JP5410703B2 - 酵母変異株の作製方法および酵母変異株 - Google Patents

Description

本発明は、酵母変異株の作製方法、該作製方法により得られた酵母変異株、該酵母変異株を培養して得られる培養物、分画物、酵母エキスおよびこれらを利用した飲食品に関する。

酵母菌体内の代表的な含硫化合物として、グルタチオンとＳ−アデノシルメチオニンがあげられる。グルタチオンは肝機能回復、抗酸化活性などを有するきわめて有用な物質であり、近年、調味料、健康食品への添加、化粧品の基材としての利用など、幅広い用途が期待されている。また、Ｓ−アデノシルメチオニンは様々な生体反応でメチル基の供与体として作用することが知られており、また、抗うつ作用、関節症の緩和、肝機能回復等報告され、これら含硫化合物は生体に対して重要な役割を果たしている。

グルタチオン等を高生産する酵母の先行技術として、これまでに多くの技術が開示されている。例えば、特許文献１には、酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）に属する菌株を親株とし、遺伝子操作技術を用いず、突然変異処理を施して得た、グルタチオンを乾燥菌体当たり５％重量以上含有する遺伝子組換え体でない酵母を取得する技術が開示されている。しかし、突然変異処理等により具体的にどの遺伝子が変異又は欠失して、グルタチオンを高生産する酵母が得られたかどうかは明らかにされていない。

また、特許文献２には、グルタチオンの前駆体であるγ−グルタミルシステインの高生産能を有し、かつ変異型ＭＥＴ３０遺伝子を保持する酵母が開示されている。ＭＥＴ３０遺伝子はＳ（硫黄）代謝関連遺伝子であり、ユビキチンリガーゼタンパク質をコードしている。ユビキチンは他の遺伝子に結合してその遺伝子の機能を抑制する働きをする。
特開２００４−１８０５０９号公報 特開２００４−１１３１５５号公報

しかしながら、工業的に安価で効率的にグルタチオン等の含硫化合物を取得するためには、更なる含硫化合物高含有酵母が望まれる。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、菌体中にグルタチオン等の含硫化合物を多量に保持しうる酵母および該酵母を利用した含硫化合物含有飲食品を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究を行った結果、ＤＯＡ１遺伝子に変異を有する酵母及びＤＯＡ１遺伝子が欠失した酵母が顕著にグルタチオン等の含硫化合物を高生産することを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の構成を採用する。

（１） 本発明は、サッカロマイセス属菌において、ＤＯＡ１遺伝子を欠損またはその開始コドン１３７１位から１４１７位までの４７塩基を欠失させることにより、酵母変異株菌体内の含硫化合物含有量を高めることを特徴とする酵母変異株の作製方法を提供するものである。
（２） また、本発明は、前記含硫化合物が、グルタチオンであることを特徴する前記（１）に記載の酵母変異株の作製方法を提供するものである。
（３） また、本発明は、突然変異処理により、ＤＯＡ１遺伝子を欠損またはその開始コドン１３７１位から１４１７位までの４７塩基を欠失させることを特徴とする前記（１）または（２）に記載の酵母変異株の作製方法を提供するものである。
（４） また、本発明は、ＭＥＴ３０遺伝子の開始コドンより１３９１番目の塩基ｇがａに変異した変異株中のＤＯＡ１遺伝子を欠損またはその開始コドン１３７１位から１４１７位までの４７塩基を欠失させる、または、ＤＯＡ１遺伝子を欠損またはその開始コドン１３７１位から１４１７位までの４７塩基を欠失させた変異株について、さらにＭＥＴ３０遺伝子の開始コドンより１３９１番目の塩基ｇをａに変異させることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれかに記載の酵母変異株の作製方法を提供するものである。
（５） また、本発明は、ＤＯＡ１遺伝子が欠損又はその開始コドン１３７１位から１４１７位までの４７塩基が欠失しており、かつＭＥＴ３０遺伝子の開始コドンより１３９１番目の塩基ｇがａに変異した、サッカロマイセス属菌の酵母変異株を提供するものである。
（６） また、本発明は、前記（５）に記載の酵母変異株の乾燥酵母菌体を提供するものである。
（７） また、本発明は、前記（１）〜（４）の何れかに記載の酵母変異株の作製方法によって作製された酵母変異株、または前記（５）に記載の酵母変異株を培養して、前記酵母株菌体内に含硫化合物を乾燥重量で０．８ｗｔ％以上に蓄積させることを特徴とする、含硫化合物高含有酵母の製造方法を提供するものである。
（８） また、本発明は、前記（５）に記載の酵母変異株の培養物を提供するものである。
（９） また、本発明は、前記（８）に記載の培養物、または前記（７）に記載の製造方法により製造された含硫化合物高含有酵母から酵母エキスを調製することを特徴とする、酵母エキスの製造方法を提供するものである。
（１０） また、本発明は、前記（８）に記載の培養物、又は前記（９）に記載の製造方法により製造された酵母エキスを含有させることを特徴とする、含硫化合物含有飲食品の製造方法を提供するものである。
（１１） また、本発明は、前記含硫化合物が、グルタチオンであることを特徴とする（１０）に記載の含硫化合物含有飲食品の製造方法を提供するものである。

