WO2020115993A1 - コク味付与物質含有酵母の製造方法及びコク味付与物質含有酵母エキスの製造方法 - Google Patents

コク味付与物質含有酵母の製造方法及びコク味付与物質含有酵母エキスの製造方法 Download PDF

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WO2020115993A1
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WO
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yeast
valine
imparting substance
abu
kokumi
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PCT/JP2019/037028
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智和 井野
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アサヒグループ食品株式会社
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    • A23L31/10—Yeasts or derivatives thereof
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a kokumi-imparting substance-containing yeast containing at least one of ⁇ -Glu-Abu and ⁇ -Glu-Abu-Gly, and a method for producing a kokumi-imparting substance-containing yeast extract using the yeast. ..
  • Yeast extract prepared from yeast cells has the function of imparting umami and rich taste to foods and is widely used in the food field as food additives such as seasonings. Demand for yeast extract is increasing due to the recent increase in natural orientation.
  • Glutathione which is a tripeptide consisting of glutamic acid, cysteine, and glycine, is known as one of the components that impart a rich taste to foods.
  • GSH Glutathione
  • a yeast mutant strain in which at least a part of the DOA1 gene and at least a part of the MET30 gene are deleted or mutated see, for example, Patent Document 1).
  • a yeast mutant having a mutant MET30 gene is subjected to a mutation treatment to obtain two or more yeast mutants having a high glutathione content, and the obtained yeast mutants are multiplied to obtain a yeast having a higher GSH content.
  • Patent Document 2 A technique for obtaining a mutant strain (see, for example, Patent Document 2) has been proposed.
  • ⁇ -Glu-X, ⁇ -Glu-X-Gly (X represents an amino acid or an amino acid derivative excluding Cys and its derivative) is also known as a component that imparts a rich taste to foods (for example,).
  • Patent Document 3 So far, Abu (L-2-aminobutyric acid) and ⁇ -Glu-Abu (L- ⁇ -glutamyl-L-2 aminobutyric acid) have been added as a technique for increasing the content of the component imparting the rich taste.
  • a technique for culturing yeast in the above medium and preparing a yeast extract containing ⁇ -Glu-Abu from the obtained cells see, for example, Patent Document 4
  • a technique for increasing the content of at least one selected from Abu, ⁇ -Glu-Abu, and ⁇ -Glu-Abu-Gly in yeast cells has been proposed (see, for example, Patent Document 5).
  • the present invention aims to solve the above-mentioned problems in the related art and achieve the following objects. That is, the present invention provides a method for producing a kokumi-imparting substance-containing yeast containing at least one of ⁇ -Glu-Abu and ⁇ -Glu-Abu-Gly and a method for producing a kokumi-imparting substance-containing yeast extract.
  • the purpose is to
  • the present inventors modified the intracellular acetolactate synthase activity to reduce, and grow isoleucine and valine-requiring yeast to produce isoleucine in the medium.
  • the content of ⁇ -Glu-Abu and ⁇ -Glu-Abu-Gly in the yeast is cultivated by adding valine to the medium when the content of It was found that the amount can be significantly increased.
  • the present invention is based on the above findings of the present inventors, and means for solving the above problems are as follows. That is, ⁇ 1> A yeast growth step of culturing yeast that is modified to reduce intracellular acetolactate synthase activity and isoleucine- and valine-requiring yeast in a medium containing isoleucine and valine, and growing the same.
  • valine is added to the medium to culture the yeast, and a kokumi-imparting substance producing step of producing a kokumi-imparting substance is included,
  • a yeast extract is prepared from a kokumi-imparting substance-containing yeast obtained by the method for producing a kokumi-imparting substance-containing yeast according to ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein the yeast extract is prepared. It is a method for producing an extract.
  • the said various problems in the past can be solved, the said objective can be achieved, and the rich taste imparting substance containing high content of at least any of (gamma)-Glu-Abu and (gamma)-Glu-Abu-Gly.
  • a method for producing a yeast and a method for producing a yeast extract containing a body-giving taste substance can be provided.
  • FIG. 1A is a diagram showing the results of measuring the content of isoleucine in the culture supernatant in the main culture of Test Example 1.
  • FIG. 1B is a diagram showing the results of measuring the content of valine in the culture supernatant in the main culture of Test Example 1.
  • FIG. 1C is a diagram showing the results of measuring the dry yeast cell weight in the main culture of Test Example 1.
  • FIG. 1D is a diagram showing the results of measuring the amount of ⁇ -Glu-Abu per dry yeast cell weight in the main culture of Test Example 1.
  • FIG. 1E is a diagram showing the results of measuring the amount of ⁇ -Glu-Abu-Gly per dry yeast cell weight in the main culture of Test Example 1.
  • FIG. 1A is a diagram showing the results of measuring the content of isoleucine in the culture supernatant in the main culture of Test Example 1.
  • FIG. 1B is a diagram showing the results of measuring the content of valine in the culture supernatant in the main culture of Test Example 1.
  • FIG. 1F is a diagram showing the results of measuring the amount of Abu per dry yeast cell weight in the main culture of Test Example 1.
  • FIG. 2A is a diagram showing the results of measuring the content of isoleucine in the culture supernatant in the main culture of Test Example 2.
  • FIG. 2B is a diagram showing the results of measuring the content of valine in the culture supernatant in the main culture of Test Example 2.
  • FIG. 2C is a diagram showing the results of measuring the dry yeast cell weight in the main culture of Test Example 2.
  • FIG. 2D is a diagram showing the results of measuring the amount of ⁇ -Glu-Abu per dry yeast cell weight in the main culture of Test Example 2.
  • FIG. 2E is a diagram showing the results of measuring the amount of ⁇ -Glu-Abu-Gly per dry yeast cell weight in the main culture of Test Example 2.
  • FIG. 2F is a diagram showing the results of measuring the amount of Abu per dry yeast cell weight in the main culture of Test Example 2.
  • FIG. 3A is a diagram showing the results of measuring the content of isoleucine in the culture supernatant in the main culture of Test Example 3.
  • FIG. 3B is a diagram showing the results of measuring the content of valine in the culture supernatant in the main culture of Test Example 3.
  • FIG. 3C is a diagram showing the results of measuring the dry yeast cell weight in the main culture of Test Example 3.
  • FIG. 3A is a diagram showing the results of measuring the content of isoleucine in the culture supernatant in the main culture of Test Example 3.
  • FIG. 3B is a diagram showing the results of measuring the content of valine in the culture supernatant in the main culture of Test Example 3.
  • FIG. 3C is a
  • FIG. 3D is a diagram showing the results of measuring the amount of ⁇ -Glu-Abu per dry yeast cell weight in the main culture of Test Example 3.
  • FIG. 3E is a diagram showing the results of measuring the amount of ⁇ -Glu-Abu-Gly per dry yeast cell weight in the main culture of Test Example 3.
  • FIG. 3F is a diagram showing the results of measuring the amount of Abu per dry yeast cell weight in the main culture of Test Example 3.
  • FIG. 4A is a drawing 1 showing the results of measuring the content of isoleucine in the culture supernatant in the main culture of Test Example 5.
  • FIG. 4B is a diagram showing the results of measuring the content of valine in the culture supernatant in the main culture of Test Example 5.
  • FIG. 4C is FIG.
  • FIG. 4D is a drawing showing the results of measuring the amount of ⁇ -Glu-Abu per dry yeast cell weight in the main culture of Test Example 5.
  • FIG. 4E is a diagram showing the results of measuring the amount of ⁇ -Glu-Abu-Gly per dry yeast cell weight in the main culture of Test Example 5.
  • FIG. 4F is FIG. 1 showing the results of measuring the amount of Abu per dry yeast cell weight in the main culture of Test Example 5.
  • FIG. 4G is a figure 2 showing the results of measuring the content of isoleucine in the culture supernatant of the main culture of Test Example 5.
  • FIG. 4H is a figure 2 showing the result of measuring the content of valine in the culture supernatant in the main culture of Test Example 5.
  • FIG. 4I is a figure 2 which shows the result of having measured the dry yeast cell weight in the main culture of Test Example 5.
  • FIG. 4J is a figure 2 showing the results of measuring the amount of ⁇ -Glu-Abu per dry yeast cell weight in the main culture of Test Example 5.
  • FIG. 4K is a figure 2 showing the results of measuring the amount of ⁇ -Glu-Abu-Gly per dry yeast cell weight in the main culture of Test Example 5.
  • FIG. 4L is a figure 2 showing the results of measuring the amount of Abu per dry yeast cell weight in the main culture of Test Example 5.
  • the method for producing a kokumi-imparting substance-containing yeast of the present invention includes at least a proliferation step and a kokumi-imparting substance producing step, and further includes other steps as necessary.
  • the body-giving substance in the present invention means at least one of ⁇ -Glu-Abu and ⁇ -Glu-Abu-Gly.
  • Abu and Glu are L-form.
  • the above-mentioned growth step is a step of culturing yeast which is modified to reduce intracellular acetolactate synthase activity and isoleucine- and valine-requiring yeast in a medium containing isoleucine and valine to grow the yeast.
  • yeast The yeast is modified so that the intracellular acetolactate synthase activity is reduced, and is isoleucine and valine auxotrophic.
  • the yeast may be budding yeast or fission yeast.
  • the budding yeasts include Saccharomyces cerevisiae and other Saccharomyces spp., Candida utilis and other Candida spp. ) And the like belonging to the genus Hansenula and the like.
  • the fission yeast include yeasts belonging to the genus Schizosaccharomyces such as Schizosaccharomyces pombe. Among these, Saccharomyces cerevisiae and Candida utilis, which are often used for producing yeast extract, are preferable.
  • the yeast may be haploid or diploid or more polyploid.
  • the isoleucine- and valine-requiring yeast modified so that the intracellular acetolactate synthase activity is reduced is at least 1 selected from Abu, ⁇ -Glu-Abu, and ⁇ -Glu-Abu-Gly in yeast cells. It is known to have a high content of seeds (see WO 2015/005378).
  • As the isoleucine- and valine-requiring yeast modified so that the intracellular acetolactate synthase activity is reduced those produced by modification or the like may be used, or commercially available products may be used.
  • the acetolactate synthase refers to a protein having an activity of catalyzing the reaction of producing ⁇ -acetohydroxybutyric acid and CO 2 from pyruvic acid and ⁇ -ketobutyric acid ( ⁇ -KB) (EC 2.2.1.6). ). Further, the same activity is also referred to as “acetolactate synthase activity”. In the present invention, acetolactate synthase may or may not have an activity of catalyzing the reaction of producing acetolactate and CO 2 from two molecules of pyruvic acid.
  • Modified to reduce intracellular acetolactate synthase activity as a method of modifying yeast to be isoleucine and valine auxotrophic, there is no particular limitation, it is possible to appropriately select a known method, for example, The method etc. which are described in the international publication 2015/005378 are mentioned. Specifically, for example, by disrupting the ILV2 gene that encodes the active subunit of acetolactate synthase, intracellular acetolactate synthase activity is reduced, resulting in isoleucine and valine auxotrophy.
  • the nucleotide sequence information of the ILV2 gene can be obtained from public databases and the like, and for example, the nucleotide sequence of the ILV2 gene of Saccharomyces cerevisiae is disclosed in Saccharomyces Genome Database (http://www.eastgenome.org/). Has been done.
  • the method for destroying the ILV2 gene is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected.
  • the decrease in acetolactate synthase activity can be confirmed, for example, by preparing crude enzyme solutions from the yeast before modification and the yeast after modification and comparing the acetolactate synthase activities.
  • the acetolactate synthase activity can be measured, for example, by a known method (FC Stormer and HE Umberger, Biochem. Biophys. Res. Commun., 17, 5, 587-592 (1964)).
  • the yeast may be modified so that the intracellular acetolactate synthase activity is reduced, and may have other properties, if necessary, in addition to the property of requiring isoleucine and valine.
  • the other properties are not particularly limited as long as they do not impair the effects of the present invention, and can be appropriately selected depending on the purpose, but it is preferable that glutathione-producing ability is enhanced, and threonine resistance is further improved. It is more preferable to have.
  • the method for enhancing the glutathione production ability of the yeast is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose.
