ES2906997T3 - Cepas de expresión de proteínas mejoradas - Google Patents

Abstract

Un método para producir una proteína heteróloga que comprende: a. proporcionar una célula hospedadora fúngica que tiene: 1. una proteína Gsh1 modificada que tiene un nivel reducido de actividad en relación con la actividad de una proteína Gsh1 de tipo silvestre de una célula hospedadora fúngica de referencia por lo demás idéntica, y/o 2. un nivel reducido de actividad de la proteína Gsh1 en relación con la actividad de una proteína Gsh1 de tipo silvestre de una célula hospedadora fúngica de referencia por lo demás idéntica, y/o 3. un gen GSH1 modificado que tiene un nivel reducido de actividad en relación con la actividad de un gen GSH1 de tipo silvestre de una célula hospedadora fúngica de referencia por lo demás idéntica, y/o 4. un nivel reducido de expresión del gen GSH1 en relación con el nivel de expresión de un gen GSH1 de tipo silvestre de una célula hospedadora fúngica de referencia por lo demás idéntica, y b. cultivar la célula hospedadora para producir la proteína heteróloga, en donde (i) la proteína heteróloga es una proteína vegetal o animal, y/o (ii) el cultivo es a una escala de al menos 1 litro, y/o (iii) el método comprende además purificar la proteína heteróloga, y/o (iv) el método comprende además formular la proteína heteróloga con un vehículo o diluyente terapéuticamente aceptable para producir así un producto terapéutico adecuado para la administración a un ser humano o un animal.

Description

DESCRIPCIÓN

Cepas de expresión de proteínas mejoradas

Campo de la invención

La presente invención se refiere principalmente al desarrollo de cepas fúngicas que expresan proteínas a niveles sustancialmente más elevados que las cepas precursoras.

Antecedentes de la invención

Desde hace unos 30 años, se producen proteínas heterólogas deseadas en microorganismos. Sin embargo, una vez introducida la secuencia codificante necesaria y obtenida la expresión, aún queda mucho por hacer para optimizar el proceso de producción comercial. Un área de interés se refiere a la mejora de cepas, es decir, encontrar o producir cepas de microorganismos hospedadores que permitan producir la proteína con mayores rendimientos o mejor pureza, por ejemplo.

Para aumentar el rendimiento, una vez que se ha ideado un buen sistema de expresión, se podría considerar intentar aumentar el número de copias de la secuencia codificante, o aumentar la cantidad o la estabilidad del ARNm, o mejorar el plegamiento y/o la secreción de la proteína o disminuir la degradación de la proteína. Sin embargo, el efecto deseado de una mayor expresión solo se verá si se dirige a los factores limitantes.

Por lo tanto, lo que se requiere es una cepa hospedadora que permita aumentar el rendimiento de una proteína deseada, tal como una proteína heteróloga.

Los inventores han identificado de manera sorprendente que la mutación de GSH1 en una célula fúngica da como resultado dicho mayor rendimiento de la proteína heteróloga.

El producto del gen GSH1 en Saccharomyces cerevisiae es Y-glutamilcisteína sintetasa (Gshlp). Esta enzima cataliza la primera etapa, y limitante de la velocidad, en la síntesis de glutatión (L-Y-glutamilcisteinilglicina; GSH). La glutatión sintetasa (Gsh2p) cataliza la segunda etapa. El glutatión es una molécula esencial que tiene muchas funciones importantes, incluida la protección de las células contra el estrés oxidativo, como cofactor en varias rutas de biosíntesis y reacciones de desintoxicación, y el mantenimiento del genoma mitocondrial de la levadura (Ayer et al., (2010) Free Radical Biology & Medicine 49 1956-1968)). Las células de levadura con el gen GSH1 eliminado, a menos que se cultiven en medios que contengan glutatión, son hipersensibles a una variedad de condiciones de estrés, tales como condiciones oxidativas y exposición a metales pesados y, de manera eventual, experimentan una detención del crecimiento (Spector et al., (2001) The Journal of Biological Chemistry 276 (10) 7011-7016). También se sabe que el glutatión protege el núcleo en momentos de estrés oxidativo (Hatem et al., (2014) Free Radical Biology & Medicine 67 103-114). Biterova y Barycki (2009) (The Journal of Biological Chemistry 284, 32700-32708) analizaron las estructuras cristalinas de Ghs1 (también conocida como glutamato cisteína ligasa) para investigar el mecanismo de biosíntesis del glutatión y afirman que se han observado variantes de la glutamato cisteína ligasa humana (por ejemplo, R127C, P158L, H370L y P414L).

Previamente (PCT/US2016/068239), se identificó que la mutación de NOT4 (también conocida como MOT2) da como resultado un mayor rendimiento de proteína heteróloga producida en una cepa hospedadora. De manera sorprendente, los inventores ahora han identificado que combinar las mutaciones NOT4 y GSH1 da como resultado un aumento adicional en el rendimiento.

Not4 es una enzima que se une a ubiquitina y forma parte del complejo Ccr4-Not. El complejo Ccr4-Not se conserva en las células eucariotas, y en la levadura el complejo consiste en 9 subunidades centrales: Ccr4, Caf1, Caf40, Caf130, Not1, Not2, Not3, Not4 y Not5 (Collar, 2003, Global control of gene expression in yeast by the Ccr4-Not complex. Gene 313: 1-16; Bai et al., 1999, The CCR4 and Caf1 proteins of the Ccr4-Not complex are physically and functionally separated from Not2, Not4 y Not5. Mol. Cell. Biol. 19: 6642-6651). Se ha propuesto que el complejo funcione como una centralita que puede interpretar señales del entorno y coordinar todos los niveles de expresión génica para responder de manera económica a la señal (Collart, 2012, The Ccr4-Not complex. Gene 492(1): 42-53). Se cree que las proteínas Not (Not1, Not2, Not3 y Not4) son necesarias para el ensamblaje del complejo de ARN polimerasa II, lo que sugiere un papel general en la regulación de la transcripción (Collart, 1994, Not1(cdc39), Not2(cdc36), Not3, and Not4 encode a global-negative regulator of transcription that differentially affects tata-element utilization. Genes & Development 8(5): 525-537; Collart, 2012, como se cita anteriormente). Una estructura de cocristal sugirió cómo la región carboxiterminal de Not4 envuelve una región de repetición HEAT de Not1, la proteína de armazón en el complejo Ccr4-Not (Bhaskar, 2015, Architecture of the ubiquitylation module of the yeast Ccr4-Not complex. Structure 23(5): 921-8).

Gutierrez-Escobedo et al., (2013), Current Genetics: Eukaryotes with emphasis on yeasts, fungi, protists, cell organelles (Springer, Berlín, Alemania) vol. 59(3): 91-106 divulga el papel del glutatión en la respuesta al estrés oxidativo en el patógeno fúngico Candida glabrata.

Maris et al., (2000), Current Genetics, vol. 37(3): 175-182 divulga que el glutatión, pero no el factor de transcripción Yap1, se requiere para la resistencia al estrés oxidativo dependiente de la fuente de carbono en Saccharomyces cerevisiae.

Wheeler et al., (2002), Molecular Microbiology, vol. 46(2): 545-556 divulga que el glutatión regula la expresión de ^y-glutamilcisteína sintetasa a través del factor de transcripción Met4.

El documento CN102296033 (Universidad de Wuhan) divulga una nueva cepa mutante por eliminación de 8-^y-glutamilcisteína sintetasa 1 (gshl) de Saccharomyces cerevisiae depositada bajo el n.° de CCTCC: M 2011130, útil para detectar la toxicidad del cloruro de cadmio y otros metales pesados.

Grant et al., (1997), Molecular Biology of the Cell (American Society for Cell Biology, EE. UU.), vol. 8(9): 1699-1707, divulga que la glutatión sintetasa es prescindible para el crecimiento en condiciones tanto normales como de estrés oxidativo en la levadura Saccharomyces cerevisiae debido a una acumulación del dipéptido Y-glutamilcisteína.

Kistler et al., (1990), Mutagene (IRL Press, Oxford, Reino Unido), vol. 5(1): 39-44, divulga un análisis genético y bioquímico de mutantes deficientes en glutatión de Saccharomyces cerevisiae.

Lee et al., 2001), FEMS Yeast Research, vol. 1(1): 57-65 divulga un papel esencial y auxiliar del glutatión en Saccharomyces cerevisiae analizado con una cepa disruptiva grande gsh1.

Otake et al., (1991), Yeast, 1991, vol. 7(9): 953-961 divulga la clonación molecular del gen de la Y-glutamilcisteína sintetasa de Saccharomyces cerevisiae.

Sumario de la invención

La invención proporciona un método para producir una proteína heteróloga que comprende:

a. proporcionar una célula hospedadora fúngica que tiene:

1. una proteína Gsh1 modificada que tiene un nivel reducido de actividad en relación con la actividad de una proteína Gsh1 de tipo silvestre de una célula hospedadora fúngica de referencia por lo demás idéntica, y/o 2. un nivel reducido de actividad de la proteína Gsh1 en relación con la actividad de una proteína Gsh1 de tipo silvestre de una célula hospedadora fúngica de referencia por lo demás idéntica, y/o

3. un gen GSH1 modificado que tiene un nivel reducido de actividad en relación con la actividad de un gen GSH1 de tipo silvestre de una célula hospedadora fúngica de referencia por lo demás idéntica, y/o

4. un nivel reducido de expresión del gen GSH1 en relación con el nivel de expresión de un gen GSH1 de tipo silvestre de una célula hospedadora fúngica de referencia por lo demás idéntica, y

b. cultivar la célula hospedadora para producir la proteína heteróloga,

en donde

(i) la proteína heteróloga es una proteína vegetal o animal, y/o

(ii) el cultivo es a una escala de al menos 1 litro, y/o

(iii) el método comprende además purificar la proteína heteróloga, y/o

(iv) el método comprende además formular la proteína heteróloga con un vehículo o diluyente terapéuticamente aceptable para producir así un producto terapéutico adecuado para la administración a un ser humano o un animal.

La célula hospedadora fúngica puede tener además:

5. una proteína Not4 modificada, y/o

6. un nivel de actividad de la proteína Not4 modificado, y/o

7. un gen NOT4 modificado, y/o

8. un nivel de expresión del gen NOT4 modificado.

Los inventores también divulgan un cultivo de células hospedadoras fúngicas que contienen una secuencia polinucleotídica que codifica una proteína deseada, tal como una proteína heteróloga, caracterizado por que las células hospedadoras fúngicas tienen un nivel de actividad y/o un nivel de expresión reducidos de la proteína Gsh1 y, opcionalmente, tienen además un nivel de actividad y/o un nivel de expresión reducidos de la proteína Not4. La invención proporciona además un método para producir una proteína deseada, tal como una proteína heteróloga, a partir de una célula hospedadora fúngica.

La invención proporciona un método para modificar el rendimiento de producción de un polipéptido deseado a partir de una célula hospedadora fúngica.

La invención también proporciona una proteína deseada, tal como una proteína heteróloga. La albúmina o variante, fragmento y/o fusión de la misma es una proteína deseada preferida.

La invención proporciona además una composición, tal como una composición farmacéutica, que comprende la proteína deseada.

La invención también proporciona un método para tratar a un paciente que comprende administrar una cantidad eficaz de la composición al paciente.

La invención proporciona además un método para preparar una célula hospedadora fúngica que tiene la propiedad o propiedades mencionadas anteriormente.

La invención también proporciona una proteína Gsh1 que comprende al menos un 50 % de identidad con la SEQ ID NO: 2 y una mutación en una posición correspondiente a una o más posiciones seleccionadas de 47, 48, 49, 50, 51, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 409, 451,452, 453, 454 y 455 de la SEQ ID NO: 2.

La invención proporciona además un polinucleótido que codifica una variante de Gsh1 de la presente invención. Cualquier realización descrita en el presente documento, incluidas aquellas descritas solo en los ejemplos y/o en la sección de realizaciones preferidas, están destinadas a poder combinarse con cualquier otra realización, a menos que se rechace de manera explícita o la combinación sea inadecuada.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un diagrama de Venn que muestra las clases de veinte aminoácidos y las relaciones entre ellos. La figura 2 muestra la construcción del plásmido pDB5438.

La figura 3 muestra la construcción del plásmido pDB2305, "HSA" significa albúmina humana recombinante, "mFL" es una secuencia líder.

La figura 4 muestra la construcción del plásmido pDB2244, "rHA" significa albúmina humana recombinante, "FL" es una secuencia líder.

La figura 5 muestra la construcción del plásmido YCp50.

La figura 6 muestra la construcción del plásmido pDB5862. "Variante de albúmina" es el ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 45. "mFL" es una secuencia líder.

La figura 7 muestra la construcción del plásmido pDB3936.

La figura 8 muestra la construcción del plásmido pDB5912. "mFL" es una secuencia líder.

La figura 9 muestra la construcción del plásmido pDB3029. "Inv" es una secuencia líder.

Definiciones

Albúmina: El término "albúmina" significa una proteína que tiene la misma estructura terciaria y/o muy similar a la seroalbúmina humana (HSA) o dominios HSA y tiene propiedades similares a la HSA o a los dominios en cuestión. Las estructuras terciarias similares son, por ejemplo, las estructuras de las albúminas de las especies mencionadas en "albúmina precursora". Algunas de las principales propiedades de la albúmina son i) su capacidad para regular el volumen en plasma (actividad oncótica), ii) una semivida en plasma prolongada de alrededor de 19 días ± 5 días, iii) unión a gp60, también conocida como albondina, iv) unión a FcRn, v) unión a ligando, por ejemplo, unión de moléculas endógenas tales como compuestos ácidos y lipófilos que incluyen bilirrubina, ácidos grasos, hemina y tiroxina (ver también la tabla 1 de Kragh-Hansen et al., 2002, Biol. Pharm. Bull. 25, 695), vi) unión de compuestos orgánicos pequeños con características ácidas o electronegativas, por ejemplo, fármacos tales como la warfarina, diazepam, ibuprofeno y paclitaxel (véase también la tabla 1 de Kragh-Hansen et al., 2002, Biol. Pharm. Bull. 25, 695). No es necesario cumplir todas estas propiedades para caracterizar una proteína o fragmento como albúmina. Si un fragmento, por ejemplo, no comprende un dominio responsable de la unión de determinados ligandos o compuestos orgánicos, tampoco se espera que la variante de dicho fragmento tenga estas propiedades.

Variante alélica: El término "variante alélica" significa cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge de manera natural a través de la mutación y puede dar lugar al polimorfismo dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.

ADNc: El término "ADNc" significa una molécula de ADN que se puede preparar mediante transcripción inversa a partir de una molécula de ARNm madura y cortada y empalmada obtenida de una célula eucariota o procariota. El ADNc carece de secuencias de intrones que pueden estar presentes en el ADN genómico correspondiente. El transcrito de ARN primario inicial es un precursor del ARNm que se procesa a través de una serie de etapas, que incluyen corte y empalme, antes de aparecer como ARNm maduro y cortado y empalmado.

Secuencia codificante: La expresión "secuencia codificante" significa un polinucleótido, que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de un polipéptido. Los límites de la secuencia codificante están determinados en general por un marco de lectura abierto, que comienza con un codón de inicio, tal como ATG, GTG o TTG y termina con un codón de terminación, tal como TAA, TAG o TGA. La secuencia codificante puede ser un ADN genómico, ADNc, ADN sintético o una combinación de los mismos.

Secuencias de control: La expresión "secuencias de control" significa secuencias de ácido nucleico necesarias para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser natural (es decir, del mismo gen) o extraña (es decir, de un gen diferente) al polinucleótido que codifica el polipéptido o natural o extraña entre sí. Dichas secuencias de control incluyen, pero sin limitación, un líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia propéptido, un promotor, una secuencia de péptido señal y un terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de terminación de la transcripción y la traducción. Las secuencias de control pueden proporcionarse con enlazadores con el fin de introducir sitios de restricción específicos que faciliten la unión de las secuencias de control con la región codificante del polinucleótido que codifica un polipéptido.

Expresión: El término "expresión" incluye cualquier etapa implicada en la producción de un polipéptido, que incluye, pero sin limitación, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional y secreción.

Casete de expresión: La expresión "casete de expresión" significa el polinucleótido que codifica un polipéptido y las secuencias de control cadena arriba y cadena abajo que proporcionan su expresión.

Hospedador de expresión: La expresión "hospedador de expresión" significa cualquier célula hospedadora que expresa una proteína deseada, particularmente una proteína heteróloga.

Vector de expresión: La expresión "vector de expresión" significa una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido y está unido de manera operativa a las secuencias de control que proporcionan su expresión.

Fragmento: El término "fragmento" significa un polipéptido que tiene uno o más (varios) aminoácidos eliminados del extremo aminoterminal y/o carboxiterminal de un polipéptido maduro y/o de una región interna de un polipéptido maduro. Los fragmentos pueden consistir en una secuencia ininterrumpida procedente de un polipéptido o pueden comprender dos o más secuencias procedentes de diferentes partes del polipéptido. Con respecto a la albúmina, un fragmento puede tener un tamaño de más de aproximadamente 20 restos de aminoácidos, preferentemente más de 30 restos de aminoácidos, más preferentemente más de 40 restos de aminoácidos, más preferentemente más de 50 restos de aminoácidos, más preferentemente más de 75 restos de aminoácidos, más preferentemente más de 100 restos de aminoácidos, más preferentemente más de 200 restos de aminoácidos, más preferentemente más de 300 restos de aminoácidos, incluso más preferentemente más de 400 restos de aminoácidos y más preferentemente más de 500 restos de aminoácidos. En una realización preferida, un fragmento corresponde a uno o más de los dominios de albúmina. Los dominios de albúmina preferidos de la invención son dominios que tienen al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 % o el 100 % de identidad con un dominio I de HsA que consiste en los restos de aminoácidos 1 a 194 ± 1 a 15 aminoácidos de la SEQ ID NO: 10; al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 % o el 100 % de identidad con el dominio II de HSA que consiste en los restos de aminoácidos 192 a 387 ± 1 a 15 aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 y al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 % o el 100 % de identidad con el dominio III de HSA que consiste en los restos de aminoácidos 381 a 585 ±1 a 15 aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 o una combinación de uno o más (varios) de estos dominios, por ejemplo, los dominios I y II, los dominios II y III o los dominios I y III fusionados juntos. No existe una convención generalmente aceptada para los límites exactos de los dominios de albúmina y la superposición en los intervalos mencionados anteriormente y la admisión de una longitud variable de más o menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos, preferentemente de 1 a 15 aminoácidos, más preferentemente de 1 a 10 aminoácidos, lo más preferentemente de 1 y 5 aminoácidos, en el extremo aminoterminal y/o carboxiterminal de los dominios, que permite una variación total en la longitud de hasta 30 aminoácidos, preferentemente de hasta 20 aminoácidos, más preferentemente de hasta 10 aminoácidos para cada dominio refleja este hecho y que puede haber algunas opiniones divergentes sobre los restos de aminoácidos en el borde entre los dominios que pertenecen a uno u otro dominio. Por la misma razón, es posible encontrar referencias a los restos de aminoácidos de los dominios de albúmina que difieren de los números anteriores, sin embargo, el experto apreciará cómo identificar los dominios de albúmina en función de la enseñanza en la bibliografía y la enseñanza anterior. Los dominios correspondientes de albúminas no humanas se pueden identificar mediante alineación con HSA utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como se implementó en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferentemente la versión 3.0.0 o posterior, más preferentemente la versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros opcionales utilizados son penalización por apertura de hueco de 10, penalización por extensión de hueco de 0,5, y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62). También se pueden utilizar herramientas de alineación alternativas, por ejemplo, MUSCLE como se describe en el presente documento. Los dominios también se pueden definir de acuerdo con Dockal o Kjeldsen: Dockal et al., (The Journal of Biological Chemistry, 1999, Vol. 274(41): 29303-29310) define los dominios de la HSA como: Dominio I: aminoácidos 1 a 197, Dominio II: aminoácidos 189 a 385 de la s Eq ID NO: 10, Dominio III: aminoácidos 381 a 585 de la SEQ ID NO: 10. Kjeldsen et al., (Protein Expression and Purification, 1998, Vol 13: 163-169) define los dominios como: Dominio I: aminoácidos 1 a 192, Dominio II: aminoácidos 193 a 382, Dominio III: aminoácidos 383 a 585. Cada dominio está compuesto por dos subdominios homólogos, a saber, 1-105, 120-194, 195-291, 316-387, 388-491 y 512-585, con regiones enlazadoras flexibles entre subdominios que comprenden los restos Lys106 a Glu119, Glu292 a Va1315 y Glu492 a Ala511. Por lo tanto, en la presente invención, se prefieren las siguientes definiciones de dominio. Los números de aminoácidos corresponden a los de la SEQ ID NO: 10 (HSA). Sin embargo, utilizando estos números, el experto en la materia puede identificar los dominios correspondientes en otras secuencias de albúmina. El dominio I puede o no comenzar en el aminoácido 1 y puede o no terminar en cualquiera de los aminoácidos 192, 193, 194, 195, 196 o 197, preferentemente en cualquiera de los aminoácidos 192, 194 o 197. El dominio II puede o no comenzar en el aminoácido 189, 190, 191, 192 o 193, preferentemente en cualquiera de los aminoácidos 189, 192 o 193, y puede o no terminar en el aminoácido 382, 383, 384, 385, 386 o 387, preferentemente en cualquiera de los aminoácidos 382, 285 o 387. El dominio III puede o no comenzar en el aminoácido 381, 382 o 383, preferentemente en el aminoácido 381 o 383, y puede o no terminar en el aminoácido 585. Los dominios en albúminas no humanas pueden tener longitudes y/o números de restos de aminoácidos iguales o diferentes que HSA. Por ejemplo, se puede preparar una alineación múltiple o una alineación por pares utilizando HSA y una o más (varias) de otras albúminas, fragmentos, derivados, variantes y/o fusiones para identificar dominios correspondientes a los dominios I, II y/o III de la HSA. Compañero de fusión: A lo largo de la presente memoria descriptiva, un compañero de fusión es una fracción que no es albúmina que puede fusionarse de manera genética con una albúmina o una variante y/o un fragmento de la misma.

Proteína heteróloga: una proteína heteróloga es aquella que no se produce de manera natural por la célula hospedadora y, preferentemente, no incluye proteínas tales como marcadores de selección (por ejemplo, marcadores de resistencia a antibióticos, marcadores seleccionables auxótrofos), chaperonas, FLP, REP1 o REP2. Célula hospedadora: La expresión "célula hospedadora" significa cualquier tipo de célula que sea susceptible de transformación, transfección, transducción o similar con una construcción de ácido nucleico o vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención. La expresión "célula hospedadora" abarca cualquier progenie de una célula precursora que no sea idéntica a la célula precursora debido a mutaciones que se producen durante la replicación.

Polipéptido maduro: La expresión "polipéptido maduro" significa un polipéptido en su forma final después de la traducción y cualquier modificación postraduccional, tal como procesamiento aminoterminal, truncamiento carboxiterminal, glucosilación, fosforilación, etc. La secuencia madura de la albúmina humana se proporciona en la SEQ ID NO: 10, mientras que se proporciona un ejemplo de una forma inmadura en la SEQ ID NO: 12.

Secuencia codificante de polipéptido maduro: La expresión "secuencia codificante de polipéptido maduro" significa un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro. En la SEQ ID NO: 9 se proporciona un ejemplo de una secuencia codificante de polipéptido maduro de la albúmina humana, mientras que en la SEQ ID NO: 11 se proporciona un ejemplo de una secuencia codificante para una forma inmadura de la albúmina humana.

Mutante: El término "mutante" significa un polinucleótido que codifica una variante.

Construcción de ácido nucleico: La expresión "construcción de ácido nucleico" significa una molécula de ácido nucleico, monocatenaria o bicatenaria, que se aísla de un gen de origen natural o se modifica para contener segmentos de ácidos nucleicos de una manera que de otro modo no existiría en la naturaleza o que es sintética, que comprende una o más secuencias de control.

Unido de manera operativa: La expresión "unido de manera operativa" significa una configuración en la que se coloca una secuencia de control en una posición adecuada en relación con la secuencia codificante de un polinucleótido, de tal manera que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia codificante.

Precursor o albúmina precursora: El término "precursor" o "albúmina precursora" significa una albúmina a la que se le hace una alteración para producir las variantes de albúmina de la presente invención. El precursor puede ser un polipéptido de origen natural (tipo silvestre) o un alelo del mismo o una variante del mismo. En una realización preferida, la albúmina precursora es una albúmina de tipo silvestre, más preferentemente una albúmina de tipo silvestre de Homo sapiens como se divulga en la SEQ ID NO: 12 (UNIPROT: P02768.2) o la secuencia madura de la misma (SEQ ID NO: 10). Las albúminas de tipo silvestre alternativas se pueden seleccionar de la lista no detallada que se muestra en la tabla 1.

Tabla 1: Albúminas de tipo silvestre de varias especies.

Preferentemente, la albúmina precursora es una albúmina madura. En otra realización, la albúmina precursora es al menos un 70 %, más preferentemente el 75 %, más preferentemente al menos un 80 %, más preferentemente al menos un 85 %, incluso más preferentemente al menos un 90 %, lo más preferente al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, al menos un 99,5 % o al menos un 99,8 % idéntica a la SEQ ID NO: 10, y mantiene al menos una de las propiedades principales de la albúmina o una estructura terciaria similar a la de la albúmina, tal como la HSA. Las propiedades principales de la albúmina se resumen en Sleep, 2015, "Albumin and its application in drug delivery", Expert Opinion on Drug Delivery 12(5): 793-812.

Identidad de secuencia: La relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe mediante el parámetro "identidad de secuencia".