本発明の酵母変異株の作製方法によれば、ＤＯＡ１遺伝子の少なくとも一部を欠損または変異させることにより、酵母変異株菌体内の含硫化合物含有量を高めることで、グルタチオン等の含硫化合物を高含有する酵母変異株を作製することができる。

従って、本発明の酵母変異株を培養して、含硫化合物を高濃度に含有する培養物または分画物を得ることができる。

また、本発明の酵母変異株を培養して、含硫化合物を高濃度に含有する酵母エキスや乾燥酵母菌体を得ることができる。

さらにまた、本発明の酵母変異株を培養して得られる培養物、含硫化合物を含む前記培養物の分画物を含有させることにより、含硫化合物含有飲食品とすることができる。

以下に、本発明の一実施形態について詳細に説明する。

本発明の酵母変異株の作製方法は、ＤＯＡ１遺伝子の少なくとも一部を欠損または変異させることにより、酵母変異株菌体内の含硫化合物含有量を高めることを特徴とする。変異は、欠失、置換、挿入、逆位、重複、転座の何れであってもよい。欠損または変異は、遺伝子領域全体であってもよく、遺伝子領域の一部であってもよい。遺伝子領域の一部である場合、好ましくはＤＯＡ１遺伝子の開始コドン１３７１位から１４１７位までの４７塩基のいずれかを欠失、置換することにより本発明の酵母変異株が得られる。

酵母としては、単細胞性の真菌類であればよく、具体的には、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属菌、シゾサッカロマイセス（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属菌、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属菌、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属菌、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属菌、ウィリオプシス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）属菌、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属菌、ガラクトマイセス（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ）属菌、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属菌、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属菌、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属菌、ジゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属菌などが挙げられる。
これらの中でも、可食性であることから、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、キャンディダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｙｐｏｌｉｔｉｃａ）、キャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、キャンディダ・サケ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓａｋｅ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などが好ましく、より好ましくは汎用されているサッカロマイセス・セレビシエである。
また、他の遺伝子の変異株であってもよい。例えば、ＭＥＴ３０等のＳ代謝に関連する遺伝子の変異株を用いることにより、より含硫化合物を高含有する酵母変異株が得られる。

具体的には、突然変異処理を酵母に対して行なえばよい。突然変異処理の変異原としては、紫外線、電離放射線、亜硝酸、ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネート（Ｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｎｅ ｓｕｌｕｆｏｎａｔｅ、以下ＥＭＳと略称する）等が挙げられる。その他、他の変異株に対し、戻し交配をすることによっても得られる。

突然変異処理を行なった後、塩基配列を確認し、ＤＯＡ１遺伝子の少なくとも一部が欠損または変異している変異株を選択することにより本発明の酵母変異株が得られる。確認した変異株は、常法により培養することができる。

このようにして、酵母変異株菌体内の含硫化合物含有量を高めることができる理由は明らかではないが、ＤＯＡ１遺伝子に欠損または変異を起こすことにより、Ｓ（硫黄）代謝遺伝子群を活性化させ、Ｓ代謝遺伝子の発現量が増加し、含硫化合物を高濃度に蓄積させることができるようになるためと考えられる。
なお、本発明においては、含硫有機化合物とは、Ｓ（硫黄）含有アミノ酸を有する化合物を意味する。具体的には、図１に示すサッカロマイセス・セレビシエのＳ代謝マップ中に記載されている、グルタチオン、システイン、ホモシステイン、メチオニン、アデノシルメチオニン、アデノシルホモシステイン、シスタチオニン、γグルタミルシステイン等が挙げられる。本発明においては、有用な生理活性が高い点から、グルタチオンであることが好ましい。