  • yeast modified so that the glutathione production ability is enhanced and the cells Modified to reduce the acetolactate synthase activity in the cells, by crossing with isoleucine and valine-requiring yeast by a known method, modified to reduce the intracellular acetolactate synthase activity, isoleucine and valine. It is possible to select a yeast that is auxotrophic and has an enhanced ability to produce glutathione.
  • yeast modified so as to enhance the glutathione production ability those produced by modification or the like may be used, or commercially available products may be used.
  • the method for modifying yeast so as to enhance the glutathione production ability is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected, for example, JP 2010-29147 A (Patent No. 5496480).
  • a method for deleting or mutating at least a part of the DOA1 gene and at least a part of the MET30 gene as described in JP-A-2011-160739 Japanese Patent No. 5667365. Mutation treatment is performed on the yeast mutant having the MET30 gene to obtain two or more yeast mutants having a high glutathione content, and the yeast mutants obtained are multiplied to obtain a yeast mutant having a higher glutathione content. Method etc. are mentioned.
  • the ability to produce glutathione was enhanced by, for example, measuring the amount of total glutathione in the yeast before modification and the yeast after modification according to the method of Titze et al. (Analytical Biochemistry, Vol. 27, p502, 1969). It can be confirmed by comparing the amounts.
  • the method for obtaining the yeast having threonine resistance is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected. Examples thereof include a method in which threonine is added to the medium and the grown yeast is selected.
  • the medium used in the growth step is not particularly limited as long as it contains at least isoleucine and valine and the yeast can grow, and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the content of isoleucine in the medium used in the growth step is not particularly limited as long as the yeast can grow, and can be appropriately selected depending on the amount of the target yeast and the like.
  • the mass% to 2.0 mass% is preferable, and the mass 0.1 to 1.0 mass% is more preferable.
  • the content of valine in the medium used in the growth step is not particularly limited as long as the yeast can grow, and can be appropriately selected depending on the amount of the target yeast and the like.
  • the mass% to 2.0 mass% is preferable, and the mass 0.1 to 1.0 mass% is more preferable.
  • the components other than isoleucine and valine and the amounts thereof in the medium used in the growth step are not particularly limited, and those used for culturing microorganisms such as yeast can be appropriately selected.
  • carbon sources include glucose, sucrose, acetic acid, ethanol, molasses, sulfite waste liquor and the like. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the nitrogen source include inorganic salts such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride and ammonium phosphate, nitrogen-containing organic substances such as corn steep liquor, casein, yeast extract and peptone. These may be used alone or in combination of two or more.
  • phosphate components such as lime superphosphate and ammonium phosphate
  • potassium components such as potassium chloride and potassium hydroxide
  • magnesium components such as magnesium sulfate and magnesium chloride
  • inorganic salts such as zinc, copper, manganese and iron ions, vitamins. Etc. may be added to the medium.
  • the yeast culture format in the proliferation step is not particularly limited, and a general yeast culture format can be appropriately selected, and examples thereof include batch culture, fed-batch culture, and continuous culture. Among these, fed-batch culture and continuous culture are preferable from the viewpoint of production on an industrial scale.
  • the conditions for culturing the yeast in the growth step are not particularly limited, and general conditions for culturing yeast can be appropriately selected.
  • the temperature is preferably 20°C to 40°C, more preferably 25°C to 35°C.
  • the pH is preferably 3.5 to 7.5, more preferably 4.0 to 6.9.
  • the culture is preferably carried out under aerobic conditions, and more preferably with aeration or stirring.
  • the amount of aeration and the conditions of stirring are not particularly limited and can be appropriately selected in consideration of the volume and time of culture, the initial concentration of bacteria, and the like.
  • aeration is 0.2 V.V. V. M. (Volume per volume per minutes) to 2V. V. About M and stirring can be performed at about 50 rpm to 900 rpm.
  • the culture time is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the amount of the target yeast.
  • the amount of yeast in the culture after the growth step is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the yeast dry cell weight is about 0.5% to 6%. Can be mentioned.
  • the method for measuring the dry yeast cell weight is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected.
  • the kokumi-imparting substance producing step is a step of culturing the yeast by adding valine to the medium when the content of isoleucine in the medium is less than 0.2% by mass to produce a kokumi-imparting substance. is there.
  • the content of isoleucine in the medium when valine is added to the medium in the kokumi imparting substance producing step is not particularly limited as long as it is less than 0.2% by mass, and can be appropriately selected depending on the purpose. However, 0.05 mass% or less is preferable, 0.02 mass% or less is more preferable, and 0.01 mass% or less is particularly preferable.
  • the method for measuring the amount of isoleucine in the medium is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected, and examples thereof include the method described in the item of Examples described later.
  • the content of valine in the medium when valine is added to the medium in the kokumi imparting substance producing step is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 0.1% by mass or less. 0.05 mass% or less is more preferable, and 0.01 mass% or less is particularly preferable.
  • the method for measuring the amount of valine in the medium is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected, and examples thereof include the method described in the item of Examples described later.
  • the amount of valine added to the medium in the kokumi-imparting substance producing step is not particularly limited as long as it can produce the kokumi-imparting substance, and can be appropriately selected depending on the purpose, but once
  • the amount (mass) is preferably 0.5% or more, more preferably 1% or more, and particularly preferably 2.5% or more, based on the dry yeast cell weight. Within the preferable range, the amount of the kokumi-imparting substance can be increased, which is advantageous.
  • the upper limit of the amount of valine added to the medium is not particularly limited as long as it does not impair the effects of the present invention, and can be appropriately selected depending on the purpose. For example, it is 5% per body weight.
  • the number of times valine is added to the medium in the kokumi-imparting substance producing step may be once or twice or more.
  • threonine is further added to the medium in the kokumi imparting substance producing step.
  • the threonine may be added to the medium at the same time as the valine, or may be added at a different time, but at the same time as the valine, the amount of the kokumi-imparting substance can be increased. It is preferable to add.
  • the amount of threonine added to the medium in the kokumi-imparting substance producing step is not particularly limited as long as it does not impair the effects of the present invention, and can be appropriately selected according to the purpose.
  • the amount of the kokumi-imparting substance can be increased, which is advantageous.
  • the upper limit of the amount of threonine added to the medium is not particularly limited as long as it does not impair the effects of the present invention, and can be appropriately selected depending on the purpose. For example, it may be 10% per body weight.
  • the number of times threonine is added to the medium in the body taste imparting substance producing step may be once or twice or more.
  • the same medium as used in the growing step can be used, except for the amounts of isoleucine and valine and, if necessary, threonine.
  • the yeast culture format in the kokumi-imparting substance producing step is not particularly limited, and a general yeast culture format can be appropriately selected, for example, the same as the proliferation step. it can.
  • the content of the kokumi-imparting substance in the yeast obtained in the kokumi-imparting substance producing step is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • ⁇ -Glu-Abu and ⁇ -Glu- The total amount (mass) of Abu-Gly is preferably 0.3% or more, more preferably 0.6% or more, still more preferably 1.0% or more, still more preferably 1.3% or more, based on the dry yeast cell weight. Particularly preferred.
  • the upper limit of the content of the kokumi-imparting substance in the yeast obtained in the kokumi-imparting substance producing step is not particularly limited, as long as the effect of the present invention is not impaired, and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the total amount (mass) of ⁇ -Glu-Abu and ⁇ -Glu-Abu-Gly is, for example, 5% based on the dry yeast cell weight.
  • the ratio of the contents of ⁇ -Glu-Abu and ⁇ -Glu-Abu-Gly is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
  • the method for measuring the amount of the body taste imparting substance in the yeast is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected, and examples thereof include the method described in the item of Examples described later.
  • the yeast may contain a component other than ⁇ -Glu-Abu and ⁇ -Glu-Abu-Gly that contributes to imparting a rich flavor.
  • the other steps are not particularly limited as long as they do not impair the effects of the present invention, and can be appropriately selected according to the purpose, and examples thereof include a pre-culturing step for preparing yeast used in the growth step. ..
  • the yeast culturing method, culturing conditions, and medium in the pre-culturing step are not particularly limited, and the culturing method, culturing conditions, and medium generally used for culturing microorganisms such as yeast can be selected depending on the purpose. Can be appropriately selected.
  • the yeast culture obtained in the kokumi imparting substance producing step may be subjected to a drying treatment to obtain yeast dry cells having a high content of the kokumi imparting substance.
  • the method of the drying treatment is not particularly limited and can be appropriately selected from the methods usually used when preparing yeast dry cells, for example, freeze-drying method, spray-drying method, drum-drying method, etc. Is mentioned.
  • the obtained yeast dry cells may be processed into powder.
  • yeast having a high content of the kokumi-imparting substance can be produced, and it can be applied to production on an industrial scale.
  • a yeast extract is prepared from the yeast containing a flavor imparting substance obtained by the method for producing a yeast containing a flavor imparting substance according to the present invention.
  • the method for preparing the yeast extract is not particularly limited, and a general method for preparing a yeast extract can be appropriately selected.
  • yeast cells can be prepared by utilizing the protease originally present in yeast cells.
  • the physical stimulus is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include ultrasonic treatment, homogenization under high pressure, and grinding by mixing with solid matter such as glass beads. ..
  • the content of the body taste imparting substance in the yeast extract is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the total amount of ⁇ -Glu-Abu and ⁇ -Glu-Abu-Gly (mass ) based on the yeast extract dry weight, more than 1% is preferable, 5% or more is more preferable, and 10% or more is particularly preferable.
  • the upper limit of the content of the body taste imparting substance in the yeast extract is appropriately selected depending on the intended purpose without any limitation, provided that the effects of the present invention are not impaired.
  • ⁇ -Glu-Abu The total amount (mass) of ⁇ -Glu-Abu-Gly and the like may be 17% based on the dry weight of yeast extract.
  • the ratio of the contents of ⁇ -Glu-Abu and ⁇ -Glu-Abu-Gly is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
  • the method for measuring the amount of the kokumi-imparting substance in the yeast extract is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected.
  • a method for measuring the amount of the kokumi-imparting substance in yeast described above and A method of measuring in the same manner may be used.
  • the yeast extract may contain components other than ⁇ -Glu-Abu and ⁇ -Glu-Abu-Gly that contribute to imparting a rich flavor.
  • a yeast extract having a high content of the kokumi-imparting substance can be produced, and is applicable to production on an industrial scale.
  • the use of the kokumi-imparting substance-containing yeast and kokumi-imparting substance-containing yeast extract obtained by the production method of the present invention is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, for example, various foods and drinks and It can be used as a supplement.
  • ⁇ Parent strain (haploid: a type)>
  • An ILV2 mutant NCYC868 strain (a type) (obtained from National Collection of Yeast Cultures) was used as a strain that is modified to reduce intracellular acetolactate synthase activity and is isoleucine and valine auxotrophic.
  • ⁇ Parent strain (haploid: ⁇ type)> As a strain modified to enhance the ability to produce glutathione, Saccharomyces cerevisiae ABYC1588 strain (accession number FERM BP-10924, incorporated administrative agency industry) described in JP2011-160739A (Patent No. 5667365) The strain was deposited at the Japan Patent Organism Depositary (1-1-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan), and the deposit date is October 19, 2007.) ( ⁇ type) was obtained.
  • haploid (a type) and the haploid ( ⁇ type) were joined by a conventional method, and the cells were cultured as follows. -Pre-culture- One platinum loop colony was inoculated into 5 mL of YPD medium and cultured at 30° C. overnight to obtain a preculture liquid.
  • molasses urea medium having the following composition was prepared in a 200 mL baffled Erlenmeyer flask, the whole amount of the preculture solution was inoculated, and the mixture was cultured at 30° C. and a stirring rate of 200 rpm for 48 hours.
  • Molasses urea medium --- ⁇ Molasses (converted to total sugar) ⁇ 8.0 mass% ⁇ Urea ⁇ 0.3 mass% ⁇ Ammonium sulfate ⁇ 0.08 mass% ⁇ Diammonium hydrogen phosphate ⁇ 0.04 mass% -YNB w/o AA AS ...
  • the dry yeast cell weight after the main culture (hereinafter sometimes referred to as “DCW”) was measured by a conventional method.
