CN102317315A - 白蛋白变体和缀合物 - Google Patents

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Abstract

基于白蛋白的三维结构，发明人设计了具有一个或多个带有游离巯基的半胱氨酸残基的变体多肽(mutein)(下文中称作“硫代白蛋白”)。变体多肽可以通过半胱氨酸残基的硫原子与缀合配偶体如生物活性化合物缀合。

Description

白蛋白变体和缀合物
对序列表的涉及
本申请含有计算机可读形式的序列表。将所述计算机可读形式通过提述并入本文。
发明领域
本发明涉及能缀合的白蛋白(conjugation competent albumin)和白蛋白相关多肽，和它们与至少一种模块(moiety)的缀合物，并且涉及编码它们的多核苷酸。
发明背景
血清白蛋白为可以融合的生物活性分子提供有价值的支架，其或者通过遗传融合或者通过化学融合以改善融合分子的性质(Leger，R.等(2004).Bioorg Med Chem Lett 14(17)：4395-8；Thibaudeau，K.，等(2005).BioconjugChem 16(4)：1000-8；Balan，V.等(2006).Antivir Ther 11(1)：35-45；EP 0 413622；WO 90/13653；EP 1 681 304；WO 1997/024445；WO 01/79271)。白蛋白和白蛋白颗粒对于将药物和前药携带并递送至它们的作用位点也很重要(Kratz(2008)Journal of Controlled Release，132(3)，p.171-183)。鉴于改进的药代动力学性质，如半衰期的延长，融合和颗粒技术提供了改进的剂量给药方案，并可以改进生物利用度且保护所述融合的生物活性分子免于失活。
白蛋白的生物化学、遗传学和医学应用是得到充分表征的(“All aboutAlbumin”，T.Peters Jr.，Academic Press N.Y.，和http://www.albumin.org/)。人血清白蛋白(HSA，也称作HA)以～60g/L而是人血浆中最丰富的蛋白质。HSA的序列在SEQ ID No.1中提供。存在HSA的天然变体并且在Minchiotti等(2008).Hum Mutat 29(8)：1007-16中和http://www.uniprot.org/uniprot/P02768上给出了已知的多态性的列表。
重组人血清白蛋白的产生和纯化是完善的(WO 95/23857；WO 00/44772；WO 2006/066595；EP 0 305 216；Sleep等1990 Biotechnology(N Y).1990 Jan；8(1)：42-6))并且包括用于药物应用的重组人血清白蛋白(Bosse等(2005).JClin Pharmacol 45(1)：57-67)。HSA的三维结构已经通过X射线晶体学得到了阐明(Carter等(1989).Science 244(4909)：1195-8；Sugio等(1999).ProteinEng 12(6)：439-46)。HSA多肽链具有35个半胱氨酸残基，其形成17个二硫键和一个在成熟蛋白(Seq ID No.1)的34位的不成对(游离)的半胱氨酸。半胱氨酸-34已经用于将分子缀合至白蛋白(Leger等(2004)Bioorg Med Chem Lett14(17)：4395-8；Thibaudeau等(2005).Bioconjug Chem 16(4)：1000-8)，并提供了精确的、明确确定的缀合用位点。然而，在半胱氨酸34处的缀合仅提供了一个用于附接单一模块的位点，因此对缀合位点没有选择。另外，提供单一缀合位点意味着只有一个模块能够与每个白蛋白分子缀合。需要的是提供一个或多个可供选择的附接位点的白蛋白分子。
发明内容
基于对人血清白蛋白(HSA)三维结构的分析，白蛋白多肽及其天然多态性中的保守残基，发明人设计了白蛋白的变体多肽(mutein)，其具有一个或多个能缀合的半胱氨酸残基。术语“硫代白蛋白”在本文用于描述包含一个或多个不成对的半胱氨酸残基的白蛋白变体，特别是其中所述不成对的半胱氨酸残基中的一个或多个不存在于白蛋白天然存在的变体中的白蛋白变体。因此，硫代白蛋白是“能缀合的白蛋白”。硫代白蛋白可以称作“白蛋白的半胱氨酸变体”。
在本说明书全文中，术语“白蛋白”包括天然存在的白蛋白、白蛋白相关蛋白及其变体，如天然的和工程化的变体。变体包括多态性、片段如结构域和亚结构域、片段和/或融合蛋白。所述白蛋白可以与SEQ ID No.1具有至少40，50，60，70，80，90，95，96，97，98，99％相似性或同一性。因此，本发明的硫代白蛋白可以是任何这样的白蛋白的衍生物，或是基于任何这样的白蛋白。
不成对的半胱氨酸残基可以由插入、缺失、取代、添加或延伸白蛋白序列来提供。
本发明还涉及包含至少一个，例如2、3、4、5或6个，缀合配偶体(conjugation partner)如生物活性化合物和根据本发明的多肽的缀合物。
本发明还提供用于设计能缀合的白蛋白的方法。
附图简述
图1是显示用于在人血清白蛋白(SEQ ID No.1)中选择用于氨基酸取代、插入和缺失以供产生能缀合的半胱氨酸的位点的标准的表。
图2是人血清白蛋白(SEQ ID No.1＝Human-P02768.pro)与来自十五种其他哺乳动物物种的白蛋白的氨基酸序列的比对。“大多数”显示出共有序列。“+大多数”以条形图形式显示所有十六种序列之间的相对同源性，其中条形图的高度指明20、40、60、80和100％的相对同源性。所述蛋白质序列包括前导序列。
图3是人血清白蛋白(P02768.pro＝SEQ ID No.1)与来自三十二种其他物种(其中一些是哺乳动物)的白蛋白的氨基酸序列的比对。“大多数”显示出共有序列。“+大多数”以条形图形式显示所有三十三种序列之间的相对同源性，其中条形图的高度指明20、40、60、80和100％的相对同源性。所述蛋白质序列包括前导序列。P02768.pro：人；P02769.pro：牛；P49064.pro：猫；P49822.pro：犬；Q5XLE4.pro：驴；JC5838.pro：沙鼠；ACF10391，1.pro：山羊片段；AAQ20088.pro：豚鼠；P35747.pro：马；Q28522.pro：猕猴；P07724.pro：小鼠；P08835.pro：猪；P02770.pro：大鼠；P49065.pro：兔；Q28522.pro：恒河猴；P14639.pro：绵羊；NP_001127106.pro：猩猩；P19121.pro：鸡；P01012.pro：鸡卵清蛋白；O73860.pro：火鸡卵清蛋白；AAC63407.pro：七腮鳗(sea lamprey)；Q91274.pro：七腮鳗；P21847.pro：牛蛙；AAD09358.pro：Rana shqiperica(欧洲水蛙)；ABXL68.pro：爪蟾(Xenopus)；NP_001004887.pro：爪蟾；AAL56646.pro：斑蝾螈(Spotted Salamander)；Q03156.pro：大西洋鲑；P21848.pro：大西洋鲑；AAM46104.pro：楔齿蜥(Sphenodon punctatus)；P83517.pro：澳洲肺鱼(Australian lungfish)；S59517.pro：monocled眼镜蛇；AAL08579.pro：曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)。
图4是显示二十种氨基酸的类别和它们之间的关系的维恩图。
图5A、5B、5C和5D是显示人血清白蛋白(SEQ ID No.1)中用于氨基酸取代、插入和缺失以供产生一个或多个能缀合的半胱氨酸的优选位点组的表。
图6A和6B是显示人血清白蛋白(SEQ ID No.1)中用于破坏一个或多个二硫键以供生成一个或多个能缀合的半胱氨酸的优选位点组的表。
图7是质粒pDB2244的图谱。
图8是质粒pDB2243的图谱。
图9是质粒pDB2713的图谱。
图10是显示根据其在SEQ ID No.1的经折叠白蛋白上的相对位置分组的用于缀合的优选位点的表。
图11是显示对天然人血清白蛋白进行的突变(参见第二列)以产生在天然人血清白蛋白的Cys-34之外还具有单一游离巯基的分子的表。
图12是质粒pDB3927的图谱。
图13是质粒pDB3964的图谱。
图14是质粒pBD3936的图谱。
图15显示SDS-PAGE分析和HPLC数据(条形图)，其显示在SEQ ID No.1的Cys-34具有游离巯基并在条形图下所指示的位置具有额外游离巯基的白蛋白分子的表达(μg/ml及标准差)。
图16是显示对天然人血清白蛋白进行的突变(参见第二列)以产生在天然人血清白蛋白的Cys-34之外还具有一个或多个游离巯基和/或去除了Cys-34的分子的表。
图17显示SDS-PAGE分析和HPLC数据(条形图)，其显示在天然人血清白蛋白的Cys-34之外还具有一个或多个游离巯基和/或去除了Cys-34的白蛋白分子的表达(μg/ml及标准差)。
图18是显示发酵产率和与包含一个或多个游离巯基的白蛋白分子缀合相对水平的表。
图19是用DTNB处理之前rHA分子的质谱图，该rHA分子经设计而具有三个游离巯基(Cys-34、A2C和L585C)。
图20是在DTNB处理之后rHA分子的质谱图，该rHA分子经设计而具有三个游离巯基(Cys-34、A2C和L585C)。
图21是在用DTNB处理之前rHA分子的质谱图，该rHA分子经设计而具有四个游离巯基(Cys-34、D129C、C360S和L585C)。
图22是在用DTNB处理之后rHA分子的质谱图，该rHA分子经设计而具有四个游离巯基(Cys-34、D129C、C360S和L585C)。
图23是用DTNB处理之前rHA分子的质谱图，该rHA分子经设计而具有三个游离巯基(Cys-34、A2C和C末端游离巯基)。
图24是rHA分子的质谱图，该rHA分子经设计而具有三个游离巯基(Cys-34、A2C和C末端游离巯基)。
发明详述
本发明的第一方面提供用于设计和/或制备变体白蛋白的方法，所述变体白蛋白包含一个或多个能缀合的半胱氨酸残基。因此，可以将所多肽认为是能缀合的。这样的白蛋白可以称作“硫代白蛋白”或称作白蛋白的“半胱氨酸变体”。术语“能缀合的半胱氨酸”包括具有未与另一半胱氨酸形成二硫键并且优选未因不利的空间位阻而与另一分子(其可称作“缀合配偶体”)缀合受到阻断的巯基的半胱氨酸。也就是说，优选所述半胱氨酸在经折叠的多肽之内或之上的位置使得其可用于缀合。
许多选择标准可以单独使用或以任意组合使用以鉴定合适的位点以供引入能缀合的半胱氨酸残基。因此，本发明提供用于先验(a priori)鉴定白蛋白氨基酸序列中可以引入能缀合的半胱氨酸的位点的方法和/或规则。这些位点可以称作“候选残基”。变体白蛋白所基于的白蛋白序列可以是SEQ ID No.1或任何其他白蛋白。例如，所述变体白蛋白可以基于在其氨基酸序列的34位或等同位置具有或不具有半胱氨酸的白蛋白。半胱氨酸残基可以或可以不通过取代、插入、缺失、延伸和添加中的一种或多种来引入。位点可以或可以不参考白蛋白或其变体的三维结构来选择。可以使用或可以不使用以下标准来选择合适的位点：
(a)溶剂可及表面积(“表面可及性”(％SASA))。
优选表面可及性高。例如，优选表面可及性至少为60％，更优选地，从60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99％至65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％。％SASA可以使用本文描述的方法作为“原始得分”确定，或者可以相对于蛋白质中具有最大表面可及性的残基的得分来计算。例如，HSA 1AO6的白蛋白具有229.0的最大表面可及性，并且这是HSA中得分最高的残基。较高的表面可及性说明该残基在所述蛋白质表面并因此可用于结合。这样的可及性可以使用如本文所述的方法来计算。
(b)晶体B因子的存在或不存在。
B因子表明三维结构内氨基酸残基的相对柔性(relative flexibility)。优选B因子从至少30、40、50、60、70、80或90％至至少40、50、60、70、80、90或100％，其可以或可以不相对于分子内任何氨基酸残基的最大B因子得分。对于HSA(例如1AO6)，优选B因子得分高，例如从至少30、40、50、60、70、80、90、或100至至少40、50、60、70、80、90、100或106(例如使用本文所述的B因子计分系统)。或者B因子得分可以小于或等于100、90、80、70、60、50、40、30、20或10％，如本文所述。
在最后一纳秒的刺激过程中C-α碳原子的B因子(均方根扰动(root meansquare fluctuation))可以使用Gromacs tool”g_rmsf”，3.3版，基于D.van der Spoel，E.Lindahl，B.Hess，G.Groenhof，A.E.Mark和H.J.C.Berendsen：GROMACS：Fast，Flexible and Free，J.Comp.Chem.26pp.1701-1718(2005)来计算。
(c)二级结构(SS)的存在或不存在
所述候选残基可以或可以不位于二级结构内，所述二级结构例如H(螺旋)、B(分离的β桥(isolated beta bridge))或E(延伸的片层)。残基在二级结构之外的位置表明所述残基与位于二级结构之内的残基相比对于二级结构可能不太重要和/或更有可能可用于结合。
(d)与其他白蛋白的相对同源性
在给定的蛋白质序列内，与其他相似序列显示高同源性的氨基酸残基可能表明这样的残基或区域可能对于蛋白质的结构和/或功能是重要的。因此优选候选残基相对于其中残基位于已知白蛋白(例如哺乳动物白蛋白如图2中所示的那些或哺乳动物和非哺乳动物白蛋白的组合如图3中所示的那些)中的白蛋白的比对显示小于100％的同源性。小于100、98、96、95、94、92、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、5的同源性是优选。同源性可以使用本领域已知的算法如Clustal测定，例如Clustal W(Thompson等(1994).Nucleic Acids Res 22(22)：4673-80)或Clustal V(Higgins，D.G.和P.M.Sharp(1989).″Fast and sensitive multiple sequence alignments on amicrocomputer.″Comput Appl Biosci 5(2)：151-3.)。较低的同源性表明所述残基对于蛋白质的结构和/或功能并非特别重要或关键。优选参考图2的十六种哺乳动物白蛋白或图3的三十三种哺乳动物和非哺乳动物白蛋白确定同源性。
(e)相邻保守残基的存在或不存在。
在氨基酸序列内，每个残基具有一个或两个相邻残基。如果候选残基紧邻一个或多个相对于已知白蛋白具有低同源性的残基，这表明所述候选残基不太可能对于蛋白质的结构和/或功能特别重要或关键。这是因为该候选残基可能位于蛋白质的相对不保守的区域内。因此优选所述候选残基与相对于与已知白蛋白的白蛋白比对具有100％同源性的残基不相邻。候选残基可以与相对于与已知白蛋白的白蛋白比对(例如图2或图3)各具有100％同源性的两个残基(即在候选残基C端的一个残基和在候选残基N端的一个残基)相邻。优选候选残基与具有小于100、98、96、95、94、92、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、5的同源性的一个或两个残基相邻——这些同源性水平可以称作“阈值”。同源性可以如本文所述确定。考虑到同源性阈值，可以量化氨基酸相对于保守区的位置，例如通过将不与任何超过该同源性阈值的氨基酸相邻的氨基酸计为0分，将与超过该阈值的一个氨基酸相邻的氨基酸计为1分并将与超过该阈值的两个氨基酸相邻的氨基酸计为2分。
(f)多态性的证据。
多态性是一种遗传变异，多态性可以或可以不引起所得蛋白质的表型变化。优选候选残基不在已知有引起表型变化的多态性的位置处。更优选地，候选残基不在引起或已知引起热不稳定性的多态性的位置处。对于HAS(SEQ ID No.1)已知的多态性详见图1并且还记载于Minchiotti等(2008).HumMutat 29(8)：1007-16和http://www.uniprot.org/uniprot/P02768上。可以量化多态性的存在、缺失和/或效果，例如通过将没有表型变化的已知多态性计为0分，将其中已知有变性变化的多态性(但是已知不引起热不稳定性)计为1分并将已知引起热不稳定性的多态性计为2分。
(g)候选氨基酸和半胱氨酸的相对保守性。
氨基酸分为多个已知类别。因此，一些氨基酸与其他氨基酸关联更紧密。引入的半胱氨酸残基可以或可以不与候选氨基酸保持相对高水平的保守性。图4是提供一种可量化保守性水平的系统的维恩图。图4的计分系统使用0到5的等级，其中高保守性取代为0分，低保守性取代为5分，且中间保守性取代为1、2、3或4分。候选残基的取代优选不是非保守取代，即优选(使用图4的计分系统)候选残基保守性分数不为5(相对于半胱氨酸)。更优选候选残基相对于半胱氨酸具有较高的保守性(例如4、3、2的得分，并且更优选1分)。计分系统记载于题为“保守取代”(下文中)的段落。
(h)表达水平。
硫代白蛋白可能或可能不能以相对于未修饰的白蛋白(如SEQ ID NO.1)的表达的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％的水平由合适的表达系统如酵母(如酵母属(Saccharomyces)，例如酿酒酵母(S.cerevisiae))或曲霉属(Aspergillus)表达。相对表达水平可以通过例如蛋白质表达继以通过SDS-PAGE、HPLC或Western印迹的定量来确定。
(i)缀合能力(conjugation competence)。
所述硫代白蛋白可以或可以不具有高水平的缀合能力，例如相对于由SEQ ID No.1组成、仅在Cys-34具有一个能缀合半胱氨酸的白蛋白的缀合能力为至少50、60、70、80、90、95或100％。缀合能力可以相对于任何关注的可缀合分子(缀合配偶体)例如生物活性分子或荧光染料来确定。确定可以通过质谱分析或定量所述生物活性化合物的活性例如其荧光来进行。具有高缀合能力的硫代白蛋白的优势在于其可以允许分子有效缀合于所述硫代白蛋白。缀合能力可以相对于时间测量。有利的硫代白蛋白可以是(a)快速或(b)缓慢地实现最大缀合的那些。
(j)缀合化合物的活性。
本发明的硫代白蛋白可以缀合至化合物(缀合配偶体)，例如生物活性化合物，由此所述化合物相对于其在未缀合状态的活性具有高水平活性。优选地，所述缀合化合物相对于其未缀合状态显示其活性的至少1、10、20、40、50、60、70、80、90且最优选100％。具有高水平活性的缀合化合物的优势在于其降低了达到期望效果(例如，期望的治疗效果)所需的缀合化合物的量。
(k)白蛋白的受体结合能力
缀合和/或未缀合的硫代白蛋白可以或可以不具有人血清白蛋白(SEQID No.1)的受体结合活性的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％的受体结合活性。或者，缀合和/或未缀合的硫代白蛋白可以或可以不具有较低的受体结合活性，例如与人血清白蛋白相比至多0、10、20、30、40、50、60、70、80或90％。受体结合活性可以通过测定法测定，如与FcRn的结合相关的测定法。
图1显示HSA(SEQ ID No.1)的各个氨基酸残基就(a)至(g)的各参数而言的得分。为了清楚起见，HSA在体内最初作为609个氨基酸的蛋白质产生，其中前24个氨基酸是前导序列。前导序列被切除而生成585个氨基酸的成熟蛋白。在本说明书全文中，将该成熟蛋白称作SEQ ID No.1。HAS模型A1O6的结构不考虑SEQ ID No.1的最先4个残基和最后3个残基，因为这些残基在3D模型中未得到解析。因此，模型A1O6的残基1等同于SEQ IDNo.1的残基5。在本说明书的全文中，所有残基均参考SEQ ID No.1引用，除非另有说明。HSA的未成熟序列(即具有其天然C末端前导序列的HSA)在SEQ ID No.102中提供。
图1各列标注的详解如下：
1AO6中的位置：指来自RCSD Protein Databank (PDB，http://www.rcsb.org/pdb/)的PDB识别号1AO6或1ao6的条目的人血清白蛋白晶体结构中的氨基酸位置(Sugio，S.，A.Kashima，等(1999).Protein Eng 12(6)：439-46)。注意与成熟HSA序列(SEQ ID No1)相比，1AO6结构始于SEQ IDNo1的残基5S(缺少结构中最开始的4个氨基酸)并以SEQ ID No1的582A结束(缺少结构中最后3个氨基酸)。本文用于描述为了产生能缀合的半胱氨酸而改变的位置的氨基酸位置指SEQ ID No1中的位置，而非1ao6。
成熟HSA中的位置：SEQ ID No.1中的氨基酸位置取自HSA的585个残基的分泌形式，National Center for Biotechnology Information，ACCESSION：1AO6_A VERSION GI：3212456(24-SEP-2008)，Chain A，Crystal Structure OfHuman Serum Albumin.(Sugio等(1999).Protein Eng 12(6)：439-46)。
具有前导序列的位置：指含有24个氨基酸的分泌前导序列的人血清白蛋白的未加工形式中的位置。
氨基酸：用于20种氨基酸中每一种的标准单字母编码(例如A＝Ala＝丙氨酸)。
％SASA：使用Kabschand和Sander(1983)Biopolymers 22(12)：2577-637中描述的DSSP软件为每个残基计算的溶剂可及表面积。用每个溶剂可及表面积除以该位置中存在的特定氨基酸的标准值再乘以100，由此得到每个残基占标准值的百分比。20种不同氨基酸的标准溶剂可及表面积定义为(使用氨基酸的单字母编码)：A＝62，C＝92，D＝69，E＝156，F＝123，G＝50，H＝130，I＝84，K＝174，L＝97，M＝103，N＝85，P＝67，Q＝127，R＝211，S＝64，T＝80，V＝81，W＝126，Y＝104。
B因子：C-α原子的晶体B因子值直接从PDB文件中提取。B因子在1ao6 PDB文件PDB(http://www.rcsb.org/pdb/)的第11列中。
SS(二级结构)：使用DS SP软件Kabsch和Sander(1983).Biopolymers22(12)：2577-637确定每个残基的二级结构。如果二级结构被定义为H(螺旋)、B(分离的β桥)或E(延伸的片层)，那么将残基标为“1”，否则标为“0”。
比对1(Mamm.W)：多种哺乳动物白蛋白家族蛋白与HSA(SEQ ID NO：1)(确定为P02768)的比对的同源性水平，其使用MegAlign程序(DNASTAR，Lasergene，version 8.0.2)基于Clustal W编制；同源性的六个水平的确定为最高＝100％，以20％的间隔逐渐降低，至最低＝0％(图2)。
Adi.100％′s(比对1)：当将HSA与图2的哺乳动物白蛋白比对时，以相邻残基是否为高度(100％)保守为根据的得分。0分表明所述残基不与当HSA与图2的哺乳动物白蛋白比对时具有100％同源性的残基相邻；1分表明所述残基与当HSA与哺乳动物白蛋白比对时具有100％同源性的一个残基相邻；2分表明所述残基与当将HSA与哺乳动物白蛋白比对时具有100％同源性的两个残基相邻。
比对2(Var.Sps.V)：针对多种白蛋白家族蛋白与HSA(SEQ ID NO：1)(确定为P02768)的比对的同源性水平，其使用MegAlign程序(DNASTAR，Lasergene，8.0.2版)基于Clustal V编制；将同源性的六个水平确定为最高＝100％，以20％的间隔逐渐降低，至最低＝0％(图3)。
多态性：鉴定在氨基酸残基处的多态性是否已知。人血清白蛋白(SEQ IDNO：1)的单氨基酸多态性获得自Minchiotti等(2008).Hum Mutat 29(8)：1007-16.，and http://www.uniprot.org/uniprot/P02768，其中氨基酸位置获得自含有24个氨基酸的分泌前导序列的人血清白蛋白的未加工形式，并且使用标准单字母氨基酸编码描述(例如D25V指SEQ ID NO：1中位置1处的天冬氨酸变为缬氨酸)。
表型变化：代表源自已知表型变化的来源的表型变化的“严重性”的得分(参考上文的“多态性”)，其中，0＝无已知的表型变化，1＝已针对与SEQID NO：1中的残基相比在该位置的任一突变描述了表型变化，不包括导致热稳定性下降的变化，2＝将在SEQ ID NO：1中在该位置处的突变描述为引起热稳定性降低。
保守突变相对于半胱氨酸：涉及所述氨基酸与半胱氨酸相比有多保守的得分，如从图4所衍生的(在本文描述)，且就成为半胱氨酸的突变而言该得分的范围从1至5。将1分指定为可能的最保守的变化(例如丙氨酸到半胱氨酸)，变动至与半胱氨酸相比保守性最低的5分(例如组氨酸到半胱氨酸)。
