CN111154704B - 一株粘质沙雷氏菌突变株以及发酵生产组氨酸的方法 - Google Patents

一株粘质沙雷氏菌突变株以及发酵生产组氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株粘质沙雷氏菌突变株以及发酵生产组氨酸的方法，属于发酵工程技术领域。所述粘质沙雷氏菌突变株是通过诱变筛选获得的，其具有如下特征：①组氨酸酶缺陷；②ATP‑磷酸核糖基转移酶158位的丙氨酸突变为苯丙氨酸，252位的苏氨酸突变为谷氨酰胺，271位的谷氨酸突变为赖氨酸；③具有组氨酸结构类似物以及嘌呤结构类似物抗性。该突变株在50 L发酵罐中经过45 h发酵，组氨酸产量达到40 g/L，糖酸转化率可达16%。

Description

一株粘质沙雷氏菌突变株以及发酵生产组氨酸的方法
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，具体地，涉及一株粘质沙雷氏菌突变株以及发酵生产组氨酸的方法。
背景技术
组氨酸是20种常用氨基酸之一，参与体内蛋白质的合成，是蛋白质结构的重要组成部分。组氨酸以多种形式参与机体的生理生化反应，如清除细胞内过氧化物，参与免疫调节等。因此，开发大批量、工业化、低成本高效的组氨酸生产方法，满足医药以及食品领域对于组氨酸原料的需求是一个重要的问题。
蛋白质水解提取组氨酸生产的传统方法，但由于蛋白质来源，如猪血粉，豆粉等来源有限，提取过程污染严重，不适用于工业化规模的生产。与之相比，微生物发酵法反应条件温和，原料价格低廉，产物旋光性单一，是制备组氨酸的理想方法。目前可用于组氨酸生产的微生物包括大肠杆菌(201910461591.5)、谷氨酸棒杆菌(ZL201410050868.2,201810118782.7)和粘质沙雷氏菌(ZL201210539597.8)等。上述生产菌通常经过传统诱变或基因工程改造，解除了组氨酸合成代谢中受到的反馈阻遏和反馈抑制，增加了组氨酸合成前体物的供应，从而实现了组氨酸的过量积累。
组氨酸高产菌株的选育难点在于解除合成途径中第一个酶即ATP-磷酸核糖基转移酶（HisG）受到的终产物反馈调节。虽然一些研究报道了谷氨酸棒杆菌来源的HisG的调节位点（ZL201410050868.2, 201810118782.7），但是对于粘质沙雷氏菌来源的HisG的调节位点尚不清楚。此外，微生物普遍具有降解组氨酸的能力，但对于组氨酸分解代谢途径以及酶尚不清楚。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的一在于提供一株粘质沙雷氏菌突变株，目的二在于提供利用所述粘质沙雷氏菌突变株发酵生产组氨酸的方法。所述突变株通过缺陷组氨酸酶降低了目标产物的分解代谢，解除了合成途径中ATP-磷酸核糖基转移酶受到的反馈阻遏和反馈抑制，从而实现组氨酸的过量积累，组氨酸浓度可达40±2 g/L，糖酸转化率可达16±1%。
为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：
一株粘质沙雷氏菌突变株，其具有如下特征：①组氨酸酶缺陷；②氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示的ATP-磷酸核糖基转移酶第158位的丙氨酸突变为苯丙氨酸、第252位的苏氨酸突变为谷氨酰胺、第271位的谷氨酸突变为赖氨酸；③具有组氨酸结构类似物或/和嘌呤结构类似物抗性。
进一步地，所述粘质沙雷氏菌突变株，分类学命名为粘质沙雷氏菌（ Serratia  marcescens），已于2019年12月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.19116。
本发明还提供利用所述粘质沙雷氏菌突变株发酵生产组氨酸的方法，具体步骤如下：以所述粘质沙雷氏菌突变株为生产菌株，将所述生产菌株接种到含有种子培养基的发酵罐中进行种子培养，接种量为7-10%，培养温度为30-40 ℃，pH 6.5-7.5，溶氧控制在20-40%，残糖控制在1-3%，培养周期为8-16 h；种子培养完成后，接种到含有发酵培养基的发酵罐中进行组氨酸发酵，接种量为7-10%，培养温度为30-40 ℃，pH 6.5-7.5，溶氧控制在20-40%，残糖控制在1-3%，发酵周期为40-45 h，完成发酵。