Para los fines de la presente invención, la identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como se implementó en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferentemente la versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros utilizados son penalización por apertura de hueco de 10, penalización por extensión de hueco de 0,5, y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62). El resultado de Needle marcado como "identidad más larga" (obtenida usando la opción -nobrief) se usa como porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:

(Restos idénticos * 100)/(Longitud de alineación - número total de huecos en la alineación) Para los fines de la presente invención, la identidad de secuencia entre dos secuencias de desoxirribonucleótidos se determina utilizando el algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, citado anteriormente) implementado en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, citado anteriormente), preferentemente la versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros utilizados son penalización por apertura de hueco de 10, penalización por extensión de hueco de 0,5, y la matriz de sustitución EDNAFULL (versión Em BOSS de NCBI NUC4.4). El resultado de Needle marcado como "identidad más larga" (obtenida usando la opción -nobrief) se usa como porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:

(Desoxirribonucleótidos idénticos * 100)/(Longitud de alineación - Número total de huecos en la alineación) Variante: El término "variante" significa un polipéptido procedente de un polipéptido precursor, por ejemplo, albúmina, que comprende una alteración, es decir, una sustitución, una inserción y/o una eliminación, en una o más (varias) posiciones. Una sustitución significa un reemplazo de un aminoácido que ocupa una posición por un aminoácido diferente; una eliminación significa la eliminación de un aminoácido que ocupa una posición; y una inserción significa añadir de 1 a 3 aminoácidos adyacentes a un aminoácido que ocupa una posición. El polipéptido alterado (variante) se puede obtener a través de la intervención humana mediante la modificación de la secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido precursor, por ejemplo, albúmina. La albúmina variante es preferentemente al menos un 70 %, preferentemente al menos un 75 %, más preferentemente al menos un 80 %, más preferentemente al menos un 85 %, incluso más preferentemente al menos un 90 %, lo más preferente al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, al menos un 99,5 % o al menos un 99,8% idéntica a la SEQ ID NO: 10 y puede o no mantener al menos una de las propiedades principales de la albúmina precursora o una estructura terciaria similar tal como la HSA. En general, las variantes o fragmentos de la HSA tendrán al menos un 10 % (preferentemente al menos un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 % o un 95 %) de actividad de unión al ligando de HSA (por ejemplo, unión a bilirrubina) y al menos un 50 % (preferentemente al menos un 70 %, un 80 %, un 90 % o un 95 %) de la actividad oncótica de la HSA, peso por peso. La actividad oncótica, también conocida como presión osmótica coloidal, de la albúmina, las variantes de la albúmina o los fragmentos de la albúmina pueden determinarse mediante el método descrito por Hoefs, J. C. (1992) Hepatology 16:396-403. La unión a bilirrubina se puede medir mediante aumento de fluorescencia a 527 nm en relación con la HSA. Se disuelve bilirrubina (1,0 mg) en 50 pl de NaOH 1 M y se diluye a 1,0 ml con agua desmineralizada. La reserva de bilirrubina se diluye en Tris-HCl 100 mM pH 8,5, EDTA 1 mM para dar 0,6 nmol de bilirrubina/ml en una cubeta de fluorómetro. La fluorescencia se mide mediante excitación a 448 nm y emisión a 527 nm (anchos de ranura de 10 nm) durante la valoración con HSA en un intensidad de proporciones de HSA:bilirrubina de 0 a 5 mol:mol. La variante puede tener una afinidad de unión alterada a FcRn y/o una semivida en plasma alterada en comparación con la albúmina precursora.

Con respecto a una variante de la proteína Gsh1, se aplican los mismos principios, con la excepción de que la actividad es actividad de Gsh1 en lugar de actividad de albúmina. La proteína Gsh1 precursora puede tener al menos un 50, 60, 70, 80 o 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 2, más preferentemente el 100 % de identidad con la SEQ ID NO: 2. La variante de la proteína Gsh1 puede tener al menos un 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 2.

Con respecto a una variante de la proteína Not4, se aplican los mismos principios, con la excepción de que la actividad es actividad de Not4 en lugar de actividad de albúmina. La proteína Not4 precursora puede tener al menos un 50, 60, 70, 80 o 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 6, más preferentemente el 100 % de identidad con la SEQ ID NO: 6. La variante de la proteína Not4 puede tener al menos un 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 6.

La secuencia polipeptídica variante es preferentemente una que no se encuentra en la naturaleza.

Vector: El término "vector" significa una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido y está unido de manera operativa a las secuencias de control que proporcionan su expresión. Los vectores incluyen plásmidos. Los vectores incluyen vectores de expresión.

Tipo silvestre: La expresión albúmina de "tipo silvestre" (TS) significa una albúmina que tiene la misma secuencia de aminoácidos de las albúminas que se encuentran de manera natural en un animal o en un ser humano. La SEQ ID NO: 10 es un ejemplo de una albúmina de tipo silvestre de Homo sapiens. La secuencia de la albúmina humana (HSA) de "tipo silvestre" está dada por el número de referencia de GenBank AAA98797.1 (Minghetti et al. "Molecular structure of the human albumin gene is revealed by nucleotide sequence within q11 -22 of chromosome 4", J. Biol. Chem. 261 (15), 6747-6757 (1986). En la tabla 1 (anterior) se proporcionan ejemplos de albúminas de tipo silvestre. Convenciones para la designación de las posiciones de aminoácidos

Para los fines de la presente invención, el polipéptido divulgado en la SEQ ID NO: 2 se utiliza para determinar el resto de aminoácido correspondiente en un homólogo de la proteína Gsh1. La secuencia de aminoácidos de un homólogo de la proteína Gsh1 se alinea con el polipéptido divulgado en la SEQ ID NO: 2, y en base a la alineación, el número de la posición de un aminoácido correspondiente a cualquier resto de aminoácido en el polipéptido divulgado en la s Eq ID NO: 2 se determina con el algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como se implementó en el programa Needle del paquete Em Bo SS (EMb Os S: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferentemente la versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros utilizados son penalización por apertura de hueco de 10, penalización por extensión de hueco de 0,5, y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62). Los mismos principios se pueden utilizar en relación con Not4, basado en la SEQ ID NO: 6.

La identificación del resto de aminoácido correspondiente en un homólogo de la proteína Gsh1 se puede determinar mediante una alineación de múltiples secuencias polipeptídicas utilizando varios programas informáticos, incluidos, pero sin limitación, MUSCLE (comparación de secuencias múltiples mediante expectativa logarítmica; versión 3.5 o posterior; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFFT (versión 6.857 o posterior; Katoh y Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh y Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh y Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900), y EMBOSS EMMA employing ClustalW (1.83 o posterior; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680), utilizando sus respectivos parámetros predeterminados. Los mismos principios se pueden utilizar en relación con Not4, basado en la SEQ ID NO: 6.

En la descripción de los polipéptidos de la presente invención, la nomenclatura descrita a continuación está adaptada para facilitar la referencia. Se emplea la abreviatura de aminoácidos de una o tres letras aceptada por la IUPAC.

Sustituciones. Para una sustitución de aminoácido, se utiliza la siguiente nomenclatura: Aminoácido originario, posición, aminoácido sustituido. Por consiguiente, la sustitución de treonina en la posición 226 por alanina se denomina "Thr226Ala" o "T226A". Las mutaciones múltiples se separan por marcas de adición ("+"), por ejemplo, "Gly205Arg Ser411Phe" o "G205R S411F", lo que representa sustituciones en las posiciones 205 y 411 de glicina (G) por arginina (R) y serina (S) por fenilalanina (F), respectivamente.

Eliminaciones. Para una eliminación de un aminoácido, se utiliza la siguiente nomenclatura: Aminoácido originario, posición, *. Por consiguiente, la eliminación de glicina en la posición 195 se denomina "Gly195*" o "G195*". Las eliminaciones múltiples están separadas por marcas de adición ("+"), por ejemplo, "Gly195* Ser411*" o "G195* S411*".

Inserciones. Como se ha divulgado anteriormente, una inserción puede ser en el lado amino ("cadena arriba", 'X-1') o en el lado carboxilo ('cadena abajo', 'X+1') del aminoácido que ocupa una posición ('el aminoácido nombrado (u originario)', 'X').

Para la inserción de un aminoácido en el lado carboxilo ("cadena abajo", 'X+1') del aminoácido originario ('X'), se utiliza la siguiente nomenclatura: Aminoácido originario, posición, aminoácido originario, aminoácido insertado. Por consiguiente, la inserción de lisina después de glicina en la posición 195 se denomina "Gly195GlyLys" o "G195GK". Una inserción de múltiples aminoácidos se denomina [aminoácido originario, posición, aminoácido originario, aminoácido insertado n.° 1, aminoácido insertado n.° 2; etc.]. Por ejemplo, la inserción de lisina y alanina después de la glicina en la posición 195 se indica como "Gly195GlyLysAla" o "G195GKA".

En dichos casos, los restos de aminoácidos insertados se numeran mediante la adición de letras minúsculas al número de posición del resto de aminoácido que precede a los restos de aminoácidos insertados. En el ejemplo anterior, la secuencia sería así:

Para una inserción de aminoácido en el lado amino ("cadena arriba", 'X-1') del aminoácido originario (X), se utiliza la siguiente nomenclatura: Aminoácido originario, posición, aminoácido insertado, aminoácido originario. Por consiguiente, la inserción de lisina (K) antes de glicina (G) en la posición 195 se denomina "Gly195LysGly" o "G195KG". Una inserción de múltiples aminoácidos se denomina [aminoácido originario, posición, aminoácido insertado n.°1, aminoácido insertado n.°2; etc., aminoácido originario]. Por ejemplo, la inserción de lisina (K) y alanina (A) antes de la glicina en la posición 195 se indica como "Gly195LysAlaGly" o "G195KAG". En dichos casos, los restos de aminoácidos insertados se numeran mediante la adición de letras minúsculas al número de posición del resto de aminoácido que sigue a los restos de aminoácidos insertados. En el ejemplo anterior, la secuencia sería así:

Múltiples alteraciones. Los polipéptidos que comprenden múltiples alteraciones están separados por marcas de adición ("+"), por ejemplo, "Arg170Tyr Gly195Glu" o "R170Y G195E" que representa una sustitución de arginina y glicina en las posiciones 170 y 195 por tirosina y ácido glutámico, respectivamente.

Diferentes alteraciones. Cuando se pueden introducir diferentes alteraciones en una posición, las diferentes alteraciones están separadas por una coma, por ejemplo, "Arg170Tyr,Glu" representa una sustitución de arginina en la posición 170 por tirosina o ácido glutámico. Por lo tanto, "Tyr167Gly,Ala Arg170Gly,Ala" indica las siguientes variantes:

"Tyr167Gly Arg170Gly", "Tyr167Gly Arg170Ala", "Tyr167Ala Arg170Gly" y "Tyr167Ala Arg170Ala".

Descripción detallada de la invención

Los inventores divulgan una célula hospedadora fúngica que tiene:

a. una proteína Gsh1 modificada que tiene un nivel reducido de actividad en relación con la actividad de una proteína Gsh1 de tipo silvestre de una célula hospedadora fúngica de referencia por lo demás idéntica, y/o b. un nivel de actividad de la proteína Gsh1 modificado en relación con la actividad de una proteína Gsh1 de tipo silvestre de una célula hospedadora fúngica de referencia por lo demás idéntica, y/o

c. un gen GSH1 modificado que tiene un nivel reducido de actividad en relación con la actividad de un gen GSH1 de tipo silvestre de una célula hospedadora fúngica de referencia por lo demás idéntica, y/o

d. un nivel de expresión modificado del gen GSH1 en relación con el nivel de expresión de un gen GSH1 de tipo silvestre de una célula hospedadora fúngica de referencia por lo demás idéntica.

Dicha célula hospedadora fúngica es de interés para los aspectos de la invención que se divulgan a continuación. La proteína Gsh1 modificada puede modificarse con respecto a una proteína Gsh1 de referencia, tal como una proteína Gsh1 de tipo silvestre, por ejemplo, de SEQ ID NO: 2. Preferentemente, la proteína Gsh1 modificada tiene al menos un 50 % de identidad con la ^s E^q ID NO: 2, más preferentemente al menos un 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8 o al menos 99,9 % de identidad con la SEQ ID NO: 2. La proteína Gsh1 modificada puede o no tener como máximo un 99.9, 99.8, 99.7, 99.6, 99.5, 99.4, 99.3, 99.2, 99.1, 99, 98, 97, 96, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65 o como máximo un 60% de identidad con la SEQ ID NO: 2. Más preferentemente, la proteína Gsh1 modificada comprende o consiste en la SEQ ID NO: 4.

El nivel de proteína Gsh1 modificado es un nivel reducido de expresión de la proteína Gsh1 y/o un nivel reducido de actividad de la proteína Gsh1. Preferentemente, el nivel reducido es relativo al nivel en una célula hospedadora fúngica de referencia, tal como una célula hospedadora fúngica en la que la proteína Gsh1 comprende o consiste en la SEQ ID NO: 2. La proteína Gsh1 del hospedador fúngico de referencia puede ser una secuencia de Gsh1 de tipo silvestre, tal como la SEQ ID NO: 2. Una célula hospedadora fúngica de referencia adecuada es S288C de S. cerevisiae o DXY1 de S. cerevisiae. S288C tiene el genotipo MATa SUC2 gal2 mal2 mel flol flo8-1 hapl ho biol bio6. DXY1 tiene el genotipo leu2-3, leu2-122, canl, pral, ubc4, ura3:yap3 (Kerry-Williams et al. (1998) Yeast 14:161-169). Otras células hospedadoras fúngicas de referencia adecuadas incluyen células que son idénticas a la célula hospedadora con la excepción del gen GSH1 o la proteína Gsh1. Por ejemplo, el gen GSH1 de la referencia puede ser de tipo silvestre (por ejemplo, SEQ ID NO: 1) o el gen GSH1 de la referencia puede codificar la proteína Gsh1 de tipo silvestre (por ejemplo, SEQ ID NO: 2) o la proteína Gsh1 codificada por la referencia puede ser de tipo silvestre (por ejemplo, SEQ ID NO: 2). Preferentemente, la célula hospedadora de la invención es idéntica a una cepa precursora con la excepción del gen GSH1 o la proteína Gsh1. Un hospedador fúngico de referencia también puede denominarse hospedador fúngico "correspondiente". Un hospedador fúngico de referencia puede ser un hospedador fúngico precursor.

Se puede lograr un nivel reducido de proteína Gsh1 y/o nivel de actividad de la proteína Gsh1, por ejemplo, mediante la mutación o eliminación del gen GSH1, dando lugar así a una proteína Gsh1 mutada o a una ausencia completa de la proteína Gsh1; mediante la eliminación o cambio del marco de lectura abierto del gen; mediante la mutación o cambio de las secuencias de control del gen GSH1 tal como una secuencia promotora y/o una secuencia terminadora; mediante el bloqueo o reducción de la transcripción del gen GSH1, por ejemplo, mediante la introducción de ARN de interferencia adecuado tal como ARNm antisentido; mediante la introducción, control o modificación de genes activadores transcripcionales adecuados o mediante la introducción de un agente que bloquea el nivel de actividad de la proteína Gsh1. Los métodos para medir los niveles de proteínas y la actividad de las proteínas son bien conocidos en la materia.

El nivel reducido de actividad de la proteína Gsh1 puede dar lugar a de un 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97 o 98 a un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % del nivel de actividad de la proteína Gsh1 de una célula hospedadora fúngica precursora o de referencia, tal como una célula hospedadora fúngica de tipo silvestre. El nivel reducido de actividad de la proteína Gsh1 en una célula hospedadora fúngica puede ser relativo al nivel de actividad de la proteína Gsh1 de una célula hospedadora fúngica de referencia tal como una célula hospedadora fúngica precursora o una célula hospedadora fúngica de tipo silvestre como se describe anteriormente. Por consiguiente, el nivel de actividad de la proteína Gsh1 en la célula hospedadora puede ser como máximo el 99 % del nivel de actividad de la proteína Gsh1 en una célula hospedadora fúngica de referencia, por ejemplo, como máximo el 98, 97, 96, 95, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o como máximo el 10 % del nivel de actividad de la proteína Gsh1 en la célula hospedadora fúngica de referencia. El nivel de actividad de la proteína Gsh1 puede reducirse a cero o sustancialmente cero.

El nivel reducido de expresión (cantidad) de proteína Gsh1 puede dar lugar a de un 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 a un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 % del nivel de expresión de la proteína Gsh1 de la célula hospedadora fúngica de referencia, tal como una célula hospedadora fúngica de tipo silvestre. El nivel reducido de expresión de la proteína Gsh1 en una célula hospedadora fúngica puede ser relativo al nivel de expression de la proteína Gsh1 de una célula hospedadora fúngica de referencia tal como una célula hospedadora fúngica precursora o una célula hospedadora fúngica de tipo silvestre como se describe anteriormente. Por consiguiente, el nivel de expresión de la proteína Gsh1 en la célula hospedadora puede ser como máximo el 99 % del nivel de expresión de la proteína Gsh1 en una célula hospedadora fúngica de referencia, por ejemplo, como máximo el 98, 97, 96, 95, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o como máximo el 10 % del nivel de expresión de la proteína Gsh1 en la célula hospedadora fúngica de referencia. El nivel de expresión de la proteína Gsh1 puede reducirse a cero o sustancialmente cero.

La célula hospedadora fúngica puede carecer de un gen GSH1 o proteína Gsh1 funcional. Por ejemplo, la célula hospedadora fúngica puede contener un gen GSH1 modificado que puede dar como resultado un nivel reducido de expresión de la proteína Gsh1 o un nivel reducido de actividad de la proteína Gsh1. La célula hospedadora fúngica puede carecer de un gen GSH1, por ejemplo, debido a una eliminación y/o puede carecer de la proteína Gsh1. La actividad de GSH1 puede medirse utilizando un ensayo tal como el divulgado por Volohonsky et al., Chemico-Biological Interactions 140 (2002) 49-65, particularmente la sección 2.8.1. El nivel de expresión de Gsh1 puede medirse, por ejemplo, mediante ELISA para determinar la cantidad de proteína o mediante RT-PCR cuantitativa para medir el nivel de ARN.

La célula hospedadora fúngica puede tener una proteína Gsh1 modificada que comprende una mutación en una posición correspondiente a una posición seleccionada de 47, 48, 49, 50, 51, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 409, 451, 452, 453, 454 y 455 de la SEQ ID NO: 2, preferentemente una posición seleccionada de: una posición correspondiente a cualquiera de las posiciones 47, 48, 49, 50 y 51 de la SEQ ID NO: 2, preferentemente correspondiente a la posición 49;

una posición correspondiente a cualquiera de las posiciones 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 o 130 de la SEQ ID NO: 2, preferentemente correspondiente a la posición 123, 124, 125, 126 o 127, más preferentemente correspondiente a la posición 125; o una posición correspondiente a la posición 409 de la SEQ ID NO: 2;

una posición correspondiente a cualquiera de las posiciones 451, 452, 453, 454 o 455 de la SEQ ID NO: 2, preferentemente correspondiente a la posición 453.

Mucho más preferentemente, la célula hospedadora fúngica tiene una proteína Gsh1 modificada que comprende una mutación en una posición correspondiente a la posición 125 de la SEQ ID NO: 2.

La mutación puede ser una sustitución, inserción y/o eliminación en una o más (por ejemplo, varias) posiciones. Se prefieren las sustituciones.

La célula hospedadora fúngica puede comprender una secuencia polinucleotídica que codifica la proteína Gsh1 modificada, por ejemplo, la SEQ ID NO: 3. Debido a la degeneración del código genético, otras secuencias polinucleotídicas también pueden codificar proteínas Gsh1 modificadas adecuadas.

Los aminoácidos pertenecen a varias clases bien conocidas. Por lo tanto, algunos aminoácidos están más estrechamente relacionados que otros. Tal como se utiliza en el presente documento, "sustituciones conservadoras de aminoácidos" se refiere a sustituciones realizadas dentro del mismo grupo y que, normalmente, no afectan de manera sustancial a la función de la proteína. Por "sustitución conservadora" se entiende dentro de grupos tales como los que se muestran en la figura 1, que es un diagrama de Venn que proporciona un sistema mediante el cual se puede visualizar el nivel de conservación. En general, las sustituciones de baja conservación son aquellas para las que existen muchos límites (líneas) entre el aminoácido inicial y la sustitución resultante. La "sustitución conservadora de aminoácidos" incluye una sustitución realizada dentro del mismo grupo, tal como dentro de: aminoácidos aromáticos: F, H, W, Y;

aminoácidos alifáticos: I, L, V;

aminoácidos hidrófobos: A, C, F, H, I, K, L, M, T, V, W, Y;

aminoácidos cargados: D, E, H, K, R, por ejemplo:

aminoácidos con carga positiva: H, K, R; o

aminoácidos con carga negativa: D, E;

aminoácidos polares: C, D, E, H, K, N, Q, R, S, T, W, Y;

aminoácidos pequeños: A, C, D, G, N, P, S, T, V, por ejemplo:

aminoácidos minúsculos: A, C, G, S.

De manera alternativa, "sustitución conservadora" puede estar dentro de los siguientes grupos:

aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas: G, A, V, L, I;

aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas: F, Y, W;

aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre: C, M;

aminoácidos que tienen cadenas laterales de hidroxilos alifáticos: S, T;

aminoácidos que contienen cadenas laterales básicas: K, R, H;

aminoácidos ácidos y sus derivados amídicos: D, E, N, Q.

Las sustituciones pueden hacerse mediante técnicas conocidas en la materia, tal como mediante mutagénesis dirigida al sitio como se divulga en la patente de EE. UU. N.° 4.302.386.

Las sustituciones de amino no conservadoras pueden referirse a sustituciones realizadas de un grupo a otro grupo, por ejemplo, del grupo que tiene cadenas laterales aromáticas al grupo que tiene cadenas laterales alifáticas.

La célula hospedadora fúngica puede comprender una proteína Gsh1 modificada en la que, en relación a la SEQ ID NO: 2, la mutación es una sustitución de un aminoácido, preferentemente un aminoácido no conservado, seleccionado de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y.

La mutación en una posición correspondiente a la posición 125 de la SEQ ID NO: 2 puede ser una sustitución del aminoácido natural, tal como R, por un aminoácido no natural, tal como A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, preferentemente por C, D, E o G, más preferentemente a G. La sustitución puede ser de un aminoácido con carga positiva por un aminoácido alifático, aromático, hidrófobo, pequeño, minúsculo, polar o con carga negativa, preferentemente un aminoácido con carga negativa por un aminoácido minúsculo. Una sustitución particularmente preferida es R por G. La sustitución por K es menos preferida.

La mutación en una posición correspondiente a la posición 49 de la SEQ ID NO: 2 puede ser una sustitución del aminoácido natural, tal como D, por un aminoácido no natural, tal como A, C, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y, preferentemente por H, K o R, más preferentemente por K o R. La sustitución puede ser de un aminoácido con carga negativa por un aminoácido con carga positiva. La sustitución por E es menos preferida.

La mutación en una posición correspondiente a la posición 409 de la SEQ ID NO: 2 puede ser una sustitución del aminoácido natural, tales como H, por un aminoácido no natural, tal como A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y, preferentemente por A, I, L, V, M, F, W, Y, más preferentemente por A, I, L, V, lo más preferentemente por L. La sustitución puede ser de un aminoácido aromático por un aminoácido alifático. Una sustitución particularmente preferida es H por L.

La mutación en una posición correspondiente a la posición P453 de la SEQ ID NO: 2 puede ser una sustitución del aminoácido natural, tal como P, por un aminoácido no natural, tal como A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W o Y, preferentemente por A, I, L, V, M, F, W, Y, más preferentemente por A, I, L, V, lo más preferentemente por L. La sustitución puede ser de un aminoácido aromático por un aminoácido alifático. Una sustitución particularmente preferida es P por L.

Una proteína Gsh1 modificada preferida incluye una mutación en una posición correspondiente a R125 de la SEQ ID NO: 2.

Una proteína Gsh1 modificada preferida comprende o consiste en la SEQ ID NO: 4, es decir, que incluye la mutación R125g . Dicha proteína Gsh1 modificada puede proporcionarse utilizando una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Gsh1 (por ejemplo, la SEQ ID NO: 1), incluyendo la secuencia de nucleótidos el polimorfismo de un solo nucleótido (SNP, del inglés "single nucleotide polymorphism") A373G y que puede proporcionarse utilizando, por ejemplo, la SEQ ID NO: 3.

Se propone que la posición R125 participe en una interacción de puente salino con la posición D49. La mutación de cualquiera de los aminoácidos se podría utilizar para interrumpir esta interacción. La mutación de R125 a D o E o de D49 a R o K podría dar como resultado efectos de repulsión electrostática que se esperaría que desestabilizaran la interacción entre las posiciones 125 y 49. Sin embargo, la mutación de R125 a K y/o D49 a E (glutamato) puede mantener la interacción.

La proteína Gsh1 puede ser exógena a la célula hospedadora o puede ser endógena a la célula hospedadora. Cuando la proteína Gsh1 es exógena a la célula hospedadora, la célula hospedadora puede mantener o carecer de una proteína Gsh1 que es endógena a la célula hospedadora.

El hospedador fúngico puede tener además:

una proteína Not4 modificada, y/o

un nivel modificado de actividad de la proteína Not4, y/o

un gen NOT4 modificado, y/o

un nivel modificado de expresión del gen NOT4.

NOT4 también se conoce como MOT2. La proteína Not4 modificada puede modificarse en relación con una proteína Not4 de referencia, tal como una proteína Not4 de tipo silvestre, por ejemplo, la SEQ ID NO: 6. Preferentemente, la proteína Not4 modificada tiene al menos un 70 % de identidad con la SEQ ID NO: 6, más preferentemente al menos un 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8 o al menos un 99,9 % de identidad con la SEQ ID NO: 6. La proteína Not4 modificada puede o no tener como máximo un 99.9, 99.8, 99.7, 99.6, 99.5, 99.4, 99.3, 99.2, 99.1, 99, 98, 97, 96, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65 o como máximo un 60 % de identidad con la SEQ ID NO: 6. Más preferentemente, la proteína Not4 modificada comprende o consiste en la SEQ ID NO: 8.

Se prefiere que el nivel modificado de proteína Not4 sea un nivel reducido de expresión de la proteína Not4 o un nivel reducido de actividad de la proteína Not4. Preferentemente, el nivel modificado, por ejemplo, reducido, es relativo al nivel en una célula hospedadora fúngica de referencia, tal como una célula hospedadora fúngica en la que la proteína Not4 comprende o consiste en la SEQ ID NO: 6. La proteína Not4 del hospedador fúngico de referencia puede ser una secuencia de Not4 de tipo silvestre, tal como la SEQ ID NO: 6. Una célula hospedadora fúngica de referencia adecuada es S288C de S. cerevisiae o DXY1 de S. cerevisiae, como se describe anteriormente. Otras células hospedadoras fúngicas de referencia adecuadas incluyen células que son idénticas a la célula hospedadora con la excepción del gen NOT4 o la proteína Not4. Por ejemplo, el gen NOT4 de la referencia puede ser de tipo silvestre (por ejemplo, SEQ ID NO: 5) o el gen NOT4 de la referencia puede codificar la proteína Not4 de tipo silvestre (por ejemplo, SEQ ID NO: 6) o la proteína Not4 codificada por la referencia puede ser de tipo silvestre (por ejemplo, SEQ ID NO: 6). Preferentemente, la célula hospedadora de la invención es idéntica a una cepa precursora con la excepción del gen NOT4 o la proteína Not4. Un hospedador fúngico de referencia también puede denominarse hospedador fúngico "correspondiente". Un hospedador fúngico de referencia puede ser un hospedador fúngico precursor.