  • DCW dry yeast cell weight after the main culture
  • GSH content total amount of glutathione in the yeast after the main culture
  • ⁇ Selection-2> Tetrad isolation was performed on the diploid strain selected in ⁇ Selection-1>.
  • the separated bacterium was applied to the following medium to isolate a strain (isoleucine and valine co-auxotrophic strain) which grew only in (iv) SD medium containing isoleucine and valine.
  • -Culture medium- (I) SD medium (ii) SD medium containing 0.01% by mass of isoleucine (iii) SD medium containing 0.01% by mass of valine (iv) 0.01% by mass of isoleucine and 0.01% by mass of valine SD medium containing
  • the isolated strain was subjected to preculture and main culture in the same manner as the culture described in ⁇ Selection-1> above.
  • the weight of dried yeast cells after the culture was measured by a conventional method. Further, the contents of ⁇ -Glu-Abu and ⁇ -Glu-Abu-Gly which are the body-giving substances in the yeast after the culture and Abu which is the precursor thereof were measured as follows.
  • the peptide was fluorescently derivatized with 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate (AQC) and detected by LC-MS/MS. Specifically, 2.5 ⁇ L of a sample diluted to an appropriate concentration or 2.5 ⁇ L of a standard solution containing 1 ⁇ M of Abu, ⁇ -Glu-Abu, and ⁇ -Glu-Abu-Gly was added to 2.5 ⁇ L of MillQ water, 5 ⁇ M internal standard substance solution (3-methyl-His-d2 (Sigma), Gly-d2 (Sigma).
  • borate buffer AccQ- manufactured by Japan Waters
  • Fluor registered trademark
  • the ratio of mobile phase B to the mixed solution is as follows. 0 minutes (5%), 0 minutes to 17 minutes (5% to 40%), 17 minutes to 17.1 minutes (40% to 80%), 17.1 minutes to 19 minutes (80%), 19 minutes to 19.1 minutes (80% to 5%), 19.1 minutes to 27 minutes (5%).
  • An excellent haploid strain was selected using the content of the body-giving substance measured above and the dry yeast cell weight as an index.
  • ⁇ Acquisition of diploids> The haploid strains obtained in ⁇ Selection-2> were selected into a-type and ⁇ -type, and mating was carried out by a conventional method to obtain a plurality of diploid strains.
  • ⁇ Selection-3> The strain obtained in ⁇ Acquisition of diploid> was subjected to fed-batch culture as follows using a flask or a jar. -Culture (flask)- Preculture and main culture were performed in the same manner as the culture described in ⁇ Selection-1> above.
  • the dry yeast cell weight after the main culture was measured by a conventional method.
  • the content of the kokumi-imparting substance in the yeast after the main culture was measured in the same manner as in the method described in the item ⁇ Selection-2>.
  • An excellent diploid strain (hereinafter sometimes referred to as “K16 strain”) was selected using the measured content of the body-giving substance and the yeast dry cell weight as indexes.
  • the K16 strain is a strain that has been modified so that the intracellular acetolactate synthase activity is reduced, isoleucine and valine auxotrophic, and has an increased ability to produce glutathione.
  • ⁇ Selection-4> YPD medium containing 2% by mass of threonine was coated with the K16 strain obtained in the above ⁇ Selection-3> and cultured at 30° C. to grow two colonies (hereinafter referred to as “K16-1 strain”). , Sometimes referred to as "K16-2 strain”.) For each of the colonies, preculture and main culture were performed in the same manner as the culture described in ⁇ Selection-1>.
  • the dry yeast cell weight after the main culture was measured by a conventional method.
  • the content of the kokumi-imparting substance in the yeast after the main culture was measured in the same manner as in the method described in the item ⁇ Selection-2>.
  • the content of the flavor enhancer per dry yeast cell weight was 0.43% for K16-1 strain and 0.52% for K16-2 strain for ⁇ -Glu-Abu.
  • -Glu-Abu-Gly was 0.46% for the K16-1 strain and 0.70% for the K16-2 strain.
  • the content of Abu per dry yeast cell weight was 0.53% for both K16-1 and K16-2 strains.
  • the K16 strain obtained in ⁇ Selection-3> was also cultured in the same manner, and the yeast dry cell weight and the content of the body-giving substance were measured.
  • the content of the imparting substance was 0.08% for ⁇ -Glu-Abu and 0.10% for ⁇ -Glu-Abu-Gly.
  • the content of Abu per dry yeast cell weight was 0.06%.
  • Test Example 1 Using the K16-2 strain obtained in Preparation Example 1 above, except that the culture was performed under the conditions described in the following ⁇ Test Example 1-1> and ⁇ Test Example 1-2>. Preculture and main culture were performed in the same manner as in the case of using the jar in ⁇ Selection-3>.
  • valine was added to the medium at 1,000 ppm (2.9% based on the dry yeast cell weight), and the main culture was continued.
  • the content of isoleucine in the culture supernatant immediately before the addition of valine was 118 ppm (0.0118% by mass), and the content of valine was 363 ppm (0.0363% by mass).
  • the amount of yeast in the medium immediately before the addition of valine was 3.45% in terms of dry yeast cell weight.
  • ⁇ Test Example 1-2> In the main culture, after 6 hours from the start, 2,000 ppm of isoleucine was added to the medium, and after 7 hours, 1,000 ppm of valine was added to the medium (2.9% based on the dry yeast cell weight). The culture was continued. The content of isoleucine in the culture supernatant immediately before the addition of valine was 1,973 ppm (0.1973% by mass), and the content of valine was 899 ppm (0.0899% by mass). The amount of yeast in the medium immediately before the addition of valine was 3.36% in terms of dry yeast cell weight.
  • ⁇ Measurement> Measurement of isoleucine and valine content in the culture supernatant- At the start of the main culture, 4 hours, 6 hours, 7 hours, 8 hours, 9 hours, 9 hours, 10 hours, 12 hours, 14 hours, and 16 hours later, isoleucine and isoleucine in the culture supernatant.
  • the content of valine was measured as follows. The results are shown in FIG. 1A (isoleucine) and FIG. 1B (valine). 1A to 1B, " ⁇ , solid line” indicates the results of Test Example 1-1, and " ⁇ , dotted line” indicates the results of Test Example 1-2.
  • valine and isoleucine were measured by an Accu-Tag Ultra (AccQ-Tag Ultra) labeling method using an "Acquity UPLC" analyzer manufactured by Waters (USA).
  • Test Example 2 Using the K16-2 strain obtained in Preparation Example 1 above, except that the culture was performed under the conditions described in the following ⁇ Test Example 2-1> to ⁇ Test Example 2-3>. Preculture and main culture were performed in the same manner as in the case of using the jar in ⁇ Selection-3>.
  • Example 2-1> In the main culture, after 6 hours from the start, 1,000 ppm of valine was added to the medium (3.3% based on the dry yeast cell weight), and the main culture was continued. The content of isoleucine in the culture supernatant just before the addition of valine was 361 ppm (0.0361% by mass), and the content of valine was 911 ppm (0.0911% by mass). The amount of yeast in the medium immediately before the addition of valine was 2.98% in terms of dry yeast cell weight.
  • valine was added to the medium at 1,000 ppm (2.9% based on the dry yeast cell weight), and the main culture was continued.
  • the content of isoleucine in the culture supernatant immediately before the addition of valine was 118 ppm (0.0118% by mass), and the content of valine was 363 ppm (0.0363% by mass).
  • the amount of yeast in the medium immediately before the addition of valine was 3.45% in terms of dry yeast cell weight.
  • valine was added to the medium at 1,000 ppm (2.5% based on the dry yeast cell weight), and the main culture was continued.
  • the content of isoleucine in the culture supernatant immediately before the addition of valine was 14.9 ppm (0.00149% by mass), and the content of valine was 18.6 ppm (0.00186% by mass). ..
  • the amount of yeast in the medium immediately before the addition of valine was 4.01% in terms of dry yeast cell weight.
  • ⁇ Measurement> Measurement of isoleucine and valine content in the culture supernatant- At the start of the main culture, 4 hours, 6 hours, 7 hours, 8 hours, 9 hours, 9 hours, 10 hours, 12 hours, 14 hours, and 16 hours later, isoleucine and isoleucine in the culture supernatant.
  • the content of valine was measured in the same manner as in Test Example 1 above. The results are shown in FIG. 2A (isoleucine) and FIG. 2B (valine).
  • FIG. 2A to 2B “ ⁇ , solid line” indicates the result of Test Example 2-1, “ ⁇ , solid line” indicates the result of Test Example 2-2, and “ ⁇ , solid line” indicates the result of Test Example 2-3.
  • Test Example 3 Using the K16-2 strain obtained in Preparation Example 1, except that the culture was performed under the conditions described in the following ⁇ Test Example 3-1> and ⁇ Test Example 3-2>. Preculture and main culture were performed in the same manner as in the case of using the jar in ⁇ Selection-3>.
  • valine was added to the medium at 1,000 ppm (2.5% based on the dry yeast cell weight), and the main culture was continued.
  • the content of isoleucine in the culture supernatant immediately before the addition of valine was 14.9 ppm (0.00149% by mass), and the content of valine was 18.6 ppm (0.00186% by mass). ..
  • the amount of yeast in the medium immediately before the addition of valine was 4.01% in terms of dry yeast cell weight.
  • ⁇ Test Example 3-2> In the main culture, after 8 hours from the start, 1,000 ppm of valine (2.6% based on dry yeast cell weight) and 2,000 ppm of threonine (5.2% based on dry yeast cell weight) were added to the medium. , Main culture was continued. The content of isoleucine in the culture supernatant immediately before the addition of valine and threonine was 14.5 ppm (0.00145% by mass), and the content of valine was 18.3 ppm (0.00183% by mass). there were. The amount of yeast in the medium immediately before the addition of valine was 3.86% in terms of yeast dry cell weight.
  • ⁇ Measurement> Measurement of isoleucine and valine content in the culture supernatant- At the start of the main culture, 4 hours, 6 hours, 7 hours, 8 hours, 9 hours, 9 hours, 10 hours, 12 hours, 14 hours, and 16 hours later, isoleucine and isoleucine in the culture supernatant.
  • the content of valine was measured in the same manner as in Test Example 1 above. The results are shown in FIG. 3A (isoleucine) and FIG. 3B (valine).
  • “ ⁇ , solid line” indicates the result of Test Example 3-1
  • ⁇ , alternate long and short dash line” indicates the result of Test Example 3-2.
  • Test Example 4 A culture after the same culture (that is, 20 hours after the start of the main culture, except that the culture time of the main culture under the culture conditions of Test Example 3-2 was changed to 12 hours after the addition of valine and threonine)
  • the yeast extract was prepared as follows using the culture. First, the yeast contained in the culture was recovered as a precipitate by centrifuging the culture, and washed with distilled water. Then, an appropriate amount of distilled water was added so that the cell concentration was 10% by weight to 15% by weight to prepare a yeast suspension. The yeast suspension was heated at 85° C. for 70 seconds, then rapidly cooled, and centrifuged to collect an extract. The collected extract was dried to obtain a yeast extract.
  • the content (amount per dry weight of yeast extract) of ⁇ -Glu-Abu and ⁇ -Glu-Abu-Gly, which are the body taste imparting substances, in the yeast extract was determined according to ⁇ Selection-2> in (Preparation Example 1). The measurement was performed in the same manner as the method described in the item. As a result, the content of ⁇ -Glu-Abu per dry weight of yeast extract was 9.40%, and the content of ⁇ -Glu-Abu-Gly per dry weight of yeast extract was 1.13%. Therefore, it was confirmed that the method of the present invention can produce a yeast extract containing more than 10% of the flavor-giving substance per dry weight of yeast extract.
  • Test Example 5 Using the K16-2 strain obtained in Preparation Example 1 above, except that the K16-2 strain was cultured under the conditions described in the following ⁇ Test Example 5-1> to ⁇ Test Example 5-5>. Preculture and main culture were performed in the same manner as in the case of using the jar in ⁇ Selection-3>.
