JP7282693B2 - 改良されたタンパク質発現株 - Google Patents

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Description

本願は紙媒体及びコンピューター読み取り可能な形態の配列表を含む。斯かる紙媒体及びコンピューター読み取り可能な形態の配列表は、本願明細書の一部であり、或いは引用により本願に組み込まれる。
本発明は主に、親株よりも実質的に高いレベルでタンパク質を発現する真菌株の開発に関する。
約３０年もの間、所望の異種タンパク質は微生物により産生されてきた。しかし、必要なコーディング配列を導入して発現を得たとしても、商業生産用にプロセスを最適化するためには、まだ達成すべきことが多く残っている。関心を集める領域の１つとして、株の改善、即ち、タンパク質をより高い収量又はより良い純度で産生できる宿主微生物の株の探索又は作製が挙げられる。
産生量を向上する上で、良好な発現系を設計したら、次はコーディング配列のコピー数を増加させ、或いはｍＲＮＡの量又は安定性を上昇させ、或いはタンパク質の折り畳み及び／又は分泌を向上させ、或いはタンパク質の分解を低減するべく試みるであろう。しかし、所望される発現増強の効果がみられるのは、阻害因子を標的とした場合のみである。
従って必要となるのは、所望のタンパク質、例えば異種タンパク質の産生量の増加を可能とする宿主株である。
本発明者らは、驚くべきことに、真菌細胞のＧＳＨ１における突然変異が、こうした異種タンパク質の産生量の増加を引き起こすことを見出した。
サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＧＳＨ１遺伝子産物はγ－グルタミルシステイン合成酵素（Ｇｓｈ１ｐ）である。この酵素は、グルタチオン（Ｌ－γ－グルタミルシステイニルグリシン；ＧＳＨ）の合成における律速となる第１の段階を触媒する。第２の段階はグルタチオン合成酵素（Ｇｓｈ２ｐ）によって触媒される。グルタチオンは、幾つかの生合成経路や解毒反応の補因子、酵母のミトコンドリアゲノムの維持、細胞の酸化ストレスからの保護など、多数の重要な役割を持つ重要な分子である（Ayer et al., (2010), Free Radical Biology & Medicine, 49:1956-1968)）。ＧＳＨ１遺伝子を欠損する酵母細胞は、グルタチオンを含有する培地で培養しない限り、酸化条件や重金属への暴露など種々のストレス条件に過敏に反応し、最終的には成長停止に至る（Spector et al., (2001), The Journal of Biological Chemistry, 276, (10), 7011-7016）。グルタチオンは、酸化ストレス時に核を保護することも知られている（Hatem et al., (2014), Free Radical Biology & Medicine, 67, 103-114）。Biterova及びBarycki (2009)（The Journal of Biological Chemistry 284, 32700-32708）は、グルタチオン生合成の機序を調べるために、Ｇｈｓ１（別名グルタミン酸システインリガーゼ）の結晶構造を分析したところ、ヒトグルタミン酸システインリガーゼの変異体が観察された（例：Ｒ１２７Ｃ、Ｐ１５８Ｌ、Ｈ３７０Ｌ、Ｐ４１４Ｌ）と述べている。
従来（ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６８２３９）、ＮＯＴ４（別名ＭＯＴ２）の変異により、宿主株で産生される異種タンパク質の収量が増加することが確認されている。本発明者らは今般、ＮＯＴ４及びＧＳＨ１突然変異を組み合わせることにより、驚くべきことに収量がさらに増加することを見出した。
Ｎｏｔ４はユビキチン連結酵素であり、Ｃｃｒ４－Ｎｏｔ複合体の一部である。Ｃｃｒ４－Ｎｏｔ複合体は真核細胞において保存されており、酵母では本複合体は９つのコアサブユニット：Ｃｃｒ４、Ｃａｆ１、Ｃａｆ４０、Ｃａｆ１３０、Ｎｏｔ１、Ｎｏｔ２、Ｎｏｔ３、Ｎｏｔ４、及びＮｏｔ５からなる（Collart, 2003, Global control of gene expression in yeast by the Ccr4-Not complex. Gene 313: 1-16; Bai et al., 1999, The CCR4 and Caf1 proteins of the Ccr4-Not complex are physically and 機能ally separated from Not2, Not4, and Not5. Mol. Cell. Biol. 19: 6642-6651）。本複合体が環境からシグナルを識別すると共に、あらゆるレベルの遺伝子発現を纏め上げて、斯かるシグナルに効率的に反応するための、中心的な交換機として機能すると考えられている（Collart, 2012, The Ccr4-Not complex. Gene 492(1): 42-53）。Ｎｏｔタンパク質（Ｎｏｔ１、Ｎｏｔ２、Ｎｏｔ３、Ｎｏｔ４）は、転写調節への広範な関与が推測されるＲＮＡポリメラーゼII複合体の構築に必要であると考えられている（Collart, 1994, Not1(cdc39), Not2(cdc36), Not3, and Not4 encode a global-negative regulator of transcription that differentially affects tata-element utilization. Genes & Development 8(5): 525-537; Collart, 2012, 上述）。
最近では共結晶構造から、Ｃｃｒ４－Ｎｏｔ複合体の骨格タンパク質であるＮｏｔ１のＨＥＡＴ繰り返し領域に、Ｎｏｔ４のＣ末端領域が巻き付いている様子が示唆されている（Bhaskar, 2015, Architecture of the ubiquitylation module of the yeast Ccr4-Not complex. Structure 23(5): 921-8）。
本発明は、
ａ．改変されたＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログ、及び／又は
ｂ．改変されたＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベル、及び／又は
ｃ．改変されたＧＳＨ１遺伝子又はそのホモログ、及び／又は
ｄ．改変されたＧＳＨ１遺伝子又はそのホモログの発現レベル
を有する真菌宿主細胞を提供する。
また、本発明は、更に
ｅ．改変されたＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログ、及び／又は
ｆ．改変されたＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベル、及び／又は
ｇ．改変されたＮＯＴ４遺伝子又はそのホモログ、及び／又は
ｈ．改変されたＮＯＴ４遺伝子又はそのホモログの発現レベル
を有する真菌宿主細胞を提供する。
また、本発明は、所望のタンパク質、例えば異種タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む、真菌宿主細胞の培養物であって、低減されたＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベル及び／又は発現レベルを有すると共に、任意により更に低減されたＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベル及び／又は発現レベルを有することを特徴とする、真菌宿主細胞の培養物を提供する。
更に、本発明は、所望のタンパク質、例えば異種タンパク質を、真菌宿主細胞により産生する方法を提供する。
本発明は、真菌宿主細胞による所望のポリペプチドの産生量を改変する方法を提供する。
また、本発明は、所望のタンパク質、例えば異種タンパク質を提供する。所望のタンパク質としては、アルブミン、或いはその変異体、断片、及び／又は融合体が好ましい。
更に、本発明は、斯かる所望のタンパク質を含む組成物、例えば医薬組成物を提供する。
また、本発明は、患者を治療する方法であって、斯かる組成物の有効量を患者に投与することを含む方法を提供する。
また、本発明は、上記の１又は２の特性を有する真菌宿主細胞を調製する方法を提供する。
また、本発明は、配列番号２に対して少なくとも５０％の同一性を含むと共に、配列番号２の４７、４８、４９、５０、５１、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、４０９、４５１、４５２、４５３、４５４及び４５５から選択される１又は２以上の位置に対応する位置に変異を含む、Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログを提供する。
更に、本発明は、本発明のＧｓｈ１変異体をコードするポリヌクレオチドを提供する。
本明細書に記載の態様は、実施例及び／又は好適な態様の欄にのみ記載されたものも含め、他の任意の態様と組み合わせることが可能である。但し、斯かる組合せが不適切である旨を明示した場合を除く。
図１は、２０種のアミノ酸の分類及び相互関係を示すベン図である。
図２は、プラスミドｐＤＢ５４３８の構成を示す。
図３は、プラスミドｐＤＢ２３０５の構成を示す。ここで「ＨＳＡ」は組換ヒトアルブミンを意味し、「ｍＦＬ」はリーダー配列を意味する。
図４は、プラスミドｐＤＢ２２４４の構成を示す。ここで「ｒＨＡ」は組換ヒトアルブミンを意味し、「ＦＬ」はリーダー配列を意味する。
図５は、プラスミドＹＣｐ５０の構成を示す。
図６は、プラスミドｐＤＢ５８６２の構成を示す。ここで「アルブミン変異体」は配列番号４５をコードする核酸を意味し、「ｍＦＬ」はリーダー配列を意味する。
図７は、プラスミドｐＤＢ３９３６の構成を示す。
図８は、プラスミドｐＤＢ５９１２の構成を示す。ここで「ｍＦＬ」はリーダー配列を意味する。
図９は、プラスミドｐＤＢ３０２９の構成を示す。ここで「Ｉｎｖ」はリーダー配列を意味する。
定義
アルブミン：「アルブミン」という語は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又はＨＳＡドメインと同一及び／又は極めて類似の三次構造を有すると共に、ＨＳＡ又はその関連ドメインと類似の特性を有するタンパク質を意味する。類似の三次構造とは、例えば、「親アルブミン」と同一の分類に属する種のアルブミンの構造である。アルブミンの主な特性としては、ｉ）血漿の量を調節する能力（膨脹活性）、ii）約１９日±５日という長い血漿半減期、iii）ｇｐ６０、別名アルボンディン（albondin）への結合能、iv）ＦｃＲｎへの結合能、ｖ）リガンド結合能、例えば内因性分子、例えば酸性親油性化合物、例えばビリルビン、脂肪酸、ヘミン、及びチロキシンへの結合能（Kragh-Hansen et al, 2002, Biol. Pharm. Bull. 25, 695の表１も参照：本文献は引用により本明細書に組み込まれる）、及びvi）酸性又は電気陰性の性質を有する小型有機化合物、例えば薬物、例えばワルファリン、ジアゼパム、イブプロフェン、及びパクリタキセルへの結合能（Kragh-Hansen et al, 2002, Biol. Pharm. Bull. 25, 695の表１も参照：本文献は引用により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。あるタンパク質又は断片をアルブミンと特定する上で、これらの特性の全てが満たされる必要はない。例えば、ある断片が特定のリガンドや有機化合物への結合に関与するドメインを含まないの場合、斯かる断片の変異体はこれらの特性の全ては有さないものと推測される。
アレル変異体：「アレル変異体」という語は、同一の染色体座を占める一遺伝子が有する２又はそれ以上の択一的形態の各々を意味する。アレル変異は天然において変異を通じて発生し、従って個体集団内における多型を生じうる。遺伝子変異はサイレントである（コードされるポリペプチドには変化が生じない）場合もあるが、従ってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列にも変化が生じる場合もある。あるポリペプチドのアレル変異体とは、遺伝子のアレル変異体によりコードされるポリペプチドである。
ｃＤＮＡ：「ｃＤＮＡ」という語は、真核細胞又は原核細胞から得られる成熟後のスプライスされたｍＲＮＡ分子からの逆転写により調製されるＤＮＡ分子を意味する。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡ内に存在するイントロン配列を有さない。ｍＲＮＡの前駆体たる初期一次ＲＮＡ転写生成物は、スプライシングを含む一連の工程を経て、成熟後のスプライスされたｍＲＮＡとなる。
コーディング配列：「コーディング配列」という語は、ポリペプチドのアミノ酸配列を直接特定するポリヌクレオチドを意味する。コーディング配列は通常はオープンリーディングフレームによって定められる。オープンリーディングフレームは開始コドン、例えばＡＴＧ、ＧＴＧ、又はＴＴＧから始まり、停止コドン、例えばＴＡＡ、ＴＡＧ、又はＴＧＡで終わる。コーディング配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又はこれらの組合せの何れであってもよい。
調節配列：「調節配列」という語は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要な核酸配列を意味する。各々の調節配列は、前記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して、また、他の調節配列に対して、固有（即ち、同一の遺伝子に由来）するものであってもよく、外来（即ち、異なる遺伝子に由来）するものであってもよい。斯かる調節配列としては、これらに限定されるものではないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、転写ターミネーター等が挙げられる。調節配列としては少なくともプロモーターと、転写及び翻訳の停止シグナルとが含まれていればよい。前記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコーディング領域に対する調節配列の連結を容易とするべく、特定の制限部位を導入する目的で、調節配列にリンカーを設けてもよい。
発現：「発現」という語には、ポリペプチドの産生に関与する一連の工程が含まれる。斯かる工程としては、これらに限定されるものではないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌が挙げられる。
発現カセット：「発現カセット」という語は、ポリペプチドをコードすると共に、その発現を可能とする上流及び下流の調節配列を更にコードするポリヌクレオチドを意味する。
発現宿主：「発現宿主」という語は、所望のタンパク質、特に異種タンパク質を発現する宿主細胞を意味する。
発現ベクター：「発現ベクター」という語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むと共に、その発現を可能とする調節配列と作動式に連結された、直鎖状又は環状のＤＮＡ分子を意味する。
断片：「断片」という語は、成熟ポリペプチドのアミノ及び／又はカルボキシ末端、及び／又は、成熟ポリペプチドの内部領域から、１又は２以上の（数個の）アミノ酸が欠失されてなるポリペプチドを意味する。断片は、あるポリペプチドに由来する単一の中断のない配列であってもよいが、ポリペプチドの異なる部位に由来する２又はそれ以上の配列を含んでいてもよい。アルブミンに関して言えば、断片のサイズは約２０アミノ酸残基以上、好ましくは３０アミノ酸残基以上、より好ましくは４０アミノ酸残基以上、より好ましくは５０アミノ酸残基以上、より好ましくは７５アミノ酸残基以上、より好ましくは１００アミノ酸残基以上、より好ましくは２００アミノ酸残基以上、より好ましくは３００アミノ酸残基以上、より一層好ましくは４００アミノ酸残基以上、最も好ましくは５００アミノ酸残基以上である。好ましい態様では、断片はアルブミンの１又は２以上のドメインに相当する。本発明において好ましいアルブミンのドメインとしては、配列番号１０のアミノ酸残基１～１９４±１～１５アミノ酸からなるＨＳＡドメインＩに対して、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５％、又は１００％の同一性を有するドメイン；配列番号１０のアミノ酸残基１９２～３８７±１～１５アミノ酸からなるＨＳＡドメインIIに対して、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５％、又は１００％の同一性を有するドメイン；及び、配列番号１０のアミノ酸残基３８１～５８５±１～１５アミノ酸からなるＨＳＡドメインIIIに対して、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５％、又は１００％の同一性を有するドメイン；並びに、これらのドメインのうち１又は２以上（数個）、例えばドメインＩ及びII、ドメインII及びIII、又はドメインＩ及びIIIが、互いに連結されてなるものが挙げられる。なお、アルブミンのドメイン間の正確な境界を定める、一般に認められた基準は存在しないため、前記の範囲は互いに重複していてもよく、ドメインのＮ末端及び／又はＣ末端において、各々±１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５アミノ酸、好ましくは±１～１５アミノ酸、より好ましくは±１～１０アミノ酸、最も好ましくは±１～５アミノ酸の違いがあってもよい。惹いては、各ドメインの長さに最大３０アミノ酸、好ましくは最大２０アミノ酸、より好ましくは最大１０アミノ酸のばらつきがあってもよい。また、複数のドメイン間の境界上に存在するアミノ酸残基が何れのドメインに属するかには、幾分の意見の相違があるかもしれない。同様の理由により、アルブミンドメインのアミノ酸残基に関して、前述の数とは異なる文献が存在する可能性もある。しかし、当業者であれば、斯かる文献の教示及び上記の教示を勘案することで、どのようにアルブミンドメインを特定するかを理解するであろう。非ヒトアルブミンの対応するドメインについては、EMBOSSパッケージ（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277）、好ましくはバージョン３．０.０以降、より好ましくはバージョン５．０.０以降のNeedleプログラムにより実行されるNeedleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453）により、ＨＳＡとのアラインメントを行うことで決定できる。使用される任意パラメーターは、例えばギャップオープンペナルティー（gap open penalty）が１０、ギャップエクステンションペナルティー（gap extension penalty）が０．５、及びEBLOSUM62（BLOSUM62のEMBOSSバージョン）置換マトリックスである。利用可能な他のアラインメントツールとしては、例えば本明細書に記載のMUSCLEが挙げられる。なお、DockalとKjeldsenとではドメインの定義が異なる場合がある：Dockal et al（The Journal of Biological Chemistry, 1999, Vol. 274(41): 29303-29310）によるＨＳＡのドメインの定義は、ドメインＩが配列番号１０のアミノ酸１～１９７、ドメインIIが配列番号１０のアミノ酸１８９～３８５、ドメインIIIが配列番号１０のアミノ酸３８１～５８５である。Kjeldsen et al（Protein Expression and Purification, 1998, Vol 13: 163-169）によるＨＳＡのドメインの定義は、ドメインＩが配列番号１０のアミノ酸１～１９２、ドメインIIが配列番号１０のアミノ酸１９３～３８２、ドメインIIIが配列番号１０のアミノ酸３８３～５８５である。各ドメインはそれ自体２つの相同のサブドメイン、即ち１～１０５と１２０～１９４、１９５～２９１と３１６～３８７、及び３８８～４９１と５１２～５８５からなり、これらはそれぞれ残基Ｌｙｓ１０６～Ｇｌｕ１１９、Ｇｌｕ２９２～Ｖａ１３１５、及びＧｌｕ４９２～Ａｌａ５１１を含む柔軟なサブドメイン間リンカー領域により連結されてなる。
従って、本発明では以下のようにドメインを定義することが好ましい。まず、アミノ酸番号は配列番号１０（ＨＳＡ）に対応する。しかし、当業者であれば、これらの番号を用いて、他のアルブミン配列における対応するドメインを特定することが可能である。ドメインＩは、アミノ酸１から開始してもよく、しなくてもよく、アミノ酸１９２、１９３、１９４、１９５、１９６又は１９７の何れか、好ましくはアミノ酸１９２、１９４又は１９７の何れかで停止してもよく、しなくてもよい。ドメインIIは、アミノ酸１８９、１９０、１９１、１９２又は１９３、好ましくはアミノ酸１８９、１９２又は１９３の何れかで開始してもよく、しなくてもよく、アミノ酸３８２、３８３、３８４、３８５、３８６又は３８７、好ましくはアミノ酸３８２、２８５又は３８７の何れかで停止してもよく、しなくてもよい。ドメインIIIは、アミノ酸３８１、３８２又は３８３、好ましくはアミノ酸３８１又は３８３で開始してもよく、しなくてもよく、アミノ酸５８５で停止してもよく、しなくてもよい。非ヒトアルブミンのドメインのアミノ酸長及び／又は残基数は、ＨＳＡのドメインと同一でも異なってもよい。例えば、１又は２以上（数個）の他のアルブミン、断片、誘導体、変異体、及び／又は融合体について、ＨＳＡのドメインＩ、II及び／又はIIIに対応するドメインを特定するために、多重アラインメント又はペアワイズアラインメントを作成してもよい。
融合パートナー：本明細書を通じて、融合パートナーとは、アルブミン或いはその変異体及び／又は断片と遺伝子工学的に連結されていてもよい非アルブミン部分を意味する。
異種タンパク質：異種タンパク質とは、宿主細胞により天然では産生されないタンパク質であって、好ましくは選択マーカー（例えば抗生物質抵抗性マーカー、栄養要求性選択マーカー等）、シャペロン、ＦＬＰ、ＲＥＰ１、又はＲＥＰ２等のタンパク質を含まないタンパク質を意味する。
宿主細胞：「宿主細胞」という語は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクト又は発現ベクターの形質転換（transformation）、トランスフェクション（transfection）、形質導入（transduction）等を許容しうる任意の細胞型を意味する。「宿主細胞」という語は、複製時に生じた変異により親細胞との同一性が失われた親細胞の任意の子孫を包含する。
成熟ポリペプチド：「成熟ポリペプチド」という語は、翻訳及び任意の翻訳後修飾、例えばＮ末端プロセシング、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化等を経たポリペプチドの最終形態を意味する。ヒトアルブミンの成熟配列を配列番号１０に、未成熟形態の例を配列番号１２にそれぞれ示す。
成熟ポリペプチドコーディング配列：「成熟ポリペプチドコーディング配列」という語は、成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。ヒトアルブミンの成熟ポリペプチドコーディング配列の例を配列番号９に、ヒトアルブミンの未成熟形態のコーディング配列の例を配列番号１１にそれぞれ示す。
ミュータント：「ミュータント」（mutant）という語は、変異体（variant）をコードするポリヌクレオチドを意味する。
核酸コンストラクト：「核酸コンストラクト」という語は、天然遺伝子から単離され、或いは核酸セグメントを含むように改変され、天然では存在しない形態となった、或いは合成された、一本鎖又は二本鎖の核酸分子であって、１又は２以上の調節配列を含むものをいう。
作動式に連結された：「作動式に連結された」という語は、ポリヌクレオチドのコーディング配列に対して調節配列が適切な位置に配置され、調節配列によってコーディング配列の発現が誘導されるように構成されることをいう。
親又は親アルブミン：「親」又は「親アルブミン」という語は、本発明のアルブミン変異体を産生するべく改変を加える元のアルブミンを意味する。親は天然（野生型）ポリペプチドでもそのアレルでもよく、その変異体でもよい。好ましい態様では、親アルブミンは野生型アルブミン、より好ましくは配列番号１２に開示のヒト由来の野生型アルブミン（UNIPROT: P02768.2）又はその成熟配列（配列番号１０）である。他の野生型アルブミンとしては、表１に示す非網羅的なリストから選択することができる。
Figure 0007282693000001
好ましくは、親アルブミンは成熟アルブミンである。他の態様では、親アルブミンは、配列番号１０に対して少なくとも７０％、より好ましくは７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より一層好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は少なくとも９９．８％同一であると共に、アルブミン、例えばＨＳＡの主な特性の少なくとも１つを維持するか、又は、類似の三次構造を有するものをいう。アルブミンの主な特性は、Sleep, 2015, “Albumin and its application in drug delivery”, Expert Opinion on Drug Delivery 12(5): 793-812に要約されている（本文献は参照により本明細書に組み込まれる。）。
配列同一性：２つのアミノ酸配列又は２つのヌクレオチド配列の間の類似度は「配列同一性」（sequence identity）というパラメーターを用いて記載される。
本発明の目的において、２つのアミノ酸配列の間の配列同一性は、EMBOSSパッケージのNeedleプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277）、好ましくはバージョン５．０.０以降を用いて実施されるNeedleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453）により決定される。使用されるパラメーターは、ギャップオープンペナルティー（gap open penalty）が１０、ギャップエクステンションペナルティー（gap extension penalty）が０．５、及びEBLOSUM62（BLOSUM62のEMBOSSバージョン）置換マトリックスである。Needleの「最長同一性」（longest identity）と付された出力値（-nobrief オプションを用いて得られる）を、配列同一性として使用する。これは以下のように計算される。
Figure 0007282693000002
本発明の目的において、２つのデオキシリボヌクレオチド配列の間の配列同一性は、EMBOSSパッケージのNeedleプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, 同上）、好ましくはバージョン５．０.０以降を用いて実施されるNeedleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, 同上）により決定される。使用されるパラメーターは、ギャップオープンペナルティー（gap open penalty）が１０、ギャップエクステンションペナルティー（gap extension penalty）が０．５、EＤＮＡFULL（NCBI NUC4.4のEMBOSSバージョン）置換マトリックスである。Needleの「最長同一性」（longest identity）と付された出力値（-nobrief オプションを用いて得られる）を、配列同一性として使用する。これは以下のように計算される。
Figure 0007282693000003
変異体：「変異体」（variant）という語は、親ポリペプチド、例えばアルブミンに由来するポリペプチドであって、１又は２以上（数個）の位置に、改変、即ち置換、挿入、及び／又は欠失を有するものを意味する。置換（substitution）とは、ある位置を占めるアミノ酸が、異なるアミノ酸で置き換えられることを意味し、欠失（deletion）とは、ある位置を占めるアミノ酸が取り除かれることを意味し、挿入（insertion）とは、ある位置を占めるアミノ酸の隣に１～３アミノ酸が付け加えられることを意味する。改変されたポリペプチド（変異体）は、人為的な介入により、親ポリペプチド、例えばアルブミンをコードするポリヌクレオチド配列に修飾を加えることにより得ることができる。変異体アルブミンは、配列番号１０に対して、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より一層好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は少なくとも９９．８％同一である。また、親アルブミン、例えばＨＳＡの、主要な特性の少なくとも１つ又は類似の三次構造を維持していてもよく、いなくてもよい。一般に、ＨＳＡの変異体又は断片は、ＨＳＡと比較して少なくとも１０％（好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％）のリガンド結合活性（例えばビリルビン結合性）を有すると共に、ＨＳＡと比較して重量対重量比率で少なくとも５０％（好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、又は９５％）の膨脹活性を有する。アルブミン、アルブミン変異体、又はアルブミンの断片の膨脹活性、別名コロイド浸透圧は、Hoefs, J.C. (1992) Hepatology 16:396-403に記載の方法で決定することができる（本文献は参照により本明細書に組み込まれる。）。ビリルビン結合性は、例えばＨＳＡを基準とした５２７ｎｍの蛍光増強により測定することができる。ビリルビン（１．０ｍｇ）を５０μＬの１Ｍ ＮａＯＨに溶解させ、脱塩水で１．０ｍＬに希釈する。ビリルビンのストックを、蛍光光度計のキュベット内で１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＩ、ｐＨ８．５、１ｍＭ ＥＤＴＡで希釈し、０．６ｎｍｏｌビリルビン／ｍＬとする。励起波長４４８ｎｍ、発光波長５２７ｎｍ（スリット幅１０ｎｍ）で蛍光を測定し、ＨＳＡ：ビリルビン比０～５ｍｏｌ：ｍｏｌの範囲に亘ってＨＳＡで較正する。変異体は、そのＦｃＲｎ結合親和性及び／又は血漿半減期が、親アルブミンと比較して改変されていてもよい。
変異Ｇｓｈ１タンパク質の場合も、活性がアルブミン活性ではなくＧｓｈ１活性であることを除けば、同様の原理を適用することができる。親Ｇｓｈ１タンパク質は、配列番号２に対して少なくとも５０、６０、７０、８０又は９０％の同一性を有していてもよく、より好ましくは配列番号２に対して１００％の同一性を有していてもよい。変異Ｇｓｈ１タンパク質は、配列番号２に対して少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は少なくとも９９％の同一性を有していてもよい。
変異Ｎｏｔ４タンパク質の場合も、活性がアルブミン活性ではなくＮｏｔ４活性であることを除けば、同様の原理を適用することができる。親Ｎｏｔ４タンパク質は、配列番号６に対して少なくとも５０、６０、７０、８０又は９０％の同一性を有していてもよく、より好ましくは配列番号６に対して１００％の同一性を有していてもよい。変異Ｎｏｔ４タンパク質は、配列番号６に対して少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は少なくとも９９％の同一性を有していてもよい。
変異体ポリペプチド配列は、天然に見出されないものであることが好ましい。
ベクター：「ベクター」（vector）という語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、これと作動式に連結された、その発現を誘導する調節配列とを含む、直鎖状又は環状のＤＮＡ分子を意味する。ベクターにはプラスミドが含まれる。ベクターには発現ベクターが含まれる。
野生型：「野生型」（wild-type：ＷＴ）アルブミンという語は、天然で動物又はヒトに見出されるアルブミンと同一のアミノ酸配列を有するアルブミンを意味する。配列番号１０はヒト野生型アルブミンの例である。「野生型」ヒトアルブミン（ＨＳＡ）の配列は、GenBank登録番号AAA98797.1として参照可能である（Minghetti et al. “Molecular structure of the human albumin gene is revealed by nucleotide sequence within q11-22 of chromosome 4”, J. Biol. Chem. 261 (15), 6747-6757 (1986)）（本文献は参照により本明細書に組み込まれる。）。野生型アルブミンの例を表１（上掲）に示す。
アミノ酸位置を指定する際の規則
本発明の目的においては、配列番号２に開示されるポリペプチドを用いて、Ｇｓｈ１タンパク質のホモログ中の対応するアミノ酸残基を決定する。Ｇｓｈ１タンパク質のホモログのアミノ酸配列を、配列番号２に開示されるポリペプチドとアラインし、このアラインメントに基づいて、EMBOSSパッケージのNeedleプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277）、好ましくはバージョン５．０.０以降を用いて実施されるNeedleman-Wunschアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453）により、配列番号２に開示されるポリペプチド中の任意のアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置番号をを決定することができる。使用されるパラメーターは、ギャップオープンペナルティー（gap open penalty）が１０、ギャップエクステンションペナルティー（gap extension penalty）が０．５、及びEBLOSUM62（BLOSUM62のEMBOSSバージョン）置換マトリックスである。Ｎｏｔ４の場合も、配列番号６に基づき、同様の原理を適用することができる。
Ｇｓｈ１タンパク質のホモログ中の対応するアミノ酸残基の特定は、幾つかのコンピュータープログラム、例えば、これらに限定されるものではないが、MUSCLE（multiple sequence comparison by log-expectation；バージョン３．５以降；Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797）、MAFFT（バージョン６．８５７以降； Katoh and Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh and Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh and Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900）、及びClustalWを用いたEMBOSS EMMA（１．８３以降；Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680）により、それぞれのデフォルトパラメーターを用いて、複数のポリペプチド配列のアラインメントを作成することにより決定することができる。Ｎｏｔ４の場合も、配列番号６に基づき、同様の原理を適用することができる。
