 위치에서 독립적으로 한 아미노산의 다음의 군: 아스파르테이트 및 글루타메이트 중의 다른 아미노산으로 대체를 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
100. 실시형태 86에 있어서, 상기 아미노산 치환 모두는 각 위치에서 독립적으로 한 아미노산의 다음의 군: 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 및 티로신 중의 다른 아미노산으로 대체를 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
101. 실시형태 87에 있어서, 상기 아미노산 치환 모두는 각 위치에서 독립적으로 한 아미노산의 다음의 군: 알라닌, 발린, 아이소류신, 류신, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌, 시스테인 및 글라이신 중의 다른 아미노산으로 대체를 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
102. 실시형태 88에 있어서, 상기 아미노산 치환 모두는 각 위치에서 독립적으로 한 아미노산의 다음의 군: 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신 중의 다른 아미노산으로 대체를 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
103. 실시형태 89에 있어서, 상기 아미노산 치환 모두는 각 위치에서 독립적으로 한 아미노산의 다음의 군: 시스테인, 세린, 및 트레오닌 중의 다른 아미노산으로 대체를 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
104. 실시형태 90에 있어서, 상기 아미노산 치환 모두는 각 위치에서 독립적으로 한 아미노산의 다음의 군: 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르테이트, 글루타메이트 중의 다른 아미노산으로 대체를 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
105. 실시형태 91에 있어서, 상기 아미노산 치환 모두는 각 위치에서 독립적으로 한 아미노산의 다음의 군: 글라이신, 세린, 트레오닌, 알라닌, 발린, 류신, 및 아이소류신 중의 다른 아미노산으로 대체를 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
106. 실시형태 92에 있어서, 상기 아미노산 치환 모두는 각 위치에서 독립적으로 비보존적 치환을 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
107. 실시형태 1 내지 106 중 어느 하나에 있어서, 이종성 단백질은 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
108. 실시형태 1-107 중 어느 하나에 있어서, 이종성 단백질은 치료적 단백질을 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
109. 실시형태 1-108 중 어느 하나에 있어서, IgG 면역글로불린의 불변 영역을 더 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
110. 실시형태 1-109 중 어느 하나에 있어서, HSA 부분은 이종성 단백질에 화학적으로 컨쥬게이트된 키메라 폴리펩타이드.
111. 실시형태 1-109 중 어느 하나에 있어서, HSA 부분은 이종성 단백질에 재조합적으로 컨쥬게이트된 키메라 폴리펩타이드.
112. 실시형태 111에 있어서, 키메라 폴리펩타이드는 HSA 부분과 이종성 단백질을 둘 다 암호화하는 재조합 벡터를 사용하여 생성된 키메라 폴리펩타이드.
113. 실시형태 111 또는 112에 있어서, 키메라 폴리펩타이드는 원색 또는 진핵 세포 내에서 생성된 키메라 폴리펩타이드.
114. 실시형태 113에 있어서, 진핵 세포는 효모 세포, 조류 세포, 곤충 세포 또는 포유류 세포로부터 선택된 키메라 폴리펩타이드.
115. 실시형태 110-114 중 어느 하나에 있어서, HSA 부분 및 이종성 단백질은 서로 직접적으로 컨쥬게이트된 키메라 폴리펩타이드.
116. 실시형태 110-114 중 어느 하나에 있어서, HSA 부분 및 이종성 단백질은 링커를 통해 컨쥬게이트된 키메라 폴리펩타이드.
117. 실시형태 116 중 어느 하나에 있어서, 링커는 하나 이상의 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser 반복체를 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
118. 실시형태 1-117 중 어느 하나에 있어서, HSA 부분은 이종성 단백질의 N-말단 아미노산에 컨쥬게이트된 키메라 폴리펩타이드.
119. 실시형태 1-117 중 어느 하나에 있어서, HSA 부분은 이종성 단백질의 C-말단 아미노산에 컨쥬게이트된 키메라 폴리펩타이드.
120. 실시형태 1-117 중 어느 하나에 있어서, HSA 부분은 이종성 단백질의 내부 아미노산에 컨쥬게이트된 키메라 폴리펩타이드.
121. 실시형태 1-120 중 어느 하나에 있어서, HSA 부분은 적어도 일부의 HSA 도메인 I; 또는 적어도 일부의 HSA 도메인 II; 또는 적어도 일부의 HSA 도메인 I 및 적어도 일부의 HSA 도메인 II를 더 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
122. 실시형태 1-121 중 어느 하나에 있어서, 상기 키메라 폴리펩타이드는 실질적으로 정제된 키메라 폴리펩타이드.
123. 실시형태 1-122 중 어느 하나의 키메라 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
124. 실시형태 123에 있어서, 상기 조성물은 멸균 조성물인 조성물.
125. 실시형태 123 또는 124에 있어서, 상기 조성물은 비발열성인 조성물.
126. 필요한 피험자의 치료방법으로서, 상기 피험자에게 실시형태 1-122 중 어느 하나에 기재된 키메라 폴리펩타이드 또는 실시형태 123-125 중 어느 하나에 기재된 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 치료방법.
127. 치료를 필요로 하는 피험자에서 단백질의 혈청 반감기를 증가시키는 방법으로서, 상기 피험자에게 실시형태 1-122 중 어느 하나에 기재된 키메라 폴리펩타이드를 투여하는 단계를 포함하는 치료방법.
128. 실시형태 126 또는 127에 있어서, 상기 피험자에게 상기 키메라 폴리펩타이드를 전신에 투여하는 단계를 포함하는 치료방법.
129. 실시형태 126 또는 127에 있어서, 상기 피험자에 투여하는 단계는 피내, 경피, 근육내, 복강내, 정맥내, 혈관내, 심막내, 피하, 폐, 비강내, 안내, 경막외, 외용 및 구강으로 이루어진 군으로부터 선택된 경로에 의해 상기 키메라 폴리펩타이드를 투여하는 것을 포함하는 치료방법.
130. 실시형태 126 또는 127에 있어서, 상기 피험자에 투여하는 단계는 정맥내로 상기 키메라 폴리펩타이드를 투여하는 단계를 포함하는 치료방법.
131. 실시형태 1-121 중 어느 하나의 키메라 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 구성체.
132. 인간 혈청 알부민(HSA) 변이체 폴리펩타이드로서, HSA 도메인 III 또는 이것의 신생아 Fc 수용체(FcRn) 결합 단편을 포함하되, 상기 변이체 폴리펩타이드는 FcRn에 결합할 수 있고, 상기 HSA 도메인 III은 1 내지 18개의 아미노산 치환을 포함하여 상기 치환이 없는 대조군 HSA 폴리펩타이드 비해 상기 변이체 폴리펩타이드의 친화도를 증가시키는 인간 혈청 알부민(HSA) 변이체 폴리펩타이드.
133. 실시형태 132에 있어서, 변이체 폴리펩타이드는 상기 대조군 폴리펩타이드보다 더 높은 친화도로 FcRn에 결합하고, 상기 친화도는 산성 pH에서 측정되는 변이체 폴리펩타이드.
134. 실시형태 132 또는 133에 있어서, 산성 pH는 5.0 내지 6.0인 변이체 폴리펩타이드.
135. 실시형태 134에 있어서, 산성 pH는 5.5±0.2인 변이체 폴리펩타이드.
136. 실시형태 132에 있어서, 산성 pH에서 변이체 폴리펩타이드는 상기 대조군 폴리펩타이드보다 더 높은 친화도로 FcRn에 결합하지만, 중성 pH에서 변이체 폴리펩타이드는 상기 대조군 폴리펩타이드보다 더 높은 친화도로 FcRn에 결합하지 않는 변이체 폴리펩타이드.
137. 실시형태 136에 있어서, 중성 pH는 6.9 내지 7.9인 변이체 폴리펩타이드.
138. 실시형태 137에 있어서, 중성 pH는 7.4 ±0.2인 변이체 폴리펩타이드.
139. 실시형태 132에 있어서, 변이체 폴리펩타이드는 상기 대조군 HSA 폴리펩타이드보다 더 긴 혈청 반감기를 가지는 변이체 폴리펩타이드.
140. 실시형태 132-139에 있어서, HSA 도메인 III은 1 내지 10개의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
141. 실시형태 132-140에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 다양한 종을 걸쳐 보존된 잔기를 가지는 변이체 폴리펩타이드.
142. 실시형태 141에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 다양한 종을 걸쳐 보존된 잔기를 가지는 변이체 폴리펩타이드.
143. 실시형태 132-140 중 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 인간, 돼지, 래트, 마우스, 개, 토끼, 소, 닭, 당나귀, 모래쥐, 양, 고양이 및 말로부터의 혈청 알부민 단백질 중에서 보존된 잔기를 가지는 변이체 폴리펩타이드.
144. 실시형태 143에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 인간, 돼지, 래트, 마우스, 개, 토끼, 소, 닭, 당나귀, 모래쥐, 양, 고양이 및 말로부터의 혈청 알부민 단백질 중에서 보존된 변이체 폴리펩타이드.
145. 실시형태 132-143 중 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 표 5에서 열거된 것으로부터 선택된 변이체 폴리펩타이드.
146. 실시형태 132-143 중 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 전장 성숙 HSA 내 위치에 대해 넘버링된 다음의 위치 중 어느 하나에 있는 변이체 폴리펩타이드: 잔기 381, 잔기 383, 잔기 391, 잔기 401, 잔기 402, 잔기 407, 잔기 411, 잔기 413, 잔기 414, 잔기 415, 잔기 416, 잔기 424, 잔기 426, 잔기 434, 잔기 442, 잔기 445, 잔기 447, 잔기 450, 잔기 454, 잔기 455, 잔기 456, 잔기 457, 잔기 459, 잔기 463, 잔기 495, 잔기 506, 잔기 508, 잔기 509, 잔기 511, 잔기 512, 잔기 515, 잔기 516, 잔기 517, 잔기 519, 잔기 521, 잔기 523, 잔기 524, 잔기 525, 잔기 526, 잔기 527, 잔기 531, 잔기 535, 잔기 538, 잔기 539, 잔기 541, 잔기 557, 잔기 561, 잔기 566, 잔기 569.
147. 실시형태 132-143 중 하나에 있어서, 변이체 폴리펩타이드는 (a) 잔기 383 및 413; (b) 잔기 401 및 523; (c) 잔기 407 및 447; (d) 잔기 407 및 447 및 539; (e) 잔기 407 및 509; (f) 잔기 407 및 526; (g) 잔기 411 및 535; (h) 잔기 414 및 456; (i) 잔기 415 및 569; (j) 잔기 426 및 526; (k) 잔기 442 및 450 및 459; (l) 잔기 463 및 508; (m) 잔기 508 및519 및 525; (n) 잔기 509 및 527; (o) 잔기 523 및 538; (p) 잔기 526 및 557; 및 (q) 잔기 541 및 561로 이루어진 군으로부터 선택된 전장 성숙 HSA 내 위치에 대해 넘버링된 위치에서 HSA 도메인 III 내 아미노산 치환을 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
148. 실시형태 132-143, 또는 146 중 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 V381N, V381Q, E383A, E383G, E383I, E383L, E383V, N391A, N391G, N391I, N391L, N391V, Y401D, Y401E, K402A, K402G, K402I, K402L, K402V, L407F, L407N, L407Q, L407W, L407Y, Y411Q, Y411N, K413C, K413S, K413T, K414S, 414T, V415C, V415S, V415T, Q416H, Q416P, V424A, V424G, V424I, V424L,V424N, V424Q, V426D, V426E, V426H, V426P, G434C, G434S, G434T, E442K, E442R, R445F, R445W, R445Y, P447S, P447T, E450D, E450E, S454C, S454M, S454T, V455N, V455Q, V456N, V456Q, L457F, L457W, L457Y, Q459K, Q459R, L463N, L463Q, E495D, T506F, T506W, T506Y, T508K, T508R, T508S, F509C, F509I, F509L, F509M, F509V, F509W, F509Y, A511F, A511W, A511Y, D512F, D512W, D512Y, T515C, T515H, T515N, T515P, T515Q, T515S, L516F, L516S, L516T, L516W, L516Y, S517C, S517M, S517T, S517W, S517Y, K519A, K519G, K519I, K519L, K519V, R521F, R521W, R521Y, I523A, I523D, I523E, I523F, I523G, I523I, I523K, I523L, I523N, I523Q, I523R, I523V, I523W, I523Y, K524A, K524G, K524I, K524L, K524V, K525A, K525G, K525I, K525L, K525V, Q526C, Q526M, Q526S, Q526T, Q526Y, T527F, T527W, T527Y, E531A, E531G, E531I, E531L, E531V, H535D, H535E, H535P, K538F, K538W, K538Y, A539I, A539L, A539V, K541F, K541W, K541Y, K557A, K557G, K557I, K557L, K557V, A561F, A561W, A561Y, T566F, T566W, T566Y, A569H, 및 A569P로 이루어진 군으로부터 선택된 변이체 폴리펩타이드.
149. 실시형태 132-143, 146, 또는 148 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 V381N, E383G, N391V, Y401E, K402A, L407N, L407Y, Y411Q, K414S, K413S, V415T, V415C, Q416P, V424I, V424Q, V426E, V426H, G434C, E442K, R445W, P447S, E450D, S454C, V455N, V456N, L457F, Q459R, L463N, E495D, T506Y, T508R, T508S, F509I, F509M, F509W, A511F, D512Y, T515P, T515Q, T515S, L516T, L516W, S517C, S517W, K519I, R521W, I523D, I523E, I523Q, I523K, I523G, I523R, I523Y, K524L, K524V, K525V, Q526T, Q526M, Q526Y, T527Y, E531I, H535N, H535P, K538Y, A539I, K541F, K557G, A561F, T566W, 및 A569P로 이루어진 군으로부터 선택된 변이체 폴리펩타이드.
150. 실시형태 132-143, 또는 146 중 어느 하나에 있어서, 변이체 폴리펩타이드는 V381N, E383G, N391V, Y401E, K402A, L409N, L407Y, Y411Q, K414S, K413S, V415T, V415C, Q416P, V424I, V424Q, V426E, V426H, G434C, E442K, R445W, P447S, E450D, S454C, V455N, V456N, L457F, Q459R, L463N, E495D, T506Y, T508R, T508S, F509I, F509M, F509W, A511F, D512Y, T515P, T515Q, T515S, L516T, L516W, S517C, S517W, K519I, R521W, I523D, I523E, I523Q, I523K, I523G, I523R, I523Y, K524L, K524V, K525V, Q526T, Q526M, Q526Y, T527Y, E531I, H535N, H535P, K538Y, A539I, K541F, K557G, A561F, T566W, 및 A569P로 이루어진 군으로부터 선택된 HSA 도메인 III 내 하나의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
151. 실시형태 149에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 L407N, L407Y, V415T, V424I, V424Q, V426E, V426H, P447S, V455N, V456N, L463N, E495D, T506Y, T508R, F509M, F509W, A511F, D512Y, T515Q, L516T, L516W, S517W, R521W, I523D, I523E, I523G, I523K, I523R, K524L, Q526M, T527Y, H535P 및 K557G로 이루어진 군으로부터 선택된 변이체 폴리펩타이드.
152. 실시형태 150에 있어서, 변이체 폴리펩타이드는 L407N, L407Y, V415T, V424I, V424Q, V426E, V426H, P447S, V455N, V456N, L463N, E495D, T506Y, T508R, F509M, F509W, A511F, D512Y, T515Q, L516T, L516W, S517W, R521W, I523D, I523E, I523G, I523K, I523R, K524L, Q526M, T527Y, H535P 및 K557G로 이루어진 군으로부터 선택된 HSA 도메인 III 내 하나의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
153. 실시형태 132-143, 또는 146 중 하나에 있어서, 변이체 폴리펩타이드는 (a) E383G/K413S; (b) Y401E/I523G; (c) L407N/P447S; (d) L407N/P447S/A539I; (e) L407N/F509M; (f) L407Y/Q526T; (g) Y411Q/H535N; (h) K414S/V456N; (i) V415T/A569P; (j) V426H/Q526Y; (k) E442K/E450D/Q459R; (l) L463N/T508R; (m) T508R/K519I/K525V; (n) F509I/T527Y; (o) I523Q/K538Y; (p) Q526M/K557G; 및 (q) K541F/A561F로 이루어진 군으로부터 선택된 HSA 도메인 III 내 하나의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
154. 실시형태 132-143 또는 146 중 하나에 있어서, 변이체 폴리펩타이드는 (a) L407N/P447S; (b) L407N/P447S/A539I; (c) L407N/F509M; (d) Y411Q/H535N; (e) K414S/V456N; (f) V426H/Q526Y; (g) L463N/T508R; (h) F509I/T527Y; (i) I523Q/K538Y; (j) Q526M/K557G; 및 (k) K541F/A561F로 이루어진 군으로부터 선택된 HSA 도메인 III 내 하나의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
155. 실시형태 132-143 중 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 인간, 돼지, 래트, 마우스, 개, 토끼, 소, 닭, 당나귀, 모래쥐, 양, 고양이 및 말로부터의 혈청 알부민 단백질 중에서 보존되지만, 닭 혈청 알부민 중에서 보존되지 않는 잔기를 가지는 변이체 폴리펩타이드.
156. 실시형태 155에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 인간, 돼지, 래트, 마우스, 개, 토끼, 소, 닭, 당나귀, 모래쥐, 양, 고양이 및 말로부터의 혈청 알부민 단백질 중에서 보존되지만, 닭 혈청 알부민 중에서 보존되지 않는 잔기를 가지는 변이체 폴리펩타이드.
157. 실시형태 143에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 전장 성숙 HSA(서열 번호 2) 내 위치에 대해 넘버링된 다음의 위치 중 어느 하나에 있는 변이체 폴리펩타이드: 잔기 383, 잔기 389, 잔기 391, 잔기 410, 잔기 417, 잔기 425, 잔기 442, 잔기 465, 잔기 467, 잔기 468, 잔기 486, 잔기 499, 잔기 502, 잔기 520, 잔기 532, 잔기 536, 잔기 543, 및 잔기 571.
158. 실시형태 157에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 전장 성숙 HSA 내 위치에 대해 넘버링된 다음의 위치 중 어느 하나에 있는 변이체 폴리펩타이드: 잔기 383, 잔기 391, 잔기 434, 잔기 442, 잔기 445, 및 잔기 450.
159. 실시형태 158에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 V381N, E383A, E383G, E383I, E383L, E383V, N391A, N391G, N391I, N391L, N391V, G434C, G434S, G434T, E442K, E442R, R445F, R445W, R445Y, E450D, 및 E450E로 이루어진 군으로부터 선택된 변이체 폴리펩타이드.
160. 실시형태 157에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 전장 성숙 HSA 내 위치에 대해 넘버링된 다음의 위치 중 어느 하나에 있는 변이체 폴리펩타이드: 잔기 417, 잔기 442, 잔기 499, 및 잔기 502.
