JP5667365B2 - サッカロマイセス・セレビシエ変異株、及び該変異株を用いた含硫化合物高含有酵母の製造方法。 - Google Patents
サッカロマイセス・セレビシエ変異株、及び該変異株を用いた含硫化合物高含有酵母の製造方法。 Download PDFInfo
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Description
本発明は、グルタチオン等の含硫化合物が高いサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）変異株、該変異株を用いた含硫化合物高含有酵母の製造方法、並びに、該変異株の培養物及び酵母エキスに関する。
酵母菌体内の代表的な含硫化合物として、グルタチオンとＳ−アデノシルメチオニンがあげられる。グルタチオンは肝機能回復、抗酸化活性等を有するきわめて有用な物質であり、近年、調味料や健康食品等の飲食品の添加剤や、化粧品の基材等、幅広い用途が期待されている。一方、Ｓ−アデノシルメチオニンは、様々な生体反応においてメチル基の供与体として作用することが知られている。その他、抗うつ作用、関節症の緩和、肝機能回復等の効果が報告されており、これら含硫化合物が生体に対して重要な役割を果たしていることが知られている。
含硫化合物は、通常、メチオニンやシステイン等の含硫アミノ酸を用いて、ＭＥＴ遺伝子（メチオニン合成遺伝子）群をはじめとする多くの遺伝子の転写・翻訳産物により合成される。そこで、より含硫化合物を高生産する酵母を得るために、酵母が有しているこれらの含硫化合物の合成に係る遺伝子に変異を生じさせ、含硫化合物高含有酵母変異株を製造することが広く行われている。このような、含硫化合物高含有酵母変異株を得る方法として、例えば、（１）酵母内のＳ−アデノシルメチオニン含量が増大すると、ＭＥＴ遺伝子群の転写が抑制される結果、含硫化合物の生産量が低下するが、このＭＥＴ遺伝子群の転写抑制に、ＭＥＴ３０遺伝子が、おそらくは他のＭＥＴ遺伝子群の転写調節を司る遺伝子であるＭＥＴ４遺伝子との相互作用を介して、関与していることが開示されている（例えば、非特許文献１参照。）。
また、（２）転写活性を強化するように変異させたＭＥＴ４遺伝子を利用して、含硫化合物を高濃度に蓄積させるように酵母を変異させる方法、及び、変異型ＭＥＴ４遺伝子を保持し、グルタチオン生産性を高めた酵母が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。その他、（３）グルタチオンの前駆体であるγ−グルタミルシステイン生産能を有し、かつ特定のアミノ酸を変異させたＭＥＴ３０遺伝子を保持する酵母が開示されている（例えば、特許文献２参照。）。ＭＥＴ３０遺伝子はＭＥＴ４のユビキチン化に関与している遺伝子であるが、該方法では、特定の変異型ＭＥＴ３０遺伝子を保持することにより、酵母の生育能を悪化させることなく、γ−グルタミルシステイン生産能を向上させ得ることが開示されている。
トーマス、他５名、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Molecular and Cellular Biology）、１９９５年、第１５巻第１２号、第６５２６〜６５３４ページ。
しかしながら、工業的に安価で効率的にグルタチオン等の含硫化合物を取得するためには、更なる含硫化合物高含有酵母が望まれる。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、菌体中にグルタチオン等の含硫化合物を多量に保持しうるサッカロマイセス・セレビシエ変異株、該変異株を用いた含硫化合物高含有酵母の製造方法、並びに、該変異株の培養物、酵母エキス、及び含硫化合物含有飲食品を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、一般的な野生株であるサッカロマイセス・セレビシエＹＮＮ２７株に突然変異処理することにより得られた変異型ＭＥＴ３０遺伝子を有する酵母変異株に、再度突然変異処理することにより、突然変異処理前の株よりも含硫化合物含量が多い２種類の酵母変異株を得、これらの酵母変異株同士を交配させることにより、親株よりも含硫化合物含量が多い酵母変異株サッカロマイセス・セレビシエＡＢＹＣ１５７９を見出し、本発明を完成させた。
（１） 本発明は、含硫化合物含量が乾燥菌体重量当たり２重量％以上であり、下記工程（ａ）〜（ｃ）より得ることができることを特徴とするサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）変異株を提供するものである；（ａ）サッカロマイセス・セレビシエＹＮＮ２７株に突然変異処理することにより、変異型ＭＥＴ３０遺伝子を有する酵母変異株を得る工程と、（ｂ）工程（ａ）により得られた酵母変異株に突然変異処理することにより、変異型ＭＥＴ３０遺伝子を有し、かつ含硫化合物含量が乾燥菌体重量当たり１．５重量％以上である酵母変異株を２以上得る工程と、（ｃ）工程（ｂ）により得られた酵母変異株のうちの２株を掛け合わせることにより、含硫化合物含量が乾燥菌体重量当たり２重量％以上である酵母変異株を得る工程。
（２） また、本発明は、サッカロマイセス・セレビシエＡＢＹＣ１５７９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９２３）であることを特徴とする前記（１）に記載のサッカロマイセス・セレビシエ変異株を提供するものである。
（３） また、本発明は、含硫化合物含量が乾燥菌体重量当たり２重量％以上であり、前記（１）又は（２）記載のサッカロマイセス・セレビシエ変異株を、サッカロマイセス・セレビシエＹＮＮ２７と交配させることにより得られることを特徴とするサッカロマイセス・セレビシエ変異株を提供するものである。
（４） また、本発明は、サッカロマイセス・セレビシエＡＢＹＣ１５８８株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９２４）であることを特徴とする前記（３）に記載のサッカロマイセス・セレビシエ変異株を提供するものである。