  • ⁇ Test Example 5-2> In the main culture, after 7.5 hours from the start, 500 ppm of valine (1.5% based on the dry yeast cell weight) was added to the medium, and the main culture was continued. The content of isoleucine in the culture supernatant immediately before the addition of valine was 12.3 ppm (0.00123% by mass), and the content of valine was 16.0 ppm (0.00160% by mass). ..
  • valine 1,000 ppm (3.0% based on the dry yeast cell weight) was added to the medium 7.5 hours after the start, and the main culture was continued.
  • the content of isoleucine in the culture supernatant immediately before the addition of valine was 0 ppm, and the content of valine was 0 ppm.
  • ⁇ Test Example 5-4> In the main culture, 7.5 hours after the start, 1,500 ppm of valine (4.5% based on the dry yeast cell weight) was added to the medium, and the main culture was continued. The content of isoleucine in the culture supernatant immediately before the addition of valine was 0 ppm, and the content of valine was 0 ppm.
  • valine 1,000 ppm (3.0% per yeast dry cell weight) and threonine 1,000 ppm (3.0% per yeast dry cell weight) were added to the medium 7.5 hours after the start. And the main culture was continued.
  • the content of isoleucine in the culture supernatant immediately before the addition of valine and threonine was 0 ppm, and the content of valine was 7.5 ppm (0.00075 mass %).
  • Examples of aspects of the present invention include the following. ⁇ 1> A yeast growth step of culturing yeast that is modified to reduce intracellular acetolactate synthase activity and isoleucine- and valine-requiring yeast in a medium containing isoleucine and valine, and growing the same.
  • valine is added to the medium to culture the yeast, and a kokumi-imparting substance producing step of producing a kokumi-imparting substance is included,
  • ⁇ 2> The method for producing a rich taste imparting substance-containing yeast according to ⁇ 1>, wherein the yeast is a yeast modified so that the glutathione production ability is enhanced.
  • ⁇ 3> The method for producing a kokumi imparting substance-containing yeast according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 2>, wherein threonine is further added to the medium in the kokumi imparting substance producing step.
  • ⁇ 4> The flavor imparting property according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the content of the flavor imparting substance in the yeast containing a flavor imparting substance is 0.3% or more per dry yeast cell weight. It is a method for producing a substance-containing yeast.
  • Addition of richness characterized in that yeast extract is prepared from yeast containing richness imparting substance obtained by the method for producing yeast containing richness imparting substance according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>.
  • ⁇ 6> The method for producing a kokumi-imparting substance-containing yeast extract according to ⁇ 5>, wherein the content of the kokumi-imparting substance-containing yeast extract is more than 1% based on the dry weight of the yeast extract. ..

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Abstract

細胞内のアセト乳酸シンターゼ活性が低下するように改変され、イソロイシン及びバリン要求性の酵母を、イソロイシン及びバリンを含有する培地で培養し、増殖させる酵母増殖工程と、前記培地中のイソロイシンの含有量が０．２質量％未満のときに、バリンを前記培地に加えて前記酵母を培養し、コク味付与物質を生成させるコク味付与物質生成工程とを含み、前記コク味付与物質が、γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ及びγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙの少なくともいずれかであるコク味付与物質含有酵母の製造方法である。

Description

コク味付与物質含有酵母の製造方法及びコク味付与物質含有酵母エキスの製造方法
　本発明は、γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ及びγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙの少なくともいずれかを含有するコク味付与物質含有酵母の製造方法、及び前記酵母を用いるコク味付与物質含有酵母エキスの製造方法に関する。
　酵母菌体から調製される酵母エキスは、食品に旨味やコク味などを付与する機能を有し、調味料等のような食品添加剤などとして食品分野で幅広く使用されている。近年の天然志向の高まりから、酵母エキスの需要は増加傾向にある。
　食品にコク味を付与する成分の１つとして、グルタミン酸、システイン、及びグリシンからなるトリペプチドであるグルタチオン（以下、「ＧＳＨ」と称することがある。）が知られている。
　これまでに、酵母菌体中のＧＳＨ含量を高めるための技術として、ＤＯＡ１遺伝子の少なくとも一部及びＭＥＴ３０遺伝子の少なくとも一部を欠損又は変異させた酵母変異株とする技術（例えば、特許文献１参照）、変異型ＭＥＴ３０遺伝子を有する酵母変異株に突然変異処理をし、グルタチオン含量が高い酵母変異株を２株以上得て、得られた酵母変異株を掛け合わせることにより、ＧＳＨ含量がより高い酵母変異株を得る技術（例えば、特許文献２参照）が提案されている。
　また、食品にコク味を付与する成分としては、γ－Ｇｌｕ－Ｘ、γ－Ｇｌｕ－Ｘ－Ｇｌｙ（ＸはＣｙｓ及びその誘導体を除くアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す。）も知られている（例えば、特許文献３参照）。
　これまでに、前記コク味を付与する成分含有量を高めるための技術として、Ａｂｕ（Ｌ－２－アミノ酪酸）及びγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ（Ｌ－γ－グルタミル－Ｌ－２アミノ酪酸）を添加した培地で酵母を培養し、得られた菌体からγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕを含む酵母エキスを調製する技術（例えば、特許文献４参照）、細胞内のアセト乳酸シンターゼ活性が低下するように改変し、酵母菌体内におけるＡｂｕ、γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ、γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙから選択される少なくとも１種の含有量を高める技術（例えば、特許文献５参照）などが提案されている。
　上記したように、食品にコク味を付与する成分の含量を高める技術について様々な検討が行われているものの、工業的規模での生産などを考慮した場合、γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ及びγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙの少なくともいずれかの酵母又は酵母エキスにおける含量は未だ十分とは言えず、前記含量を更に高める技術の速やかな提供が強く求められているのが現状である。
特開２０１０－２９１４７号公報 特開２０１１－１６０７３９号公報 特許第５８５７９７３号公報 特許第５９５４１７８号公報 国際公開第２０１５／００５３７８号
　本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ及びγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙの少なくともいずれかを高含有するコク味付与物質含有酵母の製造方法及びコク味付与物質含有酵母エキスの製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、前記目的を達成するべく鋭意検討を行った結果、細胞内のアセト乳酸シンターゼ活性が低下するように改変され、イソロイシン及びバリン要求性である酵母を増殖させ、培地中のイソロイシンの含有量が０．２質量％未満のときに、前記培地にバリンを加えて酵母を培養することで、前記酵母におけるγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ及びγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙの少なくともいずれかの含有量を顕著に高めることができることを知見した。
　本発明は、本発明者らの前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
　＜１＞　細胞内のアセト乳酸シンターゼ活性が低下するように改変され、イソロイシン及びバリン要求性の酵母を、イソロイシン及びバリンを含有する培地で培養し、増殖させる酵母増殖工程と、
　前記培地中のイソロイシンの含有量が０．２質量％未満のときに、バリンを前記培地に加えて前記酵母を培養し、コク味付与物質を生成させるコク味付与物質生成工程とを含み、
　前記コク味付与物質が、γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ及びγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙの少なくともいずれかであることを特徴とするコク味付与物質含有酵母の製造方法である。
　＜２＞　前記＜１＞から＜４＞に記載のコク味付与物質含有酵母の製造方法で得られたコク味付与物質含有酵母から酵母エキスを調製することを特徴とするコク味付与物質含有酵母エキスの製造方法である。
　本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ及びγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙの少なくともいずれかを高含有するコク味付与物質含有酵母の製造方法及びコク味付与物質含有酵母エキスの製造方法を提供することができる。