本発明のポリペプチドを記述するに当たり、参照の便宜のために、以下に説明する命名法を採用する。一般に許容されているＩＵＰＡＣの一文字又は三文字のアミノ酸略称を用いる。
置換。アミノ酸置換の場合、以下の命名法を用いる：元のアミノ酸、位置、置換後のアミノ酸。従って、位置２２６のトレオニンのアラニンによる置換は、「Ｔｈｒ２２６Ａｌａ」又は「Ｔ２２６Ａ」と表す。多重変異は加算記号（「＋」）で区切って示す。例えば、「Ｇｌｙ２０５Ａｒｇ＋Ｓｅｒ４１１Ｐｈｅ」又は「Ｇ２０５Ｒ＋Ｓ４１１Ｆ」は、位置２０５のグリシン（Ｇ）をアルギニン（Ｒ）で、位置４１１のセリン（Ｓ）をフェニルアラニン（Ｆ）で、それぞれ置換することを表す。
欠失。アミノ酸欠失の場合、以下の命名法が用いられる：元のアミノ酸、位置、＊。従って、位置１９５のグリシンの欠失は、「Ｇｌｙ１９５＊」又は「Ｇ１９５＊」と表す。多重欠失は加算記号（「＋」）で区切って、例えば「Ｇｌｙ１９５＊＋Ｓｅｒ４１１＊」又は「Ｇ１９５＊＋Ｓ４１１＊」のように表す。
挿入。上述のように、挿入には、ある位置を占めるアミノ酸（「所定の（或いは「元の」）アミノ酸」、「Ｘ」）のＮ側（「上流」、「Ｘ－１」）に対するものと、Ｃ側（「下流」、「Ｘ＋１」）に対するものとが挙げられる。
元のアミノ酸（‘Ｘ’）のＣ側（「下流」、「Ｘ＋１」）へのアミノ酸挿入の場合、以下の命名法が用いられる：元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸。従って、位置１９５のグリシンの後へのリシンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓ」又は「Ｇ１９５ＧＫ」と記す。アミノ酸の多重挿入の場合は、［元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸＃１、挿入されたアミノ酸＃２；等］と記す。例えば、位置１９５のグリシンの後へのリシン及びアラニンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓＡｌａ」又は「Ｇ１９５ＧＫＡ」と記す。
このような場合、挿入された複数のアミノ酸残基は、挿入されたアミノ酸残基に先立つアミノ酸残基の位置番号に対して、小文字を付して区別する。上記の例の場合、その順番は以下のとおりとなる。
Figure 0007282693000004
元のアミノ酸（Ｘ）のＮ側（「上流」、「Ｘ－１」）に対するアミノ酸挿入の場合、以下の命名法が用いられる：元のアミノ酸、位置、挿入されたアミノ酸、元のアミノ酸。従って、位置１９５のグリシン（Ｇ）の前へのリシン（Ｋ）（Ｋ）の挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＬｙｓＧｌｙ」又は「Ｇ１９５ＫＧ」と記す。アミノ酸の多重挿入の場合は、［元のアミノ酸、位置、挿入されたアミノ酸＃１、挿入されたアミノ酸＃２；等、元のアミノ酸］と記す。例えば、位置１９５のグリシンの前へのリシン（Ｋ）及びアラニン（Ａ）の挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＬｙｓＡｌａＧｌｙ」又は「Ｇ１９５ＫＡＧ」と記す。
このような場合、挿入された複数のアミノ酸残基は、挿入されたアミノ酸残基に続くアミノ酸残基の位置番号に対して、ダッシュ付きの小文字を付して区別する。上記の例の場合、その順番は以下のとおりとなる。
Figure 0007282693000005
多重改変。多重改変を含むポリペプチドは、加算記号（「＋」）で区切って示す。例えば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ＋Ｇｌｙ１９５Ｇｌｕ」又は「Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ」は、位置１７０のアルギニンをチロシンで、位置１９５のグリシンをグルタミン酸で、それぞれ置換することを表す。
異なる改変。ある位置に複数の異なる改変を導入可能な場合には、これらの異なる改変をコンマで区切って示す。例えば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ，Ｇｌｕ」は、位置１７０のアルギニンをチロシン又はグルタミン酸で置換することを示す。即ち、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ，Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ，Ａｌａ」は、以下の変異体を表す：「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」、「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、及び「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」。
本発明の詳細な説明
本発明の第１の側面は、
ａ．改変されたＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログ、及び／又は
ｂ．改変されたＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベル、及び／又は
ｃ．改変されたＧＳＨ１遺伝子又はそのホモログ、及び／又は
ｄ．改変されたＧＳＨ１遺伝子又はそのホモログの発現レベル。
を有する真菌宿主細胞を提供する。
改変されたＧｓｈ１タンパク質は、参照Ｇｓｈ１タンパク質、例えば野生型Ｇｓｈ１タンパク質、例えば配列番号２に対して改変されたものであってもよい。改変されたＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログは、配列番号２に対して少なくとも５０％の同一性、より好ましくは少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、或いは配列番号２に対して少なくとも９９．９％の同一性を有することが好ましい。改変されたＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログは、配列番号２に対して最高９９．９、９９．８、９９．７、９９．６、９９．５、９９．４、９９．３、９９．２、９９．１、９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、又は最高６０％の同一性を有していてもよく、いなくてもよい。中でも、改変されたＧｓｈ１タンパク質は、配列番号４を含むか、配列番号４からなることが好ましい。
Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログの改変されたレベルは、Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログの低減された発現レベル、及び／又は、Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログの低減された活性レベルであることが好ましい。前記の改変されたレベル、例えば低減されたレベルは、参照真菌宿主細胞、例えば前記Ｇｓｈ１タンパク質が配列番号２を含むか、配列番号２からなる真菌宿主細胞におけるレベルに対して改変されたレベルであることが好ましい。斯かる参照真菌宿主のＧｓｈ１タンパク質は、野生型Ｇｓｈ１配列、例えば配列番号２であってもよい。適切な参照真菌宿主細胞としては、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）Ｓ２８８Ｃ又はＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＤＸＹ１が挙げられる。Ｓ２８８Ｃは遺伝子型ＭＡＴα ＳＵＣ２ ｇａｌ２ ｍａｌ２ ｍｅｌ ｆｌｏ１ ｆｌｏ８－１ ｈａｐ１ ｈｏ ｂｉｏ１ ｂｉｏ６を有する。ＤＸＹ１は遺伝子型ｌｅｕ２－３、ｌｅｕ２－１２２、ｃａｎ１、ｐｒａ１、ｕｂｃ４、ｕｒａ３：ｙａｐ３を有する（Kerry-Williams et al., (1998) Yeast 14:161-169：本文献は参照により本明細書に組み込まれる）。他の適切な参照真菌宿主細胞としては、前記のＧＳＨ１遺伝子又はＧｓｈ１タンパク質又はホモログを除き、前記宿主細胞と同一である細胞が挙げられる。例えば、参照細胞のＧＳＨ１遺伝子が野生型（例えば配列番号１）であってもよく、参照細胞のＧＳＨ１遺伝子が野生型Ｇｓｈ１タンパク質（例えば配列番号２）であってもよく、或いは参照がによりコードされるＧｓｈ１タンパク質が野生型（例えば配列番号２）であってもよい。好ましくは、本発明の宿主細胞は、前記のＧＳＨ１遺伝子又はＧｓｈ１タンパク質又はホモログを除き、親株と同一であってもよい。参照真菌宿主は適宜「対応する」真菌宿主と呼ぶ場合がある。参照真菌宿主は親真菌宿主であってもよい。
低減されたＧｓｈ１タンパク質のレベル及び／又はＧｓｈ１タンパク質の活性レベルは、例えば、前記ＧＳＨ１遺伝子を突然変異又は欠失させることにより、突然変異を有するＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログを生じさせ、或いは、Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログを完全に不在とすることにより、前記遺伝子のオープンリーディングフレームを除去又は変更することにより、前記ＧＳＨ１遺伝子の調節配列、例えばプロモーター配列及び／又はターミネーター配列を突然変異又は変更することにより、例えば適切な干渉ＲＮＡ、例えばアンチセンスｍＲＮＡを導入して、前記ＧＳＨ１遺伝子の転写を阻害又は低減することにより、適切な転写活性化遺伝子を導入、調節、又は改変することにより、或いは、Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベルを阻害する剤を導入することにより、達成することができる。タンパク質レベル及びタンパク質活性を測定する方法は、本技術分野で周知である。
前記Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログの改変された活性レベルは、低減された活性レベルであってもよく、その結果の活性レベルは、親又は参照真菌宿主細胞、例えば野生型真菌宿主細胞のＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベルの０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、又は９８％から、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％までの範囲であってもよい。真菌宿主細胞におけるＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログの改変された活性レベル、例えば低減された活性レベルは、上述の参照真菌宿主細胞、例えば親真菌宿主細胞又は野生型真菌宿主細胞のＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベルと比較して改変された、例えば低減されたものであってもよい。従って、前記宿主細胞におけるＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベルは、参照真菌宿主細胞におけるＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベルの最高９９％、例えば参照真菌宿主細胞におけるＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベルの最高９８、９７、９６、９５、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、又は最高１０％であってもよい。Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベルは、ゼロ又は実質的にゼロまで低減されていてもよい。
Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログの改変された発現レベル（量）は、低減された活性レベルであってもよく、その結果の活性レベルは、参照真菌宿主細胞、例えば野生型真菌宿主細胞におけるＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログの発現レベルの０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８％から、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９％までの範囲であってもよい。真菌宿主細胞におけるＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログの改変された発現レベル、例えば低減された発現レベルは、上述の参照真菌宿主細胞、例えば親真菌宿主細胞又は野生型真菌宿主細胞のＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログの発現レベルと比較して改変された、例えば低減されたものであってもよい。従って、前記宿主細胞におけるＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログの発現レベルは、参照真菌宿主細胞におけるＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログの発現レベルの最高９９％、例えば参照真菌宿主細胞におけるＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログの発現レベルの最高９８、９７、９６、９５、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、又は最高１０％であってもよい。Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログの発現レベルは、ゼロ又は実質的にゼロまで低減されていてもよい。
真菌宿主細胞は、機能的なＧＳＨ１遺伝子又はホモログ、又は、Ｇｓｈ１タンパク質又はホモログを欠いていてもよい。例えば、前記真菌宿主細胞は、Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログの低減された発現レベル、又はin 低減されたＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベルを生じうるよう改変されたＧＳＨ１遺伝子を含んでいてもよい。真菌宿主細胞は、例えば遺伝子の欠失等により、ＧＳＨ１遺伝子又はそのホモログを欠いていてもよく、及び／又は、Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログを欠いていてもよい。
ＧＳＨ１活性は、例えばVolohonsky等によるChemico-Biological Interactions 140 (2002) 49-65（参照により本明細書に組み込まれる）、特に第２．８．１節に記載のアッセイ等により測定することができる。Ｇｓｈ１発現レベルは、例えばＥＬＩＳＡ等によってタンパク質の量を決定することにより、或いは定量ＲＴ－ＰＣＲ等によってＲＮＡレベルを測定することにより、決定することができる。
真菌宿主細胞は、配列番号２の４７、４８、４９、５０、５１、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、４０９、４５１、４５２、４５３、４５４及び４５５から選択される位置に対応する位置、好ましくは、
配列番号２の位置４７、４８、４９、５０及び５１の何れかに対応する位置、好ましくは位置４９に対応する位置、
配列番号２の位置１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９又は１３０の何れかに対応する位置、好ましくは位置１２３、１２４、１２５、１２６又は１２７に対応する位置、より好ましくは位置１２５に対応する位置、或いは
配列番号２の位置４０９に対応する位置、
配列番号２の位置４５１、４５２、４５３、４５４又は４５５の何れかに対応する位置、好ましくは位置４５３に対応する位置
から選択される位置に変異を含む、改変されたＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログを有していてもよい。
中でも、前記真菌宿主細胞が、配列番号２の位置１２５に対応する位置に変異を含む、改変されたＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログを有することが最も好ましい。
変異は、１又は２以上の（例えば数個の）位置における置換、挿入、及び／又は欠失の何れであってもよい。置換が好ましい。
真菌宿主細胞は、改変されたＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログをコードするポリヌクレオチド配列、例えば配列番号３を含んでいてもよい。遺伝コードの縮重ゆえに、他のポリヌクレオチド配列も、適切な改変されたＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログをコードすることが可能である。
アミノ酸は種々の周知の種類に分類される。従って、一部のアミノ酸は他のアミノ酸よりもよりより密接に関連する。本明細書で使用する場合、「保存的（同類）アミノ酸置換」（conservative amino acid substitution）は、同一群内で生じる置換であって、通常はタンパク質機能に実質的な影響を与えない置換を意味する。「保存的（同類）置換」（conservative substitution）という場合は、例えば図１に示す群内の置換を意味する。ここで図１は、保存レベルを可視化するための系を示すベン図である。通常、保存性の低い置換ほど、置換前のアミノ酸と置換後のアミノ酸との間に、より多くの境界（線）は存在する。「保存的アミノ酸置換」としては、同一群内で行われる置換、例えば、
芳香族アミノ酸：Ｆ、Ｈ、Ｗ、Ｙ；
脂肪族アミノ酸：Ｉ、Ｌ、Ｖ；
疎水性アミノ酸：Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ；
荷電アミノ酸：Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ等；
正荷電アミノ酸：Ｈ、Ｋ、Ｒ；
負荷電アミノ酸：Ｄ、Ｅ；
極性アミノ酸：Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ；
小型アミノ酸：Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｖ等；
極小アミノ酸：Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｓ；
という群内での置換が挙げられる。
或いは、「同類置換」としては、
脂肪族側鎖を有するアミノ酸：Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ；
芳香族側鎖を有するアミノ酸：Ｆ、Ｙ、Ｗ；
硫黄含有側鎖を有するアミノ酸：Ｃ、Ｍ；
脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸：Ｓ、Ｔ；
塩基性側鎖を有するアミノ酸：Ｋ、Ｒ、Ｈ；
酸性アミノ酸及びそのアミド誘導体：Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ；
という群内での置換が挙げられる。
置換は、本技術分野で公知の技術、例えば米国特許第４,３０２,３８６号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示の位置特異的突然変異生成法等により行うことができる。
非保存的アミノ酸置換とは、１の群から他の群への置換、例えば芳香族側鎖を有する群から脂肪族側鎖を有する群への置換等が挙げられる。
真菌宿主細胞が有する改変されたＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログは、配列番号２と比較して、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ及びＹから選択される非保存的アミノ酸への置換を有することが好ましい。
配列番号２の位置１２５に対応する位置の変異は、天然の配列におけるアミノ酸、例えばＲから、天然の配列とは異なるアミノ酸、例えばＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹへの置換、好ましくはＣ、Ｄ、Ｅ又はＧへの置換、より好ましくはＧへの置換であってもよい。斯かる置換としては、正荷電アミノ酸から、脂肪族、芳香族、疎水性、小型、極小、極性、又は負荷電アミノ酸への置換、好ましくは負荷電アミノ酸又は極小アミノ酸への置換が挙げられる。特に好ましい置換はＲからＧへの置換である。Ｋへの置換はそれほど好ましくない。
配列番号２の位置４９に対応する位置の変異は、天然の配列におけるアミノ酸、例えばＤから、天然の配列とは異なるアミノ酸、例えばＡ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹへの置換、好ましくはＨ、Ｋ又はＲへの置換、より好ましくはＫ又はＲへの置換であってもよい。斯かる置換としては、負荷電アミノ酸から正荷電アミノ酸への置換が挙げられる。Ｅへの置換はそれほど好ましくない。
配列番号２の位置４０９に対応する位置の変異は、天然の配列におけるアミノ酸、例えばＨから、天然の配列とは異なるアミノ酸、例えばＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹへの置換、好ましくはＡ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙへの置換、より好ましくはＡ、Ｉ、Ｌ、Ｖへの置換、最も好ましくはＬへの置換であってもよい。斯かる置換としては、芳香族アミノ酸から脂肪族アミノ酸への置換が挙げられる。特に好ましい置換はＨからＬへの置換である。
配列番号２の位置Ｐ４５３に対応する位置の変異は、天然の配列におけるアミノ酸、例えばＰから、天然の配列とは異なるアミノ酸、例えばＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹへの置換、好ましくはＡ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、Ｗ又はＹへの置換、より好ましくはＡ、Ｉ、Ｌ、Ｖへの置換、最も好ましくはＬへの置換であってもよい。斯かる置換としては、芳香族アミノ酸から脂肪族アミノ酸への置換が挙げられる。特に好ましい置換はＰからＬへの置換である。
改変されたＧｓｈ１タンパク質は、配列番号２の位置Ｒ１２５に対応する変異を含むことが好ましい。
改変されたＧｓｈ１タンパク質は、配列番号４を含むか、配列番号４からなることが好ましく、即ち変異Ｒ１２５Ｇを含むことが好ましい。斯かる改変されたＧｓｈ１タンパク質は、例えばＧｓｈ１タンパク質（例えば配列番号１）をコードするヌクレオチド配列を用いて提供することができる。単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）Ａ３７３Ｇを含むこうしたヌクレオチド配列は、例えば配列番号３を用いて提供することができる。
或いは、前記改変されたレベルは、増加したレベルであってもよい。Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログの増加したレベル又は増加した活性レベルは、所望のタンパク質（例えば異種タンパク質）の収率を減少させる可能性が高い。斯かる収率の減少は、例えば前記所望のタンパク質が宿主細胞の生存に有害である場合などに望ましい。増加したレベルとは、参照宿主、例えば親宿主におけるレベルの少なくとも１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７５、又は２００％であってもよい。
位置Ｒ１２５は位置Ｄ４９と塩橋相互作用を生じると考えられている。何れかのアミノ酸を変異させることで、斯かる相互作用を阻害できる可能性がある。Ｒ１２５をＤ又はＥに突然変異させ、或いはＤ４９をＲ又はＫに突然変異させて、静電反発作用を生じさせることにより、位置１２５と４９との間の相互作用を不安定化させることができると期待される。しかし、Ｒ１２５をＫに変異させ、及び／又は、Ｄ４９をＥ（グルタミン酸）に変異させると、斯かる相互作用が維持される可能性がある。
Ｇｓｈ１タンパク質は、宿主細胞に対して外因性であってもよく、内因性であってもよい。Ｇｓｈ１タンパク質が宿主細胞に対して外因性である場合、宿主細胞はその内因性のＧｓｈ１タンパク質を維持していてもよく、欠いていてもよい。
本発明の第１の側面に係る真菌宿主は、更に、
改変されたＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログ、及び／又は
改変されたＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベル、及び／又は
改変されたＮＯＴ４遺伝子又はそのホモログ、及び／又は
改変されたＮＯＴ４遺伝子又はそのホモログの発現レベル
を有していてもよい。
ＮＯＴ４は別名ＭＯＴ２とも呼ばれる。改変されたＮｏｔ４タンパク質は、例えば参照Ｎｏｔ４タンパク質、例えば野生型Ｎｏｔ４タンパク質、例えば配列番号６と比較して、改変されていてもよい。改変されたＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログは、配列番号６に対して少なくとも７０％の同一性、より好ましくは少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、或いは配列番号６に対して少なくとも９９．９％の同一性を有することが好ましい。改変されたＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログは、配列番号６に対して最高９９．９、９９．８、９９．７、９９．６、９９．５、９９．４、９９．３、９９．２、９９．１、９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、又は最高６０％の同一性を有していてもよく、いなくてもよい。中でも、改変されたＮｏｔ４タンパク質が配列番号８を含むか、配列番号８からなることがより好ましい。
Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの改変されたレベルは、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの低減された発現レベル、又は、低減されたＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルことが好ましい。改変されたレベル、例えば低減されたレベルは、参照真菌宿主細胞におけるレベル、例えばＮｏｔ４タンパク質が配列番号６を含むか、配列番号６からなる真菌宿主細胞におけるレベルに対して改変されたレベルであることが好ましい。参照真菌宿主のＮｏｔ４タンパク質は、例えば野生型Ｎｏｔ４配列、例えば配列番号６であってもよい。適切な参照真菌宿主細胞としては、上述したＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）Ｓ２８８Ｃ又はＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＤＸＹ１が挙げられる。他の適切な参照真菌宿主細胞としては、ＮＯＴ４遺伝子又はＮｏｔ４タンパク質又はホモログを除いて宿主細胞と同一である細胞が挙げられる。例えば、参照細胞のＮＯＴ４遺伝子が野生型（例えば配列番号５）であってもよく、参照細胞のＮＯＴ４遺伝子が野生型Ｎｏｔ４タンパク質（例えば配列番号６）をコードしていてもよく、参照細胞によってコードされるＮｏｔ４タンパク質が野生型（例えば配列番号６）であってもよい。好ましくは、本発明の宿主細胞は、ＮＯＴ４遺伝子又はＮｏｔ４タンパク質又はホモログを除いて、親株と同一であることが好ましい。参照真菌宿主を、「対応する」（corresponding）真菌宿主という場合もある。参照真菌宿主は親真菌宿主であってもよい。
Ｎｏｔ４タンパク質のレベル又はＮｏｔ４タンパク質の活性レベルの低減は、例えば、以下の手法により達成することができる。ＮＯＴ４遺伝子を突然変異又は欠失させることにより、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログに突然変異を生じさせ、或いは、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログを完全に不在とすること。遺伝子のオープンリーディングフレームを除去又は変更すること。ＮＯＴ４遺伝子の調節配列、例えばプロモーター配列及び／又はターミネーター配列を突然変異又は変更すること。例えば適切な干渉ＲＮＡ、例えばアンチセンスｍＲＮＡを導入することにより、或いは、適切な転写活性化遺伝子を導入、調節、又は改変することにより、或いは、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルを阻害する剤を導入することにより、ＮＯＴ４遺伝子の転写を阻害又は低減すること。タンパク質レベルを測定する方法は本技術分野で周知である。
Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの改変された活性レベルは、低減された活性レベルであってもよく、その結果の活性レベルは、親又は参照真菌宿主細胞、例えば野生型真菌宿主細胞のＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルの０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％から、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、又は９８％までの範囲であってもよい。真菌宿主細胞におけるＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの改変された活性レベル、例えば低減された活性レベルは、上述の参照真菌宿主細胞、例えば親真菌宿主細胞又は野生型真菌宿主細胞のＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルと比較して改変され、例えば低減されたものであってもよい。従って、宿主細胞におけるＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルは、参照真菌宿主細胞におけるＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルの最高９９％、例えば参照真菌宿主細胞におけるＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルの最高９８、９７、９６、９５、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、又は最高１０％であってもよい。Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルは、ゼロ又は実質的にゼロまで低減されていてもよい。
Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの改変された発現レベル（量）は、低減された活性レベルであってもよく、その結果の活性レベルは、参照真菌宿主細胞、例えば野生型真菌宿主細胞のＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの発現レベルの０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％から、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、又は９８％までの範囲であってもよい。真菌宿主細胞におけるＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの改変された発現レベル、例えば低減された発現レベルは、上述の参照真菌宿主細胞、例えば親真菌宿主細胞又は野生型真菌宿主細胞におけるＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの発現レベルと比較して改変され、例えば低減されたものであってもよい。従って、前記宿主細胞におけるＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの発現レベルは、参照真菌宿主細胞におけるＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの発現レベルの最高９９％、例えば参照真菌宿主細胞におけるＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの発現レベルの最高９８、９７、９６、９５、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、又は最高１０％であってもよい。Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの発現レベルは、ゼロ又は実質的にゼロまで低減されていてもよい。
真菌宿主細胞は、機能的なＮＯＴ４遺伝子又はホモログ、又は、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログを欠いていてもよい。例えば、真菌宿主細胞は、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの低減された発現レベル、又は、低減されたＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルを生じるように改変されたＮＯＴ４遺伝子を含んでいてもよい。真菌宿主細胞は、ＮＯＴ４遺伝子又はそのホモログを、例えば欠失等により欠いていてもよく、及び／又は、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログを欠いていてもよい。
Ｎｏｔ４の発現レベルは、例えばＥＬＩＳＡによってタンパク質の量を決定することにより、或いは、定量ＲＴ－ＰＣＲによってＲＮＡレベルを測定することにより、決定することができる。
改変されたＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログは、そのＮｏｔ１タンパク質又はそのホモログとの相互作用が改変されるように、突然変異していてもよい。例えば、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログのＮ末端領域は、例えば配列番号６の位置４２６～４３９に対応するアミノ酸を含むα－ヘリックスにおいて、突然変異していてもよい。