Se puede lograr un nivel de proteína Not4 o un nivel de actividad de la proteína Not4 reducido, por ejemplo, mediante la mutación o eliminación del gen NOT4, dando lugar así a una proteína Not4 mutada o a una ausencia completa de la proteína Not4; mediante la eliminación o cambio del marco de lectura abierto del gen, mediante la mutación o cambio de las secuencias de control del gen NOT4 tal como una secuencia promotora y/o una secuencia terminadora; mediante el bloqueo o reducción de la transcripción del gen NOT4, por ejemplo, mediante la introducción de ARN de interferencia adecuado tal como ARNm antisentido, mediante la introducción, control o modificación de genes activadores transcripcionales adecuados o mediante la introducción de un agente que bloquea el nivel de actividad de la proteína Not4. Los métodos para medir los niveles de proteína son bien conocidos en la materia.

El nivel de actividad modificado de la proteína Not4 puede reducirse, dando así como resultado de un 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 a un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97 o 98 % del nivel de actividad de la proteína Not4 de una célula hospedadora fúngica precursora o de referencia, tal como una célula hospedadora fúngica de tipo silvestre. El nivel de actividad modificado, por ejemplo, reducido, de la proteína Not4 en una célula hospedadora fúngica puede ser relativo al nivel de actividad de la proteína Not4 de una célula hospedadora fúngica de referencia tal como una célula hospedadora fúngica precursora o una célula hospedadora fúngica de tipo silvestre como se describe anteriormente. Por consiguiente, el nivel de actividad de la proteína Not4 en la célula hospedadora puede ser como máximo el 99 % del nivel de actividad de la proteína Not4 en una célula hospedadora fúngica de referencia, por ejemplo, como máximo el 98, 97, 96, 95, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o como máximo el 10 % del nivel de actividad de la proteína Not4 en la célula hospedadora fúngica de referencia. El nivel de actividad de la proteína Not4 puede reducirse a cero o sustancialmente cero.

El nivel de expresión modificado (cantidad) de la proteína Not4 puede reducirse, dando así como resultado de un 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 a un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97 o 98 % del nivel de expresión de la proteína Not4 de la célula hospedadora fúngica de referencia, tal como una célula hospedadora fúngica de tipo silvestre. El nivel de expresión modificado, por ejemplo, reducido, de la proteína Not4 en una célula hospedadora fúngica puede ser relativo al nivel de expresión de la proteína Not4 de una célula hospedadora fúngica de referencia tal como una célula hospedadora fúngica precursora o una célula hospedadora fúngica de tipo silvestre como se describe anteriormente. Por consiguiente, el nivel de expresión de la proteína Not4 en la célula hospedadora puede ser como máximo el 99 % del nivel de expresión de la proteína Not4 en una célula hospedadora fúngica de referencia, por ejemplo, como máximo el 98, 97, 96, 95, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o como máximo el 10 % del nivel de expresión de la proteína Not4 en la célula hospedadora fúngica de referencia. El nivel de expresión de la proteína Not4 puede reducirse a cero o sustancialmente cero.

La célula hospedadora fúngica puede carecer de un gen NOT4 o proteína Not4 funcional. Por ejemplo, la célula hospedadora fúngica puede contener un gen NOT4 modificado que puede dar como resultado un nivel reducido de expresión de la proteína Not4 o un nivel reducido de actividad de la proteína Not4. La célula hospedadora fúngica puede carecer de un gen NOT4, por ejemplo, debido a una eliminación y/o puede carecer de la proteína Not4.

El nivel de expresión de Not4 puede medirse, por ejemplo, mediante ELISA para determinar la cantidad de proteína o mediante RT-PCR cuantitativa para medir el nivel de ARN.

La proteína Not4 modificada puede mutarse de modo que se altere su interacción con la proteína Not1. Por ejemplo, la región aminoterminal de la proteína Not4 puede estar mutada, tal como los aminoácidos que contienen hélice a correspondientes a las posiciones 426 a 439 de la SEQ ID NO: 6.

Por lo tanto, la invención también proporciona una célula hospedadora fúngica que además tiene una proteína Not4 que tiene una interacción más débil, tal como una interacción hidrófoba, con Not1 que la interacción entre una proteína Not4 de tipo silvestre (por ejemplo, SEQ ID NO: 6) y una proteína Not1 de tipo silvestre (por ejemplo, SEQ ID NO: 13).

La célula hospedadora fúngica puede tener una proteína Not4 modificada que comprende una mutación en una posición correspondiente a una posición seleccionada de 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469 o 470 de la SEQ ID NO: 6, preferentemente una posición seleccionada de:

una posición correspondiente a 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438 o 439 de la SEQ ID NO: 6, preferentemente la posición 429, 430, 434 o 437, más preferentemente la posición 429;

una posición correspondiente a 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469 o 470 de la SEQ ID NO: 6, preferentemente la posición 463, 464 o 466; o

una posición correspondiente a 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455 o 456 de la SEQ ID NO: 6, preferentemente la posición 442, 445, 447 o 452.

La mutación puede ser una sustitución, inserción y/o eliminación en una o más (por ejemplo, varias) posiciones. Se prefieren las sustituciones.

La célula hospedadora fúngica puede comprender una secuencia polinucleotídica que codifica la proteína Not4 modificada, por ejemplo, la SEQ ID NO: 7. Debido a la degeneración del código genético, otras secuencias polinucleotídicas también pueden codificar proteínas Not4 modificadas adecuadas.

La célula hospedadora fúngica puede comprender una proteína Not4 modificada en la que, en relación a la SEQ ID NO: 6, la mutación es una sustitución de un aminoácido, preferentemente un aminoácido no conservado, seleccionado de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y.

La mutación en una posición correspondiente a la posición 429 de la SEQ ID NO: 6 puede ser una sustitución del aminoácido natural, tales como F, por un aminoácido no natural, tal como A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y, preferentemente por G, A, V, L o I, más preferentemente por V, L o I, lo más preferentemente por I. La sustitución puede ser por un aminoácido no conservado. La sustitución puede ser por un aminoácido alifático. Una sustitución particularmente preferida es F por I.

La mutación en una posición correspondiente a la posición 430 de la SEQ ID NO: 6 puede ser una sustitución del aminoácido natural, tal como L, por cualquier aminoácido no natural tal como A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y. La sustitución puede ser por un aminoácido no conservado.

La mutación en una posición correspondiente a la posición 434 puede ser una sustitución del aminoácido natural, tal como L, por cualquier aminoácido no natural tal como A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y. La sustitución puede ser por un aminoácido no conservado.

La mutación en una posición correspondiente a la posición 437 de la SEQ ID NO: 6 puede ser una sustitución del aminoácido natural, tal como L, por cualquier aminoácido no natural tal como A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y. La sustitución puede ser por un aminoácido no conservado.

Una proteína Not4 modificada preferida incluye una mutación en una posición correspondiente a F429 de la SEQ ID NO: 6.

Una proteína Not4 modificada preferida comprende o consiste en la SEQ ID NO: 8, es decir, que incluye la mutación F429I. Dicha proteína Not4 modificada puede proporcionarse utilizando una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Not4 (por ejemplo, SEQ ID NO: 5), incluyendo la secuencia de nucleótidos el SNP T1285A, por ejemplo, la SEQ ID NO: 7.

De manera alternativa, el nivel modificado puede aumentarse. Es probable que un nivel aumentado o una actividad aumentada de la proteína Not4 disminuyan el rendimiento de la proteína deseada (tal como una proteína heteróloga). Dicha disminución del rendimiento puede ser deseable cuando, por ejemplo, la proteína deseada es perjudicial para la viabilidad de la célula hospedadora. Un nivel aumentado puede ser al menos un 101, 102, 103, 104, 105, 110, 120, 130, 140, 150, 175 o 200 % del nivel en un hospedador de referencia, tal como un hospedador precursor.

La proteína Not4 puede ser exógena a la célula hospedadora o puede ser endógena a la célula hospedadora. Cuando la proteína Not4 es exógena a la célula hospedadora, la célula hospedadora puede mantener o carecer de una proteína Not4 que es endógena a la célula hospedadora.

El hospedador fúngico puede tener (1) un nivel reducido de la proteína Gsh1 y/o un nivel reducido de actividad de la proteína Gsh1 y/o un gen GSH1 modificado que reduce el nivel de actividad del gen GSH1, y/o un nivel reducido de expresión del gen GSH1 y (2) un nivel modificado de proteína Not4 y/o un nivel modificado de actividad de la proteína Not4, y/o un gen NOT4 modificado y/o un nivel modificado de expresión del gen NOT4. Preferentemente, el hospedador fúngico tiene (1) un nivel reducido de la proteína Gsh1 o un nivel reducido de actividad de la proteína Gsh1 y/o un nivel reducido de expresión del gen GSH1 y (2) un nivel reducido de la proteína Not4 o un nivel reducido de actividad de la proteína Not4 y/o un nivel reducido de expresión del gen NOT4. De manera alternativa, el hospedador fúngico puede tener (1) un nivel reducido de proteína Gsh1 o un nivel reducido de actividad de la proteína Gsh1 y/o un nivel reducido de expresión del gen GSH1 y (2) un nivel aumentado de la proteína Not4 o un nivel aumentado de actividad de la proteína Not4 y/o un nivel aumentado de expresión del gen NOT4. Las mismas opciones se aplican con respecto a los niveles de expresión de GSH1 y NOT4. 'Aumentado' y 'reducido' son como se describe en el presente documento.

Preferentemente, el nivel reducido de Gsh1 es relativo al nivel en una célula hospedadora fúngica de referencia, tal como una célula hospedadora fúngica en la que la proteína Gsh1 comprende o consiste en la SEQ ID NO: 2 y el nivel modificado, por ejemplo, reducido, de Not4 es relativo al nivel en una célula hospedadora fúngica de referencia, tal como una célula hospedadora fúngica en la que la proteína Not4 comprende o consiste en la SEQ ID NO: 6. La proteína Gsh1 del hospedador fúngico de referencia puede ser una secuencia de Gsh1 de tipo silvestre, tal como la SEQ ID NO: 2. La proteína Not4 del hospedador fúngico de referencia puede ser una secuencia de Not4 de tipo silvestre, tal como la SEQ ID NO: 6. Una célula hospedadora fúngica de referencia adecuada es S288C de S. cerevisiae o DXY1 de S. cerevisiae como se describe anteriormente. Otras células hospedadoras fúngicas de referencia adecuadas incluyen células que son idénticas a la célula hospedadora con la excepción del gen GSH1 gen o la proteína Gsh1 y el gen NOT4 o la proteína Not4. Por ejemplo, el gen GSH1 de la referencia puede ser de tipo silvestre (por ejemplo, SEQ ID NO: 1) o el gen GSH1 de la referencia puede codificar la proteína Gsh1 de tipo silvestre (por ejemplo, SEQ ID NO: 2) o la proteína Gsh1 codificada por la referencia puede ser de tipo silvestre (por ejemplo, SEQ ID NO: 2). El gen NOT4 de la referencia puede ser de tipo silvestre (por ejemplo, SEQ ID NO: 5) o el gen NOT4 de la referencia puede codificar la proteína Not4 de tipo silvestre (por ejemplo, SEQ ID NO: 6) o la proteína Not4 codificada por la referencia puede ser de tipo silvestre (por ejemplo, SEQ ID NO: 6). Preferentemente, la célula hospedadora de la invención es idéntica a una cepa precursora con la excepción del gen GSH1 o la proteína Gsh1 y el gen NOT4 o la proteína Not4. Un hospedador fúngico de referencia también puede denominarse hospedador fúngico "correspondiente". Un hospedador fúngico de referencia puede ser un hospedador fúngico precursor.

La célula hospedadora fúngica puede ser una célula de hongo filamentoso.

La célula hospedadora fúngica puede ser una levadura o un hongo filamentoso. "Hongos", como se usa en el presente documento, incluye los filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y Zygomycota (según define Hawksworth et al., en, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8.a edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido) así como el Oomycota (como se cita en Hawksworth et al., 1995, citado anteriormente, página 171) y todos los hongos mitospóricos (Hawksworth et al., 1995, citado anteriormente).

Preferentemente, la célula hospedadora fúngica es una célula de levadura. "Levadura", como se usa en el presente documento, incluye levadura ascoesporógena (Endomycetales), levadura basidiosporógena y levadura que pertenece a los hongos imperfectos (Blastomicetos). Puesto que la clasificación de las levaduras puede cambiar en el futuro, para los fines de la presente invención, la levadura se definirá como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, F. A., Passmore, S. M. y Davenport, R. R., eds, Soc. App. Bacteriol. n.° de serie de simposios: 9, 1980, páginas 1 a 27).

Más preferentemente, la célula hospedadora de levadura es una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia.

Incluso más preferentemente, la célula hospedadora de levadura es una célula de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, Kluyveromyces lactis o Yarrowia lipolytica. Se prefiere particularmente un hospedador de Saccharomyces cerevisiae.

El hospedador S. cerevisiae puede comprender o no una o más de las siguientes características genotípicas: leu2-3, leu2-122, can1, pra1, ubc4, ura3, yap3::URA3, lys2, hsp150::LYS2, pmt1::URA3 (como se define en el documento WO2014/138371), por ejemplo, BXP10 de S. cerevisiae. Preferentemente el hospedador S. cerevisiae incluye MATa. El hospedador S. cerevisiae puede comprender o no uno o más de los siguientes genotipos, MATa, leu2-3, leu2-112, ubc4, ura3, yap3::URA3, lys2, hsp150:LYS2; con PDI1, URA3 y Ylplac211 integrados en el locus PDI1 (Finnis et al., 2010, Microbial Cell Factories 9:87), por ejemplo, DP9 de S. cerevisiae.

El hospedador S. cerevisiae puede comprender o no uno o más de los siguientes genotipos, MATa, leu2, pep4-3, por ejemplo, MT302/28B de S. cerevisiae como se describe en Finnis et al., 1993, Eur. J. Biochem, 212: 201-210. El hospedador S. cerevisiae puede o no comprender el siguiente genotipo: MATa, SUC2, gal2, mal2, mel, flo1, flo8-1, hap1, ho, bio1, bio6 (Mortimer y Johnston (1986) Genetics 113:35-43), por ejemplo, S288C de S. cerevisiae.

La cepa hospedadora preferida de S. cerevisiae comprende o consiste en todos los MATa, leu2-3, leu2-122, canl, pral, ubc4, ura3, yap3::URA3, lys2, hsp150::LYS2 ypmt1::URA3.

Otro hospedador preferido S. cerevisiae comprende o consiste en todo: MATa, leu2-3, leu2-112, ubc4, ura3, yap3::URA3, lys2, hsp150::LYS2, con PDI1, URA3 y Ylplac211 integrados en el locus PDI1.

Otro hospedador preferido S. cerevisiae comprende o consiste en todo: MATa, SUC2, gal2, mal2, mel, flol, flo8-1, hapl, ho, bio1, bio6.

Otro hospedador preferido S. cerevisiae comprende o consiste en todo: MATa, leu2, pep4-3.

El hospedador puede ser poliploide, diploide o haploide. Se prefiere una levadura hospedadora haploide o diploide, preferentemente haploide.

El tipo de apareamiento del hospedador puede ser, por ejemplo, MATa o MATa (Mat-alfa). Preferentemente el hospedador S. cerevisiae contiene un plásmido que codifica la albúmina humana o una variante, fragmento y/o fusión de la misma.

Los "hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (según define Hawksworth et al., 1995, citado anteriormente). Los hongos filamentosos se caracterizan por una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por alargamiento hifal y el catabolismo del carbono es obligatoriamente aeróbico. Por el contrario, el crecimiento vegetativo de levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae es por gemación de un talo unicelular y el catabolismo del carbono puede ser fermentativo.

Las células hospedadoras de hongos filamentosos preferidas pueden o no incluir Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes o Trichoderma.

La célula hospedadora fúngica, puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína deseada. Preferentemente, la proteína deseada es una proteína heteróloga. Una proteína heteróloga es aquella que no se produce de manera natural por la célula hospedadora y, preferentemente, no incluye proteínas tales como marcadores seleccionables, por ejemplo, marcadores de resistencia a antibióticos o marcadores auxótrofos, chaperonas, FLP o FRT.

La célula hospedadora fúngica puede ser un hospedador de expresión. La célula hospedadora fúngica puede comprender un casete de expresión, por ejemplo, que codifica una proteína deseada tal como una proteína heteróloga. El casete de expresión puede estar, por ejemplo, dentro de un vector tal como un plásmido. La célula hospedadora fúngica puede comprender un vector de expresión.

La proteína deseada puede ser o no una proteína vegetal o animal o una variante de la misma. La proteína deseada puede, o no, comprender la secuencia de la albúmina, un anticuerpo monoclonal, un etopósido, una proteína sérica (tal como un factor de coagulación de la sangre), antiestasina, un péptido anticoagulante de garrapatas, transferrina, lactoferrina, endostatina, angiostatina, colágenos, inmunoglobulinas o moléculas basadas en inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (por ejemplo, un Small Modular ImmunoPharmaceutical™ ("SMIP") o dAb, fragmentos Fab', F(ab')2, scAb, scFv o fragmento scFv), una proteína con dominio Kunitz (tal como las descritas en el documento WO03/066824, con o sin fusiones de albúmina), interferones, interleucinas, IL-10, IL-11, IL-2, especies y subespecies de interferón a (alfa), especies y subespecies de interferón p (beta), especies y subespecies de interferón ^y (gamma), leptina, CNTF, CNTF^ax15, antagonista del receptor de IL-1, eritropoyetina (EPO) e imitadores de EPO, trombopoyetina (TPO) e imitadores de TPO, prosaptida, cianovirina-N, 5 hélices, péptido T20, péptido T1249, gp41 del VIH, gp120 del VIH, urocinasa, prourocinasa, tPA, hirudina, factor de crecimiento procedente de plaquetas, hormona paratiroidea, proinsulina, insulina, glucagón, péptidos similares al glucagón tales como exendina-4, GLP-1 o GLP-2, factor de crecimiento de tipo insulina, calcitonina, hormona del crecimiento, factor de crecimiento transformante p (beta), factor de necrosis tumoral, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, FGF, factores de coagulación en formas tanto pre como activas, que incluyen, pero sin limitación, plasminógeno, fibrinógeno, trombina, pretrombina, protrombina, factor von Willebrand, antitripsina a1, activadores de plasminógeno, factor VII, factor VIII, factor IX, factor X y factor XIII, factor de crecimiento nervioso, LACI, factor de crecimiento de células endoteliales procedente de plaquetas (PD-ECGF), glucosa oxidasa, colinesterasa sérica, aprotinina, proteína precursora de amiloide, inhibidor de intertripsina a, antitrombina III, especies de apo-lipoproteínas, proteína C, proteína S, un metabolito, un antibiótico o una variante o fragmento de cualquiera de los anteriores.

Preferentemente, la variante tiene al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con una o más de las proteínas divulgadas anteriormente.

Una proteína deseada preferida puede o no ser una proteína sérica tal como una albúmina o una variante, fragmento y/o fusión de la misma. Preferentemente, la albumina tiene del 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 98.2, 98.4, 98.6, 98.8, 99, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, o 99,9 al 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 98,2, 98,4, 98,6, 98,8, 99, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8, 99,9 o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10. Mucho más preferentemente, la albúmina comprende o consiste en la SEQ ID NO: 10.

La variante de albúmina, fragmento y/o fusión del mismo puede o no comprender de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19 a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 mutaciones en relación con la SEQ ID NO: 10. Las variantes de albúmina preferidas comprenden de 1 a 10 mutaciones en relación con la SEQ ID NO: 10, más preferentemente de 1 a 5 mutaciones. Las mutaciones preferidas incluyen sustituciones. La variante de albúmina, fragmento y/o fusión de la misma puede o no comprender A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y en una posición correspondiente a la posición K573 de la SEQ ID NO: 10, más preferentemente una P, H, W o Y en una posición correspondiente a la posición K573 de la SEQ ID NO: 10. Las variantes de albúmina particularmente preferidas tienen al menos un 95% de identidad con la SEQ ID NO: 10 (más preferentemente al menos un 96, 97, 98 o 99 % de identidad) y comprenden P en una posición correspondiente a 573 de la SEQ ID NO: 10.

La variante de albúmina, fragmento y/o fusión de la misma puede o no comprender A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y en una posición correspondiente a la posición E492 de la SEQ ID NO: 10, más preferentemente una G, D, F, H, M o R en una posición correspondiente a la posición E492 de la SEQ ID NO: 10, incluso más preferentemente una G o D en una posición correspondiente a la posición E492 de la SEQ ID NO: 10. Las variantes de albúmina particularmente preferidas tienen al menos un 95% de identidad con la SEQ ID NO: 10 (más preferentemente al menos un 96, 97, 98 o 99 % de identidad) y comprenden G en una posición correspondiente a E492 de la SEQ ID NO: 10.

La variante de albúmina, fragmento y/o fusión de la misma puede o no comprender A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y en una posición correspondiente a la posición K574 de la SEQ ID NO: 10, más preferentemente una H, G, D, F, N, S o Y en una posición correspondiente a la posición K574 de la SEQ ID NO: 10, aún más preferentemente una D, F, G o H en una posición correspondiente a la posición K574 de la SEQ ID NO: 10. Las variantes de albúmina particularmente preferidas tienen al menos un 95 % de identidad con la SEQ ID NO: 10 (más preferentemente al menos un 96, 97, 98 o 99 % de identidad) y comprenden H en una posición correspondiente a K574 de la SEQ ID NO: 10.

La variante de albúmina, fragmento y/o fusión de la misma puede o no comprender A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W o Y en una posición correspondiente a la posición Q580 de la SEQ ID NO: 10, más preferentemente una K o R en una posición correspondiente a la posición Q580 de la SEQ ID NO: 10. Las variantes de albúmina particularmente preferidas tienen al menos un 95% de identidad con la SEQ ID NO: 10 (más preferentemente al menos un 96, 97, 98 o 99 % de identidad) y comprenden K en una posición correspondiente a Q580 de la SEQ ID NO: 10.

Las variantes de albúmina preferidas pueden comprender o no mutaciones en una o más posiciones seleccionadas entre las correspondientes a las posiciones 492, 573, 574 y 580, por ejemplo, las sustituciones descritas anteriormente. Por ejemplo, la variante de albúmina puede comprender o consistir en la SEQ ID NO: 45.

Otras variantes de albúmina preferidas, fragmentos y/o fusiones de la misma incluyen las divulgadas en los documentos WO2011/051489, WO2011/124718, WO2012/059486, WO2012/150319, WO2014/072481, WO2013/135896, WO2015/036579, WO2010/092135, WO2013/075066, WO2014/179657, WO2009/126920, WO2010/059315, WO2011/103076, WO2012/112188, WO2015/063611 y WO 2017/029407 o fragmentos o fusiones de la misma.

La albúmina puede ser o no un fragmento de una albúmina o una variante de la misma.

La variante de albúmina, fragmento y/o fusión de la misma puede tener una afinidad de unión a FcRn que es más fuerte o más débil (y, preferentemente, es más fuerte) que la de la albúmina, fragmento y/o fusión de la misma precursora.

La variante de albúmina, fragmento y/o fusión de la misma puede tener una KD para FcRn (por ejemplo, shFcRn) que es menor que la KD correspondiente para la HSA o conjugado de la misma. Preferentemente, la KD para la variante de albúmina, fragmento y/o fusión de la misma es inferior a 0,9* la KD para la HSA a FcRn, más preferente inferior a 0,5* la KD para la ^hS^a a FcRn, más preferente inferior a 0,1* la KD para la HSA a FcRn, aún más preferente inferior a 0,05* la KD para la HSA a FcRn, aún más preferente inferior a 0,02* la KD para la HSA a FcRn, aún más preferente inferior a 0,01* la KD para la HSA a FcRn y lo más preferente inferior a 0,001* la KD para la HSA a FcRn (donde * significa "multiplicado por"). Una KD inferior corresponde a una afinidad de unión más fuerte.

La variante de albúmina, fragmento y/o fusión de la misma puede tener una KD para FcRn que sea más elevada que la correspondiente KD para la HSA o conjugado de la misma a FcRn. Preferentemente, la KD para la variante de albúmina, fragmento y/o fusión de la misma es superior a 2* la KD para la HSA a FcRn, más preferente superior a 5* la KD para la HSA a FcRn, más preferente superior a 10* la KD para la HSA a FcRn, aún más preferente superior a 25* la KD para la HSA a FcRn, lo más preferente superior a 5o* la KD para la HSA a FcRn. La variante de albúmina, fragmento y/o fusión de la misma puede ser un enlazador nulo para FcRn. Una KD más elevada corresponde a una afinidad de unión más débil.

Cuando se determina y/o compara la KD, se pueden utilizar uno o más (por ejemplo, varios) (y preferentemente todos) de los siguientes parámetros:

Instrumento: Instrumento Biacore 3000 (GE Healthcare)

Cubeta de lectura: Chip sensor CM5

FcRn: FcRn humano, preferentemente FcRn humano soluble, de manera opcional acoplado a un marcador tal como glutatión S transferasa (GST) o histidina (His), lo más preferentemente His tal como 6 restos de histidina en el extremo carboxiterminal de la microglobulina p2.

Cantidad de FcRn: 1200 a 2500 UR

Química de acoplamiento: química de acoplamiento de amina (por ejemplo, como se describe en el protocolo proporcionado por el fabricante del instrumento).

Método de acoplamiento: El acoplamiento se puede realizar mediante la inyección de 20 pg/ml de la proteína en acetato de sodio 10 mM pH 5,0 (GE Healthcare). El tampón de fosfato (tampón de fosfato 67 mM, NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,005 %) a pH 5,5 se puede utilizar como tampón de ejecución y tampón de dilución. La regeneración de las superficies se puede realizar mediante inyecciones de tampón HBSEP (HEPES 0,01 M, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005 %) a pH 7,4 (Biacore AB).

Cantidad de inyección de la molécula de prueba (por ejemplo, HSA o variante) de 20 a 0,032 pM.

Caudal de inyección: constante, por ejemplo, 30 pl/ml.

Temperatura de inyección: 25 °C.

Programa informático para la evaluación de datos: Programa informático BIAevaluation 4.1 (BIAcore AB).

