KR100955325B1

KR100955325B1 - 신규한 브레비박테리움속 미생물 및 이를 이용한ｌ-오르니친의 제조방법

Info

Publication number: KR100955325B1
Application number: KR1020080007531A
Authority: KR
Inventors: 정준기; 이홍원; 이진호; 안정오; 김천석; 이은교; 이혁원; 이주환
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2008-01-24
Filing date: 2008-01-24
Publication date: 2010-04-29
Also published as: KR20090081581A

Abstract

본 발명은 L-오르니친을 생산하는 신규한 브레비박테리움 속 미생물 및 이를 이용하여 L-오르니친을 제조하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 산업적으로 대량생산하기 위해 고농도의 칼륨이온에 대한 내성을 갖는 미생물을 이용하여 L-오르니친의 생산성을 향상시킨 L-오르니친의 제조방법에 관한 것이다.

L-오르니친, 브레비박테리움, 고 삼투압 내성, 칼륨이온

Description

신규한 브레비박테리움속 미생물을 및 이를 이용한 Ｌ-오르니친의 제조방법{Novel Brevibacterium sp. and Preparation Method of L-Ornithine using Thereof}

L-오르니친은 간세포 대사과정에 작용하는 원료 의약품으로 사용되는 아미노산으로서 최근 그 수요가 증가하고 있다. L-오르니친의 제조방법은 주로 미생물을 이용한 직접 발효방법이 사용되고 있는데, 이때 사용되는 미생물은 주로 아미노산 영양요구주, 아미노산 유사체에 대한 내성 및 약제 내성을 지닌 변이 균주들이다. 이러한 미생물은 통상적인 돌연변이원을 처리하여 약제 내성을 부여함으로써 지속적인 생산능 향상을 위해 연구하여 왔다. 그러나 이러한 대부분의 미생물들은 다 수의 변이처리 과정을 거치면서 생육이 지연되고, 이에 따라 전체적인 생산성 측면에서도 많은 한계를 보이고 있다.

대한민국특허공개 특1996-41371호는 아르기닌 영양요구성분인 브레비박테리움속의 미생물을 이용한 유가식 발효에 의해 오르니친을 제조하는 방법에 있어서, 아르기닌을 요구량 이상 첨가한 성장 배지에서 상기 미생물을 배양하여 오르니친의 생산을 유도한 후, 아르기닌과 인산염 농도를 상기 균주의 아르기닌 영양요구성의 상실을 억제시키는 범위내로 조절되도록 생산용 배지를 공급하여 배양하는 단계를 포함하여 생산성을 향상시키는 오르니친의 제조방법을 개시하고 있으나, 이는 발효과정 중 시간의 경과에 따른 복귀변이주 등의 출현으로 인해 발현 재현성이 떨어지고 불안정한 생육을 하게 된다.

이와 같이 L-오르니친을 제조하는데 이용되는 대부분의 미생물들은 시트룰린 또는 아르기닌 영양 요구성 균주들로서 발효과정 중 시간이 경과됨에 따라 복귀변이주 등의 출현으로 인해 발효 재현성이 떨어지고 불안정한 생육을 하는 등 많은 문제점을 가지고 있는데, 이중에서도 발효과정에서의 삼투압의 증가가 미생물의 생육을 저해하는 요인으로 작용하였다.

이에, 본 발명자들은 세포기능을 위해 세포질에 일정 농도로 존재하여야 하는 필수 성분으로서 세포 내 에너지 흐름에 관여하며 특히 세균에서 세포의 삼투압을 유지시켜주는 기능을 하는 것으로 알려진 칼륨이온에 대한 내성을 부여함으로써 전체적인 L-오르니친 생산성을 향상시키는 신규 미생물을 선별함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 주된 목적은 배양배지 중 칼륨이온에 대한 내성을 갖고 L-오르니친을 생산할 수 있는 신규한 브레비박테리움속 미생물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 신규한 브레비박테리움속 미생물을 선별하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 배양배지 중 칼륨이온에 대한 내성을 갖는 브레비박테리움 속 미생물을 이용하여 L-오르니친을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) L-오르니친의 생산능이 있는 브레박테리움속 미생물을 친주로 하여 배양한 후 자외선 조사 및 변이 유발제로 처리하는 단계; (2) 단계 (1)을 거친 균주를 배양배지에 농도별로 칼륨이온을 첨가하는 단계; (3) 친주와 대비되는 농도에서 생육이 가능한 변이균주를 선발하는 단계를 거쳐 신규한 미생물을 선별하였다.

또한 본 발명에 따른 칼륨이온에 대한 내성을 갖는 브레비박테리움 속 미생물을 이용하여 L-오르니친을 제조하였다.

본 발명에 따르면, 고농도의 칼륨이온에 대한 내성을 갖는 브레비박테리움속 미생물을 이용하여 L-오르니친의 생산성이 향상되는 효과가 있다.