突然変異処理により得られた変異株は、菌体中に含まれるグルタチオン等の含硫化合物の含有量を測定し、グルタチオン等の含硫化合物量の含有量が増強した変異株をさらに選択し、含硫化合物量を高濃度で含有しうる変異株を探索することもできる。

本発明では、更に、上記酵母変異株を培養して、当該酵母菌体内にグルタチオン等の含硫化合物を高濃度に蓄積させることを特徴とする含硫化合物量高含有酵母の製造方法が提供される。
具体的には、上記酵母変異株を培養して、当該菌体内に含硫化合物を乾燥重量当たり０．８ｗｔ％以上、好ましくは１．０ｗｔ％以上、さらに好ましくは１．６ｗｔ％以上含有させることができる。

本発明を実施するには、前述の方法で得られた酵母変異株を炭素源、窒素源及び無機塩等を含む培地で培養すればよい。
これら菌株の培地組成としては、炭素源として通常の微生物の培養に利用されるグルコース、蔗糖、酢酸、エタノール、糖蜜および亜硫酸パルプ廃液等からなる群より選ばれる１種または２種以上が用いられ、窒素源としては、尿素、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムもしくはリン酸アンモニウム等の無機塩、およびコーンスティプリカー（ＣＳＬ）、カゼイン、酵母エキスもしくはペプトン等の含窒素有機物等からなる群より選ばれる１種または２種以上が使用される。更に、リン酸成分、カリウム成分、マグネシウム成分を培地に添加してもよく、これらとしては、過リン酸石灰、リン安、塩化カリウム、水酸化カリウム、硫酸マグネシウム、塩酸マグネシウム等の通常の工業用原料でよい。その他、亜鉛、銅、マンガン、鉄イオン等の無機塩を使用してもよい。その他、ビタミン、核酸関連物質等を添加しても良い。

培養形式としては、回分培養、流加培養または連続培養のいずれでもよいが、工業的には流加培養または連続培養が採用される。

培養条件は、一般的な酵母の培養条件に従えばよく、例えば温度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃がよく、ｐＨは３．５〜８．０、特に４．０〜６．０が望ましい。また、好気的条件であることが好ましい。

本発明の方法により、高濃度のグルタチオン等の含硫化合物を酵母菌体内に含有する培養物が得られるが、培養物から含硫化合物を含有する分画物を得てもよい。
培養物から含硫化合物を含有する分画物を分画する方法としては、通常行われている方法であればいずれの方法でもよい。例えば、熱水抽出、菌体破砕による抽出等により得られた抽出物を、含硫化合物と親和性の高い物質を担持したアフィニティカラムを用いて分画することにより、含硫化合物を高濃度に含む画分に濃縮精製することが可能となる。

また、上記方法により培養した培養物から酵母エキスを調製してもよい。酵母エキスを調製する方法としては、通常行われている方法であればいずれの方法であってもよいが、自己消化法、酵素分解法あるいはアルカリ抽出法などが工業的に採用される。

また、上記方法により培養した培養物から乾燥酵母菌体を調製してもよい。乾燥酵母菌体を調製する方法としては、通常行われている方法であればいずれの方法であってもよいが、工業的には、凍結乾燥法、スプレードライ法、ドラムドライ法などが採用される。

さらに本発明は、上記酵母変異株を培養して得られる培養物、グルタチオン等の含硫化合物を含む前記培養物の分画物を含有する飲食品に関するものである。

これらの飲食品としては、通常乾燥酵母、酵母エキスを添加しうる飲食品であれば何れでもよいが、例えばアルコール飲料、清涼飲料、発酵食品、調味料、スープ類、パン類、菓子類等を挙げることができる。

本発明の飲食品を製造するには、飲食品の製造工程において、上記酵母変異株を培養して得られる調製物、グルタチオン等の含硫化合物を含む前記培養物の分画物を添加してもよい。その他、原料として酵母をそのまま用いてもよい。