La variante de albúmina, fragmento y/o fusión de la misma puede tener una semivida en plasma que es más larga o más corta, preferentemente más larga, que la de la albúmina, fragmento y/o fusión de la misma precursora.

La semivida en plasma se determina de manera ideal in vivo en individuos adecuados. Sin embargo, dado que lleva mucho tiempo y es costoso e inevitablemente existen preocupaciones éticas relacionadas con la realización de experimentos en animales o en el ser humano, es conveniente utilizar un ensayo in vitro para determinar si la semivida en plasma se prolonga o se reduce. Se sabe que la unión de la albúmina a su receptor (FcRn) es importante para la semivida en plasma y la correlación entre la unión al receptor y la semivida en plasma es que una mayor afinidad de la albúmina por su receptor conduce a una semivida en plasma más larga. Por lo tanto, para la invención, una mayor afinidad de la albúmina por FcRn se considera indicativa de una semivida en plasma aumentada y una afinidad menor de la albúmina por su receptor se considera indicativa de una semivida en plasma reducida.

La unión de la albúmina a su receptor FcRn puede describirse utilizando el término afinidad y las expresiones "más fuerte" o "más débil". Por lo tanto, debería comprenderse que, se considera que una molécula que tiene una afinidad más elevada por FcRn que la afinidad de la ^hS^a por FcRn se une de manera más fuerte a FcRn que lo que la HSA se une a FcRn y una molécula que tiene una afinidad más baja por FcRn que la afinidad de la HSA por FcRn se considera que se une de manera más débil a FcRn que lo que la HSA se une a FcRn. El término "coeficiente de unión" se puede utilizar en lugar del término "afinidad de unión".

Se entiende que las expresiones "semivida en plasma más larga" o "semivida en plasma más corta" y expresiones similares están en relación con la correspondiente molécula de albúmina precursora o de referencia o correspondiente. Por lo tanto, una semivida en plasma más larga con respecto a una variante de albúmina de la invención significa que la variante tiene una semivida en plasma más larga que la de la albúmina correspondiente que tiene las mismas secuencias excepto por la(s) alteración(es) descrita(s) en el presente documento.

La albúmina o variante, y/o fragmento de la misma puede o no estar fusionada de manera genética con un compañero de fusión. Preferentemente, el compañero de fusión es una proteína que no es albúmina. El compañero de fusión puede fusionarse en el extremo N' o C' de la albúmina. Puede haber o no uno o más aminoácidos espaciadores ubicados entre la fracción de albúmina y la fracción asociada. Los compañeros de fusión pueden insertarse dentro de la secuencia de albúmina. El compañero de fusión puede tener al menos 5 aminoácidos de longitud, por ejemplo, al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o al menos 100 aminoácidos de longitud. El compañero de fusión puede tener o no una longitud máxima de 35, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 aminoácidos de largo. La proteína de fusión puede comprender una o más compañeros de fusión, por ejemplo, fusionados en el extremo N' o C' de la albúmina o insertados dentro de la secuencia de la albúmina. La proteína de fusión puede comprender uno o más (por ejemplo, varios, tal como 2, 3, 4 o 5) copias del mismo compañero de fusión o dos o más compañeros diferentes. El compañero de fusión se puede seleccionar de proteínas deseadas o heterólogas como se divulga anteriormente. Una proteína de fusión preferida puede comprender un polipéptido que tenga actividad GLP-1 tal como los descritos en el documento WO2014/138371 (con referencia particular a las páginas 13, 14, 26 y 34 a 37). Por ejemplo, una proteína de fusión preferida puede comprender HSA (SEQ ID NO: 10) o una variante (por ejemplo, SEQ ID NO: 45) y/o un fragmento de HSA genéticamente fusionado en serie a una copia de un análogo de GLP (por ejemplo, SEQ ID NO: 14 o 51) o HSA (SEQ ID NO: 10) o una variante (por ejemplo SEQ ID NO: 45) y/o fragmento de HSA genéticamente fusionado en serie a una repetición en tándem de un análogo de GLP (por ejemplo, SEQ ID NO: 15, 52 o 53). Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender o consistir en la SEQ ID NO: 16 (albiglutida).

Las células hospedadoras fúngicas particularmente adecuadas para la producción de albúminas, variantes, fragmentos y/o fusiones de las mismas incluyen, pero sin limitación, Aspergillus (Documento WO06/066595), Kluyveromyces (Fleer, 1991, Bio/technology 9: 968-975), Pichia (Kobayashi, 1998, Therapeutic Apheresis 2: 257­ 262) y Saccharomyces (Sleep, 1990, Bio/technology 8: 42-46)).

La proteína deseada (tal como una proteína heteróloga) puede ser o no una proteína secretada. Por lo tanto, la proteína codificada por la célula hospedadora puede comprender o no un péptido señal (que en alguna bibliografía también puede denominarse "secuencia líder"). Normalmente, la secuencia del péptido señal se escinde de la proteína durante la secreción de la célula hospedadora, por lo tanto, la proteína resultante (madura) no comprende una secuencia de péptido señal. A continuación se proporcionan ejemplos de secuencias de péptidos señal adecuadas. Un péptido señal puede comprender o no un propéptido.

De manera alternativa, la proteína deseada puede o no ser intracelular.

La proteína deseada puede o no estar codificada por un plásmido.

La proteína deseada puede o no estar codificada por un ácido nucleico cromosómico.

Los plásmidos adecuados incluyen plásmidos de la familia de 2 pm tales como los descritos en el documento WO2006/067511 (con especial énfasis en la sección titulada "The 2pm-family plasmids": en las páginas 46 a 61). Dichos plásmidos, denominados de manera colectiva "plásmidos de la familia de 2 pm", incluyen pSR1, pSB3 y pSB4 de Zygosaccharomyces rouxii (anteriormente clasificado como Zygosaccharomyces bisporus), plásmidos pSB1 y pSB2 de Zygosaccharomyces bailii, plásmido pSM1 de Zygosaccharomyces fermentati, plásmido pKD1 de Kluyveromyces drosphilarum, un plásmido sin nombre de Pichia membranaefaciens ("pPM1") y el plásmido de 2 pm (como se muestra en la figura 1 del documento WO2006/067511) y variantes (tales como Scp1, Scp2 y Scp3) de Saccharomyces cerevisiae (Volkert, et al., 1989, Microbiological Reviews 53: 299; Murray et al., 1988, J. Mol. Biol.

200: 601; Painting, et al., 1984, J. Applied Bacteriology 56: 331).

Un plásmido de la familia de 2 pm normalmente comprende al menos tres marcos de lectura abiertos ("ORF", del inglés "open reading frames"), cada uno de los cuales codifica una proteína que funciona en el mantenimiento estable del plásmido de la familia de 2 pm como un plásmido multicopia. Las proteínas codificadas por los tres ORF pueden denominarse FLP, REP1 y REP2. Cuando un plásmido de la familia de 2 pm no comprende los tres ORF que codifican FLP, REP1 y REP2 entonces los ORF que codifican la(s) proteína(s) que falta(n) deben suministrarse en trans, ya sea en otro plásmido o mediante integración cromosómica.

Un plásmido preferido es el plásmido de 2 pm de S. cerevisiae, que codifica preferentemente una proteína deseada tal como una proteína heteróloga.

La proteína Gsh1, la proteína Not4 y/o la proteína deseada, por ejemplo, heteróloga, pueden estar codificadas por una secuencia de nucleótidos unida de manera operativa a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula hospedadora adecuada en condiciones compatibles con las secuencias de control.

El polinucleótido puede manipularse de diversas de maneras para proporcionar la expresión de un polipéptido. La manipulación del polinucleótido antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para la modificación de polinucleótidos utilizando métodos de ADN recombinantes son conocidas en la materia.

La secuencia de control puede ser un promotor, un polinucleótido que es reconocido por una célula hospedadora para la expresión del polinucleótido. El promotor contiene secuencias de control de la transcripción que median en la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier polinucleótido que muestra actividad transcripcional en la célula hospedadora, incluyendo promotores mutantes, truncados e híbridos, y puede obtenerse a partir de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares, bien homólogos o heterólogos de la célula hospedadora.

Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de las construcciones de ácido nucleico de la presente invención en una célula hospedadora de hongos filamentosos son los promotores obtenidos de los genes de la acetamidasa de Aspergillus nidulans, a-amilasa neutra de Aspergillus niger, a-amilasa estable a los ácidos de Aspergillus niger, glucoamilasa (glaA) de Aspergillus niger o Aspergillus awamori, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, proteasa similar a tripsina de Fusarium oxysporum (Documento WO96/00787), amiloglucosidasa de Fusarium venenatum (Documento WO00/56900), Daria de Fusarium venenatum (Documento WO00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (Documento WO00/56900), lipasa de Rhizomucor miehei, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, p-glucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa IV de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa II de Trichoderma reesei, p-xilosidasa de Trichoderma reesei, así como el promotor NA2-tpi (un promotor modificado a partir de un gen de a-amilasa neutra de Aspergillus en el que la secuencia líder no traducida se ha reemplazado por una secuencia líder no traducida de un gen de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus; los ejemplos no limitantes incluyen promotores a partir de un gen de a-amilasa neutra de Aspergillus niger en el que la secuencia líder no traducida se ha reemplazado por una secuencia líder no traducida de un gen de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae; y promotores mutantes, truncados e híbridos de los mismos.

En un hospedador de levadura, los promotores útiles se obtienen de los genes para la enolasa (ENO1) de Saccharomyces cerevisiae, galactocinasa (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH1, ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, triosa fosfato isomerasa (TPI) de Saccharomyces cerevisiae, metalotioneína (CUP1) de Saccharomyces cerevisiae y 3-fosfoglicerato cinasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros promotores útiles para las células hospedadoras de levadura se describen en Romanos et al., 1992, citado anteriormente.

La secuencia de control también puede ser un terminador de la transcripción, que es reconocido por una célula hospedadora para terminar la transcripción. La secuencia terminadora está unida de manera operativa al extremo 3' del polinucleótido que codifica el polipéptido. Se puede utilizar cualquier terminador que sea funcional en la célula hospedadora.

Los terminadores preferentes para células hospedadoras de hongos filamentosos se obtienen a partir de los genes de antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, a-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

Los terminadores preferentes para las células hospedadoras de levadura se obtienen de los genes de enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores útiles para las células hospedadoras de levadura se describen en Romanos et al., 1992, citado anteriormente.

La secuencia de control también puede ser una región estabilizadora de ARNm cadena abajo de un promotor y cadena arriba de la secuencia codificante de un gen que aumenta la expresión del gen.

La secuencia de control también puede ser una región líder, no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por parte de la célula hospedadora. La secuencia líder está unida de manera operativa al extremo 5' del polinucleótido que codifica el polipéptido. Se puede utilizar cualquier líder que sea funcional en la célula hospedadora.

Las líderes preferentes para las células hospedadoras de hongos filamentosos se obtienen a partir de los genes de TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans.

Las líderes adecuadas para las células hospedadoras de levadura se obtienen de los genes de enolasa (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, 3-fosfoglicerato cinasa de Saccharomyces cerevisiae, factor a de Saccharomyces cerevisiae y alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.

La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia unida de manera operativa al extremo 3' de la secuencia que codifica el polipéptido y, cuando se transcribe, es reconocida por la célula hospedadora como una señal para añadir restos de poliadenosina al ARNm transcrito. Se puede utilizar cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula hospedadora.

Las secuencias de poliadenilación preferentes para células hospedadoras de hongos filamentosos se obtienen de los genes de antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, a-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

Las secuencias de poliadenilación útiles para células hospedadoras de levadura están descritas en Guo y Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.

La secuencia de control también puede ser una región codificante del péptido señal que codifica un péptido señal unido al extremo N de un polipéptido y dirige el polipéptido dentro de la ruta secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificante del polinucleótido puede contener de manera inherente una secuencia codificante del péptido señal unida de manera natural en el marco de lectura de traducción con el segmento de la secuencia codificante que codifica el polipéptido. De manera alternativa, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una secuencia codificante del péptido señal que es extraña a la secuencia codificante. Puede requerirse una secuencia codificante del péptido señal extraño cuando la secuencia codificante no contiene de manera natural una secuencia codificante del péptido señal. De manera alternativa, una secuencia codificante del péptido señal extraño puede simplemente reemplazar la secuencia codificante del péptido señal natural para potenciar la secreción del polipéptido. Sin embargo, puede utilizarse cualquier secuencia codificante del péptido señal que dirija el polipéptido expresado a la ruta secretora de una célula hospedadora.

Las secuencias codificantes del péptido señal eficaces para células hospedadoras de hongos filamentosos son las secuencias codificantes del péptido señal obtenidas de los genes de amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, celulosa de Humicola insolens, endoglucanasa V de Humicola insolens, lipasa de Humicola lanuginosa y proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei.

Los péptidos señal preferidos para células hospedadoras de levadura, por ejemplo, células hospedadoras de levadura para la producción de albúmina, o variante, fragmento y/o fusión de la misma, incluyen:

un péptido señal obtenido del gen del factor a de Saccharomyces cerevisiae,

un péptido señal obtenido del gen de invertasa de Saccharomyces cerevisiae,

un péptido señal obtenido del gen de KEX2 de Saccharomyces cerevisiae, por ejemplo, que comprende o consiste en la SEQ ID NO: 17 o una secuencia de péptido señal KEX2 modificada, por ejemplo, que comprende o consiste en la SEQ ID NO: 18.

Los péptidos señal particularmente preferidos incluyen:

un péptido señal que comprende una fusión de la secuencia del péptido señal del factor a de apareamiento y la secuencia del péptido señal de la albúmina humana como se indica en el documento WO90/01063, un ejemplo de dicha secuencia del péptido señal se proporciona en la SEQ ID NO: 19;

un péptido señal que comprende el motivo pentapeptídico de SEQ ID NO: 20, en donde el motivo pentapeptídico está ubicado en el dominio hidrófobo de la secuencia del péptido señal, por ejemplo, de las posiciones -10 a -25 de una proteína inmadura, donde la posición -1 se refiere al aminoácido de la secuencia del péptido señal que está inmediatamente adyacente al extremo N del primer aminoácido de la secuencia madura, o para las secuencias del péptido señal que comprenden un propéptido, la posición -1 se refiere al aminoácido de la secuencia del péptido señal que está inmediatamente adyacente al extremo N del primer aminoácido del propéptido, ejemplos de dichas secuencias de péptidos señal se divulgan en el documento WO2004/009819; un péptido señal de albúmina que se modifica para comprender el motivo pentapeptídico de SEQ ID NO: 20, el motivo pentapeptídico puede estar ubicado en el dominio hidrófobo de la secuencia del péptido señal, se proporciona un ejemplo de dicha secuencia del péptido señal modificada en la SEQ ID NO: 21. El motivo pentapeptídico puede insertarse en un péptido señal de invertasa para generar un péptido señal de invertasa modificado, se proporcionan ejemplos de péptidos señal de invertasa modificados en las SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 42; o un péptido señal de albúmina que se modifica para comprender el motivo pentapeptídico de SEQ ID NO: 20 y comprende un propéptido en el extremo C' de la secuencia del péptido señal, el motivo pentapeptídico puede estar ubicado en el dominio hidrófobo de la secuencia del péptido señal, se proporcionan ejemplos de dicha secuencia del péptido señal modificada en la SEQ ID NO: 22, la SeQ ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 24. Los péptidos señal que comprenden o consisten en la SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 42 son especialmente preferidos, por ejemplo, para la expresión de albúmina o una variante, fragmento y/o fusión de la misma.

Otras secuencias codificantes de péptidos señal útiles se describe en Romanos et al., 1992, citado anteriormente. La secuencia de control también puede ser una secuencia codificante de propéptido que codifica un propéptido posicionado en el extremo aminoterminal de un polipéptido. El polipéptido resultante se conoce como proenzima o propolipéptido (o zimógeno en algunos casos). En general, un propolipéptido es inactivo y se puede convertir en un polipéptido activo mediante la escisión catalítica o autocatalítica del propéptido del propolipéptido. La secuencia codificante del propéptido puede obtenerse de los genes del factor a de Saccharomyces cerevisiae.

Cuando están presentes tanto las secuencias del péptido señal como las del propéptido, la secuencia de propéptido se ubica junto al extremo aminoterminal del polipéptido y la secuencia del péptido señal se ubica junto al extremo aminoterminal de la secuencia del propéptido.

También puede ser deseable añadir secuencias reguladoras que regulan la expresión del polipéptido en relación con el crecimiento de la célula hospedadora. Los ejemplos de sistemas reguladores son aquellos que hacen que la expresión del gen se active o desactive en respuesta a un estímulo químico o físico, incluida la presencia de un compuesto regulador. En levaduras, se puede usar el sistema ADH2 o el sistema GAL1. En hongos filamentosos, pueden usarse el promotor de la glucoamilasa de Aspergillus niger, el promotor de la a-amilasa TAKA de Aspergillus oryzae y el promotor de la glucoamilasa de Aspergillus oryzae. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que permiten la amplificación génica. En los sistemas eucariotas, estas secuencias reguladoras incluyen el gen de dihidrofolato reductasa que se amplifica en presencia de metotrexato y los genes de metalotioneína que se amplifican con metales pesados. En estos casos, el polinucleótido que codifica el polipéptido estaría unido de manera operativa a la secuencia reguladora.

La cepa hospedadora puede o no expresar o sobreexpresar una o más proteínas chaperonas tales como las descritas en los documentos WO2005/061718, WO2006/067511, WO2006/136831 o WO2014/138371. Por ejemplo, la cepa hospedadora puede o no sobreexpresar uno o más de: AHA1, CCT2, CCT3, CCT4, CCT5, CCT6, CCT7, CCT8, CNS1, CPR3, CPR6, ERO1, EUG1, FMO1, HCH1, HSP10, HSP12, HSP104, HSP26, HSP30, HSP42, HSP60, HSP78, HSP82, JEM1, MDJ1, MDJ2, MPD1, MPD2, PDI1, PFD1, ABC1, APJ1, ATP11, ATP12, BTT1, CDC37, CPR7, HSC82, KAR2, LHS1, MGE1, MRS11, NOB1, ECM10, SSA1, SSA2, SSA3, SSA4, SSC1, SSE2, SIL1, SLS1, ORM1, ORM2, PER1, PTC2, PSE1, UBI4 y HAC1 o un HAC1 truncado sin intrones (Valkonen et al., 2003, Applied Environ. Micro., 69: 2065), así como TIM9, PAM18 (también conocido como TIM14) y TCP1 (también conocido como CCT1) o una variante de los mismos. Se prefiere la sobreexpresión de PDI1 (s Eq ID NO: 25) o variante o fragmento del mismo y/o ERO1 (SEQ ID NO: 26) o variante o fragmento del mismo. La sobreexpresión incluye el aumento de la expresión de la chaperona en al menos un 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400 o 500 % en relación con el nivel de expresión natural de la chaperona en la célula hospedadora. La sobreexpresión puede corresponder a un aumento en la cantidad de chaperonas o un aumento en la actividad de las chaperonas. La sobreexpresión se puede lograr mediante el aumento del número de copias del gen que codifica la chaperona, por ejemplo, proporcionando una célula hospedadora que comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más copias del gen. Preferentemente, la chaperona variante tiene al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad de secuencia con la chaperona. Preferentemente, la variante mantiene la actividad funcional de la chaperona.

La célula hospedadora puede comprender o no al menos un ácido nucleico heterólogo que codifica una proteasa o un fragmento y/o variante de la misma. La célula hospedadora puede comprender o no al menos un ácido nucleico que codifica una proteasa tal como una serina proteasa dependiente de calcio tal como la proteasa que expresa toxina asesina (Kex2p) o un fragmento y/o variante de la misma. Preferentemente, la variante o fragmento de proteasa es funcional, por ejemplo, tiene la capacidad de escindir polipéptidos en el extremo carboxilo de la secuencia de reconocimiento Arg-Arg/X o Lys-Arg/X. A secuencia de nucleótidos KEX2 puede comprender o consistir en la SEQ ID NO: 27, una proteína Kex2p puede comprender o consistir en la SEQ ID NO: 28. Las variantes de KEX2 y Kex2p puede tener al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 27 y la SEQ ⁱD N^o : 28, respectivamente. KEX2 puede o no estar sobreexpresado.

Una célula hospedadora preferida, lo más preferentemente S. cerevisiae, sobreexpresa PDI1 y/o ERO1 y comprende al menos un ácido nucleico que codifica Kex2p.

Las secuencias de nucleótidos que codifican la proteína Gsh1, la proteína Not4 y las proteínas deseadas se pueden preparar utilizando cualquier procedimiento de mutagénesis conocido en la materia, tal como mutagénesis dirigida al sitio, construcción de genes sintéticos, construcción de genes semisintéticos, mutagénesis aleatoria, reordenamiento, etc.

La mutagénesis dirigida al sitio es una técnica en la que se introducen una o más (por ejemplo, varias) mutaciones en uno o más sitios definidos en un polinucleótido que codifica el precursor.

La mutagénesis dirigida al sitio se puede lograr in vitro mediante PCR que implica el uso de cebadores de oligonucleótidos que contienen la mutación deseada. También se puede realizar mutagénesis dirigida al sitio in vitro mediante mutagénesis de casete que implica la escisión mediante una enzima de restricción en un sitio en el plásmido que comprende un polinucleótido que codifica el precursor y la posterior unión de un oligonucleótido que contiene la mutación en el polinucleótido. Por lo general, la enzima de restricción que digiere el plásmido y el oligonucleótido es la misma, permitiendo que los extremos cohesivos del plásmido y el inserto se unan entre sí. Véanse, por ejemplo, Scherer y Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. ^u U. 76: 4949-4955; y Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966.

La mutagénesis dirigida al sitio también se puede lograr in vivo mediante métodos conocidos en la materia. Véanse, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2004/0171154; Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773-776; Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290; y Calissano y Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16.

Cualquier procedimiento de mutagénesis dirigida al sitio se puede utilizar en la presente invención. Hay muchos kits comerciales disponibles que se pueden utilizar para preparar polipéptidos.

La construcción de genes sintéticos implica la síntesis in vitro de una molécula polinucleotídica diseñada para codificar un polipéptido de interés. La síntesis de genes se puede realizar utilizando una serie de técnicas, tales como la tecnología múltiple basada en microchip descrita por Tian et al. (2004, Nature 432: 1050-1054) y tecnologías similares en donde los oligonucleótidos se sintetizan y ensamblan en chips de microfluidos fotoprogramables.

Se pueden realizar y analizar sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos simples o múltiples utilizando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación y/o reordenamiento, seguido de un procedimiento de selección pertinente, tal como los divulgados por Reidhaar-Olson y Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie y Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 86: 2152-2156; o los documentos WO95/17413; o WO95/22625. Otros métodos que se pueden utilizar incluyen PCR propensa a errores, presentación de fagos (por ejemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; patente de EE. UU. n.° 5.223.409; documento WO92/06204) y mutagénesis dirigida a región (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

Los métodos de mutagénesis/reordenamiento se pueden combinar con métodos de detección automatizados de alto rendimiento para detectar la actividad de polipéptidos clonados y mutagenizados expresados por células hospedadoras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Las moléculas de ADN mutagenizado que codifican polipéptidos activos se pueden recupera de las células hospedadoras y secuenciarse de manera rápida utilizando métodos convencionales en la materia. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de los restos de aminoácidos individuales en un polipéptido.

La construcción de genes semisintéticos se logra mediante la combinación de aspectos de la construcción de genes sintéticos y/o mutagénesis dirigida al sitio y/o mutagénesis aleatoria y/o reordenamiento. La construcción semisintética se caracteriza por un proceso que utiliza fragmentos de polinucleótidos que se sintetizan, en combinación con técnicas de PCR. Por lo tanto, pueden sintetizarse de novo regiones definidas de genes, mientras que otras regiones pueden amplificarse utilizando cebadores mutagénicos específicos del sitio, mientras que otras regiones pueden someterse a amplificación por PCR propensa a errores o no propensa a errores. A continuación, las subsecuencias de polinucleótidos se pueden reordenar.

También se divulga por los inventores, y es relevante para la invención divulgada a continuación, un cultivo de células hospedadoras fúngicas que contienen una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína deseada, tal como una proteína heteróloga, caracterizado porque las células hospedadoras fúngicas tienen un nivel reducido de actividad de la proteína Gsh1 y/o un nivel reducido de expresión de la proteína Gsh1.

El cultivo de células hospedadoras fúngicas también puede tener un nivel de actividad modificado, tal como reducido, de la proteína Not4 y/o un nivel de expresión modificado, tal como reducido, de la proteína Not4. Las células hospedadoras fúngicas son como se ha descrito anteriormente.

El método puede comprender el cultivo en presencia de glutatión. Esto es particularmente útil cuando el hospedador fúngico carece de una proteína Gsh1 funcional, por ejemplo, debido a mutación o eliminación. También puede ser útil cuando la célula hospedadora fúngica contiene una proteína Gsh1 funcional o parcialmente funcional. El glutatión puede estar presente en los medios de fermentación en al menos 0,05 mM, por ejemplo de aproximadamente 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 mM a aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 mM, preferentemente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 50 mM, más preferentemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mM, más preferentemente de aproximadamente 3 a aproximadamente 7 mM, lo más preferentemente a aproximadamente 5 mM.

Un primer aspecto de la invención proporciona un método para producir una proteína heteróloga que comprende: a. proporcionar una célula hospedadora fúngica que tiene:

1. una proteína Gsh1 modificada que tiene un nivel reducido de actividad en relación con la actividad de una proteína Gsh1 de tipo silvestre de una célula hospedadora fúngica de referencia por lo demás idéntica, y/o 2. un nivel reducido de actividad de la proteína Gsh1 en relación con la actividad de una proteína Gsh1 de tipo silvestre de una célula hospedadora fúngica de referencia por lo demás idéntica, y/o

3. un gen GSH1 modificado que tiene un nivel reducido de actividad en relación con la actividad de un gen GSH1 de tipo silvestre de una célula hospedadora fúngica de referencia por lo demás idéntica, y/o

4. un nivel reducido de expresión del gen GSH1 en relación con el nivel de expresión de un gen GSH1 de tipo silvestre de una célula hospedadora fúngica de referencia por lo demás idéntica, y

b. cultivar la célula hospedadora para producir la proteína heteróloga,

en donde

(i) la proteína heteróloga es una proteína vegetal o animal, y/o

(ii) el cultivo es a una escala de al menos 1 litro, y/o

(iii) el método comprende además purificar la proteína heteróloga, y/o

(iv) el método comprende además formular la proteína heteróloga con un vehículo o diluyente terapéuticamente aceptable para producir así un producto terapéutico adecuado para la administración a un ser humano o un animal.