従って、本発明は、Ｎｏｔ１との相互作用、例えば疎水性相互作用が、野生型Ｎｏｔ４タンパク質（例えば配列番号６）と野生型Ｎｏｔ１タンパク質（例えば配列番号１３）との間の相互作用よりも弱められた、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログを更に有する真菌宿主細胞を提供する。
真菌宿主細胞は、
配列番号６の４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９又は４７０から選択される位置、
好ましくは、
配列番号６の４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、又は４３９、好ましくは位置４２９、４３０、４３４、又は４３７、最も好ましくは位置４２９に対応する位置、
配列番号６の４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９又は４７０、好ましくは位置４６３、４６４、又は４６６に対応する位置、又は
配列番号６の４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、又は４５６、好ましくは位置４４２、４４５、４４７又は４５２に対応する位置
から選択される位置に対応する位置に変異を含む、改変されたＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログを有していてもよい。
斯かる変異は、１又は２以上の（例えば数個の）位置における、置換、挿入、及び／又は欠失であってもよい。中でも置換が好ましい。
真菌宿主細胞は、改変されたＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログをコードするポリヌクレオチド配列、例えば配列番号７を含んでいてもよい。遺伝コードの縮重ゆえに、他のポリヌクレオチド配列によって、適切な改変されたＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログをコードすることも可能である。
真菌宿主細胞は、配列番号６と比較して改変されたＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログであって、変異としてＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ及びＹから選択されるアミノ酸、好ましくは非保存的アミノ酸への置換を含む、改変されたＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログを含んでいてもよい。
配列番号６の位置４２９に対応する位置の変異は、例えば天然配列におけるアミノ酸、例えばＦから、天然配列とは異なるアミノ酸、例えばＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、好ましくはＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ、又はＩへの置換、より好ましくはＶ、Ｌ又はＩへの置換、最も好ましくはＩへの置換であってもよい。斯かる置換は、非保存的アミノ酸によるものでもよい。斯かる置換は脂肪族アミノ酸への置換であってもよい。特に好ましい置換はＦからＩへの置換である。
配列番号６の位置４３０に対応する位置の変異は、例えば、天然配列におけるアミノ酸、例えばＬから、天然配列とは異なるアミノ酸、例えばＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹへの置換であってもよい。斯かる置換は非保存的アミノ酸への置換であってもよい。
位置４３４に対応する位置の変異は、例えば天然配列におけるアミノ酸、例えばＬから、天然配列とは異なるアミノ酸、例えばＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹへの置換であってもよい。斯かる置換は非保存的アミノ酸への置換であってもよい。
配列番号６の位置４３７に対応する位置の変異は、例えば天然配列におけるアミノ酸、例えばＬから、天然配列とは異なるアミノ酸、例えばＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹへの置換であってもよい。斯かる置換は非保存的アミノ酸への置換であってもよい。
好ましい改変されたＮｏｔ４タンパク質としては、配列番号６の位置Ｆ４２９に対応する変異を含むものが挙げられる。
好ましい改変されたＮｏｔ４タンパク質としては、配列番号８を含むか、配列番号８からなるタンパク質、即ち、変異Ｆ４２９Ｉを含むタンパク質が挙げられる。斯かる改変されたＮｏｔ４タンパク質は、例えば、Ｎｏｔ４タンパク質をコードするヌクレオチド配列（例えば配列番号５）において、ＳＮＰとしてＴ１２８５Ａを含むヌクレオチド配列（例えば配列番号７）を用いて提供することができる。
或いは、改変されたレベルは、増加したレベルであってもよい。Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの増加したレベル又は増加した活性は、所望のタンパク質（例えば異種タンパク質）の収率を低下させる可能性が高い。斯かる減少した収率は、例えば、所望のタンパク質が宿主細胞の生存にとって有害であるような場合に望ましい。増加したレベルとしては、例えば参照宿主、例えば親宿主におけるレベルと比較して、少なくとも１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７５、又は２００％であってもよい。
Ｎｏｔ４タンパク質は、宿主細胞に対して外因性であってもよく、宿主細胞に対して内因性であってもよい。Ｎｏｔ４タンパク質が宿主細胞に対して外因性である場合には、宿主細胞は内因性のＮｏｔ４タンパク質を維持していてもよく、欠いていてもよい。
真菌宿主は、（１）改変されたＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログのレベル、及び／又は、改変されたＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベル、及び／又は、改変されたＧＳＨ１遺伝子又はそのホモログ、及び／又は、改変されたＧＳＨ１遺伝子又はそのホモログの発現レベルと、（２）Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの改変されたレベル、及び／又は、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの改変された活性レベル、及び／又は、改変されたＮＯＴ４遺伝子又はそのホモログ、及び／又は、改変されたＮＯＴ４遺伝子又はそのホモログの発現レベルとを、ともに有していてもよい。中でも、真菌宿主は、（１）低減されたＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログのレベル、或いは、低減されたＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベル、及び／又は、低減されたＧＳＨ１遺伝子又はそのホモログの発現レベルと、（２）低減されたＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログのレベル、又は、低減されたＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベル、及び／又は、低減されたＮＯＴ４遺伝子又はそのホモログの発現レベルとを有していることが好ましい。或いは、真菌宿主は、（１）低減されたＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログのレベル、又は、低減されたＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベル、及び／又は、低減されたＧＳＨ１遺伝子又はそのホモログの発現レベルと、（２）増加したＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログのレベル、又は、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの増加した活性レベル、及び／又は、増加したＮＯＴ４遺伝子又はそのホモログの発現レベルとを有していてもよい。或いは、真菌宿主は、（１）増加したＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログのレベル、又は、Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログの増加した活性レベル、及び／又は、増加したＧＳＨ１遺伝子又はそのホモログの発現レベルと、（２）低減されたＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログのレベル、又は、低減されたＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベル、及び／又は、低減されたＮＯＴ４遺伝子又はそのホモログの発現レベルとを有していてもよい。同様の選択肢は、ＧＳＨ１及びＮＯＴ４の発現レベルにも当てはまる。「増加した」（increased）及び「低減された」（decreased）という用語については、本明細書に記載したとおりである。
Ｇｓｈ１の改変されたレベル、例えば低減されたレベルは、例えば参照真菌宿主細胞、例えばＧｓｈ１タンパク質が配列番号２を含むか、配列番号２からなる真菌宿主細胞におけるレベルと比較して改変され、例えば低減されたものであることが好ましく、Ｎｏｔ４の改変されたレベル、例えば低減されたレベルは、参照真菌宿主細胞におけるレベル、例えばＮｏｔ４タンパク質が配列番号６を含むか、配列番号６からなる真菌宿主細胞におけるレベルと比較して改変され、例えば低減されたものであることが好ましい。斯かる参照真菌宿主のＧｓｈ１タンパク質は、例えば野生型Ｇｓｈ１配列、例えば配列番号２であってもよい。参照真菌宿主のＮｏｔ４タンパク質は、例えば野生型Ｎｏｔ４配列、例えば配列番号６であってもよい。適切な参照真菌宿主細胞としては、上述のＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）Ｓ２８８Ｃ又はＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＤＸＹ１が挙げられる。他の適切な参照真菌宿主細胞としては、前記のＧＳＨ１遺伝子又はＧｓｈ１タンパク質又はホモログ、及び、ＮＯＴ４遺伝子又はＮｏｔ４タンパク質又はホモログを除き、宿主細胞と同一である細胞が挙げられる。例えば、前記参照細胞のＧＳＨ１遺伝子が、野生型（例えば配列番号１）であってもよく、或いは、前記参照細胞のＧＳＨ１遺伝子が、野生型Ｇｓｈ１タンパク質（例えば配列番号２）をコードするものであってもよく、或いは、前記参照細胞によりコードされるＧｓｈ１タンパク質が、野生型（例えば配列番号２）であってもよい。また、前記参照細胞のＮＯＴ４遺伝子が、野生型（例えば配列番号５）であってもよく、或いは、前記参照細胞のＮＯＴ４遺伝子が、野生型Ｎｏｔ４タンパク質（例えば配列番号６）をコードするものであってもよく、或いは、前記参照細胞によりコードされるＮｏｔ４タンパク質が、野生型（例えば配列番号６）であってもよい。中でも、本発明の宿主細胞は、前記のＧＳＨ１遺伝子又はＧｓｈ１タンパク質又はホモログと、ＮＯＴ４遺伝子又はＮｏｔ４タンパク質又はホモログとを除けば、親株と同一であることが好ましい。参照真菌宿主を「対応する」（corresponding）真菌宿主と呼ぶ場合もある。参照真菌宿主は、例えば親真菌宿主であってもよい。
真菌宿主細胞は、組換真菌宿主細胞であってもよい。
真菌宿主細胞は、酵母又は糸状菌であってもよい。本明細書で使用する場合、「真菌」（fungi）には、子嚢菌門（Ascomycota）、担子菌門（Basidiomycota）、ツボカビ門（Chytridiomycota）、及び接合菌門（Zygomycota）（Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UKの定義による）が含まれると共に、卵菌類（Oomycota）（Hawksworth et al., 1995, 同上, page 171にて列記）及びあらゆる栄養胞子形成菌類（Hawksworth et al., 1995, 同上）も含まれる。
好ましい側面では、真菌宿主細胞は、酵母細胞である。本明細書で使用する場合、「酵母」（yeast）には、子嚢胞子形成酵母（エンドミセス：Endomycetales）、担子胞子形成酵母、及び、不完全菌類に属する酵母（分芽菌：Blastomycetes）が挙げられる。斯かる酵母の分類は将来変更される可能性もあるため、本発明の目的においては、Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., and Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No: 9, 1980, pages 1 to 27)の記載に基づいて酵母を定義するものとする。
より好ましい側面では、酵母宿主細胞は、カンジダ（Candida）、ハンゼヌラ（Hansenula）、クルイウェロミセス（Kluyveromyces）、ピチア（Pichia）、サッカロミセス（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、又はヤロウイア（Yarrowia）細胞である。
より好ましい側面では、酵母宿主細胞は、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・ディアスタティカス（Saccharomyces diastaticus）、サッカロミセス・ドウグラシイ（Saccharomyces douglasii）、サッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロミセス・ノルベンシス（Saccharomyces norbensis）、サッカロミセス・オビフォルミス（Saccharomyces oviformis）、クルイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、又はヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）細胞である。サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）宿主が特に好ましい。
Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）宿主は、以下の遺伝子型の特徴のうち１又は２以上を有していてもよく、いなくてもよい：ｌｅｕ２－３、ｌｅｕ２－１２２、ｃａｎ１、ｐｒａ１、ｕｂｃ４、ｕｒａ３、ｙａｐ３：：ＵＲＡ３、ｌｙｓ２、ｈｓｐ１５０：：ＬＹＳ２、ｐｍｔ１：：ＵＲＡ３（国際公開第２０１４／１３８３７１号：引用により本明細書に組み込まれる）、例えばＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＢＸＰ１０。Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）宿主は、ＭＡＴａを含むことが好ましい。
Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）宿主は、以下の遺伝子型のうち１又は２以上を含んでいてもよく、いなくてもよい：ＭＡＴａ、ｌｅｕ２－３、ｌｅｕ２－１１２、ｕｂｃ４、ｕｒａ３、ｙａｐ３：：ＵＲＡ３、ｌｙｓ２、ｈｓｐ１５０：：ＬＹＳ２；更にＰＤＩ１、ＵＲＡ３及びＹＩｐｌａｃ２１１がＰＤＩ１遺伝子座に組み込まれたもの（Finnis et al 2010, Microbial Cell Factories 9:87）、例えばＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＤＰ９。
Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）宿主は、以下の遺伝子型のうち１又は２以上を含んでいてもよく、いなくてもよい：ＭＡＴα、ｌｅｕ２、ｐｅｐ４－３、例えばFinnis et al 1993, Eur. J. Biochem, 212: 201-210に記載のＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＭＴ３０２／２８Ｂ。
Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）宿主は、以下の遺伝子型を含んでいてもよく、いなくてもよい： MATα、SUC２、gal２、mal２、mel、flo１、flo８-１、hap１、ho、bio１、bio６（Mortimer and Johnston (1986) Genetics 113:35-43）、例えばＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）Ｓ２８８Ｃ。
好ましいＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）宿主株は、以下の全てを含むか、以下の全てからなる：ＭＡＴａ、ｌｅｕ２－３、ｌｅｕ２－１２２、ｃａｎ１、ｐｒａ１、ｕｂｃ４、ｕｒａ３、ｙａｐ３：：ＵＲＡ３、ｌｙｓ２、ｈｓｐ１５０：：ＬＹＳ２、及びｐｍｔ１：：ＵＲＡ３。
他の好ましいＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）宿主は、以下の全てを含むか、以下の全てからなる：ＭＡＴａ、ｌｅｕ２－３、ｌｅｕ２－１１２、ｕｂｃ４、ｕｒａ３、ｙａｐ３：：ＵＲＡ３、ｌｙｓ２、ｈｓｐ１５０：：ＬＹＳ２、更にＰＤＩ１、ＵＲＡ３及びＹＩｐｌａｃ２１１がＰＤＩ１遺伝子座に組み込まれたもの。
他の好ましいＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）宿主は、以下の全てを含むか、以下の全てからなる：ＭＡＴα、ＳＵＣ２、ｇａｌ２、ｍａｌ２、ｍｅｌ、ｆｌｏ１、ｆｌｏ８－１、ｈａｐ１、ｈｏ、ｂｉｏ１、ｂｉｏ６。
他の好ましいＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）宿主は、以下の全てを含むか、以下の全てからなる：ＭＡＴα、ｌｅｕ２、ｐｅｐ４－３。
宿主は、倍数体、二倍体、又は単数体である。単数体又は二倍体の酵母宿主が好ましく、中でも好ましいのは単数体である。
宿主交配型としては、例えばＭＡＴａ又はＭＡＴα（Ｍａｔ－アルファ）が挙げられる。Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）宿主は、ヒトアルブミン、或いはその変異体、断片及び／又は融合体をコードするプラスミドを含むことが好ましい。
「糸状菌」（filamentous fungi）には、真菌類（Eumycota）及び卵菌類（Oomycota）亜区分のあらゆる糸状形態が含まれる（Hawksworth et al., 1995, 同上の定義による）。糸状菌（filamentous fungi）の特徴は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、及び他の複合多糖類から構成される菌糸壁（mycelial wall）である。栄養成長は菌糸伸長によって行われ、炭素異化は偏性好気性である。対称的に、酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等による栄養成長は、単細胞性葉状体の出芽によって行われ、炭素異化としては発酵の場合もある。
好ましい糸状菌（filamentous fungi）宿主細胞は、Acremonium、Aspergillus、Aureobasidium、Bjerkandera、Ceriporiopsis、Chrysosporium、Coprinus、Coriolus、Cryptococcus、Filibasidium、Fusarium、Humicola、Magnaporthe、Mucor、Myceliophthora、Neocallimastix、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Phanerochaete、Phlebia、Piromyces、Pleurotus、Schizophyllum、Talaromyces、Thermoascus、Thielavia、Tolypocladium、Trametes、又はTrichodermaを含んでもよく、含まなくてもよい。
真菌宿主細胞は、所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでいてもよい。所望のタンパク質は、異種タンパク質であることが好ましい。異種タンパク質とは、天然では宿主細胞によって産生されないタンパク質である。好ましくは、例えば選択マーカー、例えば抗生物質抵抗性マーカー又は栄養要求性マーカー、シャペロン、ＦＬＰ又はＦＲＴ等を含まないことが好ましい。
真菌宿主細胞は発現宿主であってもよい。真菌宿主細胞は発現カセットを含んでいてもよく、これは例えば所望のタンパク質、例えば異種タンパク質をコードしていてもよい。斯かる発現カセットは、例えばベクター、例えばプラスミドの中に存在していてもよい。真菌宿主細胞は発現ベクターを含んでいてもよい。
所望のタンパク質は、植物性タンパク質若しくは動物性タンパク質又はそれらの変異体であってもよく、なくてもよい。所望のタンパク質は、アルブミン、モノクローナル抗体、エトポシド、血清タンパク質（例えば血液凝固因子）、アンチスタシン（antistasin）、ダニ抗凝固ペプチド、トランスフェリン、ラクトフェリン、エンドスタチン、アンジオスタチン、コラーゲン、免疫グロブリン若しくは免疫グロブリン系分子、又はその何れかの断片（例えば小モジュラー免疫医薬(登録商標)（「ＳＭＩＰ」）又はｄＡｂ、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＡｂ、ｓｃＦｖ又はｓｃＦｖ断片）、Kunitzドメインタンパク質（例えば国際公開第０３／０６６８２４号（援用により本明細書に組み込まれる。）に記載のもの、アルブミン融合体を有するものも含む）、インターフェロン、インターロイキン、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－２、インターフェロンα（アルファ）種及び亜種、インターフェロンβ（ベータ）種及び亜種、インターフェロンγ（ガンマ）種及び亜種、レプチン、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＦAx１５、ＩＬ－１－受容体アンタゴニスト、エリスロポエチン（ＥＰＯ）及びＥＰＯ模倣体、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）及びＴＰＯ模倣体、プロサプチド（prosaptide）、シアノビリン（cyanovirin）－Ｎ、５－ヘリックス、Ｔ２０ペプチド、Ｔ１２４９ペプチド、ＨＩＶ ｇｐ４１、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ｔＰＡ、ヒルジン、血小板由来成長因子、副甲状腺ホルモン、プロインシュリン、インシュリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、例えばエクステンジン（exendin）－４、ＧＬＰ－１又はＧＬＰ－２、インシュリン様成長因子、カルシトニン、成長ホルモン、形質転換成長因子β（ベータ）、腫瘍壊死因子、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＦＧＦ、凝固因子（前駆体及び活性型を含む）、例えば、これらに限定されるものではないが、プラスミノーゲン、フィブリノーゲン、トロンビン、プレトロンビン、プロトロンビン、フォン・ヴィレブランド（von Willebrand's）因子、アルファ１－抗トリプシン、プラスミノーゲン活性化因子、因子VII、因子VIII、因子IX、因子Ｘ及び因子XIII、神経成長因子、ＬＡＣＩ、血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ－ＥＣＧＦ）、グルコースオキシダーゼ、血清コリンエステラーゼ、アプロチニン、アミロイド前駆体タンパク質、インターアルファトリプシン阻害剤、抗トロンビンIII、アポリポタンパク質種、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、代謝生成物、抗生物質、又は上記の何れかの変異体若しくは断片の配列を含んでいてもよく、いなくてもよい。
当該変異体は、上記のタンパク質のうち１又は２以上に対して、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有することが好ましい。
好ましい所望のタンパク質は、血清タンパク質、例えばアルブミン、或いはその変異体、断片及び／又は融合体であってもよく、なくてもよい。斯かるアルブミンは、配列番号６に対して、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９８．２、９８．４、９８．６、９８．８、９９、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、又は９９．９から、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９８．２、９８．４、９８．６、９８．８、９９、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９、又は１００％の配列同一性を有することが好ましい。中でも、前記アルブミンは、配列番号１０を含み、又は配列番号１０からなることが最も好ましい。
前記アルブミン、又はその変異体、断片、及び／又は融合体は、配列番号１０と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、又は１９個から、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個までの変異を含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。アルブミン変異体は、配列番号１０と比較して、１～１０個の変異を含むことが好ましく、１～５個の変異を含むことがより好ましい。好ましい変異としては置換が挙げられる。
アルブミン変異体、或いはその断片及び／又は融合体は、配列番号６の位置Ｋ５７３に対応する位置にＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹを、より好ましくは、配列番号１０の位置Ｋ５７３に対応する位置にＰ、Ｈ、Ｗ又はＹを含んでいてもよく、いなくてもよい。特に、アルブミン変異体は、配列番号１０に対して少なくとも９５％の同一性（より好ましくは少なくとも９６、９７、９８又は９９％の同一性）を有すると共に、配列番号１０の位置５７３に対応する位置にＰを含むことが好ましい。
前記アルブミン、又はその変異体、断片、及び／又は融合体は、配列番号１０の位置Ｅ４９２に対応する位置に、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹを、好ましくは配列番号１０の位置Ｅ４９２に対応する位置にＧ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｍ又はＲを、より一層好ましくは配列番号１０の位置Ｅ４９２に対応する位置にＧ又はＤを、含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。特に、アルブミン変異体は、配列番号１０に対して少なくとも９５％の同一性（より好ましくは少なくとも９６、９７、９８又は９９％の同一性）を有すると共に、配列番号１０の位置Ｅ４９２に対応する位置にＧを含むことが好ましい。
前記アルブミン、又はその変異体、断片、及び／又は融合体は、配列番号１０の位置Ｋ５７４に対応する位置にＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹを、より好ましくは配列番号１０の位置Ｋ５７４に対応する位置にＨ、Ｇ、Ｄ、Ｆ、Ｎ、Ｓ又はＹを、より一層好ましくは配列番号１０の位置Ｋ５７４に対応する位置にＤ、Ｆ、Ｇ又はＨを、含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。特に、アルブミン変異体は、配列番号１０に対して少なくとも９５％の同一性（より好ましくは少なくとも９６、９７、９８又は９９％の同一性）を有すると共に、配列番号１０の位置Ｋ５７４に対応する位置にＨを含むことが好ましい。
前記アルブミン、又はその変異体、断片、及び／又は融合体は、配列番号１０の位置Ｑ５８０に対応する位置にＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹを、より好ましくは配列番号１０の位置Ｑ５８０に対応する位置にＫ又はＲを、含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。特に、アルブミン変異体は、配列番号１０に対して少なくとも９５％の同一性（より好ましくは少なくとも９６、９７、９８又は９９％の同一性）を有すると共に、配列番号１０の位置Ｑ５８０に対応する位置にＫを含むことが好ましい。
好ましくは、アルブミン変異体は、位置４９２、５７３、５７４及び５８０に対応する位置から選択される１又は２以上の位置に変異を、例えば上述の置換を含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。例えば、前記アルブミン変異体は、配列番号４５を含み、又は配列番号４５からなっていてもよい。
他の好ましいアルブミン変異体、その断片、及び／又は、その融合体としては、国際公開第２０１１／０５１４８９号、国際公開第２０１１／１２４７１８号、国際公開第２０１２／０５９４８６号、国際公開第２０１２／１５０３１９号、国際公開第２０１４／０７２４８１号、国際公開第２０１３／１３５８９６号、国際公開第２０１５／０３６５７９号、国際公開第２０１０／０９２１３５号、国際公開第２０１３／０７５０６６号、国際公開第２０１４／１７９６５７号、国際公開第２００９／１２６９２０号、国際公開第２０１０／０５９３１５号、国際公開第２０１１／１０３０７６号、国際公開第２０１２／１１２１８８号、国際公開第２０１５／０６３６１１号、及び国際公開第２０１７／０２９４０７号（これらは各々参照により本明細書に組み込まれる）に記載の変異体、或いはその断片又は融合体が挙げられる。
斯かるアルブミンは、アルブミン又はその変異体の断片であってもよく、なくてもよい。
斯かるアルブミン変異体、或いはその断片及び／又は融合体は、親アルブミン、或いはその断片及び／又は融合体と比較して、ＦｃＲｎに対する結合親和性がより強められ、又は弱められてなる（好ましくは、より強められてなる）。
斯かるアルブミン変異体、或いはその断片及び／又は融合体のＦｃＲｎ（例えばｓｈＦｃＲｎ）に対するＫＤは、対応するＨＳＡ又はそのコンジュゲートのＫＤよりも低くてもよい。アルブミン変異体、或いはその断片及び／又は融合体のＦｃＲｎに対するＫＤは、ＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤ×０．９未満、より好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤ×０．５未満、より好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤ×０．１未満、より一層好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤ×０．０５未満、より一層好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤ×０．０２未満、より一層好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤ×０．０１未満、最も好ましくは、ＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤ×０．００１未満であることが好ましい（ここで×は倍数を表す）。ＫＤが低いほど結合親和性は強くなる。
斯かるアルブミン変異体、或いはその断片及び／又は融合体のＦｃＲｎに対するＫＤは、対応するＨＳＡ又はそのコンジュゲートのＫＤよりも高くてもよい。アルブミン変異体、或いはその断片及び／又は融合体のＦｃＲｎに対するＫＤは、ＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤ×２以上、より好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤ×５以上、より好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤ×１０以上、より一層好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤ×２５以上、最も好ましくはＨＳＡのＦｃＲｎに対するＫＤ×５０以上であることが好ましい。斯かるアルブミン変異体、或いはその断片及び／又は融合体は、ＦｃＲｎに対して全く結合しなくてもよい。ＫＤが高いほど結合親和性は弱くなる。
ＫＤを決定及び／又は比較する際には、以下のパラメーターのうち１又は２以上（例えば数個）（好ましくは全て）を用いてもよい。
機器： Biacore 3000 instrument（GE Healthcare）。
フローセル：cm5センサーチップ。
ＦｃＲｎ：ヒトＦｃＲｎ、好ましくは可溶性ヒトＦｃＲｎ、任意によりタグを連結。タグの例としてはグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）又はヒスチジン（Ｈｉｓ）、最も好ましくはＨｉｓ、例えばベータ－２－ミクログロブリンのＣ末端に６つのヒスチジン残基を付加。
ＦｃＲｎの量：１２００～２５００ＲＵ。
結合化学：アミンカップリング化学（例えば機器メーカーが提供するプロトコールの記載に準拠）。
結合方法：カップリングは、例えば１０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０（GE Healthcare）中２０μｇ／ｍＬのタンパク質を注入して実施する。ラニングバッファー及び希釈用バッファーとしては、リン酸緩衝液（６７ｍＭ リン酸緩衝液、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）、ｐＨ５．５を使用すればよい。表面の再生は、ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０）、ｐＨ７．４（Biacore AB）を注入して行えばよい。
試験分子（例えばＨＳＡ又は変異体）の注入量：２０～０．０３２μＭ。
注入流速：定速、例えば３０μＬ／ｍＬ。