进一步地，所述种子培养基中所含的成分及浓度分别为：葡萄糖 4-5%，酵母粉0.5-1%，甜菜碱 0.1-0.5%，磷酸氢二钾 0.12-0.25%，玉米浆3.5-5.0%，硫酸铵 0.5-0.9%，硫酸镁0.05-0.08%，硫酸锰 1-5mg/L，硫酸亚铁 5-10mg/L，生物素 0.2-0.8mg/L，VB1 0.2-0.6mg/L， 消泡剂 0.8-1.2ml/L。
进一步地，所述发酵培养基中所含的成分及浓度分别为：葡萄糖 4-10%，酵母粉0.5-0.8%，甜菜碱 0.1-0.6%，磷酸氢二钾 0.12-0.3%，玉米浆3.5-7%，硫酸铵 0.5-1.2%，硫酸镁0.050-12%，硫酸锰 1-5mg/L，硫酸亚铁 5-12mg/L，生物素 0.2-0.7mg/L，VB1 0.2-0.7mg/L，硫酸锌0.005-0.15%， 消泡剂 0.8-1.5ml/L。
本发明还另外提供所述粘质沙雷氏菌突变株在组氨酸发酵生产方面的应用。
有益效果：
1、本发明提供了一株用于组氨酸生产的粘质沙雷氏菌突变株，并提供了ATP-磷酸核糖基转移酶中存在的突变位点。上述突变位点能够有效解除组氨酸对ATP-磷酸核糖基转移酶的反馈抑制，能够应用于更高效的组氨酸生产菌株的改造。
2、本发明提供的用于组氨酸生产的粘质沙雷氏菌突变株 Serratia marcescensJL026，在50 L发酵罐中的组氨酸产量达到40±2 g/L，糖酸转化率可达16±1%，均为这类菌株现有报道的最高值。
3、本发明提供的粘质沙雷氏菌突变株 Serratia marcescens JL026，存在组氨酸酶缺陷并且能够耐受高浓度的组氨酸结构类似物以及嘌呤结构类似物。
生物材料的保藏：
所述粘质沙雷氏菌突变株具体为 Serratia marcescens JL026。该菌株已于2019年12月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.19116。
附图说明
图1是粘质沙雷氏菌突变株的遗传性状和摇瓶发酵组氨酸产量图；
图中：Histidase：组氨酸酶，TAr：1,2,4-三唑丙氨酸抗性，2MHr：2-甲基组氨酸抗性，APr：硫唑嘌呤抗性。
具体实施方式
一株高产组氨酸的粘质沙雷氏菌突变株。该粘质沙雷氏菌突变株是通过物理诱变筛选获得的，其具有如下特征：①组氨酸酶缺陷；②ATP-磷酸核糖基转移酶158位的丙氨酸突变为苯丙氨酸，252位的苏氨酸突变为谷氨酰胺，271位的谷氨酸突变为赖氨酸；③具有组氨酸结构类似物以及嘌呤结构类似物抗性。
所述粘质沙雷氏菌突变株具体为 Serratia marcescens JL026。该菌株已于2019年12月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.19116。
所述粘质沙雷氏菌突变株是以一株粘质沙雷氏菌标准株（ Serratia marcescensATCC8100）为出发菌株，经过多轮次常压室温等离子体诱变（ARTP）和高通量筛选获得的。具体步骤如下：以 Serratia marcescens ATCC8100为出发菌株进行第一轮次ARTP诱变，然后筛选出在以组氨酸为唯一碳氮源的培养基中不能正常生长的突变株HS732；以HS732为出发菌株进行第二轮次ARTP诱变诱变，然后在含有200 mg/L的1,2,4-三唑丙氨酸的培养基中筛选出菌株TA517；以TA517为出发菌株进行第三轮次ARTP诱变，然后在含有 200 mg/L的2-甲基组氨酸的培养基中筛选出菌株MH335；以MH335为出发菌株进行第四轮次的ARTP诱变，然后在含有400 mg/L的硫唑嘌呤的培养基中筛选出菌株JL026。
所述粘质沙雷氏菌突变株在以组氨酸为唯一碳氮源的培养基中不能正常生长。
所述粘质沙雷氏菌突变株的ATP-磷酸核糖基转移酶原始氨基酸序列如序列表SEQID No.1所示；突变氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示；原始核苷酸序列如序列表SEQID No.3所示；突变核苷酸序列如序列表SEQ ID No.4所示。