（５） また、本発明は、前記（１）〜（４）のいずれかに記載のサッカロマイセス・セレビシエ変異株を培養し、当該変異株菌体内に、乾燥菌体重量当たり１４重量％以上の含硫化合物を含有させることを特徴とする、含硫化合物高含有酵母の製造方法を提供するものである。
（６） また、本発明は、前記（１）〜（４）のいずれかに記載のサッカロマイセス・セレビシエ変異株の培養物を提供するものである。
（７） また、本発明は、前記（１）〜（４）のいずれかに記載のサッカロマイセス・セレビシエ変異株の培養物から酵母エキスを調製することを特徴とする、酵母エキスの調製方法を提供するものである。
（８） また、本発明は、前記（１）〜（４）のいずれかに記載のサッカロマイセス・セレビシエ変異株の培養物を分画して、含硫化合物を含む分画物を得ることを特徴とする、含硫化合物を含む分画物の調製方法を提供するものである。
（９） また、本発明は、前記含硫化合物がグルタチオンであることを特徴とする、前記（８）記載の含硫化合物を含む分画物の調製方法を提供するものである。
（１０） また、本発明は、前記（６）記載の培養物又は前記（８）若しくは（９）に記載の含硫化合物を含む分画物の調製方法により調製された分画物を含有させることを特徴とする含硫化合物含有飲食品の製造方法を提供するものである。
（２） また、本発明は、サッカロマイセス・セレビシエＡＢＹＣ１５７９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９２３）であることを特徴とする前記（１）に記載のサッカロマイセス・セレビシエ変異株を提供するものである。
（３） また、本発明は、含硫化合物含量が乾燥菌体重量当たり２重量％以上であり、前記（１）又は（２）記載のサッカロマイセス・セレビシエ変異株を、サッカロマイセス・セレビシエＹＮＮ２７と交配させることにより得られることを特徴とするサッカロマイセス・セレビシエ変異株を提供するものである。
（４） また、本発明は、サッカロマイセス・セレビシエＡＢＹＣ１５８８株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９２４）であることを特徴とする前記（３）に記載のサッカロマイセス・セレビシエ変異株を提供するものである。
（５） また、本発明は、前記（１）〜（４）のいずれかに記載のサッカロマイセス・セレビシエ変異株を培養し、当該変異株菌体内に、乾燥菌体重量当たり１４重量％以上の含硫化合物を含有させることを特徴とする、含硫化合物高含有酵母の製造方法を提供するものである。
（６） また、本発明は、前記（１）〜（４）のいずれかに記載のサッカロマイセス・セレビシエ変異株の培養物を提供するものである。
（７） また、本発明は、前記（１）〜（４）のいずれかに記載のサッカロマイセス・セレビシエ変異株の培養物から酵母エキスを調製することを特徴とする、酵母エキスの調製方法を提供するものである。
（８） また、本発明は、前記（１）〜（４）のいずれかに記載のサッカロマイセス・セレビシエ変異株の培養物を分画して、含硫化合物を含む分画物を得ることを特徴とする、含硫化合物を含む分画物の調製方法を提供するものである。
（９） また、本発明は、前記含硫化合物がグルタチオンであることを特徴とする、前記（８）記載の含硫化合物を含む分画物の調製方法を提供するものである。
（１０） また、本発明は、前記（６）記載の培養物又は前記（８）若しくは（９）に記載の含硫化合物を含む分画物の調製方法により調製された分画物を含有させることを特徴とする含硫化合物含有飲食品の製造方法を提供するものである。
本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株は、グルタチオン等の含硫化合物含有量が高い良好な酵母である。このため、該サッカロマイセス・セレビシエ変異株を培養することにより、簡便に含硫化合物高含有酵母を製造することができる。また、該サッカロマイセス・セレビシエ変異株の培養物は、含硫化合物含有量が十分に高いため、該培養物を用いることにより、含硫化合物含有量が高い酵母エキス及び分画物、ならびにこれらを含有する含硫化合物含有飲食品を、簡便に得ることができる。
本発明においては、乾燥菌体重量とは、菌体を乾燥させた後の重量を意味する。乾燥後の菌体重量は、例えば、まず、酵母の培養物を遠心分離処理することにより、菌体を沈殿として回収する。回収した菌体を遠心分離操作により２回水洗した後、１０５℃で５時間乾燥させた後の重量を測定することにより、求めることができる。
本発明においては、含硫有機化合物とは、Ｓ（硫黄）含有アミノ酸を有する化合物を意味する。具体的には、図１に示すサッカロマイセス・セレビシエのＳ代謝マップ中に記載されている、グルタチオン、システイン、ホモシステイン、メチオニン、アデノシルメチオニン、アデノシルホモシステイン、シスタチオニン、γグルタミルシステイン等が挙げられる。本発明においては、有用な生理活性が高い点から、グルタチオンであることが好ましい。
本発明及び本願明細書においては、特に記載がない限り、グルタチオンとは、酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンの双方を意味し、総グルタチオン含量とは、酸化型グルタチオン及び還元型グルタチオンの合計含量を意味する。
本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株の乾燥菌体重量当たりの含硫化合物含量は、微生物中の含硫化合物含量を定量する場合に通常行われる方法により求めることができる。例えば、酵母の乾燥菌体重量当たりの総グルタチオン含量は、Ｔｉｔｚｅらの方法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ．２７、ｐ５０２、１９６９）に従い、測定することができる。