본 발명은 (1) L-오르니친의 생산능이 있는 브레박테리움속 미생물을 친주로 하여 배양한 후 자외선 조사 및 변이 유발제로 처리하는 단계; (2) 단계 (1)을 거친 균주를 배양배지에 농도별로 칼륨이온을 첨가하는 단계; (3) 친주와 대비되는 농도에서 생육이 가능한 변이균주를 선발하는 단계를 거쳐 칼륨이온에 대한 내성을 갖고 L-오르니친을 생산할 수 있는 신규한 미생물을 선별하였다.

본 발명에서 "칼륨이온에 대한 내성"을 갖는다는 것은 특정 칼륨이온 농도 이상이 되는 배지에서 생육가능하다는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 브레비박테리움 속 미생물은 브레비박테리움 케토글루타미쿰, 브레비박테리움 락토퍼멘튬, 브레비박테리움 플라븀, 코리네박테리움 하이드로카보크레스투스, 아쓰로박터 시트레우스 등이며, 가장 바람직하게는 브레비박테리움 케토글루타미쿰을 사용하는 것이 좋다.

본 발명의 단계 (1)에서는 친주를 완전평판배지에서 25~35℃, 12~36시간 동안 배양한 후 이를 완전액체배지(포도당 1~3%, 제2인산칼륨 0.3~0.7%, 염화나트륨 0.3~0.7%, 효모추출물 0.5~1.5%, 펩톤 0.5~1.5%)에 접종하여 25~35℃, 6~18시간 동안 배양하였다. 배양한 후 약 12000rpm에서 약 15분간 원심 분리한 다음 0.01~0.2몰의 TM(Tris Maleic acid) 완충액(pH 5~7)으로 1~3회 수세하여 균체농도가 10⁵~10¹⁰ cell/ml가 되도록 희석하였다. 바람직한 완전평판배지의 조성은 이에 한정되는 것은 아니지만 포도당 2%, 제2인산칼륨 0.5%, 염화나트륨 0.5%, 효모추출물 1%, 펩톤 1%, 아가르 2% 이다.

본 발명에서 미생물에 대해 자외선 처리는 UV 램프 12~18W, 20~40cm 거리에서 10~40초 조사 하였다.

본 발명에서 사용한 변이 유발제로서는 N¹-메틸-N¹-니트로-N¹-니트로소구아니딘(NTG), 에틸 메탄술퍼네이트(EMS) 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 N¹-메틸-N¹-니트로-N¹-니트로소구아니딘(NTG)을 사용하는 것이 좋다. 이때 NTG를 사용한 경우 이를 150~350㎍/㎖ 되도록 가하여 25~35℃에서 20~40분간 처리하였다.

본 발명의 단계(2)에서는 단계(1)에서 얻은 균체를 생리식염수로 2~3회 수세한 후 0.5~1.5몰의 칼륨이온을 포함한 배지에 도말한 후 25~35℃에서 2~5일간 배양하여 성장이 빠른 콜로니를 분리하였다. 바람직하게는 상기 배지의 조성은 이에 한정하는 것은 아니지만 포도당 2%, 황산암모늄 1%, 제2인산칼륨 0.05%, 제1인산칼륨 0.05%, 황산마그네슘 0.05%, 요소 0.1%, 바이오틴 50㎍/㎖, 치아민염산염 100㎍/㎖, 황산철 0.001%, 황산망간 0.002%, 황산아연 0.001%, 아르기닌 0.015%이다.

본 발명의 단계(3)에서는 단계(2)에서 분리한 콜로니를 플라스크 역가배지에서 오르니친 생산성을 측정하여 생산성이 우수한 미생물을 선별하였다. 바람직한 역가배지의 조성은 이에 한정되는 것은 아니지만 포도당 6%, 황산암모늄 1.5%, 제2 인산칼륨 0.3%, 황산마그네슘 0.15%, 효모추출물 0.5%, 아르기닌 0.015%, 요소 0.1%, 탄살칼슘 0.5%, 황산철 0.001%, 황산망간 0.002%, 황산아연 0.001%, pH7.2 이다. 또한 위와 같이 선별된 미생물은 칼륨이온 0.9몰 이상의 농도에서 생육이 가능한 것이 바람직하다. 본 발명에서 선별된 변이균주는 브레비박테리움 케토글루타미쿰 OPR24라 명명하고 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2008년 1월 15일 기탁하였다(기탁번호 KCTC 11263BP).

본 발명에 따른 미생물을 이용하여 당 업계에 알려진 통상적인 배양조건 하에서 L-오르니친을 제조할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 칼륨이온에 대한 내성을 갖는 균주의 선별