尽管可以以任何期望的组合使用选择标准，在下文描述了四组优选的选择标准(A、B、C、D)，仅为举例。其中(A)和(B)也可(分别)称作选择组1和2：
(A)本发明第一方面特别优选的实施方案提供用于设计和/或制备硫代白蛋白的方法，所述方法包括：
提供包含至少一例白蛋白序列的三维结构模型(优选所述三维模型涉及白蛋白的氨基酸序列并且最优选提供所述白蛋白序列的氨基酸序列，所述氨基酸序列可以在所述三维模型的C端和/或N端包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个未解析的氨基酸，优选所述氨基酸序列是“全长”，即所述白蛋白的成熟氨基酸序列)；
在所述白蛋白序列中选择候选氨基酸残基，其对应于相对于(所述模型的或所述氨基酸序列的)白蛋白序列的N端或C端而言的第1、2、3、4或5个残基或其(优选与三维结构相关)满足以下条件：不存在于二级结构中；至少90％的表面可及性(SASA)；至少60的B因子得分；与已知哺乳动物白蛋白(例如图2)低于80％的同源性；没有与已知哺乳动物白蛋白(例如图2)具有100％同源性的相邻残基；没有具有已知的表型变化的多态性；并且没有得分为5或更高的成为半胱氨酸的非保守氨基酸变化；
用半胱氨酸取代选定氨基酸残基中的一个或多个或在选定残基的N端侧或C端侧插入半胱氨酸，
任选地对所述白蛋白序列进行一个或多个额外的变化，其中每个变化为氨基酸缺失、取代、延伸、添加或插入；和
任选地制备具有所需氨基酸序列的多肽。
参照模型1AO6和SEQ ID No.1，通过选择标准(A)鉴定的候选残基包括L585、D1、A2、D562、A364、A504、E505、T79和E86(按溶剂可及性递减的顺序)并且还示于图5A中。
(B)本发明第一方面的另一优选实施方案提供一种用于设计和/或制备硫代白蛋白的方法，所述方法包括：
提供包含至少一例白蛋白序列的三维模型(优选所述三维模型涉及白蛋白的氨基酸序列并且最优选还提供所述白蛋白序列的氨基酸序列，所述氨基酸序列可以在所述三维模型的C端和/或N端包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个未解析的氨基酸，优选所述氨基酸序列是“全长”，即所述白蛋白的成熟氨基酸序列)；
在(所述模型的或所述氨基酸序列的)所述白蛋白序列中选择候选氨基酸残基，其(优选与三维模型相关)满足以下条件：存在于二级结构中；至少90％的表面可及性(SASA)；至少40的B因子得分；与已知哺乳动物白蛋白(例如图2)低于80％的同源性；没有与已知哺乳动物白蛋白(例如图2)具有100％同源性的相邻残基；没有具有已知的表型变化的多态性；并且没有得分为5或更高的成为半胱氨酸的非保守氨基酸变化；
用半胱氨酸取代选定氨基酸残基中的一个或多个或在选定残基的N端侧或C端侧插入半胱氨酸，
任选地对所述白蛋白序列进行一个或多个额外的变化，其中每个变化为氨基酸缺失、取代、延伸、添加或插入；和
任选地制备具有所需氨基酸序列的多肽。
参照模型1AO6和SEQ ID No.1，通过选择标准(B)鉴定的候选残基包括D129、D549、A581、D121、E82、S270、Q397和A578(按溶剂可及性递减的顺序)并且还示于图5B中。
(C)本发明第一方面的另一优选实施方案提供一种用于设计和/或制备硫代白蛋白的方法，所述方法包括：
提供包含至少一例白蛋白序列的三维模型(优选所述三维模型涉及白蛋白的氨基酸序列并且最优选还提供所述白蛋白序列的氨基酸序列，所述氨基酸序列可以在所述三维模型的C端和/或N端包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个未解析的氨基酸，优选所述氨基酸序列是“全长”，即所述白蛋白的成熟氨基酸序列)；
在(所述模型的或所述氨基酸序列的)所述白蛋白序列中选择候选氨基酸残基，其(优选与三维模型相关)满足以下条件：不存在于二级结构中；至少80％的表面可及性(SASA)；至少50的B因子得分；与已知哺乳动物白蛋白(例如图2)低于100％的同源性；与图3中比对的多种白蛋白低于80％的同源性；没有已知引起热不稳定性的多态性；并且没有得分为4或更高的成为半胱氨酸的非保守氨基酸变化；
用半胱氨酸取代选定氨基酸残基中的一个或多个或在选定残基的N端侧或C端侧插入半胱氨酸；
任选地对所述白蛋白序列进行一个或多个额外的变化，其中每个变化为氨基酸缺失、取代、延伸、添加或插入；和
任选地制备具有所需氨基酸序列的多肽。
参照模型1AO6和SEQ ID No.1，通过选择标准(C)鉴定的候选残基示于图5C中。
(D)本发明第一方面的另一优选实施方案提供一种用于设计和/或制备硫代白蛋白的方法，所述方法包括：
提供包含至少一例白蛋白序列的三维模型(优选所述三维模型涉及白蛋白的氨基酸序列并且最优选还提供所述白蛋白序列的氨基酸序列，所述氨基酸序列可以在所述三维模型的C端和/或N端包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个未解析的氨基酸)；
在所述白蛋白序列中选择候选氨基酸残基，其(优选与三维模型相关)满足以下条件：存在于二级结构中；至少80％的表面可及性；至少30的B因子得分；与已知哺乳动物白蛋白(例如图2)低于100％的同源性；与图3中比对的多种白蛋白低于80％的同源性；没有已知引起热不稳定性的多态性；并且没有得分为4或更高的成为半胱氨酸的非保守氨基酸变化；
用半胱氨酸取代选定氨基酸残基中的一个或多个或在选定残基的N端侧或C端侧插入半胱氨酸，
任选地对所述白蛋白序列进行一个或多个额外的变化，其中每个变化为氨基酸缺失、取代、延伸、添加或插入；和
任选地制备具有所需氨基酸序列的多肽。
参照模型1AO6和SEQ ID No.1，通过选择标准(D)鉴定的候选残基示于图5D中。
由于图5A、5B、5C和5D均选自图1，所以列的标题相同。
候选残基可以是所述白蛋白分子中存在的涉及二硫键合的半胱氨酸残基中的一个或多个(在HSA(SEQ ID No.1)的情况下，存在17个二硫键，因此有34个半胱氨酸涉及二硫键合)。通过二硫键连接的两个半胱氨酸可以称作“对应体”。为了产生能缀合的半胱氨酸，可将所述候选残基缺失或可用不同的氨基酸特别是Ser、Thr、Val或Ala取代从而在配偶体半胱氨酸处产生游离巯基。涉及二硫键合的SEQ ID No.1的34个半胱氨酸残基为C53、C62、C75、C91、C90、C101、C124、C169、C168、C177、C200、C246、C245、C253、C265、C279、C278、C289、C316、C361、C360、C369、C392、C438、C437、C448、C461、C477、C476、C487、C514、C559、C558和C567。涉及本发明时，这34个候选残基中的一些比其他更有利。
半胱氨酸残基可以使用PyMOL软件(Warren L.DeLano″The PyMOLMolecular Graphics System.″DeLano Scientific LLC，San Carlos，CA，USA.http://www.pymol.org)目视检查，并且将二硫键中的半胱氨酸分为3类：
●能够替代(例如用丝氨酸替代)的半胱氨酸，使其对应体半胱氨酸作为具有高概率成为缀合位点的游离巯基保留。这些半胱氨酸对应于C75、C91、C124、C168、C169、C316、C360、C361、C567、C558。
●能够用丝氨酸替代的半胱氨酸，使其对应体半胱氨酸作为具有中等概率成为缀合位点的游离巯基保留。这些半胱氨酸对应于C90、C101、C177、C265、C279、C278、C289、C369、C392、C438、C476、C487、C514、C559。
●能够用丝氨酸替代的半胱氨酸，使其对应体半胱氨酸作为具有低概率成为缀合位点的游离巯基保留。这些半胱氨酸对应于C53、C62、C200、C246、C245、C253、C437、C448、C461、C477。
该判断基于表面可及性以及潜在游离巯基的C-α-C-β键相对于折叠后的多肽的取向。使用这种判断，为HSA的每个半胱氨酸残基给出修饰得分并评级为高、中或低。
图6A，提供了具有高修饰得分的全部半胱氨酸残基的列表(最右手侧一列)，指示出对该位置的半胱氨酸残基的修饰会导致其对应体半胱氨酸提供具有高概率成为适合用作缀合位点的游离巯基。
图6B，提供了在不成对时(因此产生游离巯基)具有高概率成为适合用作缀合位点的对应体半胱氨酸的列表。
图6的列标注与为图1描述的那些相同，另有：
修饰得分：如本文所述定义为“高”、“中”或“低”。
二硫键信息：归纳SEQ ID No.1中的二硫键成对。
(多态性)表型变化：归纳了图1中标以“多态性”和“表型变化”的列。
用于修饰的优选半胱氨酸残基可以进一步基于图6A中提供的其他信息选择，如指定的二级结构、没有相邻的保守残基(在哺乳动物白蛋白之间100％(通过Clustal W比对))的半胱氨酸残基、没有引起表型变化的已知多态性。
或者，用于修饰的半胱氨酸残基可以通过检查图6A中提供的通过修饰其对应体半胱氨酸残基产生的半胱氨酸残基(含有游离巯基)的环境来选择，如高％SASA这样的特征可能是优选的(图6B，第五列)。
为了清楚起见，对于SEQ ID No.1的人血清白蛋白之外的白蛋白，等同残基对于突变是有利的。这些等同残基可以或可以不与SEQ ID No.1的残基具有相同的残基编号，但是会由技术人员清楚地鉴定，例如参考与SEQ IDNo.1和其他白蛋白如图2和/或图3中的那些的同源性比对。例如，在图2中，水平“标尺”上在160位置的残基是等同的，但是具有不同的残基编号，且有时为不同的氨基酸，例如在人中为L159，在山羊片段中为W134，在猕猴中为L151，而在小鼠中为M159。优选的是，对于像图2或图3这样的比对，等同残基在SEQ ID No.1的候选氨基酸的10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸之内。比对之上的“标尺”指示某个氨基酸是否在SEQ ID No.1的候选氨基酸的1至10个氨基酸之内。
组(A)的选择标准与组(B)的相比更优选，组(B)的进而又比组(C)的更优选，组(C)的进而又比组(D)的更优选。
所述方法可以或可以不进一步包括确定所述多肽的受体结合能力和/或缀合能力，并任选地选择具有或不具有受体结合能力和/或缀合能力的多肽。
“制备”多肽可以包括或可以不包括在宿主细胞中表达所述多肽和/或从所述宿主或宿主细胞培养基纯化所述多肽。所述方法可以包括有利地选择满足以下标准之一或全部的残基：
●具有高表面可及性的残基比具有低表面可及性的更优选；
●从另一氨基酸保守突变为半胱氨酸比非保守突变更优选；
可供选择地，或额外地，可以或可以不将在本说明书通篇中详细描述的选择标准用于在本发明第一方面的方法中以选择残基。
本发明的第二方面提供包含根据本发明的第一方面设计和/或产生的多肽序列和/或多肽的硫代白蛋白。
优选所述多肽是重组多肽。优选所述多肽是分离的和/或纯化的多肽。优选所述多肽是合成的和/或在自然界中不天然存在。
具体而言，本发明提供具有与SEQ ID No.1的残基1-585至少60％相同的氨基酸序列的多肽，或其片段或融合物，其中：
(a)在与SEQ ID No.1的位置34等同的位置，存在能缀合的半胱氨酸残基；并且
(b)在所述多肽的其他位置，存在一个或多个能缀合的半胱氨酸残基，优选2个或更多个。
另外，本发明提供包含与SEQ ID No.1的残基1-585至少60％相同的氨基酸序列或其片段或融合物的能缀合的多肽，其中：
(a)在与SEQ ID No.1的位置34等同的位置，不存在能缀合的半胱氨酸残基；并且
(b)在所述多肽的其他位置，存在一个或多个能缀合的半胱氨酸残基，优选2个或更多个，或3个或更多个。
所述多肽可以或可以不包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个能缀合的半胱氨酸残基。
更具体而言，所述多肽(其可以相对于已知白蛋白序列如SEQ ID No.1来描述)可以或可以不包含下列的一项或多项：
(a)在对应于与SEQ ID No.1的残基L585、D1、A2、D562、A364、A504、E505、T79、E86、D129、D549、A581、D121、E82、S270、Q397和A578中任何等同的位置的位置处用半胱氨酸取代非半胱氨酸的氨基酸；
(b)在与可以或可以不对应于与SEQ ID No.1的残基L585、D1、A2、D562、A364、A504、E505、T79、E86、D129、D549、A581、D121、E82、S270、Q397和A578中任何等同的位置的氨基酸的N端侧或C端侧相邻的位置插入半胱氨酸；
(c)在可以或可以不对应于C369、C361、C91、C177、C567、C316、C75、C169、C124和C558中任何的位置的具有游离巯基的半胱氨酸，其可以或可以不通过缺失或取代C360、C316、C75、C168、C558、C361、C91、C124、C169和/或C567产生；
(d)向白蛋白序列的N末端残基的N端侧和/或向白蛋白序列的C末端残基的C端侧添加半胱氨酸，
从而使(a)、(b)、(c)和(d)的取代、缺失、添加或插入事件的净结果(netresult)为所述多肽序列的能缀合的半胱氨酸残基数相对于所述取代、插入、缺失和添加事件之前的多肽增加。在上述(a)到(d)中，所有的残基均为优选。然而，在(a)、(b)、(c)和(d)各项中，残基以优选性递减的顺序列出。
硫代白蛋白可以或可以不包括其中将一个或多个天然存在的游离巯基如HSA(SEQ ID No.1)中的半胱氨酸34修饰成非半胱氨酸的氨基酸的多肽。例如，半胱氨酸可以或可以不由具有相对高的保守得分(例如，如根据图4计算为1、2或3)的氨基酸如丙氨酸或丝氨酸替代。硫代白蛋白可以或可以不包括其中存在一个或多个天然存在的游离巯基如HSA(SEQ ID No.1)中的半胱氨酸34的多肽。
如本文所详细描述的，本发明可以通过藉由延伸、添加、插入、取代或缺失中的一种或多种引入半胱氨酸残基来实现。
添加可以通过延伸和/或插入来进行。
例如，一个或多个能缀合的半胱氨酸可以或可以不通过延伸在白蛋白中产生；例如通过向所述分子的N末端或C末端添加额外的半胱氨酸残基，其可以或可以不作为单个半胱氨酸残基添加，或作为含有一个或多个能缀合的半胱氨酸的较长多肽添加。可以将所述半胱氨酸残基添加在紧邻(immediately adjacent)所述白蛋白的N末端或C末端。或者，可以存在一个或多个其他氨基酸残基位于所述白蛋白的N末端和/或C末端与所述半胱氨酸残基之间。当添加两个或更多个半胱氨酸残基时，所添加的半胱氨酸中的一些或全部可以通过一个或多个其他氨基酸彼此分开，例如通过1-50个氨基酸，如从1、10、20、30或40个氨基酸到10、20、30、40或50个氨基酸。优选的N末端延伸是在紧邻成熟白蛋白(即，从其前导序列切下的白蛋白)的N末端添加Cys。例如，对于包含SEQ ID No.1或由SEQ ID No.1组成的白蛋白，Cys优选紧邻第一Asp(D1)的N末端。这样的白蛋白可以称作“Cys-白蛋白”，例如“Cys-HSA”(其中HSA是人血清白蛋白)。白蛋白(如SEQ ID No.1)的其他优选的N末端延伸包括Cys-Ala-白蛋白如Cys-Ala-HSA。优选的C末端延伸是在紧邻白蛋白如成熟白蛋白的C末端添加Cys。例如，对于包含SEQ ID No.1或由SEQ ID No.1组成的白蛋白，Cys优选紧邻最后的Leu(L585)残基的C末端。这样的白蛋白可以称作“白蛋白-Cys”，例如“HSA-Cys”。白蛋白(如SEQ ID No.1)的其他优选的C末端延伸包括白蛋白-Ala-Cys，如HSA-Ala-Cys。如上所述，可以向所述白蛋白的C末端氨基酸或N末端氨基酸的C端侧或N端侧(如向SEQ ID No.1中L585的C端侧)添加或插入适于提供延伸的多肽。
所述多肽可以或可以不进一步包含其他接头，所述接头可以与缀合配偶体(如生物活性化合物)连接。例如，接头可以包含伯胺如赖氨酸。
一个或多个能缀合的半胱氨酸可以或可以不通过插入在白蛋白中产生；例如通过添加一个或多个额外的半胱氨酸而不从所述白蛋白序列去除氨基酸残基，或通过用含有至少一个半胱氨酸的数目更多的残基取代一个或多个相邻氨基酸，由此延长所述多肽的整体长度。例如，可以将半胱氨酸残基紧邻本文鉴定的白蛋白残基引入。所述半胱氨酸残基可以作为单个半胱氨酸残基引入或在多肽内引入。所述多肽可以为2-50个氨基酸长，优选从2、10、20、30或40至10、20、30、40或50个氨基酸长。
可供选择地，或额外地，本发明包括用不同的氨基酸残基取代白蛋白的一个或多个二硫键中的半胱氨酸残基之一，从而破坏所述二硫键以留下额外的游离巯基。例如，可以取代HSA的17个天然存在的二硫键中的一个或多个的半胱氨酸以提供能缀合的半胱氨酸。这样的取代造成未经取代的半胱氨酸不再有二硫键合配偶体，并因此提供游离巯基。能缀合的半胱氨酸可以自白蛋白天然存在的二硫键中的一个或多个提供，如白蛋白如HSA(例如SEQ IDNo.1)天然存在的二硫键中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个。例如，可以或可以不将与另一半胱氨酸残基天然形成二硫键的一个半胱氨酸残基用相对保守的氨基酸残基，特别是Ser、Thr、Val或Ala取代。参照SEQ ID No.1，涉及二硫键合的半胱氨酸残基为C53、C62、C75、C91、C90、C101、C124、C169、C168、C177、C200、C246、C245、C253、C265、C279、C278、C289、C316、C361、C360、C369、C392、C438、C437、C448、C461、C477、C476、C487、C514、C559、C558和C567。具体而言，优选用于修饰(即缺失或取代)的半胱氨酸残基可具体对应于C360、C316、C75、C168、C558、C361、C91、C124、C169和/或C567，由此在SEQID No.1的C369、C361、C91、C177、C567、C316、C75、C169、C124和C558中的一个或多个处产生能缀合的半胱氨酸。
另外，能缀合的半胱氨酸可以或可以不通过缺失蛋白质结构中二硫键的半胱氨酸之一，从而破坏该二硫键以提供额外的游离巯基而在白蛋白中产生。
可供选择地，或额外地，可以或可以不将白蛋白分子中存在的、但不涉及二硫键合的一个或多个半胱氨酸(例如在SEQ ID No.1的情况下为Cys-34)缺失(即不用不同的氨基酸取代)，或者可以或可以不用不同的氨基酸特别是Ser、Thr、Val或Ala取代。
对于包含两个或更多个能缀合的半胱氨酸残基的多肽，当所述多肽经折叠时，所述能缀合的半胱氨酸残基可以或可以不相对平均地分布在所述经折叠的蛋白质的表面上。术语“经折叠的”包括将多肽/蛋白质折叠成其天然构型，例如在热力学上最稳定的折叠构型。相对平均的分布的优势在于，其允许两个或更多个模块与所述硫代白蛋白缀合而在所述缀合的模块的两个或更多个之间没有空间位阻。这具有最小化(并且可选地消除)由于像可缀合于所述硫代白蛋白的相邻模块(缀合配偶体)之间的空间位阻这样的问题而产生的潜在活性损失的优势。这些模块，例如生物活性分子，可能相对较大。
优选所述两个或更多个能缀合的半胱氨酸在所述硫代白蛋白分子表面上的分布使得它们彼此的间隔尽可能(例如在几何上尽可能)的远。优选两个或更多个能缀合的半胱氨酸之间的距离为至少10、20、30、40、50、60、70或80埃(Angstrom)。优选各个能缀合的半胱氨酸与所述分子中所有其他能缀合的半胱氨酸相距至少10、20、30、40、50、60、70或80埃。两个能缀合的半胱氨酸之间的距离优选为所述经折叠白蛋白分子(例如如白蛋白模型中所示)最长轴长度的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或95％并最优选100％的距离。例如，如蛋白质结构1AO6中所示的SEQ ID No.1的最长轴为约85埃。因此，优选两个或更多个半胱氨酸残基分开至少65、70、75或最优选80埃。最优选每个能缀合的半胱氨酸残基相距距离为所述经折叠白蛋白分子最长轴长度的至少80、90或95％并最优选100％。
优选能缀合的半胱氨酸的侧链的朝向彼此背离的方向和/或其朝向使得缀合于所述半胱氨酸的模块会朝向远离所述白蛋白结构的中心的方向。这提供了防止缀合模块和/或白蛋白模块本身之间的相互作用的优势。
对于氨基酸序列，候选氨基酸残基可以使用像PyMOL(Warren L.DeLano″The PyMOL Molecular Graphics System″DeLano Scientific LLC，SanCarlos，CA，USA.http://www.pymol.org)这样的软件来目视检查。可以将候选氨基酸基于它们与该组其他成员的接近程度分类。例如，可以将候选氨基酸分成2、3、4、5、6、7、8、9或10类。优选候选氨基酸的组合选自不同的类。即，优选硫代白蛋白含有来自各类的一个或少数几个突变。
对于SEQ ID No.1，使用PyMOL来分析图5A和5B中的候选残基，从而鉴定特别有利的半胱氨酸突变组合。这些组合可以用于设计具有两个或更多个能缀合的半胱氨酸残基的硫代白蛋白。选择组1和2对应于来自本文所述选择方法的图5A和5B的选择标准(A)和(B)(分别)。选择组3对应于图6B中鉴定的残基。特别有利的残基在图6A和6B中给出，其中列的标题与图1中的相同，加入了如本文所述的“选择组”和“接近组”。
分析结果在图10中给出，其中列的标题与图1和图6中使用的相同，另有：
接近组：如本文所述的接近组的分配，用于描述HSA(具体为SEQ ID No.1)内位点的亚组。
例如，使用PyMOL软件目视检查选自选择组1的候选氨基酸残基(图5A中列出)，并将选择的残基基于其与选择组1的其他成员的接近程度分类。产生了五个组(图10“接近组”中标为A至E，最右手侧一列)，四个通过目视检查产生。组E含有在1AO6中不可见的氨基酸残基，已知所述氨基酸残基在N末端区域中。另外，观察到cys-34出现在接近组A中。
类似地，使用PyMOL软件目视检查选择组2中选择的氨基酸残基(图5B中列出)，并将选择的氨基酸基于它们与选择组2的其他成员的接近程度分类。产生了五个组(图10“接近组”中标为F-J，最右手侧一列)。
类似地，使用PyMOL软件目视检查选择组3中选择的优选游离半胱氨酸残基(图6B中列出)，所述残基能够通过造成对二硫键的破坏的突变产生，并且将选择的氨基酸基于它们与该组其他成员的接近程度分类。产生了四个组(图10“接近组”中标为K-N，最右手侧一列)。当提及选择组3的残基时，所引述的残基为产生的能缀合半胱氨酸(例如图6B)。为了产生这样的能缀合的半胱氨酸残基，显然应将二硫键中的对应体半胱氨酸(例如图6A)去除，例如通过缺失或取代。
当想要两个或更多个突变的组合时，存在于不同“接近”组中的氨基酸残基(例如参照SEQ ID No.1)可能比同一接近组内存在的那些残基更优选。对于SEQ ID No.1，有14个接近组(即A至N)。优选的是，对于具有两个或更多个能缀合的半胱氨酸的硫代白蛋白，有0或1个由所述14个组中的每一组限定的能缀合的半胱氨酸。即，优选这样的硫代白蛋白不含两个或更多个属于同一组的能缀合的半胱氨酸。存在大量符合这一标准的排列组合。
例如，对于基于产生选择组1的选择标准的含有两个游离巯基残基的硫代白蛋白变体，则T79+A364，其中一个残基选自接近组A并与接近组C中的A364组合，会比两个都存在于接近组A中的T79+E86更优选。
对于包括半胱氨酸-34的组合，优选不从接近组A、F或K选择残基。即，优选选择来自接近组B-E、G-J和L-N中的一组或多组的残基。
选自选择组1中的优选的突变的实例可包括下述：
●对于选自选择组1的2个氨基酸残基；来自接近组A+C的氨基酸残基是优选，如T79+A364。类似地，选自接近组C+E的氨基酸残基，如A364+D1也是优选。而且，来自接近组D+E的氨基酸残基，如L585+A2或+L585的C端侧+A2，或来自G+I的氨基酸残基，如S270+A581，是优选。
●对于选自选择组1的3个氨基酸残基；存在于接近组A+C+B的氨基酸残基是优选，如T79+A364+D562。类似地，选自接近组B+C+E的氨基酸残基，如D562+A364+A2或D562+A364+D1也是优选。
●对于选自选择组1的4个氨基酸残基；存在于接近组A+C+B+D中的氨基酸残基，如T79+A364+D562+A504，或可选地T79+D562+A364+L585，是优选。甚至更优选的是选自接近组A+B+C+E的氨基酸残基，如C34+D562+A364+A2、T79+D562+A364+D1。
●对于选自选择组1的5个氨基酸残基；存在于接近组A+C+B+D+E中的氨基酸残基，如T79+D562+A364+L585+D1是优选。类似地，E86+D562+A364+A504+A2也是优选。
●上述白蛋白变体可以或可以不进一步包含SEQ ID No.1在Cys34的半胱氨酸，或在另一白蛋白的等同位置的半胱氨酸。
选自选择组2中的优选突变的实例包括下述：
●对于选自选择组2的2个氨基酸残基；来自接近组G+I的氨基酸残基是优选，如S270+A581。或者，存在于接近组G+H中的氨基酸残基如S270+D129也是优选。