本発明において、変異型ＭＥＴ３０遺伝子とは、ＭＥＴ３０遺伝子の一部が変異した遺伝子、すなわち、ＭＥＴ３０遺伝子の塩基配列中の一部の塩基が置換、欠損、挿入された遺伝子を意味する。これらの変異は、一塩基変異であってもよく、染色体の転座、逆位、重複等による変異のように、複数の塩基が連続した領域の変異であってもよい。
本発明において、突然変異処理とは、酵母等の生物が有する遺伝子の一部を変異させ得る処理であれば、特に限定されるものではなく、酵母等の微生物の変異株を作製する場合に通常用いられるいずれの手法を用いて行ってもよい。例えば、変異原として、紫外線、電離放射線、亜硝酸、ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネート（Ｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｎｅ ｓｕｌｕｆｏｎａｔｅ、以下ＥＭＳと略記する）等を用いて酵母を処理することにより、酵母に突然変異処理を行うことができる。
本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株は、含硫化合物含量が乾燥菌体重量当たり２重量％以上であり、下記工程（ａ）〜（ｃ）より得ることができることを特徴とする；（ａ）サッカロマイセス・セレビシエＹＮＮ２７株に突然変異処理することにより、変異型ＭＥＴ３０遺伝子を有する酵母変異株を得る工程と、（ｂ）工程（ａ）により得られた酵母変異株に突然変異処理することにより、変異型ＭＥＴ３０遺伝子を有し、かつ含硫化合物含量が乾燥菌体重量当たり１．５重量％以上である酵母変異株を２以上得る工程と、（ｃ）工程（ｂ）により得られた酵母変異株のうちの２株を掛け合わせることにより、含硫化合物含量が乾燥菌体重量当たり２重量％以上である酵母変異株を得る工程。
このように、突然変異を繰り返し、工程ごとに含硫化合物含量の多い変異株を選択した後、選択された株同士を掛け合わせることにより、より含硫化合物含量が高い変異株を得ることができる。
このように、突然変異を繰り返し、工程ごとに含硫化合物含量の多い変異株を選択した後、選択された株同士を掛け合わせることにより、より含硫化合物含量が高い変異株を得ることができる。
以下、工程ごとに説明する。
まず、工程（ａ）として、サッカロマイセス・セレビシエＹＮＮ２７株に突然変異処理することにより、変異型ＭＥＴ３０遺伝子を有する酵母変異株を得る。具体的には、野生株であるサッカロマイセス・セレビシエＹＮＮ２７株に、突然変異処理を行い、処理後の酵母のＭＥＴ３０遺伝子の塩基配列を解析し、ＭＥＴ３０遺伝子が変異している酵母変異株、すなわち、変異型ＭＥＴ３０遺伝子を有する酵母変異株を選別する。
まず、工程（ａ）として、サッカロマイセス・セレビシエＹＮＮ２７株に突然変異処理することにより、変異型ＭＥＴ３０遺伝子を有する酵母変異株を得る。具体的には、野生株であるサッカロマイセス・セレビシエＹＮＮ２７株に、突然変異処理を行い、処理後の酵母のＭＥＴ３０遺伝子の塩基配列を解析し、ＭＥＴ３０遺伝子が変異している酵母変異株、すなわち、変異型ＭＥＴ３０遺伝子を有する酵母変異株を選別する。
なお、サッカロマイセス・セレビシエＹＮＮ２７株は、常法により培養したものを用いることができる。
また、ＭＥＴ３０遺伝子の塩基配列は、遺伝子解析分野において通常用いられているシークエンス法等により解析することができる。
また、ＭＥＴ３０遺伝子の塩基配列は、遺伝子解析分野において通常用いられているシークエンス法等により解析することができる。
工程（ａ）において選別される酵母変異株は、変異型ＭＥＴ３０遺伝子を有する酵母変異株であれば特に限定されるものではないが、特に、ＭＥＴ３０遺伝子の、他のＭＥＴ遺伝子群の転写抑制機能が損なわれた、又は弱められた変異型ＭＥＴ３０遺伝子を有する酵母変異株であることが好ましい。このような変異型ＭＥＴ３０遺伝子を有する酵母変異株であれば、グルタチオン等の含硫化合物含量の多い酵母変異株を作製するための原材料として好適であるためである。
また、工程（ａ）における変異型ＭＥＴ３０遺伝子を有する酵母変異株の選別は、突然変異処理を施した全ての酵母のＭＥＴ遺伝子を解析し、選別してもよく、突然変異処理を施した酵母から、含硫化合物含量、特に総グルタチオン含量が比較的多い酵母を選択し、これらのＭＥＴ遺伝子を解析して、変異型ＭＥＴ３０遺伝子を有する株を選別してもよい。遺伝子変異等により、ＭＥＴ３０遺伝子が有する他のＭＥＴ遺伝子群の転写抑制機能が阻害されると、他のＭＥＴ遺伝子等のＳ代謝遺伝子群が活性化され、酵母中の含硫化合物含量、特に総グルタチオン含量が高くなると考えられているためである。例えば、乾燥菌体重量当たりの総グルタチオン含量は、サッカロマイセス・セレビシエＹＮＮ２７株では約０．３重量％であるが、変異型ＭＥＴ３０遺伝子を有する酵母変異株では約１重量％以上となる場合がある。
次に、工程（ｂ）として、工程（ａ）により得られた酵母変異株に突然変異処理することにより、変異型ＭＥＴ３０遺伝子を有し、かつ含硫化合物含量が乾燥菌体重量当たり１．５重量％以上である酵母変異株を２以上得る。このように、工程（ａ）により得られた酵母変異株に、繰り返し突然変異処理を施すことにより、突然変異処理前の酵母変異株よりも含硫化合物含量が高い酵母変異株を得ることができる。
工程（ｂ）において得られた酵母変異株は、含硫化合物含量が乾燥菌体重量当たり１．５重量％以上であり、工程（ａ）で得られた酵母変異株よりも含硫化合物含量が高い酵母変異株である。これは、突然変異処理により、ＭＥＴ３０遺伝子に加えて、さらに他のＳ代謝遺伝子が変異されたことにより、Ｓ代謝が促進された可能性がある。
さらに工程（ｃ）として、工程（ｂ）により得られた酵母変異株のうちの２株を掛け合わせることにより、含硫化合物含量が乾燥菌体重量当たり２重量％以上である酵母変異株を得る。なお、酵母の掛け合わせは、常法により行うことができる。特に、各親株に対して四分子解析（Ｔｅｔｒａｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ）を行い、各胞子の含硫化合物含量を測定し、それぞれの親株から選択された最も含硫化合物含量が高い胞子同士を掛け合わせることにより、乾燥菌体重量当たり２重量％以上という高い含硫化合物含量を有する酵母変異株を簡便に得ることができる。