従って、本発明によって、グルタチオン等の含硫化合物を高濃度で含む飲食品を効率的に製造することができる。

次に、実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

なお、菌体重量の測定は培養液を遠心分離操作で２回水洗後、1０５℃、５時間乾燥させた後の重量から求めた。還元型および酸化型グルタチオンを合わせた総グルタチオン（以下、ＧＳＨと略す。）の定量は、Ｔｉｔｚｅらの方法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ．２７、ｐ５０２、１９６９）に従って測定した。乾燥菌体中の総ＧＳＨ含量（％（ｗ／ｗ））は得られた総ＧＳＨ量を乾燥菌体重量で割ることにより算出した。

（実施例１）突然変異の誘発と変異株の取得
野生型サッカロマイセス・セレビジエＹＮＮ２７株をＹＰＤ培地（グルコース２％、ポリペプトン２％、イーストエキス１％）を含む試験管で対数増殖期まで培養した。この菌体を回収し、常法に従いＥＭＳを用いて変異処理を行った。変異処理は死滅率約７０％になるような条件で行った。

上記のようにして変異処理を実施した菌株をＹＰＤ寒天平板培地に塗布し、３０℃で４８時間静置培養した。形成したコロニーに対して、ニトロプルシド法により高ＧＳＨ含有株のスクリーニングを実施した。すなわち、ＹＰＤ寒天培地上でコロニー形成を行い、マスタープレートとした。マスタープレートよりレプリカ布を用いて新規ＹＰＤ寒天培地に菌を複写し、１晩３０℃で培養し、コロニーを形成させ、レプリカプレートを作製した。レプリカプレート上に２％ニトロプルシッド（Ｓｏｄｉｕｍ Ｎｉｔｏｒｏｐｒｕｓｓｉｄｅ Ｄｉｈｙｄｒａｔｅ）、５％トリクロロ酢酸溶液を添加し、５分間放置後、ニトロプルシッドトリクロロ酢酸溶液を廃棄し、２８％アンモニア水を添加し、赤く染色したコロニーをマーキングし、対応する菌株をマスタープレートより９１株ピックアップした。

これら選択株について、上述の方法で総グルタチオン含量の測定を行い菌体内グルタチオン量が増強したＡＢＹＣ１５９２株を取得した。本ＡＢＹＣ１５９２株について野生パン酵母を用いて戻し交配を実施した。戻し交配の過程で更にＧＳＨ産生量が亢進したＡＢＹＣ１５６９株を取得した。なお、このＡＢＹＣ１５６９株は独立法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されており、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０３８６が付与されている（寄託日 平成１７年２月３日）。

このようにして得られたＡＢＹＣ１５６９株、ＡＢＹＣ１５９２株の遺伝子変異を四分子解析及び、ライブラリーを用いた相補性試験により特定し、その遺伝子配列を調べたところ、ＡＢＹＣ１５９２株ではＭＥＴ３０遺伝子の開始コドンより１３９１番目の塩基ｇがａに変異していた。この結果、ＭＥＴ３０遺伝子産物の４６４位のアミノ酸残基がＧｌｙからＧｌｎに置換していた。一方、ＡＢＹＣ１５６９株ではＭＥＴ３０遺伝子の点変異に加えて、ＤＯＡ１遺伝子の開始コドン１３７１位から１４１７位までの４７塩基が欠失していた。このため、ＡＢＹＣ１５６９株中のＤＯＡ１遺伝子では塩基欠失後６アミノ酸残基目に終始コドンが出現し、翻訳が終了していた。

（実施例２）ＤＯＡ１遺伝子破壊株（ｄｏａ１Δ株）の取得
ＹＮＮ２７株およびｍｅｔ３０点変異株であるＡＢＹＣ１５９２株を用いて、ｄｏａ１Δ株の取得を行った。

まず、ＤＯＡ１遺伝子破壊カセットを以下のように作製した。ＥＵＲＯＳＣＡＲＦ社から販売されている酵母１遺伝子破壊ライブラリーにより、ｄｏａ１Δ株のゲノムを鋳型として、ＤＯＡ−Ｆ（５'−ａａｔｃｔｔｔａｃｔａｃｔｔｃａｃｃ−３'）とＤＯＡ−Ｒ（５'−ｃａａａｇｇａｇｇｃｔｃｔｔｃｃｃｔ−３'）をプライマーに用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物はＧ４１８耐性遺伝子の両端にＤＯＡ１遺伝子のＯＲＦのＮ末端配列およびＣ末端配列を含むため、同ＰＣＲ産物を用いてＤＯＡ１遺伝子を破壊することが可能である。