●对于选自选择组2的3个氨基酸残基；存在于接近组G+I+F的氨基酸残基如S270+A581+E82是优选。或者，存在于接近组G+I+H的氨基酸残基如S270+A581+D129是优选。
●对于选自选择组2的4个氨基酸残基；存在于接近组G+I+F+H的氨基酸残基如S270+A581+E82+D129是优选。
●对于选自选择组2的5个氨基酸残基；存在于接近组G+I+F+H+J的氨基酸残基如S270+A581+E82+D129+Q397是优选。然而，D549不优选与突变A578、A581组合。另外，成为D549、A578、A581的突变不优选与来自选择组1的L585突变组合。
选自选择组3中的能缀合的游离巯基的优选位点的实例包括下述：
●对于选自选择组3的2个氨基酸残基；存在于接近组M+L的氨基酸残基是优选，如C369+C177。类似地，C361+C124也是优选。
●较不优选超过两个破坏二硫键的突变。
●上述白蛋白变体可以或可以不进一步包含SEQ ID No.1在Cys34的半胱氨酸，或在另一白蛋白的等同位置的半胱氨酸。
也可以构建来自选择组1、2和3的位点的组合，其中来自选择组1的位点通常比来自选择组2的位点优选，来自选择组2的位点通常比来自选择组3的位点优选。
来自选择组1+2的位点的实例可以包括来自接近组C+I的残基，如A364+A581。或者，来自接近组A+G+I的残基，如C34+S270+A581，来自接近组A+H+G+I的残基，如C34+D129+S270+A581，来自接近组A+C+I的残基，如T79+A364+A581，或来自接近组C+I+H的残基，如A364+A581+D129也是优选。
来自选择组1+3的位点的实例可以包括来自接近组A+L+M的残基，如C34+C169+C316，来自接近组C+L的残基，如A364+C177是优选。或者，来自接近组B+M的残基，如D562+C369是优选。
来组选择组2+3的位点的实例可以包括来自接近组H+M的残基，如D129+C369是优选。或者，来自接近组I+M的残基，如A581+C369是优选。
来组选择组1+2+3的位点的实例可以包括来自接近组A+H+M+D的残基，如C34+D129+C360+L585，来自接近组B+H+M，如D562+D129+C369是优选。
以上组合通常比来自以下接近组的组合的残基组合更优选：(i)A、K和F；(ii)B、D、I、J和N；(iii)C和M；(iv)H和L。
本发明的上述白蛋白变体可以或可以不进一步包含SEQ ID No.1在Cys34的半胱氨酸，或者如果基于除SEQ ID No.1之外的白蛋白在等同位置的半胱氨酸。
本领域技术人员会理解适用于引入超过一个游离巯基(能缀合的半胱氨酸)的位点选自选择组1、2和3。然而，这一方法也可以用于选择用于从选自SEQ ID No1的其他残基引入超过一个游离巯基的位点，即，他可以使用公开的方法来产生其他有用的选择组。
优选的硫代白蛋白包含在位置34处天然存在的Cys之外，在位置2和585具有Cys的SEQ ID No.1(SEQ ID No.78，构建体‘TA33’)。更优选的硫代白蛋白在位置34处天然存在的Cys之外，在位置2、364、562、585具有Cys的SEQID No.1(SEQ ID No.82，构建体‘TA38’)。也可以优选在位置2、364、562和585包含三个或四个Cys的硫代白蛋白。
所述多肽可以或可以不包含至少一个减少糖基化的突变。
本发明的第三方面提供编码本发明的多肽的多核苷酸。所述多核苷酸可以或可以不相对于要从中进行表达的宿主进行密码子优化。SEQ ID No.2提供通常的HSA(SEQ ID No.1)的编码序列。SEQ ID No.3提供HSA(SEQ IDNo.1)的编码序列，其针对从酿酒酵母(S.cerevisiae)表达进行了密码子优化。可以突变SEQ ID No.2或3以提供编码本发明的多肽的多核苷酸。优选地，所述多核苷酸是合成的和/或重组的。优选地，所述多核苷酸是分离的多核苷酸。所述多核苷酸可以编码带有或不带前导序列的HSA。例如，所述多核苷酸可以编码带有HSA的天然前导序列(SEQ ID No.102的氨基酸1-24)的HSA或带有融合前导序列(SEQ ID No.49的氨基酸1-24)的HSA。
本发明的第四方面提供包含本发明第三方面的多核苷酸的质粒。所述质粒可以是2微米基质粒如WO2005/061719、WO2005/061718和WO2006/067511中描述的那些(全部通过提述并入本文)。所述质粒可以展现增强的蛋白伴侣活性，例如通过过表达蛋白伴侣，特别是PDI来进行。
本发明的第五方面提供表达系统，如包含本发明的第三方面的多核苷酸和/或本发明的第四方面的质粒的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞是哺乳动物细胞如人或牛细胞，或真菌细胞如酵母细胞。或者，所述宿主细胞可以是细菌细胞如芽孢杆菌属(Bacillus)或大肠杆菌或病毒细胞如杆状病毒(Baculovirus)或植物细胞如稻例如稻(Oryza sativa)。最优选地，所述细胞是酵母细胞如酵母属(例如酿酒酵母)、毕赤酵母属(Pichia)或曲霉属(Aspergillus)细胞。
本发明的第六方面提供缀合物，其包含缀合配偶体，如生物活性化合物，和本发明的多肽，其中所述缀合配偶体与所述多肽通过所述多肽的能缀合的半胱氨酸残基连接。所述缀合配偶体可以是治疗性、诊断性或成像用化合物，如本文提及的那些。所述缀合物可以包含2个或更多个，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个缀合配偶体，其可以各不相同的和/或可以是相同化合物的多个拷贝。优选地，每个缀合配偶体与所述多肽通过所述多肽的能缀合的半胱氨酸残基连接，然而缀合配偶体可以通过其他方式，例如通过遗传融合或共价键与非半胱氨酸氨基酸(如赖氨酸)连接。
本发明的第七方面提供产生本发明多肽的方法，其包括：
(a)在允许所述多肽表达的条件下培养本发明的宿主细胞；并
(b)从所述宿主细胞和/或从所述宿主细胞生长培养基回收所述多肽。
相应地，本发明还提供用于产生本发明的多肽(或蛋白质)的方法，所述方法包括：(a)提供本发明的宿主细胞，其包含编码如上文限定的所选蛋白质产物的多核苷酸；并(b)培养所述宿主细胞(例如，在培养基中培养所述宿主细胞)；由此产生与在相同条件下培养未经引起一种或多种辅助蛋白过表达的遗传修饰的相同宿主细胞所实现的所选蛋白质产物的产生水平相比，包含水平升高的所选蛋白质产物的细胞培养物或重组生物。
培养所述宿主细胞的步骤可以或可以不涉及允许将源自多细胞生物的宿主细胞重新培养成多细胞重组生物(如植物或动物)，和任选地，由其产生一代或多代子代。
所述方法可以或可以不进一步包括自培养的宿主细胞、重组生物或培养基纯化由此表达的所选蛋白质产物的步骤。
所述产生方法可以包括将缀合配偶体与本发明的多肽通过所述多肽的能缀合的半胱氨酸残基连接。合适的缀合方法和缀合配偶体在本文描述。
本发明的第八方面提供包含本发明的缀合物和至少一种药学上可接受的载体和/或稀释剂的组合物。
本发明的第九方面提供用于制备药物成分和/或药物产品的方法，其包括制备本发明的硫代白蛋白，任选地将另一分子与所述硫代白蛋白缀合，任选地将所得缀合物与药学上可接受的稀释剂和/或载体一起配制，和任选地以单位剂量形式制备所述产物。
本发明的第十方面提供本发明的多肽用于产生硫代白蛋白缀合物的用途。
本发明的第十一方面提供本发明的缀合物和/或通过本发明的方法产生的缀合物用于治疗疾病、治疗病症和/或诊断的用途。
本发明的第十二方面提供包含一种或多种本发明的白蛋白的凝胶。所述凝胶可以通过任何合适的方法形成。例如，所述凝胶可以通过将白蛋白溶液或悬浮液在合适的温度例如室温(15-25℃，如20℃)或体温(36-38℃，优选36.9℃)温育来形成。凝胶可以用于涂覆医疗装置，如支架。凝胶可以在伤口敷裹物之中或之上使用。所述白蛋白可以在其凝胶化之前或之后应用于医疗装置或伤口敷裹物。所述白蛋白可以易位(ex situ)或原位(in situ)应用(例如在医疗装置或敷裹物施用于人或动物体上或插入人或动物体中之前、之后或过程中应用于医疗装置或敷裹物)。
本发明的多肽和/或缀合物可以用于制备纳米颗粒，所述纳米颗粒可以例如用于血管生成应用、抗血管生成应用和涂覆医疗装置如支架。纳米颗粒在靶向例如非紧密连接方面是有效的，并因此可用于靶向肿瘤如癌性肿瘤。纳米颗粒也可用于靶向抗原从而刺激免疫应答，因为纳米颗粒对于吞噬细胞的吞噬和呈递尤其易感。本发明提供仅由本发明的硫代白蛋白组成的纳米颗粒，其可以或可以不与模块(缀合配偶体)缀合。本发明还提供纳米颗粒，其包含本发明的硫代白蛋白(其可以或可以不与模块缀合)，和一种或多种可以是或可以不是白蛋白相关性的其他纳米颗粒组分。在优选的实施方案中，本发明的硫代白蛋白包含至少两个位于所述多肽表面的能缀合的半胱氨酸残基。这样的硫代白蛋白可以用于制备纳米颗粒，其中可以将一个或多个能缀合的半胱氨酸残基用于形成纳米颗粒，并将一个或多个能缀合的残基用于与缀合配偶体缀合，例如与生物活性分子缀合。
本发明涉及所有白蛋白。同时优选的残基已经参考SED ID No.1进行了鉴定，本领域技术人员将能够在其他白蛋白序列，如图2和3中公开的白蛋白中鉴定等同残基，并理解在这些等同残基处的白蛋白(非SEQ ID No.1)突变是本发明的一部分。等同残基可以通过，例如，与SEQ ID No.1的同源性比对来鉴定。除SEQ ID No.1之外的白蛋白中的残基可以或可以不与其在SEQID No.1中的等同残基具有相同的残基坐标。因此本发明提供基于任何白蛋白序列(如表1中所示的序列，并且更优选地，图2和/或3中所示的那些)的硫代白蛋白。“基于”包括修饰白蛋白序列以引入一个或多个额外的游离巯基。
重组白蛋白因具有较高水平的能缀合的游离巯基而能够提供优于动物来源白蛋白的优势，并且能够在没有被病原性朊病毒和病毒污染的风险下制备。硫代白蛋白缀合物的优势在于硫代白蛋白部分可与缀合配偶体分开制备。因此，可以将一个批次的硫代白蛋白用于产生多个不同的硫代白蛋白缀合物。另外，缀合物的单独组分可以通过不同方法制备，并因此不受单一方法的限制，如在宿主细胞如酵母中的异源蛋白质表达。此外，硫代白蛋白可以包含多个缀合位点，并因此可以将单一硫代白蛋白与超过一种类型的缀合配偶体(例如治疗剂、诊断剂、靶向剂、显像剂)和/或与一种或多种类型的缀合配偶体的多个拷贝缀合。将硫代白蛋白与不同类型的缀合配偶体缀合的能力允许提供多功能物质。将硫代白蛋白与多个拷贝的缀合配偶体缀合的能力允许相对于仅有单一拷贝缀合配偶体的缀合物增加分子的浓度，并因此增加用于给定目的所需的硫代白蛋白缀合物的量或体积。通过白蛋白融合蛋白递送药物的优势在Osborn，等(2002).J Pharmacol Exp Ther 303(2)：540-8中讨论。通过本发明的缀合进行的药物递送会具有类似的优势。
可以或可以不依照本发明使用的进一步的细节在下文中描述：
三维(3D)模型
上述公开相对于涉及SEQ ID No.1的称为1AO6(Protein Data Bank)的白蛋白模型做出。
然而，本发明涉及所有白蛋白和它们的结构。白蛋白的结构是本领域技术人员可以获得的，例如人白蛋白的三级结构的原子坐标可在www.ncbi.nlm.nih.gov上的GenBank DNA数据库中获得。
可以使用合适的软件如RasM.1Chime(Sayle，TIBS 20，374，1995)来查看结构。可用的白蛋白坐标包括：
1A06、1BM0(Sugio等(1999).Protein Eng12(6)：439-46)，其为需求最多的17个蛋白质之一。
1UOR，He & Carter (1992).Nature 358(6383)：209-15.
1bi5和1bke，Curry等(1998).Nat Struct Biol 5(9)：827-35.
1e7a、1e7b、1e7c，Bhattacharya等(2000).J Biol Chem 275(49)：38731-8.
1e7e、1e7f、1e7g、1e7h和1e7i，Bhattacharya等(2000).J Mol Biol 303(5)：721-32.
1GNJ，Petitpas等(2001).J Mol Biol 314(5)：955-60.
1HA2和1H9Z Petitpas等(2001).J Biol Chem 276(25)：22804-9。
白蛋白
本发明中使用的白蛋白可以是天然存在的白蛋白、白蛋白相关蛋白或它们的变体，如天然的或工程化的变体。变体包括多态性、片段如结构域或亚结构域、片段和/或融合蛋白。本发明的白蛋白可以包含从任何来源获得的白蛋白蛋白质的序列。通常所述来源是哺乳动物的，如人或牛。在一个优选的实施方案中，所述血清白蛋白是人血清白蛋白(“HSA”)。术语“人血清白蛋白”包括具有在人中天然存在的氨基酸序列的血清白蛋白，和其变体。优选地，所述白蛋白具有SEQ ID No.1的氨基酸序列或其变体或片段，优选其功能性变体或片段。HSA编码序列可以通过用于分离对应于人基因的cDNA的已知方法获得，并且还公开于，例如，EP 0 073 646和EP 0 286 424。片段或变体可以或可以不是功能性的。例如，片段或变体可以保留亲本白蛋白(自其衍生所述片段或变体的白蛋白)与白蛋白受体如FcRn结合的能力的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％的与所述受体结合的能力。相对结合能力可以通过本领域已知的方法来测定，如表面等离振子(plasmon)共振研究。
所述白蛋白可以是人白蛋白的或人白蛋白类似物的天然存在的多态性变体。通常，人白蛋白的变体或片段会具有人白蛋白的配体结合活性(例如FcRN结合)(摩尔对摩尔)的至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％(优选至少80％、90％、95％、100％、105％或更多)。
所述“白蛋白”可以包含牛血清白蛋白序列。所述“牛血清白蛋白”包括具有在牛中天然存在的氨基酸序列的血清白蛋白，例如得自Swissprot登录号P02769，及其如本文所述的变体。术语“牛血清白蛋白”还包括全长牛血清白蛋白的片段或其变体，如本文所述。
已知白蛋白家族内存在多种蛋白质；一个非穷尽的列表示于下文表1中。该列表指明了包括成熟蛋白和前导序列的序列的全长(除非另有指明)。
所述白蛋白可以包含源自下述血清白蛋白之一的白蛋白的序列，所述血清白蛋白来自犬(例如参见Swissprot登录号P49822-1)、猪(例如参见Swissprot登录号P08835-1)、山羊(例如可从Sigma按产品号A2514或A4164获得)、猫(例如参见Swissprot登录号P49064-1)、鸡(例如参见Swissprot登录号P19121-1)、卵清蛋白(例如鸡卵清蛋白)(例如参见Swissprot登录号P01012-1)、火鸡卵清蛋白(例如参见Swissprot登录号O73860-1)、驴(例如参见Swissprot登录号Q5XLE4-1)、豚鼠(例如参见Swissprot登录号Q6WDN9-1)、仓鼠(参见DeMarco等(2007).International Journal for Parasitology 37(11)：1201-1208)、马(例如参见Swissprot登录号P35747-1)、恒河猴(例如参见Swissprot登录号Q28522-1)、小鼠(例如参见Swissprot登录号P07724-1)、鸽子(例如如由Khan等，2002，Int.J.Biol.Macromol.，30(3-4)，171-8定义)、兔(例如参见Swissprot登录号P49065-1)、大鼠(例如参见Swissprot登录号P02770-1)和绵羊(例如参见Swissprot登录号P14639-1)，并包括其变体和片段，如本文所述。
所述白蛋白可以包含白蛋白如血清白蛋白或卵清蛋白的序列，例如下文表1中所示的那些，并包括它们的变体和片段，如本文所述。
表1：来自不同物种的白蛋白
Figure BDA0000082557350000271
Figure BDA0000082557350000291
Figure BDA0000082557350000301
SA：血清白蛋白，SA-2：血清白蛋白-2；OA：卵清蛋白；NL：无前导序列
白蛋白的许多天然存在的变体形式是已知的。许多在(1996，All About白Albumin：Biochemistry，Genetics and Medical Applications，Academic Press，Inc.，San Diego，California，p.170-181)中描述。如本文定义的变体可以是这些天然存在的突变体之一，如Minchiotti等(2008).Hum Mutat 29(8)：1007-16.和http://www.uniprot.org/uniprot/P02768中描述的。
“变体白蛋白”是指其中在一个或多个位置进行了保守或非保守的氨基酸插入、缺失或取代的白蛋白蛋白质，只要这些改变导致至少一种基本性质没有显著改变的白蛋白蛋白质，所述基本性质例如结合活性(例如与胆红素或脂肪酸如长链脂肪酸，例如油酸(C18:1)、棕榈酸(C16:0)、亚油酸(C18:2)、硬脂酸(C18:0)、花生四烯酸(C20:4)和/或棕榈油酸(C16:1)的结合的类型和比活性)、渗透性(渗透压、胶体渗透压)、在特定pH范围内的表现(pH稳定性)。“显著”在此处上下文中意指本领域技术人员会认为所述变体的性质仍可能不同，但与原始蛋白(例如衍生所述变体的蛋白质)的性质相比不会不明显。这些特征可以用作本发明中的额外选择标准。
通常白蛋白变体会与天然存在的白蛋白如SEQ ID No.1具有超过40％，通常至少50％，更通常至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，还更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选至少98％或更多的序列同一性。两个多肽之间的百分比序列同一性可以使用合适的计算机程序例如University of Wisconsin Genetic Computing Group的GAP程序来确定，并且应理解百分比同一性相对于已经以最优方式比对其序列的多肽来计算。或者，所述比对可以使用Clustal W程序或Clustal V程序来进行，并因此允许计算多重比对的序列之间的％同源性和/或计算两个成对比对的序列之间的％同一性。使用的参数可以如下：
快速成对比对参数：K-元组(词)大小；1，窗口大小：5，缺口罚分；3，顶部对角线数；5。计分方法：x百分比。多重比对参数：缺口产生罚分；10，缺口延伸罚分；0.05。计分矩阵：BLOSUM
Custal W：成对比对参数：“Slow-Accurate(慢速-精确)”，缺口罚分：10，缺口长度：0.1，蛋白质权重矩阵：Gonnet 250，DNA权重矩阵：IUB。多重比对参数：缺口罚分10.00，缺口长度罚分0.20，延迟发散序列(DelayDivergent Seqs)(％)30，DNA过度权重0.50，蛋白质权重矩阵＝Gonnet系列，DNA权重矩阵＝IUB。
Clustal V：成对比对参数：K元组：1，缺口罚分：3，窗口：5，对角线：5；多重比对参数：缺口罚分10，缺口长度罚分10。
保守取代
如用于本文，术语“保守”氨基酸取代是指在同一组内进行的取代，并且所述取代通常不显著影响蛋白质功能。“保守取代”意图指组合如Gly，Ala；Val，Ile，Leu；Asp，Glu；Asn，Gln；Ser，Thr；Lys，Arg；和Phe，Tyr。这些变体可以通过本领域公知的技术来制备，如通过1981年11月24日授予Stevens的美国专利No 4,302,386中公开的定点诱变来进行，将该专利通过提述并入本文。
在一个实施方案中，可以将图4的维恩图用于确定保守氨基酸取代：使用图4，可以计算保守突变得分(范围从0至5)。0分为最高的保守性，其对于半胱氨酸仅指派给用另一半胱氨酸残基取代半胱氨酸残基。对于从任何其他氨基酸成为半胱氨酸的变化，该得分可为1、2、3、4、5。1分是比2、3、4或5分更保守的取代。5分指派给取代的氨基酸和半胱氨酸之间最低的保守性。从图4作为从半胱氨酸到适当氨基酸所跨过的边界(即线条)数来计算0至5的得分。由此对于半胱氨酸的得分为0，因为不用跨过边界。类似地，天冬氨酸(D)的得分为3，因为跨过3条边界。
将20种不同氨基酸的保守突变得分(参考图4)定义为(使用氨基酸的单字母编码)：A＝1，C＝0，D＝3，E＝4，F＝4，G＝2，H＝5，I＝4，K＝4，L＝4，M＝3，N＝2，P＝3，Q＝3，R＝5，S＝1，T＝1，V＝3，W＝3，Y＝3。参考图1、5A、5B、5C和5D，在标有“成为半胱氨酸的保守突变”的列中为每个氨基酸残基给出这些得分。使用得分为3或更低的保守突变得分残基，即天冬氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸是优选的，因为它们与半胱氨酸相对保守。更优选的是具有2或更低的得分的那些氨基酸，即甘氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸。最优选的是得分为1的那些，即丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸。类似地，使用图4的保守突变得分系统，得分为4或更高的残基，即谷氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、组氨酸和精氨酸较不优选并且可能根本不优选。
可供选择地，或额外地，“保守”氨基酸取代是指在同一组内进行的取代，如一下组内：碱性氨基酸组(如精氨酸、赖氨酸、组氨酸)，酸性氨基酸组(如谷氨酸和天冬氨酸)，极性氨基酸组(如谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)，芳族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)，和小氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸)。
例如，在SEQ ID No 1中对丙氨酸-2的保守取代可以包括甘氨酸或丝氨酸。非保守取代涵盖将一个组中的氨基酸用另一个组中的氨基酸取代。例如，非保守取代可以包括用极性氨基酸取代疏水氨基酸。
片段
术语“片段”如用于本文包括全长白蛋白或其变体的任何片段，只要至少一种基本性质，例如结合活性(类型和比活性，例如与胆红素结合)，渗透性(渗透压，胶体渗透压)，在特定pH范围中的表现(pH-稳定性)没有显著变化。“显著”在此处上下文中意指本领域技术人员会认为所述变体的性质仍可能不同，但与原始蛋白的性质相比不会不明显。片段通常会为至少50个氨基酸长。片段可以包含白蛋白的至少一个完整的亚结构域。已经将HSA的结构域作为重组蛋白表达(Dockal等，1999，J.Biol.Chem.，274，29303-29310)，其中将结构域I定义为由氨基酸1-197组成，将结构域II定义为由氨基酸189-385组成，并将结构域III定义为由氨基酸381-585组成。所述结构域存在部分重叠，因为在结构域I和II之间，以及在结构域II和III之间存在延伸的α螺旋结构(h10-h1)(Peters，1996，op.cit.，表2-4)。HSA还包含六个亚结构域(亚结构域IA、IB、IIA、IIB、IIIA和IIIB)。亚结构域IA包含氨基酸6-105，亚结构域IB包含氨基酸120-177，亚结构域IIA包含氨基酸200-291，亚结构域IIB包含氨基酸316-369，亚结构域IIIA包含氨基酸392-491，且亚结构域IIIB包含氨基酸512-583。片段可以包含如上定义的一个或多个结构域或亚结构域的全部或部分，或这些结构域和/或亚结构域的任意组合。片段可以包含白蛋白的或白蛋白结构域的至少50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99％，或由白蛋白的或白蛋白结构域的至少50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99％组成。
另外，可以使用包含上述中任一的单一或多重异源融合物；或与白蛋白的单一或多重异源融合物，或这些中任何的变体或片段。这些融合物包括白蛋白N末端融合物，白蛋白C末端融合物和N末端和C末端白蛋白共融合物，如WO 01/79271中所示例。
同源性
图2和3显示多种白蛋白家族蛋白质与HSA(SEQ ID NO：1)(以‘P02768’标识)的比对。所述蛋白质序列包括白蛋白前导序列。这些比对可以用于鉴定对应于如上所述选择的HSA中存在的保守区和氨基酸残基的保守区和氨基酸残基。一种或两种比对也可以用于为白蛋白序列中的氨基酸残基指派同源性得分。