El método puede utilizarse para aumentar el rendimiento de producción de un polipéptido deseado a partir de una célula hospedadora fúngica.

La proteína deseada puede o no secretarse por la célula hospedadora, siendo preferida una proteína secretada. Las células hospedadoras pueden cultivarse en un medio nutritivo adecuado para la producción de la proteína deseada utilizando métodos conocidos en la materia. Por ejemplo, la célula se puede cultivar mediante cultivo en matraz con agitación, o fermentación a pequeña o gran escala (incluida la fermentación continua, discontinua, alimentada-discontinua o en estado sólido) en laboratorio o fermentadores industriales realizadas en un medio adecuado y en condiciones que permitan expresar y/o aislar el polipéptido. El cultivo puede tener lugar en medios de nutrientes adecuados que comprenden fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la materia. Los medios adecuados están disponibles en proveedores comerciales o se pueden preparar de acuerdo con las composiciones publicadas (por ejemplo, en los catálogos de la American Type Culture Collection). Los medios preferidos incluyen MW11D como se describe en el ejemplo 5. Si la proteína deseada se secreta en el medio nutritivo, la proteína deseada puede recuperarse directamente del medio. Si la proteína deseada no se secreta, puede recuperarse de lisados celulares.

El cultivo puede ser a pequeña o gran escala, por ejemplo, a escala de placa de microvaloración (por ejemplo, de 10 a 500 microlitros de medios de cultivo en volumen), a escala de matraz con agitación (por ejemplo, de 5 a 1000 mililitros (ml) de volumen de cultivo) o a escala de fermentador o sistemas equivalentes (por ejemplo, al menos a partir de 5 ml de volumen de cultivo, más preferentemente al menos 1, 2, 3, 4 o 5 litros (l), más preferentemente al menos 10, 50, 100 l, por ejemplo, al menos 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000 l de volumen de cultivo).

El cultivo puede ser a un pH adecuado para la célula hospedadora. Para S. cerevisiae, el pH es, preferentemente, de 5 a 7, por ejemplo, de 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8 o 6,9 a 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 o 7. Un intervalo de pH preferido es de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,4.

El cultivo puede ser a una temperatura de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 35 °C, por ejemplo de aproximadamente 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 °C a aproximadamente 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 o 35 °C, preferentemente de aproximadamente 28 a aproximadamente 32 °C, más preferentemente aproximadamente 30 °C.

El cultivo puede o no implicar agitación, por ejemplo, la rotación del recipiente de cultivo o mediante el uso de un agitador dentro del recipiente de cultivo. Se prefiere la agitación.

La proteína deseada puede detectarse utilizando métodos conocidos en la materia que son específicos para la proteína deseada. Estos métodos de detección incluyen, pero sin limitación, el uso de anticuerpos específicos o cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

Una HPLC preferida es la HPLC de permeación en gel (GP-HPLC). El equipo adecuado incluye un sistema de HPLC LC2010 (Shimadzu) equipado con detección UV bajo el control del programa informático del servidor cliente Shimadzu VP7.3. Se pueden realizar inyecciones de 75 pl en una columna TSK G3000SWXL de 7,8 mm de d.i. x 300 mm de longitud (Tosoh Bioscience), con una precolumna TSK SW de 6,0 mm de d.i. * 40 mm de longitud (Tosoh Bioscience). Las muestras se pueden cromatografiar en fosfato de sodio 25 mM, sulfato de sodio 100 mM, azida sódica al 0,05 % (p/v), pH 7,0 a 1 ml min-1, con un tiempo de ejecución de 20 minutos. Las muestras pueden cuantificarse mediante detección de UV a 280 nm, por área de máximos, en relación con un patrón de albúmina humana recombinante de concentración conocida (por ejemplo, 10mg/ml) y corregido por sus coeficientes de extinción relativos.

De manera opcional, el método comprende recuperar la proteína deseada, por ejemplo, mediante el aislamiento de la proteína deseada de la célula hospedadora o cultivo de células hospedadoras, por ejemplo, medios celulares o lisado celular.

La proteína deseada puede recuperarse utilizando métodos conocidos en la materia. Por ejemplo, la proteína deseada puede recuperarse del medio nutritivo mediante procedimientos convencionales, que incluyen, pero sin limitación, recogida, centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación o precipitación. De manera opcional, el método comprende purificar la proteína deseada. La proteína deseada se puede purificar mediante diversos procedimientos conocidos en la materia, que incluyen, pero sin limitación, cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, hidrófoba, cromatoenfoque y de exclusión por tamaños), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, enfoque isoeléctrico preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación con sulfato amónico), SDS-PAGE o extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, Janson y Ryden, editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989) para obtener proteínas deseadas sustancialmente puras.

En un aspecto alternativo, la proteína deseada no se recupera, sino que se utiliza una célula hospedadora de la presente invención que expresa la proteína deseada como fuente de la proteína deseada.

La etapa de purificar la proteína deseada (tal como una proteína heteróloga deseada) a partir de la célula hospedadora cultivada o del medio de cultivo comprende de manera opcional inmovilización celular, separación celular y/o rotura celular, pero siempre comprende al menos otra etapa de purificación diferente a la etapa o etapas de inmovilización, separación y/o rotura celular.

Las técnicas de inmovilización celular, tales como recubrir las células con perlas de alginato de calcio, se conocen en la materia. De manera análoga, las técnicas de separación celular, tales como la centrifugación, la filtración (por ejemplo, filtración de flujo cruzado), la cromatografía de lecho expandido y similares son conocidas en la materia. Del mismo modo, los métodos de rotura celular, que incluyen, molienda con perlas, ultrasonidos, exposición enzimática y similares son conocidos en la materia.

La al menos otra etapa de purificación puede ser cualquier otra etapa adecuada para la purificación de proteínas conocida en la materia. Por ejemplo, se han divulgado técnicas de purificación para la recuperación de albúmina expresada de forma recombinante en: el documento WO2010/128142, purificación por afinidad utilizando un ligando específico de albúmina tal como 2-cloro-4,6-di(2'-sulfoanilino)-S-triazina, el documento WO92/04367, eliminación de colorante procedente de la matriz; el documento EP464590, eliminación de colorantes procedentes de levadura; el documento EP319067, precipitación alcalina y posterior aplicación de la albúmina a una fase lipófila; y los documentos WO96/37515, US5728553 y WO00/44772, que describen procesos completos de purificación.

Las proteínas deseadas distintas de la albúmina pueden purificarse del medio de cultivo mediante cualquier técnica que se haya encontrado útil para purificar dichas proteínas.

Los métodos adecuados incluyen precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido o disolvente, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita, cromatografía de lectina, concentración, dilución, ajuste de pH, diafiltración, ultrafiltración, cromatografía líquida de alto rendimiento ("HPLC"), HPLC en fase inversa, ajuste de conductividad y similares.

De manera opcional, el método puede comprender purificar la proteína aislada hasta un nivel de pureza comercial o industrialmente aceptable. Por el nivel de pureza comercial o industrialmente aceptable, se incluye el aporte de la proteína a una concentración de al menos 0,01 g ■ l-1, 0,02 g ■l-1, 0,03 g ■ l-1, 0,04 g ■ l-1, 0,05 g ■ l-1, 0,06 g ■ l-1, 0,07 g ■ l-1, 0,08 g ■ l-1, 0,09 g ■ l-1, 0,1 g ■ l-1, 0,2 g ■ l-1, 0,3 g ■ l-1, 0,4 g ■ l-1, 0,5 g ■ l-1, 0,6 g ■l-1, 0,7 g ■I-1, 0,8 g ■ l-1, 0,9 g ■ l-1, 1 g - l-1, 2 g ■l-1, 3 g ■ l-1, 4 g ■ l-1, 5 g ■ l-1, 6 g ■ l-1, 7 g ■ l-1, 8 g ■l-1, 9 g ■ l-'', 10 g ■ l-1, 15 g ■l-1, 20 g ■ l-1, 25 g ■ l-1, 30 g ■ l-1, 40 g ■ l-1, 50 g ■l-1, 60 g ■l-1, 70 g ■l-1, 80 g ■ l-1, 90 g ■ l-1, 100 g ■ l-1, 150 g ■l-1, 200 g ■l-1, 250 g ■ l-1, 300 g ■ l-1, 350 g ■ l-1, 400 g ■ l-1, 500 g ■ l-1, 600 g ■ l-1, 700 g ■ l-1, 800 g ■ l-1, 900 g ■ l-1, 1000 g ■ l-1 o más. Por el nivel de pureza comercial o industrialmente aceptable, se incluye el aporte de la proteína aislada en la que otro material (por ejemplo, uno o más (por ejemplo, varios) contaminantes) están presentes en un nivel de menos de un 50 %, un 40 %, un 30 %, un 20 %, un 10 %, un 5 %, un 4 %, un 3 %, un 2 %, un 1 %, un 0,5 %, un 0,1 %, un 0,01 %, un 0,001 %, un 0,0001 %, un 0,00001 % o un 0,000001 % y, lo más preferentemente a un nivel del 0 %.

La proteína se puede proporcionar a una concentración de al menos 0,01 g ■ l-1, 0,02 g ■ l-1, 0,03 g ■ l-1, 0,04 g ■ l-1, 0,05 g ■l-1, 0,06 g l-1, 0,07 g ■ l-1, 0,08 g ■ l-1, 0,09 g ■ l-1, 0,1 g ■ l-1, 0,2 g ■ l-1, 0,3 g ■ l-1, 0,4 g ■ -1, 0,5 g ■ -1, 0,6 g ■ l-1, 0,7 g ■ l-1, 0,8 g ■ l-1, 0,9 g ■ l-1, 1 g ■ l-1, 2 g ■ l-1, 3 g ■ l-1, 4 g ■ l-1, 5 g ■ l-1, 6 g ■ l-1, 7 g ■ l-1, 8 g ■ l-1, 9 g ■l-1, 10 g ■ l-1, 15 g ■ l-1 20 g ■ l-1, 25 g ■ l-1, 30 g ■ l-1, 40 g ■ l-1, 50 g ■ l-1, 60 g ■ l-1, 70 g ■ l-1, 80 g l-1, 90 g ■ l-1, 100 g ■ l 1, 150 g ■ l-1, 200 g ■ l-1, 250 g l-1, 300 g l-1, 350 g l-1, 400 g ■l-1, 500 g l-1, 600 g l-1, 700 g ■ l-1, 800 g ■ l-1 900 g ■ l-1, 1000 g ■l-1 o más.

Se prefiere que la proteína deseada se purifique para lograr un nivel de pureza farmacéuticamente aceptable. Una proteína tiene un nivel de pureza farmacéuticamente aceptable si está esencialmente libre de pirógenos y se puede administrar en una cantidad farmacéuticamente eficaz sin provocar efectos médicos no asociados con la actividad de la proteína.

De manera opcional, el método comprende además formular la proteína deseada con un vehículo o diluyente terapéuticamente aceptable para producir así un producto terapéutico adecuado para la administración a un ser humano o un animal.

La proteína deseada resultante puede, o no, utilizarse para cualquiera de sus utilidades conocidas, que, en el caso de la albúmina, incluye administración intravenosa (i.v.) a pacientes para tratar quemaduras graves, conmoción y pérdida de sangre, como complemento de medios de cultivo y como excipiente en formulaciones de otras proteínas. Aunque es posible que una proteína deseada de utilidad terapéutica, diagnóstica, industrial, doméstica o nutricional obtenida mediante un proceso de la invención se presente o administre sola, es preferible presentarla como una formulación (tal como una formulación farmacéutica, en particular, en el caso de proteínas útiles de manera terapéutica y/o diagnóstica), junto con uno o más vehículos o diluyentes aceptables. Los vehículos o diluyentes deben ser "aceptables" en el sentido de que sean compatibles con la proteína deseada y, cuando la formulación esté destinada a la administración a un receptor, que no sea perjudicial para el destinatario de la misma. Normalmente, los vehículos o diluyentes serán agua o solución salina que serán estériles y sin pirógenos.

De manera opcional, la proteína así formulada se presentará en forma de dosificación unitaria, tal como en forma de un comprimido, cápsula, solución inyectable o similar.

De manera opcional, el método comprende además proporcionar la proteína deseada en forma de dosificación unitaria.

Un segundo aspecto de la invención proporciona un método para aumentar el rendimiento de una proteína deseada (tal como una proteína heteróloga) que comprende el método de acuerdo con el primer aspecto de la invención. El segundo aspecto de la invención también proporciona el uso de una célula hospedadora como se describe anteriormente o un cultivo como se describe anteriormente para aumentar el rendimiento de una proteína deseada (tal como una proteína heteróloga).

El rendimiento se refiere a la cantidad de producto, por ejemplo, proteína deseada, en solución, por ejemplo, caldo de cultivo o mezcla de lisis celular. El rendimiento puede expresarse en términos relativos, por ejemplo, siendo el rendimiento a partir de una cepa hospedadora de referencia del 100%. Cuando se comparan las cepas hospedadoras, se prefiere que el rendimiento se mida en un conjunto de condiciones definido. El rendimiento absoluto se puede expresar como nanogramos por microlitro (ng/pl) o gramos por litro (g/l). El rendimiento puede expresarse de manera alternativa como tasa de productividad celular específica (Ypxt).

Preferentemente, el rendimiento de la proteína deseada es al menos un 2 % superior al rendimiento (g/l o Y^pxt) de una célula hospedadora fúngica de referencia, tal como una célula hospedadora fúngica que tiene una proteína Gsh1 de tipo silvestre, tal como la SEQ ID NO: 2, preferentemente al menos un 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12,5, 15, 17,5, 20, 22,5, 25, 27,5, 30, 35, 40, 45 o al menos un 50 % superior. Una célula hospedadora fúngica de referencia preferida tiene una proteína Gsh1 de SEQ ID NO: 2.

Preferentemente, el rendimiento de la proteína deseada es al menos un 2 % superior al rendimiento (g/l o Ypxt) de una célula hospedadora fúngica de referencia, tal como una célula hospedadora fúngica que tiene una proteína Not4 de tipo silvestre, tal como la SEQ ID NO: 6, preferentemente al menos un 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12,5, 15, 17,5, 20, 22,5, 25, 27,5, 30, 35, 40, 45 o al menos un 50 % superior. Una célula hospedadora fúngica de referencia preferida tiene una proteína Not4 de SEQ ID NO: 6.

Preferentemente, el rendimiento de la proteína deseada es al menos un 2 % superior al rendimiento (g/l o Y^pxt) de una célula hospedadora fúngica de referencia, tal como una célula hospedadora fúngica que tiene una proteína Gsh1 de tipo silvestre, tal como la SEQ ID NO: 2, y una proteína Not4 de tipo silvestre, tal como la SEQ ID NO: 6, preferentemente al menos un 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12,5, 15, 17,5, 20, 22,5, 25, 27,5, 30, 35, 40, 45 o al menos un 50 % superior. Una célula hospedadora fúngica de referencia preferida tiene una proteína Gsh1 de SEQ ID NO: 2 y una proteína Not4 de SEQ ID No : 6.

La proteína deseada puede ser como se describe anteriormente, especialmente una albúmina o variante, fragmento y/o fusión de la misma.

Un tercer aspecto de la invención proporciona una proteína deseada (tal como una proteína heteróloga) producida por el método de acuerdo con el primer o el segundo aspecto de la invención.

La invención también proporciona una composición, tal como una composición farmacéutica, que comprende la proteína deseada del tercer aspecto de la invención. La composición farmacéutica puede comprender uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, tales como los aprobados por una autoridad reguladora, tal como la US Food and Drug Administration o la European Medicines Agency. La invención proporciona además un método para tratar a un paciente que comprende administrar una cantidad eficaz de la composición farmacéutica al paciente. Como un cuarto aspecto de la invención, el primer y/o segundo aspecto pueden incluir la preparación de una célula hospedadora fúngica como se describe anteriormente o un cultivo como se describe anteriormente en el que el método comprende modificar de manera genética una célula hospedadora fúngica (precursora), modificar la proteína Gsh1 resultante, reducir el nivel de actividad de la proteína Gsh1, modificar un gen GSH1 o una secuencia de control del mismo o reducir el nivel de expresión de un gen GSH1. De manera opcional, el método también puede comprender modificar de manera genética la célula hospedadora fúngica (precursora) para modificar la proteína Not4 resultante, modificar, por ejemplo, reducir, el nivel de actividad de la proteína Not4, modificar un gen NOT4 o una secuencia de control del mismo o modificar el nivel de expresión de un gen NOT4. Las mutaciones, eliminaciones y la modificación de los niveles de actividad y/o expresión pueden ser como se describe anteriormente para la célula hospedadora fúngica o para el cultivo, o como se describe para el primer aspecto de la invención. En la materia se conocen métodos para genomanipular células hospedadoras. Como alternativa a la modificación genética de la célula hospedadora, puede modificarse el nivel o actividad de la proteína Gsh1 mediante la adición de un inhibidor o potenciador al medio de crecimiento. Del mismo modo, como una alternativa a la modificación genética de la célula hospedadora, puede modificarse el nivel o actividad de la proteína Not4 mediante la adición de un inhibidor o potenciador al medio de crecimiento.

Los inventores también divulgan una proteína Gsh1 que comprende al menos un 50 % de identidad con la SEQ ID NO: 2 y una mutación en una posición correspondiente a una o más posiciones seleccionadas de 47, 48, 49, 50, 51, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 409, 451, 452, 453, 454 y 455 de la SEQ ID NO: 2, preferentemente una posición seleccionada de (a) 57 a 51; (b) 120 a 130; (c) 409 o (d) 451 a 455. En particular, se prefiere una mutación en una posición correspondiente a la posición 125 de la SEQ ID NO: 2.

La proteína Gsh1 divulgada puede ser como se describe en relación con las células hospedadoras fúngicas descritas anteriormente. Preferentemente, la proteína Gsh1 comprende o consiste en la SEQ ID NO: 4. La proteína Gsh1 puede ser o no una proteína aislada.

Los inventores también divulgan un polinucleótido que codifica una variante de Gsh1 de la presente invención, tal como una variante de la SEQ ID NO: 2 que da como resultado un nivel menor de expresión de la proteína Gsh1 y/o un nivel menor de actividad de la proteína Gsh1, que una célula hospedadora que codifica una proteína Gsh1 de tipo silvestre tal como la SEQ ID NO: 2. Dichas proteínas Gsh1 se describen en relación con la célula hospedadora fúngica como se describe anteriormente, en relación con el cultivo como se describe anteriormente y en relación con los aspectos primero a cuarto de la invención.

Un polinucleótido preferido codifica una proteína Gsh1 con la mutación R125G (SEQ ID NO: 4), un ejemplo de dicha secuencia de polinucleótidos se proporciona mediante la SEQ ID NO: 3.

Por ejemplo, la presente invención también se refiere a construcciones de ácidos nucleicos que comprenden un polinucleótido que codifica una variante de Gsh1 de la presente invención unida de manera operativa a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula hospedadora adecuada en condiciones compatibles con las secuencias de control. Las secuencias de control adecuadas se describen en relación con la célula hospedadora fúngica, en relación con el cultivo, en relación con los aspectos primero a tercero de la invención, en relación con el método de preparación de un hospedador como se describe anteriormente y en relación con la proteína Gsh1 como se describe anteriormente.

La construcción de ácido nucleico puede comprender adicionalmente un polinucleótido que codifica una variante de Not4 de la presente invención unido de manera operativa a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula hospedadora adecuada en condiciones compatibles con las secuencias de control. Las secuencias de control adecuadas se describen en relación con la célula hospedadora fúngica, en relación con el cultivo y en relación con los aspectos primero a cuarto de la invención.

El(los) polinucleótido(s) puede(n) ubicarse en un vector o en el genoma de la célula hospedadora.

Por consiguiente, la presente invención también se refiere a vectores recombinantes que comprenden un polinucleótido que codifica una variante de Gsh1 de la presente invención, un promotor y señales de terminación de la transcripción y la traducción. De manera opcional, el vector comprende además un polinucleótido que codifica una variante de Not4 de la presente invención, un promotor y señales de terminación de la transcripción y la traducción. La Gsh1 puede estar codificada en el mismo polinucleótido (por ejemplo, vector) o en un polinucleótido diferente (por ejemplo, vector) a Not4. La invención también se refiere a vectores que comprenden un polinucleótido que codifica Gsh1 y una o más (por ejemplo, varias) secuencias de control que provocan que se reduzca el nivel de Gsh1 o la actividad de Gsh1. De manera opcional, los polinucleótidos (por ejemplo, vectores) comprenden además un polinucleótido que codifica Not4 y una o más (por ejemplo, varias) secuencias de control que provocan que se modifique, por ejemplo, que se reduzca, el nivel de Not4 o la actividad de Not4. Las diversas secuencias de nucleótidos y de control pueden estar unidas entre sí para producir un vector recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución del polinucleótido que codifica la variante en dichos sitios. De manera alternativa, el polinucleótido puede expresarse mediante la inserción del polinucleótido o una construcción de ácido nucleico que comprende el polinucleótido en un vector adecuado para la expresión. En la creación del vector, la secuencia codificante se ubica en el vector de manera que la secuencia codificante esté unida de manera operativa a las secuencias de control adecuadas para la expresión.

El vector recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que pueda someterse de manera conveniente a procedimientos de ADN recombinante y pueda provocar la expresión del polinucleótido. La elección del vector normalmente dependerá de la compatibilidad del vector con la célula hospedadora en la que ha de introducirse el vector. El vector puede ser un plásmido lineal o circular cerrado.

El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para garantizar la autorreplicación. De manera alternativa, el vector puede ser uno que, cuando se introduzca en la célula hospedadora, se integre en el genoma y se replique junto con el cromosoma o cromosomas en los que se ha integrado. Además, se pueden usar un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total a introducir en el genoma de la célula huésped o un transposón.

El vector contiene preferentemente uno o más marcadores seleccionables que permiten la selección de células transformadas, transfectadas, transducidas o similares. Un marcador seleccionable es un gen, cuyo producto proporciona biocidas o resistencia vírica, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxótrofos y similares.

El vector contiene, preferentemente, un elemento o elementos que permiten la integración del vector en el genoma de la célula hospedadora o la replicación autónoma del vector en la célula de manera independiente del genoma. Para la integración en el genoma de la célula hospedadora, el vector puede basarse en la secuencia del polinucleótido que codifica la variante o cualquier otro elemento del vector para su integración en el genoma mediante recombinación homóloga o no homóloga. De manera alternativa, el vector puede contener polinucleótidos adicionales para dirigir la integración mediante recombinación homóloga en el genoma de la célula hospedadora en una o más ubicaciones precisas en el o los cromosomas. Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos integracionales deberían contener un número suficiente de ácidos nucleicos, tal como de 100 a 10.000 pares de bases, de 400 a 10.000 pares de bases, y de 800 a 10.000 pares de bases, que tienen un alto grado de identidad de secuencia con la secuencia diana correspondiente para mejorar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga con la secuencia diana en el genoma de la célula hospedadora. Además, los elementos integracionales pueden ser polinucleótidos no codificantes o codificantes. Por otro lado, el vector puede integrarse en el genoma de la célula hospedadora mediante recombinación no homóloga.

Para la replicación autónoma, el vector puede comprender adicionalmente un origen de replicación que permita al vector replicarse de manera autónoma en la célula hospedadora en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador plasmídico que medie la replicación autónoma que funciona en una célula. La expresión "origen de replicación" o "replicador plasmídico" significa un polinucleótido que permite que un plásmido o vector se replique in vivo.

Son ejemplos de orígenes de replicación para su uso en una célula hospedadora de levadura el origen de replicación de 2 micrómetros, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3, y la combinación de ARS4 y CEN6.

Son ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula de hongo filamentoso AMA1 y ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; documento WO00/24883). El aislamiento del gen AMA1 y la construcción de plásmidos o vectores que comprenden el gen puede conseguirse de acuerdo con los métodos divulgados en el documento WO00/24883.

Más de una copia de un polinucleótido de la presente invención se puede insertar en una célula hospedadora para aumentar la producción de una proteína deseada. Se puede obtener un aumento en el número de copias del polinucleótido mediante la integración de al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula hospedadora o mediante la inclusión de un gen marcador seleccionable amplificable con el polinucleótido donde las células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable y, por tanto, copias adicionales del polinucleótido, se pueden seleccionar mediante el cultivo de las células en presencia del agente seleccionable adecuado.

Los procedimientos utilizados para unir los elementos descritos anteriormente para construir los vectores recombinantes de la presente invención son conocidos para un experto en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2.a edición, Cold Spring Harbor, Nueva York).

Realizaciones preferentes

1. Una célula hospedadora fúngica que tiene:

a. una proteína Gsh1 modificada que tiene un nivel reducido de actividad en relación con la actividad de una proteína Gsh1 de tipo silvestre de una célula hospedadora fúngica de referencia por lo demás idéntica, y/o b. un nivel de actividad o nivel reducido de expresión de la proteína Gsh1 en relación con la actividad de una proteína Gsh1 de tipo silvestre de una célula hospedadora fúngica de referencia por lo demás idéntica, y/o c. un gen GSH1 modificado que tiene un nivel reducido de actividad en relación con la actividad de un gen GSH1 de tipo silvestre de una célula hospedadora fúngica de referencia por lo demás idéntica, y/o d. un nivel reducido de expresión del gen GSH1 en relación con el nivel de expresión de un gen GSH1 de tipo silvestre de una célula hospedadora fúngica de referencia por lo demás idéntica

en donde

(i) la proteína heteróloga es una proteína vegetal o animal, y/o

(ii) el cultivo es a una escala de al menos 1 litro, y/o

(iii) el método comprende además purificar la proteína heteróloga, y/o

(iv) el método comprende además formular la proteína heteróloga con un vehículo o diluyente terapéuticamente aceptable para producir así un producto terapéutico adecuado para la administración a un ser humano o un animal.

2. La célula hospedadora fúngica de la realización 1, en donde el nivel modificado es relativo al nivel de una célula hospedadora fúngica de referencia, tal como:

a. una célula hospedadora fúngica en la que la proteína Gsh1 comprende o consiste en la SEQ ID NO: 2, b. S288C de S. cerevisiae o

c. DXY1 de S. cerevisiae.

3. El hospedador fúngico de cualquiera de las realizaciones 1 o 2 que tiene una modificación en:

e. la proteína Not4, y/o

f. el nivel de actividad o nivel de expresión de la proteína Not4, y/o

g. el gen NOT4 y/o

h. el nivel de expresión del gen NOT4.