ＰＣＲの条件は以下のとおりである。９４℃で２分間保持した後、９４℃ ３０秒間、５０℃ １分間、７２℃ ５分間を３０サイクル繰り返した後４℃で保持した。
また、反応溶液の組成は下記のとおりである。
ゲノムＤＮＡ １μｌ
１０×Ｃｏｌｎｅｄ Ｐｆｕ Ｒｅａｃｔｉｏｎ
Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社） ５μｌ
２ｎＭ ｅａｃｈ ｄＮＴＰ ５μｌ
１０ｐｍｏｌ／μｌ ＤＯＡ１−Ｆプライマー １μｌ
１０ｐｍｏｌ／μｌ ＤＯＡ１−Ｒプライマー １μｌ
Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社） ０．２５μｌ
超純水（ＭｉｌｌｉＱ水） ３６．７５μｌ
Ｔｏｔａｌ ５０μｌ

上記のようにして作製したＤＯＡ１遺伝子破壊カセットを用いて、以下のようにＹＮＮ２７株及びＡＢＹＣ１５９２株のＤＯＡ１遺伝子の破壊を試みた。
まず、ＹＮＮ２７株及びＡＢＹＣ１５９２株をＹＰＤ培地で培養し、その対数増殖期に集菌した。滅菌水で洗浄した後、１０ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ酢酸リチウム溶液に懸濁し、コンピテントセルとした。ＰＣＲ産物０．１μｇ、キャリヤーＤＮＡ１００μｇ、調製したコンピテントセル１００μｌを含むチューブに４０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、１０ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ酢酸リチウム溶液を４００μｌ添加し、３０℃で３０分間保持した。さらに４０μｌジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加した後、４２℃で１５分間保持した。この菌液を１５０００ｒｐｍ ５分間遠心し集菌し、ＹＰＤ培地に懸濁し、３０℃で１８時間培養した。この培養液を、Ｇ４１８を５００μｇ／ｍｌの濃度で含有するＹＰＤ培地に塗布しＧ４１８耐性株を取得した。

（実施例３）グルタチオン生産能の評価
親株、ＡＢＹＣ１５６９株及びＡＢＹＣ１５９２株をＳＤ培地（Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ０．６７％、グルコース２％）で培養し、培養開始１６時間後のグルタチオン蓄積量を測定した。変異株におけるグルタチン含有量の測定結果を表１に示す。

表１の結果から、親株と比較し、ＡＢＹＣ１５６９株及びＡＢＹＣ１５９２株ではそれぞれＧＳＨ含量は２〜４倍増加することが示された。さらに、実施例２で取得したＤＯＡ１遺伝子破壊株についても同様にグルタチオン蓄積量を測定した。ＤＯＡ１遺伝子破壊株におけるグルタチオン含有量の測定結果を表２に示す。

表２の結果から、遺伝子破壊株についても、ｄｏａ１遺伝子欠失変異株と同様にＧＳＨ産生能の亢進が認められた。

（実施例４）変異株におけるｍＲＮＡ発現量の網羅的解析
変異株における各種ＭＥＴ遺伝子のｍＲＮＡ量の網羅的解析を、ＤＮＡマイクロアレイを用いて実施した。測定は親株であるＹＮＮ２７株とｍｅｔ３０変異株（ＡＢＹＣ１５９２株）、実施例２で作製したＹＮＮ２７株のｄｏａ１Δ株、及びＡＢＹＣ１５９２株のｄｏａ１Δ株間で行った。