这样的方法的实例为DNASTAR Inc.基于Methods in Enzymology，Vol.183：pp.626-645中的Hein，J.J.(1990)“Unified approach to alignment andphylogenies.”开发的MegAlign程序(版本8.0.2)，是Lasergene套件的一部分。使用Jotun Hein方法和下述设置：缺口罚分＝11，缺口长度罚分＝3(用于多重比对)，以及K元组＝2(用于成对比对)，能够计算一系列百分比同一性值。或者，Clustal V方法和下述设置：缺口罚分＝10，缺口长度10(用于多重比对)，以及K元组＝1。缺口罚分＝3，窗口＝5和对角线＝5(用于成对比对)，能够计算一系列百分比同一性值。或者，Clustal W方法和下述设置：缺口罚分＝10，缺口长度罚分＝0.2，延迟发散＝30，DNA过度＝0.5，并使用用于蛋白质加权矩阵的GONNET系列和用于DNA加权矩阵的IUB(用于多重比对)，和慢速精确，缺口罚分＝10，缺口长度罚分＝0.1，并使用用于蛋白质加权矩阵的GONNET系列和用于DNA加权矩阵的IUB(用于成对比对)，能够计算一系列百分比同一性值。或者，可以使用Clustal V方法(见上文)。两个氨基酸序列的比对也可以通过使用来自EMBOSS软件包(http://emboss.org)版本2.8.0的Needle程序来确定。Needle程序执行在Needleman和Wunsch(1970)″A general method applicable to the search for similarities in the amino acidsequence of two proteins.″J.Mol.Biol.48，443-453中描述的全局比对算法。使用的取代矩阵为BLOSUM62，缺口开启罚分为10，且缺口延伸罚分为0.5。
图2显示使用基于Clustal W的MegAlign程序(版本8.0.2)编制的包括HSA(SEQ ID NO：1，在比对中标识为P02768)的十六种哺乳动物白蛋白家族蛋白质的比对。所述蛋白质序列包括白蛋白前导序列。每个序列标有其所来源的动物及其数据库登录号。
图3显示使用基于Clustal V的MegAlign程序(版本8.0.2)编制的包括HSA(SEQ ID NO：1，在比对中标识为P02768)的三十三种白蛋白家族(哺乳动物和非哺乳动物二者)蛋白质的比对。所述蛋白质序列包括白蛋白前导序列。
同源性可以参考图2和/或图3来测定。给定氨基酸序列和SEQ ID NO：1之间的同一性程度可以作为所述两个序列的比对中精确匹配数除以两个序列中较短者的长度来计算。结果以百分比同一性表示。精确匹配发生在两个序列在重叠中的相同位置具有相同氨基酸残基时。序列长度是序列中的氨基酸残基数。
相邻残基的保守性
此外，HSA的单独氨基酸残基可以根据它们与在同一位置处的其他白蛋白家族蛋白质的氨基酸残基的保守性来评级。图1，标以“比对1(Mamm.W(‘哺乳动物，Clustal W)”的列为SEQ ID No.1的每个位置给出同源性水平，如通过图2中给出的哺乳动物白蛋白的比对所计算的。可以计算同源性水平得分。一种为同源性水平评分的方法(将其用于本文)是通过使用MegAlign程序(版本8.0.2)提供的直方图的强度(strength)计算(范围从0至100％)；确定了六个同源性水平，其中最高＝100％，以20％的间隔逐渐降低至最低(0％)，并通过图2中条形的高度显示。100分为最高保守性，并且表明将来自人血清白蛋白的序列与其他哺乳动物白蛋白序列相比时，在该残基处没有变化，而0分表明所比对序列之间最低的保守水平。
类似地，当使用Clustal V比对多种白蛋白(包括非哺乳动物白蛋白)时，使用由Megalign提供的直方图的强度计算HSA中每个氨基酸残基的同源性水平得分(图1，标以‘比对2(Var.Sps.V(‘多个物种(即哺乳动物和非哺乳动物)，Clustal V’的列))。本领域技术人员会理解可以使用一系列不同白蛋白序列和比对算法来计算同源性水平得分。
当使用同源性得分(如参考图2和3的比对描述的那些)来鉴定用于本发明的候选残基时，优选的残基包括非高度保守的那些(例如，具有低于40的得分的那些，更优选低于20并且最优选0)是优选的，而具有较高同源性水平(例如，具有超过40、超过60、超过80和最优选100的得分的那些)的那些较不优选。
当将HSA与哺乳动物白蛋白比对(图1，标以‘Adj.100％’s的列(比对1))时，根据相邻残基是否高度(100％)保守为HSA(SEQ ID No.1)中的每个氨基酸残基评分。这是因为如果氨基酸在高度保守的结构域内，其可能对于所述蛋白质的功能或结构是重要的，因此进行破坏可能是不理想的。在图1中，0分表明所述残基不与任何当将HSA与哺乳动物白蛋白比对时具有100％同源性的残基相邻(参考图2的比对)；1分表明所述残基与当将HSA与哺乳动物白蛋白比对时具有100％同源性的一个残基相邻；2分表明所述残基与当将HSA与哺乳动物白蛋白比对时具有100％同源性的两个残基相邻。具有1分或1分的残基是优选的。具有0分的残基是最优选的。
例如，优选使用本发明的方法不选择具有2分的氨基酸残基(如缬氨酸-7(V7))，因为推测这些氨基酸残基存在于不太可能接受成为另一氨基酸的突变的高同源性区域中。类似地，苯丙氨酸-11(F11)与一个100％保守的残基相邻，在保守残基区域中，并且与没有相邻的100％保守残基的残基(如丙氨酸-2(A2))相比较不优选。
依照本发明，额外的信息如优选的插入、缺失或取代位点也可以通过比对分析获得。例如，小鼠白蛋白含有36个半胱氨酸残基，参与二硫键合的全部半胱氨酸都存在(因与HSA的同源性)，如半胱氨酸-34一样，然而一个半胱氨酸残基存在于成熟小鼠蛋白而非其他哺乳动物白蛋白序列上的579处，因此硫代白蛋白变体多肽S579C可能是优选的，因为其与其他哺乳动物白蛋白缺乏同源性，提示其可能对于这种白蛋白的结构和/或功能不是特别重要。
此外，使用多种哺乳动物白蛋白家族和Clustal W的比对(图2)显示，与其他哺乳动物白蛋白相比，沙鼠白蛋白在丙氨酸-2(A2)和组氨酸-3(H3)之间具有额外的丙氨酸残基，表明在残基2(例如SEQ ID No.1的A2)之后和残基3(例如SEQ ID No.1的H3)之前插入半胱氨酸残基是优选的。
与其他哺乳动物白蛋白相比，豚鼠白蛋白在半胱氨酸-34(C34)处具有丝氨酸残基。在需要缺失半胱氨酸-34处的游离巯基的实例中，突变如C34S可能是优选的。
大多数哺乳动物白蛋白序列(除了人血清白蛋白)具有长度小于或等于584个氨基酸的序列(包括前导序列小于或等于608个氨基酸)。使用图2中的比对，人血清白蛋白上存在的额外的氨基酸残基表现为在C末端，而在其他哺乳动物血清白蛋白序列中没有任何相近的(cognate)比对氨基酸残基。因此，含有G584C和缺失L585的硫代白蛋白变体可能是优选的。
许多白蛋白序列(牛、驴、山羊、马、绵羊、猪)的长度为583个氨基酸(包括前导序列为607个氨基酸)。使用图2中的比对，可见这些物种的白蛋白序列没有对应于R117(包括前导序列为R141)的残基，因此含有V116C和缺失R117的硫代白蛋白或含有缺失R117和P118C的硫代白蛋白可能是优选的。在这样的硫代白蛋白中，氨基酸序列的长度相对于SEQ ID No.1会减少。
图2中使用的比对和得出的结论具体而言是参照哺乳动物白蛋白和Clustal W，本领域技术人员会理解所述教导同样适用于白蛋白家族的其他成员也适用于其他可选的比对算法。
比对和同一性
所述白蛋白变体可以与SEQ ID NO：1具有至少40％同一性，特别是至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
同一性可以使用任何方法，如本文描述的那些方法来计算。
缀合
硫代白蛋白可以任选地与一种或多种缀合配偶体融合，例如通过遗传融合或化学融合。对于包含遗传融合的硫代白蛋白，该融合可以在N末端或C末端或包含插入。
对于白蛋白的遗传融合，本领域技术人员也会理解任何其他基因或变体、或其任一的部分的开放阅读框可以用来作为供本发明使用的开放阅读框。例如，所述开放阅读框可以编码包含任何序列的蛋白质，其可以是天然蛋白(包括酶原)，或天然蛋白的变体，或片段(其可以是例如结构域)；或是完全合成的蛋白；或是不同蛋白(天然的或合成的)的单一或多重融合物。这些蛋白质可以得自但不限于WO 01/79258、WO 01/79271、WO 01/79442、WO 01/79443、WO 01/79444和WO 01/79480中提供的列表，或它们的变体或片段，将这些公开内容通过提述并入本文。尽管这些专利申请给出了在用于白蛋白的融合配偶体情况下的蛋白质的列表，但是本发明不限于此，并且就本发明而言，该处所列的任何蛋白质可以单独存在或作为白蛋白或任何其他蛋白或上述任一的片段或变体的融合配偶体，作为期望的多肽存在。白蛋白的化学融合(也称作缀合)的实例在Leger等(2004)Bioorg Med Chem Lett 14(17)：4395-8；和Thibaudeau等(2005).Bioconjug Chem 16(4)：1000-8中给出。
使用遗传或化学融合白蛋白的优势是促成融合的任一或全部分子相对于未融合的分子可具有改进的性质(Balan等(2006)Antivir Ther 11(1)：35-45)。白蛋白和白蛋白颗粒对于将药物和前药携带并递送至它们的作用位点也是重要的(Kratz，F.(2008)Journal of Controlled Release，132(3)，p.171-183)。融合和颗粒技术因改进的药代动力学性质如半衰期的延长而提供改进的剂量给药方案，并可以改进生物利用度和保护融合的缀合配偶体(例如生物活性分子)不被失活。
所述多肽可以展现修饰的(例如减少的)糖基化，例如，但不限于，减少的N-联糖基化或减少的O-联糖基化。白蛋白分子的N-联糖基化模式可以通过在任何或全部N、X或S/T位置处添加/去除氨基酸糖基化共有序列如N-X-S/T来修饰。白蛋白多态性与N-联糖基化共存。白蛋白突变体可能具有再循环时间，由此突变体作为生物活性载体的功效得到改进。重组表达的蛋白质可能受到生产用宿主细胞的不合意的翻译后修饰。例如，SEQ ID No.1的白蛋白蛋白质序列不含任何用于N-连糖基化的位点并且从未报道其在自然界中是经O-联糖基化修饰的。然而，已经发现在许多酵母物种中产生的重组人白蛋白(“rHA”)可通过O-联糖基化修饰，通常涉及甘露糖。甘露糖基化的白蛋白能够与凝集素刀豆蛋白A(Concanavalin A)结合。通过酵母产生的甘露糖基化白蛋白的量能够通过使用一种或多种PMT基因缺陷的酵母菌株来降低(WO 94/04687)。最常规的实现这一目的的方式是创造在其基因组中有缺陷的酵母从而产生Pmt蛋白质之一的降低的水平。例如，可能在编码序列或调节区中(或在调节PMT基因之一表达的另一基因中)存在缺失、插入或转座，从而产生很少的Pmt蛋白或不产生Pmt蛋白。或者，可以转化所述酵母以产生抗Pmt剂，如抗Pmt抗体。
如果使用酿酒酵母以外的酵母，破坏等同于酿酒酵母PMT基因的一种或多种基因也是有益的，例如，在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)中。从酿酒酵母分离的PMT1(或任何其他PMT基因)的序列可以用于在其他真菌物种中鉴定或破坏编码类似酶活性的基因。对乳酸克鲁维酵母PMT1同源物的克隆记载于WO 94/04687。
“从培养的宿主细胞或培养基纯化由此表达的异源蛋白”的步骤任选包括细胞固定、细胞分离和/或细胞破碎，但总是包含至少一个不同于细胞固定、分离和/或破碎中一个或多个步骤的其他纯化步骤。
细胞固定技术，如使用藻酸钙珠封装细胞是本领域熟知的。类似地，细胞分离技术，如离心、过滤(例如交叉流过滤、膨胀床层析等)是本领域熟知的。类似地，细胞破碎的方法，包括珠磨、声处理、暴露于酶(enzymatic exposure)等是本领域熟知的。
所述至少一个其他纯化步骤可以是任何其他本领域已知的适合于蛋白纯化的步骤。例如用于回收重组表达的白蛋白的纯化技术已经公开于：WO92/04367，基质衍生染料的去除；EP 464590，酵母衍生着色剂的去除；EP 319067，白蛋白的碱性沉淀和后续应用于亲脂相；和WO 96/37515、US 5728553和WO 00/44772，其描述了完整的纯化过程，将全部这些通过提述并入本文。
能缀合的白蛋白(“硫代白蛋白”)的产生
硫代白蛋白或硫代白蛋白和另外一个蛋白质或多个蛋白质的融合物能够通过本领域已知的方法制备(Sanker，(2004)，Genetic Eng.News，24，22-28，Schmidt，(2004)，Appl.Microbiol.Biotechnol.，65，363-372)，包括但不限于通过转化或瞬时表达而在来自细胞系如CHO(及其变体)、NS0、BHK、HEK293、Vero或PERC6细胞的哺乳动物细胞培养中表达(Mason等，(2004)，ProteinExpr.Purif.，36，318-326；Mason等，(2002)，Biochemistry，41，9448-9454)；昆虫细胞培养(Lim等，(2004)Biotechnol.Prog.，20，1192-1197)；来自像青萍(Lemna)或稻(Oryza sativa)这样的植物的植物细胞培养；转基因动物(Dyck等，(2003)Trends in Biotechnology，21，394-399)；转基因植物(Ma等，(2003)Nature Reviews Genetics，4，794-805)；革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌如芽孢杆菌属和大肠杆菌(Steinlein和Ikeda，(1993)，Enzyme Microb.Technol.，15，193-199)；丝状真菌包括但不限于曲霉属物种(Aspergillus spp)(EP 238023、US 5,364,770、US 5,578,463、EP184438、EP284603、WO 2000/056900、WO9614413)、木霉属物种(Trichoderma spp)和镰孢属物种(Fusarium spp)(Navalainen等，(2005)，Trends in Biotechnology，23，468-473)。
所述宿主细胞可以是任何类型的细胞。所述宿主细胞可以或可以不是动物(如哺乳动物、鸟类、昆虫等)、植物(如稻)、真菌或细菌细胞。细菌和真菌(如酵母)宿主细胞可以是或可以不是优选的。
典型的原核载体质粒是：pUC18、pUC19、pBR322和pBR329，可从BioradLaboratories(Richmond，CA，USA)获得；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540和pRIT5，可从Pharmacia(Piscataway、NJ、USA)获得；pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A，可从Stratagene Cloning Systems(La Jolla、CA 92037、USA)获得。
典型哺乳动物细胞载体质粒是pSVL，其可从Pharmacia(Piscataway，NJ，USA)获得。这种载体使用SV40晚期启动子来驱动克隆基因的表达，在T抗原产生细胞(如COS-1细胞)中发现了最高的表达水平。诱导型哺乳动物表达载体的实例是pMSG，也可从Pharmacia(Piscataway，NJ，USA)获得。这种载体使用小鼠乳腺瘤病毒长末端重复序列的糖皮质激素诱导型启动子来驱动克隆基因的表达。
可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建含有编码序列和例如适当的转录或翻译调控(序列)的表达载体。一种这样的方法涉及通过粘端的连接。可以通过合适限制酶的作用在DNA片段和载体上产生相容的粘端。这些末端通过互补碱基配对会迅速退火，而余下的缺口能够通过DNA连接酶的作用闭合。
另一方法使用合成的双链寡核苷酸接头和适配体。通过去除突出3’末端和填充凹陷3’末端的噬菌体T4DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I产生具有平端的DNA片段。可以将含有用于限定的限制酶的识别序列的合成接头和平末端双链DNA片段(piece)通过T4DNA连接酶与平端DNA片段连接。然后将它们用合适的限制酶消化以产生粘端并与具有相容末端的表达载体连接。适配体也是化学合成的DNA片段，其含有一个用于连接的平端，但是其也具有一个预先形成的粘端。或者，可以在存在或不存在一种或多种含有粘端的合成双链寡核苷酸的情况下通过DNA连接酶的作用将一个或多个DNA片段连接在一起。
含有多种限制性内切核酸酶位点的合成接头是可从多种渠道，包括Sigma-Genosys Ltd，London Road，Pampisford，Cambridge，United Kingdom以商业方法获得的。
硫代白蛋白或硫代白蛋白和另外一个蛋白质或多个蛋白质的融合物可以从核苷酸序列表达，所述核苷酸序列可以或可以不含一个或多个内含子。此外，所述核苷酸序列可以或可以不通过本领域已知的方法针对宿主进行密码子优化。
所述硫代白蛋白或硫代白蛋白和另外一个蛋白质或多个蛋白质的融合物可作为具有减少的N-联糖基化的变体表达。相应地，在人血清白蛋白(HSA)的情况下，使用涉及蛋白质O-糖基化的一种或多种蛋白质甘露糖基转移酶缺陷的酵母(例如通过破坏所述基因编码序列)可能特别有利。重组表达的蛋白质可能受到生产用宿主细胞的不合意的翻译后修饰。甘露糖基化的白蛋白将能够与凝集素刀豆蛋白A结合。通过酵母产生的甘露糖基化白蛋白的量能够通过使用一种或多种PMT基因缺陷的酵母菌株来降低(WO 94/04687)。实现这一目的的最方便的方式是创造在其基因组中有缺陷的酵母从而产生Pmt蛋白质之一的降低的水平。例如，可以或可以不在编码序列或调节区中(或在调节PMT基因之一表达的另一基因中)存在缺失、插入或转座，从而产生很少的Pmt蛋白或不产生Pmt蛋白。或者，可以转化所述酵母以产生抗Pmt剂，如抗Pmt抗体。或者，可以将所述酵母在抑制PMT基因之一的活性的化合物存在下培养(Duffy等，“Inhibition of protein mannosyltransferase 1(PMT1)activity in the pathogenic yeast Candida albicans”，InternationalConference on Molecular Mechanisms of Fungal Cell Wall Biogenesis，26-31August 2001，Monte Verita，Switzerland，Poster Abstract P38；海报摘要可参见http://www.micro.biol.ethz.ch/cellwall/)。如果使用酿酒酵母以外的酵母，破坏等同于酿酒酵母PMT基因的一种或多种基因也是有益的，例如，在巴斯德毕赤酵母或乳酸克鲁维酵母中。从酿酒酵母分离的PMT1(或任何其他PMT基因)的序列可以用于在其他真菌物种中鉴定或破坏编码类似酶活性的基因。对乳酸克鲁维酵母的PMT1同源物的克隆描述于WO 94/04687。
所述酵母也可以或可以不具有HSP150和/或YAP3基因的缺失，如分别在WO 95/33833和WO 95/23857中教导的。
HSA变体可以通过重组表达和分泌产生。在表达系统(即宿主细胞)是酵母(如酿酒酵母)的情况下，合适的用于酿酒酵母的启动子包括那些与如下基因相关的启动子：PGK1基因、GAL1或GAL10基因、TEF1、TEF2、PYK1、PMA1、CYC1、PHO5、TRP1、ADH1、ADH2、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡糖异构酶、葡糖激酶、α-交配因子信息素、a-交配因子信息素的基因、PRB1启动子、PRA1启动子、GPD1启动子和杂合启动子(涉及5′调节区的部分与其他启动子的5′调节区的部分或与上游活性位点的杂合体)(例如EP-A-258067的启动子)。
合适的转录终止序列是本领域熟知的。在宿主细胞是真核的情况下，转录终止信号优选源自真核基因的3′侧翼序列，其含有用于转录终止和聚腺苷酸化的合适信号。例如，合适的3′侧翼序列可以是与所用的表达调控序列天然连接的基因的那些，即可对应于启动子。或者，它们可能是不同的。在这种情况下，并且在宿主是酵母，优选酿酒酵母的情况下，则酿酒酵母ADH1、ADH2、CYC1或PGK1基因的终止信号是优选的。
可能有益的是，编码所述包含白蛋白突变体的序列的重组蛋白的基因的启动子和开放阅读框的侧翼为转录终止序列，从而使所述转录终止序列同时位于所述启动子和开放阅读框的上游和下游，从而防止转录通读至任何相邻基因中，如2μm基因，反之亦然。
在一个实施方案中，在酵母如酿酒酵母中有利的调节序列包括：酵母启动子(例如酿酒酵母PRB1启动子)，如EP 431 880中所教导的；和转录终止子，优选来自酵母属ADH1的终止子，如EP 60 057中所教导的。
可能有益的是非编码区并入超过一个编码转录终止密码子如UAA、UAG或UGA的DNA序列，从而最小化翻译通读并由此避免延长的、非天然的融合蛋白的产生。翻译终止密码子UAA是优选的。
在一个优选的实施方案中，分泌了包含白蛋白突变体序列的重组蛋白。在这种情况下，可以将编码分泌前导序列的序列包括在开放阅读框中。因此，根据本发明的多核苷酸可包含与编码分泌前导序列的多核苷酸序列可操作地连接的编码包含白蛋白突变体序列的重组蛋白的序列。前导序列通常，但不必然，位于ORF的原始翻译产物的N末端，并且通常，尽管不是必然，在分泌过程中切割所述蛋白质以产生“成熟”蛋白。由此，在一个实施方案中，术语“可操作地连接的”在前导序列的语境中包括编码包含白蛋白突变体序列的重组蛋白的序列在其5’端并且符合读框地与编码分泌前导序列的多核苷酸序列的3’端连接的含义。或者，编码分泌前导序列的多核苷酸序列可以符合读框地位于包含白蛋白突变体序列的重组蛋白的编码序列中，或在包含白蛋白突变体序列的重组蛋白的编码序列的3’端处。
已经使用或开发了多种天然或人工多肽前导序列(也称为分泌前区和前/原区)用于从宿主细胞分泌蛋白。前导序列将新生蛋白指向将蛋白质从细胞输出至周围培养基或在一些情况下至周质空间的细胞机构。
对于真核物种(如酵母酿酒酵母、接合酵母属(Zygosaccharomyces)物种、乳酸克鲁维酵母和巴斯德毕赤酵母)中蛋白质的产生，可以使用分泌前导序列。这可以包含信号(前)序列或前原前导序列。已知信号序列在它们的氨基酸序列中是异源的(Nothwehr和Gordon 1990，Bioessays 12，479-484，or Gierasch 1989，Biochemistry 28，p923-930)。实质上，信号序列通常位于N末端，具有碱性n区、疏水性h区和极性c区。只要保留这个结构，信号序列就会工作，而与氨基酸组成无关。它们的效率如何，即分泌多少成熟蛋白，依赖于氨基酸序列。相应地，术语“信号肽”应理解为意指在性质上主要为疏水性的并且作为在酵母中表达的胞外蛋白前体形式的N末端序列存在的前序列。信号肽的功能是为了使表达的蛋白质能够分泌进入内质网。信号肽常常在这个过程中被切除。信号肽对于产生所述蛋白质的酵母生物可以是同源或异源的。已知前导序列包括来自酿酒酵母酸性磷酸酶蛋白(Pho5p)(参见EP 366 400)、转化酶蛋白(Suc2p)(参见Smith等(1985)Science，229，1219-1224)和热激蛋白-150(Hsp150p)(参见WO 95/33833)的那些。此外，已经使用过来自酿酒酵母交配因子α-1蛋白(MFα-1)和来自人溶菌酶和人血清白蛋白(HSA)蛋白的前导序列，特别是(但不限于)已经将后者用于分泌人白蛋白。WO 90/01063公开了MFα-1和HSA前导序列(也称作融合前导序列(FL))的融合物。此外，天然白蛋白前导序列可以或可以不用于指导包含白蛋白突变体序列的重组蛋白的分泌。
本领域技术人员会理解，可以使用任何合适的质粒，如着丝粒质粒。实施例提供了用于转化本发明的酵母宿主细胞的合适质粒(基于着丝粒YCplac33的载体)。或者，可以使用任何其他合适的质粒，如酵母相容性基于2μm的质粒。
可以将从一种酵母类型获得的质粒保持在其他酵母类型中(Irie等，1991，Gene，108(1)，139-144；Irie等，1991，Mol.Gen.Genet.，225(2)，257-265)。例如，可以将来自鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)的pSR1保持在酿酒酵母中。在一个实施方案中，所述质粒可以是或可以不是2μm家族质粒，并且所述宿主细胞与所用的2μm家族质粒会是相容的(参见下文对以下质粒的完整描述)。例如当质粒基于pSR1、pSB3或pSB4的情况下，则合适的酵母细胞是鲁氏接合酵母；当质粒基于pSB1或pSB2的情况下，则合适的酵母细胞是拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailli)；当质粒基于pSM1的情况下，则合适的酵母细胞是发酵接合酵母(Zygosaccharomyces fermentati)；当质粒基于pKD1的情况下，则合适的酵母细胞是果蝇克鲁维酵母(Kluyveromycesdrosophilarum)；当质粒基于pPM1的情况下，则合适的酵母细胞是膜醭毕赤氏酵母(Pichia membranaefaciens)；当质粒基于2μm质粒的情况下，则合适的酵母细胞是酿酒酵母或卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)。由此，所述酵母可以基于2μm质粒并且所述酵母细胞可以是酿酒酵母。2μm家族质粒可以说是“基于”天然存在的质粒，如果其包含具有源自该天然存在的质粒的序列的基因FLP、REP1和REP2中的一种、两种或优选三种。