注入温度：２５℃。
データ評価用ソフトウェア：BIAevaluation 4.1ソフトウェア（Biacore AB）。
斯かるアルブミン変異体、或いはその断片及び／又は融合体の血漿半減期は、親アルブミン、或いはその断片及び／又は融合体と比較してより長く、又はより短くてもよいが、より長いことが好ましい。
血漿半減期は、適切な個人において、インビボで決定するのが理想的である。しかし、動物又はヒトで実験を行うと、時間及び費用が掛かる上に、倫理的な懸念が避けられない。よって、血漿半減期が延長又は短縮されたことを確認するためには、インビトロアッセイを用いることが望ましい。アルブミンのその受容体（ＦｃＲｎ）への結合は、血漿半減期にとって重要な因子であること、また、受容体結合性と血漿半減期との相関によれば、アルブミンのその受容体への親和性が高いほど、血漿半減期は長くなることが知られている。従って、本発明では、アルブミンのＦｃＲｎへの親和性が高いほど、血漿半減期が延長されており、アルブミンのその受容体への親和性が低いほど、血漿半減期が短縮されていると判断ことができる。
アルブミンのその受容体ＦｃＲｎへの結合は、親和性という言葉と、「より強い」（stronger）又は「より弱い」（weaker）という表現を用いて表すことができる。即ち、ＨＳＡのＦｃＲｎに対する親和性よりもＦｃＲｎに対する親和性が強い分子は、ＨＳＡよりもＦｃＲｎへの結合性が強く、ＨＳＡのＦｃＲｎに対する親和性よりもＦｃＲｎに対する親和性が弱い分子は、ＨＳＡよりもＦｃＲｎへの結合性が弱いと判断ことができる。「結合親和性」（binding affinity）という言葉に替えて、「結合係数」（binding coefficient）という言葉を用いてもよい。
「血漿半減期がより長い」又は「血漿半減期がより短い」という記載、及び類似の表現は、対応する親又は参照又は対応するアルブミン分子との対比に基づくものと解すべきである。即ち、本発明の変異体アルブミンに関して、血漿半減期がより長いとは、斯かる変異体が、本明細書に記載の改変を有する他は同一の配列を有する対応するアルブミンと比較して、より長い血漿半減期を有することを意味する。
斯かるアルブミン、或いはその変異体及び／又は断片は、遺伝子工学的に融合パートナーと連結されていてもよく、いなくてもよい。融合パートナーは、非アルブミンタンパク質であることが好ましい。融合パートナーは、例えばアルブミンのＮ’末端又はＣ’末端に連結される。アルブミン部分とパートナー部分との間には、１又は２以上のスペーサーアミノ酸が存在していてもよい。融合パートナーは、アルブミン配列内に挿入されていてもよい。融合パートナーは、例えば少なくとも５アミノ酸長、例えば少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は少なくとも１００アミノ酸長である。斯かる融合パートナーの最大長は、例えば３５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００アミノ酸長である。
融合体タンパク質は、１又は２以上の融合パートナーを有していてもよい。これらは例えばアルブミンのＮ’又はＣ’末端に連結され、或いはアルブミン配列内に挿入される。融合体タンパク質は、１又は２以上（例えば数個、例えば２、３、４又は５）コピーの同一の融合パートナーを有していてもよく、２種又はそれ以上の異なるパートナーを有していてもよい。斯かる融合パートナーは、例えば上述した所望のタンパク質又は異種タンパク質の中から選択される。
好ましい融合体タンパク質は、ＧＬＰ－１活性を有するポリペプチド、例えば国際公開第２０１４／１３８３７１号（引用により本明細書に組み込まれる。特に第１３、１４、２６、３４～３７ページを参照）に記載のものを含んでいてもよい。例えば、好ましい融合体タンパク質は、ＨＳＡ（配列番号１０）、或いはＨＳＡの変異体（例えば配列番号４５）及び／又は断片が、１コピーのＧＬＰ類似物（例えば配列番号１４又は１５）と遺伝子工学的に連結されたものを含んでいてもよく、ＨＳＡ（配列番号１０）、或いはＨＳＡの変異体（例えば配列番号４５）及び／又は断片が、ＧＬＰ類似物のタンデムリピート（例えば配列番号１５、５２、又は５３）と遺伝子工学的に連結されたものを含んでいてもよい。例えば、融合体タンパク質は、配列番号１６（アルビグルチド：albiglutide）を含んでいてもよく、配列番号１６からなるものでもよい。
斯かるアルブミン、変異体、或いはその断片及び／又は融合体の産生に特に適した真菌宿主細胞としては、これらに限定されるものではないが、アスペルギルス（Aspergillus）（国際公開第０６／０６６５９５号）、クルイウェロミセス（Kluyveromyces）（Fleer, 1991, Bio/technology 9: 968-975）、ピチア（Pichia）（Kobayashi, 1998, Therapeutic Apheresis 2: 257-262）、及びサッカロミセス（Saccharomyces）（Sleep, 1990, Bio/technology 8: 42-46）が挙げられる。これらの文献は、各々引用により本明細書に組み込まれる。
所望のタンパク質（例えば異種タンパク質）は、分泌タンパク質であってもよく、なくてもよい。即ち、宿主細胞によりコードされるタンパク質は、シグナルペプチド（文献によっては「リーダー配列」と記載される場合もある）を含んでいてもよく、いなくてもよい。通常、タンパク質が宿主細胞から分泌される際に、シグナルペプチド配列はタンパク質から切断されるため、最終的な（成熟）タンパク質は、シグナルペプチド配列を含まない。適切なシグナルペプチド配列の例を以下に挙げる。シグナルペプチドは、プロペプチドを含んでいてもよく、いなくてもよい。
或いは、所望のタンパク質は、細胞内タンパク質であってもよく、なくてもよい。
所望のタンパク質は、プラスミドによりコードされるものであってもよく、なくてもよい。
所望のタンパク質は、染色体核酸によりコードされるものであってもよく、なくてもよい。
適切なプラスミドとしては、２ミクロンファミリープラスミド、例えば国際公開第２００６／０６７５１１号（引用により本明細書に組み込まれる。特に強調すべきは「２ミクロンファミリープラスミド」（“The 2μm-family plasmids”、第４６～６１ページ）と題された項目である。）に記載のものが挙げられる。２ミクロンファミリープラスミドと総称される斯かるプラスミドとしては、チゴサッカロミセス・ルーキシィ（Zygosaccharomyces rouxii）（旧来の分類はチゴサッカロミセス・ビスポラス（Zygosaccharomyces bisporus））由来のｐＳＲ１、ｐＳＢ３、及びｐＳＢ４、チゴサッカロミセス・バイリィ（Zygosaccharomyces bailii）由来のプラスミドｐＳＢ１及びｐＳＢ２、チゴサッカロミセス・フェルメンタティ（Zygosaccharomyces fermentati）由来のプラスミドｐＳＭ１、クルイベロミセス・ドロソフィラルム（Kluyveromyces drosphilarum）由来のプラスミドｐＫＤ１、ピチア・メンブラネファシエンス（Pichia membranaefaciens）由来の未だ命名されていないプラスミド（「ｐＰＭ１」）、及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来の２μｍプラスミド（例えば国際公開第２００６／０６７５１１号の図１に示す）及び変異体（例えばＳｃｐ１、Ｓｃｐ２、及びＳｃｐ３）が挙げられる（Volkert, et al., 1989, Microbiological Reviews 53: 299; Murray et al., 1988, J. Mol. Biol. 200: 601; Painting, et al., 1984, J. Applied Bacteriology 56: 331）。
２ミクロンファミリープラスミドは、通常は少なくとも３つのオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）を含む。これらのＯＲＦは各々、２ミクロンファミリープラスミドを多重コピープラスミドとして安定的に維持する機能を有するタンパク質をコードする。これら３つのＯＲＦによりコードされるタンパク質は、ＦＬＰ、ＲＥＰ１、及びＲＥＰ２と記される。２ミクロンファミリープラスミドが、ＦＬＰ、ＲＥＰ１、及びＲＥＰ２をコードするこれら３つのＯＲＦの全てを含んでいない場合には、欠落しているタンパク質をコードするＯＲＦを、他のプラスミド又は染色体組み込みにより、トランスで補う必要がある。
好ましいプラスミドとしては、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）由来の２ミクロンプラスミドが挙げられる。これは所望のタンパク質、例えば異種タンパク質をコードすることが好ましい。
Ｇｓｈ１タンパク質、Ｎｏｔ４タンパク質、及び／又は、所望の（例えば異種の）タンパク質が、１又は２以上の調節配列と作動式に連結されたヌクレオチド配列によってコードされてもよい。この場合、斯かる調節配列は、これと適合する条件下で、適切な宿主細胞によるコーディング配列の発現を誘導するように構成される。
斯かるポリヌクレオチドは、ポリペプチドの発現を提供するように、種々の方法で改変されてもよい。発現ベクターによっては、斯かるポリヌクレオチドをベクターへ挿入する前に、これを改変することが望ましい、或いは必要である場合がある。組換ＤＮＡ法を用いたポリヌクレオチドの改変技術は、本技術分野では公知である。
調節配列としては、プロモーターが挙げられる。これは、斯かるポリヌクレオチドを発現させるべく、宿主細胞により認識されるポリヌクレオチドである。プロモーターは、斯かるポリペプチドの発現を媒介する転写調節配列を含む。斯かるプロモーターは、宿主細胞において転写活性を示す任意のポリヌクレオチドであってよい。例としては、ミュータント、切断型、及びハイブリッドプロモーターが挙げられる。また、宿主細胞に対して同種又は異種の細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子であってもよい。
糸状菌（filamentous fungi）宿主細胞において本発明の核酸コンストラクトの転写を誘導する適切なプロモーターの例としては、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）アセトアミナーゼ、アスペルギルス・ニジェール（Aspergillus niger）中性アルファアミラーゼ、アスペルギルス・ニジェール（Aspergillus niger）耐酸性アルファアミラーゼ、アスペルギルス・ニジェール（Aspergillus niger）、又はアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKAアミラーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）アルカリ性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）トリオーズリン酸イソメラーゼ、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼ（国際公開第９６／００７８７号）、フザリウム・ヴェネナタム（Fusarium venenatum）アミログルコシダーゼ（国際公開第００／５６９００号）、フザリウム・ヴェネナタム（Fusarium venenatum）Daria（国際公開第００／５６９００号）、フザリウム・ヴェネナタム（Fusarium venenatum）Quinn（国際公開第００／５６９００号）、リゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ、リゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテアーゼ、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）ベータ－グルコシダーゼ、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）セロビオヒドラーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）セロビオヒドラーゼII、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼII、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼ III、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼIV、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）キシラナーゼ I、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）キシラナーゼII、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）ベータ-キシロシダーゼ、並びにＮＡ２ ｔｐｉプロモーター（アスペルギウス（Aspergillus）中性アルファアミラーゼ遺伝子由来の改変プロモーターであって、その非翻訳リーダーがアスペルギウス（Aspergillus）トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来の非翻訳リーダーで置換されてなるもの；非限定的な例としては、アスペルギルス・ニジェール（Aspergillus niger）中性アルファアミラーゼ遺伝子由来の改変プロモーターであって、その非翻訳リーダーアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）又はアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来の非翻訳リーダーで置換されたもの）；並びにそのミュータント、切断型、及びハイブリッドプロモーターの遺伝子から得られるプロモーターが挙げられる。
酵母宿主において有用なプロモーターとしては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ＥＮＯ１）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）メタロチオネイン（ＣＵＰ１）、及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）３－ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子から得られるものが挙げられる。酵母宿主細胞における他の有用なプロモーターとしては、Romanos et al., 1992, 同上に記載のものが挙げられる。
調節配列としては、転写ターミネーターも挙げられる。これは、転写を終了するために、宿主細胞によって認識される配列である。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３’末端に、作動式に連結される。宿主細胞において機能しうる任意のターミネーターを用いることができる。
糸状菌（filamentous fungi）宿主細胞において好ましいターミネーターとしては、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニジェール（Aspergillus niger）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニジェール（Aspergillus niger）アルファ-グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKAアミラーゼ、及びフザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られるものが挙げられる。
酵母宿主細胞において好ましいターミネーターとしては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）cytochrome C（CYC１）、及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）グリセルアルデヒドー３ーリン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得られるものが挙げられる。酵母宿主細胞において有用な他のターミネーターとしては、Romanos et al., 1992, 同上に記載のものが挙げられる。
調節配列としては、ｍＲＮＡ安定化領域も挙げられる。これは、プロモーターの下流且つ遺伝子のコーディング配列の上流に配置され、遺伝子の発現を増強する。
調節配列としては、リーダーも挙げられる。これは、宿主細胞による翻訳にとって重要なｍＲＮＡの非翻訳領域である。リーダー配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’末端に、作動式に連結される。宿主細胞において機能しうる任意のリーダーを用いることができる。
糸状菌（filamentous fungi）宿主細胞において好ましいリーダーとしては、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKAアミラーゼ及びアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られるものが挙げられる。
酵母宿主細胞に適したリーダーとしては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ＥＮＯ－１）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）３－ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルファ因子、及びサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒドー３ーリン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られるものが挙げられる。
調節配列としては、ポリアデニル化配列も挙げられる。これは、ポリペプチドエンコーディング配列の３’末端に作動式に連結され、転写の際に宿主細胞によって、転写されたｍＲＮＡ配列に対してポリアデノシン残基を付加するシグナルとして認識される配列である。宿主細胞において機能しうる任意のポリアデニル化配列を用いることができる。
糸状菌（filamentous fungi）宿主細胞において好ましいポリアデニル化配列としては、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニジェール（Aspergillus niger）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニジェール（Aspergillus niger）アルファ-グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKA アミラーゼ、及びフザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られるものが挙げられる。
酵母宿主細胞において有用なポリアデニル化配列としては、Guo and Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990に記載のものが挙げられる。
調節配列としては、シグナルペプチドコーディング領域も挙げられる。これは、ポリペプチドのＮ末端に連結され、ポリペプチドを細胞の分泌経路に誘導する、シグナルペプチドをコードする配列である。ポリヌクレオチドのコーディング配列の５’末端は、ポリペプチドをコードするコーディング配列のセグメントに、翻訳リーディングフレームにおいて連結された、天然のシグナルペプチドコーディング配列を含んでいてもよい。或いは、コーディング配列の５’末端は、コーディング配列に対して外来のシグナルペプチドコーディング配列を含んでいてもよい。コーディング配列が天然のシグナルペプチドコーディング配列をふくまない場合には、外来のシグナルペプチドコーディング配列が必要である。或いは、ポリペプチドの分泌を増強するために、外来のシグナルペプチドコーディング配列によって、天然のシグナルペプチドコーディング配列をそのまま置換してもよい。しかし、発現されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に誘導しうる、任意のシグナルペプチドコーディング配列を用いることができる。
糸状菌（filamentous fungi）宿主細胞において有効なシグナルペプチドコーディング配列としては、アスペルギルス・ニジェール（Aspergillus niger）中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニジェール（Aspergillus niger）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKAアミラーゼ、ヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens）セルラーゼ、ヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens）エンドグルカナーゼV、ヒュミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）リパーゼ、及びリゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテアーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコーディング配列が挙げられる。
酵母宿主細胞、例えばアルブミン、或いはその変異体、断片及び／又は融合体の産生のための酵母宿主細胞において好ましいシグナルペプチドとしては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルファ因子の遺伝子から得られるシグナルペプチド、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）インベルターゼの遺伝子から得られるシグナルペプチド、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＫＥＸ２の遺伝子から得られるシグナルペプチド、例えば配列番号１７を含む、又は配列番号１７からなるもの、又は、改変されたＫＥＸ２シグナルペプチド配列、例えば配列番号１８を含む、又は配列番号１８からなるものが挙げられる。
特に好ましいシグナルペプチドとしては：
国際公開第９０／０１０６３号（引用により本明細書に組み込まれる）に教示される、交配因子アルファシグナルペプチド配列とヒトアルブミンシグナルペプチド配列との融合体を含むシグナルペプチド（斯かるシグナルペプチド配列の例を配列番号１９に示す）；
配列番号２０のペンタペプチドモチーフを含むシグナルペプチド（ここでペンタペプチドモチーフは、シグナルペプチド配列の疎水性ドメインに、例えば未成熟タンパク質の－１０～－２５の位置に存在する（ここで位置－１は、成熟配列の第一のアミノ酸のＮ末端に直接隣接するシグナルペプチド配列のアミノ酸を指し、或いはプロペプチドを含むシグナルペプチド配列の場合、位置－１は、プロペプチドの第一のアミノ酸のＮ末端に直接隣接するシグナルペプチド配列のアミノ酸を指す））（斯かるシグナルペプチド配列の例は、国際公開第２００４／００９８１９号（引用により本明細書に組み込まれる）に開示されている）；
配列番号２０のペンタペプチドモチーフを含むように改変されたアルブミンシグナルペプチド（ペンタペプチドモチーフがシグナルペプチド配列の疎水性ドメイン内に存在していてもよい）（斯かる改変されたシグナルペプチド配列の例を配列番号２１に示す）（ここで斯かるペンタペプチドモチーフは、インベルターゼシグナルペプチド内に挿入されて、改変されたインベルターゼシグナルペプチドを生成するように構成されてもよい（改変されたインベルターゼシグナルペプチドの例を配列番号４１及び配列番号４２に示す））；又は
配列番号２０のペンタペプチドモチーフを含むと共に、シグナルペプチド配列のＣ’末端にプロペプチドを含むように改変されたアルブミンシグナルペプチド（ここでペンタペプチドモチーフは、シグナルペプチド配列の疎水性ドメイン内に配置されてもよい）（斯かる改変されたシグナルペプチド配列の例を、配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４に示す）が挙げられる。
例えば、アルブミン、或いはその変異体、断片及び／又は融合体の発現の場合、配列番号１９、配列番号２４、及び配列番号４２を含む、又はこれらからなるシグナルペプチドが特に好ましい。
他の有用なシグナルペプチドコーディング配列は、Romanos et al., 1992, 同上に記載されている。
調節配列としては、プロペプチドコーディング配列も挙げられる。これは、ポリペプチドのＮ末端に位置するプロペプチドをコードする配列である。その結果として生じるポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド（又は場合によってはチモーゲン）として知られている。プロポリペプチドは一般に不活性であり、触媒又は自己触媒作用によってプロポリペプチドからプロペプチドが切断されると、活性ポリペプチドに転換される。プロペプチドコーディング配列としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）アルファ因子の遺伝子から得られるものが挙げられる。
シグナルペプチド及びプロペプチド配列がともに存在する場合、プロペプチド配列はポリペプチドのＮ末端に隣接して配置され、シグナルペプチド配列はプロペプチド配列のＮ末端に隣接して配置される。
宿主細胞の増殖に伴いポリペプチドの発現を調節する調節配列を追加することも望ましい。調節系の例としては、調節性化合物の存在等の化学的又は物理的な刺激に応答して、遺伝子の発現を開始又は停止する系が挙げられる。酵母では、ＡＤＨ２系又はＧＡＬ１系を使用することができる。糸状菌（filamentous fungi）では、アスペルギルス・ニジェール（Aspergillus niger）グルコアミラーゼプロモーター、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）TAKAアルファ-アミラーゼプロモーター、及びアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）グルコアミラーゼプロモーターを使用することができる。調節配列の他の例としては、遺伝子の増幅を可能とするものが挙げられる。真核系では、これらの調節配列としては、メトトレキサートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子や、重金属により増幅されるメタロチオネイン遺伝子等が挙げられる。これらの例では、前記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、斯かる調節配列と作動式に連結されることになる。
宿主株は、１又は２以上のシャペロンタンパク質を発現又は過剰発現してもよく、しなくてもよい。例としては、国際公開第２００５／０６１７１８号、国際公開第２００６／０６７５１１号、国際公開第２００６／１３６８３１号、又は国際公開第２０１４／１３８３７１号に記載のものが挙げられる。これらは何れも引用により本明細書に組み込まれる。例えば、宿主株は、以下の遺伝子のうち１又は２以上を過剰発現してもよく、しなくてもよい：ＡＨＡ１、ＣＣＴ２、ＣＣＴ３、ＣＣＴ４、ＣＣＴ５、ＣＣＴ６、ＣＣＴ７、ＣＣＴ８、ＣＮＳ１、ＣＰＲ３、ＣＰＲ６、ＥＲＯ１、ＥＵＧ１、ＦＭＯ１、ＨＣＨ１、ＨＳＰ１０、ＨＳＰ１２、ＨＳＰ１０４、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ３０、ＨＳＰ４２、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７８、ＨＳＰ８２、ＪＥＭ１、ＭＤＪ１、ＭＤＪ２、ＭＰＤ１、ＭＰＤ２、ＰＤＩ１、ＰＦＤ１、ＡＢＣ１、ＡＰＪ１、ＡＴＰ１１、ＡＴＰ１２、ＢＴＴ１、ＣＤＣ３７、ＣＰＲ７、ＨＳＣ８２、ＫＡＲ２、ＬＨＳ１、ＭＧＥ１、ＭＲＳ１１、ＮＯＢ１、ＥＣＭ１０、ＳＳＡ１、ＳＳＡ２、ＳＳＡ３、ＳＳＡ４、ＳＳＣ１、ＳＳＥ２、ＳＩＬ１、ＳＬＳ１、ＯＲＭ１、ＯＲＭ２、ＰＥＲ１、ＰＴＣ２、ＰＳＥ１、ＵＢＩ４、及びＨＡＣ１、又は切断型イントロン欠失ＨＡＣ１（Valkonen et al., 2003, Applied Environ. Micro., 69: 2065）、並びにＴＩＭ９、ＰＡＭ１８（別名ＴＩＭ１４）、及びＴＣＰ１（別名ＣＣＴ１）、或いはこれらの変異体。中でも、ＰＤＩ１（配列番号２５）又はその変異体若しくは断片、及び／又は、ＥＲＯ１（配列番号２６）又はその変異体若しくは断片の過剰発現が好ましい。過剰発現としては、宿主細胞におけるシャペロンの天然レベルでの発現と比較して、シャペロンの発現が少なくとも２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００％増加することが挙げられる。過剰発現はシャペロン量の増加に相当してもよく、或いはシャペロン活性に相当してもよい。過剰発現は、例えばシャペロンをコードする遺伝子のコピー数を増加させることにより、例えば当該遺伝子を２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のコピー数で含む宿主細胞を提供すること等により達成される。変異体シャペロンは、元のシャペロンに対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％の配列同一性を有することが好ましい。斯かる変異体は、シャペロンの機能的な活性を維持していることが好ましい。
宿主細胞は、プロテアーゼ又はその断片及び／又は変異体をコードする少なくとも１つの異種核酸を含んでいてもよく、いなくてもよい。宿主細胞は、プロテアーゼ、例えばカルシウム依存性セリンプロテアーゼ、例えばキラー発現プロテアーゼ（Killer expression protease：Ｋｅｘ２ｐ）、又はその断片及び／又は変異体等をコードする核酸を少なくとも１つ、含んでいてもよく、いなくてもよい。プロテアーゼ変異体又は断片は機能的である、例えば認識配列Ａｒｇ－Ａｒｇ／Ｘ又はＬｙｓ－Ａｒｇ／Ｘのカルボキシ末端で、ポリペプチドを切断する能力を有することが好ましい。ＫＥＸ２ヌクレオチド配列は配列番号２７を含み、或いは配列番号２７からなっていてもよく、Ｋｅｘ２ｐタンパク質は配列番号２８を含み、或いは配列番号２８からなっていてもよい。ＫＥＸ２及びＫｅｘ２ｐの変異体は、それぞれ配列番号２７及び配列番号２８と、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有していてもよい。ＫＥＸ２は過剰発現されていてもよく、いなくてもよい。
宿主細胞、最も好ましくはＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）は、ＰＤＩ１及び／又はＥＲＯ１を過剰発現し、Ｋｅｘ２ｐをコードする核酸を少なくとも１つ含むことが好ましい。
ＧｓＨ１タンパク質、Ｎｏｔ４タンパク質、又はそのホモログをコードするヌクレオチド配列、及び所望のタンパク質は、本技術分野で公知の任意の突然変異誘発法、例えば部位特異的突然変異誘発法、合成遺伝子構築法、半合成遺伝子構築法、ランダム突然変異誘発法、シャッフリング等により調製することができる。
部位特異的突然変異誘発法は、親をコードするポリヌクレオチド内の１又は２以上の所定の部位に、１又は２以上の（例えば数個の）変異を導入する技術である。
部位特異的突然変異誘発法は、インビトロにおいて、所望の変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲにより達成することができる。また、部位特異的突然変異誘発法は、インビトロにおいて、親をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド内の一部位を制限酵素で切断した後、前記ポリヌクレオチド内に変異を含むオリゴヌクレオチドを連結することを含むカセット突然変異誘発法により達成することもできる。通常は、プラスミドとオリゴヌクレオチドとを同一の制限酵素で切断することにより、プラスミド及び挿入物に粘着末端を形成し、相互に連結を可能とすることが好ましい。例えばScherer and Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955；及びBarton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966等を参照のこと。
部位特異的突然変異誘発法は、本技術分野で公知の方法により、インビボデ達成することもできる。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１１５４号公報；Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773-776；Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290；及びCalissano and Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16等を参照のこと。
本発明では任意の部位特異的突然変異誘発法を使用できる。ポリペプチドの調製に使用可能なキットは多数市販されている。
合成遺伝子構築法は、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を設計し、インビトロで合成することを含む。遺伝子合成には多数の技術を用いることができる。例としては、Tian et al. (2004, Nature 432: 1050-1054)が記載する多重マイクロチップ系技術や、光プログラム可能なマイクロ流通チップを用いてオリゴヌクレオチドの合成及び組み立てを行う類似の技術が挙げられる。
単一又は多重のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入は、既知の突然変異誘発法、組換法、及び／又は、シャッフリング法を実施し、続いて関連するスクリーニング方を実施することにより、作製及び検証することができる。例としては、Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57；Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156；国際公開第９５／１７４１３号；又は国際公開第９５／２２６２５号に記載の方法が挙げられる。使用可能な他の方法としては、エラー許容性（error-prone）ＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えばLowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837；米国特許第５，２２３，４０９号公報；国際公開第９２／０６２０４号）、及び領域特異的突然変異誘発法（Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145；Ner et al., 1988, ＤＮＡ 7: 127）等が挙げられる。