このように、工程（ｂ）により得られた酵母変異株同士を掛け合わせることにより、親株である酵母変異株よりも含硫化合物含量が高い酵母変異株を得ることができる理由は明らかではないが、親株とする工程（ｂ）により得られた２株は、ＭＥＴ３０遺伝子以外に互いに異なる変異型遺伝子を有しており、これらの親株を掛け合わせることにより、各親株が有する変異型遺伝子を併せ持つ含硫化合物高含量酵母変異株を得ることができると推察される。
また、本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株を、親株であるサッカロマイセス・セレビシエＹＮＮ２７株と戻し交配させることによっても、含硫化合物含量が乾燥菌体重量当たり２重量％以上である酵母変異株を得ることができる。
このように、本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株は、変異型ＭＥＴ３０遺伝子を有し、かつ、少なくとも１以上のＭＥＴ３０遺伝子以外の変異型遺伝子を有する、含硫化合物含量が高い酵母である。このようなサッカロマイセス・セレビシエ変異株は、例えば、以下のようにして取得することができる。
１．工程（ａ）：変異型ＭＥＴ３０遺伝子を有する酵母変異株の作製
まず、野生株であるサッカロマイセス・セレビシエＹＮＮ２７株に、突然変異処理をすることにより、変異型ＭＥＴ３０遺伝子を有する酵母変異株を得た。
サッカロマイセス・セレビジエＹＮＮ２７株をＹＰＤ培地（グルコース２％、ポリペプトン２％、イーストエキス１％）を含む試験管で対数増殖期まで培養した。この菌体を回収し、常法に従いＥＭＳを用いて変異処理を行った。変異処理は死滅率約７０％になるような条件で行った。
上記のようにして変異処理を施した菌株を２％寒天含有ＹＰＤ平板培地に塗布し、３０℃で４８時間静置培養した。形成したコロニーに対して、ニトロプルシド法により総グルタチオン高含量酵母変異株のスクリーニングを実施した。具体的には、ＹＰＤ寒天平板培地上でコロニー形成を行い、マスタープレートとし、該マスタープレートよりレプリカ布を用いて新規２％寒天含有ＹＰＤ平板培地に菌を複写し、３０℃で１晩培養し、コロニーを形成させ、レプリカプレートを作製した。該レプリカプレート上に２％ニトロプルシッド（Ｓｏｄｉｕｍ Ｎｉｔｏｒｏｐｒｕｓｓｉｄｅ Ｄｉｈｙｄｒａｔｅ）含有５％トリクロロ酢酸溶液を添加し、５分間放置後、ニトロプルシッド含有トリクロロ酢酸溶液を廃棄し、２８％アンモニア水を添加した。これにより、赤く染色したコロニーをマーキングし、対応する菌株をマスタープレートよりピックアップした。
ピックアップした菌株のＭＥＴ３０遺伝子の塩基配列を、シークエンス法により解析し、変異型ＭＥＴ３０遺伝子を有する酵母変異株を１株得、Ｎｏ．１株と名付けた。
まず、野生株であるサッカロマイセス・セレビシエＹＮＮ２７株に、突然変異処理をすることにより、変異型ＭＥＴ３０遺伝子を有する酵母変異株を得た。
サッカロマイセス・セレビジエＹＮＮ２７株をＹＰＤ培地（グルコース２％、ポリペプトン２％、イーストエキス１％）を含む試験管で対数増殖期まで培養した。この菌体を回収し、常法に従いＥＭＳを用いて変異処理を行った。変異処理は死滅率約７０％になるような条件で行った。
上記のようにして変異処理を施した菌株を２％寒天含有ＹＰＤ平板培地に塗布し、３０℃で４８時間静置培養した。形成したコロニーに対して、ニトロプルシド法により総グルタチオン高含量酵母変異株のスクリーニングを実施した。具体的には、ＹＰＤ寒天平板培地上でコロニー形成を行い、マスタープレートとし、該マスタープレートよりレプリカ布を用いて新規２％寒天含有ＹＰＤ平板培地に菌を複写し、３０℃で１晩培養し、コロニーを形成させ、レプリカプレートを作製した。該レプリカプレート上に２％ニトロプルシッド（Ｓｏｄｉｕｍ Ｎｉｔｏｒｏｐｒｕｓｓｉｄｅ Ｄｉｈｙｄｒａｔｅ）含有５％トリクロロ酢酸溶液を添加し、５分間放置後、ニトロプルシッド含有トリクロロ酢酸溶液を廃棄し、２８％アンモニア水を添加した。これにより、赤く染色したコロニーをマーキングし、対応する菌株をマスタープレートよりピックアップした。
ピックアップした菌株のＭＥＴ３０遺伝子の塩基配列を、シークエンス法により解析し、変異型ＭＥＴ３０遺伝子を有する酵母変異株を１株得、Ｎｏ．１株と名付けた。
２．工程（ｂ）：変異型ＭＥＴ３０遺伝子を有し、かつ含硫化合物含量が乾燥菌体重量当たり１．５重量％以上である酵母変異株の作製
Ｎｏ．１株を、ＹＰＤ培地を含む試験管で対数増殖期まで培養し、工程（ａ）と同様にＥＭＳを用いて変異処理を行った後、２％寒天含有ＹＰＤ平板培地に塗布し、３０℃で４８時間静置培養した。形成したコロニーに対して、工程（ａ）と同様にして、ニトロプルシド法により総グルタチオン高含量酵母変異株のスクリーニングを実施した。
スクリーニングにより得られた菌株から、変異型ＭＥＴ３０遺伝子を有し、かつ含硫化合物含量が乾燥菌体重量当たり１．５重量％以上である酵母変異株を選別した。具体的には、マスタープレートよりピックアップしたそれぞれの菌株の総グルタチオン量を、Ｔｉｔｚｅらの方法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ．２７、ｐ５０２、１９６９）に従って測定し、各菌株の乾燥菌体重量で除することにより、乾燥菌体重量当たりの総グルタチオン含量を算出し、乾燥菌体重量当たりの総グルタチオン含量が２重量％である酵母変異株（Ｎｏ．２株）と、２重量％である酵母変異株（Ｎｏ．３株）との２株を得た。
Ｎｏ．２株とＮｏ．３株のＭＥＴ３０遺伝子の塩基配列を、シークエンス法により解析したところ、Ｎｏ．１株と同じ変異型ＭＥＴ３０遺伝子を有する酵母変異株であった。
Ｎｏ．１株を、ＹＰＤ培地を含む試験管で対数増殖期まで培養し、工程（ａ）と同様にＥＭＳを用いて変異処理を行った後、２％寒天含有ＹＰＤ平板培地に塗布し、３０℃で４８時間静置培養した。形成したコロニーに対して、工程（ａ）と同様にして、ニトロプルシド法により総グルタチオン高含量酵母変異株のスクリーニングを実施した。