有用的酵母附加型质粒载体是pRS403-406和pRS413-416，并且通常可以从Stratagene Cloning Systems(La Jolla，CA 92037，USA)获得，YEp24(Botstein，D.，等(1979)Gene 8，17-24)和YEplac122，YEplac195和YEplac181(Gietz，R.D.和Sugino.A.(1988)Gene 74，527-534)。其他酵母质粒记载于WO90/01063和EP 424 117，以及EP-A-286 424和WO2005061719的崩解载体(disintegration vector)。质粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406是酵母整合质粒(YIp)并且纳入了酵母选择标记HIS3、TRP1、LEU2和URA3，如YIplac204、YIplac211和YIplac128(Gietz、R.D.和Sugino.A.(1988)Gene 74、527-534)。质粒pRS413-416是酵母着丝粒质粒(YCp)，如YCplac22、YCplac33和YCplac111(Gietz，R.D.和Sugino.A.(1988)Gene 74，527-534)。
在一种或多种选择的辅助(也称作“伴侣”)蛋白和/或蛋白产物由质粒携带的多核苷酸序列编码时，可以针对与所用质粒类型的相容性选择宿主细胞类型。这些质粒在WO2005061719中公开。优选的辅助蛋白包括PDI1、AHA1、ATP11、CCT2、CCT3、CCT4、CCT5、CCT6、CCT7、CCT8、CNS1、CPR3、CPR6、DER1、DER3、DOA4、ERO1、EUG1、ERV2、EPS1、FKB2、FMO1、HCH1、HRD3、HSP10、HSP12、HSP104、HSP26、HSP30、HSP42、HSP60、HSP78、HSP82、KAR2、JEM1、MDJ1、MDJ2、MPD1、MPD2、PDI1、PFD1、ABC1、APJ1、ATP11、ATP12、BTT1、CDC37、CPR7、HSC82、KAR2、LHS1、MGE1、MRS11、NOB1、ECM10、SCJ1、SSA1、SSA2、SSA3、SSA4、SSB1、SSB2、SSC1、SSE2、SIL1、SLS1、ORM1、ORM2、PER1、PTC2、PSE1、UBC7、UBI4和HAC1或截短的无内含子HAC1(Valkonen等2003，AppliedEnviron.Micro.，69，2065)。这些辅助蛋白在WO 2005/061718、WO2006/067511和WO 2006/136831中公开。
可以将本文限定的质粒通过标准技术引入宿主。关于原核宿主细胞的转化，参见，例如，Cohen等(1972)Proc.Natl.Acdd.Sci.USA 69，2110和Sambrook等(2001)Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第3版Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY。酵母细胞的转化记载于Sherman等(1986)Methods In Yeast Genetics，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY。Beggs(1978)Nature 275，104-109的方法也是有用的。用于酿酒酵母的转化的方法在EP 251744、EP 258067和WO 90/01063中概括性地教导，将它们全部通过提述并入本文。关于脊椎动物细胞，在转染这些细胞中有用的试剂，例如磷酸钙和DEAE-右旋糖酐或脂质体配制物，可从Stratagene Cloning Systems或Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD 20877，USA获得。
电穿孔也可用于转化细胞，并且在本领域熟知用于转化真菌(包括酵母)细胞、植物细胞、细菌细胞和动物(包括脊椎动物)细胞。用于通过电穿孔转化酵母的方法在Becker & Guarente(1990)Methods Enzymol.194，182中公开。
概括而言，所述质粒不会转化所述宿主中的全部，因此会有必要选择经转化的宿主细胞。由此，质粒可以包含选择标记，包括但不限于细菌选择标记和/或酵母选择标记。典型的细菌选择标记是β-内酰胺酶基因，尽管本领域已知许多其他选择标记。典型的酵母选择标记包括LEU2、TRP1、HIS3、HIS4、URA3、URA5、SFA1、ADE2、MET15、LYS5、LYS2、ILV2、FBA1、PSE1、PDI1和PGK1。本领域技术人员会理解任何其染色体缺失或失活导致不能存活的宿主的基因，即所谓的必需基因，可以用作选择标记，如果在质粒上提供功能基因，如对pgk1酵母菌株中的PGK1所述(Piper和Curran，1990，Curr.Genet.17，119)。合适的关键基因可以在Stanford Genome Database(SGD)(斯坦福基因组数据库)，(http:://db.yeastgenome.org)中找到。任何在缺失或失活时不产生营养缺陷(生物合成)需求的关键基因产物(例如PDI1、PSE1、PGK1或FBA1)可用作宿主细胞中质粒上的选择标记，所述宿主细胞在该质粒不存在时无法产生该基因产物，以实现增加的质粒稳定性而没有要求将该细胞在特定选择条件下培养的缺点。“营养缺陷(生物合成)需求”包括能够通过添加或修饰生长培养基来补足的缺陷。因此，在本申请的上下文中优选的“关键标记基因”是那些当在宿主细胞中缺失或失活时，导致无法通过添加或修饰生长培养基来补足的缺陷的基因。此外，质粒可以包含超过一种选择标记。
可以将经转化的宿主细胞培养足够的时间并且在本领域技术人员已知的合适的条件下，并且考虑到本文公开的教导，以允许辅助蛋白和所选蛋白产物的表达。
所述培养基可以是非选择性的或者对质粒的保留设有选择压力。
用于培养原核宿主细胞如大肠杆菌和真核宿主细胞如哺乳动物细胞的方法是本领域熟知的。用于培养酵母的方法在EP 330451和EP 361991中概括性地教导。
如此产生的所选蛋白质产物可以存在于胞内，或者如果分泌的话，存在于培养基和/或宿主细胞的周质空间中。
多肽的制备
“从培养的宿主细胞、重组生物或培养基纯化如此表达的所选蛋白产物”的步骤任选地包括细胞固定、细胞分离和/或细胞破碎，但总是包含至少一个不同于细胞固定、分离和/或破碎中一个或多个步骤的其他纯化步骤。
本发明的硫代白蛋白可以通过任何已经发现可用于纯化这些蛋白的技术从培养基中纯化。类似地，细胞分离技术，如离心、过滤(例如交叉流过滤、膨胀床层析等)是本领域熟知的。类似地，细胞破碎的方法，包括球磨、声处理、暴露于酶等是本领域熟知的。
所述“至少一个其他纯化步骤”可以是任何其他本领域已知的适合于蛋白纯化的步骤。例如用于回收重组表达的白蛋白的纯化技术已经公开于：WO 92/04367，基质衍生染料的去除；EP 464590，酵母衍生色素的去除；EP 319067，白蛋白的碱性沉淀和后续用于亲脂相的应用；和WO 96/37515、US 5728553和WO 00/44772，其描述了完整的纯化过程，将全部这些通过提述并入本文。合适的方法包括硫酸铵或乙醇沉淀，酸或溶剂提取，阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水相互作用层析，亲和层析，羟磷灰石层析，凝集素层析，浓缩，稀释，pH调节，透析，超滤，高效液相层析(“HPLC”)，反相HPLC，电导率调节等。
所述多肽可以纯化至商业上或工业上可以接受的纯度水平。商业上或工业上可以接受的纯度水平包括提供其中其他物质(例如，一种或多种污染物)以低于50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.01％、0.001％、0.0001％、0.00001％或0.000001％的水平并且最优选以0％的水平存在的硫代白蛋白和/或硫代白蛋白缀合物。
商业上或工业上可以接受的纯度水平可以通过相对粗制的纯化方法来获得，通过该方法将所选蛋白产物置于适合用于其预期目的的形式中。已经纯化至商业上或工业上可以接受的纯度水平的蛋白制备物在所选蛋白产物之外还可以包含例如细胞培养物组分如宿主细胞或自其衍生的碎片。或者，可以或可以不(如通过过滤或离心)去除高分子量组分(如宿主细胞或自其衍生的碎片)以获得包含所选蛋白产物和任选地在功能上可接受水平的源自细胞培养过程的低分子量污染物的组合物。
可以或可以不将所述蛋白质纯化以达到药学上可接受的纯度水平。如果蛋白质基本上不含热原并且能够用于其预期的目的并且因此以药学上有效量施用而不引起与所述蛋白质活性无关的医疗效果，则其具有药学上可接受的纯度水平。
所述硫代白蛋白和/或硫代白蛋白缀合物可以以至少10-4g.L-1、10-3g.L-1、0.01g.L-1、0.02g.L-1、0.03g.L-1、0.04g.L-1、0.05g.L-1、0.06g.L-1，0.07g.L-1、0.08g.L-1、0.09g.L-1、0.1g.L-1、0.2g.L-1、0.3g.L-1、0.4g.L-1、0.5g.L-1、0.6g.L-1、0.7g.L-1、0.8g.L-1、0.9g.L-1、1g.L-1、2g.L-1、3g.L-1、4g.L-1、5g.L-1、6g.L-1、7g.L-1、8g.L-1、9g.L-1、10g.L-1、15g.L-1、20g.L-1、25g.L-1、30g.L-1、40g.L-1，50g.L-1、60g.L-1、70g.L-1、80g.L-1、90g.L-1、100g.L-1、150g.L-1、200g.L-1、250g.L-1、300g.L-1、350g.L-1、400g.L-1、500g.L-1、600g.L-1、700g.L-1、800g.L-1、900g.L-1、1000g.L-1的浓度提供。
本发明的方法可以或可以不进一步包括将纯化的所选蛋白产物与载体或稀释剂一起配制并任选地将如此配制的蛋白质以单位剂量形式呈现的步骤。
尽管可以将通过本发明方法获得的在治疗上有用的蛋白质单独施用，优选将其作为药学配制剂与一种或多种可接受的载体或稀释剂一起呈现。所述载体或稀释剂必需是“可接受的”，意思是与想要的蛋白质相容。通常，所述载体或稀释剂会是水或盐水，其会是无菌且无热原的。
或者，本发明的方法可以或可以不进一步包括冻干如此纯化的所选蛋白产物的步骤。
硫代白蛋白或缀合物的配制
可以通过在“Protein Formulation and Delivery”，E.J.McNally(编)，由Marcel DekkerInc.New York出版，2000和“Rational Design of Stable ProteinFormulations-Theory and Practice”；J.F.Carpenter和M.C.Manning(编)Pharmaceutical Biotechnology Vol  13.Kluwer Academic/Plenum Publishers，New York 2002，Yazdi和Murphy，(1994)Cancer Research 54，6387-6394，Widera等，(2003)Pharmaceutical Research 20，1231-1238；Lee等，(2005)Arch.Pharm.Res.28，722-729中提供的策略来配制。配制方法的实例如下：
方法#1：在纯化之后，可以将本发明的含游离巯基的白蛋白变体多肽或缀合物储存在4℃、-20℃或-80℃在含有0.01M-0.2M NaCl的0.01M-0.1M磷酸盐缓冲盐水(pH 7.0-8.0)中。
方法#2：在纯化之后，可以将本发明的含游离巯基的白蛋白变体多肽或缀合物储存在4℃、-20℃或-80℃在含有0.01M-0.2M NaCl并含有10-20mg/L聚山梨酯80的0.01M-0.1M磷酸盐缓冲盐水(pH7.0-8.0)中。
方法#3：在纯化之后，可以将本发明的含游离巯基的白蛋白变体多肽或缀合物储存在4℃、-20℃或-80℃在0.01M-0.2M NaCl(pH 7.0-8.0)中。
方法#4：在纯化之后，可以将本发明的含游离巯基的白蛋白变体多肽或缀合物储存在4℃、-20℃或-80℃在含有10-20mg/L聚山梨酯80的0.01M-0.2M NaCl(pH7.0-8.0)中。
冷冻干燥配制剂
方法#5：在纯化之后，可以将本发明的含游离巯基的白蛋白变体多肽或缀合物相对于水透析、冷冻干燥并储存在4℃、-20℃或-80℃。
方法#6：在纯化之后，可以将本发明的含游离巯基的白蛋白变体多肽或缀合物相对于0.01M-0.2M NaCl(pH7.0-8.0)透析、冷冻干燥并储存在4℃、-20℃或-80℃。
纳米颗粒配制剂
可以将本发明的硫代白蛋白(和/或其缀合形式)用于产生纳米颗粒和/或封装(entrap)在纳米颗粒或脂质体内。
可以将本发明的硫代白蛋白与纳米颗粒和/或脂质体一起使用，和/或用于纳米颗粒和/或脂质体中，和/或作为纳米颗粒和/或脂质体使用。当前缀合策略的问题是同时保持所述缀合配偶体如(生物活性靶向性配体缀合物)的药理学和免疫学活性。有可能存在能用于与蛋白质缀合的蛋白质靶向性配体/生物活性模块(缀合配偶体)的最大数目，并且如果超过该值，所述靶向性配体不再保持其生物活性。优选地，所述缀合配偶体的生物活性不因与本发明白蛋白的缀合而降低。
可以使用脂质体和纳米颗粒来封装生物活性化合物。它们提供增强的药物(如生物活性化合物)递送，或靶细胞摄取，和/或降低游离生物活性物质对非靶器官的毒性的机制，其可导致增加的治疗指数和/或降低的副作用。另外，某些生物活性化合物(紫杉烷)的递送所需的许多基于溶剂的配制剂与毒性相关，这限制了能够提供给患者的最大剂量。脂质体和纳米颗粒递送对于这些生物活性化合物可能也是有利的，因为它们会允许递送更大量的所述生物活性化合物同时避免基于溶剂的配制剂的某些毒性(Hawkins等(2008)Advanced Drug Delivery Reviews，60，8，p876-885)。
用于将靶向性配体附接至脂质体和纳米颗粒的方法是本领域已知的(在Nobs等(2004)Journal of Pharmaceutical Sciences Vol 93 p1980-1992中综述)并且可以依照本发明使用。附接方法可以是非共价的或共价的。共价反应似乎更有利，因为共价联结比非共价方法更稳定。用于蛋白质、肽或药物与脂质体表面的共价或非共价附接的脂质是商业上可以获得的(例如Avanti PolarLipids Inc Alabaster，Alabama，USA)。存在3种主要的官能性4类型：通过二硫键或硫醚形式、酰胺键形式、或生物素/抗生蛋白链菌素结合的缀合，在本发明中可以使用这些中的任一。
已经描述了多种依赖于通过硫醚键将配体共价偶联至脂质体表面的方法，最常用马来酰亚胺与巯基的高效反应。通常加入脂质体并且可以在本发明中使用或与本发明一起使用的官能化的脂质锚包括但不限于含有马来酰亚胺的那些，如N-[4-(p-马来酰亚胺苯基)丁酰胺]-PE(N-MPB]-PE)或N-[4-(p-马来酰亚胺甲基)环己烷-羧酰胺)(MCC-PE)，其允许靶向性模块通过稳定的硫醚键的便利共价偶联(Martin & Papahadjopoulos(1982)J.Biol.Chem.257，286-288)。
方法#7：在纯化之后，可以将本发明的含游离巯基的白蛋白变体多肽或缀合物配制到依照已知的用于制备纳米颗粒的方法制备的纳米颗粒中，所述方法如WO 2004/071536 A1和WO 2008/007146 A1中公开的方法，将它们二者均通过提述并入本文。
类似地，用于纳米颗粒配制的材料，包括但不限于聚(乳酸)(PLA)、聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)和COOH-PLA是商业上可以获得的并且可以用马来酰亚胺或其他已知的化学试剂依照已知的关于纳米颗粒配制剂的文献来官能化。任何这些均可用于本发明中或与本发明一起使用。
另一用于将配体共价偶联至脂质体的便利方法涉及缀合两个巯基以形成二硫键；然而在血清中的还原性条件下，可优选更稳定的涉及一个游离巯基的缀合化学物质。化学物质如(PDP-PE)允许通过二硫键共价偶联。可以使用引入游离巯基或官能化接头的配体修饰。本发明的硫代白蛋白的优势在于不需要配体修饰。然而，配体修饰可以任选地在本发明之外额外使用。
巯基通常不存在于蛋白质中，或者不以足量存在或不存在于理想的位置。因此，大多数将一个或多个配体通过硫醚或二硫键共价偶联至脂质体需要使用异双官能交联剂(本文参照缀合描述)。一些异双官能交联剂(如SPDP和SATA)需要脱保护步骤。本发明的硫代白蛋白克服了对这一额外加工的需要。
可选地，可以将硫代白蛋白与脂质体或纳米颗粒通过其他本领域已知的化学方法缀合。例如，可以将硫代白蛋白通过酰胺键使用与配体的伯胺反应的具有胺或羧基官能团的官能化脂质锚(实例包括DSPE-PEG-COOH)附接。也可以使用伯胺和脂质体表面的直接交联。然后硫代白蛋白的一个或多个游离巯基可用于与另一缀合配偶体缀合。
缀合之后，缀合配偶体(例如生物活性分子)可以显示其活性(例如生物活性)的降低。本发明中描述的硫代白蛋白可以通过提供其中缀合配偶体相对于硫代白蛋白定位和/或朝向从而使所述缀合配偶体保留其未缀合时活性的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％的缀合物、纳米颗粒和/或脂质体而克服了这个问题。
缀合配偶体
术语“缀合配偶体”包括生物活性剂、显像剂、诊断剂、造影剂和治疗性化合物如化疗药物和放射药物。本发明的硫代白蛋白可以与一种或多种缀合配偶体缀合。
显像剂、诊断性化合物、造影剂和治疗性化合物
诊断剂、显像剂和生物“造影”剂的使用是本领域公知的。诊断剂是任何作为诊断测试的一部分使用的药物产品(即与评估所述测试结果所需的设备和方法一起)。诊断剂可以体内、离体(ex vivo)或体外使用。
已经充分描述了白蛋白在营养不良性肌肉的受损肌肉纤维中积累。例如，可以使用钆-DTPA-白蛋白缀合物作为联合诊断和治疗工具通过磁共振成像来显像和监视例如营养不良性肌肉并用于递送与白蛋白结合的推定治疗剂以供有效靶向营养不良性肌肉(Amthor等(2004)Neuromuscular Disorders14912：791-796)。恶性肿瘤通常显示白蛋白增加的摄取和代谢。已经描述了使用钆-白蛋白缀合物用于对恶性肿瘤的改进成像并用于通过MRI确定对使用药物缀合的白蛋白的治疗敏感的肿瘤(Kiessling等(2002)InvestigativeRadiology 37(4)：93-198)。
当前的显像剂通常快速降解，同时长效试剂通常为毒性的。白蛋白缀合物的使用对于增加显像剂的半衰期可能特别有用，并因此会允许在一段延长的时间中的显像。WO2005/082423描述了与用于显像的荧光物质缀合的血清白蛋白的使用。
可以将本发明的硫代白蛋白与选自显像剂、诊断剂、治疗性化合物和造影剂的两种或多种分子缀合。
肿瘤(和肌肉退化)显示增强的白蛋白摄取(EPR：增强的渗透和保留)。白蛋白缀合物可以用于增强的显像，并且也可用于评估肿瘤(或其他组织和器官)是否会适合于白蛋白缀合的药物。
生物活性化合物
所述生物活性化合物可以是治疗性化合物或诊断化合物。治疗性化合物可以是用于癌症化疗的化疗药物。其可以是细胞抑制性或细胞毒性的；其可以是肿瘤抑制剂。
所述生物活性化合物可能已经含有游离巯基，例如含有带游离巯基的半胱氨酸残基的多肽。或者，可以修饰所述生物活性化合物从而使其含有游离巯基。如此，可以改变多肽的氨基酸序列从而使其包括带游离巯基的半胱氨酸残基，或者可以化学衍生化所述生物活性化合物以包括游离巯基。
所述生物活性化合物可以是多肽(蛋白质)，特别是重组蛋白药物。其可以是用于治疗癌症和其他相关疾病的化疗或放射治疗药物。
本发明的含有游离巯基的白蛋白变体多肽(硫代白蛋白)可以通过所述一个或多个(如果本发明的白蛋白变体多肽含有超过一个游离巯基)游离巯基与至少一种生物活性化合物通过本领域已知方法缀合。所述生物活性化合物包括但不限于肽、多肽或蛋白质(或者是天然的，或者是重组的，或者是合成的)(Debinski，(2002)Cancer Investigation 20，801-809，O’Keefe and Draper等，(1985)JBC 260，932-937，Xia等，(2000)J.Pharmacology ExperimentalTherapeutics 295，594-600，Kavimandan等，(2006)Bioconjugate Chem.17，1376-1384，Humphries，等，(1994)J.Tissue Culture Methods 16，239-242，Wenning等，(1998)Biotech.Bioeng.57，484-496，Yazdi and Murphy，(1994)Cancer Research 54，6387-6394，Weaver and Laske(2003)J.Neuro-Oncology 65，3-13，Widera等，(2003)Pharmaceutical Research 20，1231-1238，Daniels，T.R.等(2006)Clinical Immunology 121，159-176和其中包括的参考文献)；治疗性和诊断性药物或化合物(Mishra等，(2006)J.Drug Targeting 14，45-53，Lim和Shen，(2004)Pharmaceutical Research 21，1985-1992，Fritzer等，(1996)Biochemical Pharmacology 51，489-493，Lubgan和Jozwiak(2002)Cell.Mol.Biol.Lett.7，98，Daniels，T.R.等(2006)Clinical Immunology 121，159-176和其中包括的参考文献)；高分子量复合物包括但不限于脂质体、病毒和纳米颗粒(Mishra等，(2006)J.Drug Targeting 14，45-53，Daniels，T.R.等(2006)ClinicalImmunology 121，159-176和其中包括的参考文献)；核酸和放射性核素，包括DNA、RNA(包括siRNA)和它们的类似物(Lee等，(2005)Arch.Pharm.Res.28，722-729，Huang等，(2007)FASEB J.21，1117-1125，Daniels，T.R.等(2006)Clinical Immunology 121，159-176和其中包括的参考文献)和装置(Humphries，等，(1994)J.Tissue Culture Methods 16，239-242和其中包括的参考文献)。另外，所述实体本身可以通过本领域已知的方法修饰。
治疗性化合物