突然変異誘発／シャッフリング法を高スループット自動スクリーニング法と組み合わせ、宿主細胞が発現するクローン化突然変異誘発ポリペプチドの活性を検出することもできる（Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896）。活性ポリペプチドをコードする突然変異誘発ＤＮＡ分子の宿主細胞殻の回収及び即時の配列決定は、本分野で標準的な方法により実施することができる。これらの方法により、ポリペプチド中の個々のアミノ酸残基の重要性を、迅速に決定することが可能となる。
半合成遺伝子構築法は、合成遺伝子構築法、及び／又は、部位特異的突然変異誘発法、及び／又は、ランダム突然変異誘発法、及び／又は、シャッフリング法の各側面を組み合わせることにより実施することができる。半合成構築法は、合成されたポリヌクレオチド断片を用い、これをＰＣＲ技術と組み合わせたことを特徴とする方法である。従って、例えば遺伝子のある所定の領域を新規に（de novo）合成し、他の領域を部位特異的突然変異誘発プライマーを用いて増幅し、更に他の領域をエラー許容性（error-prone）ＰＣＲ又はエラー非許容性（non-error prone）ＰＣＲ増幅に供することができる。その後、ポリヌクレオチドのサブ配列をシャッフルしてもよい。
本発明の第２の側面は、所望のタンパク質、例えば異種タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む、真菌宿主細胞の培養物であって、当該真菌宿主細胞が、改変された、例えば低減された、Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベル、又は、改変された、例えば低減された、Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログの発現レベルを有する、培養物を提供する。
本発明の第２の側面に係る真菌宿主細胞の培養物は更に、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの改変された活性レベル、例えば低減された活性レベル、及び／又は、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの改変された発現レベル、例えば低減された発現レベルを有していてもよい。本発明の第２の側面に係る真菌宿主細胞は、本発明の第一の側面について説明したものと同様である。
或いは、本発明の第２の側面は、所望のタンパク質、例えば異種タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む、真菌宿主細胞の培養物であって、当該真菌宿主細胞が、上昇したＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベル、及び／又は、上昇したＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログの発現レベルを有する、培養物を提供する。これは例えば、所望のタンパク質の産生が宿主の生存に有害である場合等に有用である。斯かる本発明の第２の側面の代替例に係る真菌宿主細胞は、本発明の第一の側面について説明したものと同様である。斯かる例は例えば、宿主の生存性に害を及ぼす所望のタンパク質の産生に有用である。
或いは、本発明の第２の側面は、所望のタンパク質、例えば異種タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む真菌宿主細胞の培養物であって、Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログの増加した活性レベル、及び／又は、Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログの増加した発現レベルを有することを特徴とする真菌宿主細胞の培養物を提供する。これは例えば、所望のタンパク質の産生が宿主の生存に有害である場合等に有用である。斯かる本発明の第２の側面の別態様に係る真菌宿主細胞は、本発明の第一の側面について説明したものと同様である。
また、本発明の第２の側面は、所望のタンパク質、例えば異種タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む真菌宿主細胞の培養物であって、（i）Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログの増加した活性レベル、及び／又は、Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログの増加した発現レベルと、（ii）Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの増加した活性レベル、及び／又は、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの増加した発現レベルとを有することを特徴とする真菌宿主細胞の培養物を提供する。これは例えば、所望のタンパク質の産生が宿主の生存に有害である場合等に有用である。斯かる本発明の第２の側面の別態様に係る真菌宿主細胞は、本発明の第一の側面について説明したものと同様である。
斯かる方法は、グルタチオンの存在下での培養を含んでいてもよい。これは特に、真菌宿主が例えば変異又は欠失等により、機能的なＧｓｈ１タンパク質を欠失している場合に有用である。また、その機能を完全に又は部分的に保持するＧｓｈ１タンパク質を、真菌宿主細胞が含む場合にも有用な可能性もある。グルタチオンは発酵培地中に、少なくとも０．０５ｍＭ、例えば約０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０ｍＭから、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００ｍＭまで、好ましくは約０．５から約５０ｍＭまで、より好ましくは約１～約１０ｍＭ、より好ましくは約３～約７ｍＭ、最も好ましくは約５ｍＭの濃度で存在することができる。
本発明の第３の側面は、所望のタンパク質、例えば異種タンパク質を、真菌宿主細胞により産生する方法であって、本発明の第一の側面に係る真菌宿主細胞、又は、本発明の第２の側面に係る培養物を供し、前記真菌宿主細胞又はその培養物を培養して、前記所望のタンパク質を産生させることを含む、方法を提供する。斯かる方法を使用することで、例えば、真菌宿主細胞による所望のポリペプチドの産生量を改変することができる。ある例によれば、１又は２以上のタンパク質の産生量を増加させることが望ましい。他の例によれば、あるタンパク質、例えば宿主細胞に対して毒性を有しうるタンパク質について、その産生量を低減することが望ましい。
斯かる所望のタンパク質は、宿主細胞から分泌されるものであってもよく、なくてもよいが、分泌タンパク質であることが好ましい。
宿主細胞は例えば、所望のタンパク質の産生に適した栄養培地中、本技術分野で公知の方法により培養することができる。例えば、斯かる細胞は、震盪フラスコ培養により、或いは小スケール又は大スケール発酵（例えば連続、バッチ、供給バッチ、又は固相発酵等）により、実験室又は工業用発酵漕により、適切な培地中、ポリペプチドの発現及び／又は単離を許容する条件下で培養することができる。培養は、例えば炭素及び窒素源並びに無機塩を含む適切な栄養培地中、本技術分野で公知の方法を用いて実施することができる。適切な培地は、市販の製造業者から入手してもよく、（例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログ等で）公表されている組成に基づき調製してもよい。好ましい培地としては、実施例５に記載のＭＷ１１Ｄを含む培地が挙げられる。所望のタンパク質が栄養培地中に分泌される場合、所望のタンパク質を培地から直接回収してもよい。所望のタンパク質が分泌されない場合、例えば細胞溶解物から回収すればよい。
培養は小スケールでも大スケールでもよく、例えばマイクロタイタープレートスケール（例えば培養培地体積１０～５００μＬ）、震盪フラスコスケール（例えば培養体積５～１０００ｍＬ）、或いは発酵漕又は同等の系のスケール（例えば少なくとも培養体積５ｍＬ、より好ましくは少なくとも１、２、３、４又は５Ｌ、より好ましくは少なくとも１０、５０、１００Ｌから、例えば少なくとも５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００Ｌまで）のいずれでもよい。
培養は、例えば宿主細胞に適したｐＨで行うことができる。Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）の場合、そのｐＨは５～７、例えば５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、又は６．９から、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９又は７までの範囲とすることができる。好ましいｐＨ範囲は、約６．０から約６．４までの範囲である。
培養時の温度は、約２０℃～約３５℃、例えば約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４℃から、３４又は３５℃まで、好ましくは約２８～約３２℃、より好ましくは約３０℃とすることができる。
培養時には攪拌を加えてもよく、加えなくてもよい。攪拌は、例えば培養容器を回転させたり、培養容器内に攪拌手段を配置したりして行うことができる。攪拌を加えることが好ましい。
所望のタンパク質の検出は、所望のタンパク質に特異的な本技術分野で公知の方法を用いて行うことができる。斯かる検出方法としては、これらに限定されるものではないが、特異抗体の使用や、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等が挙げられる。
好ましいＨＰＬＣとしては、ゲル浸透ＨＰＬＣ（ＧＰ－ＨＰＬＣ）が挙げられる。適切な装置としてはLC2010 ＨＰＬＣ系（Shimadzu）を用い、これにＵＶ検出器を装備し、Shimadzu VP7.3クライアントサーバーソフトウェアで制御したものが挙げられる。例えば注入量を７５μＬとし、これを７．８ｍｍ ｉｄ×３００ｍｍ長さのＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（Tosoh Bioscience）に、６．０ｍｍ ｉｄ×４０ｍｍ長さのＴＳＫ ＳＷガードカラム（Tosoh Bioscience）を組み合わせたものに導入する。試料のクロマトグラフ測定は、例えば２５ｍＭ リン酸ナトリウム、１００ｍＭ 硫酸ナトリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、ｐＨ７．０中、１ｍＬ・分－１で、稼働時間２０分間で実施することができる。試料の定量は、例えば２８０ｎｍでＵＶ検出を行い、ピーク面積を既知の濃度（例えば１０ｍｇ／ｍＬ）の組換ヒトアルブミン標準品と比較し、相対吸光係数で補正することにより行うことができる。
本方法は任意により、前記所望のタンパク質を回収することを含む。例としては、宿主細胞又は宿主細胞培養物から、例えば細胞培地又は細胞溶解物から、所望のタンパク質を単離してもよい。
所望のタンパク質の回収は、本技術分野で公知の方法を用いて実施しうる。例えば、所望のタンパク質の栄養培地からの回収は、従来の方法、例えばこれらに限定されるものではないが、収集、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸散、又は沈殿を用いて行うことができる。
本方法は任意により、前記所望のタンパク質を精製することを含む。所望のタンパク質の精製は、本技術分野で公知の種々の方法により実施しうる。例としては、これらに限定されるものではないが、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、親和性、疎水性、クロマト分画、及びサイズ排除）、電気泳動法（例えば予備的等電点電気泳動法）、示差溶解性（例えば硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、又は抽出法（例えばProtein Purification, Janson and Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989）等を用いて、実質的に純粋な所望のタンパク質を得ることができる。
代替的な側面によれば、所望のタンパク質を回収する代わりに、所望のタンパク質を発現する本発明の宿主細胞を、所望のタンパク質の供給源として用いることもできる。
前記所望のタンパク質（例えば所望の異種タンパク質）を培養宿主細胞又は培地から精製する工程は、任意により細胞固定化、細胞分離、及び／又は、細胞破砕を含んでいてもよい。但し、斯かる工程とは異なる他の少なくとも１つの精製工程、或いは細胞固定化、分離、及び／又は破砕の工程を含む。
細胞固定化技術、例えば細胞をアルギン酸ナトリウムビーズに内包させる技術は、本技術分野で公知である。同様に、細胞分離技術、例えば遠心分離、濾過（例えば直交流濾過）、膨張床（expanded bed）クロマトグラフィー等も、本技術分野で公知である。同様に、細胞破砕の方法、例えばビーズミル処理、超音波処理、酵素暴露等も、本技術分野で公知である。
他の少なくとも１つの精製工程は、タンパク質精製に適した工程であれば、本技術分野で公知の任意の工程を用いることができる。例えば、組換発現アルブミンの回収のための精製技術は、国際公開第２０１０／１２８１４２号、アルブミン特異性リガンド、例えば２－クロロ－４，６－ジ（２’－スルホアニリノ）－Ｓ－トリアジン等を用いた親和性精製；国際公開第９２／０４３６７号、マトリックス由来染料の除去；欧州特許出願第４６４５９０号公報、酵母由来色素の除去；欧州特許出願第３１９０６７号公報、アルカリ沈殿及びそれに続くアルブミンの親油性相への暴露；並びに、国際公開第９６／３７５１５号、米国特許第５７２８５５３号、及び国際公開第００／４４７７２号公報に記載の、完全精製工程等が挙げられる。これらは何れも引用により本明細書に組み込まれる。
アルブミン以外の他の所望のタンパク質も、斯かるタンパク質の精製に有用であることが知られている任意の技術を用いて、培地から精製することができる。
適切な方法としては、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸又は溶媒抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、濃縮、希釈、ｐＨ調節、透析濾過、限界濾過、高性能液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）、逆相ＨＰＬＣ、導電率調節等が挙げられる。
任意により、斯かる方法は、単離されたタンパク質を、商業的又は工業的許容しうるレベルに至るまで精製することを含んでいてもよい。商業的又は工業的許容しうるレベルの純度としては、例えば少なくとも０．０１ｇ・Ｌ－１、０．０２ｇ・Ｌ－１、０．０３ｇ・Ｌ－１、０．０４ｇ・Ｌ－１、０．０５ｇ・Ｌ－１，０．０６ｇ・Ｌ－１，０．０７ｇ・Ｌ－１、０．０８ｇ・Ｌ－１、０．０９ｇ・Ｌ－１、０．１ｇ・Ｌ－１、０．２ｇ・Ｌ－１、０．３ｇ・Ｌ－１、０．４ｇ・Ｌ－１、０．５ｇ・Ｌ－１、０．６ｇ・Ｌ－１、０．７ｇ・Ｌ－１、０．８ｇ・Ｌ－１、０．９ｇ・Ｌ－１、１ｇ・Ｌ－１、２ｇ・Ｌ－１、３ｇ・Ｌ－１、４ｇ・Ｌ－１、５ｇ・Ｌ－１、６ｇ・Ｌ－１、７ｇ・Ｌ－１、８ｇ・Ｌ－１、９ｇ・Ｌ－１、１０ｇ・Ｌ－１、１５ｇ・Ｌ－１、２０ｇ・Ｌ－１、２５ｇ・Ｌ－１、３０ｇ・Ｌ－１、４０ｇ・Ｌ－１，５０ｇ・Ｌ－１、６０ｇ・Ｌ－１、７０ｇ・Ｌ－１、８０ｇ・Ｌ－１、９０ｇ・Ｌ－１、１００ｇ・Ｌ－１、１５０ｇ・Ｌ－１、２００ｇ・Ｌ－１，２５０ｇ・Ｌ－１、３００ｇ・Ｌ－１、３５０ｇ・Ｌ－１、４００ｇ・Ｌ－１、５００ｇ・Ｌ－１、６００ｇ・Ｌ－１、７００ｇ・Ｌ－１、８００ｇ・Ｌ－１、９００ｇ・Ｌ－１、１０００ｇ・Ｌ－１、又はそれ以上のタンパク質濃度が挙げられる。商業的又は工業的許容しうるレベルの純度としては、例えば単離タンパク質中に存在する他の物質（例えば１又は２以上（例えば数個）の夾雑物）の比率が、少なくとも例えば少なくとも５０％未満、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０１％、０．００１％、０．０００１％、０．００００１％、又は０．０００００１％未満、最も好ましくは０％のレベルで存在することが挙げられる。
斯かるタンパク質は、例えば少なくとも０．０１ｇ・Ｌ－１、０．０２ｇ・Ｌ－１、０．０３ｇ・Ｌ－１、０．０４ｇ・Ｌ－１、０．０５ｇ・Ｌ－１，０．０６ｇ・Ｌ－１，０．０７ｇ・Ｌ－１、０．０８ｇ・Ｌ－１、０．０９ｇ・Ｌ－１、０．１ｇ・Ｌ－１、０．２ｇ・Ｌ－１、０．３ｇ・Ｌ－１、０．４ｇ・Ｌ－１、０．５ｇ・Ｌ－１、０．６ｇ・Ｌ－１、０．７ｇ・Ｌ－１、０．８ｇ・Ｌ－１、０．９ｇ・Ｌ－１、１ｇ・Ｌ－１、２ｇ・Ｌ－１、３ｇ・Ｌ－１、４ｇ・Ｌ－１、５ｇ・Ｌ－１、６ｇ・Ｌ－１、７ｇ・Ｌ－１、８ｇ・Ｌ－１、９ｇ・Ｌ－１、１０ｇ・Ｌ－１、１５ｇ・Ｌ－１、２０ｇ・Ｌ－１、２５ｇ・Ｌ－１、３０ｇ・Ｌ－１、４０ｇ・Ｌ－１，５０ｇ・Ｌ－１、６０ｇ・Ｌ－１、７０ｇ・Ｌ－１、８０ｇ・Ｌ－１、９０ｇ・Ｌ－１、１００ｇ・Ｌ－１、１５０ｇ・Ｌ－１、２００ｇ・Ｌ－１，２５０ｇ・Ｌ－１、３００ｇ・Ｌ－１、３５０ｇ・Ｌ－１、４００ｇ・Ｌ－１、５００ｇ・Ｌ－１、６００ｇ・Ｌ－１、７００ｇ・Ｌ－１、８００ｇ・Ｌ－１、９００ｇ・Ｌ－１、１０００ｇ・Ｌ－１、又はそれ以上の濃度濃度で供される。
所望のタンパク質を精製することにより、医薬的に許容可能なレベルの純度を達成することが好ましい。タンパク質が医薬的に許容可能なレベルの純度を有するとは、タンパク質が実質的に発熱物質を含まず、惹いては、タンパク質の活性とは関連しない医薬作用を引き起こすことなく、タンパク質の医薬有効量を投与できる濃度を意味する。
本方法は任意により、前記所望のタンパク質を、治療上許容しうる担体又は希釈剤と共に製剤することにより、ヒト又は動物への投与に適した治療製剤を製造することを含む。
得られた所望のタンパク質は、その既知の用途のうち何れかに用いるものでもよく、用いなくともよい。斯かる用途の例としては、アルブミンの場合、患者に静脈内（ｉ．ｖ．）投与することにより、重傷の火傷、ショック及び貧血を治療することに加え、補充培養培地としての使用や、他のタンパク質の製剤の賦形剤としての使用が挙げられる。
本発明の方法により得られた治療的、診断的、工業的、家庭的、又は栄養的に有用な所望のタンパク質は、単独で供給又は投与してもよいが、１又は２以上の許容しうる担体又は希釈剤と組み合わせ、製剤（例えば医薬製剤、特に治療的及び／又は診断的に有用なタンパク質の場合）の形態とすることが好ましい。担体又は希釈剤が「許容しうる」とは、所望のタンパク質と適合しうると共に、需要者への投与を意図した製剤の場合、その受容者に有害でないことを意味する。通常、担体又は希釈剤は水又は食塩水であり、無菌で且つ発熱物質を含まない。
任意により、こうして製剤化されたタンパク質を単位投与形態として、例えば錠剤、カプセル、注射溶液等の形態で提供してもよい。
任意により、斯かる方法は更に、前記所望のタンパク質を単位投与形態として提供することを含む。
本発明の第４の側面は、所望のタンパク質（例えば異種タンパク質）の産生量を増加させる方法であって、本発明の第３の側面に係る方法を提供する。
また、本発明の第４の側面は、所望のタンパク質（例えば異種タンパク質）の産生量を増加させるための、本発明の第一の側面に係る宿主細胞、又は、本発明の第２の側面に係る培養物の使用を提供する。
産生量とは、溶液、例えば培養液や細胞溶解混合物等の中における、生成物、例えば所望のタンパク質等の量を意味する。産生量は、例えば参照宿主株からの産生量を１００％として、相対量として表してもよい。宿主株と比較する場合、所定の条件群の下で産生量を測定することが好ましい。絶対産生量は、例えばμＬ当たりｎｇ（ｎｇ／μＬ）又はＬ当たりｇ（ｇ／Ｌ）として表現することができる。また、産生量は、例えば比細胞産生率（rate of specific cellolar productivuty：ＹＰＸＴ）として表現することもできる。
前記所望のタンパク質の産生量は、参照真菌宿主細胞、例えば野生型Ｇｓｈ１タンパク質、例えば配列番号２のタンパク質を有する真菌宿主細胞からの産生量（ｇ／Ｌ又はＹＰＸＴ）と比較して、少なくとも２％高い、より好ましくは少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２．５、１５、１７．５、２０、２２．５、２５、２７．５、３０、３５、４０、４５、又は少なくとも５０％高いことが好ましい。参照真菌宿主細胞は、配列番号２のＧｓｈ１タンパク質を有することが好ましい。
中でも、前記所望のタンパク質の産生量が、参照真菌宿主細胞、例えば野生型Ｎｏｔ４タンパク質、例えば配列番号６を有する真菌宿主細胞からの産生量（ｇ／Ｌ又はＹＰＸＴ）と比較して、少なくとも２％高い、より好ましくは少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２．５、１５、１７．５、２０、２２．５、２５、２７．５、３０、３５、４０、４５、又は少なくとも５０％高いことが好ましい。参照真菌宿主細胞は、配列番号６のＮｏｔ４タンパク質を有することが好ましい。
更には、前記所望のタンパク質の産生量が、参照真菌宿主細胞、例えば野生型Ｇｓｈ１タンパク質、例えば配列番号２を有する真菌宿主細胞、及び、野生型Ｎｏｔ４タンパク質、例えば配列番号６を有する真菌宿主細胞からの産生量（ｇ／Ｌ又はＹＰＸＴ）と比較して、少なくとも２％高い、より好ましくは少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２．５、１５、１７．５、２０、２２．５、２５、２７．５、３０、３５、４０、４５、又は少なくとも５０％高いことが好ましい。参照真菌宿主細胞は、配列番号２のＧｓｈ１タンパク質と配列番号６のＮｏｔ４タンパク質とを有することが好ましい。
所望のタンパク質は、本発明の第一の側面について説明したとおりであり、特にアルブミン、或いはその変異体、断片及び／又は融合体である。
本発明の第５の側面は、本発明の第３又は第４の側面に係る方法により作製された所望のタンパク質（例えば異種タンパク質）を提供する。
また、本発明は、本発明の第５の側面の所望のタンパク質を含む組成物、例えば医薬組成物を提供する。斯かる医薬組成物は、更に１又は２以上の医薬的に許容可能な担体、例えば米国食品医薬品局又は欧州医薬品庁等の規制当局によって承認されたものを含んでいてもよい。更に、本発明は、患者を治療する方法であって、斯かる医薬組成物の有効量を患者に投与することを含む方法を提供する。
本発明の第６の側面は、本発明の第１の側面に係る真菌宿主細胞又は本発明の第２の側面に係る培養物を調製する方法を提供する。当該方法は、（親）真菌宿主細胞を遺伝子的に改変することにより、結果として得られるＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログを改変し、Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベルを改変、例えば低減し、ＧＳＨ１遺伝子又はホモログ又はその調節配列を改変し、或いはＧＳＨ１遺伝子又はそのホモログの発現レベルを改変することを含む。任意により、前記方法は、（親）真菌宿主細胞を遺伝子的に改変することにより、結果として得られる結果として得られるＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログを改変し、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルを改変、例えば低減し、ＮＯＴ４遺伝子又はホモログ又はその調節配列を改変し、或いはＮＯＴ４遺伝子又はそのホモログの発現レベルを改変することを含んでいてもよい。活性及び／又は発現レベルの変異、欠失、及び修飾は、本発明の第１、第２、及び第３の側面について説明したとおりである。宿主細胞を改変する方法は、本技術分野で公知である。前記宿主細胞の遺伝子修飾に代わる手法として、阻害剤又は促進剤を増殖培地に添加することにより、Ｇｓｈ１タンパク質のレベル又は活性レベルを改変してもよい。同様に、前記宿主細胞の遺伝子修飾に代わる手法として、阻害剤又は促進剤を増殖培地に添加することにより、Ｎｏｔ４タンパク質のレベル又は活性レベルを改変してもよい。
本発明の第７の側面は、配列番号２に対して少なくとも５０％の同一性を含むと共に、配列番号２の４７、４８、４９、５０、５１、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、４０９、４５１、４５２、４５３、４５４及び４５５、から選択される１又は２以上の位置、好ましくは（ａ）５７～５１；（ｂ）１２０～１３０；（ｃ）４０９又は（ｄ）４５１～４５５に対応する位置から選択される位置に変異を含む、Ｇｓｈ１タンパク質、又はそのホモログを提供する。配列番号２の位置１２５に対応する位置の変異が特に好ましい。
本発明の第７の側面に係るＧｓｈ１タンパク質は、例えば本発明の第１の側面について説明したとおりである。斯かるＧｓｈ１タンパク質は、配列番号４を含むか、配列番号４からなることが好ましい。本発明の第７の側面のＧｓｈ１タンパク質は、単離されたタンパク質であってもよく、なくてもよい。
本発明の第８の側面は、本発明のＧｓｈ１変異体、例えば配列番号２の変異体であって、野生型Ｇｓｈ１タンパク質、例えば配列番号２、又はそのホモログをコードする宿主細胞と比べて、Ｇｓｈ１タンパク質の発現レベルが低減されてなる変異体若しくはそのホモログ、及び／又は、Ｇｓｈ１タンパク質の活性レベルが低減されてなる変異体若しくはそのホモログをコードするポリヌクレオチドを提供する。斯かるＧｓｈ１タンパク質は、本発明の第１から第６の側面について説明したとおりである。
好ましいポリヌクレオチドとしては、変異Ｒ１２５Ｇ（配列番号４）を有するＧｓｈ１タンパク質が挙げられる。斯かるポリヌクレオチド配列の例は、配列番号３に供される。
また、本発明は例えば、本発明のＧｓｈ１変異体をコードするポリヌクレオチドと、これと作動式に連結された１又は２以上の調節配列とを含む核酸コンストラクトであって、前記調節配列が、適切な宿主細胞内で、且つ、前記調節配列と適合しうる条件下で、前記コーディング配列の発現を誘導するように構成された、核酸コンストラクトにも関する。適切な調節配列は、本発明の第１から第７の側面について説明したとおりである。
斯かる核酸コンストラクトは更に、本発明のＮｏｔ４変異体をコードするポリヌクレオチドと、これと作動式に連結された１又は２以上の調節配列とを含むと共に、前記調節配列が、適切な宿主細胞内で、且つ、前記調節配列と適合しうる条件下で、前記コーディング配列の発現を誘導するように構成されていてもよい。適切な調節配列は、本発明の第１から第７の側面について説明したとおりである。
斯かるポリヌクレオチドは、ベクター内に位置していてもよく、宿主細胞のゲノム内に位置していてもよい。
従って、本発明は、本発明のＧｓｈ１変異体をコードするポリヌクレオチド、プロモーター、並びに、転写及び翻訳停止シグナルを含む組換ベクターにも関する。任意により、前記ベクターは更に、本発明のＮｏｔ４変異体をコードするポリヌクレオチド、プロモーター、並びに、転写及び翻訳停止シグナルを含んでいてもよい。Ｇｓｈ１とＮｏｔ４は、同一のポリヌクレオチド（例えばベクター）によりコードされていてもよく、異なるポリヌクレオチド（例えばベクター）によりコードされていてもよい。また、本発明は、Ｇｓｈ１をコードするポリヌクレオチドと、Ｇｓｈ１のレベル又はＧｓｈ１の活性を改変しうる、例えば低減しうる、１又は２以上（例えば数個）の調節配列とを含むベクターにも関する。任意により、斯かるポリヌクレオチド（例えばベクター）は更に、Ｎｏｔ４をコードするポリヌクレオチドと、Ｎｏｔ４のレベル又はＮｏｔ４の活性を改変しうる、例えば低減しうる、１又は２以上（例えば数個）の調節配列とを含んでいてもよい。種々のヌクレオチド及び調節配列を組み合わせることで、組換ベクター内に１又は２以上の有用な制限部位を組み込んでもよく、これにより、変異体をコードするポリヌクレオチドを、斯かる部位に挿入又は置換することが可能となる。或いは、ポリヌクレオチド又はそれを含む核酸コンストラクトを、適切な発現用ベクターに挿入することにより、斯かるポリヌクレオチドを発現させてもよい。ベクターを作製する際には、コーディング配列が発現用の適切な調節配列と作動式に連結されるように、コーディング配列をベクター内に配置する。
組換ベクターは、組換ＤＮＡ手順に簡便に供することができ、且つ、斯かるポリヌクレオチドの発現を生じさせることが可能な限り、任意のベクター（例えばプラスミド又はウイルス）であってよい。ベクターの選択は、通常はベクターを導入する宿主細胞との適合性に依存する。ベクターは直鎖状でも閉鎖環状プラスミドでもよい。
ベクターは自己複製ベクター、即ち染色体外に存在し、染色体複製とは独立に複製されるベクターであってもよい。その例としては、プラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、又は人工染色体が挙げられる。ベクターは自己複製を行うための何らかの手段を含んでいてもよい。或いはベクターは、宿主細胞内に導入されるとゲノムに組み込まれると共に、導入された染色体と一緒に複製されるものであってもよい。更に、宿主細胞のゲノムに取り込まれるべきＤＮＡは、単一のベクター又はプラスミドにまとめて含まれていてもよく、２又はそれ以上のベクター又はプラスミドに分割して含まれていてもよい。更にはトランスポゾンを用いてもよい。
ベクターは、形質転換、トランスフェクト、形質導入等された細胞の選択を可能とする、１又は２以上の選択マーカーを含むことが好ましい。選択マーカーとしては、殺生物性、ウイルス抵抗性、重金属に対する抵抗性、栄養要求体に対する原栄養性等を提供する遺伝子生成物を発現する遺伝子が挙げられる。
斯かるベクターは、ベクターが宿主細胞のゲノム内に組み込まれること、又は、ベクターがゲノムとは独立に細胞内で自己複製することを可能とする要素を含むことが好ましい。
ベクターが宿主細胞ゲノム内に組み込まれるには、ベクターが相同又は非相同組換によりゲノム内に組み込まれるように、ポリヌクレオチド内の変異体をコードする配列、又は、ベクターの他の任意の要素の構成を設計してもよい。或いは、ベクターが（１又は２以上の）染色体内の（１又は２以上の）位置に対して、相同組換により正確に組み込まれるように、ベクターに追加のポリヌクレオチドを付与してもよい。正確な位置で組み込みが生じる確率を高めるべく、組み込みのための要素として、対応する標的配列に対して高い配列同一性を有する十分な数の核酸、例えば１００～１０，０００塩基対、４００～１０，０００塩基対、及び８００～１０，０００塩基対の核酸を設けることで、相同組換の可能性を向上させることができる。斯かる組み込みのための要素は、宿主細胞ゲノム内の標的配列と相同であれば、任意の配列とすることができる。更に、組み込みのための要素は、ポリヌクレオチドをコードする配列であってもよく、コードしない配列であってもよい。或いは、ベクターは、宿主細胞のゲノムに対して、非相同組換により組み込まれてもよい。
ベクターが自己複製を生じるように、所望の宿主細胞内での自律的複製を可能とする複製起点を、ベクターに含めてもよい。複製起点としては、細胞内で自己複製を媒介するよう機能しうる任意のプラスミド複製子が挙げられる。「複製起点」又は「プラスミド複製子」という語は、プラスミド又はベクターのインビボでの複製を可能とするポリヌクレオチドを意味する。
酵母宿主細胞で使用可能な複製起点の例としては、２ミクロン複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３との組合せ、及び、ＡＲＳ４とＣＥＮ６との組合せが挙げられる。
糸状菌（filamentous fungi）細胞で有用な複製起点の例としては、ＡＭＡ１及びＡＮＳ１が挙げられる（Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67；Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175；国際公開第００／２４８８３号）。ＡＭＡ１遺伝子の単離、及び、当該遺伝子を含むプラスミド又はベクターの構築は、国際公開第００／２４８８３号に開示の方法に従って行うことができる。
所望のタンパク質の産生を高めるために、本発明のポリヌクレオチドを宿主細胞に２コピー以上導入してもよい。ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、少なくとも１コピー分多い配列を宿主細胞のゲノム内に組み込むことにより、或いは、ポリヌクレオチドと共に増幅可能な選択マーカー遺伝子を導入し、その後に適切な選択物質の存在下で細胞を培養することで、増幅されたコピー数の選択マーカー遺伝子を含む細胞、惹いては増幅されたコピー数のポリヌクレオチドを含むを含む細胞を選択することにより、達成することができる。
上述の要素を連結して本発明の組換ベクターを構築するための手法は、当業者には既知である（例えばSambrook et al., 1989, Molecular クローニング, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照）。
好適な態様
１．ａ．Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログ、及び／又は
ｂ．Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベル又は発現レベル、及び／又は
ｃ．ＧＳＨ１遺伝子又はそのホモログ、及び／又は
ｄ．ＧＳＨ１遺伝子又はそのホモログの発現レベル
が改変された、真菌宿主細胞。
２．前記改変されたレベルが、低減されたレベルである、態様１の真菌宿主細胞。
３．前記改変されたレベルが、増加したレベルである、態様１の真菌宿主細胞。
４．前記改変されたレベルが、参照真菌宿主細胞、例えば、
ａ．前記Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログが、野生型Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログである、真菌宿主細胞、
ｂ．前記Ｇｓｈ１タンパク質が配列番号２を含むか、配列番号２からなる真菌宿主細胞、
ｃ．Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）Ｓ２８８Ｃ、又は
ｄ．Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＤＸＹ１
のレベルと比較して改変されたレベルである、前記態様の何れかの真菌宿主細胞。
５．改変された
ｅ．Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログ、及び／又は
ｆ．Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベル又は発現レベル、及び／又は