スクリーニングにより得られた菌株から、変異型ＭＥＴ３０遺伝子を有し、かつ含硫化合物含量が乾燥菌体重量当たり１．５重量％以上である酵母変異株を選別した。具体的には、マスタープレートよりピックアップしたそれぞれの菌株の総グルタチオン量を、Ｔｉｔｚｅらの方法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ．２７、ｐ５０２、１９６９）に従って測定し、各菌株の乾燥菌体重量で除することにより、乾燥菌体重量当たりの総グルタチオン含量を算出し、乾燥菌体重量当たりの総グルタチオン含量が２重量％である酵母変異株（Ｎｏ．２株）と、２重量％である酵母変異株（Ｎｏ．３株）との２株を得た。
Ｎｏ．２株とＮｏ．３株のＭＥＴ３０遺伝子の塩基配列を、シークエンス法により解析したところ、Ｎｏ．１株と同じ変異型ＭＥＴ３０遺伝子を有する酵母変異株であった。
３．工程（ｃ）：含硫化合物含量が乾燥菌体重量当たり２重量％以上である酵母変異株の作製。
Ｎｏ．２株とＮｏ．３株を掛け合わせることにより、含硫化合物含量が乾燥菌体重量当たり２重量％以上である酵母変異株を作製した。具体的には、まず、Ｎｏ．２株とＮｏ．３株のそれぞれに対して、四分子解析を行い、最も含硫化合物含量の高い胞子を選別し、これらの胞子を掛け合わせることにより、乾燥菌体重量当たりの総グルタチオン含量が３重量％である酵母変異株を１株得た。該１株は、ＡＢＹＣ１５７９株と名付けた。
Ｎｏ．２株とＮｏ．３株を掛け合わせることにより、含硫化合物含量が乾燥菌体重量当たり２重量％以上である酵母変異株を作製した。具体的には、まず、Ｎｏ．２株とＮｏ．３株のそれぞれに対して、四分子解析を行い、最も含硫化合物含量の高い胞子を選別し、これらの胞子を掛け合わせることにより、乾燥菌体重量当たりの総グルタチオン含量が３重量％である酵母変異株を１株得た。該１株は、ＡＢＹＣ１５７９株と名付けた。
４．ＡＢＹＣ１５７９株の菌学的性質
ＡＢＹＣ１５７９株は、含硫化合物含量が乾燥菌体重量当たり２重量％以上であること以外は、サッカロマイセス・セレビシエの一般的な菌学的性質と同一である。
ＡＢＹＣ１５７９株を２％寒天含有ＹＰＤ平板培地にて、３０℃で２日間培養して得られたコロニーは、下記の形態的特徴を有する。
（１）大きさ：直径約２ｍｍ、（２）色調：白〜クリーム色、（３）形状：全縁で半レンズ状に隆起した円形、（４）表面形状：スムース、（５）透明度：不透明、（６）粘稠性：バター様。
ＡＢＹＣ１５７９株は、含硫化合物含量が乾燥菌体重量当たり２重量％以上であること以外は、サッカロマイセス・セレビシエの一般的な菌学的性質と同一である。
ＡＢＹＣ１５７９株を２％寒天含有ＹＰＤ平板培地にて、３０℃で２日間培養して得られたコロニーは、下記の形態的特徴を有する。
（１）大きさ：直径約２ｍｍ、（２）色調：白〜クリーム色、（３）形状：全縁で半レンズ状に隆起した円形、（４）表面形状：スムース、（５）透明度：不透明、（６）粘稠性：バター様。
このようにして得られたＡＢＹＣ１５７９株は、含硫化合物含量が乾燥菌体重量当たり２重量％以上であるサッカロマイセス・セレビシエ変異株であり、本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株である。
５．戻し交配株の取得
また、得られたＡＢＹＣ１５７９株を、サッカロマイセス・セレビシエＹＮＮ２７株と戻し交配させることにより、やはり乾燥菌体重量当たりの総グルタチオン含量が３重量％である酵母変異株を１株得た。該１株は、ＡＢＹＣ１５８８株と名付けた。
また、得られたＡＢＹＣ１５７９株を、サッカロマイセス・セレビシエＹＮＮ２７株と戻し交配させることにより、やはり乾燥菌体重量当たりの総グルタチオン含量が３重量％である酵母変異株を１株得た。該１株は、ＡＢＹＣ１５８８株と名付けた。
６．ＡＢＹＣ１５８８株の菌学的性質
ＡＢＹＣ１５８８株は、含硫化合物含量が乾燥菌体重量当たり２重量％以上であること以外は、サッカロマイセス・セレビシエの一般的な菌学的性質と同一である。
ＡＢＹＣ１５８８株を２％寒天含有ＹＰＤ平板培地にて、３０℃で２日間培養して得られたコロニーは、下記の形態的特徴を有する。
（１）大きさ：直径約２ｍｍ、（２）色調：白〜クリーム色、（３）形状：全縁で半レンズ状に隆起した円形、（４）表面形状：スムース、（５）透明度：不透明、（６）粘稠性：バター様。
ＡＢＹＣ１５８８株は、含硫化合物含量が乾燥菌体重量当たり２重量％以上であること以外は、サッカロマイセス・セレビシエの一般的な菌学的性質と同一である。
ＡＢＹＣ１５８８株を２％寒天含有ＹＰＤ平板培地にて、３０℃で２日間培養して得られたコロニーは、下記の形態的特徴を有する。
（１）大きさ：直径約２ｍｍ、（２）色調：白〜クリーム色、（３）形状：全縁で半レンズ状に隆起した円形、（４）表面形状：スムース、（５）透明度：不透明、（６）粘稠性：バター様。
このようにして得られたＡＢＹＣ１５８８株は、含硫化合物含量が乾燥菌体重量当たり２重量％以上であるサッカロマイセス・セレビシエ変異株であり、本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株である。
ＡＢＹＣ１５７９株は、本発明において、突然変異処理により得られた酵母変異株同士を掛け合わせることにより新規に作製されたサッカロマイセス・セレビシエ変異株である。また、ＡＢＹＣ１５８８株は、ＡＢＹＣ１５７９株を戻し交配することにより新規に作製されたサッカロマイセス・セレビシエ変異株である。そこで、出願人は、ＡＢＹＣ１５７９株とＡＢＹＣ１５８８株とを、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１）に新規酵母として寄託した。受託番号は、ＡＢＹＣ１５７９株はＦＥＲＭ ＢＰ−１０９２３であり、ＡＢＹＣ１５８８株はＦＥＲＭ ＢＰ−１０９２４である。また、受託日はいずれも２００７年１０月１９日である。