4. La célula hospedadora fúngica de la realización 3, en donde el nivel modificado es un nivel reducido.

5. La célula hospedadora fúngica de la realización 3, en donde el nivel modificado es un nivel aumentado.

6. La célula hospedadora fúngica de la realización 3 o 4, en donde el nivel modificado es relativo al nivel de una célula hospedadora fúngica de referencia, tal como:

a. una célula hospedadora fúngica en la que la proteína Not4 es una proteína Not4 de tipo silvestre, b. una célula hospedadora fúngica en la que la proteína Not4 comprende o consiste en la SEQ ID NO: 6, c. S288C de S. cerevisiae o

d. DXY1 de S. cerevisiae.

7. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquier realización anterior, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína deseada tal como una proteína heteróloga.

8. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 7 en la que la proteína deseada se selecciona de albúmina, un anticuerpo monoclonal, un etopósido, una proteína sérica (tal como un factor de coagulación de la sangre), antiestasina, un péptido anticoagulante de garrapatas, transferrina, lactoferrina, endostatina, angiostatina, colágenos, inmunoglobulinas o moléculas basadas en inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (por ejemplo, un Small Modular ImmunoPharmaceutical™ ("SMIP") o dAb, fragmentos Fab', F(ab')2, scAb, scFv o fragmento scFv), una proteína con dominio Kunitz (tal como las descritas en el documento WO03/066824, con o sin fusiones de albúmina), interferones, interleucinas, IL-10, IL-11, IL-2, especies y subespecies de interferón a (alfa), especies y subespecies de interferón p (beta), especies y subespecies de interferón ^y (gamma), leptina, CNTF, CNTF^ax15, antagonista del receptor de IL-1, eritropoyetina (EPO) e imitadores de EPO, trombopoyetina (TPO) e imitadores de TPO, prosaptida, cianovirina-N, 5 hélices, péptido T20, péptido T1249, gp41 del VIH, gp120 del VIH, urocinasa, prourocinasa, tPA, hirudina, factor de crecimiento procedente de plaquetas, hormona paratiroidea, proinsulina, insulina, glucagón, péptidos similares al glucagón tales como exendina-4, GLP-1 o GLP-2, factor de crecimiento de tipo insulina, calcitonina, hormona del crecimiento, factor de crecimiento transformante p (beta), factor de necrosis tumoral, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, FGF, factores de coagulación en formas tanto pre como activas, que incluyen, pero sin limitación, plasminógeno, fibrinógeno, trombina, pretrombina, protrombina, factor von Willebrand, antitripsina a-i, activadores de plasminógeno, factor VII, factor VIII, factor IX, factor X y factor XIII, factor de crecimiento nervioso, LACI, factor de crecimiento de células endoteliales procedente de plaquetas (PD-ECGF), glucosa oxidasa, colinesterasa sérica, aprotinina, proteína precursora de amiloide, inhibidor de intertripsina a, antitrombina III, especies de apolipoproteínas, proteína C, proteína S, un metabolito, un antibiótico o una variante o fragmento de cualquiera de los anteriores.

9. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 7 u 8 en la que la proteína deseada comprende o consiste en una albúmina, variante, fragmento y/o fusión de la misma.

10. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 9 en la que la albúmina o variante, fragmento y/o fusión de la misma tiene al menos un 70 % de identidad con la SEQ ID NO: 10.

11. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 9 en la que la albúmina o variante, fragmento y/o fusión de la misma tiene al menos un 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 10.

12. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 11 en la que la albúmina o variante, fragmento y/o fusión de la misma tiene al menos un 70 % de identidad con la SEQ ID NO: 10, preferentemente al menos un 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 10 y comprende A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y en una posición correspondiente a K573 de la SEQ ID NO: 10.

13. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 12 en la que la albúmina o variante, fragmento y/o fusión de la misma comprende una P, H, W o Y en una posición correspondiente a K573 de la SEQ ID NO: 10.

14. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 13 en la que la variante de albúmina, fragmento y/o fusión de la misma tiene al menos un 98 % de identidad con la SEQ ID NO: 10 y comprende una P en una posición correspondiente a K573 de la SEQ ID NO: 10.

15. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 11 a 14 en la que la albúmina o variante, fragmento y/o fusión de la misma tiene al menos un 70% de identidad con la s Eq ID NO: 10, preferentemente al menos un 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 10 y comprende A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y en una posición correspondiente a E492 de la SEQ ID NO: 10.

16. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 15 en la que la albúmina o variante, fragmento y/o fusión de la misma comprende una G, D, F, H, M o R en una posición correspondiente a E492 de la SEQ ID NO: 10.

17. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 16 en la que la variante de albúmina, fragmento y/o fusión de la misma tiene al menos un 98 % de identidad con la SEQ ID NO: 10 y comprende una G o D en una posición correspondiente a E492 de la SEQ ID NO: 10.

18. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 17 en la que la variante de albúmina, fragmento y/o fusión de la misma tiene al menos un 98 % de identidad con la SEQ ID NO: 10 y comprende una G en una posición correspondiente a E492 de la SEQ ID NO: 10.

19. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 11 a 18 en la que la albúmina o variante, fragmento y/o fusión de la misma tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID NO: 10, preferentemente al menos un 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 10 y comprende A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y en una posición correspondiente a K574 de la SEQ ID NO: 10.

20. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 19 en la que la albúmina o variante, fragmento y/o fusión de la misma comprende una H, G, D, F, N, S o Y en una posición correspondiente a K574 de la SEQ ID NO: 10.

21. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 21 en la que la variante de albúmina, fragmento y/o fusión de la misma tiene al menos un 98 % de identidad con la SEQ ID NO: 10 y comprende una D, F, G o H en una posición correspondiente a K574 de la SEQ ID NO: 10.

22. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 21 en la que la variante de albúmina, fragmento y/o fusión de la misma tiene al menos un 98 % de identidad con la SEQ ID NO: 10 y comprende una H en una posición correspondiente a K574 de la SEQ ID NO: 10.

23. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 11 a 22 en la que la albúmina o variante, fragmento y/o fusión de la misma tiene al menos un 70% de identidad con la s Eq ID NO: 10, preferentemente al menos un 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 10 y comprende A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W o Y en una posición correspondiente a Q580 de la SEQ ID NO: 10.

24. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 23 en la que la albúmina o variante, fragmento y/o fusión de la misma comprende una K o R en una posición correspondiente a Q580 de la SEQ ID NO: 10. 25. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 24 en la que la variante de albúmina, fragmento y/o fusión de la misma tiene al menos un 98 % de identidad con la SEQ ID NO: 10 y comprende una K en una posición correspondiente a K573 de la SEQ ID NO: 10.

26. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 11 a 24 en la que la fusión de albúmina comprende la variante de albúmina de SEQ ID NO: 45.

27. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 11 a 24 en la que la variante de albúmina comprende o consiste en la SEQ ID NO: 45.

28. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 9 a 27 en la que la fusión comprende un compañero de fusión que no es albúmina o una variante o un fragmento o fusión de la misma. 29. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 10 a 28 en la que la fusión comprende un compañero de fusión seleccionado de anticuerpo monoclonal, un etopósido, una proteína sérica (tal como un factor de coagulación de la sangre), antiestasina, un péptido anticoagulante de garrapatas, transferrina, lactoferrina, endostatina, angiostatina, colágenos, inmunoglobulinas o moléculas basadas en inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (por ejemplo, un Small Modular ImmunoPharmaceutical™ ("SMIP") o dAb, fragmentos Fab', F(ab')2, scAb, scFv o fragmento scFv), una proteína con dominio Kunitz (tal como las descritas en el documento WO03/066824, interferones, interleucinas, IL-10, IL-11, IL-2, especies y subespecies de interferón a (alfa), especies y subespecies de interferón p (beta), especies y subespecies de interferón ^y (gamma), leptina, CNTF, CNTF^ax15, antagonista del receptor de IL-1, eritropoyetina (EPO) e imitadores de EPO, trombopoyetina (TPO) e imitadores de TPO, prosaptida, cianovirina-N, 5 hélices, péptido T20, péptido T1249, gp41 del VIH, gp120 del VIH, urocinasa, prourocinasa, tPA, hirudina, factor de crecimiento procedente de plaquetas, hormona paratiroidea, proinsulina, insulina, glucagón, péptidos similares al glucagón tales como exendina-4, GLP-1 o GLP-2, factor de crecimiento de tipo insulina, calcitonina, hormona del crecimiento, factor de crecimiento transformante p (beta), factor de necrosis tumoral, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, FGF, factores de coagulación en formas tanto pre como activas, que incluyen, pero sin limitación, plasminógeno, fibrinógeno, trombina, pretrombina, protrombina, factor von Willebrand, antitripsina ai, activadores de plasminógeno, factor VII, factor VIII, factor IX, factor X y factor XIII, factor de crecimiento nervioso, LACI, factor de crecimiento de células endoteliales procedente de plaquetas (PD-ECGF), glucosa oxidasa, colinesterasa sérica, aprotinina, proteína precursora de amiloide, inhibidor de intertripsina a, antitrombina III, especies de apolipoproteínas, proteína C, proteína S, un metabolito, un antibiótico o una variante o fragmento de cualquiera de los anteriores.

30. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 28 o 29 en la que el compañero de fusión comprende o consiste en una proteína similar al glucagón o un análogo de la misma.

31. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 30 en la que el compañero de fusión comprende o consiste en la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 51 o SEQ ID NO: 52.

32. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 7 a 31 en la que la proteína deseada comprende o consiste en la SEQ ID NO: 16.

33. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquier realización anterior en la que el nivel de actividad y/o el nivel reducido de expresión de la proteína Gsh1 es relativo al nivel de actividad o al nivel de expresión de la proteína Gsh1 de una célula hospedadora fúngica precursora tal como una célula hospedadora fúngica de tipo silvestre.

34. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 33, en la que el nivel de actividad y/o el nivel de expresión de la proteína Gsh1 se reduce a no más del 99 % del nivel de actividad o del nivel de expresión de la proteína Gsh1 de la célula hospedadora fúngica precursora.

35. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 34, en la que el nivel de actividad y/o el nivel de expresión de la proteína Gsh1 se reduce a no más del 95 % del nivel de actividad o del nivel de expresión de la proteína Gsh1 de la célula hospedadora fúngica precursora.

36. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 35, en la que el nivel de actividad y/o el nivel de expresión de la proteína Gsh1 se reduce a no más del 90 % del nivel de actividad o del nivel de expresión de la proteína Gsh1 de la célula hospedadora fúngica precursora.

37. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 36, en la que el nivel de actividad y/o el nivel de expresión de la proteína Gsh1 se reduce a no más del 80 % del nivel de actividad o del nivel de expresión de la proteína Gsh1 de la célula hospedadora fúngica precursora.

38. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 37, en la que el nivel de actividad y/o el nivel de expresión de la proteína Gsh1 se reduce a no más del 70 % del nivel de actividad o del nivel de expresión de la proteína Gsh1 de la célula hospedadora fúngica precursora.

39. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 38, en la que el nivel de actividad y/o el nivel de expresión de la proteína Gsh1 se reduce a no más del 60 % del nivel de actividad o del nivel de expresión de la proteína Gsh1 de la célula hospedadora fúngica precursora.

40. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 39 en la que el nivel de actividad y/o el nivel de expresión de la proteína Gsh1 se reduce a no más del 50 % del nivel de actividad o del nivel de expresión de la proteína Gsh1 de la célula hospedadora fúngica precursora.

41. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 40, en la que el nivel de actividad y/o el nivel de expresión de la proteína Gsh1 se reduce a no más del 40 % del nivel de actividad o del nivel de expresión de la proteína Gsh1 de la célula hospedadora fúngica precursora.

42. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 41, en la que el nivel de actividad y/o el nivel de expresión de la proteína Gsh1 se reduce a no más del 30 %, preferentemente no más del 20 %, del nivel de actividad o del nivel de expresión de la proteína Gsh1 de la célula hospedadora fúngica precursora.

43. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 42, en la que el nivel de actividad y/o el nivel de expresión de la proteína Gsh1 se reduce sustancialmente al 0 % del nivel de actividad o del nivel de expresión de la proteína Gsh1 de la célula hospedadora fúngica precursora.

44. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquier realización anterior, en la que la célula hospedadora carece de un gen GSH1 funcional o una proteína Gsh1 funcional.

45. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquier realización anterior, en la que la célula hospedadora carece de un gen GSH1 o proteína Gsh1.

46. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquier realización anterior en la que la proteína Gsh1 comprende una mutación en la posición correspondiente a una posición seleccionada de 47, 48, 49, 50, 51, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 409, 451,452, 453, 454 y 455 de la SEQ ID NO: 2.

47. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 46 en la que la posición corresponde a R125 de la SEQ ID NO: 2.

48. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 46 o 47 en la que la posición corresponde a H409 de la SEQ ID NO: 2.

49. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 46 a 48 en la que la posición corresponde a P453 de la SEQ ID NO: 2.

50. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 46 a 49 en la que la mutación es una sustitución, preferentemente por un aminoácido no conservado.

51. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 50 en la que la mutación en una posición correspondiente a la posición 125 de la SEQ ID NO: 2 es una sustitución por A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, preferentemente por C, D, E o G, más preferentemente por G.

52. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 46 a 51 en la que la mutación en una posición correspondiente a la posición 125 de la SEQ ID NO: 2 es de un aminoácido con carga positiva por un aminoácido alifático, aromático, hidrófobo, pequeño, minúsculo, polar o con carga negativa, preferentemente un aminoácido con carga negativa por un aminoácido minúsculo.

53. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 46 a 52 en la que la mutación en una posición correspondiente a la posición D49 de la SEQ ID NO: 2 es una sustitución por A, C, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y, preferentemente por H, K o R, más preferentemente por K o R.

54. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 46 a 53 en la que la mutación en una posición correspondiente a la posición 49 de la SEQ ID NO: 2 es de un aminoácido con carga negativa por un aminoácido con carga positiva.

55. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 46 a 54 en la que la mutación en una posición correspondiente a la posición H409 de la SEQ ID NO: 2 es una sustitución por A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y, preferentemente por A, I, L, V, M, F, W, Y, más preferentemente por A, I, L, V, más preferentemente por L.

56. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 46 a 55 en la que la mutación en una posición correspondiente a la posición H409 de la SEQ ID NO: 2 es de un aminoácido aromático a un aminoácido alifático.

57. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 46 a 56 en la que la mutación en una posición correspondiente a la posición P453 de la SEQ ID NO: 2 es una sustitución por A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W o Y, preferentemente por A, I, L, V, M, F, W, Y, más preferentemente por A, I, L, V, más preferentemente por L.

58. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 46 a 57 en la que la mutación en una posición correspondiente a la posición P453 de la SEQ ID NO: 2 es de un aminoácido aromático a un aminoácido alifático.

59. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquier realización anterior en la que la proteína Gsh1 comprende o consiste en la SEQ ID NO: 4.

60. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquier realización anterior que comprende un gen GSH1 modificado, por ejemplo, un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 4.

61. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 3 a 60 en la que el nivel de actividad o el nivel de expresión modificado de la proteína Not4 está relacionado con el nivel de actividad o el nivel de expresión de la proteína Not4 de una célula hospedadora fúngica precursora tal como una célula hospedadora fúngica de tipo silvestre.

62. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 61, en la que el nivel de actividad y/o el nivel de expresión de la proteína Not4 se reduce a no más del 90 % del nivel de actividad y/o del nivel de expresión de la proteína Not4 de la célula hospedadora fúngica precursora.

63. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 62, en la que el nivel de actividad y/o el nivel de expresión de la proteína Not4 se reduce a no más del 80 % del nivel de actividad y/o del nivel de expresión de la proteína Not4 de la célula hospedadora fúngica precursora.

64. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 63, en la que el nivel de actividad y/o el nivel de expresión de la proteína Not4 se reduce a no más del 70 % del nivel de actividad y/o del nivel de expresión de la proteína Not4 de la célula hospedadora fúngica precursora.

65. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 64, en la que el nivel de actividad y/o el nivel de expresión de la proteína Not4 se reduce a no más del 60 % del nivel de actividad y/o del nivel de expresión de la proteína Not4 de la célula hospedadora fúngica precursora.

66. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 65, en la que el nivel de actividad y/o el nivel de expresión de la proteína Not4 se reduce a no más del 50 % del nivel de actividad y/o del nivel de expresión de la proteína Not4 de la célula hospedadora fúngica precursora.

67. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 66, en la que el nivel de actividad y/o el nivel de expresión de la proteína Not4 se reduce a no más del 40 % del nivel de actividad y/o del nivel de expresión de la proteína Not4 de la célula hospedadora fúngica precursora.

68. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 67, en la que el nivel de actividad y/o el nivel de expresión de la proteína Not4 se reduce a no más del 30 % del nivel de actividad y/o del nivel de expresión de la proteína Not4 de la célula hospedadora fúngica precursora.

69. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 68, en la que el nivel de actividad y/o el nivel de expresión de la proteína Not4 se reduce a no más del 20 % del nivel de actividad y/o del nivel de expresión de la proteína Not4 de la célula hospedadora fúngica precursora.

70. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 69, en la que el nivel de actividad y/o el nivel de expresión de la proteína Not4 se reduce sustancialmente al 0 % del nivel de actividad y/o del nivel de expresión de la proteína Not4 de la célula hospedadora fúngica precursora.

71. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 3 a 70, en la que la célula hospedadora carece de un gen NOT4 funcional o una proteína Not4 funcional.

72. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 3 a 71, en la que la célula hospedadora carece de un gen NOT4 o proteína Not4.

73. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 3 a 72, en la que el gen NOT4 o la proteína Not4 se muta para alterar la interacción de la proteína Not4 con una proteína Not1.

74. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 3 a 73 en la que la proteína Not4 comprende una mutación en la posición correspondiente a una posición seleccionada de 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469 o 470 de la SEQ ID NO: 6.

75. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 74 en la que la posición se selecciona de una posición correspondiente a 429, 430, 434 o 437 de la SEQ ID NO: 6.

76. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 74 o 75 en la que la posición se selecciona de una posición correspondiente a 463, 464 o 466 de la SEQ ID NO: 6.

77. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 74 a 76 en la que la posición se selecciona de una posición correspondiente a 442, 445, 447 o 452 de la SEQ ID NO: 6.

78. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 74 a 77 en la que la mutación es una sustitución, preferentemente por un aminoácido no conservado.

79. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 74 a 78 en la que la mutación en una posición correspondiente a la posición 429 de la SEQ ID NO: 6 es una sustitución de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y, preferentemente por G, A, V, L o I, más preferentemente por I, L o V, más preferentemente por I.

80. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 74 a 79, en la que la mutación en una posición correspondiente a la posición 429 de la SEQ ID NO: 6 es una sustitución de un aminoácido aromático por un aminoácido alifático.

81. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 74 a 80 en la que la proteína Not4 comprende o consiste en la SEQ ID NO: 8.

82. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquier realización anterior que comprende un gen NOT4 modificado, por ejemplo, un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 8.

83. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquier realización anterior en la que la célula hospedadora carece de un gen NOT4 o una proteína Not4.

84. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquier realización anterior, en la que se sobreexpresa una o más de las siguientes chaperonas: AHA1, CCT2, ^c C^t3, CCT4, CCT5, CCT6, CCT7, CCT8, CNS1, CPR3, CPR6, ERO1, EUG1, FMO1, HCH1, HSP10, HSP12, HSP104, HSP26, HSP30, HSP42, HSP60, HSP78, HSP82, JEM1, MDJ1, MDJ2, MPD1, MPD2, PDI1, PFD1, ABC1, APJ1, ATP11, ATP12, BTT1, CDC37, CPR7, HSC82, KAR2, LHS1, MGE1, MRS11, NOB1, ECM10, SSA1, SSA2, SSA3, SSA4, SSC1, SSE2, SIL1, SLS1, ORM1, ORM2, PER1, PTC2, PSE1, UBI4 y HAC1 o una HAC1 truncada sin intrones, TIM9, PAM18, TCP1 o una variante de las mismas.

85. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquier realización anterior en la que KEX2, o una variante o fragmento del mismo, se expresa o se sobreexpresa.

86. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 84 u 85 en la que PDI1 o una variante del mismo se sobreexpresa o ERO1 o una variante del mismo se sobreexpresa.

87. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 84 u 85 en la que PDI1 o una variante del mismo se sobreexpresa y ERO1 o una variante del mismo se sobreexpresa.

88. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 84 u 85 en la que PDI1 o una variante del mismo se sobreexpresa y KEX2 o una variante del mismo se expresa o se sobreexpresa.

89. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 84 u 85 en la que ERO1 o una variante del mismo se sobreexpresa y KEX2 o una variante del mismo se expresa o se sobreexpresa.

90. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 84 a 89 en la que PDI1 o una variante del mismo se sobreexpresa y ERO1 o una variante del mismo se sobreexpresa y KEX2 o una variante del mismo se expresa o se sobreexpresa.

91. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquier realización anterior en la que el hospedador fúngico es una levadura o un hongo filamentoso.

92. La célula hospedadora fúngica, de acuerdo con cualquier realización anterior, en la que la célula hospedadora es un Saccharomyces, Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia.

93. La célula hospedadora fúngica de acuerdo con la realización 92 en la que el Saccharomyces es un Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis, preferentemente Saccharomyces cerevisiae.

94. Un cultivo de células hospedadoras fúngicas que contienen una secuencia polinucleotídica que codifica una proteína deseada, tal como una proteína heteróloga, caracterizada por que las células hospedadoras fúngicas tienen un nivel de actividad y/o un nivel de expresión reducido de la proteína Gsh1.

95. El cultivo de células hospedadoras fúngicas de acuerdo con la realización 94, que tiene un nivel de actividad y/o un nivel de expresión reducido de la proteína Not4.

96. El cultivo de células hospedadoras fúngicas de la realización 94 o 95 en el que las células hospedadoras son como se definen en cualquiera de las realizaciones 1 a 93.

97. Un método para producir una proteína deseada, tal como una proteína heteróloga, de una célula hospedadora fúngica que comprende:

a. proporcionar una célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 92 o un cultivo de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 94 a 96,

b. cultivar la célula hospedadora fúngica o el cultivo para producir la proteína deseada,

c. opcionalmente recuperar la proteína deseada,

d. opcionalmente purificar la proteína deseada,

e. opcionalmente formular la proteína deseada con un vehículo o diluyente terapéuticamente aceptable para producir así un producto terapéutico adecuado para la administración a un ser humano o un animal, y f. opcionalmente proporcionar la proteína deseada en forma de dosificación unitaria.

98. Un método para aumentar el rendimiento de una proteína deseada (tal como una proteína heteróloga) que comprende:

a. proporcionar una célula hospedadora fúngica (tal como una levadura o un hongo filamentoso) que tenga:

1. una proteína Gsh1 modificada que tiene un nivel reducido de actividad en relación con la actividad de una proteína Gsh1 de tipo silvestre de una célula hospedadora fúngica de referencia por lo demás idéntica, y/o

2. un nivel reducido de actividad de la proteína Gsh1 en relación con la actividad de una proteína Gsh1 de tipo silvestre de una célula hospedadora fúngica de referencia por lo demás idéntica, y/o

3. un gen GSH1 modificado que tiene un nivel reducido de actividad en relación con la actividad de un gen GSH1 de tipo silvestre de una célula hospedadora fúngica de referencia por lo demás idéntica, y/o 4. un nivel reducido de expresión del gen GSH1 en relación con el nivel de expresión de un gen GSH1 de tipo silvestre de una célula hospedadora fúngica de referencia por lo demás idéntica,

tal como una célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 92, y

b. cultivar la célula hospedadora para producir la proteína deseada, y

c. opcionalmente recuperar la proteína deseada,

d. opcionalmente purificar la proteína deseada,

e. opcionalmente formular la proteína deseada con un vehículo o diluyente terapéuticamente aceptable para producir así un producto terapéutico adecuado para la administración a un ser humano o un animal, y f. opcionalmente proporcionar la proteína deseada en forma de dosificación unitaria.

99. El método de acuerdo con la realización 97 o 98 en el que el cultivo se realiza en presencia de glutatión. 100. El método de acuerdo con la realización 99 en el que el glutatión está presente en al menos 0,05 mM. 101. El método de acuerdo con la realización 100 en el que el glutatión está presente de aproximadamente 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 mM a aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 mM.

102. El método de acuerdo con la realización 101 en el que el glutatión está presente de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mM.

103. El método de acuerdo con la realización 102 en el que el glutatión está presente de aproximadamente 3 a aproximadamente 7 mM.

104. El método de acuerdo con la realización 103 en el que el glutatión está presente en aproximadamente 5 mM.

105. El método de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 97 a 104 en el que el rendimiento de la proteína deseada es al menos un 2 % superior al rendimiento a partir de una célula hospedadora fúngica de referencia tal como una célula hospedadora fúngica que tiene una proteína Gsh1 de tipo silvestre, tal como la SEQ ID NO: 2.

106. El método de acuerdo con la realización 105 en el que el rendimiento es al menos un 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12.5, 15, 17,5, 20, 22,5, 25, 27,5, 30, 35, 40, 45 o al menos un 50 % superior al rendimiento a partir de una célula hospedadora fúngica de referencia.

107. El método de acuerdo con la realización 105 o 106 en el que el rendimiento de la proteína deseada es al menos un 2 % superior al rendimiento a partir de una célula hospedadora fúngica de referencia tal como una célula hospedadora fúngica que tiene una proteína Gsh1 de SEQ iD NO: 2.

108. El método de acuerdo con la realización 107 en el que el rendimiento es al menos un 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12.5, 15, 17,5, 20, 22,5, 25, 27,5, 30, 35, 40, 45 o al menos un 50 % superior al rendimiento a partir de una célula hospedadora fúngica de referencia.

109. El método de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 97 a 108, en el que la célula hospedadora fúngica tiene una modificación en:

1. la proteína Not4, y/o

2. el nivel de actividad (preferentemente reducido) de la proteína Not4, y/o

3. el gen NOT4 y/o

4. el nivel de expresión (preferentemente reducido) del gen NOT4

tal como una célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 3 a 93.

110. El método de acuerdo con la realización 109 en el que el rendimiento de la proteína deseada es al menos un 2 % superior al rendimiento a partir de una célula hospedadora fúngica de referencia tal como una célula hospedadora fúngica que tiene una proteína Not4 de tipo silvestre, tal como la SEQ ID NO: 6.

111. El método de acuerdo con la realización 110 en el que el rendimiento es al menos un 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12.5, 15, 17,5, 20, 22,5, 25, 27,5, 30, 35, 40, 45 o al menos un 50 % superior al rendimiento a partir de una célula hospedadora fúngica de referencia tal como una célula hospedadora fúngica que tiene una proteína Not4 de tipo silvestre, tal como la SEQ ID NO: 6.