各酵母を必要なアミノ酸を含むＳＤ培地で１６時間培養した後、菌体を集菌し、ＴＥＳバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．５、０．５％ＳＤＳ）に懸濁し、等量のフェノール／クロロホルムを加え、１０分おきに３０秒間ボルテックス処理を行いながら６５℃で１時間保持した。得られた菌体破砕液を５０００ｒｐｍ、５分間遠心分離して上清を得た。フェノール／クロロホルム抽出を再度実施した後、クロロホルム抽出を行い、エタノール沈殿を行い、−８０℃で全ＲＮＡを沈殿させた。遠心後、沈殿を７０％エタノールで洗浄し、減圧乾固させた後、蒸留水で溶解し、全ＲＮＡ溶液とした。

得られた全ＲＮＡ５００ｎｇよりＬｏｗ ＲＮＡ Ｉｎｐｕｔ Ｌｉｎｅａｒ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いてｃＤＮＡを合成し、次いでｃＲＮＡ合成を行った。得られたｃＲＮＡはＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて精製し、遊離のラベル化ヌクレオチドを除去した。

Ｃｙａｎｉｎｅ３およびＣｙａｎｉｎｅ５ラベルしたｃＲＮＡを、それぞれ０．２５μｇずつを使用してＩｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプラス（Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いてハイブリダイゼーションを行った。ＤＮＡチップは、Ａｇｌｉｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のＹｅａｓｔオリゴＤＮＡマイクロアレイキットを使用した。ハイブリダイゼーションは６０℃で１７時間行った。

ハイブリダイゼーション後、６×ＳＳＣ、０．００５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０２中のガスケットスライドをはずして、６×ＳＳＣ、０．００５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０２中で１０分間、０．１×ＳＳＣ、０．００５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０２中で５分間洗浄した後、完全乾燥させた。

ＤＮＡマイクロアレイスキャナー（Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて、ＤＮＡチップ上の各スポットの蛍光強度を検出した。Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎを用いて蛍光強度を数値化した後、Ｌｕｍｉｎａｔｏｒ（Ｒｏｓｅｔｔａ社製）を用いて解析を行った。実験誤差、ラベル化効率等を考慮し、カラースワップ実験を行い、高い相関係数を得た。マイクロアレイ法による各変異株におけるＳ代謝関連遺伝子の発現量として、親株であるＹＮＮ２７株の発現量を１としたときのＳ代謝関連遺伝子の発現量比を表３に示す。

表３の結果から、図１に示すサッカロマイセス・セレビシエのＳ代謝マップの遺伝子の中で、ｍｅｔ３０遺伝子点変異株ではＳ代謝関連遺伝子群、特に硫酸基の取り込みからホモシステインに至るまでの各遺伝子群の発現量が増加していた。
ｄｏａ１遺伝子欠失株では、ＭＥＴ１６やＭＥＴ５など、親株と比較して発現量が増加している遺伝子が存在した。一方、ｍｅｔ３０、ｄｏａ１Δ二重変異株では、ｍｅｔ３０点変異株で認められたＳ代謝関連遺伝子群の発現量の増加が、さらに亢進していた。

（実施例５）変異株における各種Ｓ基資化関連遺伝子のｍＲＮＡ発現量
親株、ｍｅｔ３０点変異株（ＡＢＹＣ１５９２）および実施例２で取得したＤＯＡ１遺伝子破壊株をＳＤ培地で１６時間培養した。実施例４と同様の方法により全ＲＮＡを抽出し、得られた全ＲＮＡ１００ｎｇを用いて定量ＰＣＲ法により定量を行った。定量ＰＣＲを実施した遺伝子は、ＳＵＬ２、ＭＥＴ５、ＭＥＴ１６、ＭＥＴ２５、ＣＹＳ３、ＧＳＨ１およびインターナルマーカーとしてＡＣＴ１である。定量ＰＣＲ法で増幅させた領域と同一の領域をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターに挿入したプラスミドを作製し、モル濃度を計算し、スタンダードとして用いた。ＳＵＬ２、ＭＥＴ５、ＭＥＴ１６、ＭＥＴ２５、ＣＹＳ３、ＧＳＨ１およびＡＣＴ１の増幅用プライマーとして、表４に示す合成ＤＮＡを用いた。

ＰＣＲ反応は以下の条件で実施した。すなわち、４８℃で３０分間保持し、逆転写反応を行った後、９５℃で１０分間保持することにより逆転写酵素を失活させた。その後、９５℃ １５秒間、６０℃ １分間を４０サイクル繰り返した。ＰＣＲ反応、及び蛍光強度の検出はＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｏｐｔｉｏｎ２ ｓｙｓｔｅｍ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を用いた。