本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株を培養し、当該変異株菌体内に、乾燥菌体重量当たり２重量％以上の含硫化合物を含有させることにより、含硫化合物高含有酵母を簡便に製造することができる。本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株の培養に用いられる培地は、炭素源、窒素源、及び無機塩等を含み、サッカロマイセス・セレビシエ変異株が増殖可能な培地であれば特に限定されるものではなく、通常サッカロマイセス・セレビシエ等の酵母の培養に用いられるいずれの培地も用いることができる。
本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株を培養するための培地に含有される炭素源としては、例えば、通常の微生物の培養に利用されるグルコース、蔗糖、酢酸、エタノール、糖蜜、及び亜硫酸パルプ廃液等からなる群より選択される１又は２種以上を用いることができる。また、窒素源としては、含窒素無機塩であってもよく、含窒素有機物であってもよい。例えば、尿素、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、コーンスティプリカー（ＣＳＬ）、カゼイン、酵母エキス、及びペプトン等からなる群より選択される１又は２種以上を用いることができる。また、無機塩としては、過リン酸石灰やリン安等のリン酸成分、塩化カリウムや水酸化カリウム等のカリウム成分、硫酸マグネシウムや塩酸マグネシウム等のマグネシウム成分等を用いることができる。その他、亜鉛、銅、マンガン、鉄イオン等の無機塩を使用してもよい。さらに、本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株を培養するための培地には、ビタミン、核酸関連物質等を適宜添加しても良い。このような培地として、例えば、ＹＰＤ培地等が挙げられる。
培養形式は、特に限定されるものではなく、培養スケール、得られた培養物の使用用途等を考慮して適宜決定することができる。例えば、寒天平板培地に塗布して培養してもよく、液体培地中で培養してもよい。液体培地における培養形式として、回分培養、流加培養、連続培養等が挙げられる。例えば、継代培養の場合には、簡便であるため、寒天平板培地上で培養することや、適当な液体培地中で回分培養することが好ましい。また、工業的に含硫化合物高含有酵母を製造し、培養物を量産する場合には、流加培養又は連続培養を行うことが好ましい。
また、本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株の培養条件は、特に限定されるものではなく、サッカロマイセス酵母を培養する場合に一般的に用いられる条件により培養することができる。例えば、培養温度は２０〜４０℃であることが好ましく、２５〜３５℃であることがより好ましい。また、培地のｐＨは３．５〜８．０であることが好ましく、４．０〜７．０であることがより好ましい。特に、工業的に培養物を量産する場合には、培地中のｐＨを定期的に測定し、ｐＨ４．０〜７．０に維持するよう調整することが好ましい。その他、本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株は、他のサッカロマイセス酵母と同様に好気的条件で培養することが好ましい。例えば、回分培養においては、通気量の条件は０．５〜２ｖｖｍであることが好ましく、０．８〜１．５ｖｖｍであることがより好ましい。
例えば、ＹＰＤ培地を用いて、２５〜３５℃、撹拌数１４０〜４００ｒｐｍ、通気量０．８〜１．５ｖｖｍ、ｐＨ４．０〜５．０の条件で、２０時間以上回分培養を行うことにより、本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株の含硫化合物含量を、乾燥菌体重量当たり２重量％以上にすることができる。
本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株を培養することにより、サッカロマイセス・セレビシエの公知株を用いた場合よりも、十分に含硫化合物含有量が高い培養物を得ることができる。このため、該培養物を用いることにより、含硫化合物含量の高い酵母エキス、特に総グルタチオン含量が８重量％以上という含硫化合物含量の高い酵母エキスを調製することができる。
本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株の培養物からの酵母エキスの調製は、特に限定されるものではなく、酵母エキスを調製する場合に通常行われている調製方法のいずれを用いてもよい。該調製方法として、例えば、酵母菌体内に本来あるタンパク質分解酵素等を利用して菌体を可溶化する自己消化法、微生物や植物由来の酵素製剤を添加して菌体を可溶化する酵素分解法、熱水中に一定時間浸漬することにより菌体を可溶化する熱水抽出法、種々の酸あるいはアルカリを添加して菌体を可溶化する酸・アルカリ分解法、凍結・融解を１回以上行うことにより菌体を破砕する凍結融解法、物理的な刺激により菌体を破砕する物理的破砕法等がある。物理的破砕法において用いられる物理的刺激としては、例えば、超音波処理、高圧下におけるホモジェナイズ、グラスビーズ等の固形物との混合による磨砕等がある。
また、本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株の培養物を、乾燥処理することにより、含硫化合物含有量が高い乾燥酵母菌体を得ることができる。該培養物を乾燥処理する方法は、特に限定されるものではなく、乾燥酵母菌体を調製する場合に通常行われている調製方法のいずれを用いてもよい。該調製方法として、例えば、凍結乾燥法、スプレードライ法、ドラムドライ法等がある。さらに、得られた乾燥酵母菌体を粉末状に加工することにより、取り扱い性に優れた含硫化合物含有量が高い乾燥酵母菌末を得ることができる。