ｇ．ＮＯＴ４遺伝子又はそのホモログ、及び／又は
ｈ．ＮＯＴ４遺伝子又はそのホモログの発現レベル
を有する、態様１～４の何れかの真菌宿主細胞。
６．前記改変されたレベルが、低減されたレベルである、態様５の真菌宿主細胞。
７．前記改変されたレベルが、増加したレベルである、態様５の真菌宿主細胞。
８．前記改変されたレベルが、参照真菌宿主細胞、例えば、
ａ．前記Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログが、野生型Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログである、真菌宿主細胞、
ｂ．前記Ｎｏｔ４タンパク質が配列番号６を含むか、配列番号６からなる真菌宿主細胞、
ｃ．Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）Ｓ２８８Ｃ、又は、
ｄ．Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＤＸＹ１
のレベルに対して改変されたレベルである、態様５又は６の真菌宿主細胞。
９．所望のタンパク質、例えば異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、前記態様の何れかの真菌宿主細胞。
１０．前記所望のタンパク質が、アルブミン、モノクローナル抗体、エトポシド、血清タンパク質（例えば血液凝固因子）、アンチスタシン、ダニ抗凝血ペプチド、トランスフェリン、ラクトフェリン、エンドスタチン、アンジオスタチン、コラーゲン、免疫グロブリン若しくは免疫グロブリン系分子、又はその何れかの断片（例えば小型モジュラー免疫医薬（Small Modular ImmunoPharmaceuticals（登録商標）：“ＳＭＩＰ”）又はｄＡｂ、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＡｂ、ｓｃＦｖ又はｓｃＦｖ断片）、クニッツ（Kunitz）ドメインタンパク質（例えば国際公開第０３／０６６８２４号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のタンパク質及びそのアルブミン融合体）、インターフェロン、インターロイキン、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－２、インターフェロンα（alpha）種及び亜種、インターフェロンβ（beta）種及び亜種、インターフェロンγ（gamma）種及び亜種、レプチン、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＦＡｘ１５、ＩＬ－１受容体アンタゴニスト、エリスロポエチン（ＥＰＯ）及びＥＰＯ模倣薬、トロンボポエチン（ＴＰＯ）及びＴＰＯ模倣薬、プロサプチド（prosaptide）、シアノビリン－Ｎ、５－ヘリックス、Ｔ２０ペプチド、Ｔ１２４９ペプチド、ＨＩＶｇｐ４１、ＨＩＶｇｐ１２０、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ｔＰＡ、ヒルジン、血小板由来成長因子、副甲状腺ホルモン、プロインシュリン、インシュリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、例えばエキセンディン（exendin）－４、ＧＬＰ－１又はＧＬＰ－２、インシュリン様成長因子、カルシトニン、成長ホルモン、形質転換成長因子β（beta）、腫瘍壊死因子、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＦＧＦ、凝固因子（前活性型又は活性型）、例えば、これらに限定されるものではないが、プラスミノーゲン、フィブリノーゲン、トロンビン、プレトロンビン、プロトロンビン、フォン・ヴィレブランド（von Willebrand）因子、α（alpha）１－アンチトリプシン、プラスミノーゲン活性化剤、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X及び因子XIII、神経成長因子、ＬＡＣＩ、血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ－ＥＣＧＦ）、グルコースオキシダーゼ、血清コリンエステラーゼ、アプロチニン、アミロイド前駆体タンパク質、インターアルファトリプシン阻害剤、抗トロンビンIII、アポリポタンパク質種、タンパク質C、タンパク質S、代謝産物、抗生物質、或いは上記何れかの変異体又は断片から選択される、態様９の真菌宿主細胞。
１１．前記所望のタンパク質が、アルブミン、又はその変異体、断片、及び／又は融合体を含むか、アルブミン、又はその変異体、断片、及び／又は融合体からなる、態様９又は１０の真菌宿主細胞。
１２．前記アルブミン又はその変異体、断片、及び／又は融合体が、配列番号１０に対して少なくとも７０％の同一性を有する、態様１１の真菌宿主細胞。
１３．前記アルブミン又はその変異体、断片、及び／又は融合体が、配列番号１０に対して少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性を有する、態様１１の真菌宿主細胞。
１４．前記アルブミン又はその変異体、断片、及び／又は融合体が、配列番号１０に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは配列番号１０に対して少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性を有すると共に、配列番号１０のＫ５７３に対応する位置にＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹを含む、態様１３の真菌宿主細胞。
１５．アルブミン又はその変異体、断片、及び／又は融合体が、配列番号１０のＫ５７３に対応する位置にＰ、Ｈ、Ｗ又はＹを含む、態様１４の真菌宿主細胞。
１６．前記アルブミン、又はその変異体、断片、及び／又は融合体が、配列番号１０に対して少なくとも９８％の同一性を有すると共に、配列番号１０のＫ５７３に対応する位置にＰを含む、態様１５の真菌宿主細胞。
１７．前記アルブミン又はその変異体、断片、及び／又は融合体が、配列番号１０に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは配列番号１０に対して少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性を有すると共に、配列番号１０のＥ４９２に対応する位置にＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹを含む．態様１３～１６の何れかの真菌宿主細胞。
１８．アルブミン又はその変異体、断片、及び／又は融合体が、配列番号１０のＥ４９２に対応する位置に、Ｇ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｍ又はＲを含む、態様１７の真菌宿主細胞。
１９．前記アルブミン、又はその変異体、断片、及び／又は融合体が、配列番号１０に対して少なくとも９８％の同一性を有すると共に、配列番号１０のＥ４９２に対応する位置に、Ｇ又はＤを含む、態様１８の真菌宿主細胞。
２０．前記アルブミン、又はその変異体、断片、及び／又は融合体が、配列番号１０に対して少なくとも９８％の同一性を有すると共に、配列番号１０のＥ４９２に対応する位置にＧを含む、態様１９の真菌宿主細胞。
２１．前記アルブミン又はその変異体、断片、及び／又は融合体が、配列番号１０に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは配列番号１０に対して少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性を有すると共に、配列番号１０のＫ５７４に対応する位置にＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹを含む、態様１３～２０の何れかの真菌宿主細胞。
２２．アルブミン又はその変異体、断片、及び／又は融合体が、配列番号１０のＫ５７４に対応する位置にＨ、Ｇ、Ｄ、Ｆ、Ｎ、Ｓ又はＹを含む、態様２１の真菌宿主細胞。
２３．前記アルブミン、又はその変異体、断片、及び／又は融合体が、配列番号１０に対して少なくとも９８％の同一性を有すると共に、配列番号１０のＫ５７４に対応する位置にＤ、Ｆ、Ｇ又はＨを含む、態様２２の真菌宿主細胞。
２４．前記アルブミン、又はその変異体、断片、及び／又は融合体が、配列番号１０に対して少なくとも９８％の同一性を有すると共に、配列番号１０のＫ５７４に対応する位置にＨを含む、態様２３の真菌宿主細胞。
２５．前記アルブミン又はその変異体、断片、及び／又は融合体が、配列番号１０に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは配列番号１０に対して少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性を有すると共に、配列番号１０のＱ５８０に対応する位置にＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹを含む、態様１３～２４の何れかの真菌宿主細胞。
２６．アルブミン又はその変異体、断片、及び／又は融合体が、配列番号１０のＱ５８０に対応する位置にＫ又はＲを含む、態様２５の真菌宿主細胞。
２７．前記アルブミン、又はその変異体、断片、及び／又は融合体が、配列番号１０に対して少なくとも９８％の同一性を有すると共に、配列番号１０のＫ５７３に対応する位置にＫを含む、態様２６の真菌宿主細胞。
２８．前記アルブミン融合体が、配列番号４５のアルブミン変異体を含む、態様１３～２６の何れかの真菌宿主細胞。
２９．前記アルブミン変異体が配列番号４５を含むか、配列番号４５からなる、態様１３～２６の何れかの真菌宿主細胞。
３０．前記融合体が、アルブミン又はその変異体、断片若しくは融合体ではない融合パートナーを含む、態様１１～２９の何れかの真菌宿主細胞。
３１．前記融合体が、モノクローナル抗体、エトポシド、血清タンパク質（例えば血液凝固因子）、アンチスタシン、ダニ抗凝血ペプチド、トランスフェリン、ラクトフェリン、エンドスタチン、アンジオスタチン、コラーゲン、免疫グロブリン若しくは免疫グロブリン系分子、又はその何れかの断片（例えば小型モジュラー免疫医薬（Small Modular ImmunoPharmaceuticals）（登録商標）（“ＳＭＩＰ”）又はｄＡｂ、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＡｂ、ｓｃＦｖ又はｓｃＦｖ断片）、クニッツ（Kunitz）ドメインタンパク質（例えば国際公開第０３／０６６８２４号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のもの、インターフェロン、インターロイキン、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－２、インターフェロンα（alpha）種及び亜種、インターフェロンβ（beta）種及び亜種、インターフェロンγ（gamma）種及び亜種、レプチン、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＦＡｘ１５、ＩＬ－１受容体アンタゴニスト、エリスロポエチン（ＥＰＯ）及びＥＰＯ模倣薬、トロンボポエチン（ＴＰＯ）及びＴＰＯ模倣薬、プロサプチド（prosaptide）、シアノビリン－Ｎ、５－ヘリックス、Ｔ２０ペプチド、Ｔ１２４９ペプチド、ＨＩＶｇｐ４１、ＨＩＶｇｐ１２０、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ｔＰＡ、ヒルジン、血小板由来成長因子、副甲状腺ホルモン、プロインシュリン、インシュリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、例えばエキセンディン（exendin）－４、ＧＬＰ－１又はＧＬＰ－２、インシュリン様成長因子、カルシトニン、成長ホルモン、形質転換成長因子β（beta）、腫瘍壊死因子、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＦＧＦ、凝固因子（前活性型又は活性型）、例えば、これらに限定されるものではないが、プラスミノーゲン、フィブリノーゲン、トロンビン、プレトロンビン、プロトロンビン、フォン・ヴィレブランド（von Willebrand）因子、α（alpha）１－アンチトリプシン、プラスミノーゲン活性化剤、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X及び因子XIII、神経成長因子、ＬＡＣＩ、血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ－ＥＣＧＦ）、グルコースオキシダーゼ、血清コリンエステラーゼ、アプロチニン、アミロイド前駆体タンパク質、インターアルファトリプシン阻害剤、抗トロンビンIII、アポリポタンパク質種、タンパク質C、タンパク質S、代謝産物、抗生物質、或いは上記何れかの変異体又は断片から選択される融合パートナーを含む、態様１２～３０の何れかの真菌宿主細胞。
３２．前記融合パートナーが、グルカゴン様タンパク質又はその類似物を含むか、グルカゴン様タンパク質又はその類似物からなる、態様３０又は３１の真菌宿主細胞。
３３．前記融合パートナーが配列番号１４、１５、５１、又は５２を含むか、配列番号１４、１５、５１、又は５２からなる、態様３２の真菌宿主細胞。
３４．前記所望のタンパク質が配列番号１６を含むか、配列番号１６からなる、態様９～３３の何れかの真菌宿主細胞。
３５．前記改変されたＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベル及び／又は発現レベルが、親真菌宿主細胞、例えば野生型真菌宿主細胞における、前記Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベル又は発現レベルに対して改変されたレベルである、前記態様の何れかの真菌宿主細胞。
３６．前記Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベル及び／又は発現レベルが、前記親真菌宿主細胞のＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベル又は発現レベルの９９％以下まで低減されている、態様３５の真菌宿主細胞。
３７．前記Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベル及び／又は発現レベルが、前記親真菌宿主細胞のＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベル又は発現レベルの９５％以下まで低減されている、態様３６の真菌宿主細胞。
３８．前記Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベル及び／又は発現レベルが、前記親真菌宿主細胞のＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベル又は発現レベルの９０％以下まで低減されている、態様３７の真菌宿主細胞。
３９．前記Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベル及び／又は発現レベルが、前記親真菌宿主細胞のＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベル又は発現レベルの８０％以下まで低減されている、態様３８の真菌宿主細胞。
４０．前記Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベル及び／又は発現レベルが、前記親真菌宿主細胞のＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベル又は発現レベルの７０％以下まで低減されている、態様３９の真菌宿主細胞。
４１．前記Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベル及び／又は発現レベルが、前記親真菌宿主細胞のＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベル又は発現レベルの６０％以下まで低減されている、態様４０の真菌宿主細胞。
４２．前記Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベル及び／又は発現レベルが、前記親真菌宿主細胞のＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベル又は発現レベルの５０％以下まで低減されている、態様４１の真菌宿主細胞。
４３．前記Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベル及び／又は発現レベルが、前記親真菌宿主細胞のＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベル又は発現レベルの４０％以下まで低減されている、態様４２の真菌宿主細胞。
４４．前記Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベル及び／又は発現レベルが、前記親真菌宿主細胞のＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベル又は発現レベルの３０％以下、好ましくは２０％以下まで低減されている、態様４３の真菌宿主細胞。
４５．前記Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベル及び／又は発現レベルが、前記親真菌宿主細胞のＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベル又は発現レベルの実質的に０％まで低減されている、態様４４の真菌宿主細胞。
４６．前記宿主細胞が、機能的なＧＳＨ１遺伝子又はホモログ、又は、機能的なＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログを欠いている、前記態様の何れかの真菌宿主細胞。
４７．前記宿主細胞が、ＧＳＨ１遺伝子又はホモログ、又は、Ｇｓｈ１タンパク質又はホモログを欠いている、前記態様の何れかの真菌宿主細胞。
４８．前記Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログが、配列番号２の４７、４８、４９、５０、５１、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、４０９、４５１、４５２、４５３、４５４及び４５５から選択される位置に対応する位置に変異を含む、前記態様の何れかの真菌宿主細胞。
４９．前記位置が、配列番号２のＲ１２５に対応する、態様４８の真菌宿主細胞。
５０．前記位置が、配列番号２のＨ４０９に対応する、態様４８又は４９の真菌宿主細胞。
５１．前記位置が、配列番号２のＰ４５３に対応する、態様４８～５０の何れかの真菌宿主細胞。
５２．前記変異が置換、好ましくは非保存的アミノ酸への置換である、態様４８～５１の何れかの真菌宿主細胞。
５３．配列番号２の位置１２５に対応する位置の変異が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹへの置換、好ましくはＣ、Ｄ、Ｅ又はＧへの置換、より好ましくはＧへの置換である、態様５２の真菌宿主細胞。
５４．配列番号２の位置１２５に対応する位置の変異が、正荷電アミノ酸から脂肪族、芳香族、疎水性、小型、極小、極性、又は負荷電アミノ酸への置換、好ましくは負荷電アミノ酸から極小アミノ酸への置換である、態様４８～５３の何れかの真菌宿主細胞。
５５．配列番号２の位置Ｄ４９に対応する位置における変異が、Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹへの置換、好ましくはＨ、Ｋ又はＲへの置換、より好ましくはＫ又はＲへの置換である、態様４８～５４の何れかの真菌宿主細胞。
５６．配列番号２の位置４９に対応する位置の変異が、負荷電アミノ酸から正荷電アミノ酸への置換である、態様４８～５５の何れかの真菌宿主細胞。
５７．配列番号２の位置Ｈ４０９に対応する位置の変異が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹへの置換、好ましくはＡ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙへの置換、より好ましくはＡ、Ｉ、Ｌ、Ｖへの置換、最も好ましくはＬへの置換である、態様４８～５６の何れかの真菌宿主細胞。
５８．配列番号２の位置Ｈ４０９に対応する位置の変異が、芳香族アミノ酸から脂肪族アミノ酸への置換である、態様４８～５７の何れかの真菌宿主細胞。
５９．配列番号２の位置Ｐ４５３に対応する位置の変異が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹへの置換、好ましくはＡ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙへの置換、より好ましくはＡ、Ｉ、Ｌ、Ｖへの置換、最も好ましくはＬへの置換である、態様４８～５８の何れかの真菌宿主細胞。
６０．配列番号２の位置Ｐ４５３に対応する位置の変異が、芳香族アミノ酸から脂肪族アミノ酸への置換である、態様４８～５９の何れかの真菌宿主細胞。
６１．前記Ｇｓｈ１タンパク質が配列番号４を含むか、配列番号４からなる、前記態様の何れかの真菌宿主細胞。
６２．改変されたＧＳＨ１遺伝子、例えば配列番号４をコードするポリヌクレオチドを含む、前記態様の何れかの真菌宿主細胞。
６３．前記改変されたＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベル又は発現レベルが、親真菌宿主細胞、例えば野生型真菌宿主細胞の前記Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベル又は発現レベルに対して改変されたレベルである、態様５～６２の何れかの真菌宿主細胞。
６４．Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベル及び／又は発現レベルが、前記親真菌宿主細胞のＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベル及び／又は発現レベルの９０％以下まで低減されている、態様６３の真菌宿主細胞。
６５．Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベル及び／又は発現レベルが、前記親真菌宿主細胞のＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベル及び／又は発現レベルの８０％以下まで低減されている、態様６４の真菌宿主細胞。
６６．Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベル及び／又は発現レベルが、前記親真菌宿主細胞のＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベル及び／又は発現レベルの７０％以下まで低減されている、態様６５の真菌宿主細胞。
６７．Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベル及び／又は発現レベルが、前記親真菌宿主細胞のＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベル及び／又は発現レベルの６０％以下まで低減されている、態様６６の真菌宿主細胞。
６８．Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベル及び／又は発現レベルが、前記親真菌宿主細胞のＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベル及び／又は発現レベルの５０％以下まで低減されている、態様６７の真菌宿主細胞。
６９．Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベル及び／又は発現レベルが、前記親真菌宿主細胞のＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベル及び／又は発現レベルの４０％以下まで低減されている、態様６８の真菌宿主細胞。
７０．Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベル及び／又は発現レベルが、前記親真菌宿主細胞のＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベル及び／又は発現レベルの３０％以下まで低減されている、態様６９の真菌宿主細胞。
７１．Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベル及び／又は発現レベルが、前記親真菌宿主細胞のＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベル及び／又は発現レベルの２０％以下まで低減されている、態様７０の真菌宿主細胞。
７２．Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベル及び／又は発現レベルが、前記親真菌宿主細胞のＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベル及び／又は発現レベルの実質的に０％まで低減されている、態様７１の真菌宿主細胞。
７３．前記宿主細胞が、機能的なＮＯＴ４遺伝子又はホモログ、又は、機能的なＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログを欠いている、態様５～７２の何れかの真菌宿主細胞。
７４．前記宿主細胞が、ＮＯＴ４遺伝子又はホモログ、又は、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログを欠いている、態様５～７３の何れかの真菌宿主細胞。
７５．前記ＮＯＴ４遺伝子又はホモログ、又は、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログが、前記Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの、Ｎｏｔ１タンパク質又はそのホモログとの相互作用を改変するように突然変異している、態様５～７４の何れかの真菌宿主細胞。
７６．前記Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログが、配列番号６の４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９又は４７０から選択される位置に対応する位置に変異を含む態様５～７５の何れかの真菌宿主細胞。
７７．前記位置が、配列番号６の４２９、４３０、４３４、又は４３７に対応する位置から選択される、態様７６の真菌宿主細胞。
７８．前記位置が、配列番号６の４６３、４６４又は４６６に対応する位置から選択される、態様７６又は７７の真菌宿主細胞。
７９．前記位置が、配列番号６の４４２、４４５、４４７又は４５２に対応する位置から選択される、態様７６～７８の何れかの真菌宿主細胞。
８０．前記変異が置換、好ましくは非保存的アミノ酸への置換である、態様７６～７９の何れかの真菌宿主細胞。
８１．配列番号６の位置４２９に対応する位置の変異が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹに対する置換、好ましくはＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ又はＩに対する置換、より好ましくはＩ、Ｌ又はＶに対する置換、最も好ましくはＩに対する置換である、態様７６～８０の何れかの真菌宿主細胞。
８２．配列番号６の位置４２９に対応する位置の変異が、芳香族アミノ酸から脂肪族アミノ酸への置換である、態様７６～８１の何れかの真菌宿主細胞。
８３．前記Ｎｏｔ４タンパク質が配列番号８を含むか、配列番号８からなる、態様７６～８２の何れかの真菌宿主細胞。
８４．改変されたＮＯＴ４遺伝子、例えば配列番号８をコードするポリヌクレオチドを含む、前記態様の何れかの真菌宿主細胞。
８５．前記宿主細胞が、ＮＯＴ４遺伝子又はホモログ、又は、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログを欠いている、前記態様の何れかの真菌宿主細胞。
８６．ＡＨＡ１、ＣＣＴ２、ＣＣＴ３、ＣＣＴ４、ＣＣＴ５、ＣＣＴ６、ＣＣＴ７、ＣＣＴ８、ＣＮＳ１、ＣＰＲ３、ＣＰＲ６、ＥＲＯ１、ＥＵＧ１、ＦＭＯ１、ＨＣＨ１、ＨＳＰ１０、ＨＳＰ１２、ＨＳＰ１０４、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ３０、ＨＳＰ４２、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７８、ＨＳＰ８２、ＪＥＭ１、ＭＤＪ１、ＭＤＪ２、ＭＰＤ１、ＭＰＤ２、ＰＤＩ１、ＰＦＤ１、ＡＢＣ１、ＡＰＪ１、ＡＴＰ１１、ＡＴＰ１２、ＢＴＴ１、ＣＤＣ３７、ＣＰＲ７、ＨＳＣ８２、ＫＡＲ２、ＬＨＳ１、ＭＧＥ１、ＭＲＳ１１、ＮＯＢ１、ＥＣＭ１０、ＳＳＡ１、ＳＳＡ２、ＳＳＡ３、ＳＳＡ４、ＳＳＣ１、ＳＳＥ２、ＳＩＬ１、ＳＬＳ１、ＯＲＭ１、ＯＲＭ２、ＰＥＲ１、ＰＴＣ２、ＰＳＥ１、ＵＢＩ４、及びＨＡＣ１、又は切断型イントロン欠失ＨＡＣ１、ＴＩＭ９、ＰＡＭ１８、ＴＣＰ１、又はそれらの変異体のうち１又は２以上のシャペロンが過剰発現している、前記態様の何れかの真菌宿主細胞。
８７．ＫＥＸ２又はその変異体若しくは断片が、発現又は過剰発現している、前記態様の何れかの真菌宿主細胞。
８８．ＰＤＩ１又はその変異体が過剰発現しているか、或いはＥＲＯ１又はその変異体が過剰発現している、態様８６又は８７の真菌宿主細胞。
８９．ＰＤＩ１又はその変異体が過剰発現していると共に、ＥＲＯ１又はその変異体が過剰発現している、態様８６又は８７の真菌宿主細胞。
９０．ＰＤＩ１又はその変異体が過剰発現していると共に、ＫＥＸ２又はその変異体が発現又は過剰発現している態様８６又は８７の真菌宿主細胞。
９１．ＥＲＯ１又はその変異体が過剰発現していると共に、ＫＥＸ２又はその変異体が発現又は過剰発現している、態様８６又は８７の真菌宿主細胞。
９２．ＰＤＩ１又はその変異体が過剰発現していると共に、ＥＲＯ１又はその変異体が過剰発現していると共に、ＫＥＸ２又はその変異体が発現又は過剰発現している、態様８６～９１の何れかの真菌宿主細胞。
９３．前記真菌宿主が、酵母又は糸状菌（filamentous fungus）である、前記態様の何れかの真菌宿主細胞。
９４．前記宿主細胞が、サッカロミセス属（Saccharomyces）、カンジダ属（Candida）、ハンセヌラ属（Hansenula）、クルイベロミセス属（Kluyveromyces）、ピチア属（Pichia）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）、又はヤロウィア属（Yarrowia）である、前記態様の何れかの真菌宿主細胞。
９５．前記サッカロミセス属（Saccharomyces）が、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・ディアスタティクス（Saccharomyces diastaticus）、サッカロミセス・ダグラシイ（Saccharomyces douglasii）、サッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロミセス・ノルベンシス（Saccharomyces norbensis）、又はサッカロミセス・オビフォルミス（Saccharomyces oviformis）、好ましくはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である、態様９４の真菌宿主細胞。
９６．所望のタンパク質、例えば異種タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む、真菌宿主細胞の培養物であって、前記真菌宿主細胞のＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベル及び／又は発現レベルが低減されてなることを特徴とする、真菌宿主細胞の培養物。
９７．Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベル及び／又は発現レベルが低減されてなる、態様９６の真菌宿主細胞の培養物。
９８．前記宿主細胞が、態様１～９５の何れかに定義される宿主細胞である、態様９６又は９７の真菌宿主細胞の培養物。
９９．真菌宿主細胞から所望のタンパク質、例えば異種タンパク質を産生するための方法であって、
ａ．態様１～９４の何れかの真菌宿主細胞、又は、態様９６～９８の何れかの培養物を提供し、
ｂ．前記の真菌宿主細胞又は培養物を培養して、前記所望のタンパク質を産生させ、
ｃ．任意により前記所望のタンパク質を回収し、
ｄ．任意により前記所望のタンパク質を精製する、
ｅ．任意により前記所望のタンパク質を、治療的に許容しうる担体又は希釈剤と共に製剤化することにより、ヒト又は動物への投与に適した治療薬を製造し、
ｆ．任意により前記所望のタンパク質を単位投与形態で提供する
ことを含む方法。
１００．所望のタンパク質（例えば異種タンパク質）の収率を増加させるための方法であって、
ａ．改変された、
１．Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログ、及び／又は
２．Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログの（好ましくは低減された）活性レベル、及び／又は
３．ＧＳＨ１遺伝子又はそのホモログ、及び／又は
４．ＧＳＨ１遺伝子又はそのホモログの（好ましくは低減された）発現レベル
を有する真菌宿主細胞（例えば酵母又は糸状菌（filamentous fungus））、例えば態様１～９４の何れかの真菌宿主細胞を提供し、
ｂ．前記宿主細胞を培養して前記所望のタンパク質を産生させ、
ｃ．任意により前記所望のタンパク質を回収し、
ｄ．任意により前記所望のタンパク質を精製し、
ｅ．任意により前記所望のタンパク質を、治療的に許容しうる担体又は希釈剤と共に製剤化することにより、ヒト又は動物への投与に適した治療薬を製造し、
ｆ．任意により前記所望のタンパク質を単位投与形態で提供する
ことを含む方法。
１０１．前記培養がグルタチオンの存在下で行われる、態様９９又は１００の方法。
１０２．前記グルタチオンが、少なくとも０．０５ｍＭの濃度で存在する、態様１０１の方法。
１０３．前記グルタチオンが、約０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０ｍＭ～約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００ｍＭの濃度で存在する、態様１０２の方法。