161. 실시형태 155에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 전장 성숙 HSA 내 위치에 대해 넘버링된 다음의 위치 중 어느 하나에 있는 변이체 폴리펩타이드: 잔기 380, 잔기 381, 잔기 384, 잔기 387, 잔기 396, 잔기 401, 잔기 404, 잔기 405, 잔기 406, 잔기 409, 잔기 419, 잔기 421, 잔기 422, 잔기 424, 잔기 428, 잔기 430, 잔기 431, 잔기 433, 잔기 441, 잔기 457, 잔기 458, 잔기 463, 잔기 464, 잔기 466, 잔기 469, 잔기 470, 잔기 474, 잔기 475, 잔기 480, 잔기 481, 잔기 489, 잔기 491, 잔기 495, 잔기 500, 잔기 508, 잔기 510, 잔기 515, 잔기 516, 잔기 524, 잔기 525, 잔기 526, 잔기 528, 잔기 531, 잔기 535, 잔기 539, 잔기 544, 잔기 547, 및 잔기 576.
162. 실시형태 161에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 전장 성숙 HSA 내 위치에 대해 넘버링된 다음의 위치 중 어느 하나에 있는 변이체 폴리펩타이드: 잔기 381, 잔기 401, 잔기 424, 잔기 457, 잔기 463, 잔기 495, 잔기 508, 잔기 515, 잔기 516, 잔기 524, 잔기 525, 잔기 526, 잔기 531, 잔기 535, 및 잔기 539.
163. 실시형태 162에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 V381N, V381Q, Y401D, Y401E, V424N, V424Q, L457F, L457W, L457Y, L463N, L463Q, E495D, T508K, T508R, T508S, T515C, T515H, T515N, T515P, T515Q, T515S, L516F, L516S, L516T, L516W, L516Y, K524A, K524G, K524I, K524L, K524V, K525A, K525G, K525I, K525L, K525V, Q526C, Q526M, Q526S, Q526T, Q526Y, E531A, E531G, E531I, E531L, E531V, H535D, H535E, H535P, A539I, 및 A539L, A539V로 이루어진 군으로부터 선택된 변이체 폴리펩타이드.
164. 실시형태 157에 있어서, 상기 아미노산 치환 모두는 잔기 383, 잔기 389, 잔기 391, 잔기 410, 잔기 417, 잔기 425, 잔기 442, 잔기 465, 잔기 467, 잔기 468, 잔기 486, 잔기 499, 잔기 502, 잔기 520, 잔기 532, 잔기 536, 잔기 543, 및 잔기 571로 이루어진 군의 구성원 중에서 선택된 변이체 폴리펩타이드.
165. 실시형태 161에 있어서, 상기 아미노산 치환 모두는 잔기 380, 잔기 381, 잔기 384, 잔기 387, 잔기 396, 잔기 401, 잔기 404, 잔기 405, 잔기 406, 잔기 409, 잔기 419, 잔기 421, 잔기 422, 잔기 424, 잔기 428, 잔기 430, 잔기 431, 잔기 433, 잔기 441, 잔기 457, 잔기 458, 잔기 463, 잔기 464, 잔기 466, 잔기 469, 잔기 470, 잔기 474, 잔기 475, 잔기 480, 잔기 481, 잔기 489, 잔기 491, 잔기 495, 잔기 500, 잔기 508, 잔기 510, 잔기 515, 잔기 516, 잔기 524, 잔기 525, 잔기 526, 잔기 528, 잔기 531, 잔기 535, 잔기 539, 잔기 544, 잔기 547, 및 잔기 576로 이루어진 군의 구성원 중에서 선택된 변이체 폴리펩타이드.
166. 실시형태 157 또는 161에 있어서, 상기 아미노산 치환 모두는 잔기 380, 잔기 381, 잔기 384, 잔기 383, 잔기 387, 잔기 389, 잔기 391, 잔기 396, 잔기 401, 잔기 404, 잔기 405, 잔기 406, 잔기 409, 잔기 410, 잔기 417, 잔기 419, 잔기 421, 잔기 422, 잔기 424, 잔기 425, 잔기 428, 잔기 430, 잔기 431, 잔기 433, 잔기 441, 잔기 442, 잔기 457, 잔기 458, 잔기 463, 잔기 464, 잔기 465, 잔기 466, 잔기 467, 잔기 468, 잔기 469, 잔기 470, 잔기 474, 잔기 475, 잔기 480, 잔기 481, 잔기 486, 잔기 489, 잔기 491, 잔기 495, 잔기 499, 잔기 500, 잔기 502, 잔기 508, 잔기 510, 잔기 515, 잔기 516, 잔기 520, 잔기 524, 잔기 525, 잔기 526, 잔기 528, 잔기 531, 잔기 532, 잔기 535, 잔기 536, 잔기 539, 잔기 543, 잔기 544, 잔기 547, 잔기 571, 및 잔기 576로 이루어진 군의 구성원 중에서 선택된 변이체 폴리펩타이드.
167. 실시형태 166에 있어서, 상기 아미노산 치환 모두는 잔기 381, 잔기 383, 잔기 391, 잔기 401, 잔기 424, 잔기 442, 잔기 463, 잔기 495, 잔기 508, 잔기 515, 잔기 516, 잔기 524, 잔기 525, 잔기 526, 잔기 531, 잔기 535, 및 잔기 539로 이루어진 군의 구성원 중에서 선택된 변이체 폴리펩타이드.
168. 실시형태 167에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 V381N, V381Q, E383A, E383G, E383I, E383L, E383V, N391A, N391G, N391I, N391L, N391V, Y401D, Y401E, V424A, V424G, V424I, V424L,V424N, V424Q, E442K, E442R, L463N, L463Q, E495D, T506F, T506W, T506Y, T508K, T508R, T508S, T515C, T515H, T515N, T515P, T515Q, T515S, L516S, L516T, L516W, L516Y, K524A, K524G, K524I, K524L, K524V, K525A, K525G, K525I, K525L, K525V, Q526C, Q526M, Q526S, Q526T, Q526Y, E531A, E531G, E531I, E531L, E531V, H535D, H535E, H535P, A539I, A539L, 및 A539V로 이루어진 군으로부터 선택된 변이체 폴리펩타이드.
169. 실시형태 132-166 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 표면 접근가능 잔기를 가지는 변이체 폴리펩타이드.
170. 실시형태 169에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 표면 접근가능 잔기를 가지는 변이체 폴리펩타이드.
171. 실시형태 132-166 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 표면 접근가능하며 잔기 다양한 종에 걸쳐 보존된 잔기를 가지는 변이체 폴리펩타이드.
172. 실시형태 171에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 표면 접근가능하며 잔기 다양한 종에 걸쳐 보존된 잔기를 가지는 변이체 폴리펩타이드.
173. 실시형태 171 또는 172에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 전장 성숙 HSA 내 위치에 대해 넘버링된 다음 위치 중 어느 하나에 있는 변이체 폴리펩타이드: 잔기 383, 잔기 389, 잔기 391, 잔기 410, 잔기 417, 잔기 425, 잔기 442, 잔기 465, 잔기 467, 잔기 468, 잔기 486, 잔기 499, 잔기 502, 잔기 520, 잔기 532, 잔기 536, 잔기 543, 및 잔기 571.
174. 실시형태 173에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 전장 성숙 HSA 내 위치에 대해 넘버링된 다음 위치 중 어느 하나에 있는 변이체 폴리펩타이드: 잔기 383, 잔기 391, 및 잔기 442.
175. 실시형태 174에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 E383A, E383G, E383I, E383L, E383V, N391A, N391G, N391I, N391L, N391V, 및 E442K, E442R로 이루어진 군으로부터 선택된 변이체 폴리펩타이드.
176. 실시형태 132-172 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III은 서열 번호 1과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
177. 실시형태 176에 있어서, HSA 도메인 III 은 서열 번호 1과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
178. 실시형태 169-177 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III은 서열 번호 1과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
179. 실시형태 132-178 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 루프 2 내에 있는 변이체 폴리펩타이드.
180. 실시형태 132-150, 155-157, 161, 164-166, 169-173, 176-179 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 HSA 도메인 III의 루프 2 내에 있는 변이체 폴리펩타이드.
181. 실시형태 179 또는 180에 있어서, HSA 도메인 III 내 1 내지 5개의 아미노산 치환을 포함하되, 상기 1 내지 5개의 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 루프 2 내에 있는 변이체 폴리펩타이드.
182. 실시형태 132-179 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 루프 3 내에 있는 변이체 폴리펩타이드.
183. 실시형태 132-150, 155-161, 164-166-178, 또는 182 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 HSA 도메인 III의 루프 3 내에 있는 변이체 폴리펩타이드.
184. 실시형태 182 또는 183에 있어서, HSA 도메인 III 내 1 내지 5개의 아미노산 치환을 포함하되, 상기 1 내지 5개의 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 루프 3 내에 있는 변이체 폴리펩타이드.
185. 실시형태 132-173 또는 182 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 루프 6 내에 있는 변이체 폴리펩타이드.
186. 실시형태 132-150, 155-157, 160-173, 176-178, 또는 185에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 HSA 도메인 III의 루프 6 내에 있는 변이체 폴리펩타이드.
187. 실시형태 185 또는 186에 있어서, HSA 도메인 III 내 1 내지 5개의 아미노산 치환을 포함하되, 상기 1 내지 5개의 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 루프 6 내에 있는 변이체 폴리펩타이드.
188. 실시형태 132-173, 182 또는 185 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 나선 7 내에 있는 변이체 폴리펩타이드.
189. 실시형태 132-150, 155-157, 160-173, 176-178, 또는 188에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 HSA 도메인 III의 나선 7 내에 있는 변이체 폴리펩타이드.
190. 실시형태 188 또는 192에 있어서, HSA 도메인 III 내 1 내지 3개의 아미노산 치환을 포함하되, 상기 1 내지 6개의 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 나선 7 내에 있는 변이체 폴리펩타이드.
191. 실시형태 132-173, 182, 185, 또는 188 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 루프 7 내에 있는 변이체 폴리펩타이드.
192. 실시형태 132-150, 155-157, 160-173, 176-178, 또는 191 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 HSA 도메인 III의 루프 7 내에 있는 변이체 폴리펩타이드.
193. 실시형태 191 또는 192에 있어서, HSA 도메인 III 내 1 내지 3개의 아미노산 치환을 포함하되, 상기 1 내지 3개의 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 루프 7 내에 있는 변이체 폴리펩타이드.
194. 실시형태 132-173, 182, 185, 188, 또는 191 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 나선 8 내에 있는 변이체 폴리펩타이드.
195. 실시형태 132-150, 155-157, 165-166, 169-173, 176-178, 또는 194 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 HSA 도메인 III의 나선 8 내에 있는 변이체 폴리펩타이드.
196. 실시형태 194 또는 195에 있어서, HSA 도메인 III 내 1 내지 5개의 아미노산 치환을 포함하되, 상기 1 내지 18개의 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 나선 8 내에 있는 변이체 폴리펩타이드.
197. 실시형태 132-173, 182, 185, 188, 191 또는 194 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 루프 8 내에 있는 변이체 폴리펩타이드.
198. 실시형태 132-150, 155-157, 165-166, 169-173, 176-178, 또는 197 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 HSA 도메인 III의 루프 8 내에 있는 변이체 폴리펩타이드.
199. 실시형태 197 또는 198에 있어서, HSA 도메인 III 내 1 내지 5개의 아미노산 치환을 포함하되, 상기 1 내지 5개의 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 루프 8 내에 있는 변이체 폴리펩타이드.
200. 실시형태 132-173, 182, 185 또는 197 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 루프 9 내에 있는 변이체 폴리펩타이드.
201. 실시형태 132-150, 155, 156, 169-172, 176-178, 또는 200 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 루프 9 내에 있는 변이체 폴리펩타이드.
202. 실시형태 200 또는 201에 있어서, HSA 도메인 III 내 1 내지 4개의 아미노산 치환을 포함하되, 상기 1 내지 4개의 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 루프 9 내에 있는 변이체 폴리펩타이드.
203. 실시형태 132-202에 있어서, 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 아미노산 자기의 알라닌으로 대체를 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
204. 실시형태 132-203 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 보존적 아미노산 치환을 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
205. 실시형태 132-204 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 염기성 아미노산의 다른 아미노산으로 대체를 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
206. 실시형태 132-205 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 치환 중 적어도 산성 아미노산의 하나는 다른 아미노산으로 대체를 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
207. 실시형태 132-206 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 중성 아미노산의 하나는 다른 아미노산으로 대체를 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
208. 실시형태 132-207 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 한 아미노산의 다음의 군: 리신, 아르기닌, 및 히스티딘 중의 다른 것으로 대체를 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
209. 실시형태 132-208 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 한 아미노산의 다음의 군: 아스파르테이트 및 글루타메이트 중의 다른 것으로 대체를 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
210. 실시형태 132-209 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 한 아미노산의 다음의 군: 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 및 티로신 중의 다른 것으로 대체를 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
211. 실시형태 132-210 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 한 아미노산의 다음의 군: 알라닌, 발린, 아이소류신, 류신, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌, 시스테인 및 글라이신 중의 다른 것으로 대체를 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
212. 실시형태 132-211 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 한 아미노산의 다음의 군: 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신 중의 다른 것으로 대체를 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
213. 실시형태 132-212 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 한 아미노산의 다음의 군: 시스테인, 세린, 및 트레오닌 중의 다른 것으로 대체를 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
214. 실시형태 132-213 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 한 아미노산의 다음의 군: 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르테이트, 글루타메이트 중의 다른 것으로 대체를 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
215. 실시형태 132-214 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 한 아미노산의 다음의 군: 글라이신, 세린, 트레오닌, 알라닌, 발린, 류신, 및 아이소류신 중의 다른 것으로 대체를 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
216. 실시형태 132-215 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 비보존적 치환을 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
217. 실시형태 203 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 치환 모두는 아미노산 잔기의 알라닌으로 대체를 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
218. 실시형태 204에 있어서, 상기 아미노산 치환 모두는 각 위치에서 독립적으로 보존적 아미노산 치환을 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
219. 실시형태 205에 있어서, 상기 아미노산 치환 모두는 각 위치에서 독립적으로 염기성 아미노산의 다른 염기성 아미노산으로 대체를 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
220. 실시형태 206에 있어서, 상기 아미노산 치환 모두는 각 위치에서 독립적으로 산성 아미노산의 다른 산성 아미노산으로 대체를 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
221. 실시형태 207에 있어서, 상기 아미노산 치환 모두는 각 위치에서 독립적으로 중성 아미노산의 다른 중성 아미노산으로 대체를 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
222. 실시형태 208에 있어서, 상기 아미노산 치환 모두는 각 위치에서 독립적으로 한 아미노산의 다음의 군: 리신, 아르기닌, 및 히스티딘 중의 다른 것으로 대체를 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
223. 실시형태 209에 있어서, 상기 아미노산 치환 모두는 각 위치에서 독립적으로 한 아미노산의 다음의 군 중의 다른 것으로 대체를 포함하는 변이체 폴리펩타이드: 아스파르테이트 및 글루타메이트.
224. 실시형태 210에 있어서, 상기 아미노산 치환 모두는 각 위치에서 독립적으로 한 아미노산의 다음의 군: 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 및 티로신 중의 다른 것으로 대체를 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
225. 실시형태 211에 있어서, 상기 아미노산 치환 모두는 각 위치에서 독립적으로 한 아미노산의 다음의 군: 알라닌, 발린, 아이소류신, 류신, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌, 시스테인 및 글라이신 중의 다른 것으로 대체를 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
226. 실시형태 212에 있어서, 상기 아미노산 치환 모두는 각 위치에서 독립적으로 한 아미노산의 다음의 군: 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신 중의 다른 것으로 대체를 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
227. 실시형태 213에 있어서, 상기 아미노산 치환 모두는 각 위치에서 독립적으로 한 아미노산의 다음의 군: 시스테인, 세린, 및 트레오닌 중의 다른 것으로 대체를 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
228. 실시형태 214에 있어서, 상기 아미노산 치환 모두는 각 위치에서 독립적으로 한 아미노산의 다음의 군: 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르테이트, 글루타메이트 중의 다른 것으로 대체를 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
229. 실시형태 215에 있어서, 상기 아미노산 치환 모두는 각 위치에서 독립적으로 한 아미노산의 다음의 군: 글라이신, 세린, 트레오닌, 알라닌, 발린, 류신, 및 아이소류신 중의 다른 것으로 대체를 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
230. 실시형태 216에 있어서, 상기 아미노산 치환 모두는 각 위치에서 독립적으로 비보존적 치환을 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
231. 실시형태 132-230 중 어느 하나에 있어서, HSA 위치는 HSA 부분은 적어도 일부의 HSA 도메인 I; 또는 적어도 일부의 HSA 도메인 II; 또는 적어도 일부의 HSA 도메인 I 및 적어도 일부의 HSA 도메인 II를 더 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
232. 실시형태 132-231 중 어느 하나에 있어서, 상기 변이체 폴리펩타이드 실질적으로 정제된 변이체 폴리펩타이드.
233. 실시형태 132-232 중 어느 하나에 있어서, 상기 변이체 폴리펩타이드는 표적 상의 에피토프에 대해 결합 자리를 더 포함하는 변이체 폴리펩타이드.
234. 실시형태 233에 있어서, 결합 자리는 상기 표적을 안타고니스트적인 변이체 폴리펩타이드.
235. 실시형태 233에 있어서, 결합 자리는 상기 표적을 아고니스트적인 변이체 폴리펩타이드.
236. 실시형태 132-235 중 어느 하나의 변이체 폴리펩타이드, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
237. 실시형태 236에 있어서, 상기 조성물은 멸균 조성물인 조성물.
238. 실시형태 236 또는 237에 있어서, 상기 조성물은 비발열성인 조성물.
239. 상기 단백질을 실시형태 132-235 중 어느 하나에 따르는 변이체 폴리펩타이드에 컨쥬게이트하는 단계를 포함하는, 단백질의 혈청 반감기를 증가시키는 방법.
240. 실시형태 233-235 중 어느 하나에 따르는 변이체 폴리펩타이드를 상기 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료가 필요한 피험자를 치료하는 방법.
241. 실시형태 132-231 중 어느 하나의 변이체 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 구성체.
242. (a) 인간 혈청 알부민(HSA) 부분을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(HSA 부분은 HSA 도메인 III, 또는 이것의 FcRn 결합 단편을 포함하며, HSA 도메인 III은 1 내지 18개의 아미노산 치환을 포함한다)이 (b) 이종성 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(핵산 구성체는 이종성 단백질의 기능적 활성을 보유하며, FcRn에 결합할 수 있다)에 작동가능하게 연결되도록 포함하며, 상기 키메라 폴리펩타이드는 대조군 키메라 폴리펩타이드에 비해 증가된 혈청 반감기 및/또는 FcRn에 증가된 친화도를 가지고, 이때 HSA 부분은 상기 아미노산 치환을 포함하지 않는, 핵산 구성체.