완전 평판배지(포도당 2%, 제2인산칼륨 0.5%, 염화나트륨 0.5%, 효모추출물 1%, 펩톤 1%, 한천 2%)에서 30℃, 24시간 동안 배양된 친주 ORN을 모균주로 하여 이를 완전액체배지에 접종하여 30℃에서 12시간 동안 배양하였다. 배양 후 12000rpm에서 15분동안 원심분리 한 다음 0.2몰 TM완충액 (pH6.0)으로 2회 수세하 였다. 동일한 완충액으로 균체농도가 10⁶-10⁸cell/ml 가 되도록 적절히 희석한 후 NTG 250㎍/㎖ 되도록 가하여 30℃에서 30분간 처리하였다. 처리된 균체를 생리식염수로 2-3회 수세한 후 칼륨이온 0.9몰을 포함한 동일배지에 도말한 후 30℃에서 3-4일간 배양하여 성장이 빠른 콜로니를 분리 하였다. 이를 플라스크 역가배지(포도당 6%, 황산암모늄 1.5%, 제2인산칼륨 0.3%, 황산마그네슘 0.15%, 효모추출물 0.5%, 아르기닌 0.015%, 요소 0.1%, 탄산칼슘 0.5%, 황산철 0.001%, 황산망간 0.002%, 황산아연 0.001%, pH7.2)에서 아래의 오르니친 정량법을 이용하여 오르니친 생산성을 측정하여 생산성이 우수한 균주를 선별한 후 OPR24로 명명하였고 이를 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2008년 1월 15일자 기탁하였다(기탁번호 KCTC 11263BP). 선별된 변이주 OPR24의 특성은 표1에 기재 된바와 같으며, 본 발명의 미생물은 칼륨이온 0.9몰 이상의 농도에서 생육이 가능한 균주임을 확인하였다. 이때 오르니친 정량법은 닌히드린 정량법에 따른 것으로, (1) 시료와 표준액을 0.3ml씩 캡 튜브에 넣은 후 3노르말 염산 0.2ml 첨가하는 단계, (2) 각 튜브에 닌히드린 용액 (15g 닌히드린/100ml 에틸렌글리콜 모노메틸 에테르) 0.5ml 첨가후 교반하는 단계, (3) 100℃ 항온조에 40분간 반응 후 상온까지 냉각하는 단계 및 (4) 각 튜브에 인산 4ml를 첨가하여 교반한 후 526nm에서 흡광도 측정하는 단계를 거쳐 오르니친을 정량하였다.

실시예 2: 선별된 변이균주를 이용하여 L- 오르니친의 제조

실시예 1의 완전액체배지 20ml를 250ml 삼각 배플플라스크에 분주하여 121℃에서 15분간 가압살균한 후 상기 실시예 1에서 선별된 변이주와 모균주를 각각 접종하고 30 ℃에서 16시간 진탕 배양하여 종균배양액으로 하였다. 이를 탄산칼슘 100mg 포함된 플라스크에 121℃에서 15분간 가압살균한 후 실시예 1의 동일한 플라스크 역가배지 조성의 발효배지를 250ml 삼각 배플플라스크에 20ml씩 분주하고 미리 준비한 종균배양액 200㎕를 접종하여 30℃에서 72시간 진탕 배양하였다. 균주의 생육도와 발효액 중 L-오르니친의 생산량을 측정한 결과는 하기 표 2와 같다.

따라서 본 발명에 따른 변이주 ORP24가 모균주보다 L-오르니친을 3.5배 많이 생산한다는 것을 알 수 있다.

실시예 3: 선별된 변이균주의 생산성 평가

발효 생산배지(포도당 10%, 황산마그네슘 0.15%, 효모추출액 1.5%, 황산암모늄 1.5%, 제1인산칼륨 0.16%, 제2인산수소나트륨 0.5%, 황산철 0.001%, 황산망간 0.002%, 황산아연 0.001%, 아르기닌 0.045%) 1.8ℓ를 살균된 5ℓ 규모의 소형 발효조에 넣고 실시예 2와 같이 OPR24의 종균 배양액을 200ml을 접종하고 650rpm, 1vvm의 조건으로 30℃에서 72시간 발효 하였다. 발효액 중 pH는 암모니아수로 7로 조절하였으며 추가 당 및 추가 물질은 발효 중에 첨가하는 유가식 발효 공정으로 균주의 생산성을 비교하였다. 발효에 사용된 총 당량은 200g/ℓ를 사용하였고 이때 발효시간은 72시간이 소요되었으며 최종 균생육도 및 오르니친 생산성은 하기 표 3과 같았다. 하기의 발효실험에서와 같이 본 발명의 변이균주는 모균주(ORN)에 비하여 초기배지중의 아르기닌 농도에 영향을 거의 받지 않으면서 생산성이 우수한 안정적인 균주임을 확인 하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

브레비박테리움 케토글루타미쿰의 변이주로 L-오르니친을 생산하는 브레비박테리움 케토글루타미쿰 OPR24(KCTC 11263BP)
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(1) L-오르니친의 생산능이 있는 브레비박테리움 케토글루타미쿰을 친주로 하여 배양한 후 자외선 조사 및 변이 유발제로 처리하는 단계; (2) 단계 (1)을 거친 균주를 배양배지에 농도별로 칼륨이온을 첨가하는 단계; (3) 친주와 대비되는 농도에서 생육이 가능한 변이균주를 선발하는 단계를 거쳐 제1항의 미생물을 제조하는 방법.
제1항의 미생물을 배양하는 것을 포함하는 L-오르니친을 제조하는 방법.