図１Ａは、試験例１の本培養における培養上清中のイソロイシンの含有量を測定した結果を示す図である。 図１Ｂは、試験例１の本培養における培養上清中のバリンの含有量を測定した結果を示す図である。 図１Ｃは、試験例１の本培養における酵母乾燥菌体重量を測定した結果を示す図である。 図１Ｄは、試験例１の本培養における酵母乾燥菌体重量あたりのγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕの量を測定した結果を示す図である。 図１Ｅは、試験例１の本培養における酵母乾燥菌体重量あたりのγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙの量を測定した結果を示す図である。 図１Ｆは、試験例１の本培養における酵母乾燥菌体重量あたりのＡｂｕの量を測定した結果を示す図である。 図２Ａは、試験例２の本培養における培養上清中のイソロイシンの含有量を測定した結果を示す図である。 図２Ｂは、試験例２の本培養における培養上清中のバリンの含有量を測定した結果を示す図である。 図２Ｃは、試験例２の本培養における酵母乾燥菌体重量を測定した結果を示す図である。 図２Ｄは、試験例２の本培養における酵母乾燥菌体重量あたりのγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕの量を測定した結果を示す図である。 図２Ｅは、試験例２の本培養における酵母乾燥菌体重量あたりのγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙの量を測定した結果を示す図である。 図２Ｆは、試験例２の本培養における酵母乾燥菌体重量あたりのＡｂｕの量を測定した結果を示す図である。 図３Ａは、試験例３の本培養における培養上清中のイソロイシンの含有量を測定した結果を示す図である。 図３Ｂは、試験例３の本培養における培養上清中のバリンの含有量を測定した結果を示す図である。 図３Ｃは、試験例３の本培養における酵母乾燥菌体重量を測定した結果を示す図である。 図３Ｄは、試験例３の本培養における酵母乾燥菌体重量あたりのγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕの量を測定した結果を示す図である。 図３Ｅは、試験例３の本培養における酵母乾燥菌体重量あたりのγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙの量を測定した結果を示す図である。 図３Ｆは、試験例３の本培養における酵母乾燥菌体重量あたりのＡｂｕの量を測定した結果を示す図である。 図４Ａは、試験例５の本培養における培養上清中のイソロイシンの含有量を測定した結果を示す図－１である。 図４Ｂは、試験例５の本培養における培養上清中のバリンの含有量を測定した結果を示す図－１である。 図４Ｃは、試験例５の本培養における酵母乾燥菌体重量を測定した結果を示す図－１である。 図４Ｄは、試験例５の本培養における酵母乾燥菌体重量あたりのγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕの量を測定した結果を示す図－１である。 図４Ｅは、試験例５の本培養における酵母乾燥菌体重量あたりのγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙの量を測定した結果を示す図－１である。 図４Ｆは、試験例５の本培養における酵母乾燥菌体重量あたりのＡｂｕの量を測定した結果を示す図－１である。 図４Ｇは、試験例５の本培養における培養上清中のイソロイシンの含有量を測定した結果を示す図－２である。 図４Ｈは、試験例５の本培養における培養上清中のバリンの含有量を測定した結果を示す図－２である。 図４Ｉは、試験例５の本培養における酵母乾燥菌体重量を測定した結果を示す図－２である。 図４Ｊは、試験例５の本培養における酵母乾燥菌体重量あたりのγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕの量を測定した結果を示す図－２である。 図４Ｋは、試験例５の本培養における酵母乾燥菌体重量あたりのγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙの量を測定した結果を示す図－２である。 図４Ｌは、試験例５の本培養における酵母乾燥菌体重量あたりのＡｂｕの量を測定した結果を示す図－２である。
（コク味付与物質含有酵母の製造方法）
　本発明のコク味付与物質含有酵母の製造方法は、増殖工程と、コク味付与物質生成工程とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
　本発明におけるコク味付与物質とは、γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ及びγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙの少なくともいずれかをいう。なお、本発明において、Ａｂｕ及びＧｌｕはＬ体である。
＜増殖工程＞
　前記増殖工程は、細胞内のアセト乳酸シンターゼ活性が低下するように改変され、イソロイシン及びバリン要求性の酵母を、イソロイシン及びバリンを含有する培地で培養し、増殖させる工程である。
－酵母－
　前記酵母は、細胞内のアセト乳酸シンターゼ活性が低下するように改変され、イソロイシン及びバリン要求性である。
　前記酵母は、出芽酵母であってもよいし、分裂酵母であってもよい。
　前記出芽酵母としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等のサッカロミセス属、キャンディダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ）等のキャンディダ属、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）等のピヒア属、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）等のハンゼヌラ属等に属する酵母などが挙げられる。
　前記分裂酵母としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）等のシゾサッカロミセス属等に属する酵母などが挙げられる。
　これらの中でも、酵母エキスの生産によく用いられているサッカロミセス・セレビシエやキャンディダ・ユティリスが好ましい。
　前記酵母は、１倍体でもよいし、２倍性またはそれ以上の倍数性を有するものであってもよい。
　前記細胞内のアセト乳酸シンターゼ活性が低下するように改変され、イソロイシン及びバリン要求性の酵母は、酵母菌体内におけるＡｂｕ、γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ、γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙから選択される少なくとも１種を高含有することが知られている（国際公開第２０１５／００５３７８号参照）。
　前記細胞内のアセト乳酸シンターゼ活性が低下するように改変され、イソロイシン及びバリン要求性の酵母は、改変等により作製したものを使用してもよいし、市販品を使用してもよい。
　前記アセト乳酸シンターゼとは、ピルビン酸及びα－ケト酪酸（α－ＫＢ）からα－アセトヒドロキシ酪酸及びＣＯ２を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう（ＥＣ　２．２．１．６）。また、同活性を「アセト乳酸シンターゼ活性」ともいう。本発明において、アセト乳酸シンターゼは、２分子のピルビン酸からアセト乳酸及びＣＯ２を生成する反応を触媒する活性を有していてもよく、有していなくてもよい。
　細胞内のアセト乳酸シンターゼ活性が低下するように改変され、イソロイシン及びバリン要求性となるように酵母を改変する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、国際公開第２０１５／００５３７８号に記載されている方法などが挙げられる。
　具体的には、例えば、アセト乳酸シンターゼの活性サブユニットをコードするＩＬＶ２遺伝子を破壊することにより、細胞内のアセト乳酸シンターゼ活性が低下し、イソロイシン及びバリン要求性となる。
　前記ＩＬＶ２遺伝子の塩基配列情報は、公共のデータベースなどから取得することができ、例えば、サッカロミセス・セレビシエのＩＬＶ２遺伝子の塩基配列は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／）に開示されている。
　前記ＩＬＶ２遺伝子を破壊する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
　アセト乳酸シンターゼ活性が低下したことは、例えば、改変前の酵母と改変後の酵母よりそれぞれ粗酵素液を調製し、そのアセト乳酸シンターゼ活性を比較することにより、確認できる。アセト乳酸シンターゼ活性は、例えば、公知の方法（Ｆ．Ｃ．　Ｓｔｏｒｍｅｒ　ａｎｄ　Ｈ．Ｅ．　Ｕｍｂａｒｇｅｒ，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　１７，　５，　５８７－５９２（１９６４））により測定できる。
　前記酵母は、細胞内のアセト乳酸シンターゼ活性が低下するように改変され、イソロイシン及びバリン要求性という性質以外にも、必要に応じて更にその他の性質を有していてもよい。
　前記その他の性質としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、グルタチオンの生成能が増強されていることが好ましく、更にスレオニン耐性を有することがより好ましい。
　前記酵母のグルタチオンの生成能を増強する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、グルタチオンの生成能が増強されるように改変された酵母と、前記細胞内のアセト乳酸シンターゼ活性が低下するように改変され、イソロイシン及びバリン要求性の酵母とを公知の方法により掛け合わせることで、細胞内のアセト乳酸シンターゼ活性が低下するように改変され、イソロイシン及びバリン要求性であり、かつ、グルタチオンの生成能が増強された酵母を選抜することができる。
　前記グルタチオンの生成能が増強されるように改変された酵母は、改変等により作製したものを使用してもよいし、市販品を使用してもよい。
　グルタチオンの生成能が増強されるように酵母を改変する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、特開２０１０－２９１４７号公報（特許第５４９６４８０号公報）に記載されているようなＤＯＡ１遺伝子の少なくとも一部及びＭＥＴ３０遺伝子の少なくとも一部を欠損又は変異させる方法、特開２０１１－１６０７３９号公報（特許第５６６７３６５号公報）に記載されているような変異型ＭＥＴ３０遺伝子を有する酵母変異株に突然変異処理をし、グルタチオン含量が高い酵母変異株を２株以上得て、得られた酵母変異株を掛け合わせることにより、グルタチオン含量がより高い酵母変異株を得る方法などが挙げられる。
　グルタチオンの生成能が増強されたことは、例えば、改変前の酵母と改変後の酵母における総グルタチオン量をＴｉｔｚｅらの方法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　Ｖｏｌ．２７、ｐ５０２、１９６９）に従って測定し、その総グルタチオン量を比較することにより、確認できる。
　前記スレオニン耐性を有する酵母を取得する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、培地にスレオニンを添加し、生育した酵母を選抜する方法などが挙げられる。
－培地－
　前記増殖工程に用いる培地としては、イソロイシン及びバリンを少なくとも含み、前記酵母が増殖できる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　前記増殖工程に用いる培地におけるイソロイシンの含有量としては、前記酵母が増殖することができる限り、特に制限はなく、目的とする酵母の量などに応じて適宜選択することができるが、０．０１質量％～２．０質量％が好ましく、０．１質量％～１．０質量％がより好ましい。
　前記増殖工程に用いる培地におけるバリンの含有量としては、前記酵母が増殖することができる限り、特に制限はなく、目的とする酵母の量などに応じて適宜選択することができるが、０．０１質量％～２．０質量％が好ましく、０．１質量％～１．０質量％がより好ましい。
　前記増殖工程に用いる培地におけるイソロイシン及びバリン以外の成分及びその量としては、特に制限はなく、酵母などの微生物の培養に利用されているものを適宜選択することができる。
　例えば、炭素源としては、グルコース、蔗糖、酢酸、エタノール、糖蜜、亜硫酸パルプ廃液などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
　窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機塩、コーンスティプリカー、カゼイン、酵母エキス、ペプトン等の含窒素有機物などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
　また、過リン酸石灰、リン安等のリン酸成分、塩化カリウム、水酸化カリウム等のカリウム成分、硫酸マグネシウム、塩酸マグネシウム等のマグネシウム成分、亜鉛、銅、マンガン、鉄イオン等の無機塩、ビタミンなどを培地に添加してもよい。
－培養－
　前記増殖工程における前記酵母の培養形式としては、特に制限はなく、一般的な酵母の培養形式を適宜選択することができ、例えば、回分培養、流加培養、連続培養などが挙げられる。これらの中でも、工業的規模で生産する観点からは、流加培養、連続培養が好ましい。
　前記増殖工程における前記酵母の培養条件としては、特に制限はなく、一般的な酵母の培養条件を適宜選択することができる。
　例えば、温度としては、２０℃～４０℃が好ましく、２５℃～３５℃がより好ましい。
　ｐＨとしては、３．５～７．５が好ましく、４．０～６．９がより好ましい。
　また、前記培養は、好気的条件で行うことが好ましく、通気又は撹拌を行いながら培養することがより好ましい。前記通気の量と撹拌の条件としては、特に制限はなく、培養の容量や時間、菌の初発濃度などを考慮して適宜選択することができ、例えば、通気は、０．２Ｖ．Ｖ．Ｍ．（Ｖｏｌｕｍｅ　ｐｅｒ　ｖｏｌｕｍｅ　ｐｅｒ　ｍｉｎｕｔｅｓ）～２Ｖ．Ｖ．Ｍ程度、撹拌は、５０ｒｐｍ～９００ｒｐｍ程度で行うことができる。
　培養時間としては、特に制限はなく、目的とする酵母の量に応じて適宜選択することができる。
　前記増殖工程後の培養物中の酵母の量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酵母乾燥菌体重量として、０．５％～６％程度などが挙げられる。
　前記酵母乾燥菌体重量の測定方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
＜コク味付与物質生成工程＞
　前記コク味付与物質生成工程は、前記培地中のイソロイシンの含有量が０．２質量％未満のときに、バリンを前記培地に加えて前記酵母を培養し、コク味付与物質を生成させる工程である。
－バリンを加えるときの培地中のイソロイシンの量－
　前記コク味付与物質生成工程においてバリンを培地に加えるときの培地中のイソロイシンの含有量としては、０．２質量％未満であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．０５質量％以下が好ましく、０．０２質量％以下がより好ましく、０．０１質量％以下が特に好ましい。
　前記培地中のイソロイシンの量の測定方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、後述する実施例の項目に記載の方法などが挙げられる。