その他、本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株の培養物から含硫化合物を含有する分画物を得てもよい。培養物から含硫化合物を含有する分画物を分画する方法としては、通常行われている方法であればいずれの方法でもよい。例えば、熱水抽出、菌体破砕による抽出等により得られた抽出物を、含硫化合物と親和性の高い物質を担持したアフィニティカラムを用いて分画することにより、含硫化合物を高濃度に含む画分に濃縮精製することが可能となる。
本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株の培養物自体や、酵母エキス、乾燥酵母菌体、含硫化合物を含む分画物等の該培養物から調製された調製物は、調味料等の食品添加物として、特に好適に用いることができる。添加される飲食品は、特に限定されるものではなく、例えば、アルコール飲料、清涼飲料、発酵食品、調味料、スープ類、パン類、菓子類等を挙げることができる。その他、該培養物等は、ソフトカプセル剤やハードカプセル剤、打錠剤等に加工することにより、サプリメント等として摂食することもできる。
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］ 総グルタチオン高含有酵母の製造１
まず、２％寒天含有ＹＰＤ平板培地に、ＡＢＹＣ１５７９株とＡＢＹＣ１５８８株とをそれぞれ植菌し、３０℃のインキュベーターにて一晩静置培養行い、継代培養プレートを作製し、４℃にて保存した。
該継代培養プレートから１白金耳のコロニーをそれぞれ採取し、５ｍＬのＹＰＤ培地に植菌し、３０℃で１晩培養したものを前培養液とした。その後、１０ｍＬのＹＰＤ培地に前培養液を最終濃度５％となるように添加して植菌し、３０℃、撹拌数１６０ｒｐｍで１８時間培養した。該培養物中の各菌株に含有される総グルタチオン量を、Ｔｉｔｚｅらの方法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ．２７、ｐ５０２、１９６９）に従って測定し、各菌株の乾燥菌体重量で除することにより、乾燥菌体重量当たりの総グルタチオン含量を算出した。この結果、各培養物中の菌体の乾燥菌体重量当たりの総グルタチオン含量は、ＡＢＹＣ１５７９株は２．７重量％であり、ＡＢＹＣ１５８８株は２．８重量％であった。
まず、２％寒天含有ＹＰＤ平板培地に、ＡＢＹＣ１５７９株とＡＢＹＣ１５８８株とをそれぞれ植菌し、３０℃のインキュベーターにて一晩静置培養行い、継代培養プレートを作製し、４℃にて保存した。
該継代培養プレートから１白金耳のコロニーをそれぞれ採取し、５ｍＬのＹＰＤ培地に植菌し、３０℃で１晩培養したものを前培養液とした。その後、１０ｍＬのＹＰＤ培地に前培養液を最終濃度５％となるように添加して植菌し、３０℃、撹拌数１６０ｒｐｍで１８時間培養した。該培養物中の各菌株に含有される総グルタチオン量を、Ｔｉｔｚｅらの方法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ．２７、ｐ５０２、１９６９）に従って測定し、各菌株の乾燥菌体重量で除することにより、乾燥菌体重量当たりの総グルタチオン含量を算出した。この結果、各培養物中の菌体の乾燥菌体重量当たりの総グルタチオン含量は、ＡＢＹＣ１５７９株は２．７重量％であり、ＡＢＹＣ１５８８株は２．８重量％であった。
［実施例２］ 総グルタチオン高含有酵母の製造２
実施例１と同様にして作製した継代培養プレートから１白金耳のコロニーをそれぞれ採取し、５０ｍＬのＹＰＤ培地に植菌し、３０℃で１晩培養したものを前培養液とした。その後、５Ｌ容量のジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社製）に、１．５ＬのＹＰＤ培地を入れ、さらに、前培養液を添加して、初発菌数が１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように植菌し、３０℃、撹拌数２５０ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍとして、回分培養を行った。回分培養時の培地中のｐＨは、アンモニア水を用いて４．５に維持した。なお、同様にして、公知のサッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株を培養したものを対照とした。
培養開始後１２〜２４時間目に、５０ｍＬの培養物（ＡＢＹＣ１５７９株含有ＹＰＤ培地、ＡＢＹＣ１５８８株含有ＹＰＤ培地、又はＳ２８８Ｃ株含有ＹＰＤ培地）をそれぞれ分取し、各培養物中の菌株に含有される乾燥菌体重量当たりの総グルタチオン含量を実施例１と同様にして測定した。
実施例１と同様にして作製した継代培養プレートから１白金耳のコロニーをそれぞれ採取し、５０ｍＬのＹＰＤ培地に植菌し、３０℃で１晩培養したものを前培養液とした。その後、５Ｌ容量のジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社製）に、１．５ＬのＹＰＤ培地を入れ、さらに、前培養液を添加して、初発菌数が１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように植菌し、３０℃、撹拌数２５０ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍとして、回分培養を行った。回分培養時の培地中のｐＨは、アンモニア水を用いて４．５に維持した。なお、同様にして、公知のサッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株を培養したものを対照とした。
培養開始後１２〜２４時間目に、５０ｍＬの培養物（ＡＢＹＣ１５７９株含有ＹＰＤ培地、ＡＢＹＣ１５８８株含有ＹＰＤ培地、又はＳ２８８Ｃ株含有ＹＰＤ培地）をそれぞれ分取し、各培養物中の菌株に含有される乾燥菌体重量当たりの総グルタチオン含量を実施例１と同様にして測定した。