243. 실시형태 242에 있어서, 키메라 폴리펩타이드가 상기 대조군 키메라 폴리펩타이드보다 더 높은 친화도로 FcRn에 결합하는 핵산 구성체.
244. 실시형태 242 또는 243에 있어서, 키메라 폴리펩타이드가 상기 대조군 키메라 폴리펩타이드보다 더 높은 친화도로 FcRn에 결합하며, 상기 친화도는 산성 pH에서 측정된 핵산 구성체.
245. 실시형태 244에 있어서, 산성 pH는 5.0 내지 6.0인 핵산 구성체.
246. 실시형태 245에 있어서, 산성 pH는 5.5±0.2인 핵산 구성체.
247. 실시형태 242-247 중 어느 하나에 있어서, 산성 pH에서 키메라 폴리펩타이드가 상기 대조군 키메라 폴리펩타이드보다 더 높은 친화도로 FcRn에 결합하지만, 중성 pH에서 키메라 폴리펩타이드는 상기 대조군 키메라 폴리펩타이드보다 더 높은 친화도로 FcRn에 결합하지 않는 핵산 구성체.
248. 실시형태 247에 있어서, 중성 pH는 6.9 내지 7.9인 핵산 구성체.
249. 실시형태 248에 있어서, 중성 pH는 7.4±0.2인 핵산 구성체.
250. 실시형태 242에 있어서, (i) 인간 혈청 알부민(HSA) 부분을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, HSA 부분은 HSA 도메인 III, 또는 이것의 FcRn 결합 단편을 포함하고, HSA 도메인 III은 1 내지 10개의 아미노산 치환을 포함하는 핵산 구성체.
251. 실시형태 242-250 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 다양한 종에 걸쳐 보존된 잔기를 가지는 핵산 구성체.
252. 실시형태 251에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 다양한 종에 걸쳐 보존된 잔기를 가지는 핵산 구성체.
253. 실시형태 242-250 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 인간, 돼지, 래트, 마우스, 개, 토끼, 소, 닭, 당나귀, 모래쥐, 양, 고양이 및 말로부터의 혈청 알부민 단백질 중에서 보존된 잔기를 가지는 핵산 구성체.
254. 실시형태 253에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 인간, 돼지, 래트, 마우스, 개, 토끼, 소, 닭, 당나귀, 모래쥐, 양, 고양이 및 말로부터의 혈청 알부민 단백질 중에서 보존된 잔기를 가지는 핵산 구성체.
255. 실시형태 242-254 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 표 5에 열거된 것으로부터 선택된 핵산 구성체.
256. 실시형태 242-254 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 전장 성숙 HSA 내 위치에 대해 넘버링된 다음 위치 중 어느 하나에 있는 핵산 구성체: 잔기 381, 잔기 383, 잔기 391, 잔기 401, 잔기 402, 잔기 407, 잔기 411, 잔기 413, 잔기 414, 잔기 415, 잔기 416, 잔기 424, 잔기 426, 잔기 434, 잔기 442, 잔기 445, 잔기 447, 잔기 450, 잔기 454, 잔기 455, 잔기 456, 잔기 457, 잔기 459, 잔기 463, 잔기 495, 잔기 506, 잔기 508, 잔기 509, 잔기 511, 잔기 512, 잔기 515, 잔기 516, 잔기 517, 잔기 519, 잔기 521, 잔기 523, 잔기 524, 잔기 525, 잔기 526, 잔기 527, 잔기 531, 잔기 535, 잔기 538, 잔기 539, 잔기 541, 잔기 557, 잔기 561, 잔기 566, 잔기 569.
257. 실시형태 242-254 중 어느 하나에 있어서, 핵산 구성체가 (a) 잔기 383 및 413; (b) 잔기 401 및 523; (c) 잔기 407 및 447; (d) 잔기 407 및 447 및 539; (e) 잔기 407 및 509; (f) 잔기 407 및 526; (g) 잔기 411 및 535; (h) 잔기 414 및 456; (i) 잔기 415 및 569; (j) 잔기 426 및 526; (k) 잔기 442 및 450 및 459; (l) 잔기 463 및 508; (m) 잔기 508 및 519 및 525; (n) 잔기 509 및 527; (o) 잔기 523 및 538; (p) 잔기 526 및 557; 및 (q) 잔기 541 및 561로 이루어진 군으로부터 선택된 전장 성숙 HSA 내 위치에 대해 넘버링된 위치에서 HSA 도메인 III 내 아미노산 치환을 포함하는 핵산 구성체.
258. 실시형태 242-254 또는 256 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 V381N, V381Q, E383A, E383G, E383I, E383L, E383V, N391A, N391G, N391I, N391L, N391V, Y401D, Y401E, K402A, K402G, K402I, K402L, K402V, L407F, L407N, L407Q, L407W, L407Y, Y411Q, Y411N, K413C, K413S, K413T, K414S, 414T, V415C, V415S, V415T, Q416H, Q416P, V424A, V424G, V424I, V424L, V424N, V424Q, V426D, V426E, V426H, V426P, G434C, G434S, G434T, E442K, E442R, R445F, R445W, R445Y, P447S, P447T, E450D, E450E, S454C, S454M, S454T, V455N, V455Q, V456N, V456Q, L457F, L457W, L457Y, Q459K, Q459R, L463N, L463Q, E495D, T506F, T506W, T506Y, T508K, T508R, T508S, F509C, F509I, F509L, F509M, F509V, F509W, F509Y, A511F, A511W, A511Y, D512F, D512W, D512Y, T515C, T515H, T515N, T515P, T515Q, T515S, L516F, L516S, L516T, L516W, L516Y, S517C, S517F, S517M, S517T, S517W, S517Y, K519A, K519G, K519I, K519L, K519V, R521F, R521W, R521Y, I523A, I523D, I523E, I523F, I523G, I523I, I523K, I523L, I523N, I523Q, I523R, I523V, I523W, I523Y, K524A, K524G, K524I, K524L, K524V, K525A, K525G, K525I, K525L, K525V, Q526C, Q526M, Q526S, Q526T, Q526Y, T527F, T527W, T527Y, E531A, E531G, E531I, E531L, E531V, H535D, H535E, H535P, K538F, K538W, K538Y, A539I, A539L, A539V, K541F, K541W, K541Y, K557A, K557G, K557I, K557L, K557V, A561F, A561W, A561Y, T566F, T566W, T566Y, A569H, 및 A569P로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 구성체.
259. 실시형태 242-254, 또는 256 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 V381N, E383G, N391V, Y401E, K402A, L407N, L407Y, Y411Q, K414S, K413S, V415T, V415C, Q416P, V424I, V424Q, V426E, V426H, G434C, E442K, R445W, P447S, E450D, S454C, V455N, V456N, L457F, Q459R, L463N, E495D, T506Y, T508R, T508S, F509I, F509M, F509W, A511F, D512Y, T515P, T515Q, T515S, L516T, L516W, S517C, S517W, K519I, R521W, I523D, I523E, I523Q, I523K, I523G, I523R, I523Y, K524L, K524V, K525V, Q526T, Q526M, Q526Y, T527Y, E531I, H535N, H535P, K538Y, A539I, K541F, K557G, A561F, T566W, 및 A569P로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 구성체.
260. 실시형태 259에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 L407N, L407Y, V415T, V424I, V424Q, V426E, V426H, P447S, V455N, V456N, L463N, E495D, T506Y, T508R, F509M, F509W, A511F, D512Y, T515Q, L516T, L516W, S517W, R521W, I523D, I523E, I523G, I523K, I523R, K524L, Q526M, T527Y, H535P 및 K557G로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 구성체.
261. 실시형태 242-254, 또는 256 중 어느 하나에 있어서, 키메라 폴리펩타이드는 (a) E383G/K413S; (b) Y401E/I523G; (c) L407N/P447S; (d) L407N/P447S/A539I; (e) L407N/F509M; (f) L407Y/Q526T; (g) Y411Q/H535N; (h) K414S/V456N; (i) V415T/A569P; (j) V426H/Q526Y; (k) E442K/E450D/Q459R; (l) L463N/T508R; (m) T508R/K519I/K525V; (n) F509I/T527Y; (o) I523Q/K538Y; (p) Q526M/K557G; 및 (q) K541F/A561F로 이루어진 군으로부터 선택된 HSA 도메인 III 내 아미노산 치환을 포함하는 핵산 구성체.
262. 실시형태 261에 있어서, 키메라 폴리펩타이드는 (a) L407N/P447S; (b) L407N/P447S/A539I; (c) L407N/F509M; (d) Y411Q/H535N; (e) K414S/V456N; (f) V426H/Q526Y; (g) L463N/T508R; (h) F509I/T527Y; (i) I523Q/K538Y; (j) Q526M/K557G; 및 (k) K541F/A561F로 이루어진 군으로부터 선택된 HSA 도메인 III 내 아미노산 치환을 포함하는 핵산 구성체.
263. 실시형태 242-254 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 표면 접근가능한 잔기를 가지는 핵산 구성체.
264. 실시형태 263에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 표면 접근가능한 잔기를 가지는 핵산 구성체.
265. 실시형태 242-250 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 표면 접근가능하고 다양한 종에 걸쳐 보존된 잔기를 가지는 핵산 구성체.
266. 실시형태 265에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 모두는 표면 접근가능하고 다양한 종에 걸쳐 보존된 잔기를 가지는 핵산 구성체.
267. 실시형태 242-266 중 어느 하나에 있어서, (i) 서열 번호 1에 적어도 90% 동일한 HSA 도메인 III을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 구성체.
268. 실시형태 267에 있어서, (i) 서열 번호 1에 적어도 95% 동일한 HSA 도메인 III을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 구성체.
269. 실시형태 268에 있어서, (i) 서열 번호 1에 적어도 98% 동일한 HSA 도메인 III을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 구성체.
270. 실시형태 242-269 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 루프 2 내에 있는 핵산 구성체.
271. 실시형태 242-270 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 루프 3 내에 있는 핵산 구성체.
272. 실시형태 242-271 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 루프 6 내에 있는 핵산 구성체.
273. 실시형태 242-272 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 나선 7 내에 있는 핵산 구성체.
274. 실시형태 242-273 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 루프 7 내에 있는 핵산 구성체.
275. 실시형태 242-274 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 나선 8 내에 있는 핵산 구성체.
276. 실시형태 242-275 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III 내에 있는 루프 8 내에 있는 핵산 구성체.
277. 실시형태 242-276 중 어느 하나에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 HSA 도메인 III의 루프 9 내에 있는 핵산 구성체.
278. 실시형태 242-277 중 어느 하나에 있어서, (ii) 이종성 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 이종성 단백질은 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 핵산 구성체.
279. 실시형태 242-278 중 어느 하나에 있어서, 링커를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하는 핵산 구성체.
280. 실시형태 279에 있어서, 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser 반복체를 포함하는 링커를 암호화하는 핵산 구성체.
281. 실시형태 242-280 중 어느 하나에 있어서, HSA 부분은 적어도 일부의 HSA 도메인 I; 또는 적어도 일부의 HSA 도메인 II; 또는 적어도 일부의 HSA 도메인 I 및 적어도 일부의 HSA 도메인 II를 더 포함하는 핵산 구성체.
282. 다수의 폴리펩타이드를 포함하는 라이브러리로서, 각각의 상기 다수의 폴리펩타이드는 HSA 도메인 III 또는 이것의 FcRn 결합 단편을 포함하며, 각각의 상기 다수의 폴리펩타이드는 인간, 돼지, 래트, 마우스, 개, 토끼, 소, 닭, 당나귀, 모래쥐, 양, 고양이 및 말로부터의 혈청 알부민 단백질 중에서 보존된 상기 HSA 도메인 III 내 잔기의 적어도 하나의 아미노산 치환을 독립적으로 포함하는 라이브러리.
283. 다수의 폴리펩타이드를 포함하는 라이브러리로서, 각각의 상기 다수의 폴리펩타이드는 HSA 도메인 III 또는 이것의 FcRn 결합 단편을 포함하며, 각각의 상기 다수의 폴리펩타이드는 인간, 돼지, 래트, 마우스, 개, 토끼, 소, 당나귀, 모래쥐, 양, 고양이 및 말로부터의 혈청 알부민 단백질 중에서 보존되지만, 닭으로부터의 혈청 알부민 중에서 보존되지 않은 상기 HSA 도메인 III 내 잔기의 적어도 하나의 아미노산 치환을 독립적으로 포함하는 라이브러리.
284. 다수의 폴리펩타이드를 포함하는 라이브러리로서, 각각의 상기 다수의 폴리펩타이드는 HSA 도메인 III 또는 이것의 FcRn 결합 단편을 포함하며, 각각의 상기 다수의 폴리펩타이드는 표면 접근가능한 잔기의 상기 HSA 도메인 III 내 잔기의 적어도 하나의 아미노산 치환을 독립적으로 포함하는 라이브러리.
285. 실시형태 284에 있어서, 상기 표면 접근가능 잔기는 HSA 도메인 III의 루프 2 내에 있는 라이브러리.
286. 실시형태 284 또는 285에 있어서, 상기 표면 접근가능 잔기는 HSA 도메인 III의 루프 3 내에 있는 라이브러리.
287. 실시형태 284-286 중 어느 하나에 있어서, 상기 표면 접근가능 잔기는 HSA 도메인 III의 루프 6 내에 있는 라이브러리.
288. 실시형태 284-273 중 어느 하나에 있어서, 상기 표면 접근가능 잔기는 HSA 도메인 III의 루프 7 내에 있는 라이브러리.
289. 실시형태 284-288 중 어느 하나에 있어서, 상기 표면 접근가능 잔기는 HSA 도메인 III의 루프 8 내에 있는 라이브러리.
290. 실시형태 284-289 중 어느 하나에 있어서, 상기 표면 접근가능 잔기는 HSA 도메인 III의 루프 9 내에 있는 라이브러리.
291. 다수의 폴리펩타이드를 포함하는 라이브러리로서, 각각의 상기 다수의 폴리펩타이드는 HSA 도메인 III 또는 이것의 FcRn 결합 단편을 포함하며, 각각의 상기 다수의 폴리펩타이드는 (i) 표면 접근가능한 잔기와 (ii) 인간, 돼지, 래트, 마우스, 개, 토끼, 소, 닭, 당나귀, 모래쥐, 양, 고양이 및 말로부터의 혈청 알부민 단백질 중에서 보존된 상기 HSA 도메인 III 내 잔기의 적어도 하나의 아미노산 치환을 독립적으로 포함하는 라이브러리.
292. 다수의 폴리펩타이드를 포함하는 라이브러리로서, 각각의 상기 다수의 폴리펩타이드는 HSA 도메인 III 또는 이것의 FcRn 결합 단편을 포함하며, 각각의 상기 다수의 폴리펩타이드는 인간, 돼지, 래트, 마우스, 개, 토끼, 소, 닭, 당나귀, 모래쥐, 양, 고양이 및 말로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 이외의 2이상의 종으로부터 혈청 알부민 단백질 중에서 보존된 아미노산에 상기 HSA 도메인 III 내 잔기의 적어도 하나의 아미노산 치환을 독립적으로 포함하는 라이브러리.
293. 실시형태 291 또는 292에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 루프 2 내에 있는 라이브러리.
294. 실시형태 291-293 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 루프 3 내에 있는 라이브러리.
295. 실시형태 291-294 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 루프 6 내에 있는 라이브러리.
296. 실시형태 291-295 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 나선 7 내에 있는 라이브러리.
297. 실시형태 291-296 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 루프 7 내에 있는 라이브러리.
298. 실시형태 291-297 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 나선 8 내에 있는 라이브러리.
299. 실시형태 291-298 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 루프 8 내에 있는 라이브러리.
300. 실시형태 291-298 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 HSA 도메인 III의 루프 9 내에 있는 라이브러리.
301. 실시형태 282-300 중 어느 하나에 있어서, 각각의 상기 다수의 폴리펩타이드는 적어도 일부의 HSA 도메인 I; 또는 적어도 일부의 HSA 도메인 II; 또는 적어도 일부의 HSA 도메인 I 및 적어도 일부의 HSA 도메인 II를 더 포함하는 라이브러리.
302. 실시형태 282-301 중 어느 하나에 있어서, 라이브러리는 디스플레이 라이브러리인 라이브러리.
303. 실시형태 302에 있어서, 디스플레이 라이브러리의 유형은 효모, 파지 및 포유류로 이루어진 군으로부터 선택된 라이브러리.
304. 실시형태 282-303 중 어느 하나에 있어서, (a) 스크리닝을 위한 다수의 폴리펩타이드를 선택하는 단계; (b) FcRn에 대해 증가된 결합 친화도 또는 증가된 혈청 반감기를 가지는 폴리펩타이드를 위한 스크리닝 단계; 및 (c) FcRn에 대해 증가된 결합 친화도 또는 증가된 혈청 반감기를 가지는 폴리펩타이드의 서열을 결정하는 단계를 포함하는 방법.
8 실시예
본 발명은 지금 일반적으로 설명되었고, 다음의 실시예에 대한 언급에 의해 용이하게 이해되며, 이는 단지 본 발명의 특정 양태 및 실시형태의 예시 목적을 위해 포함되고, 본 발명을 제한하려는 의도는 아니다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 특정 구성 및 실험적 설계는 적절한 작용을 입증하기 위한 예시적인 도구 및 방법을 나타낸다. 이와 같이, 개시된 특정 구성 및 실험적 계획은 본 명세서의 범주 내에서 치환될 수 있다는 것은 용이하게 명백할 것이다. 더 나아가, 사용된 특정 도구 및 시약, 크기, 제조업자 등의 구체적 열거 또는 설명은 구체적으로 언급되지 않는다면 본 발명을 제한하는 것으로 생각되어서는 안 된다. 유사하게 수행하는 다른 도구 및 시약으로 용이하게 대체할 수 있다는 것이 추가로 인식될 것이다.
8.1 실시예 1: 인간 혈청 알부민(HSA)의 도메인 III에 대한 인간 FcRn 결합의 역학 및 친화도 분석
이 실시예는 표면 플라스몬 공명(surface Plasmon resonance: SPR)을 사용하여 인간 FcRn에 대한 HSA의 도메인 III의 해리, 결합 및 평형 친화도 상수를 측정한다. 도메인 III(또한 "DIII"로 약칭)은 인간 혈청 알부민 단백질 확장 아미노산 잔기 381-585의 단편이다. 도메인 III의 아미노산 서열은 서열 번호 1에서 제시한다. 전장 성숙 HSA의 아미노산 서열은 서열 번호 2에서 제시한다. 이 실험에서 사용을 위해, 도메인 III을 피키아 파토리스로부터 발현시키고 정제하였다.