－バリンを加えるときの培地中のバリンの量－
　前記コク味付与物質生成工程においてバリンを培地に加えるときの培地中のバリンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．１質量％以下が好ましく、０．０５質量％以下がより好ましく、０．０１質量％以下が特に好ましい。
　前記培地中のバリンの量の測定方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、後述する実施例の項目に記載の方法などが挙げられる。
－培地に加えるバリンの量－
　前記コク味付与物質生成工程において培地に加えるバリンの量としては、前記コク味付与物質を生成することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１回あたりの量（質量）として、酵母乾燥菌体重量あたり、０．５％以上が好ましく、１％以上がより好ましく、２．５％以上が特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、前記コク味付与物質の生成量をより多くすることができる点で、有利である。
　前記培地に加えるバリンの量の上限値としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１回あたりの量として、酵母乾燥菌体重量あたり５％などが挙げられる。
　前記コク味付与物質生成工程において培地にバリンを加える回数としては、１回であってもよいし、２回以上であってもよい。
－培地に加えるスレオニンの量－
　前記コク味付与物質生成工程では、更にスレオニンを培地に加えることが好ましい。
　前記スレオニンは、前記バリンと同時期に培地に加えてもよいし、異なる時期に加えてもよいが、前記コク味付与物質の生成量をより多くすることができる点で、バリンと同時期に加えることが好ましい。
　前記コク味付与物質生成工程において培地に加えるスレオニンの量としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１回あたりの量（質量）として、酵母乾燥菌体重量あたり、０．５％以上が好ましく、１％以上がより好ましく、２．５％以上が特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、前記コク味付与物質の生成量をより多くすることができる点で、有利である。
　前記培地に加えるスレオニンの量の上限値としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１回あたりの量として、酵母乾燥菌体重量あたり１０％などが挙げられる。
　前記コク味付与物質生成工程において培地にスレオニンを加える回数としては、１回であってもよいし、２回以上であってもよい。
－培地－
　前記コク味付与物質生成工程に用いる培地としては、上記したイソロイシン及びバリン、並びに必要に応じてスレオニンの量以外は、前記増殖工程に用いる培地と同様のものを用いることができる。
－培養－
　前記コク味付与物質生成工程における前記酵母の培養形式、培養条件としては、特に制限はなく、一般的な酵母の培養形式を適宜選択することができ、例えば、前記増殖工程と同様とすることができる。
－コク味付与物質－
　前記コク味付与物質生成工程で得られる酵母における前記コク味付与物質の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ及びγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙの合計量（質量）として、酵母乾燥菌体重量あたり、０．３％以上が好ましく、０．６％以上がより好ましく、１．０％以上が更に好ましく、１．３％以上が特に好ましい。
　前記コク味付与物質生成工程で得られる酵母における前記コク味付与物質の含有量の上限値としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ及びγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙの合計量（質量）として、酵母乾燥菌体重量あたり５％などが挙げられる。
　前記γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕと、前記γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙとの含有量の比率としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　前記酵母中におけるコク味付与物質の量の測定方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、後述する実施例の項目に記載の方法などが挙げられる。
　なお、前記酵母は、γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ及びγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙ以外のコク味の付与に寄与する成分を含んでいてもよい。
＜その他の工程＞
　前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記増殖工程に用いる酵母を調製する前培養工程などが挙げられる。
　前記前培養工程における前記酵母の培養方法、培養条件、及び培地としては、特に制限はなく、酵母などの微生物の培養に一般的に利用されている培養方法、培養条件、及び培地を目的に応じて適宜選択することができる。
　前記コク味付与物質生成工程で得られる酵母の培養物は、乾燥処理し、前記コク味付与物質の含有量が高い酵母乾燥菌体としてもよい。
　前記乾燥処理の方法としては、特に制限はなく、酵母乾燥菌体を調製する際に通常行われている方法を適宜選択することができ、例えば、凍結乾燥法、スプレードライ法、ドラムドライ法などが挙げられる。
　また、得られた酵母乾燥菌体は、粉末状に加工してもよい。
　本発明のコク味付与物質含有酵母の製造方法によれば、前記コク味付与物質を高含有する酵母を製造することができ、工業的規模での生産にも適用可能である。
（コク味付与物質含有酵母エキスの製造方法）
　本発明のコク味付与物質含有酵母エキスの製造方法は、上記した本発明のコク味付与物質含有酵母の製造方法で得られたコク味付与物質含有酵母から酵母エキスを調製する。
　前記酵母エキスを調製する方法としては、特に制限はなく、一般的な酵母エキスの調製方法を適宜選択することができ、例えば、酵母菌体内に本来あるタンパク質分解酵素等を利用して菌体を可溶化する自己消化法、微生物や植物由来の酵素製剤を添加して酵母を可溶化する酵素分解法、熱水中に一定時間浸漬することにより菌体を可溶化する熱水抽出法、種々の酸又はアルカリを添加して菌体を可溶化する酸・アルカリ分解法、凍結と融解を１回以上行うことにより菌体を破砕する凍結融解法、物理的な刺激により菌体を破砕する物理的破砕法などが挙げられる。
　前記物理的刺激としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、超音波処理、高圧下におけるホモジェナイズ、グラスビーズ等の固形物との混合による磨砕などが挙げられる。
－コク味付与物質－
　前記酵母エキスにおける前記コク味付与物質の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ及びγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙの合計量（質量）として、酵母エキス乾燥重量あたり、１％超が好ましく、５％以上がより好ましく、１０％以上が特に好ましい。
　前記酵母エキスにおける前記コク味付与物質の含有量の上限値としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ及びγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙの合計量（質量）として、酵母エキス乾燥重量あたり１７％などが挙げられる。
　前記γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕと、前記γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙとの含有量の比率としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　前記酵母エキス中におけるコク味付与物質の量の測定方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、上記した酵母中におけるコク味付与物質の量の測定方法と同様にして測定する方法などが挙げられる。
　なお、前記酵母エキスは、γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ及びγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙ以外のコク味の付与に寄与する成分を含んでいてもよい。
　本発明のコク味付与物質含有酵母エキスの製造方法によれば、前記コク味付与物質を高含有する酵母エキスを製造することでき、工業的規模での生産にも適用可能である。
　本発明の製造方法により得られたコク味付与物質含有酵母及びコク味付与物質含有酵母エキスの用途としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、各種飲食品やサプリメントなどに用いることができる。
　以下に調製例及び試験例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの調製例及び試験例に何ら限定されるものではない。
（調製例１：酵母の調製）
　以下のようにして、細胞内のアセト乳酸シンターゼ活性が低下するように改変され、イソロイシン及びバリン要求性であり、グルタチオンの生成能が増強され、スレオニン耐性を有する酵母株を調製した。
＜親株（１倍体：ａ型）＞
　細胞内のアセト乳酸シンターゼ活性が低下するように改変され、イソロイシン及びバリン要求性である株として、ＩＬＶ２変異株であるＮＣＹＣ８６８株（ａ型）（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｙｅａｓｔ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓより入手）を用いた。
＜親株（１倍体：α型）＞
　グルタチオンの生成能が増強されるように改変された株として、特開２０１１－１６０７３９号公報（特許第５６６７３６５号公報）に記載のサッカロマイセス・セレビシエＡＢＹＣ１５８８株（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９２４、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１－１－１）に寄託された株であり、受託日は２００７年１０月１９日である。）を用い、常法により、１倍体（α型）を入手した。
＜選抜－１＞
　前記１倍体（ａ型）と、前記１倍体（α型）とを常法により接合し、以下のようにして培養した。
－前培養－
　５ｍＬのＹＰＤ培地に１白金耳のコロニーを植菌し、３０℃で一晩培養したものを前培養液とした。
－本培養－
　下記組成の糖蜜尿素培地を２００ｍＬバッフル付き三角フラスコに準備し、前記前培養液を全量接種し、３０℃、撹拌数２００ｒｐｍで４８時間培養した。
－－糖蜜尿素培地－－
　・　糖蜜（全糖換算）　　　　　　・・・　８．０質量％
　・　尿素　　　　　　　　　　　　・・・　０．３質量％
　・　硫酸アンモニウム　　　　　　・・・　０．０８質量％
　・　リン酸水素２アンモニウム　　・・・　０．０４質量％
　・　ＹＮＢ　ｗ／ｏ　ＡＡ　ＡＳ　・・・　０．１７質量％
　　　（Ｄｉｆｃｏ社製）
　・　アデニン硫酸塩　　　　　　　・・・　０．００５質量％
　・　Ｌ－リシン　　　　　　　　　・・・　０．０１質量％
　・　Ｌ－チロシン　　　　　　　　・・・　０．０１質量％
　・　Ｌ－イソロイシン　　　　　　・・・　０．０２質量％
　・　Ｌ－バリン　　　　　　　　　・・・　０．０２質量％
　・　グリシン　　　　　　　　　　・・・　０．１質量％
　前記本培養後の酵母乾燥菌体重量（以下、「ＤＣＷ」と称することがある。）を常法により測定した。また、Ｔｉｔｚｅらの方法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　Ｖｏｌ．２７、ｐ５０２、１９６９）に従って、前記本培養後の酵母中の総グルタチオン量（以下、「ＧＳＨ含量」と称することがある。）を測定した。
　前記測定したＤＣＷとＧＳＨ含量とを指標として、優れた２倍体株を複数選抜した。
＜選抜－２＞
　前記＜選抜－１＞で選抜した２倍体株に対し、Ｔｅｔｒａｄ分離を行った。分離した菌を以下の培地に塗布し、（ｉｖ）イソロイシン及びバリンを含有するＳＤ培地のみで生育した株（イソロイシン及びバリン同時要求性株）を単離した。
－培地－
　（ｉ）　ＳＤ培地
　（ｉｉ）　イソロイシン０．０１質量％を含有するＳＤ培地
　（ｉｉｉ）　バリン０．０１質量％を含有するＳＤ培地
　（ｉｖ）　イソロイシン０．０１質量％及びバリン０．０１質量％を含有するＳＤ培地
　前記単離した株について、前記＜選抜－１＞に記載の培養と同様にして、前培養及び本培養を行った。
　前記培養後の酵母乾燥菌体重量を常法により測定した。また、前記培養後の酵母中のコク味付与物質であるγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ及びγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙと、その前駆体であるＡｂｕの含有量を以下のようにして測定した。
－コク味付与物質等の測定－
　ペプチドを６－アミノキノリル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＡＱＣ）を用いて蛍光誘導体化し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより検出することより行った。
　具体的には、適当な濃度に希釈したサンプル２．５μＬ又は、１μＭのＡｂｕ、γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ、及びγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙを含む標準液２．５μＬに、ＭｉｌｌＱ水２．５μＬ、５μＭ内部標準物質溶液（３－ｍｅｔｈｙｌ－Ｈｉｓ－ｄ２（シグマ社）、Ｇｌｙ－ｄ２（シグマ社）。いずれも安定同位体で標識されている。）５μＬ、硼酸緩衝液（日本ウォーターズ社製ＡｃｃＱ－Ｆｌｕｏｒ（登録商標）試薬キット付属品）３０μＬを添加した。
　前記混合物に、ＡＱＣ試薬溶液（上記試薬キットの試薬粉末をアセトニトリル１ｍＬ中に溶解することにより調製）１０μＬを添加した。得られた混合物を１０分間、５５℃で加熱後、０．１％のギ酸水溶液１００μＬを加え、分析サンプルとした。