１０４．前記グルタチオンが、約１～約１０ｍＭの濃度で存在する、態様１０３の方法。
１０５．前記グルタチオンが、約３～約７ｍＭの濃度で存在する、態様１０４の方法。
１０６．前記グルタチオンが、約５ｍＭの濃度で存在する、態様１０５の方法。
１０７．前記所望のタンパク質の収率が、参照真菌宿主細胞、例えば野生型Ｇｓｈ１タンパク質、例えば配列番号２を有する真菌宿主細胞における収率より少なくとも２％高い、態様９９～１０６の何れかの方法。
１０８．前記収率が、参照真菌宿主細胞における収率より少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２．５、１５、１７．５、２０、２２．５、２５、２７．５、３０、３５、４０、４５、又は少なくとも５０％高い、態様１０７の方法。
１０９．前記所望のタンパク質の収率が、参照真菌宿主細胞、例えば配列番号２のＧｓｈ１タンパク質を有する真菌宿主細胞における収率より少なくとも２％高い、態様１０７又は１０８の方法。
１１０．前記収率が、参照真菌宿主細胞における収率より少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２．５、１５、１７．５、２０、２２．５、２５、２７．５、３０、３５、４０、４５、又は少なくとも５０％高い、態様１０９の方法。
１１１．前記真菌宿主細胞が、改変された、
１．Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログ、及び／又は
２．Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの（好ましくは低減された）活性レベル、及び／又は
３．ＮＯＴ４遺伝子又はそのホモログ、及び／又は
４．ＮＯＴ４遺伝子又はそのホモログの（好ましくは低減された）発現レベル
を有する、例えば態様５～９５の何れかの真菌宿主細胞である、態様９９～１１０の何れかの方法。
１１２．前記所望のタンパク質の収率が、参照真菌宿主細胞、例えば野生型Ｎｏｔ４タンパク質、例えば配列番号６を有する真菌宿主細胞における収率より少なくとも２％高い、態様１１１の方法。
１１３．前記収率が、参照真菌宿主細胞における収率、例えば野生型Ｎｏｔ４タンパク質、例えば配列番号６を有する真菌宿主細胞より少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２．５、１５、１７．５、２０、２２．５、２５、２７．５、３０、３５、４０、４５、又は少なくとも５０％高い、態様１１２の方法。
１１４．前記所望のタンパク質の収率が、参照真菌宿主細胞、例えば配列番号２のＧｓｈ１タンパク質を有する真菌宿主細胞における収率より少なくとも２％高い、態様１１１～１１３の何れかの方法。
１１５．前記収率が、参照真菌宿主細胞、例えば配列番号２のＧｓｈ１タンパク質を有する真菌宿主細胞における収率より少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２．５、１５、１７．５、２０、２２．５、２５、２７．５、３０、３５、４０、４５、又は少なくとも５０％高い、態様１１４の方法。
１１６．前記所望のタンパク質の収率が、参照真菌宿主細胞、例えば配列番号２のＧｓｈ１タンパク質及び配列番号６のＮｏｔ４タンパク質を有する真菌宿主細胞における収率より少なくとも２％高い、態様１１１～１１５の何れかの方法。
１１７．前記所望のタンパク質の収率が、参照真菌宿主細胞、例えば配列番号２のＧｓｈ１タンパク質及び配列番号６のＮｏｔ４タンパク質を有する真菌宿主細胞における収率より少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２．５、１５、１７．５、２０、２２．５、２５、２７．５、３０、３５、４０、４５、又は少なくとも５０％高い、態様１１６の方法。
１１８．前記所望のタンパク質が、アルブミン、モノクローナル抗体、エトポシド、血清タンパク質（例えば血液凝固因子）、アンチスタシン、ダニ抗凝血ペプチド、トランスフェリン、ラクトフェリン、エンドスタチン、アンジオスタチン、コラーゲン、免疫グロブリン若しくは免疫グロブリン系分子、又はその何れかの断片（例えば小型モジュラー免疫医薬（Small Modular ImmunoPharmaceuticals）（登録商標）（“ＳＭＩＰ”）又はｄＡｂ、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＡｂ、ｓｃＦｖ又はｓｃＦｖ断片）、クニッツ（Kunitz）ドメインタンパク質（例えば国際公開第０３／０６６８２４号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のタンパク質及びそのアルブミン融合体）、インターフェロン、インターロイキン、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－２、インターフェロンα（alpha）種及び亜種、インターフェロンβ（beta）種及び亜種、インターフェロンγ（gamma）種及び亜種、レプチン、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＦＡｘ１５、ＩＬ－１受容体アンタゴニスト、エリスロポエチン（ＥＰＯ）及びＥＰＯ模倣薬、トロンボポエチン（ＴＰＯ）及びＴＰＯ模倣薬、プロサプチド（prosaptide）、シアノビリン－Ｎ、５－ヘリックス、Ｔ２０ペプチド、Ｔ１２４９ペプチド、ＨＩＶｇｐ４１、ＨＩＶｇｐ１２０、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ｔＰＡ、ヒルジン、血小板由来成長因子、副甲状腺ホルモン、プロインシュリン、インシュリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、例えばエキセンディン（exendin）－４、ＧＬＰ－１又はＧＬＰ－２、インシュリン様成長因子、カルシトニン、成長ホルモン、形質転換成長因子β（beta）、腫瘍壊死因子、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＦＧＦ、凝固因子（前活性型又は活性型）、例えば、これらに限定されるものではないが、プラスミノーゲン、フィブリノーゲン、トロンビン、プレトロンビン、プロトロンビン、フォン・ヴィレブランド（von Willebrand）因子、α（alpha）１－アンチトリプシン、プラスミノーゲン活性化剤、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X及び因子XIII、神経成長因子、ＬＡＣＩ、血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ－ＥＣＧＦ）、グルコースオキシダーゼ、血清コリンエステラーゼ、アプロチニン、アミロイド前駆体タンパク質、インターアルファトリプシン阻害剤、抗トロンビンIII、アポリポタンパク質種、タンパク質C、タンパク質S、代謝産物、抗生物質、或いは上記何れかの変異体又は断片から選択される、態様９９～１１７の何れかの方法。
１１９．前記所望のタンパク質が、アルブミン又はその変異体、断片、及び／又は融合体を含むか、或いはアルブミン又はその変異体、断片、及び／又は融合体からなる、態様９９～１１８の何れかの方法。
１２０．前記アルブミン又はその変異体、断片、及び／又は融合体が、配列番号１０に対して少なくとも７０％の同一性を有する、態様１１９の方法。
１２１．前記アルブミン又はその変異体、断片、及び／又は融合体が、配列番号１０に対して少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性を有する、態様１２０の方法。
１２２．前記アルブミン又はその変異体、断片、及び／又は融合体が、配列番号１０に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは配列番号１０に対して少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性を有すると共に、配列番号１０のＫ５７３に対応する位置にＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹを含む、態様１２１の方法。
１２３．前記アルブミン又はその変異体、断片、及び／又は融合体が、配列番号１０のＫ５７３に対応する位置にＰ、Ｈ、Ｗ又はＹを含む、態様１２２の方法。
１２４．前記アルブミン又はその変異体、断片、及び／又は融合体が、配列番号１０に対して少なくとも９８％の同一性を有すると共に、配列番号１０のＫ５７３に対応する位置にＰを含む、態様１２３の方法。
１２５．前記融合体が、アルブミン又はその変異体、断片、及び／又は融合体ではない融合パートナーを含む、態様１１９～１２４の何れかの方法。
１２６．前記融合体が、モノクローナル抗体、エトポシド、血清タンパク質（例えば血液凝固因子）、アンチスタシン、ダニ抗凝血ペプチド、トランスフェリン、ラクトフェリン、エンドスタチン、アンジオスタチン、コラーゲン、免疫グロブリン若しくは免疫グロブリン系分子、又はその何れかの断片（例えば小型モジュラー免疫医薬（Small Modular ImmunoPharmaceuticals）（登録商標）（“ＳＭＩＰ”）又はｄＡｂ、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＡｂ、ｓｃＦｖ又はｓｃＦｖ断片）、クニッツ（Kunitz）ドメインタンパク質（例えば国際公開第０３／０６６８２４号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のもの、インターフェロン、インターロイキン、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－２、インターフェロンα（alpha）種及び亜種、インターフェロンβ（beta）種及び亜種、インターフェロンγ（gamma）種及び亜種、レプチン、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＦＡｘ１５、ＩＬ－１受容体アンタゴニスト、エリスロポエチン（ＥＰＯ）及びＥＰＯ模倣薬、トロンボポエチン（ＴＰＯ）及びＴＰＯ模倣薬、プロサプチド（prosaptide）、シアノビリン－Ｎ、５－ヘリックス、Ｔ２０ペプチド、Ｔ１２４９ペプチド、ＨＩＶｇｐ４１、ＨＩＶｇｐ１２０、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ｔＰＡ、ヒルジン、血小板由来成長因子、副甲状腺ホルモン、プロインシュリン、インシュリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、例えばエキセンディン（exendin）－４、ＧＬＰ－１又はＧＬＰ－２、インシュリン様成長因子、カルシトニン、成長ホルモン、形質転換成長因子β（beta）、腫瘍壊死因子、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＦＧＦ、凝固因子（前活性型又は活性型）、例えば、これらに限定されるものではないが、プラスミノーゲン、フィブリノーゲン、トロンビン、プレトロンビン、プロトロンビン、フォン・ヴィレブランド（von Willebrand）因子、α（alpha）１－アンチトリプシン、プラスミノーゲン活性化剤、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X及び因子XIII、神経成長因子、ＬＡＣＩ、血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ－ＥＣＧＦ）、グルコースオキシダーゼ、血清コリンエステラーゼ、アプロチニン、アミロイド前駆体タンパク質、インターアルファトリプシン阻害剤、抗トロンビンIII、アポリポタンパク質種、タンパク質C、タンパク質S、代謝産物、抗生物質、或いは上記何れかの変異体又は断片から選択される融合パートナーを含む、態様１２０～１２５の何れかの方法。
１２７．前記融合パートナーが、グルカゴン様タンパク質又はその類似物を含むか、グルカゴン様タンパク質又はその類似物からなる、態様１２６の方法。
１２８．前記融合パートナーが、配列番号１４、１５、５１、又は５２を含むか、配列番号１４、１５、５１、又は５２からなる態様１２７の方法。
１２９．前記所望のタンパク質が、配列番号１６を含むか、配列番号１６からなる、態様１１８～１２８の何れかの方法。
１３０．前記宿主細胞が、少なくとも１Ｌのスケールで培養される、態様９９～１２９の何れかの方法。
１３１．前記宿主細胞が、少なくとも２Ｌのスケールで培養される、態様１３０の方法。
１３２．前記宿主細胞が、少なくとも５Ｌのスケールで培養される、態様１３１の方法。
１３３．前記宿主細胞が、少なくとも１０Ｌのスケールで培養される、態様１３２の方法。
１３４．前記宿主細胞が、少なくとも１０００Ｌのスケールで培養される、態様１３３の方法。
１３５．前記宿主細胞が、少なくとも５０００Ｌのスケールで培養される、態様１３４の方法。
１３６．前記所望のタンパク質が、前記真菌宿主細胞から分泌される、態様９９～１３５の何れかの方法。
１３７．前記所望のタンパク質が、シグナルペプチドを含む未成熟タンパク質に由来する、態様１３６の方法。
１３８．前記シグナルペプチドが、配列番号１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、４１、又は４２を含むか、配列番号１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、４１、又は４２からなり、或いは、配列番号２０のペンタペプチドモチーフを含むシグナルペプチドである、態様１３７の方法。
１３９．前記シグナルペプチドが、配列番号１９を含むか、配列番号１９からなる、態様１３８の方法。
１４０．前記シグナルペプチドが、配列番号２４を含むか、配列番号２４からなる、態様１３８の方法。
１４１．前記シグナルペプチドが、配列番号４２を含むか、配列番号４２からなる、態様１３８の方法。
１４２．前記所望のタンパク質が、細胞内に存在する、態様９９～１３５の何れかの方法。
１４３．態様９９～１４２の何れかの方法により産生される所望のタンパク質（例えば異種タンパク質）。
１４４．予防、治療、又は診断のための、態様１４３の所望のタンパク質。
１４５．態様１４３又は１４４の所望のタンパク質と、医薬的に許容可能な担体とを含む組成物、例えば医薬組成物。
１４６．態様１４３又は１４４の所望のタンパク質、又は、態様１４５の組成物を、患者に投与することを含む、治療方法。
１４７．態様１～９５の何れかの真菌宿主細胞、又は、態様９６～９８の何れかの培養物を調製する方法であって、（親）真菌宿主細胞を遺伝子的に改変し、Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログの発現レベル及び／又は活性レベルを低減することを含む方法。
１４８．（親）真菌宿主細胞を遺伝子的に改変し、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの発現レベル及び／又は活性レベルを低減することを更に含む、態様１４７の方法。
１４９．真菌宿主細胞におけるＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログの発現レベル及び／又は活性レベルを低減する手段の、前記真菌宿主細胞からの所望のタンパク質（例えば異種タンパク質）の収率を増加させるための使用であって、前記手段が例えば、前記ＧＳＨ１遺伝子を突然変異又は欠失させることにより、突然変異を有するＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログを生じさせ、或いは、Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログを完全に不在とすること、前記遺伝子のオープンリーディングフレームを除去又は変更すること、前記ＧＳＨ１遺伝子の調節配列、例えばプロモーター配列及び／又はターミネーター配列を突然変異又は変更すること、例えば適切な干渉ＲＮＡ、例えばアンチセンスｍＲＮＡを導入して、前記ＧＳＨ１遺伝子の転写を阻害又は低減すること、適切な転写活性化遺伝子を導入、調節、又は改変すること、或いは、Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベルを阻害する剤を導入することによる手段である、使用。
１５０．真菌宿主細胞において、Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログの発現レベル及び／又は活性レベルを低減すると共に、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルを低減する手段の、前記真菌宿主細胞からの所望のタンパク質（例えば異種タンパク質）の収率を増加させるための使用であって、前記手段が例えば、前記ＧＳＨ１遺伝子を突然変異又は欠失させると共に、前記ＮＯＴ４遺伝子を突然変異又は欠失させることにより、突然変異を有するＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログを生じさせ、或いは、Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログを完全に不在とすると共に、突然変異を有するＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログを生じさせ、或いは、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログを完全に不在とすること、前記遺伝子のオープンリーディングフレームを除去又は変更すること、前記ＧＳＨ１及び／又はＮＯＴ４遺伝子の調節配列、例えばプロモーター配列及び／又はターミネーター配列を突然変異又は変更すること、適切な干渉ＲＮＡ、例えばアンチセンスｍＲＮＡを導入し、前記ＧＳＨ１及び／又はＮＯＴ４遺伝子の転写を阻害又は低減すること、或いは、Ｇｓｈ１タンパク質又はホモログ及び／又はＮｏｔ４タンパク質又はホモログの活性レベルを阻害する剤を導入することにより、適切な転写活性化遺伝子を導入、調節、又は改変することによる手段である、使用。
１５１．配列番号２に対して少なくとも５０％の同一性を含むと共に、配列番号２の４７、４８、４９、５０、５１、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、４０９、４５１、４５２、４５３、４５４及び４５５から選択される１又は２以上の位置に対応する位置に変異を含む、Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログ。
１５２．前記位置が、配列番号２のＲ１２５に対応する、態様１５１のＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログ。
１５３．前記位置が、配列番号２のＨ４０９に対応する、態様１５１又は１５２のＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログ。
１５４．前記位置が、配列番号２のＰ４５３に対応する、態様１５１～１５３の何れかのＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログ。
１５５．前記変異が置換、好ましくは非保存的アミノ酸への置換である、態様１５１～１５４の何れかのＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログ。
１５６．配列番号２の位置Ｒ１２５に対応する位置の変異が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹへの置換、好ましくはＣ、Ｄ、Ｅ又はＧへの置換、より好ましくはＧへの置換である、態様１５２～１５５の何れかのＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログ。
１５７．配列番号２の位置Ｒ１２５に対応する位置の変異が、正荷電アミノ酸から脂肪族、芳香族、疎水性、小型、極小、極性、又は負荷電アミノ酸への置換、好ましくは負荷電アミノ酸から極小アミノ酸への置換である、態様１５１～１５６の何れかのＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログ。
１５８．配列番号２の位置Ｄ４９に対応する位置の変異が、Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹへの置換、好ましくはＨ、Ｋ又はＲへの置換、より好ましくはＫ又はＲへの置換である、態様１５１～１５７の何れかのＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログ。
１５９．配列番号２の位置４９に対応する位置の変異が、負荷電アミノ酸から正荷電アミノ酸への置換である、態様１５１～１５８の何れかのＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログ。
１６０．配列番号２の位置Ｈ４０９に対応する位置の変異が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹへの置換、好ましくはＡ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙへの置換、より好ましくはＡ、Ｉ、Ｌ、Ｖへの置換、最も好ましくはＬへの置換である、態様１５１～１５９の何れかのＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログ。
１６１．配列番号２の位置Ｈ４０９に対応する位置の変異が、芳香族アミノ酸から脂肪族アミノ酸への置換である、態様１５１～１６０の何れかのＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログ。
１６２．配列番号２の位置Ｐ４５３に対応する位置の変異が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹへの置換、好ましくはＡ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙへの置換、より好ましくはＡ、Ｉ、Ｌ、Ｖへの置換、最も好ましくはＬへの置換である、態様１５１～１６１の何れかのＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログ。
１６３．配列番号２の位置Ｐ４５３に対応する位置の変異が、芳香族アミノ酸から脂肪族アミノ酸への置換である、態様１５１～１６２の何れかのＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログ。
１６４．配列番号４を含むか、或いは配列番号４からなる、態様１５１～１６３の何れかのＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログ。
以下の非制限的な実施例を参照しながら本発明を説明する。
実施例１：サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＧＳＨ１遺伝子の変異
Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＤＰ９は遺伝子型ｃｉｒ° ＭＡＴａ、ｌｅｕ２－３、ｌｅｕ２－１１２ ｕｂｃ４ ｕｒａ３ ｙａｐ３：：ＵＲＡ３ ｌｙｓ２ ｈｓｐ１５０：ＬＹＳ２を有し、更にＰＤＩ１、ＵＲＡ３及びＹＩｐｌａｃ２１１がＰＤＩ１遺伝子座に組み込まれてなる（Finnis et al, 2010, Microbial Cell Factories 9: 87）。本発明者等は、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＤＰ９（アルブミンをコードするプラスミドで形質転換されたもの）が、その前駆体株、例えばＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＤＢ１と比較して、組換ヒトアルブミンをより高い産生量で産生できるとの知見を得た。Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＤＰ９の特性決定によれば、ＧＳＨ１遺伝子内に一塩基ポリヌクレオチド多型（ＳＮＰ）が存在することが判明した。このＳＮＰがＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＤＰ９のタンパク質産生量向上に寄与しているか否かを決定するために、以下の手順に従って、このＳＮＰ（Ａ３７３Ｇ）を野生型のもの（即ち位置３７３がＡ）に戻した。これに伴い、ミュータントＧｓｈ１タンパク質（Ｇ１２５）も野生型野生型（Ｒ１２５）変更された。野生型ＧＳＨ１遺伝子及びＧｓｈ１タンパク質をそれぞれ配列番号１及び配列番号２に示す。前記ミュータント（即ちＳＮＰを含む）ＧＳＨ１遺伝子及びＧｓｈ１タンパク質をそれぞれ配列番号３及び配列番号４に示す。
Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）のＧＳＨ１遺伝子は染色体Ｘ上に存在する。ミュータントＧＳＨ１遺伝子のＳＮＰ（Ａ３７３Ｇ）を野生型のものに戻すべく、遺伝子断片をＧＳＨ１遺伝子座内に導入し、塩基３７３ＧをＡに変更した。これにより、ミュータントＧｓｈ１タンパク質（位置１２５がＧ）が野生型Ｇｓｈ１タンパク質（位置１２５がＲ）に変更された。
これを達成するために、まずＰＣＲにより、ＧＳＨ１オープンリーディングフレームの上流領域と同一のＤＮＡ配列を５’末端に含むＤＮＡプライマーを用いて、適切な選択マーカー（ＫａｎＭＸ）を増幅した。これらのＰＣＲプライマーは以下のＭＢＰ２６７及びＭＢＰ２６８である。ＫａｎＭＸはジェネティシン（Geneticin：Ｇ４１８）に対する抵抗性を付与する。
プライマー ＭＢＰ２６７：
５’－ＡＴＡＣＴＡＴＴＧＴＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＧＡＡＴＣＴＴＣＣＣＡＴＧＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＣＴＣＴＴＧＡＡＴＧＧＣＧＡＣＡＧＣＣＴＡＴＴＧＣＣＣＣＡＧＴＧＴＴＣＣＣＴＣＡＡＣＡＡＣＣＴＴＧＣＧＴＡＣＧＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧ－３’（配列番号２９）
プライマー ＭＢＰ２６８：
５’－ＡＣＡＧＴＴＧＴＡＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＡＣＴＡＡＴＧＧＣＡＧＣＣＧＴＣＧＴＴＧＧＧＣＡＧＡＡＧＡＧＡＡＴＴＡＧＴＡＴＧＧＴＡＣＡＧＧＡＴＡＣＧＣＴＡＡＴＴＧＣＧＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＡＴＣＧＡＴＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧ－３’（配列番号３０）
ＰＣＲ反応を実施してプラスミドｐＤＢ５４３８からＫａｎＭＸ遺伝子を増幅した（図２）。条件は以下のとおりとした。１００ｎｇのプラスミドｐＤＢ５４３８、０．５μＭの各プライマー、０．２μＭのｄＮＴＰを用い、初回の変性は９８℃で３０秒、次に９８℃で１０秒、６２℃で３０秒のアニーリング、７２℃で２分間の伸長からなるサイクルを３５回行い、その後に７２℃で４分間の最終伸長を行ってから、４℃に冷却した。以上の操作は、Applied Biosystems 2720サーマルサイクラー及びNEB Q5 Hot Start High-Fidelity ＤＮＡポリメラーゼＰＣＲキット（M0493S）を使用し、総反応体積は５０μＬとし、製造メーカーの指示に従って実施した。
得られた生成物である５’－ＧＳＨ１ ５’ＵＴＲ－ＫａｎＭＸ－ＧＳＨ１ ５’ＵＴＲ－３’をゲル電気泳動で分析したところ、そのサイズは予想どおり約１．７ｋｂであった。この増幅ＰＣＲ産物を精製した。この精製物を用いて、ＧＳＨ１が野生型である（即ち配列番号１の）Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）株を形質転換した。形質転換にはSigma Yeast形質転換キットを使用し、以下の点を除いては製造メーカーの指示に従って実施した。即ち、形質転換混合物を遠心分離した後、ペレットを０．５ｍＬのＹＥＰＤ培地に再懸濁し、４．５ｍＬのＹＥＰＤを含む振盪フラスコに移した。なお、ＹＥＰＤ（ｇ／Ｌ）の組成は以下の通り。１０ｇのBacto（登録商標）酵母エキスTechnical、２０ｇのBacto（登録商標）ペプトン、２０ｇのグルコース。
この振盪フラスコを振盪しながら（２００ｒｐｍ）３０℃で１６時間インキュベートした。この培養物を毎分３,０００回転（ｒｐｍ）で５分間遠心分離し、上澄みを静かに除去した。次にこのペレットを１Ｍソルビトールで洗浄してから、０．５ｍＬの１Ｍソルビトールに再懸濁した。約１００μＬを新規調製したＧ４１８寒天プレート（Ｇ４１８最終濃度３００μｇ／ｍＬ）に播種し、寒天表面を下にして３０℃で４日間インキュベートした。なお、Ｇ４１８寒天プレートは以下のように調製した。０．１７ｇの酵母窒素ベース（（ＮＨ４）２ＳＯ４不含有、アミノ酸不含有）、０．１ｇグルタミン酸（一ナトリウム塩、Sigma G-1626）、及び０．０６９ｇのＣＳＭ－Ｌｅｕ粉末を、１００ｍＬのＨ２Ｏ（注射用無菌水、非発熱性、低張性）に溶解し、フィルターで滅菌した。次に、１．５ｇのBacto寒天を加え、この瓶をスチーマーで１時間加熱し、次に水槽で５５℃に冷却した。０．６ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬジェネティシン（Geneticin：Ｇ４１８）及び４ｍＬの無菌５０％デキストロース（ｗ／ｖ）を加えて混合した。混合物のアリコートをペトリ皿に注いで静置した。
Ｇ４１８抵抗性の形質転換体からゲノムＤＮＡを抽出し、これをテンプレートとして、プライマーＭＢＰ２８８及びＭＢＰ２８９を用いて第２のＰＣＲを実施し、ＫａｎＭＸ遺伝子が挿入されたＧＳＨ１ ５’ＵＴＲと、ＧＳＨ１ ＯＲＦの５’部分（塩基４２２まで）とを含む、５’－ＧＳＨ１ ５’ＵＴＲ－ＫａｎＭＸ－ＧＳＨ１ ５’ＵＴＲ－ＧＳＨ１ ＯＲＦ断片（配列番号３１）を増幅した。
プライマーＭＢＰ２８８：５’－ＧＡＴＴＴＴＡＴＣＧＧＴＣＡＡＡＧＧ－３’（配列番号３２）
プライマーＭＢＰ２８９：５’－ＣＴＡＴＣＴＴＧＴＣＴＣＧＣＡＴＡＴＴＣ－３’（配列番号３３）
ＰＣＲの材料、方法、及び条件は、以下の点を除いて上述の通りとした。１μＬのゲノムＤＮＡを用い、アニーリング温度は５５℃とし、伸長時間は各サイクル３分間ずつ、最後は７分間とした。生成物をゲル電気泳動で分析し、予想どおりサイズが約２．９ｋｂであることを確認した。この増幅ＰＣＲ産物を、QIAGEN QIAquick ＰＣＲ精製キットを用い、製造メーカーの指示に従って精製した。得られた精製物を用いて、上述の形質転換法により、ＤＰ９［ｐＤＢ２３０５］（図３）を形質転換した。Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＤＰ９は、ＧＳＨ１ ＳＮＰ（Ａ３７３Ｇ、これによりＲ１２５Ｇとなる）を含む株である。ｐＤＢ２３０５はヒトアルブミンの発現用のプラスミドである（図３）。Ｇ４１８寒天プレートでの増生及び選択を上記手順に従い行った。抵抗性コロニーからゲノムＤＮＡを抽出し、プライマーＭＢＰ２９０及びＭＢＰ２９２を用いたＰＣＲにより、ＯＲＦの１００ｂｐ上流からＯＲＦの塩基４４６までの領域をカバーする５４６ｂｐの断片を増幅した。サイクルの条件を、初回の変性が９８℃で１分間、次に９８℃で１０秒の変性、６１℃で２０秒のアニーリング、７２℃で２．５分間の伸長からなるサイクルを３５回、最後に７２℃で７分間の最終伸長に変更した他は、前記と同一のキット及び条件を用いた。
プライマーＭＢＰ２９０：５’－ＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＴＴＧＴＡＧＡＡＧ－３’（配列番号３４）
プライマーＭＢＰ２９２：５’－ＧＡＧＣＣＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＴＴ－３’（配列番号３５）
得られた生成物を、Qiagen QIAquick 96 ＰＣＲ精製キットを用いて清浄化した。Life Technologies BigDye Terminator v3.1 Cycleシークエンシングキットを用いて、製造メーカーの指示に従って生成物の配列決定を行った。総反応体積は５０μＬとし、清浄化された生成物５０ｎｇをテンプレートとし、１μＭのプライマーＭＢＰ２９１を４μＬ用いた。条件は以下の通りとした。初回変性は９６℃で１分間とし、続いて９６℃で１０秒の変性、５０℃で５秒のアニーリング、６０℃で４分間の伸長からなるサイクルを２５回実施し、その後４℃まで冷却した。シークエンシング反応物を沈殿させ、HiDi（Applied BioSystems）に再懸濁し、Applied BioSystems 3130xl Genetic Analyserにより分析した。
プライマーＭＢＰ２９１：５’－ＧＴＡＧＧＧＴＧＧＴＴＴＡＧＡＧＴＡＴＣ－３’（配列番号３６）
配列決定分析の結果、１つの形質転換体が野生型のＡを位置３７３に有していた（Ｒ１２５）。この株をＰＲＧ１３［ｐＤＢ２３０５］と命名した。また、２つの形質転換体は依然としてＧを位置３７３に有していた（Ｇ１２５）。これらの株をＰＳＧ１０［ｐＤＢ２３０５］及びＰＳＧ１１［ｐＤＢ２３０５］と命名した。これら３つの形質転換体を、０．５ｍＬのＢＭＭＤ（０．１７％（ｗ／ｖ）のアミノ酸及び硫酸アンモニウムを含まない酵母窒素ベース（Difco）、３７．８ｍＭの硫酸アンモニウム、３６ｍＭのクエン酸、１２６ｍＭのオルトリン酸水素二ナトリウム、ｐＨ６．５、２％（ｗ／ｖ）のグルコース、ＮａＯＨでｐＨ６．５に調整）を各ウェルに含む４８ウェルのマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）で培養した。このＭＴＰを湿度室で振盪しながら（２００ｒｐｍ）３０℃で７２時間インキュベートした。次に、各ウェルから５０μＬの細胞培養物を、各ウェルに０．４５ｍＬのＢＭＭＤを含む新たな４８ウェルＭＴＰの３ウェルに移した。この新たなＭＴＰを湿度室で振盪しながら（２００ｒｐｍ）３０℃で９６時間インキュベートした。
遠心分離で上澄みを単離し、組換アルブミンの生産量をＧＰ－ＨＰＬＣ分析により決定した。ＧＰ－ＨＰＬＣ分析は、LC2010 ＨＰＬＣ系（Shimadzu）にＵＶ検出器を装着したものを用い、Shimadzu VP7.3クライアントサーバーソフトウェアの制御下で行った。７．８ｍｍ ｉｄ×３００ｍｍ長さのTSK G3000SWXＬ カラム（Tosoh Bioscience）に、６．０ｍｍ ｉｄ×４０ｍｍ長さのTSK SW ガードカラム（Tosoh Bioscience）を組み合わせたものに、７５μＬを注入した。試料のクロマトグラムの取得は、２５ｍＭ リン酸ナトリウム、１００ｍＭ 硫酸ナトリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、ｐＨ７．０を１ｍＬ・分－１で流通しながら、ランタイム２０分間で行った。試料の定量は、２８０ｎｍのＵＶ検出によりピーク面積を決定し、既知濃度（１０ｍｇ／ｍＬ）の組換ヒトアルブミン標準との比を求め、それらの相対吸光係数に基づき補正を行った。