8.1.1 재조합 단백질 발현 및 정제
도메인 III 유전자를 암호화하는 재조합 플라스미드를 독일 레겐스부르크에 소재한 Geneart AG로부터 얻었다. 도메인 III 유전자를 제한 효소 EcoRI 및 NotI를 사용하여 공급업자 제공 벡터로부터 절단하고, pPICZ-알파-A 피키아 발현 벡터에 클로닝하였다(Invitrogen, Catalog no.V195-20). 제조업자의 설명서에서 약술된 방법으로 재조합 도메인 III 단백질을 발현시켰다. 재조합 도메인 III 단백질을 배지에 분비시켰고, GE Healthcare제의 Hi Trap Butyl-Sepharose Fast Flow 컬럼(Catalog, no. 17 5197 01) 상에서 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 간략하게, 배양물 배지의 염분 및 pH를 우선 1.5M 황산암모늄 및 50mM 인산나트륨으로 pH 7.0으로 조절하였다. 배양물 배지를 여과하였고 뷰틸 세파로스 컬럼에 걸쳐 통과시켰으며, 낮은 염 pH 7.0 인산 나트륨 완충제를 사용하여 결합된 도메인 III을 용리시켰다. 정제 단백질의 분획을 50℃에서 유지한 순환 워터 재킷(water jacket)이 있는 하이드록시알옥시프소필 덱스트란(Sigma-Aldrich, Catalog no. H6258)에 걸쳐 통과시킴으로써 지질을 제거하였다. 쿠마씨 블루 염색에 의해 4-12% SDS PAGE로 시각화하여 탈지질화하고 탈지질화하지 않은 형태 둘 다의 순도는 99%이었다(도 1a). A280에 의해 단백질 농도를 결정하였다. 정제한 도메인 III의 적절한 폴딩을 이전에 공개된 측정과 밀접한 관련이 있는 near-UV-CD 및 far-UV-CD 측정에 의해 확인하였다(예를 들어, 문헌[Giancola et al. International Journal of Biological Macromolecules 20(1997) 193-204]을 참조).
8.1.2 역학 측정
평형, 결합 및 해리 속도 상수를 BIAcore T100 기기(스웨덴에 웁살라에 소재) 상의 25℃에서 측정하였고, 데이터를 BIAcore T100 평가 소프트웨어, v. 1.1(스웨덴 웁살라에 소재한 BIAcore, Inc)을 사용하여 분석하였다. 도메인 III의 탈지질화되지 않은 형태와 탈지질화된 형태는 표준 아민 커플링에 의해(BIAcore Handbook, 2002) 둘 다 CM4(catalog no.BR- 1005-39) 또는 CM5 칩(catalog no. BR-1000-14) 상에서 각각 결합 밀도 1016 및 1184 RU로 공유적으로 고정시켰다. 유세포 중 하나를 단백질 없이 동일한 고정 프로토콜을 사용하여 목 커플링(mock couple)하여 블랭크(blank)로 제공하였다. 모든 주입을 pH 5.5, 50 mM 인산염 및 150 mM NaCl 완충제 등에서 만들었고, pH 7.4 인산염 완충 식염수(PBS)로 주입 사이에 칩 표면을 재생시켰다. 단일 실험에서 결합 상수(kon), 및 해리 상수(koff)를 측정하기 위하여, 인간 FcRn의 증가하는 농도(39 nM-40μM)를 고정된 도메인 III 단백질을 거쳐서 50㎕/분에 주입하였다(도 1b, 왼쪽 패널). 결합이 평형상태에 도달하도록 하였고, 역학 상수 kon 및 koff는 1:1 랭뮤어 모델(langmuir model)에 대한 곡선의 결합(4분)과 해리 단계(1분)로 동시에 적합화시키는 것에 의해 유도된다. 비선형 회귀 분석을 사용하여 정상상태 친화도 모델에 대해 평형상태(Req) 대 분석물 농도에서 결합반응의 플롯을 적합화함으로써 KD가 유도된다. 도메인 III의 탈지질화된 형태와 탈지질화되지 않은 형태는 둘 다 유사한 결합 센서그램 및 Req 대 Ligand 원뿔 플롯을 나타낸다.
도메인 III과 FcRn의 상호작용은 빠른 결합(kon
Figure pct00002
7e3) 및 해리(koff
Figure pct00003
4e-2) 역학(표 1)을 나타낸다. 도메인 III에 대한 KD는 FcRn에 대한 전장 HSA보다 대략 7배 더 큰(예를 들어 더 큰 해리 상수) 5-8 μM이다. KD에서 이런 차이는 HSA에 대한 도메인 III에 대해 더 빠른 koff에 크게 기인하는 한편, 분자 둘 다에 대한 kon은 비슷하다. kon 및 koff로부터 유도된 KD는 실험적으로 얻은 값과 거의 일치하며, 이것에 의해 역학 측정을 제공한다. 게다가, 가변성 카복시 모이어티가 있는 센서 칩의 2가지 상이한 종류(CM4 및 CM5)는 유사한 친화도를 제공한다. 역학 및 평형상수는 탈지질화된 형태와 탈지질화되지 않은 형태 사이에 상당히 유사하며, 도메인 III에 대해 FcRn 결합을 매개하거나 촉진하지 않는다는 것을 시사한다.
Figure pct00004
8.2 실시예 2: FcRn 에 대한 인간 IgG 의 친화도롤 향상시키는 전장 HSA 와의 융합 또는 단독의 도메인 III
이 실험은 치료적 단백질 또는 이것의 항체 또는 변이체에 HSA의 도메인 III의 융합이 상호작용의 pH 의존도에 영향을 미치지 않고 산성 pH에서 FcRn에 대한 치료적 단백질/항체의 친화도를 향상시킨다는 것을 증명하였다. pH 5.5에서 FcRn에 대한 친화도의 증가는 증가된 혈청 반감기로 바뀔 가능성이 있다(예를 들어 생체 내 또는 적절한 모델 시스템에서 향상된 수명). 치료적 단백질에 융합된 도메인 III을 포함하는 HSA 부분의 약동학적 반감기 측정을, 예를 들어 인간 FcRn 유전자의 단일 복제물을 발현시키는 유전자이식 마우스에서 수행하여(그러나 뮤린 FcRn은 결여) 야생형 또는 변이체 도메인 III을 포함하는 부분을 가지는 융합의 반감기 상의 효과를 평가하였다.
8.2.1 구성체 설계
대표적인 단백질로서, 인간 IgG1을 사용하여 IgG 단독과 HsA 또는 도메인 III과 융합된 IgG 사이의 FcRn 친화도를 비교하였다. HSA 또는 도메인 III을 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser의 4개 반복 단위를 포함하는 링커를 통해 인간 IgG1 중쇄의 C-말단에 융합시켰다(도 2a). FcRn 상에서 IgG 결합 자리와 HSA 결합 자리 간의 거리에 기반하여 링커의 길이를 설계하여 리간드가 둘 다 그것의 각 결합 자리와 동시에 결합하도록 하였다. 천연 IgG에 대해 FcRn에 대해 10배 개선된 친화도를 나타내는 이전에 설명된 IgG의 높은 친화도 변이체의 HSA 및 도메인 III 융합 버전(IgG-YTE, 문헌[Dall'Acqua, et al, 2002, J Immunol., 169:5171-5180]을 참조)을 또한 유사한 방식으로 만들었다. 따라서, 다음의 구성체를 만들고 사용하였다:
IgG
IgG(YTE)
IgG-(G4S)4-HSA
IgG-(G4S)4-도메인 III
IgG(YTE)-(G4S)4-HSA
IgG(YTE)-(G4S)4-도메인 III
8.2.2 정제 및 특징화
간략하게, 모든 6개 구성체를 발현 벡터에 클로닝하였고, 293F 세포 내 일시적 발현에 의해 단백질을 정제하였다(GIBCO Cat. No. R79007). 배양물 배지에 분비된 IgG1 및 융합 단백질을 GE Healthcare제의 HiTrap(상표명) 단백질 A 친화도 컬럼(catalog no. 17-0403-03)을 사용하여 정제하였다. 환원과 비환원 조건 하에서 정제 단백질을 SDS PAGE에 의해 분석하였고, 쿠마씨 염색에 의해 시각화하여 99% 순도를 관찰하였다(도 2b).
IgG-(G4S)4-HSA 융합 단백질의 추정된 분자량은 284 킬로달톤(KDa)인 한편 IgG-(G4S)4-도메인 III의 분자량은 196 KDa이다. 관찰한 분자량은 이 추정값과 매우 상관관계가 있었다. 더 큰 크기 또는 변경된 물리화학적 특성에 기인하여 이 융합 단백질이 응집물을 형성하는지 여부를 평가하기 위하여, 융합 단백질을 Agilent Technologies 1200 시리즈 SEC를 사용하여 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 분석하였다(도 2c). IgG-(G4S)4-HSA와 IgG-(G4S)4-도메인 III은 둘 다 모노머에 대응하는 A280 상의 단일 피크 대 체류시간(분) 플롯을 나타내며, 이는 융합 단백질이 임의의 측정가능한 정도로 응집하지 않는다는 것을 나타낸다. IgG-YTE 변이체에 대한 융합 단백질의 SEC 프로파일은 IgG-(G4S)4-HSA 또는 IgG-(G4S)4-HSA 키메라 단백질로부터 구별가능하지 않았다.
8.2.3 평형 결합 상수의 측정( K D )
융합 단백질에 대한 인간 FcRn의 친화도(KD)를 BIAcore T100 기기(스웨덴 웁살라) 상에서 측정하였다. 간략하게, 인간 IgG, IgG-(G4S)4-도메인 III, IgG-(G4S)4-HSA, IgG-YTE, IgG-YTE-(G4S)4-도메인 III 및 IgG-YTE-(G4S)4-HSA를 기기 제조업자에 의해 약술된 바와 같은 표준 아미노 커플링 화학을 사용하여 2개의 시리즈 5 센서 칩(GE Healthcare) 상에서 유세포를 분리하였다. 최종 표면 IgG 밀도는 가각 5116, 5258, 6097, 5256, 5561 및 5531 RU이었다. 또한 동일한 고정 프로토콜을 사용하는 임의의 단백질 없이 각 센서 칩 상에서 기준 유세포를 제조하였다. 50mM P04 중에서 5.86 nM 내지 3000 nM 범위에 있는 인간 FcRn의 2배 단계 희석에 150mM NaCl 완충제를 pH5.5에서 커플링된 단백질과 기준 세포 표면 둘 다에 걸쳐 5 ㎕/분의 유속으로 주입하였다. 결합 데이터를 50분 동안 수집한 다음 0.05% Tween20을 함유하는 pH 7.4 인산염 완충 식염수의 다수회 60초 주입 으로 재생시켰다. 각 주입에 대해 평형상태(Req)에서 결합 반응을 농도에 대해 플롯팅하였고, 평형 결합 상수 KD를 유도하기 위하여 BIAcore T100 평가 소프트웨어 v. 1.1(스웨덴 웁살라에 소재한 BIAcore, Inc,)을 사용하여 정상상태 친화도 모델로 적합화시켰다(도 3). 삽도는 고정된 리간드에 FcRn의 농도 범위의 결합을 나타낸다. IgG-YTE 변이체 및 대응하는 융합 단백질에 대한 KD를 또한 동일한 방식으로 유도하였다(데이터 미제시).
IgG-(G4S)4-HSA의 KD는 183 nM이며 IgG-(G4S)4-도메인 III의 KD는 305 nM이며IgG 단독에 대한 1.51μM과 비교하였고, 이는 IgG에 대한 융합 HSA 또는 도메인 III이 각각 10 및 5배로 FcRn 친화도를 개선시킨다는 것을 증명한다(표 2). 유사한 아직 덜 알려진 경향을 또한 YTE 변이체에 대해 관찰하였으며, IgG-YTE에 대한 친화도에서 IgG-YTE-(G4S)4-HSA는 3.8배(42.5 nM)를 나타내고, IgG-YTE-(G4S)4-도메인 III은 2.5배(65.1 nM) 개선을 나타낸다(표 2).
표는 pH 5.5에서 HSA과 IgG 융합 또는 도메인 III과 IgG 융합뿐만 아니라 그것들의 YTE 변이체 유사체에 대한 인간 FcRn 결합에 대한 SPR 유도 평형 상수를 제공한다.
상수 KD(nM)
IgG 1510
IgG-(G4S)4-HSA 183
IgG-(G4S)4-DIII 305
IgG-YTE 161
IgG-YTE-(G4S)4-HSA 42.5
IgG-YTE-(G4S)4-DIII 65.1
그러나 pH 5.5에서 친화도의 개선은 중성 pH에서 FcRn 결합에 영향을 미치지 않는다. 이는 동일한 고정 표면에 걸쳐 pH 7.2에서 1μM FcRn을 주입하는 것에 의해 시험하였다. IgG/IgG-YTE 대조군과 비교하여 임의의 융합 단백질 커플링된 표면에 FcRn 결합의 측정가능하지 않은 차이를 검출하였다(데이터 미제시).
산성 pH(~5.5-6.0)에서 FcRn에 HSA-융합의 결합 및 중성 pH(~7.4)에서 방출은 이러한 특성이 생체내 결합을 모방하기 때문에 생체내 효능과 관련이 있다. 따라서, 바람직한 HSA 변이체는 (i) 천연 HSA에 대해 개선된 친화도 또는 천연 HSA를 포함하는 컨쥬게이트를 가지는 변이체 및 (ii) 개선된 친화도가 산성 pH에서 관찰된 변이체이다. 게다가 중성 pH에서 FcRn에 대해 증가된 친화도를 가지는 변이체는 효능을 위태롭게 하며, 산성 pH에서 증가된 친화도의 유리한 효과를 감소시킬 수 있다.
8.3 실시예 3: 전장 HSA 와 융합은 인간 IgG 의 혈청 지속성을 향상시킨다
이 실험은 항체에 HSA의 융합이 항체의 혈청 반감기를 증가시킨다는 것을 증명하였다. 도 7에서 나타내는 바와 같이, 실시예 1에서 설명한 IgG-HSA의 혈청 지속성은 IgG 단독과 비교하여 증가되었다. 혈청 반감기의 증가는 IgG-YTE 변이체에 대해 보이는 것과 유사하다. 그러나, IgG-YTE 변이체에 HSA의 첨가는 이 연구에서 YTE에 대한 상당한 향상을 초래하는 것으로 나타나지 않았다.
마우스 신생아 Fc 수용체(mFcRn)를 인간 FcRn (huFcRn)의 단일 복제물로 대체한 4 내지 5개월령 인간 FcRnC57BL/6 유전자이식 마우스(JAX laboratories)를 사용하여 PK 연구를 수행하였다. 마우스를 인산염 완충 식염수 pH 7.2 중에서 희석한 적절한 단백질의 15㎎/㎏ 용량으로 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 모든 동물을 반전 안와 얼기(retro-orbital plexus)로부터 채혈하여 주사 1시간 후 혈청을 수집하였고 순환 내 주사한 실제 양을 결정하였다. 다음으로 혈청 샘플을 주사 후 24, 72, 168 및 240 시간에 수집하였고 -80℃에서 저장하였다. 혈청 내 남아있는 표시한 단백질의 양을 ELISA에 의해 분석한다. 간략하게, 항 HSA 코팅된 플레이트를 사용하여 다양한 IgG 융합 구성체를 포획하고 항-카파 검출 항체를 사용하여 검출한다. IgG 및 YTE 구성체에 대해, 항원 코팅 플레이트를 사용하여 IgG를 포획하고 항 중쇄 검출 항체를 사용하여 검출한다. 혈청 내 남아있는 단백질의 %를 주사한 양의 분획(1시간 샘플) 대 시간으로 플롯팅한다.
8.4 실시예 4: FcRn에 대한 HSA 상의 에피토프는 입체형태적이다
인간 FcRn이 천연 HSA와 잘 결합하는지를 농도 의존적 방식으로 관찰하였고, 항-β-2마이크로글로불린 항체와 면역블롯팅함으로써 시각화하였다. 그러나, 유사한 실험 조건 하에 시험한 변성된 HSA를 사용하여 유사한 결과가 관찰되지 않았다.
Sigma-Aldrich제의 인간 혈청 알부민(HSA; catalog no. A-8763), 인간 IgG (hlgG; catalog no. 1-4506), Tris 완충제를 10 ㎎ 단백질/㎖ 세파로스에서 CNBr-활성화된 세파로스 4B(GE HealthCare) 상에 고정하였다. 세파로스-Tris를 0.1 M Trizma 염기, 0.5 M NaCl, pH 8로 CNBr-활성화된 세파로스 4B를 차단함으로써 제조하였다. HSA에 연결된 세파로스 비드, hIgG 또는 Tris(~180 ㎍ 연결 단백질과 동등한 20㎕ 비드)를 환원(1% 2-머캅토에탄올) 또는 비환원 조건 하에 SDS 함유 샘플의 존재에서 10분 동안 비등시켰고, 또는 미처리로 남겨두었다. 이렇게 처리한 단백질 또는 pH 5.5에서 Tris 커플링된 비드를 50 mM 인산나트륨, 0.1% 피쉬 젤라틴(BIOFX Laboratories Inc, catalog no. PFGP-1000-01)을 함유하는 150 mM NaCl 완충제로 세척한 다음, 2시간 동안 실온에서 pH 5.5 중에서 인간 FcRn (0-20 ㎍)의 200㎕의 다양한 농도로 인큐베이션하였다. 미결합 단백질을 pH 5.5 완충제를 사용하여 세척하였다. 결합 단백질을 1% 2-머캅토에탄올을 함유하는 SDS-함유 샘플 완충제와 함께 비등시킴으로써 용리시켰고, SDS 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분석한 다음 항-2 마이크로글로불린 항체로 면역블롯팅하였다(Abeam catalog no. Ab6608).
세파로스-HSA에 인간 FcRn의 결합은 전체 FcRn 농도 범위에 대한 천연 HSA에 대해 최대였다. 그러나, HSA가 환원 및 비환원 조건 하에 변성될 때 결합이 극적으로 감소되었고, 이는 FcRn에 대해 HSA 상의 에피토프가 거의 입체형태적 에피토프일 가능성이 있다는 것을 시사한다(도 4). 예상한 바와 같이, 세파로스-IgG는 인간 FcRn에 결합하는 한편, Tris 차단 비드는 임의의 조건 하에 FcRn과 결합하지 않았다.
8.5 실시예 5: HSA 및 도메인 III은 효모 세포의 표면 상에서 디스플레이되 며, 디스플레이된 단백질은 FcRn 결합 능력을 보유한다
이 실험은 HSA와 도메인 III이 둘 다 효모 세포의 표면 상에서 성공적으로 발현될 수 있고, 산성 pH에서 수행한 변형된 유세포분석기에 의해 평가되는 바와 같이 이것이 pH 의존적 방식으로 단백질 결합 FcRn을 나타낸다는 것을 증명한다. 따라서 효모 세포 상의 발현은 도메인 III 내 변이를 함유하는 구성체(예를 들어, 도메인 III 단독, 전장 HSA, 절단된 HSA 또는 적어도 도메인 III을 포함하는 키메라 폴리펩타이드)를 스크리닝하기 위한 한 방법을 제공하여, (i) FcRn에 결합하고 (ii) 예를 들어 비변이체 구성체에 대해 증가된 친화도를 가지는 FcRn에 결합하는 이러한 구성체의 능력을 평가한다.