この結果、本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株であるＡＢＹＣ１５７９株とＡＢＹＣ１５８８株では、いずれも培養開始後２０時間以上経過時には、乾燥菌体重量当たりの総グルタチオン含量が２重量％以上であった。一方、公知株であるＳ２８８Ｃ株は、０．６重量％程度であり、本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株が非常にグルタチオン等の含硫化合物含量の高い酵母であることが明らかである。
［実施例３］ 酵母エキスの調製
実施例２で調製した２４時間培養後の各菌株の培養物を用いて酵母エキスを調製した。
まず、各培養物を遠心分離処理することにより、含有されていた酵母を沈殿として回収し、蒸留水で洗浄した。その後、菌体濃度が１０〜１５％となるように適量の蒸留水を加えて酵母懸濁液を作成した。該酵母懸濁液を８５℃で７０秒間加熱した後に急速冷却し、遠心分離処理することにより、エキス分を回収した。回収したエキス分を乾燥させて酵母エキスを調製した。
得られた酵母エキス中の総グルタチオン含量を、実施例１と同様にして測定したところ、ＡＢＹＣ１５７９株培養物由来酵母エキスでは８．４重量％、ＡＢＹＣ１５８８株培養物由来酵母エキスでは８．１重量％であった。これに対して、Ｓ２８８Ｃ株培養物由来酵母エキスでは２．２重量％であった。
この結果から、本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株を用いることにより、総グルタチオン含量が８重量％以上という含硫化合物含量の高い良好な酵母エキスを調製し得ることが明らかである。
実施例２で調製した２４時間培養後の各菌株の培養物を用いて酵母エキスを調製した。
まず、各培養物を遠心分離処理することにより、含有されていた酵母を沈殿として回収し、蒸留水で洗浄した。その後、菌体濃度が１０〜１５％となるように適量の蒸留水を加えて酵母懸濁液を作成した。該酵母懸濁液を８５℃で７０秒間加熱した後に急速冷却し、遠心分離処理することにより、エキス分を回収した。回収したエキス分を乾燥させて酵母エキスを調製した。
得られた酵母エキス中の総グルタチオン含量を、実施例１と同様にして測定したところ、ＡＢＹＣ１５７９株培養物由来酵母エキスでは８．４重量％、ＡＢＹＣ１５８８株培養物由来酵母エキスでは８．１重量％であった。これに対して、Ｓ２８８Ｃ株培養物由来酵母エキスでは２．２重量％であった。
この結果から、本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株を用いることにより、総グルタチオン含量が８重量％以上という含硫化合物含量の高い良好な酵母エキスを調製し得ることが明らかである。
本発明のサッカロマイセス・セレビシエ変異株は、グルタチオン等の含硫化合物含量が高く、該変異株を培養することにより、簡便に含硫化合物含有量の高い酵母培養物や酵母エキス等を製造することができるため特に食品分野等で利用が可能である。
ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９２３
ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９２４
ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９２４
Claims (10)
- 含硫化合物含量が乾燥菌体重量当たり２重量％以上であり、下記工程（ａ）〜（ｃ）より得ることができることを特徴とするサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）変異株。
（ａ）サッカロマイセス・セレビシエＹＮＮ２７に突然変異処理することにより、変異型ＭＥＴ３０遺伝子を有する酵母変異株を得る工程と、
（ｂ）工程（ａ）により得られた酵母変異株に突然変異処理することにより、変異型ＭＥＴ３０遺伝子を有し、かつ含硫化合物含量が乾燥菌体重量当たり１．５重量％以上である酵母変異株を２以上得る工程と、
（ｃ）工程（ｂ）により得られた酵母変異株のうちの２株を掛け合わせることにより、含硫化合物含量が乾燥菌体重量当たり２重量％以上である酵母変異株を得る工程。 - サッカロマイセス・セレビシエＡＢＹＣ１５７９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９２３）であることを特徴とする、請求項１記載のサッカロマイセス・セレビシエ変異株。
- 含硫化合物含量が乾燥菌体重量当たり２重量％以上であり、請求項１又は２記載のサッカロマイセス・セレビシエ変異株を、サッカロマイセス・セレビシエＹＮＮ２７と交配させることにより得られることを特徴とするサッカロマイセス・セレビシエ変異株。
- サッカロマイセス・セレビシエＡＢＹＣ１５８８株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９２４）であることを特徴とする、請求項３記載のサッカロマイセス・セレビシエ変異株。
- 請求項１〜４のいずれか一項に記載のサッカロマイセス・セレビシエ変異株を培養し、当該変異株菌体内に、乾燥菌体重量当たり３重量％以上の含硫化合物を含有させることを特徴とする、含硫化合物高含有酵母の製造方法。
- 請求項１〜４のいずれか一項に記載のサッカロマイセス・セレビシエ変異株の培養物。
- 請求項１〜４のいずれか一項に記載のサッカロマイセス・セレビシエ変異株の培養物から酵母エキスを調製することを特徴とする、酵母エキスの調製方法。
- 請求項１〜４のいずれか一項に記載のサッカロマイセス・セレビシエ変異株の培養物を分画して、含硫化合物を含む分画物を得ることを特徴とする、含硫化合物を含む分画物の調製方法。
- 前記含硫化合物がグルタチオンであることを特徴とする請求項８記載の含硫化合物を含む分画物の調製方法。
- 請求項６に記載の培養物、又は請求項８若しくは９に記載の含硫化合物を含む分画物の調製方法により調製された分画物を含有させることを特徴とする含硫化合物含有飲食品の製造方法。
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