4-1BB配体、5-螺旋、人C-C趋化因子、人L105趋化因子、命名为huL1053.的A人L105趋化因子、γ-干扰素诱导的单核因子(MIG)、部分CXCR4B蛋白、血小板碱性蛋白(PBP)、α1-抗胰蛋白酶、ACRP-30同源物；补体成分C1q C、腺样-表达的趋化因子(ADEC)、aFGF；FGF-1、AGF、AGF蛋白、白蛋白、依托泊苷、血管抑素、炭疽疫苗、对脑衰蛋白具有特异性的抗体、antistasin、抗-TGFβ家族抗体、抗凝血酶III、APM-1；ACRP-30；Famoxin、载脂蛋白类物质(apo-lipoprotein species)、芳基硫酸酯酶B、b57蛋白、BCMA、β-凝血球蛋白(β-TG)、bFGF；FGF2、血凝因子、BMP加工酶弗林蛋白酶、BMP-10、BMP-12、BMP-15、BMP-17、BMP-18、BMP-2B、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-9、骨形态发生蛋白-2、降钙素、钙蛋白酶-10a、钙蛋白酶-10b、钙蛋白酶-10c、癌症疫苗、羧肽酶、C-C趋化因子、MCP2、CCR5变体、CCR7、CCR7、CD11a Mab、CD137；4-1BB受体蛋白、CD20Mab、CD27、CD27L、CD30、CD30配体、CD33免疫毒素、CD40、CD40L、CD52Mab、Cerebus蛋白、趋化因子嗜酸细胞活化趋化因子、趋化因子hIL-8、趋化因子hMCP1、趋化因子hMCP1a、趋化因子hMCP1b、趋化因子hMCP2、趋化因子hMCP3、趋化因子hSDF1b、趋化因子MCP-4、趋化因子TECK和TECK变体、全长和成熟趋化因子-样蛋白IL-8M1、全长和成熟趋化因子-样蛋白IL-8M10、趋化因子-样蛋白IL-8M3、全长和成熟趋化因子-样蛋白IL-8M8、全长和成熟趋化因子-样蛋白IL-8M9、全长和成熟趋化因子-样蛋白PF4-414、全长和成熟趋化因子-样蛋白PF4-426、全长和成熟趋化因子-样蛋白PF4-M2、霍乱疫苗、软骨调节因子-样蛋白、c-kit配体；SCF；肥大细胞生长因子；MGF；纤维肉瘤来源的干细胞因子、CNTF及其片段(如CNTFAx15`(AxokineTM))、前体和活性两种形式的凝结因子、胶原、互补C5Mab、结缔组织活化蛋白-III、CTAA16.88 Mab、CTAP-III、CTLA4-Ig、CTLA-8、CXC3、CXC3、CXCR3；CXC趋化因子受体3、cyanovirin-N、Darbepoetin(促红血球生成素)、指定的exodus、指定的huL1057、DIL-40、脱氧核糖核酸酶、EDAR、EGF受体Mab、ENA-78、内皮抑素、嗜酸细胞活化趋化因子、上皮嗜中性粒细胞活化蛋白-78、EPO受体；EPOR、红细胞生成素(EPO)和EPO模拟物、Eutropin、Exodus蛋白、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X和因子XIII、FAS配体抑制蛋白(DcR3)、FasL、FasL、FasL、FGF、FGF-12；成纤维细胞生长因子同源因子-1、FGF-15、FGF-16、FGF-18、FGF-3；INT-2、FGF-4；多花白树毒蛋白、HST-1；HBGF-4、FGF-5、FGF-6；肝素结合分泌转化因子-2、FGF-8、FGF-9；神经胶质活化因子、纤维蛋白原、flt-1、flt-3配体、滤泡刺激激素α亚基、滤泡刺激激素β亚基、促滤泡素、趋化因子CX3(fractalkine)、片段肌原纤维蛋白肌钙蛋白I、FSH、半乳糖苷酶、半乳凝素-4、G-CSF、GDF-1、基因疗法、胶质瘤来源的生长因子、胰高血糖素、胰高血糖素-样肽、葡糖脑苷脂酶、葡萄糖氧化酶、葡糖苷酶、妊娠相关蛋白-A(Glycodelin-A)；与孕酮有关的子宫内膜蛋白、GM-CSF、促性腺激素、粒细胞趋化性蛋白-2(GCP-2)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、生长激素、生长相关的致癌基因-α(GRO-α)、生长相关的致癌基因-β(GRO-β)、生长相关的致癌基因-γ(GRO-γ)、hAPO-4；TROY、hCG、乙肝表面抗原、乙肝疫苗、HER2受体Mab、水蛭素、HIV gp120、HIV gp41、HIV抑制剂肽、HIV抑制剂肽、HIV抑制剂肽、HIV蛋白酶抑制肽、HIV-1蛋白酶抑制剂、HPV疫苗、人6CKine蛋白、人Act-2蛋白、人脂肪形成抑制因子、人B细胞刺激因子-2受体、人β-趋化因子H1305(MCP-2)、人C-C趋化因子DGWCC、人CC趋化因子ELC蛋白、人CC型趋化因子白介素C、人CCC3蛋白、人CCF18趋化因子、命名为SLC(第二淋巴样趋化因子)的人CC-型趋化因子蛋白、人趋化因子β-8短形、人趋化因子C10、人趋化因子CC-2、人趋化因子CC-3、人趋化因子CCR-2、人趋化因子Ckβ-7、人趋化因子ENA-78、人趋化因子嗜酸细胞活化趋化因子、人趋化因子GRO α、人趋化因子GROα、人趋化因子GROβ、人趋化因子HCC-1、人趋化因子HCC-1、人趋化因子I-309、人趋化因子IP-10、人趋化因子L105_3、人趋化因子L105_7、人趋化因子MIG、人趋化因子MIG-β蛋白、人趋化因子MIP-1α、人趋化因子MIP1β、人趋化因子MIP-3α、人趋化因子MIP-3β、人趋化因子PF4、人趋化因子蛋白331D5、人趋化因子蛋白61164、人趋化因子受体CXCR3、人趋化因子SDF1α、人趋化因子SDF1β、人趋化因子ZSIG-35、人Chr19Kine蛋白、人CKbeta-9、人CKbeta-9、人CX3C 111氨基酸趋化因子、人DNAX白介素-40、人DVic-1C-C趋化因子、人EDIRF I蛋白序列、人EDIRF II蛋白序列、人嗜曙红细胞CC型趋化因子嗜酸细胞活化趋化因子、人嗜曙红细胞表达的趋化因子(EEC)、人快速颤搐骨骼肌肌钙蛋白C、人快速颤搐骨骼肌肌钙蛋白I、人快速颤搐骨骼肌肌钙蛋白亚基C、人快速颤搐骨骼肌肌钙蛋白亚基I蛋白、人快速颤搐骨骼肌肌钙蛋白亚基T、人快速颤搐骨骼肌肌钙蛋白T、人胎儿脾脏表达的趋化因子、FSEC、人GM-CSF受体、人gro-α趋化因子、人gro-β趋化因子、人gro-γ趋化因子、人IL-16蛋白、人IL-1RD10蛋白序列、人IL-1RD9、人IL-5受体α链、人IL-6受体、人IL-8受体蛋白hIL8RA、人IL-8受体蛋白hIL8RB、人IL-9受体蛋白、人IL-9受体蛋白变体#3、人IL-9受体蛋白变体片段、人IL-9受体蛋白变体片段#3、人白介素1δ、人白介素10、人白介素10、人白介素18，、人白介素18衍生物、人白介素-1β前体、人白介素-1β前体、人白介素-1受体辅助蛋白、人白介素-1受体拮抗剂β、人白介素-13-型受体、人白介素-10(前体)、人白介素-10(前体)、人白介素-11受体、人白介素-12 40 kD亚基、人白介素-12β-1受体、人白介素-12β-2受体、人白介素-12p35蛋白、人白介素-12p40蛋白、人白介素-12受体、人白介素-13α受体、人白介素-13β受体、人白介素-15、来自P1克隆的人白介素-15受体、人白介素-17受体、人白介素-18蛋白(IL-18)、人白介素-3、人白介素-3受体、人白介素-3变体、人白介素-4受体、人白介素-5、人白介素-6、人白介素-7、人白介素-7、人白介素-8(IL-8)、人胞内IL-1受体拮抗剂、人IP-10和HIV-1gp120高可变区融合蛋白、人IP-10和人Muc-1核心表位(VNT)融合蛋白、人肝脏和活化调节趋化因子(LARC)、人Lkn-1全长和成熟蛋白、全长和成熟的人乳腺相关趋化因子(MACK)蛋白、人成熟趋化因子Ckβ-7、人成熟gro-α、用于治疗败血症(sepsis)的人成熟gro-γ多肽、人MCP-3和人Muc-1核心表位(VNT)融合蛋白、人MI10蛋白、人MI1A蛋白、人单核细胞化学引诱物因子hMCP-1、人单核细胞化学引诱物因子hMCP-3、人单核细胞趋化原蛋白(MCPP)序列、人neurotactin趋化因子样域、人非-ELR CXC趋化因子H174、人非-ELRCXC趋化因子IP10、人非-ELR CXC趋化因子Mig、人PAI-1突变体、具有IL-16活性的人蛋白、具有IL-16活性的人蛋白、人第二淋巴样趋化因子(SLC)、人SISD蛋白、人STCP-1、人基质细胞来源的趋化因子、SDF-1、人T细胞混合的淋巴细胞反应表达的趋化因子(TMEC)、人胸腺和活化调节细胞因子(TARC)、人胸腺表达的、人TNF-α、人TNF-α、人TNF-β(LT-α)、人CC型趋化因子嗜酸细胞活化趋化因子3蛋白序列、人II型白介素-1受体、人野生型白介素-4(hIL-4)蛋白、人ZCHEMO-8蛋白、人源化的抗-VEGF抗体，及其片段，人源化的抗-VEGF抗体，及其片段，透明质酸酶、ICE 10 kD亚基、ICE 20 kD亚基、ICE 22 kD亚基、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、艾杜糖醛酸酶、IL-1α、IL-1β、IL-1抑制剂(IL-1i)、成熟IL-1、IL-10受体、IL-11、IL-11、IL-12p40亚基、IL-13、IL-14、IL-15、IL-15受体、IL-17、IL-17受体、Il-17受体、Il-17受体、IL-19、IL-1i片段、IL1-受体拮抗剂、IL-21(TIF)、含IL-3的融合蛋白、IL-3突变蛋白、IL-3变体、IL-3变体、IL-4、IL-4变体多肽、IL-4变体多肽Y124G、IL-4变体多肽Y124X、IL-4变体多肽、Il-5受体、IL-6、Il-6受体、IL-7受体克隆、IL-8受体、IL-9成熟蛋白变体(Met117型)、免疫球蛋白或基于免疫球蛋白的分子或它们任一的片段(例如小模块ImmunoPharmaceuticalTM(“SMIP”)或dAb、Fab’片段、F(ab’)2、scAb、scFv或scFv片段)，包括但不限于血纤维蛋白溶酶原、流感疫苗、抑制素α、抑制素β、胰岛素、胰岛素-样生长因子、整合素Mab、间α胰蛋白酶抑制剂、间α胰蛋白酶抑制剂、干扰素γ诱导蛋白(IP-10)、干扰素(如干扰素α类物质和子类物质，干扰素β类物质和子类物质，干扰素γ类物质和子类物质)、干扰素(如干扰素α类物质和子类物质，干扰素β类物质和子类物质，干扰素γ类物质和子类物质)、白介素6、白介素8(IL-8)受体、白介素8受体B、白介素-1α、白介素-2受体相关蛋白p43、白介素-3、白介素-4变体多肽、白介素-8(IL-8)蛋白、白介素-9、白介素-9(IL-9)成熟蛋白(Thr117型)、白介素(如IL10、IL11和IL2)、白介素(如IL10、IL11和IL2)、日本脑炎疫苗、Kalikrein抑制剂、角化细胞生长因子、Kunitz域蛋白(如抑肽酶、淀粉样前体蛋白和WO 03/066824中所述的那些蛋白，包含或不包含白蛋白融合体)、Kunitz域蛋白(如抑肽酶、淀粉样前体蛋白和WO 03/066824中所述的那些蛋白，包含或不包含白蛋白融合体)、LACI、乳铁蛋白、潜在TGF-β结合蛋白II、瘦素、肝脏表达趋化因子-1(LVEC-1)、肝脏表达趋化因子-2(LVEC-2)、LT-α、LT-β、黄体素化激素、莱姆疫苗、淋巴细胞趋化因子、巨噬细胞来源的趋化因子类似物MDC(n+1)、巨噬细胞来源的趋化因子类似物MDC-eyfy、巨噬细胞来源的趋化因子类似物MDC-yl、巨噬细胞来源的趋化因子、MDC、巨噬细胞来源的趋化因子(MDC)、乳腺丝氨酸蛋白酶抑制物(Maspin)；蛋白酶抑制剂5、MCP-1受体、MCP-1a、MCP-1b、MCP-3、MCP-4受体、M-CSF、黑素瘤抑制蛋白、膜结合蛋白、Met117人白介素9、MIP-3α、MIP-3β、MIP-Γ、MIRAP、修饰的Rantes、单克隆抗体、MP52、突变白介素6 S176R、肌原纤维蛋白收缩蛋白肌钙蛋白I、钠尿肽、神经生长因子-β、神经生长因子-β2、Neuropilin-1、Neuropilin-2、Neurotactin、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、神经营养蛋白-4a、神经营养蛋白-4b、神经营养蛋白-4c、神经营养蛋白-4d、嗜中性粒细胞活化肽-2(NAP-2)、NOGO-66受体、NOGO-A、NOGO-B、NOGO-C、命名为PTEC的新β-趋化因子、N-末端修饰的趋化因子GroHEK/hSDF-1α、N-末端修饰的趋化因子GroHEK/hSDF-1β、N-末端修饰的趋化因子met-hSDF-1α、N-末端修饰的趋化因子met-hSDF-1β、OPGL、成骨蛋白-1；OP-1；BMP-7、成骨蛋白-2、OX40；ACT-4、OX40L、催产素(神经垂体激素运载蛋白I)、甲状旁腺激素、Patched、Patched-2、PDGF-D、百日咳类毒素、脑垂体表达的趋化因子(PGEC)、胎盘生长因子、胎盘生长因子-2、血纤维蛋白溶酶原活化子抑制剂-1；PAI-1、血纤维蛋白溶酶原活化子抑制剂-2；PAI-2、血纤维蛋白溶酶原活化子抑制剂-2；PAI-2、血小板来源生长因子、血小板来源生长因子Bv-sis、血小板来源生长因子前体A、血小板来源生长因子前体B、血小板Mab、血小板来源内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、血小板来源生长因子A链、血小板来源生长因子B链、用于治疗败血症的多肽、前原载脂蛋白(Preproapolipoprotein)“米兰”变体、前原载脂蛋白“巴黎”变体、前-凝血酶、灵长类动物CC趋化因子″ILINCK″、灵长类动物CXC趋化因子″IBICK″、胰岛素原、催乳素、催乳素2、prosaptide、蛋白酶抑制肽、蛋白C、蛋白S、凝血酶原、尿激酶原、RANTES、RANTES 8-68、RANTES 9-68、RANTES肽、RANTES受体、重组白介素-16、抵抗素、局限曲菌素、逆转录病毒蛋白酶抑制剂、蓖麻毒蛋白、轮状病毒疫苗、RSV Mab、肥皂草毒蛋白、帚曲霉素、分泌的和跨膜多肽、分泌的和跨膜多肽、血清胆碱酯酶、血清蛋白(如凝血因子)、可溶BMP受体激酶蛋白-3、可溶VEGF受体、干细胞抑制因子、葡萄球菌属(Straphylococcus)疫苗、基质来源的因子-1α、基质来源的因子-1β、物质P(速激肽)、T1249肽、T20肽、T4内切核酸酶、TACI、Tarc、TGF-β1、TGF-β2、Thr117人白介素9、凝血酶、促血小板生成素、促血小板生成素衍生物1、促血小板生成素衍生物2、促血小板生成素衍生物3、促血小板生成素衍生物4、促血小板生成素衍生物5、促血小板生成素衍生物6、促血小板生成素衍生物7、胸腺表达的趋化因子(TECK)、甲状腺刺激激素、壁虱抗凝肽、Tim-1蛋白、TNF-α前体、TNF-R、TNF-RII；TNF p75受体；死亡受体、tPA、转铁蛋白、转化生长因子β、肌钙蛋白肽、截短型单核趋化因子蛋白2(6-76)、截短型单核趋化因子蛋白2(6-76)、截短型RANTES蛋白(3-68)、肿瘤坏死因子、尿酸氧化酶、尿激酶、加压素(神经垂体激素运载蛋白II)、VEGF R-3；flt-4、VEGF受体；KDR；flk-1、VEGF-110、VEGF-121、VEGF-138、VEGF-145、VEGF-162、VEGF-165、VEGF-182、VEGF-189、VEGF-206、VEGF-D、VEGF-E；VEGF-X、von Willebrand因子、野生型单核细胞趋化因子蛋白2、野生型单核细胞趋化因子蛋白2、ZTGF-β9。
化疗药物
13-顺-视黄酸、2-CdA、2-氯脱氧腺苷、5-氮杂胞苷、5-氟尿嘧啶、5-FU、6-巯嘌呤、6-MP、6-TG、6-硫鸟嘌呤、A、Abraxane、
Figure BDA0000082557350000561
放线菌素-D、
Figure BDA0000082557350000562
Ala-阿地白介素(Aldesleukin)、阿伦单抗(Alemtuzumab)、ALIMTA、阿利维A酸(Alitretinoin)、Alkaban-
Figure BDA0000082557350000564
全反视黄酸、α干扰素、六甲蜜胺、甲氨蝶呤、氨磷汀(Amifstine)、氨鲁米特(Aminoglutethimide)、阿那格雷(Anagrelide)、
Figure BDA0000082557350000565
阿那曲唑(Anastrozole)、阿糖胞苷(Arabinosylcytonasine)、Ara-C、
Figure BDA0000082557350000566
Figure BDA0000082557350000567
三氧化二砷、天冬酰胺酶、ATRA、
Figure BDA0000082557350000568
阿扎胞苷(Azacitidine)、BCG、BCNU、贝伐单抗(Bevacizumab)、贝沙罗汀(Bexarotene)、
Figure BDA0000082557350000569
比卡鲁胺(Bicalutamide)、BiCNU、
Figure BDA00000825573500005610
博来霉素(Bleomycin)、Bortezomib、白消安(Busulfan)、
Figure BDA00000825573500005611
C225、亚叶酸钙(Calcium Leucovorin)、喜树碱-11(Camptothecin-11)、卡培他滨(Capecitabine)、Carac TM、卡铂(Carboplatin)、卡莫司汀(Carmustine)、卡莫司汀薄片(CarmustineWafer)、
Figure BDA00000825573500005613
CC-5013、CCNU、CDDP、CeeNU、
Figure BDA00000825573500005614
西妥昔单抗(Cetuximab)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、顺铂(Cisplatin)、亚叶酸钙(Citrovorum Factor)、克拉屈滨(Cladribine)、可的松(Cortisone)、
Figure BDA00000825573500005615
CPT-11、环磷酰胺、
Figure BDA00000825573500005616
阿糖胞苷(Cytarabine)、脂质体阿糖胞苷(CytarabineLiposomal)、Cytosar-
Figure BDA00000825573500005617
达卡巴嗪(Dacarbazine)、Dacogen、更生霉素(Dactinomycin)、Darbepoetin Alfa、Dasatinib、道诺霉素(Daunomycin)、柔红霉素(Daunorubicin)、盐酸柔红霉素(Daunorubicin Hydrochloride)、脂质体柔红霉素(Daunorubicin Liposomal)、
Figure BDA00000825573500005618
地塞米松(Decadron)、地西他滨(Decitabine)、Delta-
Figure BDA00000825573500005619
地尼白介素-毒素连接物(Denileukindiftitox)、DepoCyt TM、地塞米松(Dexamethasone)、醋酸地塞米松(Dexamethasoneacetate)、地塞米松磷酸钠(Dexamethasone Sodium Phosphate)、地塞米松(Dexasone)、地塞米松(Dexrazoxane)、DHAD、DIC、Diodex、多西紫杉醇(Docetaxel)、
Figure BDA00000825573500005620
多柔比星(Doxorubicin)、脂质体多柔比星(Doxorubicinliposomal)、Droxia TM、DTIC、DTIC-
Figure BDA00000825573500005621
Eligard TM、Ellence TM、Eloxatin TM、
Figure BDA00000825573500005622
表柔比星(Epirubicin)、阿法依泊汀(Epoetin alfa)、Erbitux TM、Erlotinib、欧文氏L-天冬酰胺酶(ErwiniaL-asparaginase)、雌莫司汀(Estramustine)、氨磷汀(Ethyol)、
Figure BDA0000082557350000571
依托泊苷(Etoposide)、磷酸依托泊苷(Etoposide Phosphate)、
Figure BDA0000082557350000572
依西美坦(Exemestane)、
Figure BDA0000082557350000573
非格司亭(Filgrastim)、氟尿苷(Floxuridine)、
Figure BDA0000082557350000574
氟达拉滨(Fludarabine)、
Figure BDA0000082557350000575
氟尿嘧啶、氟尿嘧啶(乳膏)、氟甲睾酮(Fluoxymesterone)、氟他胺(Flutamide)、亚叶酸(FolinicAcid)、
Figure BDA0000082557350000576
氟维司群(Fulvestrant)、G-CSF、Gefitinib、吉西他滨(Gemcitabine)、吉姆单抗奥佐米星(Gemtuzumab ozogamicin)、
Figure BDA0000082557350000577
Gleevec TM、
Figure BDA0000082557350000578
Wafer、GM-CSF、戈舍瑞林(Goserelin)、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨细胞集落刺激因子、地塞米松(Hexadrol)、六甲蜜胺(Hexamethylmelamine)、HMM、
Figure BDA00000825573500005711
Hydrocort
Figure BDA00000825573500005712
氢化可的松(Hydrocortisone)、氢化可的松磷酯钠(Hydrocortisone SodiumPhosphate)、氢化可的松琥珀酸钠(Hydrocortisone Sodium Succinate)、氢化可的松磷酸酯(Hydrocortone Phosphate)、羟基脲(Hydroxyurea)、替伊莫单抗(Ibritumomab)、替伊莫单抗(Ibritumomab Tiuxetan)、
Figure BDA00000825573500005713
依达比星(Idarubicin)、
Figure BDA00000825573500005714
IFN-α、异环磷酰胺(Ifosfamide)、IL-11、IL-2、甲磺酸伊马替尼(Imatinib mesylate)、达卡巴嗪(Imidazole Carboxamide)、干扰素α、干扰素A-2b(PEG缀合物)、白介素-2、白介素-11、Intron(干扰素α-2b)、
Figure BDA00000825573500005716
伊立替康(Irinotecan)、异维A酸(Isotretinoin)、
Figure BDA00000825573500005717
拉帕替尼(Lapatinib)、L-天冬酰胺酶、LCR、来那度胺(Lenalidomide)、来曲唑(Letrozole)、亚叶酸钙(Leucovorin)、苯丁酸氮芥(Leukeran)、Leukine TM、醋酸亮丙瑞林(Leuprolide)、长春新碱(Leurocristine)、Leustatin TM、脂质体Ara-C、Liquid
Figure BDA00000825573500005718
洛莫司汀(Lomustine)、L-PAM、L-沙克来新(L-Sarcolysin)、
Figure BDA00000825573500005719
Lupron
Figure BDA00000825573500005720
M、
Figure BDA00000825573500005721
Maxidex、氮芥(Mechlorethamine)、氮芥(MechlorethamineHydrochloride)、
Figure BDA00000825573500005722
甲地孕酮(Megestrol)、醋酸甲地孕酮(Megestrol Acetate)、美法仑(Melphalan)、巯嘌呤(Mercaptopurine)、美司钠(Mesna)、Mesnex TM、甲氨蝶呤(Methotrexate)、甲氨蝶呤钠(MethotrexateSodium)、甲泼尼龙(Methylprednisolone)、
Figure BDA00000825573500005723
丝裂霉素(Mitomycin)、丝裂霉素C(Mitomycin-C)、米托蒽醌(Mitoxantrone)、M-
Figure BDA00000825573500005724
MTC、MTX、
Figure BDA00000825573500005725
氮芥(Mustine)、
Figure BDA00000825573500005726
Mylocel TM、
Figure BDA00000825573500005727
Figure BDA00000825573500005728
奈拉滨(Nelarabine)、
Figure BDA00000825573500005729
Neulasta TM、
Figure BDA0000082557350000581
尼鲁米特(Nilutamide)、
Figure BDA0000082557350000582
氮芥(Nitrogen Mustard)、
Figure BDA0000082557350000583
奥曲肽(Octreotide)、醋酸奥曲肽(Octreotide acetate)、
Figure BDA0000082557350000584
Onxal TM、Oprevelkin、
Figure BDA0000082557350000585
奥沙利铂(Oxaliplatin)、紫杉醇(Paclitaxel)、紫杉醇蛋白-结合的、帕米磷酸二钠(Pamidronate)、Panitumumab、
Figure BDA0000082557350000586
PEG干扰素、培门冬酶(Pegaspargase)、Pegfilgrastim、PEG-INTRON TM、PEG-L-天冬酰胺酶、PEMETREXED、喷司他丁(Pentostatin)、苯丙氨酸(Phenylalanine Mustard)、Platinol-
Figure BDA0000082557350000588
泼尼松龙(Prednisolone)、泼尼松(Prednisone)、
Figure BDA0000082557350000589
丙卡巴肼(Procarbazine)、
Figure BDA00000825573500005810