　次に前述のように調製した分析サンプルを、下記逆相の液体クロマトグラフィーで分離後に、質量分析装置に導入した。分離条件は下記の通りとした。
－－分離条件－－
　（１）　ＨＰＬＣ　：　Ａｇｉｌｅｎｔ　１２００シリーズ
　（２）　分離カラム　：　Ｕｎｉｓｏｎ　ＵＫ－Ｐｈｅｎｙｌ（内径２．０ｍｍ、長さ１００ｍｍ、粒子径３μｍ（Ｉｍｔａｋｔ社製））
　（３）　カラム温度　：　４０℃
　（４）　移動相Ａ　：　２５ｍＭギ酸水溶液をアンモニア水でｐＨ６．０に調整した水溶液
　（５）　移動相Ｂ　：　メタノール
　（６）　流速　：　０．２５ｍＬ／分間
　（７）　溶出条件　：　溶出は、移動相Ａ及び移動相Ｂの混合液を用いて行った。混合液に対する移動相Ｂの比率は以下の通り。０分（５％）、０分～１７分（５％～４０％）、１７分～１７．１分（４０％～８０％）、１７．１分～１９分（８０％）、１９分～１９．１分（８０％～５％）、１９．１分～２７分（５％）。
　その後、前述の分離条件によって溶出されたＡｂｕ、γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ、及びγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙの誘導体化物を質量分析計に導入してマスクロマトグラムにより定量を行った。分析条件は下記の通りとした。
－－分析条件－－
　（１）　質量分析装置　：　ＡＢ　Ｓｃｉｅｘ　ＡＰＩ３２００　ＱＴＲＡＰ
　（２）　検出モード　：　Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｉｏｎ　Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ポジティブイオンモード）
　（３）　選択イオン　：　下記表１参照
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　Ａｂｕ、γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ、及びγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙの誘導体化物の定量は、解析ソフトＡｎａｌｙｓｔ　ｖｅｒ　１．４．２（ＡＢ　Ｓｃｉｅｘ）を用いて行った。定量を行うための内部標準物質として、Ａｂｕの誘導体化物の場合は３－ｍｅｔｈｙｌ－Ｈｉｓ－ｄ２の誘導体化物を、γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ又はγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙの誘導体化物の場合はＧｌｙ－ｄ２の誘導体化物を、各々用いた。
　なお、γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕの定量の際に、極まれにサンプルによって夾雑ピークが見られた場合は、第２のマスアナライザーでの選択イオンを、１４５．２、或いは、１０４．１を用いて定量した。
　前記測定したコク味付与物質の含有量と酵母乾燥菌体重量とを指標として、優れた１倍体株を選抜した。
＜２倍体の取得＞
　前記＜選抜－２＞で得られた１倍体の株をａ型とα型とに選別し、常法により交配を実施し、２倍体株を複数取得した。
＜選抜－３＞
　前記＜２倍体の取得＞で得られた株をフラスコ又はジャーを用い、以下のようにして流加培養を実施した。
－培養（フラスコ）－
　前記＜選抜－１＞に記載の培養と同様にして、前培養及び本培養を行った。
－培養（ジャー）－
－－前培養－－
　下記組成の培地を容量３，０００ｍＬで２本作製した（丸菱バイオエンジジャーファーメンタ）。前記培地は、混合後、１２１℃で１５分間、オートクレーブ滅菌した。
［培地］
　・　糖蜜（全糖換算）　　　　　・・・　８．０質量％
　・　尿素　　　　　　　　　　　・・・　０．３質量％
　・　硫酸アンモニウム　　　　　・・・　０．０８質量％
　・　リン酸水素２アンモニウム　・・・　０．０４質量％
　・　アデニン硫酸塩　　　　　　・・・　０．００５質量％
　・　Ｌ－リシン　　　　　　　　・・・　０．０１質量％
　・　Ｌ－チロシン　　　　　　　・・・　０．０１質量％
　・　Ｌ－イソロイシン　　　　　・・・　０．０２質量％
　・　Ｌ－バリン　　　　　　　　・・・　０．０２質量％
　・　グリシン　　　　　　　　　・・・　０．１質量％
　前記組成の前培養用培地に、ＹＰＤ平板培地で生育させた前記＜２倍体の取得＞で得られた株を１白金耳植菌し、以下の培養条件で培養した。
　培養終了後、遠心分離（３，０００ｇ×５分間）で菌体を全量回収し、等量の滅菌水で菌体を洗浄した。その後、再度遠心分離を行って菌体を回収し、滅菌水で懸濁し、固形分濃度が１０質量％～２０質量％になるように調整し、これを前培養菌体液とした。
［培養条件］
　・　培養温度　：　３０℃
　・　振とう　　：　４００ｒｐｍ
　・　培養時間　：　２４時間
　・　通気量　　：　３Ｌ／分間（１Ｖ．Ｖ．Ｍ．）
－－本培養－－
　下記組成の培地を用い、下記培養条件で、流加培養により、前記株を培養した。
［培地］
　・　前培養菌体液　　　　　　　　・・・　１５０ｍＬ
　・　水　　　　　　　　　　　　　・・・　２，０００ｍＬ
　・　硫酸アンモニウム（９７％）　・・・　１．３３ｍＬ
　・　糖蜜（糖度３６％）　　　　　・・・　６．７ｍＬ
　・　リン酸水素２アンモニウム　　・・・　０．０６質量％
　・　Ｌ－イソロイシン　　　　　　・・・　０．４質量％
　・　Ｌ－バリン　　　　　　　　　・・・　０．３５質量％
［培養条件］
　・　培養温度　：　３０℃
　・　培養条件　：　１８時間
　・　ｐＨ　　　：　下限５．５、上限６．７となるように、２５％苛性ソーダ又は４７％硫酸で制御。
　・　撹拌　　　：　６００ｒｐｍ～８００ｒｐｍ
　・　流加培地　：　糖蜜（糖度３６％）　８７０ｍＬ～１，０００ｍＬ
　　　　　　　　　　アンモニア水（１０％）　１００ｍＬ～２００ｍＬ
　　　　　　　　　　リン酸（８５％）　５ｇ～２０ｇ
　前記本培養後の酵母乾燥菌体重量を常法により測定した。また、前記本培養後の酵母中のコク味付与物質の含有量を、前記＜選抜－２＞の項目中に記載した方法と同様にして測定した。
　前記測定したコク味付与物質の含有量と酵母乾燥菌体重量とを指標として、優れた２倍体株（以下、「Ｋ１６株」と称することがある。）を選抜した。
　前記Ｋ１６株は、細胞内のアセト乳酸シンターゼ活性が低下するように改変され、イソロイシン及びバリン要求性であり、グルタチオンの生成能が増強された株である。
＜選抜－４＞
　ＹＰＤ培地にスレオニンを２質量％添加した培地に、前記＜選抜－３＞で得られたＫ１６株を塗布し、３０℃で培養し、生育したコロニーを２つ（以下、「Ｋ１６－１株」、「Ｋ１６－２株」と称することがある。）取得した。
　前記各コロニーについて、前記＜選抜－１＞に記載の培養と同様にして、前培養及び本培養を行った。
　前記本培養後の酵母乾燥菌体重量を常法により測定した。また、前記本培養後の酵母中のコク味付与物質等の含有量を、前記＜選抜－２＞の項目中に記載した方法と同様にして測定した。
　その結果、酵母乾燥菌体重量あたりのコク味付与物質の含有量は、γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕについては、Ｋ１６－１株では０．４３％、Ｋ１６－２株では０．５２％であり、γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙについては、Ｋ１６－１株では０．４６％、Ｋ１６－２株では０．７０％であった。なお、酵母乾燥菌体重量あたりのＡｂｕの含有量は、Ｋ１６－１株及びＫ１６－２株共に、０．５３％であった。
　なお、前記＜選抜－３＞で得られたＫ１６株についても同様にして培養し、酵母乾燥菌体重量及びコク味付与物質等の含有量を測定したところ、酵母乾燥菌体重量あたりのコク味付与物質の含有量は、γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕは０．０８％、γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙは０．１０％であった。また、酵母乾燥菌体重量あたりのＡｂｕの含有量は、０．０６％であった。
　以上の結果から、酵母にスレオニン耐性を付与することで、コク味付与物質の含有量が高まり、また、コク味付与物質前駆体の含有量も高まることがわかった。
（試験例１）
　前記調製例１で得られたＫ１６－２株を用い、下記＜試験例１－１＞及び＜試験例１－２＞の項目に記載の条件で培養を行った以外は、前記調製例１の＜選抜－３＞におけるジャーを用いた場合と同様にして、前培養及び本培養を行った。
＜試験例１－１＞
　前記本培養において、開始から７時間後に、バリンを培地に１，０００ｐｐｍ添加（酵母乾燥菌体重量あたり２．９％）し、本培養を続けた。
　なお、前記バリン添加直前の培養上清中のイソロイシンの含有量は、１１８ｐｐｍ（０．０１１８質量％）であり、バリンの含有量は、３６３ｐｐｍ（０．０３６３質量％）であった。また、前記バリン添加直前の培地中の酵母の量は、酵母乾燥菌体重量で３．４５％であった。
＜試験例１－２＞
　前記本培養において、開始から６時間後に、イソロイシンを培地に２，０００ｐｐｍ添加し、また、７時間後に、バリンを培地に１，０００ｐｐｍ添加（酵母乾燥菌体重量あたり２．９％）し、本培養を続けた。
　なお、前記バリン添加直前の培養上清中のイソロイシンの含有量は、１，９７３ｐｐｍ（０．１９７３質量％）であり、バリンの含有量は、８９９ｐｐｍ（０．０８９９質量％）であった。また、前記バリン添加直前の培地中の酵母の量は、酵母乾燥菌体重量で３．３６％であった。
＜測定＞
－培養上清中のイソロイシン及びバリンの含有量の測定－
　前記本培養開始時、４時間後、６時間後、７時間後、８時間後、９時間後、１０時間後、１２時間後、１４時間後、及び１６時間後の培養上清中のイソロイシン及びバリンの含有量を以下のようにして、測定した。
　結果を図１Ａ（イソロイシン）、図１Ｂ（バリン）に示す。なお、図１Ａ～１Ｂ中、「●、実線」は試験例１－１、「□、点線」は試験例１－２の結果を示す。
－－イソロイシン及びバリンの含有量の測定－－
　バリン及びイソロイシンの含有量は、ウォーターズ社（米国）製「Ａｃｑｕｉｔｙ　ＵＰＬＣ」分析装置を用いて、アキュタグウルトラ（ＡｃｃＱ－Ｔａｇ　Ｕｌｔｒａ）ラベル化法により測定した。
－酵母乾燥菌体重量の測定－
　前記本培養開始時、２時間後、４時間後、６時間後、７時間後、８時間後、９時間後、１０時間後、１１時間後、１２時間後、１３時間後、１４時間後、１６時間後、及び１８時間後の酵母乾燥菌体重量（以下、「ＤＣＷ」と称することがある。）を常法により測定した。
　結果を図１Ｃに示す。なお、図１Ｃ中、「●、実線」は試験例１－１、「□、点線」は試験例１－２の結果を示す。
－コク味付与物質等の測定－
　前記本培養開始６時間後、７時間後、８時間後、９時間後、１０時間後、１１時間後、１２時間後、１３時間後、１４時間後、及び１６時間後に酵母を回収し、コク味付与物質であるγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ及びγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙと、その前駆体であるＡｂｕの酵母中の含有量（酵母乾燥菌体重量あたりの量）を、前記（調製例１）の＜選抜－２＞の項目中に記載した方法と同様にして測定した。
　結果を図１Ｄ（γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ）、図１Ｅ（γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙ）、及び図１Ｆ（Ａｂｕ）に示す。なお、図１Ｄ～１Ｆ中、「●、実線」は試験例１－１、「□、点線」は試験例１－２の結果を示す。
　図１Ａ～１Ｆに示したように、前記本培養において、培養上清中のイソロイシンの含有量が０．２質量％未満のときにバリンを添加して酵母を培養した試験例１－１では、コク味付与物質であるγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ及びγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙが生成され、また、コク味付与物質の前駆体であるＡｂｕの生成も認められた。一方、培養上清中のイソロイシンの含有量が０．２質量％のときにバリンを添加して酵母を培養した試験例１－１では、コク味付与物質及びその前駆体の生成が非常に少なかった。
　したがって、本発明の方法により、コク味付与物質の生成量を顕著に高めることができることが確認された。
（試験例２）
　前記調製例１で得られたＫ１６－２株を用い、下記＜試験例２－１＞～＜試験例２－３＞の項目に記載の条件で培養を行った以外は、前記調製例１の＜選抜－３＞におけるジャーを用いた場合と同様にして、前培養及び本培養を行った。
＜試験例２－１＞
　前記本培養において、開始から６時間後に、バリンを培地に１，０００ｐｐｍ添加（酵母乾燥菌体重量あたり３．３％）し、本培養を続けた。
　なお、前記バリン添加直前の培養上清中のイソロイシンの含有量は、３６１ｐｐｍ（０．０３６１質量％）であり、バリンの含有量は、９１１ｐｐｍ（０．０９１１質量％）であった。また、前記バリン添加直前の培地中の酵母の量は、酵母乾燥菌体重量で２．９８％であった。
＜試験例２－２＞
　前記本培養において、開始から７時間後に、バリンを培地に１，０００ｐｐｍ添加（酵母乾燥菌体重量あたり２．９％）し、本培養を続けた。
　なお、前記バリン添加直前の培養上清中のイソロイシンの含有量は、１１８ｐｐｍ（０．０１１８質量％）であり、バリンの含有量は、３６３ｐｐｍ（０．０３６３質量％）であった。また、前記バリン添加直前の培地中の酵母の量は、酵母乾燥菌体重量で３．４５％であった。
＜試験例２－３＞
　前記本培養において、開始から８時間後に、バリンを培地に１，０００ｐｐｍ添加（酵母乾燥菌体重量あたり２．５％）し、本培養を続けた。
　なお、前記バリン添加直前の培養上清中のイソロイシンの含有量は、１４．９ｐｐｍ（０．００１４９質量％）であり、バリンの含有量は、１８．６ｐｐｍ（０．００１８６質量％）であった。また、前記バリン添加直前の培地中の酵母の量は、酵母乾燥菌体重量で４．０１％であった。
＜測定＞
－培養上清中のイソロイシン及びバリンの含有量の測定－
　前記本培養開始時、４時間後、６時間後、７時間後、８時間後、９時間後、１０時間後、１２時間後、１４時間後、及び１６時間後の培養上清中のイソロイシン及びバリンの含有量を前記試験例１と同様にして測定した。
　結果を図２Ａ（イソロイシン）、図２Ｂ（バリン）に示す。なお、図２Ａ～２Ｂ中、「△、実線」は試験例２－１、「●、実線」は試験例２－２、「◇、実線」は試験例２－３の結果を示す。
－酵母乾燥菌体重量の測定－