また、反応溶液の組成は下記のとおりである。
２ｘＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ２５μｌ
（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）
ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ ０．２５μｌ
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）
ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １μｌ
（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ（１０ｐｍｏｌ／μｌ） １μｌ
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（１０ｐｍｏｌ／μｌ） １μｌ
Ｔｅｍｐｌａｔｅ １００ｎｇ
Ｔｏｔａｌ ５０μｌ

定量ＰＣＲ法による各変異株におけるＳ代謝関連遺伝子の発現量として、検量線より算出した各サンプルＲＮＡ中のｍＲＮＡ濃度を表５に示す。単位はｐＭである。

マイクロアレイの結果同様、ｍｅｔ３０、ｄｏａ１Δ二重変異株では、ｍｅｔ３０点変異株で認められたＳ代謝関連遺伝子群の発現量の増加が更に亢進していることが確認された。

本発明は、以下の点において、産業上の利用可能性が存在する。

本発明の酵母変異株の作製方法により得られる新規な酵母変異株は、菌体内に含硫化合物を蓄積することが可能であり、本発明の新規な酵母変異株を培養して当該酵母菌体内にグルタチオン等の含硫化合物を高濃度に含有させることができる。

従って、本発明の新規な酵母変異株を培養して、含硫化合物を高濃度に含有する培養物または分画物を得ることができる。

また、本発明の新規な酵母変異株を培養して、含硫化合物を高濃度に含有する酵母エキスを得ることができる。

さらにまた、本発明の新規な酵母変異株を培養して得られる培養物、含硫化合物を含む前記培養物の分画物または加熱処理した前記培養物もしくは分画物を含有させることにより、含硫化合物含有飲食品とすることができる。

図１は、サッカロマイセス・セレビシエにおけるＳ代謝マップを示す。

Claims (11)

1. サッカロマイセス属菌において、ＤＯＡ１遺伝子を欠損またはその開始コドン１３７１位から１４１７位までの４７塩基を欠失させることにより、酵母変異株菌体内の含硫化合物含有量を高めることを特徴とする酵母変異株の作製方法。
2. 前記含硫化合物が、グルタチオンであることを特徴する請求項１記載の酵母変異株の作製方法。
3. 突然変異処理により、ＤＯＡ１遺伝子を欠損またはその開始コドン１３７１位から１４１７位までの４７塩基を欠失させることを特徴とする請求項１または２に記載の酵母変異株の作製方法。
4. ＭＥＴ３０遺伝子の開始コドンより１３９１番目の塩基ｇがａに変異した変異株中のＤＯＡ１遺伝子を欠損またはその開始コドン１３７１位から１４１７位までの４７塩基を欠失させる、または、
   ＤＯＡ１遺伝子を欠損またはその開始コドン１３７１位から１４１７位までの４７塩基を欠失させた変異株について、さらにＭＥＴ３０遺伝子の開始コドンより１３９１番目の塩基ｇをａに変異させることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵母変異株の作製方法。
5. ＤＯＡ１遺伝子が欠損又はその開始コドン１３７１位から１４１７位までの４７塩基が欠失しており、かつＭＥＴ３０遺伝子の開始コドンより１３９１番目の塩基ｇがａに変異した、サッカロマイセス属菌の酵母変異株。
6. 請求項５に記載の酵母変異株の乾燥酵母菌体。
7. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵母変異株の作製方法によって作製された酵母変異株、または請求項５に記載の酵母変異株を培養して、前記酵母株菌体内に含硫化合物を乾燥重量で０．８ｗｔ％以上に蓄積させることを特徴とする、含硫化合物高含有酵母の製造方法。
8. 請求項５に記載の酵母変異株の培養物。
9. 請求項８に記載の培養物、または請求項７に記載の製造方法により製造された含硫化合物高含有酵母から酵母エキスを調製することを特徴とする、酵母エキスの製造方法。
10. 請求項８に記載の培養物、又は請求項９に記載の製造方法により製造された酵母エキスを含有させることを特徴とする、含硫化合物含有飲食品の製造方法。
11. 前記含硫化合物が、グルタチオンであることを特徴とする請求項１０記載の含硫化合物含有飲食品の製造方法。

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