8.5.1 효모 세포 표면 디스플레이
HSA, 도메인 III 또는 단일 쇄 Fv 단편(scfv)을 pYD1 효모 디스플레이 벡터(Invitrogen Catalog no. V835-01)에 클로닝하였고, 효모 세포 표면 상에서 존재를 위해 사카로마이세스 세레비시에로 형질전환하였다. pYD1은 갈락토스 유도성 프로모터의 대조군 하에 사카로마이세스 세레비시에 단백질 Aga2p를 가지는 C-말단 융합으로서 관심의 단백질을 디스플레이한다. 모든 실험 절차를 공급업자의 매뉴얼 중에서 설명되는 바와 같이 수행하였다. 영양요구성 선택 마커 우라실 및 트립토판을 사용하여 형질전환된 세포를 선택하였고, 적절한 선택 배지 중에서 배양하였다(Teknova Inc., Catalog no. C8140). 배양물을 48시간까지의 시간 동안 갈락토스로 유도하여 Aga2p 융합 단백질을 발현시켰다. 세포를 0, 24 및 48시간에 샘플링하였다. 세포 샘플을 세척하였고, 0.1% 피쉬 젤라틴을 함유하는 pH 7.2 PBS로 차단하였으며, FITC 컨쥬게이트된 토끼 다클론성 항-HSA 항체(Abeam Inc., Catalog no. AB34669)로 염색하였고, 유세포 분석기로 분석하였다.
HSA 또는 도메인 III의 세포 표면 발현이 0시간에 관찰되지 않은 반면, 효모 세포 상의 단백질 둘 다의 발현은 24시간에 관찰되었다. 이러한 발현을 유도 48시간 후에 유지하였다. 발현을 양성 FITC 염색에 의해 시각화하였다. 도 5a는 HSA와 도메인 III이 둘 다 효모 세포의 표면 상에서 성공적으로 발현될 수 있다는 것을 나타낸다. scfv 형질전환된 세포는 예상한 바와 같이 항-HSA로 염색하지 않았다(예를 들어, 음성). 따라서, scfv 형질전환 세포는 음성 대조군으로 작용하였다.
8.5.2 표면 발현된 HSA 또는 도메인 III 의 FcRn 결합 능력
HSA, 도메인 III 또는 scfv를 발현시키고 48시간 동안 갈락토스로 유도한 효모 세포를 pH 5.5, 50 mM 인산나트륨, 0.1% 피쉬 젤라틴을 함유하는 1-50 mM NaCl 완충제(또한 FACS 완충제로 언급)로 1시간 동안 차단하였다. 다음으로 세포를 pH 5.5 인산염 완충제 중에서 바이오틴화된 FcRn(70 μM)과 함께 인큐베이션하였고, 결합한 FcRn을 스트렙타비딘 피코에리트린(PE)(Invitrogen Inc.)을 사용하여 시각화하였다. pH 5.5 50 mM 인산나트륨, 일상적으로 사용하는 PBS 대신 150 mM NaCl 완충제가 있는 유세포 분석기에 의해 이렇게 염색한 세포를 분석하였다.
scfv에 대한 것과 비교하여 히스토그램 내 이동에서 보이는 바와 같이, HSA와 도메인 III 발현 세포를 PE에 대해 양성으로 염색한 반면, 음성 대조군 scfv 발현 세포는 그렇지 않았고(도 5b), 이는 효모 세포 표면 상에서 발현된 HSA 및 도메인 III이 FcRn 결합 능력을 보유하고, 따라서 기능적이라는 것을 증명한다. 별개의 실험에서, 세포를 FcRn 결합에 대해 낮은 pH 유세포분석기로 유사하게 처리하였고, 유사한 결과를 가지는 고속대량 샘플링 기법, HyperCyt(등록상표) 시스템(IntelliCyt Corporation)을 사용하여 분석하였다.
8.6 실시예 6 높은 다양성을 가지는 라이브러리를 발생시키기 위해 OriP 를 포함하는 아데노바이러스 포유류 세포 표면 디스플레이 벡터
scFv-Fc 단백질의 표면 디스플레이를 위한 글라이코실포스파티딜이노시톨(GPI)-앵커를 사용하는 포유류 표면 디스플레이 라이브러리를 scFv-Fc 발현 카세트 지정 pENDisplay를 함유하도록 유전자 조작된 Gateway(등록상표) 유입 벡터 내에서 구성하였다(도 8a를 참조). 상이한 scFv 서열의 라이브러리를 Sfi/NotI 자리에 용이하게 삽입한다. pENDisplay 벡터 내 라이브러리를 제조업자에 따라 pAd/PL-DEST(상표명) 벡터(Invitrogen Cat. No. V494-20) 벡터와 조합하여 아데노바이러스 발현 라이브러리를 발생시켰고, 총 ~5 x 106 콜로니 형성 단위(cfu)를 얻었다. 아데노바이러스를 발생시키기 위하여, 트랜스로 재조합 아데노바이러스를 발생시키는데 필요한 E1 단백질(E1a 및 E1b)을 공급하는 E1 유전자의 안정적으로 통합된 복제물을 함유하는 293 A 세포(Invitrogen Cat. No. R70507)는 왼쪽 및 오른쪽 반전 말단 반복체(ITR)를 노출시키기 위해 선형화된 아데노바이러스 발현 라이브러리로 트랜스펙션한다. 선형화된 아데노바이러스 라이브러리로 직접 트랜스펙션한 적어도 50%의 293 A 세포를 FACS 분석에 의해 그것의 표면 상에서 항체를 디스플레이하는 것을 발견하였다. 그러나 선형화된 아데노바이러스 라이브러리가 아데노바이러스의 생성을 위해 293 A 세포로 트랜스펙션되었을 때, 110 ㎜ 디쉬 당 50개 미만의 플라크를 얻었다. 아데노바이러스를 제10일에 채취하였고, 바이러스 DNA를 분리하였으며, PCR을 사용하여 pENDisplay 벡터로 다시 재클로닝한 scFv 암호화 영역을 증폭시켰고, 96개 콜로니를 선택하고 시퀀싱하였다. 단지 14개의 독특한 VH 서열을 분석한 96개 콜로니로부터 확인하였다. 플라크 회수의 낮은 효율은 선형화된 아데노바이러스 벡터의 분해에 기인할 수 있고, 아데노바이러스 라이브러리의 복잡성의 상당한 감소를 초래한다.
엡스타인-바르 핵 항원 1(EBNA-1)은 핵 위치 신호(nuclear localization signal: NLS)를 함유하며, 플라스미드와 같이 핵산을 함유하는 OriP에 결합한다. EBNA-1 단백질(도 9a를 참조)은 핵산을 함유하는 OriP가 NLS를 통해 핵으로 이동되도록 할 수 있고, 에피솜 유지를 향상시킨다. 유지된 에피솜이 아데노바이러스 구제에 필요한 것으로 생각되지 않지만, OriP 서열(도 9c를 참조)은 pENDisplay 벡터의 attL1과 attL2 서열 사이의 scFv-Fc 카세트의 폴리A 서열 뒤에 도입되었다. 새로운 벡터 지정 pENDisplay-OriP는 도 8b에서 도시한다. pENDisplay-OriP 내 라이브러리를 pAd/PL-DEST(상표명) 벡터(Invitrogen Cat. No. V494-20) 벡터와 조합하여 또한 ~5 x 106 cfu를 가지는 제2 아데노바이러스 발현 라이브러리를 만들었다. pENDisplay-OriP 벡터로부터 발생된 라이브러리를 선형화하였고 293E 세포(Invitrogen Cat. No. R620-07)에 트랜스펙션하였는데, 이는 엡스타인-바르 바이러스 핵 항원(EBNA-1) 및 아데노바이러스 E1a 단백질을 발현시키며, 110㎜(직경) 디쉬 당 10,000 이상으로 초래된다. 바이러스를 제7일에 채취하였고, 96개 클론을 상기 설명한 바와 같이 분석하였다. OriP 자리가 없는 제1 라이브러리로부터 분리한 독특한 클론의 낮은 수와 대조적으로, 분석한 모든 96 VH 서열은 독특하였다. 이 결과와 함께 아데노바이러스 발현 라이브러리 벡터에 OriP 서열의 부가는 EBNA-1을 발현시키는 세포로부터 아데노바이러스의 구제와 아데노바이러스 라이브러리의 다양성을 둘 다 크게 향상시킨다는 것을 증명한다.
아데노바이러스 벡터에 OriP 서열(예를 들어 도 9c)의 부가는 EBNA-1 단백질의 존재에서 숙주 세포로부터 재조합 아데노바이러스 입자의 발생 효율을 향상시킨다. 아데노바이러스 발현 라이브러리를 구성할 때, 바이러스 생성의 향상된 효율은 상실된 클론의 수를 감소시키는 것에 의해 라이브러리의 다양성/복잡성을 유지한다. 이하의 실시예 7은 상기 설명한 바와 같이 본질적으로 아데노바이러스 발현 벡터에 OriP 서열을 포함하는 HSA 도메인 III 변이체를 발현시키는 포유류 표면 디스플레이 라이브러리의 구성 및 스크리닝을 상술한다.
도 10은 관심의 단백질(들)의 발현을 위해 대표적인 유전적 아데노바이러스 발현 벡터의 개략도를 제공한다. 이 실시예에서, 돌연변이체 아데노바이러스 게놈은 E1 및/또는 E3 부분이 결실되도록 제공된다. 상실 바이러스 유전자는 바이러스 구제를 위해 사용한 숙주 세포에 의해 트랜스로 제공된다. 결실은 관심의 단백질(들)의 발현을 위해 사용한 숙주 세포 내 아데노바이러스의 복제를 방지한다. 관심의 DNA는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 암호화 서열(들), 프로모터 서열(들), 종결 신호(들), 폴리A 서열(들) 등을 포함하는 단백질(들)의 발현에 필요한 모든 성분을 포함할 것이다. 관심의 단백질(들)은 가용성 일 수 있고 또는 막투과 도메인 또는 GPI-앵커 신호와 같이 세포 표면에 단백질(들)을 고정시키는 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서에 예시되는 바와 같이, 아데노바이러스 벡터는 유전자 조작되어 변이체 단백질의 라이브러리를 발현시킬 수 있다. 도 10에서 도시한 아데노바이러스 발현 벡터는 Gateway(상표명) 유입 및 구성체에 대한 지정 플라스미드를 사용하는 것으로부터 초래된 att 재조합 자리의 위치를 제공한다. 또한 EBNA-1 DNA 서열이 위치될 경우 하나의 가능한 위치가 도시된다. 벡터 성분에 대한 다른 위치 및 배향이 생각된다. 벡터 영역의 배향 및/또는 상대적 위치는 다를 수 있다는 것은 당업자에 의해 이해될 것이다.
8.7 실시예 7 HSA 및 도메인 III 에 대해 다른 디스플레이 플랫폼의 사용
파지 디스플레이 및 포유류 세포 표면 디스플레이 기법을 또한 HSA 및 도메인 III에 대한 잠재적인 디스플레이 플랫폼으로 평가하였다. 파지 디스플레이 플랫폼은 박테리아 세포의 표면 상에서 HSA 및 도메인 III을 발현시키지 않았는데, 아마도 이 분자에서 이황화 결합의 풍부함에 기인한다(데이터 미제시). 그러나, 감쇠 가속화 인자(예를 들어 미국 특허 2007/0111260에서 설명되는 돌연변이된 DAF)로부터의 글라이코실포스파티딜이니소톨(GPI)-앵커 신호를 통해 매개된 293-F 세포 내 일시적 표면 발현을 사용하는 포유류 세포 디스플레이 시스템은 HSA 및 도메인 III을 디스플레이하는데 성공적이었다. 디스플레이된 단백질은 FcRn 결합 능력을 보유하였다(데이터 미제시).
pEN-HSA-GPI 지정된 부가적인 포유류 발현 구성체를 발생시켰으며, 에피토프 태그(예를 들어 플래그 태그)를 2회 염색 동안 부가하였고 링커를 융합 단백질의 가요성을 증가시키기 위해 HSA의 5'과 3' 둘 다에 부가하였으며 FcRn에 HSA의 결합을 용이하게 하였고(도 11a), 이 구성체를 일시적 트랜스펙션을 위해 직접 사용하거나 pAd-HSA-GPI 지정된 OriP 서열을 또한 포함하는 아데노바이러스 발현 벡터를 발생시키기 위하여 사용하였다. 일시적 트랜스펙션 분석(데이터 미제시)과 아데노바이러스 발현 시스템을 사용하여 이 구성체로부터 포유류 세포(예를 들어, 293F 세포)의 표면 상에서 기능적 HSA를 발현시켰다. 도 11은 25㎍/㎖ 및 5㎕/㎖(각각 도 11c 및 도 11d)에서 항-HSA(도 11b) 또는 FcRn으로 염색한 세포의 히스토그램에서 결과 이동을 보여준다. 따라서 몇몇 잠재적 시스템은 HSA 및 도메인 III 변이체를 발현시키기 위해, 예를 들어 비변형체 구성체에 비해 증가된 친화도로 (i) FcRn에 결합 및 (ii) FcRn에 결합하는 능력에 대해 이러한 변이체를 스크리닝하기 위해 존재한다.
세포 표면 상에서 HSA 를 디스플레이하기 위한 293 F 세포의 트랜스펙션 : 1.5 ㎍의 플라스미드 및 2.25 ㎕의 293 펙틴을 별개의 튜브에서 100 ㎕의 Optimem 배지(Invitrogen)에 첨가하였고, 5분 동안 실온에서 인큐베이션한 다음 2성분을 함께 합하였다. 실온에서 추가 20분 동안 인큐베이션한 후, 24 깊이 웰 플레이트 중에서 혼합물을 2 ㎖의 293F 세포에 1 x 106 세포/㎖의 밀도로 첨가하였다. 트랜스펙션한 세포를 8% C02의 존재에서 24시간 동안 250 rpm에서 성장시켰다.
아데노바이러스 발현 벡터의 발생 및 사용 : Gateway(R) 기법(Invitrogen)을 사용하여 Invitrogen 지정 벡터에 대해 유입 벡터(pEN-HSA-GPI)에서 HSA를 재조합하여 아데노바이러스 발현 벡터를 만들었다. 간략하게, 150 ng의 pEN-HSA-GPI 벡터, 300 ng의 pAd/PL-DEST(Invitrogen), 2 ㎕의 LR Clonase II(Invitrogen), 및 TE 완충제를 총 10 ㎕ 반응 혼합물에 첨가하였다. 25℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 2 ㎕의 반응 혼합물을 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라서 One-shot Top 10 컴피턴트 세포(Invitrogen)로 형질전환하였다. 형질전환시킨 TOP 10 세포를 암피실린 플레이트 상에 플레이팅하고 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플라스미드를 제조하기 위하여 단일 콜로니를 LB 배지에 넣었다. 아데노바이러스 발현 벡터를 함유하는 HSA 유전자를 Pac I로 선형화한 후 트랜스펙션하여 아데노바이러스를 발생시켰다. 2 ㎍의 선형화된 아데노바이러스 벡터 및 6 ㎕의 리포페카틴-2000을 사용하여 293E 세포를 트랜스펙션하고 아데노바이러스를 생성하였다. 트랜스펙션 7일 후, 2-3회 교대로 냉동(-80℃에서) 및 해동(37℃에서)하여 트랜스펙션된 세포로부터 아데노바이러스를 방출시켰다. 3000 rpm에서 10분 동안 원심분리에 의해 세포 파편을 제거하였고, 아데노바이러스 함유 상청액을 새로운 튜브에 알리쿼트하고 -80℃에서 저장하였다. 제조업자의 설명서에 따라서 Adeno-XTM 급속 역가 키트(Clontech:PT3651-2)를 사용하여 바이러스 역가를 결정하였다. 아데노바이러스를 HSA 구성체의 발현 동안 1의 MOP에서 사용하였다.
8.8 실시예 8: FcRn 결합 에피토프를 확인하기 위한 DIII 상에서 표면 노출된 루프의 알라닌 스캐닝 돌연변이유발
이 실시예는 HSA에 FcRn 결합을 매개하는 도메인 III 상에서 표면 노출된 루프의 역할을 기술한다.
도메인 III은 205개의 아미노산 잔기로 구성되며, 9개의 루프를 통해 연결되고 6개의 이황화 결합을 통해 안정화된 10개의 나선을 암호화한다(Sugio et al. 1999, Protein Eng. 12:439-46 and PDB: 1BM0). 이 루프를 포함하는 아미노산 잔기의 위치뿐만 아니라 각 루프의 길이를 이하에 열거한다. 아미노산 넘버링은 전장 성숙 HSA 부분 내 이 루프의 위치에 대한 것이다(서열 번호 2).
루프 1: 잔기 398-400 = 3 아미노산
루프 2: 잔기 415-419 = 5 아미노산
루프 3: 잔기 439-443 = 5 아미노산
루프 4: 잔기 468-470 = 3 아미노산
루프 5: 잔기 480-482 = 3 아미노산
루프 6: 잔기 492-509 = 18 아미노산
루프 7: 잔기 516-517 = 2 아미노산
루프 8: 잔기 537-541 = 5 아미노산
루프 9: 잔기 561-564 = 4 아미노산
루프 넘버링된 2, 3, 6, 8 및 9는 용매 접근가능하고 분자의 표면상에 노출되어 있다(Sugio et al. ibid, 및 PDB: 1BM0).
특정 실시예에서, 각 개별 표면 접근가능 루프 내 또 다른 아미노산을 한 세트 내에서 홀수로 넘버링된 돌연변이된 잔기 및 다른 세트 내에서 짝수로 넘버링된 돌연변이된 잔기를 가지는 알라닌으로 돌연변이시켰다(돌연변이되지 않는 프롤린 및 시스테인을 제외). 실험 설계를 적합화하는데 단지 하나의 구성체가 필요한 경우 루프 당 2개의 돌연변이체 세트를 루프 9의 제외로 만든다. 세포 표면 디스플레이(예를 들어 pYD1 효모 디스플레이 벡터)에 대한 벡터 내에서 총 9개의 이러한 구성체를 만들고 FcRn 결합 능력에 대해 평가한다. 변이체를 적용에서 설명한 표준 시험관내 분석을 사용하여 평가할 수 있다(예를 들어, 유세포분석). FcRn에 대해 개선된 친화도를 나타내는 변이체(들)를 확인한다. 또한 산성 pH에서, 그러나 중성 pH는 아닌 FcRn에 대해 개선된 친화도가 생기는지 여부를 결정하기 위하여 각 변이체를 스크리닝할 수 있다. 중성 pH가 아닌 산성 pH에서 FcRn에 대해 개선된 친화도가 (i) 변이체 도메인 III 구성체 단독; (ii) 전장 HSA의 맥락에서 존재하는 변이체 도메인 III 구성체; 또는 (iii) 적어도 도메인 III을 포함하는 절단된 HSA 또는 키메라 폴리펩타이드의 맥락에서 시험될 수 있다. 앞서 언급한 것을 야생형 도메인 III, 야생형 전장 HSA, 또는 돌연변이가 없는 키메라 폴리펩타이드와 비교한다.