含卡莫司汀植入物的Prolifeprospan 20、
Figure BDA00000825573500005811
R、雷洛昔芬(Raloxifene)、
Figure BDA00000825573500005813
美罗华(Rituximab)、Roferon-
Figure BDA00000825573500005814
(干扰素A-2a)、
Figure BDA00000825573500005815
盐酸柔红霉素(Rubidomycin hydrochloride)、
Figure BDA00000825573500005816
Sandostatin
Figure BDA00000825573500005817
沙格司亭(Sargramostim)、Solu-
Figure BDA00000825573500005818
Solu-
Figure BDA00000825573500005819
索拉非尼(Sorafenib)、SPRYCEL TM、STI-571、链佐星(Streptozocin)、SU11248、舒尼替尼(Sunitinib)、
Figure BDA00000825573500005820
他莫昔芬(Tamoxifen)、
Figure BDA00000825573500005821
替莫唑胺(Temozolomide)、替尼泊苷(Teniposide)、TESPA、沙利度胺(Thalidomide)、
Figure BDA00000825573500005822
硫鸟嘌呤(Thioguanine)、Thioguanine
Figure BDA00000825573500005823
Thiophosphoamide、
Figure BDA00000825573500005824
塞替派(Thiotepa)、
Figure BDA00000825573500005825
托泊替康(Topotecan)、托瑞米芬(Toremifene)、托西莫单抗(Tositumomab)、曲妥单抗(Trastuzumab)、维A酸(Tretinoin)、Trexall TM、
Figure BDA00000825573500005826
TSPA、
Figure BDA00000825573500005827
VCR、Vectibix TM、
Figure BDA00000825573500005828
Viadur TM、
Figure BDA00000825573500005829
长春碱(Vinblastine)、硫酸长春碱(Vinblastine Sulfate)、Vincasar
Figure BDA00000825573500005830
长春新碱(Vincristine)、长春瑞滨(Vinorelbine)、长春瑞滨(Vinorelbine tartrate)、VLB、VM-26、Vorinostat、VP-16、
Figure BDA00000825573500005831
Zevalin TM、
Figure BDA00000825573500005832
唑来膦酸(Zoledronic acid)、Zolinza、
Figure BDA00000825573500005833
放射性药物
碳-11、碳-14、铬-51、钴-57、钴-58、铒-169、氟-18、镓-67、金-198、铟-111、铟-113m、碘-123、碘-125、碘-131、铁-59、氪-81m、氮-13、氧-15、磷-32、铼-186、铷-82、钐-153、硒-75、锶-89、锝-99m、铊-201、氚、氙-127、氙-133、钇-90。
显像剂
钆，磁铁矿(magnetite)，锰，锝，I125，I131，P32，TI201，碘帕醇(Iopamidol)，PET-FDG。
纯化标签
也可以将所述白蛋白与一种或多种纯化标签融合，所述纯化标签如(Ala-Trp-Trp-Pro)n、亲和素/链霉亲和素/Strep-tag、BCCP、B-tag(蓝舌病毒的VP7蛋白区)、钙调蛋白结合蛋白(CBP)、纤维素结合域(CBD′s)、壳多糖结合域、氯霉素乙酰转移酶、c-myc、二氢叶酸还原酶(DHFR)、FLAGTM肽(DYKDDDDK)、半乳糖-结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、绿色荧光蛋白(GFP)、生长激素、N-末端、血凝素流感病毒(HAI)、His-patch硫氧还蛋白、His-标签、HSB-标签、KSI、lacZ(β-半乳糖苷酶)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、NusA、ompT/ompA/pelB/DsbA/DsbC、聚精氨酸、聚天冬氨酸、聚半胱氨酸、聚苯丙氨酸、S-标签、葡萄球菌蛋白A、链球菌蛋白G、T4gp55、T7基因10、T7-标签、硫氧还蛋白、trpE、泛素。
配体结合
HSA具有配体结合和酯酶活性，如在“All about Albumin”，T.Peters Jr.，Academic Press N.Y。所述配体结合性质包括与阴离子和中性配体如长链脂肪酸、胆红素和其他混合配体(miscellaneous ligand)结合。已知长链脂肪酸，油酸(C18:1)、棕榈酸(C16:0)、亚油酸(C18:2)、硬脂酸(C18:0)、花生四烯酸(C20:4)和/或棕榈油酸(C16:1)结合HSA。
所述多肽可以包括插入、缺失和保守或非保守的取代，其中这些变化不显著降低所述白蛋白有用的配体结合、免疫原性或受体结合性质，例如与FcRN、胆红素和/或脂肪酸的结合性质。所述多肽可以具有人血清白蛋白的受体结合活性的至少5％、10％、15％、20％、30％、40％或50％、60％、70％，至少80％、90％、95％、100％、105％或更多，摩尔对摩尔。所述多肽可以具有增加的对白蛋白受体的亲和性。
可以使用等温滴定量热法对HSA和硫代白蛋白进行配体结合研究，所述等温滴定量热法对于这一目的是适格的。可以通过脱脂(Sogami，M.和J.F.Foster(1968).Biochemistry 7(6)：2172-82，通过提述并入本文)继以巯基封闭(Sogami，M.，H.A.Petersen，等(1969).Biochemistry 8(1)：49-58，通过提述并入本文)和后续的凝胶渗透层析来预处理样品。例如，后续可以比较使用辛酸对硫代白蛋白和HSA生成的结合曲线，并且建立功能相似性。
缀合方法
本发明的白蛋白变体多肽(硫代白蛋白)可以与一种或多种缀合配偶体如生物活性化合物通过本领域已知的方法共价连接(例如由Pierce，ThermoFisher  Scientific，Rockford，IL，USA；http://www.piercenet.com/files/1601361Crosslink.pdf提供的那些方法)。这些包括，但不限于将巯基反应性基团并入或工程化至缀合配偶体之中或之上，例如通过并入或工程化所述缀合配偶体上存在的另一游离巯基；或通过将吡啶二硫基团并入或工程化至所述缀合配偶体上；或通过将碘乙酰基并入或工程化至所述生物活性化合物上或通过将马来酰亚胺基并入或工程化至所述缀合配偶体上。例如，N-乙基马来酰亚胺(NEM，Pierce)，2-氨基-2’-氨基乙硫醇磺酸盐(2-amino-2’-aminoethanethiolsulfonate)(Pierce)，N-β-马来酰亚胺基丙酸(N-beta-maleimidoprpionic acid)(BMPA Pierce)，甲基甲烷硫代磺酸(methylmethane thiosulfonate)(MMTS，Pierce)，荧光素-5-马来酰亚胺(Pierce)，5-碘代乙酰胺基-荧光素(5-IAF，Pierce)或N-[6-7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酰氨基)己基]-3′-[2′-吡啶二硫代]丙酰胺(N-[6-7-amino-4-methylcoumarin-3-acetamido)hexyl]-3′-[2′-pyridyldithio]propionamide)(AMCA-HPDP，Pierce)。
如果所述缀合配偶体含有至少一个巯基，那么所述缀合配偶体可以与本发明的白蛋白变体多肽通过本领域已知的方法(例如，但不限于氧化)或通过使用交联剂交联，所述交联剂例如，但不限于，1，4-二-马来酰亚胺丁烷(BMB，Pierce)；1，4-二-马来酰亚胺-2，3-二羟基丁烷(BMDB，Pierce)；二-马来酰亚胺己烷(BMH，Pierce)，二-马来酰亚胺乙烷(BMOE，Pierce)；1，8-二-马来酰亚胺三乙二醇(BM[PEO]3 Pierce)；1，11-二-马来酰亚胺四乙二醇(BM[PEO]4Pierce)；1，4-二-[3’-(2’-吡啶二硫代)-丙酰胺基]丁烷(DPDPB，Pierce)；二硫代-二-马来酰亚胺乙烷(DTME Pierce)；1，6-己烷-二-乙烯砜(HBVS，Pierce)和Tris-[2-马来酰亚胺乙基]胺(TMEA，Pierce)。
如果所述缀合配偶体不含巯基活性基团，那么可以通过本领域已知的方法通过化学修饰或者基因工程对其进行修饰以并入一个或多个这样的基团(Chapman，A.P.(2002)Adv.Drug Deliv.Rev.，54531-545：Humphreys，D.P.等Protein Engineering，Design & Selection vol.20 no.5pp.227-234，2007)。尽管这两片文献描述了将PEG与抗体或抗体片段内的工程化游离巯基交联的方法，所述技术可以用于将缀合配偶体与本发明的白蛋白变体多肽内的工程化游离巯基交联。或者，可以使用由ConjuChem Inc.(Montreal，Quebec，Canada，H2X 3Y8)开发的Drug Affinity Complex(DACTM)技术，例如，如WO200069902中所述。每个DACTM构建体含有三个部分：1)药物组分(负责生物活性的部分)；2)与所述药物组分附接的接头；和3)在所述接头另一端的活性化学基团，其通常为巯基的软亲电子选择剂(soft electrophile selective)；马来酰亚胺是最常用的实施例。其他可用的缀合方法在WO2007/071068中描述，将其通过提述并入本文。
如果所述缀合配偶体不含巯基活性基团，但是含一个或多个氨基基团，那么可以通过本领域已知方法通过化学修饰对其进行修饰以并入一个或多个巯基活性基团，如使用交联剂，例如，但不限于N-5-叠氮-2-硝基苯甲酰氧基琥珀酰亚胺(AMAS，Pierce)，N-[β-马来酰亚胺丙氧基]琥珀酰亚胺酯(BMPS，Pierce)，N-eta-马来酰亚胺己酸(EMCA，Pierce)，N-[eta-马来酰亚胺己酰氧基]琥珀酰亚胺酯(EMCS，Pierce)，N-[eta-马来酰亚胺己酰氧基]磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-EMCS，Pierce)，N-[γ-马来酰亚胺丁酰氧基]琥珀酰亚胺酯(GMBS，Pierce)，N-[β-马来酰亚胺丁酰氧基]磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-GMBS，Pierce)，N-kappa-马来酰亚胺十一酸(KMUA，Pierce)，N-[kappa-马来酰亚胺十一酸]酰肼(KMUH，Pierce)，N-[kappa-马来酰亚胺十一酰氧基]磺基琥珀酸亚胺酯(磺基-KMUS，Pierce)，m-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺(MBS，Pierce)，m-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-MBS，Pierce)，N-琥珀酰亚胺基S-乙酰硫代乙酸酯(SATA，Pierce)，N-琥珀酰亚胺基S-乙酰硫代丙酸酯(SATP，Pierce)，琥珀酰亚胺基3-[溴乙酰氨基]丙酸酯(SBAP，Pierce)，N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA，Pierce)，N-琥珀酰亚胺基[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸酯(SIAB，Pierce)，磺基琥珀酰亚胺基[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸酯(磺基-SIAB，Pierce)，琥珀酰亚胺基[4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯(SMCC，Pierce)，磺基琥珀酰亚胺基[4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC，Pierce)，琥珀酰亚胺基-[4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧基-[6-氨基己酸酯(LC-SMCC，Pierce)，4-琥珀酰亚胺基羰氧基-甲基-α[2-吡啶二硫代]甲苯(SMPT，Pierce)，磺基琥珀酰亚胺基-6-[α-甲基-α2-吡啶二硫代)甲苯酰胺]己酸酯(磺基-LC-SMPT，Pierce)，琥珀酰亚胺基4-[P-马来酰亚胺苯基]-丁酸酯(SMPB，Pierce)，磺基琥珀酰亚胺基4-[p-马来酰亚胺苯基]-丁酸酯(磺基-SMPB，Pierce)，琥珀酰亚胺基-6-[(beta-马来酰亚胺丙酰胺)己酸酯](SMPH，Pierce)，N-琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶二硫代]丙酸酯(SPDP，Pierce)，琥珀酰亚胺基[3-(2-吡啶二硫代)丙酰胺]己酸酯(LC-SPDP，Pierce)，磺基琥珀酰亚胺基[3’-(2-吡啶二硫代)丙酰胺]己酸酯(磺基-LC-SPDP，Pierce)和N-琥珀酰亚胺基-[4-乙烯基砜基]苯甲酸酯(SVSBPierce)。如Kavimandan等，(2006)Bioconjugate Chem.17，1376-1384所述封闭某些胺残基可能是有利的。
如果所述缀合配偶体不含巯基活性基团，但是含一个或多个羧基(氧化的碳水化合物)基团，那么可以通过本领域已知方法通过化学修饰对其进行修饰以并入一个或多个巯基活性基团，如使用交联剂，例如，但不限于，N-[eta-马来酰亚胺己酸]酰肼(EMCH，Pierce)，4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1羧基酰肼·HCl·1/2二
Figure BDA0000082557350000621
烷(M2C2H，Pierce)，3-马来酰亚胺苯基硼酸(MPBH，Pierce)和3-[2-吡啶二硫代]丙酰肼(PDPH，Pierce)。
如果所述缀合配偶体不含巯基活性基团，但是含一个或多个羟基，那么可以通过本领域已知方法通过化学修饰对其进行修饰以并入一个或多个巯基活性基团，如使用交联剂，例如，但不限于N-[p-马来酰亚胺苯基]异氰酸酯(PMPI，Pierce)。
白蛋白变体的缀合能力
本发明的多肽的缀合能力可以通过荧光标记和细胞摄取来测试，如由McGraw等，(1987)，The Journal of Cell Biology，105，207-214和Presley等，(1993)，The Journal of Cell Biology，122，1231-1241所描述的。测试缀合能力的其他方法包括将所述白蛋白与另一分子如HRP缀合。接下来，可以测定所得缀合物的质量和/或所述缀合化合物的活性，例如通过质谱或通过酶测定法。
微生物
适合于在本发明中使用的宿主菌株包括DXY1的hsp150-缺陷型，其在S.M.Kerry-Williams等(1998)Yeast 14：161-169中公开。WO 95/33833教导了本领域技术人员如何制备hsp150-缺陷的酵母。可以将这种宿主菌株称作“菌株1”。
将引用的所有文献通过提述以其整体并入本文。
参考以下实施例仅以示例的方式描述本发明。
实施例
实施例1：白蛋白变体多肽表达质粒的构建
所述HSA编码序列可以通过用于分离对应于人基因的cDNA的已知方法来获得，并且也公开在例如EP 0 073 646和EP 0 286 424中。用于本发明的白蛋白变体的表达质粒可以以与WO 00/44772中描述的pDB2244或WO/2006/013859中描述的pDB2305类似的方式来构建，以供从酿酒酵母表达人血清白蛋白。质粒pDB2305含有针对在酿酒酵母中的表达进行了密码子优化的HSA序列。可以使用可选的密码子优化方法用于为硫代白蛋白产生选择的特定宿主生物。用于本发明的白蛋白变体的表达质粒也可以以与WO 2005/061719 A1中描述的那些类似的方法来构建以供从酿酒酵母改进的表达人血清白蛋白。
硫代白蛋白变体多肽可以在通过定点诱变修饰质粒pDB2244(图7)或pDB2305之后来制备。可以使用由商业上可以获得的试剂盒(如Stratagene’sQuikchangeTM Kit)指明的流程使用重叠的诱变寡核苷酸序列将所选残基的密码子修饰成编码半胱氨酸残基任意DNA序列(TGT或TGC)。或者，可以制备合成DNA片段使其含有期望的对多核苷酸序列的修饰。
硫代白蛋白变体表达质粒的构建
可以用于创建质粒pDB2244(图7)的亚克隆质粒是质粒pDB2243(图8)(在WO 00/44772中描述)和pSAC35(在EP 286424中描述)。质粒pDB2243和pDB2244含有天然的HSA基因。本领域技术人员会理解表达盒可以或可以不经密码子优化；用于构建含有针对在酿酒酵母中的表达进行了密码子优化的HSA的表达质粒的方法在WO/2006/013859中描述。编码HSA的天然核苷酸序列在SEQ ID No.2中提供。针对在酿酒酵母中的表达进行了密码子优化的HSA核苷酸序列作为SEQ ID No.3提供。
将质粒pDB2243(6.203kb)使用限制性内切核酸酶NotI完全消化以释放2.992kb人血清白蛋白表达盒。
质粒pSAC35是Chinery和Hinchliffe(1989)Curr.Genet.16，21-25以及EP 286424中的pSAC3的衍生物。将质粒pSAC35(11.037kb)使用限制性内切核酸酶NotI完全消化并使用小牛碱性肠磷酸酶去磷酸化并与2.992kb NotI人血清白蛋白表达盒连接以产生14.037kb pDB2244，其具有以与LEU2基因相同的方向定向的所述人血清白蛋白表达盒(图7)。本领域技术人员会理解所述表达盒可以或可以不经密码子优化，并且所述表达盒可以或可以不以任一朝向克隆至所述表达载体中作为本发明一部分。
或者可以使用质粒pDB2690。质粒pDB2690的构建在WO/2005061719A1中描述。将质粒pDB2690(13.018kb)使用限制性内切核酸酶NotI完全消化，并使用小牛碱性肠磷酸酶去磷酸化，并与2.992kb NotI人血清白蛋白表达盒连接以产生16.039kb质粒pDB2713，其具有与LEU2基因相同的方向定向的所述人血清白蛋白表达盒(图9)。本领域技术人员会理解所述表达盒可以或可以不经密码子优化，并且所述表达盒可以或可以不以任一朝向克隆至所述表达载体中作为本发明一部分。
作为用于本发明的白蛋白(即能缀合的白蛋白)变体的定点诱变表达质粒可以通过在克隆至pSAC35或pDB2690中之前将合成的DNA片段亚克隆至质粒pDB2243(图8)中来制备。用于构建含有一个额外的能缀合的半胱氨酸(相对于SEQ ID No.1)的硫代白蛋白亚克隆质粒的方法在下文描述，仅作为示例。
pDB2243的白蛋白DNA序列包括两个HindIII限制内切核酸酶位点。
可以修饰所述合成DNA从而将所述人血清白蛋白蛋白编码序列在选择的密码子处修饰成半胱氨酸密码子，或将现有的半胱氨酸密码子缺失或修饰成另一氨基酸的密码子。或者，可以将所述成熟硫代白蛋白的编码序列在5’或3’端延伸或在所述多肽内进行插入以添加编码半胱氨酸或含有一个或多个半胱氨酸的多肽的新序列。
或者，可以修饰合成DNA从而将所述人血清白蛋白蛋白编码序列在选定的半胱氨酸密码子处修饰成别的密码子以创建不成对半胱氨酸。或者，可以修饰合成DNA从而通过将指定位点的两个密码子取代成半胱氨酸密码子来修饰所述人血清白蛋白蛋白编码序列(氨基酸链长减少)。或者，可以修饰合成DNA从而通过在指定位点插入半胱氨酸密码子来修饰所述人血清白蛋白蛋白编码序列(例如与HSA相关的SEQ ID No.2或SEQ ID No.3)(氨基酸链长增加)。可以用HindIII限制性核酸内切酶完全消化质粒pDB2243，并回收片段(约4.383kb)并去磷酸化，然后可以克隆含有对所述人血清白蛋白编码序列的适当修饰的合成DNA以产生需要的硫代白蛋白亚克隆质粒。然后可以将所述硫代白蛋白亚克隆质粒消化以产生表达盒，可以将所述表达盒以与构建pDB2244、pDB2305或pDB2713类似的方式克隆至合适的表达质粒中。
本领域技术人员会理解，所述具有对白蛋白蛋白序列的额外修饰的用于硫代白蛋白变体的表达盒可以使用与对于构建含有一个额外的能缀合的半胱氨酸的硫代白蛋白(相对于SEQ ID No.1)的亚克隆质粒所描述的类似方法来产生。
可以将酿酒酵母菌株，例如菌株1，用pDB2244(WO 00/44772)或pDB2305(WO/2006/013859)转化成亮氨酸原养型以供人血清白蛋白的表达或用合适的硫代白蛋白表达质粒转化。可以使用修改的醋酸锂方法(Sigma酵母转化试剂盒，YEAST-1，方案2；Ito等，1983，J.Bacteriol.，153，16；Elble，1992，Biotechniques，13，18)转化酵母。可以在BMMD琼脂平板上选择转化体，然后贴片(patch out)到BMMD琼脂培养基上。BMMD的组成由Sleep等，2002，Yeast，18，403描述。冷冻保存的原种可以从10mL BMMD摇瓶培养物(24小时，30℃，200rpm)制备到20％(w/v)海藻糖中。
实施例2：与HSA相比具有单个氨基酸变化的白蛋白变体多肽的表达
具有单个氨基酸变化的硫代白蛋白变体选自表5A、5B和6A。根据上文所述的方法这些变体被鉴定为优选突变。每个变体的细节在图11中给出，其提供了构建体参考号(例如rHAA2C的TA1)，编码每个硫代白蛋白变体表达构建体的质粒的名称，和通过缺口修复的体内重组所需的侧翼序列，和给予冷冻保存的产生每个硫代白蛋白变体的酵母原种的编号(酵母原种号)。还提供了与SEQ ID No.2相比的突变密码子的细节，如每个硫代白蛋白变体的SEQ ID号(DNA和蛋白质)。
为了修饰非人血清白蛋白中的氨基酸，可以从包括人血清白蛋白(SEQID No.1)的比对如图2和3确定HSA中特定位置的等同位置。本领域技术人员熟悉比对并且能够容易地确定序列中的某个氨基酸是否与另一序列中的某个氨基酸等同。例如，非人白蛋白中的氨基酸位置相对于HSA的N末端不一定相同。例如，图2中HSA的位置239是丙氨酸残基，而牛序列中的相应残基为丝氨酸-238。类似地，HSA的缬氨酸-479对应于绵羊白蛋白中的亮氨酸-478。质粒pDB3927(图12)从质粒pDB2244(图7，WO 0044772A，‘FL’：融合前导序列)构建。将pDB2244用限制酶SwaI和HpaI(均产生平端)消化并自连接形成pDB3927。为了创建质粒pDB3964(图13)，修饰pDB3927的白蛋白DNA序列中的限制酶位点而不修饰所述蛋白序列，如下文所列。所得DNA序列为序列ID No.4。
1)引入的酶位点：(圆括号中的碱基对位置指SEQ ID No.4中的位置)SEQ ID No.4
Figure BDA0000082557350000651
Figure BDA0000082557350000661
pDB3964中HSA的编码序列作为SEQ ID No.4提供。使用DNA合成和克隆从pDB3927(DNA2.0Inc，USA)生成pDB3964。设计合成DNA片段以改变pDB3964的白蛋白基因内的特定氨基酸密码子，或具有修饰的组合(参见下文实施例3)。合成了(DNA 2.0Inc，USA)含有这些修饰的DNA片段并且将其克隆至pDB3964中以产生含有所述硫代白蛋白序列的质粒(图11)。将这些合成基因和侧翼区用限制酶BstEII和BsrBI从图11中为每个硫代白蛋白变体和对照命名的质粒pDB3927、pDB3964和pDB2244切下，之后纯化所得DNA片段(PCR纯化试剂盒，Qiagen)。在下文描述的酵母转化方法中使用所述DNA片段以允许使用线性化pDB3936的体内缺口修复。
所述质粒pDB3853(未显示)构建自基本载体pDB2690(Ref DB88/WO2005/061719A1)和下文描述的合成接头。所述合成接头使用从96℃至室温的温度梯度(1min每1℃)在蒸馏水中从退火的两个寡核苷酸(Sigma-Genosys)构建。将pDB2690使用KpnI和NotI消化，并通过凝胶提取(Qiagen)纯化，然后连接所述退火的接头：
‘KpnI    (接头)    BamHI  NotI’
5’-CGCTAGCCTCGAGGTTTAAACGCTAGCGAGCTCGGATCC   -3’