112. El método de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 109 a 111 en el que el rendimiento de la proteína deseada es al menos un 2 % superior al rendimiento a partir de una célula hospedadora fúngica de referencia tal como una célula hospedadora fúngica que tiene una proteína Gsh1 de SEQ ID NO: 2.

113. El método de acuerdo con la realización 112 en el que el rendimiento es al menos un 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12.5, 15, 17,5, 20, 22,5, 25, 27,5, 30, 35, 40, 45 o al menos un 50 % superior al rendimiento a partir de una célula hospedadora fúngica de referencia tal como una célula hospedadora fúngica que tiene la proteína Gsh1 de SEQ ID NO: 2.

114. El método de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 109 a 113 en el que el rendimiento de la proteína deseada es al menos un 2 % superior al rendimiento a partir de una célula hospedadora fúngica de referencia tal como una célula hospedadora fúngica que tiene la proteína Gsh1 de SEQ ID NO: 2 y la proteína Not4 de SEQ ID NO: 6.

115. El método de acuerdo con la realización 114 en el que el rendimiento de la proteína deseada es al menos un 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12,5, 15, 17,5, 20, 22,5, 25, 27,5, 30, 35, 40, 45 o al menos un 50% superior al rendimiento a partir de una célula hospedadora fúngica de referencia tal como una célula hospedadora fúngica que tiene la proteína Gsh1 de SEQ ID N^o : 2 y la proteína Not4 de SEQ ID NO: 6.

116. El método de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 97 a 115 en el que la proteína deseada se selecciona de albúmina, un anticuerpo monoclonal, un etopósido, una proteína sérica (tal como un factor de coagulación de la sangre), antiestasina, un péptido anticoagulante de garrapatas, transferrina, lactoferrina, endostatina, angiostatina, colágenos, inmunoglobulinas o moléculas basadas en inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (por ejemplo, un Small Modular ImmunoPharmaceutical™ ("SMIP") o dAb, fragmentos Fab', F(ab')2, scAb, scFv o fragmento scFv), una proteína con dominio Kunitz (tal como las descritas en el documento WO03/066824, con o sin fusiones de albúmina), interferones, interleucinas, IL-10, IL-11, IL-2, especies y subespecies de interferón a (alfa), especies y subespecies de interferón p (beta), especies y subespecies de interferón ^y (gamma), leptina, CNTF, CNTF^ax15, antagonista del receptor de IL-1, eritropoyetina (EPO) e imitadores de EPO, trombopoyetina (TPO) e imitadores de TPO, prosaptida, cianovirina-N, 5 hélices, péptido T20, péptido T1249, gp41 del VIH, gp120 del VIH, urocinasa, prourocinasa, tPA, hirudina, factor de crecimiento procedente de plaquetas, hormona paratiroidea, proinsulina, insulina, glucagón, péptidos similares al glucagón tales como exendina-4, GLP-1 o GLP-2, factor de crecimiento de tipo insulina, calcitonina, hormona del crecimiento, factor de crecimiento transformante p (beta), factor de necrosis tumoral, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, FGF, factores de coagulación en formas tanto pre como activas, que incluyen, pero sin limitación, plasminógeno, fibrinógeno, trombina, pretrombina, protrombina, factor von Willebrand, antitripsina a-i, activadores de plasminógeno, factor VII, factor VIII, factor IX, factor X y factor XIII, factor de crecimiento nervioso, LACI, factor de crecimiento de células endoteliales procedente de plaquetas (PD-ECGF), glucosa oxidasa, colinesterasa sérica, aprotinina, proteína precursora de amiloide, inhibidor de intertripsina a, antitrombina III, especies de apolipoproteínas, proteína C, proteína S, un metabolito, un antibiótico o una variante o fragmento de cualquiera de los anteriores.

117. El método de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 97 a 116 en el que la proteína deseada comprende o consiste en una albúmina o variante, fragmento y/o fusión de la misma.

118. El método de acuerdo con la realización 117 en el que la albúmina o variante, fragmento y/o fusión de la misma tiene al menos un 70 % de identidad con la SEQ ID NO: 10.

119. El método de acuerdo con la realización 118 en el que la albúmina o variante, fragmento y/o fusión de la misma tiene al menos un 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 10. 120. El método de acuerdo con la realización 119 en el que la albúmina o variante, fragmento y/o fusión de la misma tiene al menos un 70 % de identidad con la SEQ ID NO: 10, preferentemente al menos un 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 10 y comprende una A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y en una posición correspondiente a K573 de la SEQ ID NO: 10.

121. El método de acuerdo con la realización 120 en el que la albúmina o variante, fragmento y/o fusión de la misma comprende una P, H, W o Y en una posición correspondiente a K573 de la SEQ ID NO: 10.

122. El método de acuerdo con la realización 121 en el que la albúmina o variante, fragmento y/o fusión de la misma tiene al menos un 98% de identidad con la SEQ ID NO: 10 y comprende una P en una posición correspondiente a K573 de la SEQ ID NO: 10.

123. El método de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 117 a 122 en el que la fusión comprende un compañero de fusión que no es albúmina o una variante, fragmento y/o fusión de la misma.

124. El método de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 118 a 123 en el que la fusión comprende un compañero de fusión seleccionado de anticuerpo monoclonal, un etopósido, una proteína sérica (tal como un factor de coagulación de la sangre), antiestasina, un péptido anticoagulante de garrapatas, transferrina, lactoferrina, endostatina, angiostatina, colágenos, inmunoglobulinas o moléculas basadas en inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (por ejemplo, un Small Modular ImmunoPharmaceutical™ ("SMIP") o dAb, fragmentos Fab', F(ab')2, scAb, scFv o fragmento scFv), una proteína con dominio Kunitz (tal como las descritas en el documento WO03/066824, interferones, interleucinas, IL-10, IL-11, IL-2, especies y subespecies de interferón a (alfa), especies y subespecies de interferón p (beta), especies y subespecies de interferón y (gamma), leptina, CNTF, CNTF^ax15, antagonista del receptor de IL-1, eritropoyetina (EPO) e imitadores de EPO, trombopoyetina (TPO) e imitadores de TPO, prosaptida, cianovirina-N, 5 hélices, péptido T20, péptido T1249, gp41 del VIH, gp120 del VIH, urocinasa, prourocinasa, tPA, hirudina, factor de crecimiento procedente de plaquetas, hormona paratiroidea, proinsulina, insulina, glucagón, péptidos similares al glucagón tales como exendina-4, GLP-1 o GLP-2, factor de crecimiento de tipo insulina, calcitonina, hormona del crecimiento, factor de crecimiento transformante p (beta), factor de necrosis tumoral, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, FGF, factores de coagulación en formas tanto pre como activas, que incluyen, pero sin limitación, plasminógeno, fibrinógeno, trombina, pretrombina, protrombina, factor von Willebrand, antitripsina ai, activadores de plasminógeno, factor VII, factor VIII, factor IX, factor X y factor XIII, factor de crecimiento nervioso, LACI, factor de crecimiento de células endoteliales procedente de plaquetas (PD-ECGF), glucosa oxidasa, colinesterasa sérica, aprotinina, proteína precursora de amiloide, inhibidor de intertripsina a, antitrombina III, especies de apo-lipoproteínas, proteína C, proteína S, un metabolito, un antibiótico o una variante o fragmento de cualquiera de los anteriores.

125. El método de acuerdo con la realización 124 en el que el compañero de fusión comprende o consiste en una proteína similar al glucagón o un análogo de la misma.

126. El método de acuerdo con la realización 125 en el que el compañero de fusión comprende o consiste en la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 51 o SEQ ID NO: 52.

127. El método de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 116 a 126 en el que la proteína deseada comprende o consiste en la SEQ ID NO: 16.

128. El método de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 97 a 127 en el que la célula hospedadora se cultiva a una escala de al menos 1 l.

129. El método de acuerdo con la realización 128 en el que la célula hospedadora se cultiva a una escala de al menos 2 l.

130. El método de acuerdo con la realización 129 en el que la célula hospedadora se cultiva a una escala de al menos 5 l.

131. El método de acuerdo con la realización 130 en el que la célula hospedadora se cultiva a una escala de al menos 10 l.

132. El método de acuerdo con la realización 131 en el que la célula hospedadora se cultiva a una escala de al menos 1000 l.

133. El método de acuerdo con la realización 132 en el que la célula hospedadora se cultiva a una escala de al menos 5000 l.

134. El método de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 97 a 133 en el que la proteína deseada se secreta a partir de la célula hospedadora fúngica.

135. El método de acuerdo con la realización 134 en el que la proteína deseada resulta de una proteína inmadura que comprende un péptido señal.

136. El método de acuerdo con la realización 135 en el que el péptido señal comprende o consiste en la SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 42 o un péptido señal que comprende el motivo pentapeptídico de SEQ ID NO: 20. 137. El método de acuerdo con la realización 136 en el que el péptido señal comprende o consiste en la SEQ ID NO: 19.

138. El método de acuerdo con la realización 136 en el que el péptido señal comprende o consiste en la SEQ ID NO: 24.

139. El método de acuerdo con la realización 136 en el que el péptido señal comprende o consiste en la SEQ ID NO: 42.

140. El método de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 97 a 133 en el que la proteína deseada es intracelular.

141. Una proteína deseada (tal como una proteína heteróloga) producida por el método de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 97 a 140.

142. La proteína deseada de acuerdo con la realización 141 para profilaxis, terapia o diagnóstico.

143. Una composición, tal como una composición farmacéutica, que comprende la proteína deseada de acuerdo con la realización 141 o 142 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

144. Un método de tratamiento que comprende administrar la proteína deseada de la realización 143 o 144 o la composición de la realización 143 a un paciente.

145. Un método para preparar una célula hospedadora fúngica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 93 o un cultivo de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 94 a 96, comprendiendo el método modificar de manera genética una célula hospedadora fúngica (precursora) para reducir el nivel de expresión y/o el nivel de actividad de la proteína Gsh1.

146. El método de acuerdo con la realización 145, que comprende además modificar de manera genética una célula hospedadora fúngica (precursora) para reducir el nivel de expresión y/o el nivel de actividad de la proteína Not4.

147. Uso de un medio para reducir el nivel de expresión y/o el nivel de actividad de la proteína Gsh1 en una célula hospedadora fúngica para aumentar el rendimiento de una proteína deseada (tal como una proteína heteróloga) de la célula hospedadora fúngica, por ejemplo: mediante la mutación o eliminación del gen GSH1, dando lugar así a una proteína Gsh1 mutada o a una ausencia completa de la proteína Gsh1; mediante la eliminación o cambio del marco de lectura abierto del gen; mediante la mutación o cambio de las secuencias de control del gen GSH1 tal como una secuencia promotora y/o una secuencia terminadora; mediante el bloqueo o reducción de la transcripción del gen GSH1, por ejemplo, mediante la introducción de ARN de interferencia adecuado tal como ARNm antisentido, mediante la introducción, control o modificación de genes activadores transcripcionales adecuados o mediante la introducción de un agente que bloquea el nivel de actividad de la proteína Gsh1.

148. Uso de un medio para reducir el nivel de expresión y/o el nivel de actividad de la proteína Gsh1 y para reducir el nivel de actividad de la proteína Not4 en una célula hospedadora fúngica para aumentar el rendimiento de una proteína deseada (tal como una proteína heteróloga) de la célula hospedadora fúngica, por ejemplo: mediante la mutación o eliminación del gen GSH1 y la mutación o eliminación del gen NOT4, dando así como resultado una proteína Gsh1 mutada o una ausencia completa de proteína Gsh1 y dando como resultado una proteína Not4 mutada o una ausencia completa de proteína Not4; mediante la eliminación o cambio del marco de lectura abierto del gen; mediante la mutación o cambio de las secuencias de control del gen GSH1 y/o NOT4 tal como una secuencia promotora y/o una secuencia terminadora; mediante el bloqueo o reducción de la transcripción del gen GSH1 y/o NOT4, por ejemplo, mediante la introducción de ARN de interferencia adecuado tal como ARNm antisentido; mediante la introducción, control o modificación de genes activadores transcripcionales adecuados o mediante la introducción de un agente que bloquea el nivel de actividad de la proteína Gsh1 y/o la proteína Not4.

149. Una proteína Gsh1, que comprende al menos un 50 % de identidad con la SEQ ID NO: 2 y una mutación en una posición correspondiente a una o más posiciones seleccionadas de 47, 48, 49, 50, 51, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 409, 451, 452, 453, 454 y 455 de la SEQ ID NO: 2.

150. La proteína Gsh1 de acuerdo con la realización 149 en la que la posición corresponde a R125 de la SEQ ID NO: 2.

151. La proteína Gsh1 de acuerdo con la realización 149 o 150 en la que la posición corresponde a H409 de la SEQ ID NO: 2.

152. La proteína Gsh1 de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 149 a 151 en la que la posición corresponde a P453 de la SEQ ID NO: 2.

153. La proteína Gsh1 de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 149 a 152 en la que la mutación es una sustitución, preferentemente por un aminoácido no conservado.

154. La proteína Gsh1 de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 150 a 153 en la que la mutación en una posición correspondiente a la posición R125 de la SEQ ID NO: 2 es una sustitución por A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, preferentemente por C, D, E o G, más preferentemente por G.

155. La proteína Gsh1 de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 149 a 154 en la que la mutación en una posición correspondiente a la posición R125 de la SEQ ID NO: 2 es una sustitución de un aminoácido con carga positiva por un aminoácido alifático, aromático, hidrófobo, pequeño, minúsculo, polar o con carga negativa, preferentemente un aminoácido con carga negativa por un aminoácido minúsculo.

156. La proteína Gsh1 de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 149 a 155 en la que la mutación en una posición correspondiente a la posición D49 de la SEQ ID NO: 2 es una sustitución por A, C, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y, preferentemente por H, K o R, más preferentemente por K o R.

157. La proteína Gsh1 de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 149 a 156 en la que la mutación en una posición correspondiente a la posición 49 de la SEQ ID NO: 2 es de un aminoácido con carga negativa a un aminoácido con carga positiva.

158. La proteína Gsh1 de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 149 a 157 en la que la mutación en una posición correspondiente a la posición H409 de la SEQ ID NO: 2 es una sustitución por A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y, preferentemente por A, I, L, V, M, F, W, Y, más preferentemente por A, I, L, V, más preferentemente por L.

159. La proteína Gsh1 de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 149 a 158 en la que la mutación en una posición correspondiente a la posición H409 de la SEQ ID NO: 2 es de un aminoácido aromático a un aminoácido alifático.

160. La proteína Gsh1 de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 149 a 159 en la que la mutación en una posición correspondiente a la posición P453 de la SEQ ID NO: 2 es una sustitución por A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W o Y, preferentemente por A, I, L, V, M, F, W, Y, más preferentemente por A, I, L, V, más preferentemente por L.

161. La proteína Gsh1 de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 149 a 160 en la que la mutación en una posición correspondiente a la posición P453 de la SEQ ID NO: 2 es de un aminoácido aromático a un aminoácido alifático.

162. La proteína Gsh1 de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 149 a 161 que comprende o consiste en la SEQ ID NO: 4.

La invención se describe ahora en referencia a los siguientes ejemplos no limitantes:

Ejemplos

Ejemplo 1: Mutación del gen GSH1 de Saccharomyces cerevisiae

DP9 de S. cerevisiae tiene el genotipo cir° MATa, leu2-3, leu2-112 ubc4 ura3 yap3::URA3 lys2 hsp150:LYS2 con PDI1, URA3 y Ylplac211 integrados en el locus PDI1 (Finnis et al., 2010, Microbial Cell Factories 9: 87). Los inventores observaron que DP9 de S. cerevisiae (cuando se transformó con un plásmido codificante de albúmina) fue capaz de producir albúmina humana recombinante con un rendimiento superior al de las cepas predecesoras, por ejemplo, DB1 de S. cerevisiae. La caracterización de DP9 de S. cerevisiae reveló un SNP en el gen GSH1. Para establecer si este SNP contribuyó a mejorar el rendimiento proteico de DP9 de S. cerevisiae, el SNP (A373G) se revirtió al tipo silvestre (es decir, A en la posición 373) como se describe a continuación. Por consiguiente, la proteína Gsh1 mutante (G125) también se revirtió al tipo silvestre (R125). El gen GSH1 y la proteína Gsh1 de tipo silvestre se proporcionan en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, respectivamente. El gen GSH1 y la proteína Gsh1 mutante (es decir, que contienen el SNP) se proporcionan en la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4, respectivamente. El gen GSH1 de S. cerevisiae está ubicado en el cromosoma X. El SNP (A373G) en el gen GSH1 mutante se revirtió al tipo silvestre mediante el proceso de integración de un fragmento en el locus GSH1, que cambió la base 373G a A, revirtiendo así la proteína Gsh1 mutante (G en la posición 125) a la proteína Gsh1 de tipo silvestre (R en la posición 125).

Esto se logró amplificando primero, mediante PCR, un marcador de selección adecuado (KanMX) con cebadores de ADN que incluían secuencias de ADN en sus extremos 5', idénticas a las regiones cadena arriba del marco de lectura abierto de GSH1. Los cebadores de PCR fueron MBP267 y MBP268. KanMX confiere resistencia a la geneticina (G418).

Cebador MBP267:

5'-ATACTATTGTAATTCAAAAAAAAAAAGCGAATCTTCCCATGCCTGTTGCTGCTCTTGAATGGCGACAGCCTATT GCCCCAGTGTTCCCTCAACAACCTTGCGTACGCTGCAGGTCG-3' (SEQ ID NO: 29)

Cebador MBP268:

5'-ACAGTTGTAGTCACGTGCGCGCCATGCTGACTAATGGCAGCCGTCGTTGGGCAGAAGAGAATTAGTATGGTA CAGGATACGCTAATTGCGCTCCAACTACATCGATGAATTCGAGCTCG-3' (SEQ ID NO: 30)

Se realizó PCR para amplificar el gen KanMX del plásmido pDB5438 (Figura 2). Las condiciones fueron las siguientes: 100 ng del plásmido pDB5438, cada cebador 0,5 pM, dNTP 0,2 pM, desnaturalización inicial durante 30 segundos a 98 °C, a continuación, 35 ciclos a 98 °C durante 10 segundos, hibridación a 62 °C durante 30 segundos, extensión a 72 °C durante 2 minutos, seguido de una extensión final a 72 °C durante 4 minutos y enfriamiento a 4 °C, utilizando un termociclador Applied Biosystems 2720 y un kit de PCR de polimerasa de ADN de alta fidelidad NEB Q5 Hot Start (M0493S), volumen de reacción total de 50 pl, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El producto, 5-GSH15'UTR-KanMX-GSH15'UTR-3', se analizó mediante electroforesis en gel y se encontró que era del tamaño esperado, aproximadamente 1,7 kb. El producto de PCR amplificado se purificó. El producto purificado se utilizó para transformar una cepa de S. cerevisiae cepa que era de tipo silvestre para GSH1 (es decir, SEQ ID NO: 1). La transformación se realizó utilizando un kit Sigma Yeast Transformation de acuerdo con las instrucciones del fabricante, excepto que después de la etapa donde se centrifuga la mezcla de transformación, el sedimento se volvió a suspender en 0,5 ml de medio YEPD y después se transfirió a un matraz de agitación que contenía 4,5 ml de YEPD. YEPD (g/l): 10 g de extracto técnico de levadura Bacto™, 20 g de peptona Bacto™, 20 g de glucosa. El matraz de agitación se incubó durante 16 horas a 30 °C con agitación (200 rpm). El cultivo se centrifugó a 3.000 revoluciones por minuto (rpm) durante 5 minutos y se decantó el sobrenadante. A continuación, el sedimento se lavó en sorbitol 1 M y después se volvió a suspender en 0,5 ml de sorbitol 1 M. A continuación, se sembraron aproximadamente 100 pl en placas de agar G418 recién preparadas (concentración final de G418 de 300 pg/ml) y se incubaron boca abajo a 30 °C durante cuatro días. Las placas de agar G418 se prepararon de la siguiente manera: se disolvieron 0,17 g de base de nitrógeno de levadura (sin (NH4)2SO4 y sin aminoácidos), 0,1 g de ácido glutámico (sal monosódica, Sigma G-1626) y 0,069 g de polvo de CSM-Leu en 100 ml de H2O (agua estéril para irrigación -apirógena, hipotónica) y se esterilizaron por filtración. A continuación, se añadieron 1,5 g de agar Bacto y la botella se calentó en un vaporizador durante una hora y después se enfrió a 55 °C en un baño de agua. Se añadieron y mezclaron 0,6 ml de geneticina (G418) 50 mg/ml y 4 ml de dextrosa estéril al 50 % (p/v). Se vertieron alícuotas de la mezcla en placas de Petri para que se solidificaran.

El ADN genómico se extrajo de transformantes resistentes a G418 y se utilizó como plantilla en una segunda PCR, utilizando los cebadores MBP288 y MBP289, para amplificar un fragmento de ORF de GSH1 en 5'UTR 5'-GSH1 5'UTR-KanMX-GSH1 (SEQ ID NO: 31) que contiene la 5'UTR de GSH1 con el gen KanMX insertado, y la parte del ORF de GSH1 en 5' (hasta la base 422)

Cebador MBP288: 5' — GATTTTATCGGTCAAAGG — 3' (SEQ ID NO: 32)

Cebador MBP289: 5' — CTATCTTGTCTCGCATATTC — 3' (SEQ ID NO: 33)

Los materiales de PCR, el método y las condiciones fueron los descritos anteriormente, excepto que se utilizó 1 pl de ADN genómico, la temperatura de hibridación fue de 55 °C y el tiempo de extensión fue de 3 minutos en cada ciclo y finalmente de 7 minutos. El producto se analizó mediante electroforesis en gel y se encontró que tenía el tamaño esperado, aproximadamente 2,9 kb. Los productos de PCR amplificados se purificaron con un kit de purificación de PCR QIAquick de QIAGEN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El producto purificado se utilizó para transformar DP9 [pDB2305] (Figura 3) utilizando el método de transformación descrito anteriormente. DP9 de S. cerevisiae es una cepa que contiene el SNP de GSH1 (A373G que da como resultado R125G). pDB2305 es un plásmido para la expresión de albúmina humana (Figura 3). El crecimiento y la selección en placas de agar G418 fueron como se describe anteriormente. El ADN genómico se extrajo de colonias resistentes y se utilizó PCR para amplificar un fragmento de 546 pb que cubría la región desde 100 pb cadena arriba del ORF hasta la base 446 del ORF, utilizando los cebadores MBP290 y MBP292. Se utilizaron el mismo kit de PCR y las mismas condiciones, excepto que las etapas de ciclado se cambiaron a una desnaturalización inicial de 98 °C durante 1 minuto, seguida de 35 ciclos a 98 °C durante 10 segundos, hibridación a 61 °C durante 20 segundos y extensión a 72 °C durante 2,5 minutos y después una extensión final a 72 °C durante 7 minutos.

Cebador MBP290: 5'— TCTCGAGTCACTTGTAGAAG — 3' (SEQ ID NO: 34)

Cebador MBP292: 5'— GAGCCCACATGCAAGTT — 3' (SEQ ID NO: 35)

Los productos se limpiaron con el kit de purificación de PCR Qiagen QIAquick 96. Se utilizó un kit de secuenciación cíclica Life Technologies BigDye Terminator v3.1 para la secuenciación de los productos de acuerdo con las instrucciones del fabricante, utilizando volúmenes de reacción totales de 50 pl, con -50 ng de los productos limpios como molde y 4 pl del cebador MBP291 1 pM. Las condiciones fueron las siguientes: Desnaturalización inicial a 96 °C durante 1 minuto después 25 ciclos con desnaturalización a 96 °C durante 10 segundos, hibridación a 50 °C durante 5 segundos, elongación a 60 °C durante 4 minutos y finalmente enfriamiento a 4 °C. Las reacciones de secuenciación se precipitaron y volvieron a suspender en HiDi (Applied Biosystems) y se analizaron en un analizador genético Applied Biosystems 3130xl.

Cebador MBP291: 5'— GTAGGGTGGTTTAGAGTATC — 3' (SEQ ID NO: 36)

El análisis de secuenciación mostró que un transformante tenía A de tipo silvestre en la posición 373 (R125), esta cepa se denominó PRG13 [pDB2305]. Dos transformantes todavía tenían la G en la posición 373 (G125), estas cepas se denominaron PSG10 [pDB2305] y PSG11 [pDB2305]. Estos tres transformantes se cultivaron en una placa de microvaloración (MTP, del inglés "microtiter plate") de 48 pocillos, que contenía 0,5 ml de BMMD (0,17 % (p/v) de base nitrogenada de levadura sin aminoácido y sulfato de amonio (Difco), sulfato de amonio 37,8 mM, ácido cítrico 36 mM, ortofosfato de hidrógeno disódico 126 mM pH 6,5, glucosa al 2% (p/v), ajustado a pH 6,5 con NaOH) en cada pocillo. La MTP se incubó a 30 °C en cámara húmeda con agitación (200 rpm) durante 72 horas. A continuación, se transfirieron 50 pl de cultivo celular de cada pocillo a tres pocillos en una nueva MTP de 48 pocillos que contenía 0,45 ml de BMMD en cada pocillo. La nueva ^m T^p se incubó a 30 °C en cámara húmeda con agitación (200 rpm) durante 96 horas.

El sobrenadante se aisló mediante centrifugación y la productividad de albúmina recombinante se determinó mediante análisis GP-HPLC con un sistema HPLC LC2010 (Shimadzu) equipado con detección UV bajo el control del programa informático del servidor cliente Shimadzu VP7.3. Se realizaron inyecciones de 75 pl en una columna TSK G3000SWXL de 7,8 mm de d.i. * 300 mm de longitud (Tosoh Bioscience), con una precolumna TSK SW de 6,0 mm de d.i. * 40 mm de longitud (Tosoh Bioscience). Las muestras se cromatografiaron en fosfato de sodio 25 mM, sulfato de sodio 100 mM, azida sódica al 0,05 % (p/v), pH 7,0 a 1 ml min-1, con un tiempo de ejecución de 20 minutos. Las muestras se cuantificaron por detección UV a 280 nm, por área de máximos, respecto a un patrón de albúmina humana recombinante de concentración conocida (10mg/ml) y se corrigieron por sus coeficientes de extinción relativos.

Como se muestra en la tabla 2, la presencia del SNP dio como resultado un aumento del 21 % en el rendimiento promedio de la albúmina.