表２に示すように、このＳＮＰの存在により、平均アルブミン収率は２１％増加していた。
Figure 0007282693000006
この作業を更にＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）株を用いて繰り返した。簡単に述べると、ＧＳＨ１ ＳＮＰを野生型に戻すために、同一の形質転換操作をＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）株ＢＸＰ１０［ｐＤＢ２２４４］（図４）に対して実施した。ｐＤＢ２２４４はヒトアルブミンを発現するプラスミドである。この株を振盪フラスコに移し、約１０ｍＬの増殖培地を入れた５０ｍＬフラスコで、２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃でインキュベートした。ＳＮＰを含む形質転換体、即ちＢＳＧ３［ｐＤＢ２２４４］によるアルブミンの収率を、ＳＮＰが野生型に変換された形質転換体、即ちＢＲＧ５［ｐＤＢ２２４４］によるアルブミンの収率と比較した。ＢＸＰ１０は遺伝子型ＭＡＴａ、ｌｅｕ２－３、ｌｅｕ２－１２２、ｃａｎ１、ｐｒａ１、ｕｂｃ４、ｕｒａ３、ｙａｐ３：：ＵＲＡ３、ｌｙｓ２、ｈｓｐ１５０：：ＬＹＳ２、及びｐｍｔ１：：ＵＲＡ３を有する。
表３に示すように、このＳＮＰの存在により、アルブミン産生量は６８％増加していた（各株につき３回の重複実験）。
Figure 0007282693000007
実施例２：Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＧＳＨ１遺伝子の欠失による組換タンパク質産生の増強
実施例１で使用したのと同じ２つのＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）株において、ＳＮＰを元に戻すために前記のＧＳＨ１遺伝子を欠失させた。この欠失は、前記のＧＳＨ１遺伝子をマーカーＫａｎＭＸで置換することにより行った。従って、結果として得られる株は、どのようなＧｓｈ１タンパク質も産生できない。欠失を実施するために、必要なＤＮＡをプラスミドインサートとして配置し、両側にＡｃｃ６５Ｉ制限部位を配置した。このＤＮＡ断片は、ＫａｎＭＸ ＤＮＡと、５’側に配置された、ＧＳＨ１ ＯＲＦのすぐ上流の３００ｂｐ、３’側に配置された、ＧＳＨ１ ＯＲＦのすぐ下流の３００ｂｐの両不ランキング配列からなる（配列番号４３）。このプラスミドをＡｃｃ６５Ｉで消化し、QIAGENゲル抽出キットを用いてトリス－酢酸塩－ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）アガロースゲルからＫａｎＭＸ断片を精製した。このＤＮＡを用いて、酵母株ＤＰ９［ｐＤＢ２３０５］及びＢＸＰ１０［ｐＤＢ２２４４］を形質転換した。ここでｐＤＢ２３０５及びｐＤＢ２２４４は、ヒト血清アルブミン用の発現カセットを含むプラスミドである。形質転換操作の最後に、酵母細胞をＹＥＰＤ培地に再懸濁し、２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩培養した。翌日にこの培養細胞を、Ｌ－グルタチオンを５ｍＭ添加した（実施例１に記載した）Ｇ４１８プレートに播種した。コロニーを（同様にＧ４１８及びＬ－グルタチオンを含む）新たなプレートにパッチとして播種し、パッチが生育したら、ゲノムＤＮＡを抽出してＰＣＲに供した。このＰＣＲには、前記のＤＮＡ断片が完全に導入されていれば、その接合部に隣接するはずの配列をプライマーとして用いた。ＢＸＰ１０内のＧＳＨ１が欠失された３つの形質転換体（これらの形質転換体はＢＤＧ１、ＢＤＧ２、及びＢＤＧ１０と命名された）と、ＤＰ９内のＧＳＨ１が欠失された１つの形質転換体（この形質転換体はＰＤＧ１４と命名された）が同定された。これらの株を、ＳＮＰが元に戻された、或いは戻されていない前述の株と共に、ＢＭＭＤを入れた４８ウェルのプレートで培養した。欠失株については、５ｍＭのＬ－グルタチオンをウェルに添加し、他の株については、Ｌ－グルタチオンの存在下又は不在かで培養した。上清をＧＰ－ＨＰＬＣでアッセイし、ヒト血清アルブミンの発現レベルを定量した。
Figure 0007282693000008
表４に示すように、ＧＳＨ１が欠失したＢＸＰ１０［ｐＤＢ２２４４］では、野生型ＧＳＨ１を有する株と比較してアルブミン収率が結果した。加えて、これも実施例１で示したように、ＧＳＨ１におけるＳＮＰの存在により、野生型ＧＳＨ１を含む株と比較してアルブミン収率が結果した。
Figure 0007282693000009
表５に示すように、ＧＳＨ１が欠失したＤＰ９［ｐＤＢ２３０５］では、野生型ＧＳＨ１を有する株と比較しても、ＳＮＰを含むＧＳＨ１を有する株と比較しても、アルブミン収率が増加した。
実施例３：ＧＳＨ１遺伝子の変異により１０Ｌスケールでのアルブミン発酵収率が増加
実施例１のＢＸＰ１０由来株を、発酵槽を用いて１０リットルのスケールで培養し、比細胞生産（ＹＰＸＴ）収量の比を求めた（表６）。発酵は実施例５と同様に実施した。
Figure 0007282693000010
ＳＮＰ Ａ３７３Ｇ（その結果Ｒ１２５Ｇ）を含むＧＳＨ１を有する株では、平均増加率は４．６％であった。これは統計的に有意であった。P値＝０．０６９
実施例４：Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）からの組換タンパク質の収率がＧＳＨ１の変異により増加する作用は、ＮＯＴ４の変異の存在によってさらに増強される
以前（ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６８２３９、これは参照により本明細書に組み込まれる）、宿主株による異種タンパク質の収率が、ＮＯＴ４（別名ＭＯＴ２）の変異によって増加することを報告した。
ＮＯＴ４の変異とＧＳＨ１の変異との組み合わせによる収率への影響を決定するために、（これらの遺伝子の一方又は両方の野生型を有するプラスミド、或いはいずれも有しないプラスミドによって形質転換することにより）宿主細胞内でこれらの変異の一方又は両方を補完し、又は何れも補完せず、結果として以下に相当する表現型を有する株を調製した。
（Ａ）ＳＮＰ含有ＧＳＨ１及びＳＮＰ含有ＮＯＴ４、
（Ｂ）ＳＮＰ含有ＧＳＨ１及び野生型ＮＯＴ４、
（Ｃ）野生型ＧＳＨ１及びＳＮＰ含有ＮＯＴ４、並びに
（Ｄ）野生型ＧＳＨ１及び野生型ＮＯＴ４。
得られた株の培養上清をＧＰ－ＨＰＬＣ分析することにより、異種タンパク質の収量を測定した。
野生型ＮＯＴ４及び／又はＧＳＨ１を含むプラスミドの産生のために、酵母株ＤＢ１由来のゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲを実施した。この株は野生型ＮＯＴ４及び野生型ＧＳＨ１を有する。プライマー対（表７）を用いて、野生型ＯＲＦとＮＯＴ４及びＧＳＨ１の上流及び下流配列とを含むＤＮＡを生成した。これらのプライマーは、プラスミドＹＣＰ５０へのクローニングを可能とするための制限酵素部位を含むように設計した（図５及びRose et al., 1987, Gene, 60, 237-243）。ＰＣＲは表８に従って実施した。
Figure 0007282693000011
Figure 0007282693000012
ＰＣＲ条件は以下の通りとした。０．１μｇのゲノムＤＮＡ、０．５μＭの各プライマー、０．２μＭのｄＮＴＰを用い、初回の変性は９８℃で３０秒、次に９８℃で１０秒の変性、上記温度で３０秒のアニーリング、及び７２℃で２分間の伸長からなるサイクルを３５回、最後の伸長は７２℃で４分間、その後４℃に冷却した。以上の操作は、Applied Biosystems 2720サーマルサイクラー及びNEB Q5 Hot Start High-Fidelity ＤＮＡポリメラーゼＰＣＲキット（M0493S）を使用し、総反応体積は５０μＬとし、製造メーカーの指示に従って実施した。得られた産物をゲル電気泳動で分析したところ、そのサイズは予想通り、ＮＯＴ４が約２．５ｋｂ、ＧＳＨ１が約３．３ｋｂであった。この増幅ＰＣＲ産物を、QIAGEN QIAquick ＰＣＲ精製キットを用い、製造メーカーの指示に従って精製した。
精製したＰＣＲ産物及びＹＣＰ５０プラスミドを制限酵素で消化した。制限酵素及び緩衝剤は何れもNew England Biolabs（NEB）のものを用い、製造メーカーの指示に従って使用した。消化としては、ＮＯＴ４ ＰＣＲ産物についてはＥｃｏＲＩ ＋ ＨｉｎｄIII、ＹＣＰ５０についてはＥｃｏＲＩ ＋ ＨｉｎｄIII、ＧＳＨ１ ＰＣＲ産物についてはＳｐｈＩ ＋ ＳａｌＩ、ＹＣＰ５０についてはＳｐｈＩ ＋ ＳａｌＩを実施した。緩衝剤としてはCutSmart緩衝剤を使用し、制限酵素は何れもNEB High Fidelity（“ＨＦ”）酵素（即ちＥｃｏＲＩ－ＨＦ等）であった。消化物を約１．３７℃で５時間インキュベートした。ＰＣＲ産物の消化物はQIAGEN QIAquick ＰＣＲ精製キットで精製し、ＴＡＥアガロースゲルからのＹＣＰ５０ ＤＮＡの精製は、QIAGEN QIAquick ゲル抽出キットを用いて、製造メーカーの指示に従って行った。
消化及び精製された各ＰＣＲ産物を、同じ酵素で切断したＹＣＰ５０ ＤＮＡにライゲートした。ライゲーションは、NEB Quickライゲーションキット（M2200S）を用い、製造メーカーの指示に従って行った。ＰＣＲ産物：ＹＣＰ５０のモル比は３：１とした。各ライゲーション反応液１μＬを用いて、製造メーカーの指示に従って、NEB 5-alpha コンピテント（高効率）大腸菌細胞（M2987I）を形質転換し、細胞をＬＢアンピシリンプレートに播種した。得られたコロニーから一晩培養物を調製し、QIAGEN QIAprep spin miniprepsを実施した。制限酵素消化により、クローニングが首尾よく行われたと思われるプラスミドを同定した。
次に、ＹＣＰ５０－ＮＯＴ４プラスミドをＳｐｈＩ ＋ ＳａｌＩで消化し、ＴＡＥ アガロースゲルから、QIAGEN QIAquickゲル抽出キットを用いて、製造メーカーの指示に従ってＤＮＡを精製した。このＤＮＡを、ＳｐｈＩ ＋ ＳａｌＩで消化したＧＳＨ１ ＰＣＲ産物にライゲートし、QIAquick ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。インサート：バックボーンのＤＮＡモル比は３：１とした。NEB 5-alphaコンピテント（高効率）細胞を（上述のように）形質転換し、プラスミドＤＮＡを（上述のように）精製した。制限酵素消化により正しいプラスミドを特定した。
これにより、新たに３つのプラスミド：ＹＣＰ５０－ＮＯＴ４、ＹＣＰ５０－ＧＳＨ１及びＹＣＰ５０－ＮＯＴ４－ＧＳＨ１が得られた。これらのプラスミドと、ＹＣＰ５０単体とを用いて、組換ヒト血清アルブミン発現用のプラスミドｐＤＢ２３０５を含むＤＹＢ７ ura３［ｐＤＢ２３０５］を形質転換した。ＤＹＢ７は、Payne et al, (2008) Applied and Environmental Microbiology 74 (24) 7759-7766に記載されている。形質転換は、Sigma酵母形質転換キットを用い、以下を除いては製造メーカーの指示に従って実施した。即ち、形質転換混合物の遠心分離工程後に、ペレットを２００μＬ １Ｍソルビトールに再懸濁し、その１００μＬをＢＭＭＤ寒天プレートに播種した。このプレートをコロニーが生じるまで３０℃でインキュベートした。
各形質転換物当たり一つのコロニーを、１ウェル当たり０．５ｍＬのＢＭＭＤを含む４８ウェルのマイクロタイタープレートのウェルに播種した。このプレートを２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で２日間インキュベートした後、各ウェルに同体積の４０％トレハロースを混合し、プレートを－８０℃で保存した。後日、プレートを解凍し、各ウェルから５０μＬを、４５０μＬのＢＭＭＤを含む新たなプレートのウェルに移した。このプレートを２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で２日間インキュベートし、他の新たなプレートに移して再培養した（４５０μＬのＢＭＭＤに５０μＬ）。このプレートを４日間培養した。次にこのプレートを２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、各々２００μＬの上清をＨＰＬＣバイアルに移した。実施例に記載の手順により、上清中のヒト血清アルブミン量をＧＰ－ＨＰＬＣで定量した。
新たなプラスミドであるＹＣＰ５０－ＮＯＴ４、ＹＣＰ５０－ＧＳＨ１、及びＹＣＰ５０－ＮＯＴ４－ＧＳＨ１の配列を決定し、各々正しいインサートを含んでいることを確認した。配列決定は上記実施例に記載の通りに行ったが、今回は各反応当たり１５０～３００ｎｇのプラスミドＤＮＡを用いた。
培養上清のＧＰ－ＨＰＬＣ分析により測定した相対アルブミン収率を表９（下記）に示す。
Figure 0007282693000013
収率は、ＳＮＰ含有遺伝子の両方が補完された株（Ｄ）との相対値で示す。ＮＯＴ４のＳＮＰを有する（Ｃ）では、収率は３１％増加し、ＧＳＨ１のＳＮＰを有する（Ｂ）では、収率は７７％増加し、両方のＳＮＰを有する（Ａ）では、収率は８４％増加した。これらの補完実験は、ＧＳＨ１及びＮＯＴ４変異がアルブミン収率に性の影響を与えると共に、これらを組み合わせることで収率が更に増加することを示している。
斯かる収率の増加はより大きなスケールでも見られると予想される。その理由としては、実施例１及び２によればＧＳＨ１の変異又は欠失が小スケールにおけるＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）のアルブミン生産収率に影響を与えたこと、実施例３及び５によれば同様の結果が１０Ｌスケールでも見られたこと、更に先行出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６８２３９によればＮＯＴ４の変異又は欠失が小スケール及び１０Ｌスケールの双方でＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）のアルブミン生産収率に影響を与えたことが挙げられる。
実施例５：Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＧＳＨ１遺伝子の変異が１０Ｌスケールでのアルブミン収率に影響を与えた
Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）株ＤＹＢ７ ura３［ｐＤＢ２３０５／ＹＣＰ５０－ＮＯＴ４］、ＤＹＢ７ ura３［ｐＤＢ２３０５／ＹＣｐ５０－ＧＳＨ１］、及びＤＹＢ７ ura３［ｐＤＢ２３０５／ＹＣＰ５０－ＮＯＴ４－ＧＳＨ１］による組換タンパク質発現の生産量を、１０Ｌ発酵槽での培養により調べた（Wigley et al, (2007) Genetic Engineering News. 27 (2): 40 - 42）。発酵は、以下に説明する点を除き、国際公開第９７／３３９７３号（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例１に記載の手順に従い、ＭＷ１１Ｄ培地を用いて行った。ＭＦＣＳの代わりにWonderware Supervisory Control and Data Acquisitionソフトウェアを用い、発酵槽の使用前に容器をクエン酸で洗浄し、Ｎａ２ＭｏＯ４．５Ｈ２Ｏの代わりにＮａ２ＭｏＯ４．２Ｈ２Ｏを含む微量元素ストック液を用い、アンモニア溶液を用いてｐＨをｐＨ６．２に調節し、容器への初回の無菌空気の導入は０．５ｖｖｍではなく約１．０ｖｖｍ（即ち１．０リットル）とし、発酵時の気流増加を二段階ではなく一段階とし、即ち約１．０ｖｖｍの気流を維持し、比増殖速度を約０．０６ｈ－１、指数定数（Ｋ）を０．０６に維持した。ここで「ｖｖｍ」とは単位流体体積当たり１分当たりの気体体積流量を意味する。
相対収率を（１リットル当たり産物グラム数として）表１０に示す。
Figure 0007282693000014
ＳＮＰを含むＧＳＨ１を有する株では、野生型に相当する表現型のＧＳＨ１を有する株と比較して、アルブミンの収率が増加した。
実施例６：サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）におけるＧＳＨ１遺伝子の変異又は欠失は、アルブミン変異体の発現を増強し、ＧＳＨ１の欠失は、アルブミン融合体タンパク質（アルブミン－ＩＬ－１Ｒａ）及びｓｃＦｖ（ｖＨｖＬ）－ＦＬＡＧの発現を増強した。
本実施例で発現されるタンパク質は、（ａ）ＷＴ ＨＳＡ（配列番号１０）と比較して４つの変異を有するアルブミン変異体（配列番号４５）、（ｂ）遺伝子操作によりヒト血清アルブミンのＣ末端に融合されたＩＬ－１Ｒａ（配列番号４７、「アルブミン－ＩＬ－１Ｒａ」）、及び、（ｃ）Ｃ末端にＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ、配列番号５０）を有するｓｃＦｖ、ＦＩＴＣ８（配列番号４９）である（Evans et al 2010, Protein Expression and Purification 73:113-124：本文献は、参照文献１６及び１７と共に、参照により本明細書に組み込まれる）。
アルブミン－ＩＬ－１Ｒａ発現等の調製のために、プラスミドｐＤＢ３９３６（図７）を制限酵素Ａｃｃ６５Ｉ及びＢａｍＨＩで切断し、プラスミドｐＤＢ５９１２（アルブミン－ＩＬ－１Ｒａ発現カセットを含む）を酵素ＮｓｉＩ及びＰｖｕＩで切断した。ｐＤＢ５９１２のプラスミドマップを図８に示し、アルブミン－ＩＬ－１ＲａをコードするＤＮＡ配列を配列番号４６に示す。制限酵素及び緩衝剤は何れもNew England Biolabsから入手した。両プラスミド消化物を、Qiagen ＰＣＲ精製キットを用い、製造メーカーの指示に従って精製した。
３つの株、即ちＰＤＧ１４［ｐＤＢ２３０５］、ＰＳＧ１１［ｐＤＢ２３０５］、及びＰＲＧ１３［ｐＤＢ２３０５］を、ＹＥＰＤ培地を入れた振盪フラスコで培養し、更に３時間二次培養して、プラスミド（ｐＤＢ２３０５）を除去した。最終培養物の希釈物をＹＥＰＤプレートに播種し、これらのプレートから得られた単一コロニーをＹＥＰＤにパッチとして播種した。ＹＥＰＤのパッチをＢＭＭＤ ＋ ５ｍＭ Ｌ－グルタチオン プレートに移し、３０℃でインキュベートした。ＢＭＭＤ ＋ ５ｍＭ Ｌ－グルタチオンの下では成長しなかったことから、これらの細胞ではプラスミドが除去されていることが確認された。これらの酵母株を各々、Sigma Yeast 形質転換キットを用い、製造メーカーの指示に従って、（前記アルブミン変異体発現用）プラスミドｐＤＢ５８６２（ｐＤＢ５８６２のプラスミドマップを図９に示し、前記アルブミン変異体をコードするＤＮＡ配列を配列番号４４に示す）、（ｓｃＦｖ（ｖＨｖＬ）－ＦＬＡＧ発現用）プラスミドｐＤＢ３０２９（ｐＤＢ３０２９のプラスミドマップを図９に示し、ｓｃＦｖ－ＦＬＡＧをコードするＤＮＡ配列を配列番号４８に示す）、又は精製及び制限消化したｐＤＢ３９３６及びｐＤＢ５９１２（ギャップ修復プラスミドｐＤＢ３９３６：ＧＲ：ｐＤＢ５９１２からのアルブミン－ＩＬ－１ＲＡ発現用）によって形質転換した。これらの細胞をＢＭＭＤプレートに播種し、３０℃で５日間培養した。各株６つの形質転換体を、５ｍＭ Ｌ－グルタチオンを含む０．５ｍＬのＢＭＭＤを各ウェルに有する４８ウェルＭＴＰで培養した。このプレートを湿度室で２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で４８時間培養した。このプレートから各培養物５０μＬを、５ｍＭのＬ－グルタチオンを含む４５０μＬのＢＭＭＤを入れた新たなプレートに移して、二次培養を行った。このプレートを９６時間インキュベートした。
遠心分離によって上清を単離し、組換タンパク質（アルブミン変異体、アルブミン－ＩＬ－１Ｒａ、又はＳｃＦｖ）の生産量を、実施例１に示すようにＧＰ－ＨＰＬＣにより決定した。
表１１に示すように、ＳＮＰ（Ａ３７３Ｇ）の存在又は欠失の結果、アルブミン変異体の収率は増大した。野生型ＧＳＨ１（ＰＲＧ１３）を有する株と比較して、ＧＳＨ１（ＰＳＧ１１）にＳＮＰを含む株では１５％、ＧＳＨ１（ＰＤＧ１４）の欠失を含む株では２３％、収率が増大した。
Figure 0007282693000015
表１２に示すように、欠失が存在する結果、アルブミン－ＩＬ－１Ｒａの収率は増加した。野生型ＧＳＨ１を含む株（ＰＲＧ１３）と比べて、欠失を含む株（ＰＤＧ１４）の収率は１４％増加した。
Figure 0007282693000016
表１３に示すように、欠失が存在する結果、ＳｃＦｖ－ＦＬＡＧの収率は増加した。野生型ＧＳＨ１を有する株（ＰＲＧ１３）と比較して、ＧＳＨ１を欠失する株（ＰＤＧ１４）による収率は３８％増加した。
Figure 0007282693000017

Claims (29)

  1. 真菌宿主細胞であって、
    ａ．配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有するＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログであって、野生型Ｇｓｈ１タンパク質を有する他は同一の参照真菌宿主細胞におけるレベルと比較して、活性レベルの低減又は発現レベルの低減を示すように改変されたＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログ、
    ｂ．配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有するＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベルであって、野生型Ｇｓｈ１タンパク質を有する他は同一の参照真菌宿主細胞におけるレベルと比較して、低減された活性レベル、
    ｃ．配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するＧＳＨ１遺伝子又はそのホモログであって、野生型ＧＳＨ１遺伝子又はＧｓｈ１タンパク質を発現する他は同一の参照真菌宿主細胞におけるレベルと比較して、Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベルの低減又は発現レベルの低減を示すように改変されたＧＳＨ１遺伝子又はそのホモログ、
    ｄ．配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するＧＳＨ１遺伝子又はそのホモログの発現レベルであって、野生型Ｇｓｈ１タンパク質を有する他は同一の参照真菌宿主細胞におけるレベルと比較して、低減された活性レベル、及び
    ｅ．Ｇｓｈ１タンパク質又はＧＳＨ１遺伝子の欠失
    から選択される１又は２以上を有すると共に、
    異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで前記異種タンパク質は、植物又は動物タンパク質である、真菌宿主細胞。
  2. 前記真菌宿主細胞が更に、
    ａ．配列番号６に対して少なくとも９０％の同一性を有するＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログであって、野生型Ｎｏｔ４タンパク質を有する他は同一の参照真菌宿主細胞におけるレベルと比較して、活性レベルの低減又は発現レベルの低減を示すように改変されたＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログ、
    ｂ．配列番号６に対して少なくとも９０％の同一性を有するＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルであって、野生型Ｎｏｔ４タンパク質を有する他は同一の参照真菌宿主細胞におけるレベルと比較して、低減された活性レベル、
    ｃ．配列番号５に対して少なくとも９０％の同一性を有するＮＯＴ４遺伝子又はそのホモログであって、野生型ＮＯＴ４遺伝子又はＮｏｔ４タンパク質を発現する他は同一の参照真菌宿主細胞におけるレベルと比較して、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルの低減又は発現レベルの低減を示すように改変されたＮＯＴ４遺伝子又はそのホモログ、
    ｄ．配列番号５に対して少なくとも９０％の同一性を有するＮＯＴ４遺伝子又はそのホモログの発現レベルであって、野生型ＮＯＴ４遺伝子又はＮｏｔ４タンパク質を発現する他は同一の参照真菌宿主細胞におけるレベルと比較して、低減された活性レベル、及び
    ｅ．Ｎｏｔ４タンパク質又はＮＯＴ４遺伝子の欠失
    から選択される１又は２以上を有する、請求項１に記載の真菌宿主細胞。
  3. 前記真菌宿主が、酵母又は糸状菌（filamentous fungus）である、請求項１又は２に記載の真菌宿主細胞。
  4. 前記異種タンパク質が、配列番号１０に対して少なくとも９０％の同一性を有するアルブミン又はその断片若しくは融合体である、請求項１～３の何れか一項に記載の真菌宿主細胞。
  5. 前記Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログが、配列番号２の４７、４８、４９、５０、５１、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、４０９、４５１、４５２、４５３、４５４及び４５５から選択される位置に対応する位置に変異を含む、請求項１～４の何れか一項に記載の真菌宿主細胞。
  6. 前記Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログが、配列番号２のＲ１２５、Ｄ４９、Ｈ４０９、又はＰ４５３から選択される位置に対応する位置に変異を含む、請求項５に記載の真菌宿主細胞。
  7. 配列番号２の位置１２５に対応する位置の変異が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹへの置換である、請求項５に記載の真菌宿主細胞。
  8. 配列番号２の位置１２５に対応する位置の変異が、Ｇ、Ｃ、Ｄ、又はＥへの置換である、請求項７に記載の真菌宿主細胞。
  9. 配列番号２の位置１２５に対応する位置の変異が、Ｇへの置換である、請求項８に記載の真菌宿主細胞。
  10. 前記Ｇｓｈ１タンパク質が配列番号４を含むか、配列番号４からなる、請求項１～９の何れか一項に記載の真菌宿主細胞。
  11. 前記Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログが、配列番号６の４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９又は４７０から選択される位置に対応する位置に変異を含む、請求項２～１０の何れか一項に記載の真菌宿主細胞。
  12. 配列番号６の位置４２９に対応する位置の変異が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹに対する置換である、請求項１１に記載の真菌宿主細胞。
  13. 配列番号６の位置４２９に対応する位置の変異が、Ｉ、Ｇ、Ａ、Ｖ、又はＬに対する置換である、請求項１２に記載の真菌宿主細胞。
  14. 配列番号６の位置４２９に対応する位置の変異が、Ｉ、Ｇ、Ａ、Ｖ、又はＬに対する置換である、請求項１３に記載の真菌宿主細胞。
  15. 前記Ｎｏｔ４タンパク質が配列番号８を含むか、配列番号８からなる、請求項２～１４の何れか一項に記載の真菌宿主細胞。
  16. 前記真菌宿主が、サッカロミセス属（Saccharomyces）真菌である、請求項１～１５の何れか一項に記載の真菌宿主細胞。
  17. 前記サッカロミセス属（Saccharomyces）真菌が、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である、請求項１６に記載の真菌宿主細胞。
  18. 異種タンパク質を産生するための方法であって、前記方法は、
    ａ．真菌宿主細胞であって、
    １．配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有するＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログであって、野生型Ｇｓｈ１タンパク質を有する他は同一の参照真菌宿主細胞におけるレベルと比較して、活性レベルの低減又は発現レベルの低減を示すように改変されたＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログ、
    ２．配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有するＧｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベルであって、野生型Ｇｓｈ１タンパク質を有する他は同一の参照真菌宿主細胞におけるレベルと比較して、低減された活性レベル、
    ３．配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するＧＳＨ１遺伝子又はそのホモログであって、野生型ＧＳＨ１遺伝子又はＧｓｈ１タンパク質を発現する他は同一の参照真菌宿主細胞におけるレベルと比較して、Ｇｓｈ１タンパク質又はそのホモログの活性レベルの低減又は発現レベルの低減を示すように改変されたＧＳＨ１遺伝子又はそのホモログ、
    ４．配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するＧＳＨ１遺伝子又はそのホモログの発現レベルであって、野生型Ｇｓｈ１タンパク質を有する他は同一の参照真菌宿主細胞におけるレベルと比較して、低減された活性レベル、及び
    ５．Ｇｓｈ１タンパク質又はＧＳＨ１遺伝子の欠失
    から選択される１又は２以上を有する真菌宿主細胞を提供する工程、
    ｂ．前記宿主細胞を培養して前記異種タンパク質を産生させる工程
    を含み、
    ここで前記真菌宿主細胞は、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで前記異種タンパク質は、植物又は動物タンパク質であり、
    ここで前記方法は、更に、
    （ｉ）前記異種タンパク質が植物又は動物タンパク質であること、
    （ii）前記培養が少なくとも１リットルの規模で行われること、
    （iii）前記方法が更に、前記異種タンパク質を精製する工程を含むこと、及び
    （iv）前記方法が更に、前記異種タンパク質を、治療的に許容しうる担体又は希釈剤と共に製剤化することにより、ヒト又は動物への投与に適した治療薬を製造する工程を含むこと
    から選択される１又は２以上の特徴を有する、方法。
  19. 前記方法が更に、
    ｃ．前記異種タンパク質を回収する工程、
    ｄ．前記異種タンパク質を精製する工程、
    ｅ．前記異種タンパク質を、治療的に許容しうる担体又は希釈剤と共に製剤化することにより、ヒト又は動物への投与に適した治療薬を製造する工程、及び
    ｆ．前記異種タンパク質を単位投与形態で提供する工程
    から選択される１又は２以上の工程を含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記異種タンパク質の収率を増加させるための、請求項１８又は１９に記載の方法。
  21. 前記異種タンパク質の収率が、参照真菌宿主細胞における収率より少なくとも２％高く、ここで前記参照真菌宿主細胞は、Ｇｓｈ１タンパク質又はＧＳＨ１遺伝子が野生型であることを除いて、真菌宿主細胞と同一である、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記参照真菌宿主細胞が、配列番号２のＧｓｈ１タンパク質を有する、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記真菌宿主細胞が更に、
    １．配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有するＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログであって、野生型Ｎｏｔ４タンパク質を有する他は同一の参照真菌宿主細胞におけるレベルと比較して、活性レベルの低減又は発現レベルの低減を示すように改変されたＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログ、及び
    ２．配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有するＮｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルであって、野生型Ｎｏｔ４タンパク質を有する他は同一の参照真菌宿主細胞におけるレベルと比較して、低減された活性レベル、及び
    ３．配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するＮＯＴ４遺伝子又はそのホモログであって、野生型ＮＯＴ４遺伝子又はＮｏｔ４タンパク質を発現する他は同一の参照真菌宿主細胞におけるレベルと比較して、Ｎｏｔ４タンパク質又はそのホモログの活性レベルの低減又は発現レベルの低減を示すように改変されたＮＯＴ４遺伝子又はそのホモログ、及び
    ４．配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するＮＯＴ４遺伝子又はそのホモログの発現レベルであって、野生型ＮＯＴ４遺伝子又はＮｏｔ４タンパク質を発現する他は同一の参照真菌宿主細胞におけるレベルと比較して、低減された活性レベル、及び
    ５．Ｎｏｔ４タンパク質又はＮＯＴ４遺伝子の欠失
    を有する、請求項１８～２２の何れか一項に記載の方法。
  24. 前記異種タンパク質の収率が、参照真菌宿主細胞における収率より少なくとも２％高く、ここで前記参照真菌宿主細胞は、Ｎｏｔ４タンパク質又はＮＯＴ４遺伝子が野生型であることを除いて、真菌宿主細胞と同一である、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記参照真菌宿主細胞が、配列番号６のＮｏｔ４タンパク質を有する、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記異種タンパク質の収率が、配列番号２のＧｓｈ１タンパク質を有する参照真菌宿主細胞における収率より少なくとも２％高い、請求項１８～２５の何れか一項に記載の方法。
  27. 前記異種タンパク質の収率が、配列番号２のＧｓｈ１タンパク質及び配列番号６のＮｏｔ４タンパク質を有する参照真菌宿主細胞における収率より少なくとも２％高い、請求項１８～２６の何れか一項に記載の方法。
  28. 前記異種タンパク質が、配列番号１０に対して少なくとも９０％の同一性を有するアルブミン又はその断片若しくは融合体を含むか、或いはアルブミン又はその断片若しくは融合体からなる、請求項１８～２７の何れか一項に記載の方法。
  29. 前記宿主細胞が少なくとも５Ｌのスケールで培養される、請求項１８～２８の何れか一項に記載の方法。
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