특정 실시예에서, 앞서 언급한 스크리닝으로부터 얻은 정보는 FcRn 결합 능력을 유지하는(또는 심지어 개선) 동안 변이를 잘 받아들이는 표면 접근가능 루프 내 잔기를 확인한다. 이러한 확인된 위치가 각각의 다른 20개 아미노산으로 돌연변이된 일련의 변이체를 구성하고, 이러한 변이체를 또한 스크리닝한다. 하나 이상의 위치에서 돌연변이를 포함하는 추가 변이체를 후속하여 구성하고 스크리닝한다.
특정 실시예에서, 변이체의 라이브러리를 만들고 평가한다.
8.9 실시예 9: 보존되고, 표면 노출된 잔기의 알라닌 스크리닝 돌연변이유발
13가지의 상이한 동물 종 중에서 도메인 III 중에 보존된 표면 접근가능 아미노산 잔기를 아미노산 서열 배열에 의해 확인하였다. 이러한 보존된 잔기를 알라닌으로 하나씩 돌연변이시켜 FcRn 결합에서 그것들의 역할을 결정하였다.
HSA의 도메인 III 아미노산 서열을 래트, 마우스, 소, 개, 토끼, 돼지, 닭, 당나귀, 모래쥐, 양, 고양이 및 말을 포함하는 12가지의 상이한 종으로부터의 혈청 알부민 도메인 III 서열과 비교하였고, 모든 이들 종 중에서 보존된 잔기를 확인하였다(도 6a 내지 도 6d). 닭 HSA는 포유류 HSA 단백질과 별개이기 때문에 제2 배열은 바로 포유류 종으로 제공된다(도 6e 내지 도 6h). 돼지, 래트, 마우스, 개, 양, 토끼 및 소로부터의 혈청 알부민은 ELISA, 면역블롯팅 및 SPR에 의해 인간 FcRn에 결합하는 것으로 이미 나타났다(데이터 미제시). 별개의 분석에서, 도메인 III 내 표면 노출된 잔기를 관심의 이용가능한 GETAREA 1.0 베타 소프트웨어(http://curie.utmb.edu/getarea.html)를 사용하여 확인하였다. 이 소프트웨어는 개개 원자의 접근가능 표면 영역 및 그것의 기울기를 계산하고, 각각 접근불가능 및 접근가능을 나타내는, "i" 또는 "o"로 표현되는 표면 접근가능성에 대해 각 아미노산 잔기를 스코어링한다(표 3). 소프트웨어에 의해 계산하고 HSA 결정 구조의 조작 검사에 의해 확인한 바와 같은 모든 이런 상이한 종 및 노출된 표면인 아미노산을 확인하였다(표 3의 박스).
이렇게 확인한 모두 18개의 아미노산 잔기를 하나씩 알라닌으로 돌연변이시키고, 세포 표면 디스플레이(예를 들어 pYD1 효모 디스플레이 시스템)를 사용하여 FcRn 결합 상에서 영향을 평가한다. 도메인 III 돌연변이를 다음 중 하나 이상의 맥락에서 도입하고 스크리닝한다: 도메인 III 단독, 전체 HSA 단백질, 절단된 HSA 또는 적어도 도메인 III을 포함하는 키메라 폴리펩타이드. 보존된, 표면 노출된 시스테인 및 프롤린은 분석에 포함하지 않는다.
다른 실시예에서, 모두 18개 아미노산 잔기(또는 알라닌 실험이 특정 위치가 치환을 허용할 수 없는 것으로 나타난다면 모두 18 미만)를 각각의 다른 19개 아미노산 잔기로 하나씩 돌연변이시키고, pYD1 효모 디스플레이 시스템(또는 다른 디스플레이 시스템)을 사용하여 FcRn 결합 상의 영향에 대해 평가하였다.
다른 실시예에서, 돌연변이의 조합을 포함하는 변이체를 구성하고 평가한다. 적용에서 설명한 표준 시험관내 분석을 사용하여 변이체를 평가할 수 있다(예를 들어, 유세포 분석기). FcRn에 대해 개선된 친화도를 나타내는 변이체(들)를 확인한다. 각 변이체를 또한 스크리닝하여 중성 pH가 아닌 산성 pH에서만 FcRn에 대해 개선된 친화도가 생기는지 여부를 결정할 수 있다. 중성 pH가 아닌 산성 pH에서 FcRn에 대해 개선된 친화도를 다음 중 하나 이상에 대해 시험한다 (i) 변이체 도메인 III 구성체 단독; (ii) 전장 HSA의 맥락에서 변이체 도메인 III 구성체, 또는 (iii) 절단된 HSA 또는 적어도 도메인 III을 포함하는 키메라 폴리펩타이드의 맥락. 앞서 언급한 것을 야생형 도메인 III, 야생형 전장 HSA, 또는 돌연변이가 없는 키메라 폴리펩타이드와 비교한다.
표 3. 표는 도메인 III 내 모든 아미노산에 대한 용매 접근가능성 변수를 설명한다. 도 6a 내지 도 6d에서 배열한 모든 종 중에서 보존된 잔기(서열번호 2에 제공된 성숙 전장 HSA 서열에 대해 넘버링)를 볼드체로 나타내고 표시하며(##), 모든 배열 종 중에서 표면 접근가능하고 보존된 잔기를 박스 표시하였다.
http://curie.utmb.edu/getarea.html. 추가로, 닭을 제외한 도 6e 내지 도 6h에서 배열된 모든 종에서 보존된 잔기를 표시한다(@@). 잔기는 각각 표면 접근불가능 및 접근가능을 나타내는 (i) 및 (o)로 주석을 단다.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
8.10 실시예 10: 단일 아미노산 돌연변이체의 라이브러리를 만들기 위한 모든 가능한 아미노산에 대해 도메인 III 상의 각 잔기의 돌연변이유발
시스테인과 프롤린을 제외하고 도메인 III 내 모든 아미노산을 모두 20개의 아미노산(즉, 야생형 아미노산 및 모두 19개의 비야생형 아미노산)으로 돌연변이시켜 돌연변이체의 라이브러리를 만들었고, 각 개개의 돌연변이체는 단지 하나의 위치에서 단일 돌연변이를 가진다. 205개의 아미노산의 전체 길이는 라이브러리 구조 내에 포함되고; 따라서 184개 잔기는 개별적으로 총 3496의 라이브러리 다양성을 초래하도록 돌연변이된다. 도메인 III 돌열변이를 다음 중 하나 이상의 맥락에서 도입하고 스크리닝한다: 도메인 III 단독, 전체 HSA 단백질, 절단된 HSA 또는 적어도 도메인 III을 포함하는 키메라 단백질. 표준 돌연변이유발 방법을 이용하여 도메인 III 돌연변이체의 라이브러리를 발생시킬 수 있다. 선택적으로 또는 대안으로 도메인 III 돌연변이체의 라이브러리는 독일에 소재한 Geneart AG와 같은 상업적 시설에 의해 만들어진다. 돌연변이체의 라이브러리를 pYD1 효모 디스플레이 벡터 또는 포유류 디스플레이 벡터에 클로닝한다. 재조합 아데노바이러스의 향상된 발생을 위한 OriP 서열을 포함하는(OriP를 포함하는 개략적인 유전적 유입 벡터에 대해 도 10 참조) 상기 설명한 pYD1 효모 디스플레이 벡터 또는 포유류 디스플레이 벡터 pEN-HSA-GPI와 같은 디스플레이 벡터에 클로닝하고, 적용에서 설명한 표준 시험관내 분석(예를 들어 유세포 분석기)을 사용하여 FcRn 결합 능력에 대해 스크리닝한다. FcRn에 대해 개선된 친화도를 나타내는 변이체(들)를 확인한다. 또한 각 변이체를 스크리닝하여 FcRn에 대해 개선된 친화도가 중성 pH가 아닌 산성 pH에서만 생기는지 여부를 결정할 수 있다. 중성 pH가 아닌 산성 pH에서 FcRn에 대해 개선된 친화도를 (i) 변이체 도메인 III 구성체 단독; (ii) 전장 HSA의 맥락에서 변이체 도메인 III 구성체, 또는 (iii) 절단된 HSA 또는 적어도 도메인 III을 포함하는 키메라 폴리펩타이드의 맥락에 대해 시험한다. 앞서 언급한 것을 야생형 도메인 III, 야생형 전장 HSA, 또는 돌연변이가 없는 키메라 폴리펩타이드와 비교한다. 실험적 설계는 FcRn에 대해 친화도를 개선시키는 돌연변이(들)와 함께 결합 에피토프를 확인시킨다.
합성 도메인 III(DIII) 라이브러리를 6 x 10e4 독립적 형질전환체를 가지는 상기 설명한 것과 같이 발생시켰다. 각 개개의 돌연변이체가 단지 하나의 위치에서 단일 돌연변이를 가지도록 라이브러리를 설계하였지만 다수의 이중 및 심지어 삼중 돌연변이가 발생하였다. 합성 DIII 라이브러리를 PCR 증폭시켰고, DI 및 DII와 조립하여 중첩 PCR에 의해 전장 HSA 라이브러리를 형성한다. PCR을 Sfi I 및 EcoR I로 분해하였고, 유사하게 분해된 벡터 pEN-HSA-GPI, 상기 설명한 바와 같은 OriP 서열을 포함하는 향상된 포유류 디스플레이 Gateway(상표명) 유입 벡터로 클로닝하였다(예를 들어 도 8b 및 도 10을 참조). DIII 라이브러리를 증폭시키기 위하여 사용한 프라이머는 N 및 C 말단 끝에서 6개의 야생형 아미노산 잔기를 가지며, 따라서 도메인 III의 이들 12개 아미노산의 다양성을 제거하였다. 2개의 라이브러리를 pEN-HSA-GPI 벡터 내에서 발생시켰고, 12 ㎍의 PAC I 선형화된 아데노바이러스 발현 벡터가 라이브러리 발생에 대해 사용되는 것을 제외하고 본질적으로 상기 설명한 바와 같이 대응하는 아데노바이러스 라이브러리를 발생시켰다. 각 라이브러리의 크기를 표 4에서 나타낸다. pEN-HSA-GPI 라이브러리의 다양성을 시험하였고, 라이브러리 1: ~ 50%의 클론은 야생형이었고, 라이브러리 2: ~30%의 클론이 야생형이었다.
DIII 라이브러리 크기
pEN-HSA pAd-HSA
라이브러리 1 1.3 × 106 5.4 × 106
라이브러리 2 6.4 × 106 1.7 ×107
야생형 HSA, HSA-DIII 라이브러리 1 또는 HSA-DIII 라이브러리 2를 발현시키는 아데노바이러스로 감염시킨 세포를 본질적으로 상기 실시예 5에서 설명한 바와 같이 항-HSA-FITC 항체 및 FcRn-바이오틴(SA-PE로 검출)으로 염색하였고 이하에 설명하는 바와 같이 FACS로 분석하고/스크리닝하였다. 야생형 HSA 및 2개의 라이브러리의 발현 수준은 비슷하였다(도 12a). 10 ㎍/㎖FcRn으로 염색하였을 때 HSA-DIII을 발현시키는 세포 집단만이 히스토그램에서 이동을 나타내었다(도 12b). 도 13은 대응하는 이중 염색 FACS 프로파을 나타낸다. 소팅으로부터 회수한 풍부한 세포 집단을 증폭시켰고, 소팅에 의해 두 번째 라운드를 받게 하거나 또는 이하에 설명하는 바와 같은 개개의 클론을 분리하기 위해 사용하였다. 도 14a의 히스토그램에서 볼 수 있는 것과 같이, 야생형 HSA의 발현 수준, 출발 라이브러리 및 저장된 라이브러리는 비슷하다. 그러나, FcRn으로 염색은 라운드 1 및 2 소팅 라이브러리가 낮은 농도, 1 ㎍/㎖ 및 심지어 0.1 ㎍/㎖에서 존재하는 FcRn에 결합할 수 있는 HSA-DIII 돌연변이체를 발현시키는 세포에 대해 풍부하다는 것을 나타낸다(도 14b 및 도 14c).
다수의 개개의 클론을 분리하였고(이하에 설명) 실험을 pH 7.2에서 수행하는 것을 제외하고는 본질적으로 상기 실시예 2에서 설명한 것과 같이 pH 의존적 FcRn 결합에 대해 스크리닝하였다. 도 15는 pH 5.5(패널 a) 및 pH 7.2(패널 b)에서 대조군 세포, 야생형 HSA 및 몇몇 대표적인 클론에 대한 대표적인 히스토그램을 보여준다. 이 HSA 돌연변이체와 야생형 HSA 사이의 발현 수준은 유사하다(도 15c). 도 16에서 나타내는 바와 같이 pH 의존적 결합(즉 낮은 pH에서 선호되는 결합)을 보유하는 것으로 확인한 클론을 시퀀싱하고, 야생형 HSA 및 대조군 세포와 함께 몇몇 FcRn 농도(예를 들어, 0.1 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖, 및 10 ㎍/㎖의 FcRn-바이오틴)를 사용하여 추가 FACS 분석을 받게 하여 FcRn에 대한 돌연변이의 상대적 친화도롤 분석할 수 있다. 풍부한 집단으로부터 추가 ~1100개 클론을 시퀀싱한 후 임의의 다른 특징화를 하였다. 표 5는 라이브러리로부터 분리되고 및/또는 시퀀싱된 클론 내에서 확인되는 아미노산 치환의 요약을 제공한다. 볼드체 위치는 치환이 약 1-5%의 클론 사이의 위치에서 발견되고 "선호되는 스팟"으로 언급될 수 있다는 것을 나타낸다. 볼드체이고 밑줄친 위치는 치환이 클론의 5% 이상의 위치에서 발견되고 "핫 스팟"으로 언급될 수 있다는 것을 나타낸다. 이탤릭체로 열거된 아미노산 치환(치환된 AA 컬럼)은 이중/삼중 돌연변이의 맥락에서만 확인될 수 있다. 5개 이상의 클론에서 발견되는 아미노산 치환(치환된 AA 컬럼)은 볼드체로 나타낸다. 3개 이상의 클론에서 발견되는 조합은 괄호로 나타낸 확인한 클론의 수로 볼드체로 나타낸다. 아미노산 넘버링은 서열번호 2로 제공된 성숙 전장 HSA에 대한 것이다. 동일한 위치에서 동일한 아미노산 치환 및/또는 동일한 위치에서 상이한 아미노산 치환을 함유하는 다중 클론을 분리하였고(표 5를 참조) 이는 이 위치가 돌연변이의 핫 스팟을 나타낼 수 있다는 것을 표시한다.
HSA의 분해된 구조 상에서 몇몇 선호되는 및/또는 핫 스팟의 위치를 도 17에 표시한다. 아미노산 407, 415 및 463을 제외하고 핫 스팟 및 선호되는 스팟의 대부분은 루프 6 및 7(각각 잔기 492-509 및 516-518을 포함) 및 나선 7(각각 잔기 510-515 및 519-536을 포함)에서 발견하였고, 도 16에서 원으로 표시한다.
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
이렇게 확인한 몇몇 돌연변이체를 자리 지정 돌연변이에 의해 용해성 단백질로 발생시켰고, 추가 분석을 위해 이하에 설명하는 바와 같이 정제하였다. 결합 친화도(pH 5.5에서 KD) 및 pH 의존도(7.2 대 5.5)를 ProteOn(이하에 설명) 및/또는 BIAcore(본질적으로 상기 설명한 바와 같음)에 의해 결정하였다. 표 6은 결합 연구의 요약을 제공하며, 이 연구에 대한 단백질 밀도를 포함한다. 다수의 돌연변이체가 pH 5.5에서 향상된 결합을 가지는 것을 발견하였으며, 이는 표 6에서 볼드체인 L407Y/Q526T; L463N/T508R; I523G; V424Q; L83N/128R/I143G; 및 K144를 포함한다. pH 5.5에서 향상된 결합을 나타낸 시험한 것들 모두는 또한 pH 의존적 결합을 유지하는 것으로 발견되었다(표 6의 마지막 컬럼을 참조). 분석한 몇몇 돌연변이체는 pH 5.5에서 변하지 않았고 또는 심지어 증가된 KD(즉, 변하지 않거나 더 나쁜 결합)를 가지는 것을 발견하였다. 이러한 클론이 확인될 수 있는 몇몇 가능한 이유가 있으며, 이 돌연변이는 디스플레이 시스템에서 단백질 발현 또는 안정성을 향상시킬 수 있다. 또한 디스플레이를 위해 사용한 GPI 앵커는 돌연변이체 HSA가 가용성 분자로 발현될 때 복제되지 않는 이 돌연변이체가 보충할 수 있는 결합에 일부 영향을 가질 수 있다. 더 나아가, 포획 방출속도에 대해 최적화된 스크리닝 방법의 설계는 전반적인 친화도 개선으로 번역되거나 번역되지 않을 수 있는 돌연변이체를 안정화시킨다. 또한 이 돌연변이는 하나 이상의 다른 돌연변이와 조합될 때 향상을 제공한다는 것을 반영할 수 있다. 다수의 돌연변이가 조합에서 발견되었다(표 5를 참조).
Figure pct00015
세포 염색 및 FACS 분석 및 소팅 : 1 x 106/㎖ 밀도에서 3천만 개의 293F 세포를 MOI=1에서 HSA 아데노바이러스 라이브러리로 감염시켰다. 세포를 원심분리에 의해 형질도입 후 16시간에 채취하였고, 차가운 FACS 완충제로 세척하였고, ~1 x 107 세포/㎖로 재현탁하였다. 바이오틴화된 FcRn을 소팅의 제1 라운드 동안 10 ㎍/㎖(212 nM)에서 첨가하였다. 4℃에서 60분 동안 인큐베이션 후, 세포를 FACS 완충제로 2회 세척하였고, 스트렙타비딘-PE 중에서 1:500 희석으로 재현탁하였다. 30분 동안 4℃에서 인큐베이션 후, FACS 완충제로 한 번 세척하였고, FcRn 결합 동안 소팅하였으며, 이는 pH 5.5에서 FcRn과 결합하는 세포를 풍부하게 한다. 소팅된 세포를 추가 스크리닝을 위해 증폭시켰다. 제2 라운드 소팅 동안, 풍부화 세포 집단을 바이오틴화된 FcRn이 1 ㎍/㎖(21.2 nM)에서 사용되어 추가로 높은 친화도 HSA 돌연변이체를 풍부하게 하는 것을 제외하고, 본질적으로 상기 설명한 바와 같이 소팅하였다. 풍부화 라이브러리의 추가적인 분석을 또한 0.1 ㎍/㎖(2.12 nM)에서 수행하였으며, 예를 들어 도 14를 참조한다. 일부 스크리닝에서, "탈선택" 단계는 스크리닝의 제1 또는 제2 라운드에 포함되며, 세포의 풍부화 집단을 소팅하여 중성 pH(pH 7.4)에서 FcRn과 결합한 것을 제거하였다. 개개의 클론을 확인하기 위하여, 바이러스 DNA를 풍부화 세포 집단으로부터 추출하였고, DIII HSA 변이체를 293F 세포의 일시적 트랜스펙션을 위한 포유류 발현 벡터로 클로닝하였다. 상기 설명한 바와 같이 pH 5.5 및 pH 7.4에서 유세포분석기에 의해 pH 의존적 결합을 위해 개개의 클론을 스크리닝한다.