　前記本培養開始時、２時間後、４時間後、６時間後、７時間後、８時間後、９時間後、１０時間後、１１時間後、１２時間後、１３時間後、１４時間後、１６時間後、及び１８時間後の酵母乾燥菌体重量を前記試験例１と同様にして測定した。
　結果を図２Ｃに示す。なお、図２Ｃ中、「△、実線」は試験例２－１、「●、実線」は試験例２－２、「◇、実線」は試験例２－３の結果を示す。
－コク味付与物質等の測定－
　前記本培養開始６時間後、７時間後、８時間後、９時間後、１０時間後、１１時間後、１２時間後、１３時間後、１４時間後、及び１６時間後に酵母を回収し、コク味付与物質であるγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ及びγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙと、その前駆体であるＡｂｕの酵母中の含有量（酵母乾燥菌体重量あたりの量）を、前記（調製例１）の＜選抜－２＞の項目中に記載した方法と同様にして測定した。
　結果を図２Ｄ（γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ）、図２Ｅ（γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙ）、及び図２Ｆ（Ａｂｕ）に示す。なお、図２Ｄ～２Ｆ中、「△、実線」は試験例２－１、「●、実線」は試験例２－２、「◇、実線」は試験例２－３の結果を示す。
　図２Ａ～２Ｆに示したように、前記本培養においてバリンを添加するときの培養上清中のイソロイシン及びバリンの含有量が少ないほど、より多くのコク味付与物質及びその前駆体が生成されていた。
（試験例３）
　前記調製例１で得られたＫ１６－２株を用い、下記＜試験例３－１＞及び＜試験例３－２＞の項目に記載の条件で培養を行った以外は、前記調製例１の＜選抜－３＞におけるジャーを用いた場合と同様にして、前培養及び本培養を行った。
＜試験例３－１＞
　前記本培養において、開始から８時間後に、バリンを培地に１，０００ｐｐｍ添加（酵母乾燥菌体重量あたり２．５％）し、本培養を続けた。
　なお、前記バリン添加直前の培養上清中のイソロイシンの含有量は、１４．９ｐｐｍ（０．００１４９質量％）であり、バリンの含有量は、１８．６ｐｐｍ（０．００１８６質量％）であった。また、前記バリン添加直前の培地中の酵母の量は、酵母乾燥菌体重量で４．０１％であった。
＜試験例３－２＞
　前記本培養において、開始から８時間後に、バリン１，０００ｐｐｍ（酵母乾燥菌体重量あたり２．６％）、及びスレオニン２，０００ｐｐｍ（酵母乾燥菌体重量あたり５．２％）を培地に添加し、本培養を続けた。
　なお、前記バリン及びスレオニン添加直前の培養上清中のイソロイシンの含有量は、１４．５ｐｐｍ（０．００１４５質量％）であり、バリンの含有量は、１８．３ｐｐｍ（０．００１８３質量％）であった。また、前記バリン添加直前の培地中の酵母の量は、酵母乾燥菌体重量で３．８６％であった。
＜測定＞
－培養上清中のイソロイシン及びバリンの含有量の測定－
　前記本培養開始時、４時間後、６時間後、７時間後、８時間後、９時間後、１０時間後、１２時間後、１４時間後、及び１６時間後の培養上清中のイソロイシン及びバリンの含有量を前記試験例１と同様にして測定した。
　結果を図３Ａ（イソロイシン）、図３Ｂ（バリン）に示す。なお、図３Ａ～３Ｂ中、「◇、実線」は試験例３－１、「●、一点鎖線」は試験例３－２の結果を示す。
－酵母乾燥菌体重量の測定－
　前記本培養開始時、２時間後、４時間後、６時間後、７時間後、８時間後、９時間後、１０時間後、１１時間後、１２時間後、１３時間後、１４時間後、１６時間後、及び１８時間後の酵母乾燥菌体重量を前記試験例１と同様にして測定した。
　結果を図３Ｃに示す。なお、図３Ｃ中、「◇、実線」は試験例３－１、「●、一点鎖線」は試験例３－２の結果を示す。
－コク味付与物質等の測定－
　前記本培養開始６時間後、７時間後、８時間後、９時間後、１０時間後、１１時間後、１２時間後、１３時間後、１４時間後、及び１６時間後に酵母を回収し、コク味付与物質であるγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ及びγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙと、その前駆体であるＡｂｕの酵母中の含有量（酵母乾燥菌体重量あたりの量）を、前記（調製例１）の＜選抜－２＞の項目中に記載した方法と同様にして測定した。
　結果を図３Ｄ（γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ）、図３Ｅ（γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙ）、及び図３Ｆ（Ａｂｕ）に示す。なお、図３Ｄ～３Ｆ中、「◇、実線」は試験例３－１、「●、一点鎖線」は試験例３－２の結果を示す。
　図３Ａ～３Ｆに示したように、前記本培養においてバリンを添加するときにスレオニンも加えることで、より多くのコク味付与物質及びその前駆体が生成されていた。
（試験例４）
　前記試験例３－２の培養条件における本培養の培養時間をバリン及びスレオニンを添加した後、１２時間に変更した以外は同様にして培養した後の培養物（即ち、本培養開始２０時間後の培養物）を用い、以下のようにして酵母エキスを調製した。
　まず、前記培養物を遠心分離処理することにより、培養物に含有されていた酵母を沈殿として回収し、蒸留水で洗浄した。その後、菌体濃度が１０重量％～１５重量％となるように適量の蒸留水を加えて酵母懸濁液を作製した。前記酵母懸濁液を８５℃で７０秒間加熱した後に急速冷却し、遠心分離することにより、エキス分を回収した。回収したエキス分を乾燥させて、酵母エキスとした。
＜＜測定＞＞
－コク味付与物質の測定－
　前記酵母エキス中におけるコク味付与物質であるγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ及びγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙの含有量（酵母エキス乾燥重量あたりの量）を、前記（調製例１）の＜選抜－２＞の項目中に記載した方法と同様にして測定した。その結果、γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕの酵母エキス乾燥重量あたりの含有量は９．４０％であり、γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙの酵母エキス乾燥重量あたりの含有量は１．１３％であった。したがって、本発明の方法により、酵母エキス乾燥重量あたりのコク味付与物質の含有量が１０％を超える酵母エキスを製造することができることが確認された。
（試験例５）
　前記調製例１で得られたＫ１６－２株を用い、下記＜試験例５－１＞～＜試験例５－５＞の項目に記載の条件で培養を行った以外は、前記調製例１の＜選抜－３＞におけるジャーを用いた場合と同様にして、前培養及び本培養を行った。
＜試験例５－１＞
　前記本培養において、バリン及びスレオニンの添加を行わずに、本培養を続けた（対照）。
＜試験例５－２＞
　前記本培養において、開始から７．５時間後に、バリン５００ｐｐｍ（酵母乾燥菌体重量あたり１．５％）を培地に添加し、本培養を続けた。
　なお、前記バリン添加直前の培養上清中のイソロイシンの含有量は、１２．３ｐｐｍ（０．００１２３質量％）であり、バリンの含有量は、１６．０ｐｐｍ（０．００１６０質量％）であった。
＜試験例５－３＞
　前記本培養において、開始から７．５時間後に、バリン１，０００ｐｐｍ（酵母乾燥菌体重量あたり３．０％）を培地に添加し、本培養を続けた。
　なお、前記バリン添加直前の培養上清中のイソロイシンの含有量は、０ｐｐｍであり、バリンの含有量は、０ｐｐｍであった。
＜試験例５－４＞
　前記本培養において、開始から７．５時間後に、バリン１，５００ｐｐｍ（酵母乾燥菌体重量あたり４．５％）を培地に添加し、本培養を続けた。
　なお、前記バリン添加直前の培養上清中のイソロイシンの含有量は、０ｐｐｍであり、バリンの含有量は、０ｐｐｍであった。
＜試験例５－５＞
　前記本培養において、開始から７．５時間後に、バリン１，０００ｐｐｍ（酵母乾燥菌体重量あたり３．０％）、及びスレオニン１，０００ｐｐｍ（酵母乾燥菌体重量あたり３．０％）を培地に添加し、本培養を続けた。
　なお、前記バリン及びスレオニン添加直前の培養上清中のイソロイシンの含有量は、０ｐｐｍであり、バリンの含有量は、７．５ｐｐｍ（０．０００７５質量％）であった。
＜測定＞
－培養上清中のイソロイシン及びバリンの含有量の測定－
　前記本培養開始時、２時間後、４時間後、６時間後、７．５時間後、８時間後、９時間後、１０時間後、１２時間後、及び１４時間後の培養上清中のイソロイシン及びバリンの含有量を前記試験例１と同様にして測定した。
　結果を図４Ａ及び図４Ｇ（イソロイシン）、図４Ｂ及び図４Ｈ（バリン）に示す。なお、図４Ａ、４Ｂ、４Ｇ、４Ｈ中、「△、点線」は試験例５－１、「○、実線」は試験例５－２、「■、一点鎖線」は試験例５－３、「□、実線」は試験例５－４、「◇、一点鎖線」は試験例５－５の結果を示す。
－酵母乾燥菌体重量の測定－
　前記本培養開始時、２時間後、４時間後、６時間後、８時間後、９時間後、１０時間後、１１時間後、１２時間後、及び１４時間後の酵母乾燥菌体重量を前記試験例１と同様にして測定した。
　結果を図４Ｃ及び図４Ｉに示す。なお、図４Ｃ及び図４Ｉ中、「△、点線」は試験例５－１、「○、実線」は試験例５－２、「■、一点鎖線」は試験例５－３、「□、実線」は試験例５－４、「◇、一点鎖線」は試験例５－５の結果を示す。
－コク味付与物質等の測定－
　前記本培養開始８時間後、９時間後、１０時間後、１１時間後、１２時間後、及び１４時間後に酵母を回収し、コク味付与物質であるγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ及びγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙと、その前駆体であるＡｂｕの酵母中の含有量（酵母乾燥菌体重量あたりの量）を、前記（調製例１）の＜選抜－２＞の項目中に記載した方法と同様にして測定した。
　結果を図４Ｄ及び図４Ｊ（γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ）、図４Ｅ及び図４Ｋ（γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙ）、並びに図４Ｆ及び図４Ｌ（Ａｂｕ）に示す。なお、図４Ｄ、４Ｅ、４Ｆ、４Ｊ、４Ｋ、４Ｌ中、「△、点線」は試験例５－１、「○、実線」は試験例５－２、「■、一点鎖線」は試験例５－３、「□、実線」は試験例５－４、「◇、一点鎖線」は試験例５－５の結果を示す。
　図４Ａ～４Ｌに示したように、前記本培養において添加するバリンの量を増やすことで、より多くのコク味付与物質及びその前駆体が生成されていた。また、バリンを添加する際にスレオニンも加えることで、より多くのコク味付与物質及びその前駆体が生成されることが本試験例でも確認された。
　本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
　＜１＞　細胞内のアセト乳酸シンターゼ活性が低下するように改変され、イソロイシン及びバリン要求性の酵母を、イソロイシン及びバリンを含有する培地で培養し、増殖させる酵母増殖工程と、
　前記培地中のイソロイシンの含有量が０．２質量％未満のときに、バリンを前記培地に加えて前記酵母を培養し、コク味付与物質を生成させるコク味付与物質生成工程とを含み、
　前記コク味付与物質が、γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ及びγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙの少なくともいずれかであることを特徴とするコク味付与物質含有酵母の製造方法である。
　＜２＞　前記酵母が、グルタチオンの生成能が増強されるように改変された酵母である前記＜１＞に記載のコク味付与物質含有酵母の製造方法である。
　＜３＞　前記コク味付与物質生成工程において、更にスレオニンを前記培地に加える前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のコク味付与物質含有酵母の製造方法である。
　＜４＞　前記コク味付与物質含有酵母におけるコク味付与物質の含有量が、酵母乾燥菌体重量あたり０．３％以上である前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のコク味付与物質含有酵母の製造方法である。
　＜５＞　前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のコク味付与物質含有酵母の製造方法で得られたコク味付与物質含有酵母から酵母エキスを調製することを特徴とするコク味付与物質含有酵母エキスの製造方法である。
　＜６＞　前記コク味付与物質含有酵母エキスにおけるコク味付与物質の含有量が、酵母エキス乾燥重量あたり１％超である前記＜５＞に記載のコク味付与物質含有酵母エキスの製造方法である。

 

Claims (6)

  1. 　細胞内のアセト乳酸シンターゼ活性が低下するように改変され、イソロイシン及びバリン要求性の酵母を、イソロイシン及びバリンを含有する培地で培養し、増殖させる酵母増殖工程と、
    　前記培地中のイソロイシンの含有量が０．２質量％未満のときに、バリンを前記培地に加えて前記酵母を培養し、コク味付与物質を生成させるコク味付与物質生成工程とを含み、
    　前記コク味付与物質が、γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ及びγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕ－Ｇｌｙの少なくともいずれかであることを特徴とするコク味付与物質含有酵母の製造方法。
  2. 　前記酵母が、グルタチオンの生成能が増強されるように改変された酵母である請求項１に記載のコク味付与物質含有酵母の製造方法。
  3. 　前記コク味付与物質生成工程において、更にスレオニンを前記培地に加える請求項１から２のいずれかに記載のコク味付与物質含有酵母の製造方法。
  4. 　前記コク味付与物質含有酵母におけるコク味付与物質の含有量が、酵母乾燥菌体重量あたり０．３％以上である請求項１から３のいずれかに記載のコク味付与物質含有酵母の製造方法。
  5. 　請求項１から４のいずれかに記載のコク味付与物質含有酵母の製造方法で得られたコク味付与物質含有酵母から酵母エキスを調製することを特徴とするコク味付与物質含有酵母エキスの製造方法。
  6. 　前記コク味付与物質含有酵母エキスにおけるコク味付与物質の含有量が、酵母エキス乾燥重量あたり１％超である請求項５に記載のコク味付与物質含有酵母エキスの製造方法。
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