3’-CATGGCGATCGGAGCTCCAAATTTGCGATCGCTCGAGCCTAGGCCGG  -5’
构建pDB3853之后，将接头使用PstI和ScaI切下(3787bp片段)，然后连接至凝胶提取的PstI/ScaI切割的pSAC35质粒(WO 0044772A和WO2005/061719A1))中，形成pDB3936(图14)。
将pDB3936用限制酶Acc65I和BamHI线性化，然后在通过琼脂糖凝胶电泳分离之后纯化9721bp的片段。对于允许体内缺口修复(下文描述)的酵母转化方法，计算线性化pDB3936和每种编码硫代白蛋白编码序列的BsrBI-BstEII片段的浓度，并且将每种100ng用于每个酵母转化反应。
始终使用酿酒酵母菌株BXP10作为表达宿主(So-low，S.P.，J.Sengbusch，等(2005).″Heterologous protein production from the inducible MET25 promoterin Saccharomyces cerevisiae.″Biotechnol Prog 21(2)：617-20.)，尽管可选的其他表达宿主也是合适的。
冷冻保存的酿酒酵母BXP10原种制备自10mL YEPPD(1％w/v酵母提取物，2％w/v植物蛋白胨，2％w/v右旋糖))摇瓶培养物(培养24小时，30℃，200rpm)，将其与等体积的40％w/v无菌海藻糖溶液混合，并以1mL等分试样分配以供在-80℃储存。将10mL BMMD、YEPPD和LB(1％w/v细菌胰蛋白胨，0.5％w/v酵母提取物，0.5％w/v NaCl)摇瓶用100μL冷冻保存的酵母原种接种，并如上所述在30℃，200rpm温育四天，然后以显微镜观察以确认他们是否没有被污染(axenic)。
冷冻的感受态酿酒酵母BXP10细胞通过将100μL冷冻保存的酵母原种接种到10mL YEPPD中来制备，将其在30℃，200rpm温育两天，然后用于接种300mL YEPPD至OD600＝0.3。如上所述将细胞温育大约4小时或直至实现OD600加倍。通过离心(3000xg，5min，室温)收获细胞，然后重悬在120mL蒸馏水中，接着是进一步的离心步骤。将沉淀重悬在3mL TE/LiAc(10mMTris，1mM EDTA，pH7；500mM醋酸锂)中，并添加甘油至终浓度为15％(v/v)，然后以等分试样储存在-80℃。
将酿酒酵母BXP10细胞使用修改的醋酸锂方法(Elble，R.″A simple andefficient procedure for transformation of yeasts.″Biotechniques 13.1(1992)：18-20.Ito，H.，等″Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations.″J.Bacteriol.153.1(1983)：163-68.)转化成亮氨酸原养型。将50μl解冻的感受态细胞分配至48孔微量滴定板(Nunc)中，然后添加用于缺口修复的DNA片段，如上所述。将平板通过在平放于操作台上时旋转(swirl)所述平板来混合。将300μlPEG/LiAc(40％w/v PEG 3350，100mM醋酸锂)添加至每个孔并再次混合。将平板在30℃以200rpm的摇动温育1小时，然后转移至42℃静止温育30min。在冰上温育1min之后，将平板离心(2000xg，5min，室温)，接着去除上清液并在200μl 1M山梨糖醇中重悬沉淀。将全部体积接种至含CSM-Leu营养补充剂(MPBiomedicals，Bio 101)的BMMD琼脂平板上，并在30℃温育4天。
挑取单菌落转化体并贴片接种至新鲜的BMMD琼脂平板上以供短期储存。将这些贴片培养物(patch)在30℃培养，然后将细胞接种至10mL BMMD摇瓶培养物中，并如先前所述冷冻保存。将10μl酵母原种接种至每孔含有0.5mL BMMD的48孔板中。在湿度室中实现微量滴定板中的培养物生长，所述湿度室是含有湿纸巾以提供～100％湿度并且在生长条件下历时5天的蒸发损失低于0.25％的密封的Perspex箱。将所述平板在摇动的湿度室中在30℃温育(30℃，200rpm)5天。离心所述48孔板以沉淀细胞(2000xg，10min，室温)，然后收获上清液。
通过凝胶渗透高压液相层析(GP-HPLC)测定所述培养上清液中所述硫代白蛋白变体的浓度。蛋白浓度使用配有UV检测的LC2010 HPLC系统(Shimadzu)在Shimadzu VP7.3客户服务器软件控制下测定。将25μL注射到7.8mm内径x 300mm长的TSK G3000SWXL柱(Tosoh Bioscience)上，所述柱带有6.0mm内径x 40mm length长的TSK SW保护柱(Tosoh Bioscience)。使样品在25mM磷酸钠、100mM硫酸钠、0.05％(w/v)叠氮化钠、pH7.0中以1mL.min-1进行层析，运行时间为15分钟。将样品通过在280nm UV检测通过峰的高度相对于已知浓度(10mg/mL)的重组人白蛋白标准品定量。
将每种具有单一突变的硫代白蛋白变体的非还原性SDS-PAGE分析和表达滴度(titer)(通过GP-HPLC)在图15中与对照相比。显然所有硫代白蛋白变体已经成功地自酿酒酵母BXP10分泌。优选的突变具有高表达滴度并且通过非还原性SDS-PAGE分析显示与rHA对照等同的锐利的Coomassie染色条带。
实施例3：其他硫代白蛋白变体的表达
图16描述了具有两个或更多个游离巯基的硫代白蛋白的另一种选择。将在上述实施例2中显示为表达的突变组合以生成设计为具有多个可用于缀合的游离巯基的序列。这种选择包括设计为具有多至5个游离巯基的硫代白蛋白变体，设计为具有来自一个选择组内的游离巯基或来自超过一个选择组的游离巯基的硫代白蛋白变体，设计为具有含或不含在HSA的C34处天然存在的游离巯基的游离巯基的硫代白蛋白变体，设计为具有来自一系列接近组的游离巯基的硫代白蛋白变体，和设计为具有自插入、延伸、添加和/或缺失衍生的游离巯基的硫代白蛋白变体。其代表了具有多个能缀合的半胱氨酸残基的硫代白蛋白的亚组。这些硫代白蛋白变体的细节，编码它们的质粒和它们的DNA和蛋白质序列的SEQ ID No.在图16中描述，以类似于图11对于具有单一修饰的硫代白蛋白变体的方式。用于质粒构建和从酿酒酵母BXP10表达的方法类似于上文描述的那些。
图17显示这些额外的硫代白蛋白变体中的每一种与rHA对照(pDB3927编码序列)相比的非还原性SDS-PAGE分析和表达滴度(通过GP-HPLC)。类似地，显然所有硫代白蛋白变体已经成功地从酿酒酵母BXP10分泌。因此确认了所述选择标准允许产生合适的硫代白蛋白变体，并因此表明在不想要的错误折叠或聚集方面没有问题。类似地，优选的突变组合具有高表达滴度并且通过非还原性SDS-PAGE分析显示与rHA对照等同的锐利的Coomassie染色条带。
实施例4：硫代白蛋白变体的产生、纯化和缀合
将五种冷冻保存的酵母原种(9116、9118、9124、9125和9130；图11)每种以1mL等分试样接种到含有100mL BMMS生长培养基(不含氨基酸和(NH4)2SO4的酵母氮源基础，Difco 1.7g/L；一水合柠檬酸6.09g/L；无水Na2HPO4 20.16g/L；(NH4)2SO4 5.0g/L；pH6.5±0.2；蔗糖，加至20g/L)的摇瓶中。当摇瓶中的细胞浓度达到0.8-1.2g/L时将细胞从摇瓶转移至发酵罐(10L工作体积，Sartorius Biostat C 10-3发酵罐)，这种发酵罐中达到≥10mg/L(大于或等于10mg/L)的细胞接种物浓度。
硫代白蛋白变体蛋白通过五种酵母菌株中每种的无污染菌培养物在高细胞密度(HCD)补料分批发酵中产生。发酵的目的是通过控制补料速率添加从而避免副产物如乙醇和乙酸的形成来实现最大生物量和产率。发酵方法的更多细节在WO96/37515中描述。将温度和pH分别控制在30℃和pH5.5。培养物上清液使用Sorvall RC 3C离心机(DuPont)通过离心收获并冷冻储存，然后解冻用于后续的纯化。终产物浓度通过GPHPLC使用配备有在Shimadzu VP7.3客户服务器软件控制下的UV检测的LC2010 HPLC系统(Shimadzu)测定，如上所述。图18提供了每种白蛋白变体的产率(以g/L培养物上清液表示)并显示在所有情况下获得了超过1g/L培养物上清液的高产物滴度。
使用单一步骤层析流程制备适用于质谱的材料。这种纯化步骤使用装填有AlbuPureTM基质(ProMetic BioSciences Ltd，Cambridge UK或NovozymesBiophama UK Ltd.)的柱(床体积大约200μL)。将其用50mM磷酸钠，pH5.3平衡，并加载纯培养物上清液(约pH5.5-6.5)至约40mg蛋白/mL基质。将所述柱用各为约3倍柱体积的50mM磷酸钠，pH5.3和50mM醋酸铵，pH8.0分别洗涤。将结合的蛋白使用约5倍柱体积的50mM醋酸铵、10mM辛酸酯，pH7.0洗脱。用于加载步骤的流速为137μL/min，而洗涤和洗脱步骤通过离心力使用Heraeus Multifuge 3离心机以300rpm来进行。终浓度在1.8-4.0mg/mL的范围中，并且样品为约2mL体积。游离巯基的测定通过下文描述的方法在样品洗脱之后即刻进行。
蛋白上的游离巯基数可以使用Ellman试剂以分光光度法测定。Ellman试剂(5’5’-二硫-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB))是一种芳族二硫化物，其与巯基反应形成所述蛋白质与一摩尔5-硫-2-硝基苯甲酸(TNB)的混合型二硫化物(每摩尔蛋白硫氢基)。该反应还自释放在溶液中的游离TNB产生黄色。或者，蛋白上的游离巯基数可以使用对用DTNB试剂处理过的蛋白样品的质谱分析来确定。5-硫-2-硝基苯甲酸(TNB)具有199Da的分子量，如此197Da的质量增加(TNB减去在与测试蛋白上的游离巯基形成二硫键的过程中损失的H2)表明蛋白样品上存在一个游离巯基。
将700μL所述测试蛋白样品添加至100μl缓冲液2(4mg/mL DTNB和500mM磷酸钠，pH7.0)和900μL缓冲液1(0.1M Tris-HCl，100mM EDTA，pH8.0)。允许所述制备物在环境温度(21-25℃)混合25分钟，然后通过低分子量截留滤器(Vivaspin 2-10000 MWCO Sartorius Stedim Germany)过滤。用两倍体积的0.1％三氟乙酸(TFA)洗涤所述滤器，并将样品重悬在1ml 0.1％TFA中。通过脱盐/浓缩使用固相提取(SPE)制备TNB标记和未标记的样品用于质谱分析。将SPE柱首先使用1mL 70％乙腈(ACN Fisher)/0.1％TFA润湿，然后用0.1％TFA平衡来准备就绪以供加载来制备SPE柱。将1mL样品加载到平衡的SPE柱上，允许蛋白结合一段时间。然后将结合的蛋白和SPE柱在1mL 0.1％甲酸(Merck)中洗涤三次。最后将结合的蛋白洗脱到用0.5mL70％ACN/0.1％FA预洗涤的1mL微量离心管中。
对于飞行时间质谱，将30μL样品引入到杂合四极子飞行时间质谱仪(QqOaTOF，Applied Biosystems，QSTAR-
Figure BDA0000082557350000701
)中，其配备有正离子模式的IonSprayTM源，使用流动注射分析(FIA)。主动调节的唯一仪器参数是解耦势能(Decoupling Potential)(DP)，通常设为250V。通常平均进行2分钟样品扫描。对于蛋白质分析，将TOF分析仪相对于马肌红蛋白(Sigma)质子化分子离子校准，且解析度通常＞14,000。仪器控制和数据获取和处理使用AnalystTM QS v1.1软件(Applied Biosystems)进行。
对纯化硫代白蛋白样品的上述分析结果在下文描述。在添加DTNB时，所有样品如预期一样因大量游离巯基的存在迅速变为黄色。当将所述样品与含有单一游离巯基的rHA的等同样品在视觉上比较时，观察到的硫代白蛋白样品的颜色变化显著地更强烈，有力地表明每个硫代白蛋白分子上多个游离巯基的存在。将结果归纳在图18中，渐增的颜色强度通过增加的“+”数以逐渐增加的方式表示。
以较高发酵产率产生的硫代白蛋白变体优选用于上述通过质谱法进行的分析。因此，通过ESI TOF(电喷雾电离飞行时间)质谱在DTNB处理之前和之后分析重组蛋白rHA(A2C，L585C)(总共3个游离巯基)，rHA(D129C，C360S，L585C)(总共4个游离巯基)，和A2C rHA-Cys(总共3个游离巯基)以确定每种分子上存在的游离巯基数。
当在DTNB处理之前分析rHA(A2C，L585C)时(图19)，观察到的主卷积峰在66633Da和66807Da，相当于在预期质量66461Da之上172Da和346Da。这些修饰很可能因为生长培养基中存在的～172Da的物质交联至rHA(A2C，L585C)中的游离巯基。DTNB处理之后的质谱分析(图20)产生了一个67428Da的主卷积峰，其在具有3个游离巯基的蛋白的预期质量之上376Da。这种超出的质量最有可能是因为额外的TNB连接至游离巯基和额外的179Da，这有力地提示了4个游离巯基的存在和可能的被～179Da的物质封闭的另一巯基。因此，rHA(A2C，L558C)硫代白蛋白变体特别令人惊讶之处在于其提供超过预期数目的可用于缀合的反应性基团。还存在一系列相距～396Da的峰，其原因是在电离时仍存在过量的DTNB，引起与标记的rHA(A2C，L558C)分子形成DTNB加成物。这种加成物的形成已知在过量DTNB存在时发生。
当在DTNB处理之前分析rHA(D129C，C360S，L585C)(总共4个游离巯基)时(图21)，观察到的主卷积峰在66575Da和66747Da，其相当于在66403Da的预期质量之上172Da和344Da。这些修饰很可能因为生长培养基中存在的～172Da的分子交联至rHA(D129C，C360S，L585C)中的游离巯基。DTNB处理之后的质谱分析(图22)产生了一个67564Da的主卷积峰，其在具有4个游离巯基的蛋白的预期质量之上373Da。这种超出的质量最有可能是因为额外的TNB连接至游离巯基和额外的176Da，这有力地提示了5个游离巯基的存在和可能的被～176Da的物质封闭的另一巯基。因此，rHA(D129C，C360S，L585C)硫代白蛋白变体特别令人惊讶之处在于其提供超过预期数目的可用于缀合的基团。还存在一系列相距～396Da的峰，这些是由于在电离时仍存在过量的DTNB，引起与标记的rHA D129C，C360S，L585C形成DTNB加成物。这种加成物的形成已知在过量DTNB存在时发生。
最后，当在DTNB处理之前分析rHA-Cys(总共3个游离巯基)时(图23)，观察到的主卷积峰在66747Da和66919Da，其相当于在66574Da的预期质量之上172Da和344Da。然而还存在对应于预期的66575Da处的未修饰质量的较小的峰。该质谱表明一些游离巯基的封闭，同时存在的部分分子含有预期的3个游离巯基。DTNB处理之后的质谱分析(图24)产生了一个67142Da的主卷积峰，其在用3个TNB分子标记的蛋白的预期质量67165Da之下23Da，这有可能是因为两个TNB分子和175Da修饰的存在，提示存在3个巯基，其中一个被未知的～175Da物质类型封闭。然而，在更靠近地检视图24时，可以看到每个物质类型之上23Da存在次主峰。这些次主峰对应于原始数据(数据未显示)中的小肩，其很可能表明以3个TNB分子修饰的分子的存在，表明3个游离巯基。存在的其他主要物质类型是因为在电离时仍存在过量DTNB，引起与标记的rHAD129C，C360S，L585C形成DTNB加成物。这种加成物的形成已知在过量DTNB存在时发生。
总之，已经产生了一系列带有三个或更多个能缀合的半胱氨酸残基的硫代白蛋白变体。所述能缀合的半胱氨酸可能存在于可具有或可不具有二级结构的区域中，和/或可以或可以不产生自天然的二硫键，和/或可以或可以不是额外的半胱氨酸残基(如从HSA的天然C-末端延伸的半胱氨酸残基)。
实施例5：从硫代白蛋白变体形成凝胶
将TA35(即A2C、A364、D562，除了天然存在的C34之外)和TA33(即A2C、L585C，除了天然存在的C34之外)的样品在室温温育24小时，二者均形成了凝胶。
Figure IDA0000082557400000021
Figure IDA0000082557400000031
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Claims (31)

1.一种制备能缀合的多肽的方法，包括：
a)提供包含至少一例白蛋白序列的三维结构模型，并且任选地提供该白蛋白序列的氨基酸序列，
b)在所述白蛋白序列中选择氨基酸残基，其对应于相对所述模型的或所述氨基酸序列的序列的N端或C端的第1、2、3、4或5个残基或其在涉及三维结构模型的所述白蛋白序列的各种情况下满足以下条件：
i)至少80％的溶剂表面可及性；
ii)至少30的B因子得分；
iii)没有已知引起热不稳定性的多态性；
c)用半胱氨酸取代选择的残基或在选择残基的N端侧或C端侧插入半胱氨酸，
d)任选地，对所述白蛋白序列进行额外的变化，其中每个变化为氨基酸缺失、取代或插入；和
e)制备具有所得氨基酸序列的多肽。
2.根据权利要求1的方法，其中所述残基是：
a)不在二级结构内，并且任选地，B因子为至少60和/或任选地表面可及性为至少90％；
b)在二级结构内，并且任选地，B因子为至少40和/或任选地表面可及性至少为90％；
c)不在二级结构内，并且任选地，B因子为至少50；或
d)在二级结构内，并且任选地，B因子为至少30。
3.通过权利要求1或2的方法可获得的能缀合的多肽。
4.根据权利要求3的能缀合的多肽，其包含与SEQ ID No.1的残基1-585至少60％相同的氨基酸序列，或其片段或融合物，其中：
a)在与SEQ ID No.1的位置34等同的位置，存在能缀合的半胱氨酸残基；并且
b)在所述多肽中的其他位置，存在两个或更多个能缀合的半胱氨酸残基。
5.根据权利要求3的能缀合的多肽，其包含与SEQ ID No.1的残基1-585至少60％相同的氨基酸序列，或其片段或融合物，其中：
a)在与SEQ ID No.1的位置34等同的位置，不存在能缀合的半胱氨酸残基；并且
b)在所述多肽中的其他位置，存在三个或更多个能缀合的半胱氨酸残基。
6.一种能缀合的多肽，其包含与SEQ ID No.1的残基1-585至少60％相同的氨基酸序列，或其片段或融合物，其中：
a)在与SEQ ID No.1的位置34等同的位置，存在能缀合的半胱氨酸残基；并且
b)在所述多肽中的其他位置，存在两个或更多个能缀合的半胱氨酸残基。
7.一种能缀合的多肽，其包含与SEQ ID No.1的残基1-585至少60％相同的氨基酸序列，或其片段或融合物，其中：
a)在与SEQ ID No.1的位置34等同的位置，不存在能缀合的半胱氨酸残基；并且
b)在所述多肽中的其他位置，存在三个或更多个能缀合的半胱氨酸残基。
8.根据权利要求3-7中任一项的多肽，其在与SEQ ID No.1的位置2和585等同的位置包含能缀合的半胱氨酸残基。
9.根据权利要求3-8中任一项的多肽，其包含四个或更多个能缀合的半胱氨酸残基。
10.根据权利要求9的多肽，其包含：
a)在与SEQ ID No.1的位置2和585等同的位置处的能缀合的半胱氨酸残基；和
b)在与SEQ ID No.1的位置364和562等同的位置中的一个或两个处的能缀合的半胱氨酸残基。
11.根据权利要求3-10中任一项的多肽，其中所述多肽包含以下的一项或多项：
a)在对应于与SEQ ID No.1的残基L585、D1、A2、D562、A364、A504、E505、T79、E86、D129、D549、A581、D121、E82、S270、Q397和A578中任何等同的位置的位置处用半胱氨酸取代非半胱氨酸的氨基酸；
b)在与对应于与SEQ ID No.1的残基L585、D1、A2、D562、A364、A504、E505、T79、E86、D129、D549、A581、D121、E82、S270、Q397和A578中任何等同的位置的氨基酸的N端侧或C端侧相邻的位置插入半胱氨酸；
c)在对应于SEQ ID No.1的C360、C316、C75、C168、C558、C361、C91、C124、C169和C567中任一的位置缺失半胱氨酸，从而在C369、C361、C91、C177、C567、C316、C75、C169、C124和C558中任一处生成能缀合的半胱氨酸；
d)向白蛋白序列的N末端残基的N端侧或向白蛋白序列的C末端残基的C端侧添加半胱氨酸
从而使(a)、(b)、(c)和(d)的取代、缺失、添加或插入事件的净结果为所述多肽序列的能缀合的半胱氨酸残基数相对于所述取代、插入、缺失和添加事件之前的多肽增加。
12.根据权利要求3-11中任一项的多肽，其中至少一个半胱氨酸残基已经用不同的氨基酸残基，特别是Ser、Thr、Val或Ala取代。
13.根据权利要求3-12中任一项的多肽，其包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个能缀合的半胱氨酸残基。
14.根据权利要求3-13中任一项的多肽，其中，当所述多肽包含三个或更多个能缀合的半胱氨酸残基时，当所述多肽折叠时，两个或更多个所述能缀合的半胱氨酸残基之间的距离为至少
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15.根据权利要求3-14中任一项的多肽，其中将一个或多个所述能缀合的半胱氨酸与生物活性分子缀合。
16.根据权利要求3-15中任一项的多肽，其中所述多肽与SEQ ID No.1具有至少70、75、80、85、90或95％同一性。
a)根据权利要求3-15中任一项的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO：1具有至少95％序列同一性并且包含能缀合的半胱氨酸残基，所述能缀合的半胱氨酸残基位于：(a)A2+L585，(b)A2+A364+D562+L585C，(c)A2和与所述白蛋白的C端的C端侧相邻处(d)T79+A364；(e)A364+D1；(f)T79+D562+A364；(g)D562+A364+D1；(h)T79+D562+A364+A504；(i)T79+D562+A364+L585；(j)T79+D562+A364+D1；(k)T79+D562+A364+L585+D1；(l)E86+D562+A364+A504+A2；(m)S270+A581；(n)S270+D129；(o)S270+A581+E82；(p)S270+A581+D129；(q)S270+A581+E82+D129；(r)S270+A581+E82+D129+Q397；(s)C369+C177；(t)A364+A581；(u)T79+A364+A581；(v)A364+A581+D129；(w)A364+C177；(x)D562+C369；(y)D129+C369；(z)A581+C369；或(ai)D562+D129+C369。
17.根据权利要求3-16中任一项的多肽，其中所述多肽还包含另外的接头，所述接头可以与生物活性化合物连接。
18.一种多核苷酸，其编码权利要求3-17中任一项的多肽。
19.一种质粒，其包含权利要求18的多核苷酸。
20.一种宿主细胞，其包含权利要求18的多核苷酸和/或权利要求19的质粒。
21.权利要求20的宿主细胞，其是酵母细胞，特别是酿酒酵母细胞。
22.一种缀合物，其包含生物活性化合物和根据权利要求3-21中任一项的多肽，其中所述生物活性化合物通过所述多肽的能缀合的半胱氨酸残基与所述多肽连接。
23.根据权利要求22的缀合物，其进一步包含一种或多种另外的生物活性化合物，每种生物活性化合物通过所述多肽的能缀合的半胱氨酸残基与所述多肽连接。
24.一种产生权利要求3-23中任一项的多肽的方法，其包括：
a)在允许所述多肽表达的条件下培养权利要求20或21的宿主细胞；和
b)从所述宿主细胞和/或从宿主细胞生长培养基回收所述多肽。
25.一种产生权利要求22或23的缀合物的方法，其包括将生物活性化合物与权利要求3-16中任一项的多肽通过所述多肽的能缀合的半胱氨酸残基连接。
26.根据权利要求24或25的方法，其中所述宿主细胞展现增强的蛋白伴侣活性。
27.一种组合物，其包含权利要求22或23的缀合物和至少一种药学可接受的载体或稀释剂。
28.一种凝胶，其包含根据权利要求3-17中任一项的多肽和/或根据权利要求22-23中任一项的缀合物。
29.根据权利要求22或23的缀合物，或通过根据权利要求24、25或26的方法产生的缀合物，用于治疗疾病、治疗病症和/或用于诊断的用途。
30.权利要求24或25的方法，其进一步包括确定所述多肽的受体结合能力和/或缀合能力，并选择具有受体结合能力和/或缀合能力的多肽。
31.根据权利要求3-17中任一项的多肽和/或根据权利要求22或23的缀合物用于产生凝胶的用途。
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