HSA - DIII 돌연변이체의 발생 및 발현 : 특이적 돌연변이 유발 프라이머를 사용하여 포유류 발현 벡터 내 표준 프로토콜(QuikChange(등록상표) II XL Site-Directed Mutagenesis Kit, Agilent Catalog #200521)을 사용하여 몇몇 DIII 돌연변이체를 발생시키도록 야생형 HSA를 돌연변이시켰다. 제조업자의 프로토콜에 따라서 293fectin(상표명) 트랜스펙션 시약(Invitrogen, Catalog #Skul2347-019)으로 일시적 트랜스펙션에 의해 293F 세포 내에서 돌연변이체를 발현시켰고, 표준 과정을 사용하여 돌연변이체를 ANTI-FLAG M2 친화도 겔(Sigma-Aldrich Catalog #A2220) 상에서 정제하였다. 이렇게 정제한 모든 돌연변이체를 모든 SDS PAGE에 의해 분석하였고, 크기 배제 크로마토그래피로 순도 및 응집을 평가하였다. 모든 돌연변이체는 상당한 응집 없이 ~99% 순도가 되는 것으로 판단하였다(95% 초과 모노머)(데이터 미제시).
ProteOn 분석 : HSA 변이체에 대한 인간 FcRn의 친화도(KD)를 ProteOn XPR36 단백질 상호작용 어레이 시스템(BioRad) 상에서 측정하였다. 간략하게, 제조업자에 의해 약술된 바와 같은 ProteOn 아민 커플링 키트를 사용하여 HSA 변이체를 높은 밀도에서 ProteOn GLM 센서칩 상의 별개의 유동 표면으로 고정하였다. 최종 표면 HSA 밀도는 3740-3950 RU이었다. 동일한 고정 프로토콜을 사용하여 기준 유동 표면을 또한 임의의 단백질 없이 칩 상에서 제조하였다. pH5.5에서 50mM P04, 150mM NaCl 완충제 중의 5.86 nM 내지 10000 nM 범위에 있는 인간 FcRn의 2배 단계 희석을 25 L/분의 유속에서 커플링된 단백질과 기준 세포 표면 둘 다에 대해 주입하였다. 결과 데이터를 8분 동안 수집한 후, 여러 번 0.05% Tween 20을 함유하는 pH 7.4 인산염 완충 식염수의 60초 주입으로 재생시켰다. 각 주입에 대해 평형상태(Req)에서 결합 반응을 농도에 대해 플롯팅하였고, 평형 결합 상수 KD를 유도하기 위하여 ProteOn Manager 소프트웨어를 사용하여 정상상태 친화도 모델로 적합화하였다.
이 분석을 기반으로, 확인한 조합 돌연변이의 추가적인 분석을 수행하여 각 개개의 돌연변이 활성을 평가한다. 추가적으로, 돌연변이의 상이한 조합(예를 들어, 스트린에서 직접 확인되지 않은 하나 이상의 위치에서 돌연변이를 가지는 구성체)이 FcRn에 대해 개선된 친화도를 제공하는지 여부를 확인하기 위한 추가 스크리닝을 수행한다.
8.11 실시예 11: 도메인 III 상에서 선택된 잔기의 조합 돌연변이유발
실시예 10(상기)에서 확인한 가장 빈번한 돌연변이의 조합을 시험하기 위하여 합성 도메인 III 라이브러리를 만들었고, 잔기: 407; 415; 463; 495; 508; 509; 511; 512; 515; 516; 517; 521; 523; 524; 526; 527; 및 557은 표 7에서 표시된 잔기로 돌연변이되어 돌연변이체의 라이브러리를 만들며, 각 개개의 돌연변이체는 2 내지 4개의 돌연변이를 가진다. 대안으로, 각각의 열거된 잔기가 모두 20개의 아미노산(즉, 야생형 아미노산 및 모두 19개의 비-야생형 아미노산)으로 돌연변이되어 더 광범위한 조합의 설정을 시험하도록 라이브러리를 발생시킬 수 있다.
도메인 III 조합 돌연변이는 다음 중 하나 이상의 맥락에서 도입되고 스크리닝된다: 도메인 III 단독, 전체 HSA 단백질, 절단된 HSA 또는 적어도 도메인 III을 포함하는 키메라 단백질. 표준 돌연변이유발 방법을 이용하여 도메인 III 돌연변이체의 라이브러리를 발생시킬 수 있다. 선택적 또는 대안으로 독일에 소재한 Geneart AG와 같은 상업적 시설에 의해 도메인 III 돌연변이체의 라이브러리를 만든다.
조합 돌연변이체의 라이브러리를 상기 설명한 pYD1 효모 디스플레이 벡터 또는 포유류 디스플레이 벡터 pEN-HSA-GPI 디스플레이 벡터에 클로닝하고, 적용에서 설명한 표준 시험관내 분석(예를 들어, 유세포분석)을 사용하여 FcRn 결합 능력에 대해 스크리닝한다. 실시예 10에서 설명한 것과 같은 양성 및/또는 음성 선택 방법을 사용할 수 있다. FcRn에 대해 개선된 친화도를 나타내는 조합 변이체(들)를 확인한다. 각 조합 변이체를 또한 스크리닝하여 FcRn에 대해 개선된 친화도가 산성 pH에서만 생기기고, 중성 pH에서 생기지 않는지 여부를 결정할 수 있다. 중성 pH는 아닌, 산성 pH에서 FcRn에 대해 개선된 친화도를 (i) 변이체 도메인 III 구성체 단독; (ii) 전장 HSA의 맥락에서 존재하는 변이체 도메인 III 구성체; 또는 (iii) 키메라 폴리펩타이드의 맥락에서 시험한다. 앞서 언급한 것을 야생형 도메인 III, 야생형 전장 HSA, 또는 돌연변이가 없는 키메라 폴리펩타이드와 비교할 수 있다. 대안으로, 또는 선택적으로, 조합 돌연변이를 도메인 III, 전장 HSA, 또는 각 돌연변이를 하나씩 포함하는 키메라 폴리펩타이드와 비교하여, 조합이 FcRn 및/또는 혈청 반감기에 대한 친화도를 추가로 향상시키는지 여부를 결정할 수 있다. 실험 설계는 FcRn에 대해 친화도를 개선시키고 및/또는 혈청 반감기를 개선시키는 조합 돌연변이를 확인하게 한다.
Figure pct00016
8.12 실시예 12: 개선된 FcRn 친화도를 위해 스크리닝되는 단일 아미노산 돌연변이체를 만들기 위한 도메인 III 상에서 잔기의 돌연변이유발
18개의 단일 아미노산을 도메인 III의 보존적 아미노산으로부터 선택하고 하나씩 알라닌으로 돌연변이하여서, 각 변이체는 적용에서 설명한 표준 방법을 사용하여 단지 하나의 위치에서 단일 돌연변이를 가진다. 18개의 변이체를 전체 HSA 단백질, 또 다르게는 적어도 도메인 III을 포함하는 절단된 HSA 또는 키메라 단백질의 맥락에서 도입하고 스크리닝한다. 18개의 변이체를 적용에서 설명한 표준 시험관내 분석을 사용하여 FcRn 결합 능력에 대해 스크리닝한다. FcRn에 대해 개선된 친화도를 나타내는 변이체(들)를 확인한다. 또한 FcRn에 대해 개선된 친화도가 중성 pH는 아닌 산성 pH에서만 생기는지 여부를 결정하기 위하여 각 변이체를 스크리닝한다. 중성 pH는 아닌 산성 pH에서 FcRn에 대해 개선된 친화도를 (i) 변이체 도메인 III 구성체 단독; (ii) 전장 HSA의 맥락에서 존재하는 변이체 도메인 III 구성체; 또는 (iii) 키메라 폴리펩타이드의 맥락에서 시험한다. 앞서 언급한 것을 야생형 도메인 III, 야생형 전장 HSA, 또는 돌연변이가 없는 키메라 폴리펩타이드와 비교한다.
이 분석을 기반으로, 돌연변이의 조합(예를 들어, 하나 이상의 위치에서 돌연변이를 가지는 구성체)이 FcRn에 대해 개선된 친화도를 제공하는지 여부를 확인하기 위한 추가적인 스크리닝을 수행한다.
9 서열
서열 번호 1 - 인간 HSA DIII 단백질 서열
Figure pct00017
서열 번호 2 - 인간 전장 HSA 단백질 서열
Figure pct00018
도 6은 다양한 종으로부터 혈청 알부민 단백질의 도메인 III의 얼라인먼트를 제공한다.
래트 혈청 알부민의 도메인 III에 대한 야생형 아미노산 서열을 서열 번호 3으로 도 6에서 제시한다. 마우스 혈청 알부민의 도메인 III에 대한 야생형 아미노산 서열은 서열 번호 4로 도 6에서 제시한다. 소 혈청 알부민의 도메인 III에 대한 야생형 아미노산 서열은 서열 번호 5로 도 6에서 제시한다. 인간 혈청 알부민의 도메인 III에 대한 야생형 아미노산 서열은 서열 번호 2로 도 6에서 제시한다. 개 혈청 알부민의 도메인 III에 대한 야생형 아미노산 서열은 서열 번호 6으로 도 6에서 제시한다. 토끼 혈청 알부민의 도메인 III에 대한 야생형 아미노산 서열은 서열 번호 7로 도 6에서 제시한다. 돼지 혈청 알부민의 도메인 III에 대한 야생형 아미노산 서열은 서열 번호 8로 도 6에서 제시한다. 닭 혈청 알부민의 도메인 III에 대한 야생형 아미노산 서열은 서열 번호 9로 도 6에서 제시한다. 당나귀 혈청 알부민의 도메인 III에 대한 야생형 아미노산 서열은 서열 번호 10으로 도 6에서 제시한다. 모래쥐 혈청 알부민의 도메인 III에 대한 야생형 아미노산 서열은 서열 번호 11로 도 6에서 제시한다. 양 혈청 알부민의 도메인 III에 대한 야생형 아미노산 서열은 서열 번호 12로 도 6에서 제시한다. 고양이 혈청 알부민의 도메인 III에 대한 야생형 아미노산 서열은 서열 번호 13으로 도 6에서 제시한다. 말 혈청 알부민의 도메인 III에 대한 야생형 아미노산 서열은 서열 번호 14로 도 6에서 제시한다.
본 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 특허는 각 개개의 간행물 또는 특허가 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되는 것과 같이 그것의 전문이 참조로 포함된다. 추가로, 2010년 2월 16일 출원된 미국 가특허 출원 제61/304,954호; 및 2010년 7월 15일 출원된 제61/364,503호는 모든 목적을 위하여 그것의 전문이 참조로 포함된다.
대상 발명의 특정 구체예가 논의되었지만, 상기 명세서는 예시적이며 제한적이지 않다. 본 발명의 다수의 변형은 본 명세서 및 이하의 특허청구범위의 검토 시 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명의 전체 범주는 그것의 동등물의 전체 범주와 함께 특허청구범위, 및 이러한 변형와 함께 본 명세서를 기준으로 결정되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> MedImmune LLC <120> HSA-Related Compositions and Methods of Use <130> MED0554.PCT <150> US61/304,954 <151> 2010-02-16 <150> US61/364,503 <151> 2010-07-15 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 205 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu 1 5 10 15 Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr 20 25 30 Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg 35 40 45 Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys 50 55 60 Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu 65 70 75 80 Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys 85 90 95 Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu 100 105 110 Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr 115 120 125 Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys 130 135 140 Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala 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365 Ala Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Glu Lys Arg Pro Arg Ser Pro 370 375 380 Ser Ser Gln Ser Ser Ser Ser Gly Ser Pro Pro Arg Arg Pro Pro Pro 385 390 395 400 Gly Arg Arg Pro Phe Phe His Pro Val Gly Glu Ala Asp Tyr Phe Glu 405 410 415 Tyr His Gln Glu Gly Gly Pro Asp Gly Glu Pro Asp Val Pro Pro Gly 420 425 430 Ala Ile Glu Gln Gly Pro Ala Asp Asp Pro Gly Glu Gly Pro Ser Thr 435 440 445 Gly Pro Arg Gly Gln Gly Asp Gly Gly Arg Arg Lys Lys Gly Gly Trp 450 455 460 Phe Gly Lys His Arg Gly Gln Gly Gly Ser Asn Pro Lys Phe Glu Asn 465 470 475 480 Ile Ala Glu Gly Leu Arg Ala Leu Leu Ala Arg Ser His Val Glu Arg 485 490 495 Thr Thr Asp Glu Gly Thr Trp Val Ala Gly Val Phe Val Tyr Gly Gly 500 505 510 Ser Lys Thr Ser Leu Tyr Asn Leu Arg Arg Gly Thr Ala Leu Ala Ile 515 520 525 Pro Gln Cys Arg Leu Thr Pro Leu Ser Arg Leu Pro Phe Gly Met Ala 530 535 540 Pro Gly Pro Gly Pro Gln Pro Gly Pro Leu Arg Glu Ser Ile Val Cys 545 550 555 560 Tyr Phe Met Val Phe Leu Gln Thr His Ile Phe Ala Glu Val Leu Lys 565 570 575 Asp Ala Ile Lys Asp Leu Val Met Thr Lys Pro Ala Pro Thr Cys Asn 580 585 590 Ile Arg Val Thr Val Cys Ser Phe Asp Asp Gly Val Asp Leu Pro Pro 595 600 605 Trp Phe Pro Pro Met Val Glu Gly Ala Ala Ala Glu Gly Asp Asp Gly 610 615 620 Asp Asp Gly Asp Glu Gly Gly Asp Gly Asp Glu Gly Glu Glu Gly Gln 625 630 635 640 Glu <210> 16 <211> 1926 <212> DNA <213> Human herpesvirus 4 <400> 16 atgtctgacg aggggccagg tacaggacct ggaaatggcc taggagagaa gggagacaca 60 tctggaccag aaggctccgg cggcagtgga cctcaaagaa gagggggtga taaccatgga 120 cgaggacggg gaagaggacg aggacgagga ggcggaagac caggagcccc gggcggctca 180 ggatcagggc caagacatag agatggtgtc cggagacccc aaaaacgtcc aagttgcatt 240 ggctgcaaag ggacccacgg tggaacagga gcaggagcag gagcgggagg ggcaggagca 300 ggaggggcag gagcaggagg aggggcagga gcaggaggag gggcaggagg ggcaggaggg 360 gcaggagggg caggagcagg aggaggggca ggagcaggag gaggggcagg aggggcagga 420 ggggcaggag caggaggagg ggcaggagca ggaggagggg caggaggggc aggagcagga 480 ggaggggcag gaggggcagg aggggcagga gcaggaggag gggcaggagc aggaggaggg 540 gcaggagggg caggagcagg aggaggggca ggaggggcag gaggggcagg agcaggagga 600 ggggcaggag caggaggggc aggaggggca ggaggggcag gagcaggagg ggcaggagca 660 ggaggagggg caggaggggc aggaggggca ggagcaggag gggcaggagc aggaggggca 720 ggagcaggag gggcaggagc aggaggggca ggaggggcag gagcaggagg ggcaggaggg 780 gcaggagcag gaggggcagg aggggcagga gcaggaggag gggcaggagg ggcaggagca 840 ggaggagggg caggaggggc aggagcagga ggggcaggag gggcaggagc aggaggggca 900 ggaggggcag gagcaggagg ggcaggaggg gcaggagcag gaggaggggc aggagcagga 960 ggggcaggag caggaggtgg aggccggggt cgaggaggca gtggaggccg gggtcgagga 1020 ggtagtggag gccggggtcg aggaggtagt ggaggccgcc ggggtagagg acgtgaaaga 1080 gccagggggg gaagtcgtga aagagccagg gggagaggtc gtggacgtgg agaaaagagg 1140 cccaggagtc ccagtagtca gtcatcatca tccgggtctc caccgcgcag gccccctcca 1200 ggtagaaggc catttttcca ccctgtaggg gaagccgatt attttgaata ccaccaagaa 1260 ggtggcccag atggtgagcc tgacgtgccc ccgggagcga tagagcaggg ccccgcagat 1320 gacccaggag aaggcccaag cactggaccc cggggtcagg gtgatggagg caggcgcaaa 1380 aaaggagggt ggtttggaaa gcatcgtggt caaggaggtt ccaacccgaa atttgagaac 1440 attgcagaag gtttaagagc tctcctggct aggagtcacg tagaaaggac taccgacgaa 1500 ggaacttggg tcgccggtgt gttcgtatat ggaggtagta agacctccct ttacaaccta 1560 aggcgaggaa ctgcccttgc tattccacaa tgtcgtctta caccattgag tcgtctcccc 1620 tttggaatgg cccctggacc cggcccacaa cctggcccgc taagggagtc cattgtctgt 1680 tatttcatgg tctttttaca aactcatata tttgctgagg ttttgaagga tgcgattaag 1740 gaccttgtta tgacaaagcc cgctcctacc tgcaatatca gggtgactgt gtgcagcttt 1800 gacgatggag tagatttgcc tccctggttt ccacctatgg tggaaggggc tgccgcggag 1860 ggtgatgacg gagatgacgg agatgaagga ggtgatggag atgagggtga ggaagggcag 1920 gagtga 1926 <210> 17 <211> 1976 <212> DNA <213> Human herpesvirus 4 <400> 17 cctttatgtg taactcttgg ctgaagctct tacaccaatg ctgggggaca tgtacctccc 60 aggggcccag gaagactacg ggaggctaca ccaacgtcaa tcagaggggc ctgtgtagct 120 accgataagc ggaccctcaa gagggcatta gcaatagtgt ttataaggcc cccttgttaa 180 ccctaaacgg gtagcatatg cttcccgggt agtagtatat actatccaga ctaaccctaa 240 ttcaatagca tatgttaccc aacgggaagc atatgctatc gaattagggt tagtaaaagg 300 gtcctaagga acagcgatat ctcccacccc atgagctgtc acggttttat ttacatgggg 360 tcaggattcc acgagggtag tgaaccattt tagtcacaag ggcagtggct gaagatcaag 420 gagcgggcag tgaactctcc tgaatcttcg cctgcttctt cattctcctt cgtttagcta 480 atagaataac tgctgagttg tgaacagtaa ggtgtatgtg aggtgctcga aaacaaggtt 540 tcaggtgacg cccccagaat aaaatttgga cggggggttc agtggtggca ttgtgctatg 600 acaccaatat aaccctcaca aaccccttgg gcaataaata ctagtgtagg aatgaaacat 660 tctgaatatc tttaacaata gaaatccatg gggtggggac aagccgtaaa gactggatgt 720 ccatctcaca cgaatttatg gctatgggca acacataatc ctagtgcaat atgatactgg 780 ggttattaag atgtgtccca ggcagggacc aagacaggtg aaccatgttg ttacactcta 840 tttgtaacaa ggggaaagag agtggacgcc gacagcagcg gactccactg gttgtctcta 900 acacccccga aaattaaacg gggctccacg ccaatggggc ccataaacaa agacaagtgg 960 ccactctttt ttttgaaatt gtggagtggg ggcacgcgtc agcccccaca cgccgccctg 1020 cggttttgga ctgtaaaata agggtgtaat aacttggctg attgtaaccc cgctaaccac 1080 tgcggtcaaa ccacttgccc acaaaaccac taatggcacc ccggggaata cctgcataag 1140 taggtgggcg ggccaagata ggggcgcgat tgctgcgatc tggaggacaa attacacaca 1200 cttgcgcctg agcgccaagc acagggttgt tggtcctcat attcacgagg tcgctgagag 1260 cacggtgggc taatgttgcc atgggtagca tatactaccc aaatatctgg atagcatatg 1320 ctatcctaat ctatatctgg gtagcatagg ctatcctaat ctatatctgg gtagcatatg 1380 ctatcctaat ctatatctgg gtagtatatg ctatcctaat ttatatctgg gtagcatagg 1440 ctatcctaat ctatatctgg gtagcatatg ctatcctaat ctatatctgg gtagtatatg 1500 ctatcctaat ctgtatccgg gtagcatatg ctatcctaat agagattagg gtagtatatg 1560 ctatcctaat ttatatctgg gtagcatata ctacccaaat atctggatag catatgctat 1620 cctaatctat atctgggtag catatgctat cctaatctat atctgggtag cataggctat 1680 cctaatctat atctgggtag catatgctat cctaatctat atctgggtag tatatgctat 1740 cctaatttat atctgggtag cataggctat cctaatctat atctgggtag catatgctat 1800 cctaatctat atctgggtag tatatgctat cctaatctgt atccgggtag catatgctat 1860 cctcatgcat atacagtcag catatgatac ccagtagtag agtgggagtg ctatcctttg 1920 catatgccgc cacctcccaa gggggcgtga attttcgctg cttgtccttt tcctgc 1976