Tabla 2: Productividad de la albúmina en PRG13 [pDB2305' en comparación con PSG10 [pDB2305] y PSG11

El trabajo se repitió en otra cepa de S. cerevisiae. Brevemente, se realizó el mismo procedimiento de transformación en la cepa BXP10 [pDB2244] de S. cerevisiae (Figura 4), para revertir el SNP de ^g S^h 1 a tipo silvestre. pDB2244 es un plásmido que expresa albúmina humana. Las cepas se cultivaron en matraz de agitación, se incubaron aproximadamente 10 ml de medio de cultivo en un matraz de 50 ml, con agitación a 200 rpm a 30 °C. El rendimiento de la albúmina de un transformante que todavía contenía el SNP, es decir, BSG3 [pDB2244], se comparó con el rendimiento de la albúmina de un transformante con el SNP convertido a tipo silvestre, es decir, BRG5 [pDB2244]. BXP10 tiene el genotipo MATa, leu2-3, leu2-122, canl, pral, ubc4, ura3, yap3::URA3, lys2, hsp150::LYS2 y pmt1::URA3.

Como se muestra en la tabla 3, la presencia del SNP dio como resultado un aumento del 68 % en el rendimiento de la albúmina (tres repeticiones para cada cepa).

Ejemplo 2: La eliminación del gen GSH1 en S. cerevisiae mejoró la producción de proteína recombinante

El gen GSH1 se eliminó en las mismas dos cepas de S. cerevisiae que se utilizaron en el ejemplo 1 para la reversión del SNP. La eliminación se logró mediante el reemplazo del gen GSH1 con el marcador KanMX. Por consiguiente, las cepas resultantes no fueron capaces de producir ninguna proteína Gsh1. Para realizar la eliminación, el ADN requerido se ordenó como un inserto de plásmido flanqueado por sitios de restricción Acc65l. El fragmento de ADN estaba formado por KanMXDNA flanqueado en el extremo 5' por 300 pb inmediatamente cadena arriba del ORF de GSH1 y en el extremo 3' por 300 pb inmediatamente cadena abajo del ORF de GSH1 (SEQ ID NO: 43). El plásmido se digirió con Acc65l y el fragmento KanMX se purificó a partir de un gel de agarosa Trisacetato-EDTA (TAE) con el kit de extracción de gel QIAGEN. Este ADN se utilizó para transformar las cepas de levadura DP9 [pDB2305] y BXP10 [pDB2244], donde pDB2305 y pDB2244 son plásmidos que contienen un casete de expresión para seroalbúmina humana. Al final del procedimiento de transformación, las células de levadura se volvieron a suspender en medio YEPD y se cultivaron durante la noche a 30 °C y 200 rpm. Al día siguiente se sembraron en placas G418 (como se describe en el ejemplo 1) con L-glutatión añadido a 5 mM. Las colonias se sembraron en placas nuevas (igualmente con G418 y L-glutatión) y cuando las manchas crecieron, se extrajo el ADN genómico y se realizaron PCR utilizando cebadores que flanquearían las uniones si todo el fragmento de ADN se hubiera integrado de manera correcta. Se identificaron tres transformantes en los que se había eliminado GSH1 en BXP10 (los transformantes se denominaron BDG1, BDG2 y BDG10) y un transformante en el que se había eliminado GSH1 en DP9 (el transformante se denominó PDG14). Estas cepas, junto con la cepa descrita anteriormente con o sin la reversión del SNP, se cultivaron en placas de 48 pocillos en BMMD. Las cepas con la eliminación se cultivaron en pocillos complementados con L-glutatión 5 mM y las otras cepas se cultivaron con y sin L-glutatión. Los sobrenadantes se analizaron mediante GP-HPLC para cuantificar los niveles de expresión de la seroalbúmina humana.

Tabla 4: Productividad de la albúmina en cepas procedentes de BXP10: BRG5 [pDB2244] (GSH1 TS), BSG3 DB22441 SNP BDG1 DB22441 BDG2 DB22441 BDG10 DB22441 AGSH1 _

Cepa(s)

p p p y p p p y (GSH1 TS) (GSH1 con BDG10 [pDB22441 (GSH1 TS) (GSH1 con BDG10 [pDB22441 SNP) (todo ÁG SH1 SNP todo ÁG SH1 Albúmina 100 % ± 1,47 132% ±5,70 (no somet (rendimien ensayo) to relativo)

(1 desviación típica) Eliminación del valor P (prueba de la t) (cultivado con L-glutatión) en comparación con TS (cultivado sin L-glutatión): 1,25E-08 (véase la tabla 4, columnas F y A)

Eliminación del valor P (prueba de la t) en comparación con TS (ambos cultivados con L-glutatión): 8,90E-05 (véase la tabla 4, columnas F y D)________________________________________________________________________________

Como se muestra en la tabla 4, la eliminación de GSH1 en BXP10 [pDB22441, dio como resultado un aumento en el rendimiento de la albúmina en comparación con la cepa con GSH1 de tipo silvestre. Además, como también se ha mostrado en el ejemplo 1, la presencia del SNP en GSH1 aumentó el rendimiento de la albúmina en comparación con la cepa que contenía GSH1 de tipo silvestre.

Tabla 5: Productividad de la albúmina en cepas procedentes de DP9: PRG13 [pDB23051 (GSH1 TS), PSG10

continuación

Como se muestra en la tabla 5, la eliminación de GSH1 en DP9 [pDB2305], dio como resultado un aumento en el rendimiento de la albúmina en comparación con la cepa con GSH1 de tipo silvestre y en comparación con la cepa con el GSH1 con el SNP.

Ejemplo 3: La mutación del gen GSH1 mejora el rendimiento de fermentación de la albúmina a una escala de 10 l Las cepas procedentes de BXP10 del ejemplo 1 se cultivaron a escala de 10 litros en fermentadores y la tasa de rendimiento de productividad celular específica (YPXT) se midió (Tabla 6). Las fermentaciones se llevaron a cabo de manera similar a la descrita para el ejemplo 5.

Tabla 6: Productividad de la albúmina en fermentaciones de 10 litros en cepas procedentes de BXP10

BRG5 [pDB2244] (GSH1 TS) BSG3 [pDB2244] (GSH1 con SNP A373G) Albúmina (rendimiento relativo, Y^pxt)

_____________(n = 6)_____________ ^{100 104,61}

Se observó un aumento promedio del 4,6 % en la cepa que tenía GSH1 que contenía el SNP A373G (lo que dio lugar a R125G), esto fue estadísticamente significativo. Valor de p = 0,069

Ejemplo 4: El efecto positivo en el rendimiento de la proteína recombinante de S. cerevisiae proporcionado por una mutación en GSH1 se ve reforzado por la presencia de una mutación en NOT4

Anteriormente (Documento PCT/US2016/068239, posteriormente publicado como documento WO 2017/112847), se identificó que la mutación de NOT4 (también conocido como MOT2) da como resultado un mayor rendimiento de la proteína heteróloga producida en una cepa hospedadora.

Para determinar si combinar o no una mutación en NOT4 con una mutación en GSH1 afecta aún más al rendimiento, se complementaron una, ambas o ninguna de las mutaciones en las células hospedadoras (mediante la transformación con un plásmido que contenía una versión de tipo silvestre de ninguno, uno o ambos genes) dando como resultado una serie de cepas que tenían fenotipos que se aproximan a:

(A) GSH1 que contiene el SNP, y NOT4 que contiene el SNP,

(^b ) GSH1 que contiene el SNP y NOT4 de tipo silvestre,

(c ) GSH1 de tipo silvestre y NOT4 que contiene el SNP, y

(d ) GSH1 de tipo silvestre y NOT4 de tipo silvestre.

Los rendimientos de la proteína heteróloga se midieron mediante análisis GP-HPLC de los sobrenadantes de los cultivos de las cepas resultantes.

Para generar plásmidos que contuvieran GSH1 y/o NOT4 de tipo silvestre, se llevaron a cabo PCR con ADN genómico de la cepa de levadura DB1. Esta cepa tiene NOT4 de tipo silvestre y GSH1 de tipo silvestre. Se utilizaron pares de cebadores (Tabla 7) para producir ADN que contenía los ORF de tipo silvestre y las secuencias cadena arriba y cadena abajo de NOT4 y GSH1. Los cebadores se diseñaron para incluir sitios de enzimas de restricción para permitir la clonación en el plásmido YCP50 (Figura 5 y Rose et al., 1987, Gene, 60, 237-243). Las PCR se realizaron de acuerdo con la tabla 8.

Tabla 7: Cebadores de PCR

continuación

Tabla 8: Condiciones de PCR

Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 0,1 |jg de ADN genómico, 0,5 |^jM de cada cebador, dNTP 0,2 |^jM, desnaturalización inicial durante 30 segundos a 98 °C, a continuación, 35 ciclos a 98 °C durante 10 segundos, hibridación a temperatura superior durante 30 segundos, extensión a 72 °C durante 2 minutos, seguido de una extensión final a 72 °C durante 4 minutos y enfriamiento a 4 °C, utilizando un termociclador Applied Biosystems 2720 y un kit de PCR de polimerasa de ADN de alta fidelidad NEB Q5 Hot Start (M0493S), volumen de reacción total de 50 jl, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los productos se analizaron mediante electroforesis en gel y se encontró que tenían los tamaños esperados, aproximadamente 2,5 kb para NOT4 y aproximadamente 3,3 kb para GSH1. Los productos de PCR amplificados se purificaron con un kit de purificación de PCR QIAquick de QIAGEN de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se realizaron digestiones con enzimas de restricción en los productos de PCR purificados y en el plásmido YCP50. Las enzimas de restricción y los tampones eran de New England Biolabs (NEB) y se siguieron los protocolos del fabricante. Los digestiones realizadas fueron: EcoRI HindIII en el producto de ^pC^r de NOT4, EcoRl HindIII en YCP50, Sphl + SalI en el producto de PCR de GSH1 y Sphl y Sail en YCP50. El tampón utilizado fue el tampón CutSmart y las enzimas de restricción fueron todas las enzimas NEB High Fidelity ("HF") (es decir, EcoRI-HF etc.). Los productos de digestión se incubaron durante aproximadamente 1,5 horas a 37 °C. Las digestiones de los productos de PCR se purificaron con el kit de purificación de PCR QIAquick de QIAGEN y el ADN de YCP50 se purificó a partir de un gel de agarosa TAE, con el kit de extracción de gel QIAquick de QIAGEN, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Cada uno de los productos de PCR digeridos y purificados se unió al ADN de YCP50 que se había cortado con las mismas enzimas. Las uniones se realizaron utilizando el kit de unión NEB Quick (M2200S) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y utilizando una relación molar de 3:1 para el producto de PCR:YCP50. A continuación, se utilizó un microlitro de cada reacción de unión para transformar células de E. coli competentes en NEB 5-a (eficacia elevada) (M2987I) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y las células se sembraron en LB ampicilina. Se cultivaron durante la noche a partir de las colonias resultantes y se realizaron minipreparaciones de centrifugado QIAprep de QIAGEN. Se realizaron digestiones con enzimas de restricción para identificar plásmidos en los que la clonación parecía haber tenido éxito.

A continuación, el plásmido YCP50-NOT4 se digirió con Sphl + SalI y el ADN purificado de un gel de agarosa TAE, con el kit de extracción de gel QIAquick de QIAGEN, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este ADN se unió al producto de PCR de GSH1 que había sido digerido con SphI + SalI y después se purificó con el kit de purificación QIAquick PCR. De nuevo, la relación molar de ADN del inserto a la cadena principal fue de 3:1. Se transformaron células competentes en NEB 5-a (eficacia elevada) (como anteriormente) y se preparó ADN plasmídico (como anteriormente). Los plásmidos correctos se identificaron mediante digestiones de restricción.

Esto dio lugar a tres nuevos plásmidos: YCP50-NOT4, YCP50-GSH1 e YCP50-NOT4-GSH1. Estos, e YCP50 solo, se utilizaron para transformar ura3 de DYB7 [pDB2305] que contenía el plásmido pDB2305 para la expresión de la seroalbúmina humana recombinante. DYB7 se describe en Payne et al., (2008) Applied and Environmental Microbiology 74 (24) 7759-7766. Las transformaciones se realizaron utilizando un kit Sigma Yeast Transformation de acuerdo a las instrucciones del fabricante, excepto después de la etapa donde se centrifuga la mezcla de transformación, el sedimento se volvió a suspender en 200 j l de sorbitol 1 M y después se sembraron 100 j l en placas de agar BMMD. Las placas se incubaron a 30 °C hasta la aparición de colonias.

Se inocularon colonias individuales de cada transformación en pocillos de una placa de microvaloración de 48 pocillos, que contenía 0,5 ml de BMMD por pocillo. La placa se incubó a 30 °C y 200 rpm durante 2 días y después se mezcló un volumen igual de trehalosa al 40 % en cada pocillo y la placa se almacenó a -80 °C. En una fecha posterior, la placa se descongeló y se transfirieron 50 j l de cada pocillo a un pocillo de una placa nueva que contenía 450 j l de BMMD. Esta placa se incubó durante 2 días a 30 °C y 200 rpm y después se subcultivó en otra placa nueva (50 j l en 450 j l de BMMD). Esta placa se incubó durante 4 días. A continuación, la placa se centrifugó a 2000 rpm durante 5 minutos y se transfirieron 200 j l del sobrenadante de cada uno a frascos de HPLC. Las cantidades de seroalbúmina humana en los sobrenadantes se cuantificaron mediante GP-HPLC como se describe en el ejemplo 1.

Los nuevos plásmidos, YCP50-NOT4, YCP50-GSH1 y YCP50-NOT4-GSH1, se secuenciaron para confirmar que cada uno contenía los insertos correctos. La secuenciación se realizó como se describe en los ejemplos anteriores, excepto que en este caso se utilizaron de 150 a 300 ng de ADN plasmídico para cada reacción

Los rendimientos relativos de la albúmina, medido mediante análisis GP-HPLC de sobrenadantes de cultivo, se muestran en la tabla 9 (a continuación).

Tabla 9: Productividad de la albúmina en cepas que se aproximan a los fenotipos que contienen combinaciones de GSH1 SNP o de ti o silvestre NOT4 SNP o de ti o silvestre

Los rendimientos se muestran en relación con (D), la cepa en la que había complementación de ambos genes que contenían el SNP. Se vio que el NOT4 con SNP (C), dio como resultado un aumento del 31 % en el rendimiento, el GSH1 con SNP (B) dio como resultado un aumento del 77 % en el rendimiento y la presencia de ambos SNP (A), dio como resultado un aumento del 84 % en el rendimiento. Estos estudios de complementación demuestran que las mutaciones en GSH1 y NOT4 afectan de manera positiva el rendimiento de la albúmina, y cuando se combinan, el rendimiento aumenta aún más.

Se espera que dicho aumento en el rendimiento también se observe a mayor escala. Esto se debe a que, los ejemplos 1 y 2 demuestran que la mutación o eliminación de GSH1 afecta al rendimiento de la albúmina producida a partir de S. cerevisiae a pequeña escala, los ejemplos 3 y 5 demuestran que esto también se observa a una escala de 10 l y la solicitud anterior PCT/US2016/068239 demostró que la mutación o eliminación de NOT4 afecta al rendimiento de la albúmina producida a partir de S. cerevisiae tanto a escala pequeña como de 10 l.

Ejemplo 5: La mutación del gen GSH1 de S. cerevisiae mejoró el rendimiento de la albúmina a escala de 10 l La productividad de las cepas de S. cerevisiae DYB7 ura3 [pDB2305 / YCp50-NOT4], DYB7 ura3 [pDB2305 / YCp50-GSH1] y DYB7 ura3 [pDB2305 / YCp50-NOT4-GSH1] para la expresión de proteína recombinante se evaluaron mediante el crecimiento en un fermentador de 10 l (Wigley et al., (2007) Genetic Engineering News. 27 (2): 40 - 42). La fermentación fue como se describe en el ejemplo 1 del documento WO97/33973 utilizando medio MW11 D, excepto que se utilizó el programa informático Wonderware Supervisory Control and Data Acquisition en lugar de MFCS, antes de su uso, el recipiente del fermentador también se sometió a un lavado con ácido cítrico, la reserva de oligoelementos comprendía Na2MoO4.2H2O en lugar de Na2MoO4.5H2O, el pH se ajustó a pH 6,2 con solución de amoníaco, la introducción inicial de aire estéril en el recipiente fue de aproximadamente 1,0 vvm (es decir, 1,0 litro) en lugar de 0,5 vvm, durante la fermentación, el flujo de aire se incrementó en una etapa en lugar de dos para mantener un flujo de aire de aproximadamente 1,0 vvm, la tasa de crecimiento específico fue de aproximadamente 0,06 h-1 y la constante exponencial (K) se mantuvo en 0,06. "vvm" significa flujo de volumen de gas por unidad de volumen de líquido por minuto.

Los rendimientos relativos se muestran (gramos de producto por litro) en la tabla 10.

Tabla 10: Productividad de la albúmina a escala de 10 litros a partir de DYB7 [pDB2305/YCp50-NOT4] y DYB7

DB2 Y -N T4- H1

El rendimiento de la albúmina aumenta en una cepa que tiene GSH1 que contiene un SNP en comparación con una cepa que tiene un fenotipo de GSH1 que se aproxima al tipo silvestre.

Ejemplo 6: La mutación o eliminación del gen GSH1 de Saccharomyces cerevisiae mejoró la expresión de una variante de albúmina y la eliminación de GSH1 mejoró la expresión de una proteína de fusión de albúmina (albúmina-IL-1Ra) y scFv (vHvL)-FLAG

Las proteínas que se expresaron en este ejemplo fueron (a) una variante de albúmina (SEQ ID NO: 45) que contenía 4 mutaciones en relación con HSA TS (s Eq ID NO: 10), (b) IL-1Ra fusionado de manera genética con el extremo carboxiterminal de la seroalbúmina humana (SEQ ID NO: 47, "albúmina-IL-1Ra") y (c) el scFv, FITC8 (Evans et al., 2010, Protein Expression and Purification 73:113-124, incluidas las referencias 16 y 17) con un marcador FLAG (DYKDDDDK, SEQ ID NO: 50) en su extremo carboxiterminal (SEQ ID NO: 49).

En la preparación para la expresión de albúmina-IL-1Ra, se cortó el plásmido pDB3936 (Figura 7) con las enzimas de restricción Acc65l y SamHI y el plásmido pDB5912 (que contiene un casete de expresión de albúmina-IL-1Ra) se cortó con enzimas Nsil y Pvul. En la figura 8 se proporciona un mapa de plásmido para pDB5912, la secuencia de ADN que codifica la albúmina-IL-1Ra se muestra en la SEQ ID NO: 46. Las enzimas de restricción y los tampones eran de New England Biolabs. Ambos plásmidos digeridos se purificaron utilizando un kit de purificación Qiagen PCR siguiendo las instrucciones del fabricante.

Las 3 cepas, PDG14 [pDB2305], PSG11 [pDB2305] y PRG13 [pDB2305], se cultivaron en matraces de agitación en medio YEPD y se subcultivaron 3 veces para curarlos del plásmido (pDB2305). Las diluciones de los cultivos finales se sembraron en YEPD y después las colonias individuales de estas placas se sembraron en YEPD. Las manchas en YEPD se transfirieron aplacas con BMMD L-glutatión 5 mM y se incubaron a 30 °C; una falta de crecimiento en BMMD L-glutatión 5 mM identificó las células que se habían curado del plásmido. Cada una de las cepas de levadura curadas se transformó, utilizando el kit Sigma Yeast Transformation de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con el plásmido pDB5862 (para la expresión de la variante de albúmina) (en la figura 9 se proporciona un mapa de plásmido para pDB5862, la secuencia de ADN que codifica la variante de albúmina se muestra en la SEQ ID NO: 44), pDB3029 (para la expresión de scFv (vHvL)-FLAG) (en la figura 9 se proporciona un mapa de plásmido para pDB3029, la secuencia de ADN que codifica scFv-FLAG se muestra en la SEQ ID NO: 48), o con los productos de digestión de restricción purificados de pDB3936 y pDB5912 (para la expresión de albúmina-IL-1RA del plásmido reparado en hueco pDB3936:GR:pDB5912). Las células se sembraron en BMMD y se incubaron durante 5 días a 30 °C. Se cultivaron seis transformantes de cada cepa en una MTP de 48 pocillos que contenía 0,5 ml de BMMD con L-glutatión 5 mM por pocillo. La placa se incubó durante 48 horas a 30 °C y 200 rpm en una cámara de humedad. A continuación, esta placa se subcultivó transfiriendo 50 pl de cada cultivo a 450 pl de BMMD con L-glutatión 5 mM en una nueva placa. Esta placa se incubó durante 96 horas.

El sobrenadante se aisló mediante centrifugación y la productividad de proteína recombinante (para la variante de albúmina, albúmina-IL-1Ra o ScFv) se determinó por ^g P-HPLC, como en el ejemplo 1.

Como se muestra en la tabla 11, la presencia del SNP (A373G) o la eliminación, dio como resultado un aumento en el rendimiento de la variante de albúmina. El rendimiento fue 15% superior en la cepa que contenía el SNP en GSH1 (PSG11) y 23 % superior en la cepa que contiene la eliminación de GSH1 (PDG14) en comparación con la cepa con GSH1 de tipo silvestre (PRG13).

Como se muestra en la tabla 12, la presencia de la eliminación dio como resultado un aumento en el rendimiento de la albúmina-IL-1Ra. El rendimiento fue un 14% superior en la cepa que contenía la eliminación (PDG14) en comparación con la cepa con GSH1 de tipo silvestre (PRG13).

Tabla 12: Productividad de la albúmina-IL-1Ra en PRG13 [pDB3936:GR:pDB5912], PSG11 [pDB3936:GR:pDB5912]

Como se muestra en la tabla 13, la presencia de la eliminación dio como resultado un aumento en el rendimiento de

Claims (27)

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir una proteína heteróloga que comprende:

a. proporcionar una célula hospedadora fúngica que tiene:

1. una proteína Gsh1 modificada que tiene un nivel reducido de actividad en relación con la actividad de una proteína Gsh1 de tipo silvestre de una célula hospedadora fúngica de referencia por lo demás idéntica, y/o

2. un nivel reducido de actividad de la proteína Gsh1 en relación con la actividad de una proteína Gsh1 de tipo silvestre de una célula hospedadora fúngica de referencia por lo demás idéntica, y/o

3. un gen GSH1 modificado que tiene un nivel reducido de actividad en relación con la actividad de un gen GSH1 de tipo silvestre de una célula hospedadora fúngica de referencia por lo demás idéntica, y/o

4. un nivel reducido de expresión del gen GSH1 en relación con el nivel de expresión de un gen GSH1 de tipo silvestre de una célula hospedadora fúngica de referencia por lo demás idéntica, y

b. cultivar la célula hospedadora para producir la proteína heteróloga,

en donde

(i) la proteína heteróloga es una proteína vegetal o animal, y/o

(ii) el cultivo es a una escala de al menos 1 litro, y/o

(iii) el método comprende además purificar la proteína heteróloga, y/o

(iv) el método comprende además formular la proteína heteróloga con un vehículo o diluyente terapéuticamente aceptable para producir así un producto terapéutico adecuado para la administración a un ser humano o un animal.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1 para aumentar el rendimiento de la proteína heteróloga.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 en el que la célula hospedadora fúngica es una levadura o un hongo filamentoso.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que la proteína Gsh1 comprende una mutación en la posición correspondiente a una posición seleccionada de 47, 48, 49, 50, 51, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 409, 451, 452, 453, 454 y 455 de la SEQ ID NO: 2.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4 en el que la mutación en una posición correspondiente a la posición 125 de la SEQ ID NO: 2 es una sustitución por C, D, E o G.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que la proteína Gsh1 comprende o consiste en la SEQ ID NO: 4.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que la célula hospedadora carece de un gen GSH1 o una proteína Gsh1.

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en el que el rendimiento de la proteína heteróloga es al menos un 2 % superior al rendimiento a partir de una célula hospedadora fúngica de referencia.

9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en el que la célula hospedadora fúngica de referencia tiene la proteína Gsh1 de SEQ ID NO: 2.

10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la célula hospedadora fúngica tiene una modificación en:

1. la proteína Not4, y/o

2. el nivel de actividad de la proteína Not4, y/o

3. el gen NOT4 y/o

4. el nivel de expresión del gen NOT4.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10 en el que se reduce el nivel de actividad de la proteína Not4.

12. El método de la reivindicación 10 u 11 en el que se reduce el nivel de expresión del gen NOT4.

13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 en el que la proteína Not4 comprende una mutación en la posición correspondiente a una posición seleccionada de 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469 o 470 de la SEQ ID NO: 6.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13 en el que la mutación en una posición correspondiente a la posición 429 de la SEQ ID NO: 6 es una sustitución por G, A, V, L o I.

15. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 en el que la proteína Not4 comprende o consiste en la SEQ ID NO: 8.

16. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 en el que la célula hospedadora carece de un gen NOT4 o una proteína Not4.

17. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16 en el que el rendimiento de la proteína heteróloga es al menos un 2 % superior al rendimiento a partir de una célula hospedadora fúngica de referencia que tiene una proteína Not4 de tipo silvestre.

18. El método de acuerdo con la reivindicación 17 en donde la célula hospedadora fúngica de referencia tiene una proteína Not4 de SEQ ID NO: 6.

19. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 18 en el que el rendimiento de la proteína heteróloga es al menos un 2 % superior al rendimiento a partir de una célula hospedadora fúngica de referencia que tiene la proteína Gsh1 de SEQ ID NO: 2.

20. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 19 en el que el rendimiento de la proteína heteróloga es al menos un 2 % superior al rendimiento a partir de una célula hospedadora fúngica de referencia que tiene la proteína Gsh1 de tipo silvestre y la proteína Not4 de tipo silvestre.

21. El método de acuerdo con la reivindicación 20 en el que la célula hospedadora fúngica de referencia tiene la proteína Gsh1 de SEQ ID NO: 2 y la proteína Not4 de SEQ ID NO: 6.

22. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 en el que la proteína heteróloga comprende o consiste en una albúmina o variante, fragmento y/o fusión de la misma.

23. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 en el que la célula hospedadora se cultiva a una escala de al menos 5 l.

24. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 que comprende además recuperar la proteína heteróloga.

25. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 que comprende además purificar la proteína heteróloga.

26. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 que comprende además formular la proteína heteróloga con un vehículo o diluyente terapéuticamente aceptable para producir así un producto terapéutico adecuado para la administración a un ser humano o un animal.

27. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26 que comprende además proporcionar la proteína heteróloga en forma de dosificación unitaria.