Claims (21)

  1. 인간 혈청 알부민(human serum albumin: HSA) 부분을 포함하는 폴리펩타이드로서, HSA 부분은 HSA 도메인 III, 또는 이것의 신생아 Fc 수용체(FcRn) 결합 단편을 포함하되, 상기 HSA 도메인 III은 대조군 폴리펩타이드에 비해 FcRn에 대한 친화도 및 폴리펩타이드의 혈청 반감기 중 하나 또는 둘 다가 증가하도록 1 내지 18개의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 HSA 부분은 상기 아미노산 치환을 포함하지 않는 것인, 인간 혈청 알부민(HSA) 부분을 포함하는 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 상기 대조군 폴리펩타이드보다 높은 친화도로 FcRn에 결합하는 것인, 인간 혈청 알부민(HSA) 부분을 포함하는 폴리펩타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 상기 대조군 폴리펩타이드보다 높은 친화도로 FcRn에 결합하며, 상기 친화도는 산성 pH에서 측정된 것인, 인간 혈청 알부민(HSA) 부분을 포함하는 폴리펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는 표 5에서 열거된 것으로부터 선택된 것인, 인간 혈청 알부민(HSA) 부분을 포함하는 폴리펩타이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 중 적어도 하나는 전장 성숙 HSA(서열 번호 2) 내 위치에 대해 넘버링된 다음의 위치들 중 어느 하나에 있는 것인, 인간 혈청 알부민(HSA) 부분을 포함하는 폴리펩타이드: 잔기 381, 잔기 383, 잔기 391, 잔기 401, 잔기 402, 잔기 407, 잔기 411, 잔기 413, 잔기 414, 잔기 415, 잔기 416, 잔기 424, 잔기 426, 잔기 434, 잔기 442, 잔기 445, 잔기 447, 잔기 450, 잔기 454, 잔기 455, 잔기 456, 잔기 457, 잔기 459, 잔기 463, 잔기 495, 잔기 506, 잔기 508, 잔기 509, 잔기 511, 잔기 512, 잔기 515, 잔기 516, 잔기 517, 잔기 519, 잔기 521, 잔기 523, 잔기 524, 잔기 525, 잔기 526, 잔기 527, 잔기 531, 잔기 535, 잔기 538, 잔기 539, 잔기 541, 잔기 557, 잔기 561, 잔기 566, 잔기 569.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 (a) 잔기 383 및 413; (b) 잔기 401 및 523; (c) 잔기 407 및 447; (d) 잔기 407 및 447 및 539; (e) 잔기 407 및 509; (f) 잔기 407 및 526; (g) 잔기 411 및 535; (h) 잔기 414 및 456; (i) 잔기 415 및 569; (j) 잔기 426 및 526; (k) 잔기 442 및 450 및 459; (l) 잔기 463 및 508; (m) 잔기 508 및 519 및 525; (n) 잔기 509 및 527; (o) 잔기 523 및 538; (p) 잔기 526 및 557; 및 (q) 잔기 541 및 561로 이루어진 군으로부터 선택된 전장 성숙 HSA 내 위치에 대해 넘버링된 위치에서 HSA 도메인 III 내 아미노산 치환을 포함하는 것인, 인간 혈청 알부민(HSA) 부분을 포함하는 폴리펩타이드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는
    Figure pct00019
    로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 인간 혈청 알부민(HSA) 부분을 포함하는 폴리펩타이드.
  8. 제7항에 있어서, HSA 도메인 III 내 상기 아미노산 치환 중 적어도 하나는
    Figure pct00020
    로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 인간 혈청 알부민(HSA) 부분을 포함하는 폴리펩타이드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는
    (a) L407N/P447S;
    (b) L407N/P447S/A539I;
    (c) L407N/F509M;
    (d) Y411Q/H535N;
    (e) K414S/V456N;
    (f) V426H/Q526Y;
    (g) L463N/T508R;
    (h) F509I/T527Y;
    (i) I523Q/K538Y;
    (j) Q526M/K557G; 및
    (k) K541F/A561F로 이루어진 군으로부터 선택된 HSA 도메인 III 내 아미노산 치환을 포함하는 것인, 인간 혈청 알부민(HSA) 부분을 포함하는 폴리펩타이드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 단백질을 포함하되, 상기 폴리펩타이드는 상기 이종성 단백질의 기능적 활성을 보유하고 FcRn과 결합할 수 있는 것인, 인간 혈청 알부민(HSA) 부분을 포함하는 폴리펩타이드.
  11. 제10항에 있어서, 상기 이종성 단백질은 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 것인, 인간 혈청 알부민(HSA) 부분을 포함하는 폴리펩타이드.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 이종성 단백질은 치료적 단백질을 포함하는 것인, 인간 혈청 알부민(HSA) 부분을 포함하는 폴리펩타이드.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종성 단백질은 HSA 부분에 화학적으로 또는 재조합적으로 컨쥬게이트된 것인, 인간 혈청 알부민(HSA) 부분을 포함하는 폴리펩타이드.
  14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 비단백질제(non-protein agent)에 컨쥬게이트되며, 상기 폴리펩타이드가 상기 이종성 비단백질제의 기능적 활성을 보유하고, FcRn에 결합할 수 있는 것인, 인간 혈청 알부민(HSA) 부분을 포함하는 폴리펩타이드.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종성 단백질 또는 비단백질제는 상기 HSA 부분의 상기 N-말단 아미노산에, 상기 HSA 부분의 C-말단 아미노산에, 또는 상기 HSA 부분의 내부 아미노산에 컨쥬게이트된 것인, 인간 혈청 알부민(HSA) 부분을 포함하는 폴리펩타이드.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HSA 부분은 적어도 일부의 HSA 도메인 I; 또는 적어도 일부의 HSA 도메인 II; 또는 적어도 일부의 HSA 도메인 I 및 적어도 일부의 HSA 도메인 II를 더 포함하는 것인, 인간 혈청 알부민(HSA) 부분을 포함하는 폴리펩타이드.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 상기 폴리펩타이드, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  18. 치료를 필요로 하는 피험자를 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩타이드 또는 제17항의 조성물을 상기 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 치료방법.
  19. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 기재된 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 구성체.
  20. 제1항 내지 제9항 및 제16항 중 어느 한 항에 기재된 상기 폴리펩타이드에 상기 단백질을 컨쥬게이트하는 단계를 포함하는, FcRn에 대한 친화도 및 단백질의 혈청 반감기 중 하나 또는 둘 다를 증가시키는 방법.
  21. 제1항 내지 제9항 및 제16항 중 어느 한 항에 기재된 상기 폴리펩타이드에 상기 비단백질제를 컨쥬게이트하는 단계를 포함하는, FcRn에 대한 친화도 및 비단백질제의 혈청 반감기 중 하나 또는 둘 다를 증가시키는 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160072257A (ko) * 2013-11-01 2016-06-22 유니버시티 오브 오슬로 알부민 변이체 및 이의 용도

Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102317315A (zh) 2009-02-11 2012-01-11 诺维信生物制药丹麦公司 白蛋白变体和缀合物
JP2013509170A (ja) * 2009-10-30 2013-03-14 ノボザイムス バイオファーマ デーコー アクティーゼルスカブ アルブミン変異体
US8697650B2 (en) 2010-02-16 2014-04-15 Medimmune, Llc HSA-related compositions and methods of use
WO2011124718A1 (en) 2010-04-09 2011-10-13 Novozymes A/S Albumin derivatives and variants
US9045564B2 (en) * 2011-02-15 2015-06-02 Medimmune, Llc HSA-related compositions and methods of use
CN103379915A (zh) * 2011-02-15 2013-10-30 米迪缪尼有限公司 Hsa相关组合物及使用方法
RU2650784C2 (ru) 2011-05-05 2018-04-17 Альбумедикс А/С Варианты альбумина
CA2851667A1 (en) 2011-10-11 2013-04-18 Medimmune, Llc Cd40l-specific tn3-derived scaffolds and methods of use thereof
EP2780364A2 (en) 2011-11-18 2014-09-24 Eleven Biotherapeutics, Inc. Proteins with improved half-life and other properties
KR20140136934A (ko) 2012-03-16 2014-12-01 노보자임스 바이오파마 디케이 에이/에스 알부민 변이체
BR112015010318A2 (pt) 2012-11-08 2017-08-22 Albumedix As Variantes de albumina
EP2956002B1 (en) 2013-02-16 2017-09-06 Albumedix A/S Pharmacokinetic animal model
WO2014179657A1 (en) 2013-05-03 2014-11-06 Eleven Biotherapeutics, Inc. Albumin variants binding to fcrn
RU2671708C2 (ru) 2013-06-12 2018-11-06 Фарис Биотек Гмбх Пептиды с антагонистической активностью в отношении природного cxcr4
CA2958479A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Genentech, Inc. Anti-cll-1 antibodies and immunoconjugates
EP3191521A2 (en) 2014-09-12 2017-07-19 F. Hoffmann-La Roche AG Cysteine engineered antibodies and conjugates
SI3191135T1 (sl) 2014-09-12 2021-01-29 Genentech, Inc. Anti-HER2 protitelesa in imunokonjugati
BR112017004953A2 (pt) 2014-09-17 2017-12-05 Genentech Inc imunoconjugado, formulação farmacêutica, método de tratamento e método de inibição da proliferação de uma célula
EP3268389B1 (en) 2015-03-12 2020-09-30 Medimmune, LLC Method of purifying albumin-fusion proteins
CA2989966C (en) 2015-08-20 2024-04-30 Albumedix A/S Albumin variants and conjugates
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
US10407510B2 (en) 2015-10-30 2019-09-10 Genentech, Inc. Anti-factor D antibodies and conjugates
CN108431204A (zh) 2015-12-22 2018-08-21 阿尔布梅迪克斯医疗有限公司 改良的表达蛋白质的菌株
EP3394265A1 (en) 2015-12-23 2018-10-31 Biogen MA Inc. Dkk2 cysteine rich domain 2 containing proteins and uses thereof
PL3458101T3 (pl) 2016-05-20 2021-05-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Koniugaty PROTAC-przeciwciało i sposoby ich stosowania
CN109313200B (zh) 2016-05-27 2022-10-04 豪夫迈·罗氏有限公司 用于表征位点特异性抗体-药物缀合物的生物分析性方法
CN110139674B (zh) 2016-10-05 2023-05-16 豪夫迈·罗氏有限公司 制备抗体药物缀合物的方法
EP3535585A1 (en) 2016-11-04 2019-09-11 Aarhus Universitet Identification and treatment of tumors characterized by an overexpression of the neonatal fc receptor
US11130979B2 (en) 2017-06-20 2021-09-28 Albumedix Ltd Protein expression strains
PE20200013A1 (es) 2017-06-20 2020-01-06 Amgen Inc Metodo para tratar o mejorar trastornos metabolicos con proteinas de union para el receptor peptidico inhibidor gastrico (gipr) en combinacion con agonistas de glp-1
EP3697812A4 (en) * 2017-10-18 2021-09-22 CSL Limited HUMAN SERIAL ALBUMIN VARIANTS AND THEIR USES
CA3081770A1 (en) 2017-11-29 2019-06-06 Csl Limited Method of treating or preventing ischemia-reperfusion injury
JP7402806B2 (ja) * 2018-02-23 2023-12-21 バイオトロニック アクチェンゲゼルシャフト ４０－ｏ－環状炭化水素エステル及び関連構造のための非経口製剤材料及び方法
WO2019218009A1 (en) 2018-05-16 2019-11-21 Csl Limited Soluble complement receptor type 1 variants and uses thereof
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
US20210356377A1 (en) * 2018-09-07 2021-11-18 Medimmune, Llc Methods Of Cell Selection
EA202191179A1 (ru) 2018-10-29 2021-09-09 Байоджен Ма Инк. Гуманизированные и стабилизированные варианты fc5 для улучшения транспорта через гематоэнцефалический барьер
WO2020123275A1 (en) 2018-12-10 2020-06-18 Genentech, Inc. Photocrosslinking peptides for site specific conjugation to fc-containing proteins
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
JP2022547111A (ja) 2019-09-06 2022-11-10 ノバルティス アーゲー 治療用融合タンパク質
EP4069200A1 (en) 2019-12-04 2022-10-12 Albumedix Ltd Methods and compositions produced thereby
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
WO2022197877A1 (en) 2021-03-19 2022-09-22 Genentech, Inc. Methods and compositions for time delayed bio-orthogonal release of cytotoxic agents
CN113912730B (zh) * 2021-12-14 2022-03-04 北京科诺信诚科技有限公司 缓释的抗FcRn抗体或抗原结合片段及其应用
WO2024089258A1 (en) 2022-10-28 2024-05-02 Aarhus Universitet Albumin conjugated to cpg oligodeoxynucleotides as super-boosters of immune response

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5198346A (en) 1989-01-06 1993-03-30 Protein Engineering Corp. Generation and selection of novel DNA-binding proteins and polypeptides
US5096815A (en) 1989-01-06 1992-03-17 Protein Engineering Corporation Generation and selection of novel dna-binding proteins and polypeptides
GB9404270D0 (en) * 1994-03-05 1994-04-20 Delta Biotechnology Ltd Yeast strains and modified albumins
US5541087A (en) 1994-09-14 1996-07-30 Fuji Immunopharmaceuticals Corporation Expression and export technology of proteins as immunofusins
WO2002079415A2 (en) 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
EP1463752A4 (en) * 2001-12-21 2005-07-13 Human Genome Sciences Inc ALBUMIN FUSION PROTEINS
US20080194481A1 (en) 2001-12-21 2008-08-14 Human Genome Sciences, Inc. Albumin Fusion Proteins
US20060051859A1 (en) * 2004-09-09 2006-03-09 Yan Fu Long acting human interferon analogs
CA2625619A1 (en) 2005-10-14 2007-04-26 Medimmune, Inc. Cell display of antibody libraries
CA2721093A1 (en) 2008-04-11 2009-10-15 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Human serum albumin linkers and conjugates thereof
JP5677972B2 (ja) * 2008-11-18 2015-02-25 メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド ヒト血清アルブミンリンカーおよびそのコンジュゲート
CN102317315A (zh) 2009-02-11 2012-01-11 诺维信生物制药丹麦公司 白蛋白变体和缀合物
JP5841046B2 (ja) * 2009-04-08 2016-01-06 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 制御された血清中薬物動態を有するヒトタンパク質スキャフォールド
EP2456454A4 (en) 2009-07-20 2013-03-20 Univ Nat Cheng Kung FOR AV-3-INTEGRIN SELECTIVE POLYPEPTIDE AND PHARMACEUTICAL USES THEREOF ASSOCIATED WITH A HUMAN SERUM ALUMINUM (HSA) VARIATION
JP2013509170A (ja) 2009-10-30 2013-03-14 ノボザイムス バイオファーマ デーコー アクティーゼルスカブ アルブミン変異体
GB2476671B (en) 2010-01-04 2014-11-26 Plastic Logic Ltd Touch-sensing systems
US8697650B2 (en) 2010-02-16 2014-04-15 Medimmune, Llc HSA-related compositions and methods of use
WO2011124718A1 (en) 2010-04-09 2011-10-13 Novozymes A/S Albumin derivatives and variants
US8691771B2 (en) * 2010-05-21 2014-04-08 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Bi-specific fusion proteins for tissue repair
JP5240316B2 (ja) 2010-10-26 2013-07-17 株式会社デンソー 車両乗員非操作運転システム
US20130225496A1 (en) * 2010-11-01 2013-08-29 Novozymes Biopharma Dk A/S Albumin Variants
CN103379915A (zh) 2011-02-15 2013-10-30 米迪缪尼有限公司 Hsa相关组合物及使用方法
WO2012138733A2 (en) 2011-04-05 2012-10-11 Chevron Oronite Company Llc Low viscosity marine cylinder lubricating oil compositions
RU2650784C2 (ru) * 2011-05-05 2018-04-17 Альбумедикс А/С Варианты альбумина

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160072257A (ko) * 2013-11-01 2016-06-22 유니버시티 오브 오슬로 알부민 변이체 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
CA2789337A1 (en) 2011-08-25
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US8697650B2 (en) 2014-04-15
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