所述粘质沙雷氏菌突变株具有1,2,4-三唑丙氨酸抗性，抗性浓度为2.2 g/L；具有2-甲基组氨酸抗性，抗性浓度为2.5 g/L，具有硫唑嘌呤抗性，抗性浓度为3.8 g/L。
一种组氨酸的发酵生产方法，具体为：以 Serratia marcescens JL026为生产菌株，将其接种到含有9 L种子培养基的15 L发酵罐中进行种子培养，接种量为7-10%，培养温度为30-40 ℃，pH 6.5-7.5，溶氧控制在20-40%，残糖控制在1-3%，培养周期为8-16 h。种子培养完成后，接种到含有20 L发酵培养基的50 L发酵罐中进行组氨酸发酵，接种量为7-10%，培养温度为30-40 ℃，pH 6.5-7.5，溶氧控制在20-40%，残糖控制在1-3%，发酵周期为40-45 h。发酵完成后，发酵液中组氨酸浓度可达40±2 g/L，糖酸转化率可达16±1%。
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1：粘质沙雷氏菌突变株 Serratia marcescens HS732的选育
1.ARTP诱变
将出发菌株 Serratia marcescens ATCC8100接种于含有LB培养基的摇管中，放入30 ℃，200 r/min的摇床中培养12 h。将培养好的种子液用生理盐水稀释至OD600=1.0，再用移液器吸取10 μL菌液均匀涂至圆形金属片上。将金属片放置于ARTP育种机（北京思清源生物科技有限公司）中，以氦气作为工作气体，设置气体流量为10 L/min，喷气口与金属片的距离为2 mm，作用功率100 W，作用时间为40 S。
2.菌种初筛
将处理后的菌体重悬于1 mL生理盐水中，并涂布于LB固体培养基中，放入30 ℃培养箱中静置培养12 h。将长出的菌落逐一对点到以组氨酸为唯一碳氮源的固体培养基中。选取在LB固体培养基中能够生长而在以组氨酸为唯一碳氮源的固体培养基中不能生长的菌株进行复筛。
3.深孔板复筛
将初筛获得的菌株逐一转接入含有200 μL培养基的深孔板中，深孔板培养基包括葡萄糖2%，酵母粉0.5%，蛋白胨1%，磷酸氢二钾0.2%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.1%，柠檬酸钠0.1%。将深孔板放入30 ℃，150 r/min的摇床中培养48 h。培养结束后，用孔板离心机离心，取80 μL上清液加入20 μL Pauly溶液混合后静置 5min，放入酶标仪中检测470 nm处的吸光值。选取吸光值较大的菌体50个备用。
4.摇瓶发酵检测
将复筛获得的菌体逐一转入含有30 mL种子培养基的摇瓶中，摇瓶种子培养基组成与深孔板培养基相同。将摇瓶放入30 ℃，200 r/min的摇床中培养12 h。培养结束后，取3mL种子液转移到含有30 mL发酵培养基的摇瓶中。摇瓶发酵培养基包括葡萄糖10%，酵母粉0.8%，玉米浆1%，硫酸铵2%，磷酸二氢钾0.2%，硫酸镁0.1%。将摇瓶放入30 ℃，200 r/min的摇床中培养48 h。培养结束后，离心机离心取上清液，再用高效液相色谱测定其中组氨酸的含量。
高效液相色谱条件为：色 谱 柱：C18 4.6mm×25cm×5μm，柱 温：25℃ ，检测波长：260nm，流速：1.0ml/min，进样量：20μl，流动相：0.01mol/L磷酸氢二钾溶液，用磷酸调节pH6.0：甲醇90：10
实施例2：粘质沙雷氏菌突变株 Serratia marcescens TA517、MH335以及JL026的选育
1.ARTP诱变
将出发菌株Serratia marcescens HS732接种于含有LB培养基的摇管中，放入30℃，200 r/min的摇床中培养12 h。将培养好的种子液用生理盐水稀释至OD600=1.0，再用移液器吸取10 μL菌液均匀涂至圆形金属片上。将金属片放置于ARTP育种机（北京思清源生物科技有限公司）中，以氦气作为工作气体，设置气体流量为10 L/min，喷气口与金属片的距离为2 mm，作用功率100 W，作用时间为40 S。
2.菌种初筛
将处理后的菌体重悬于1 mL生理盐水中，并涂布于含有组氨酸或嘌呤结构类似物（200 mg/L的1,2,4-三唑丙氨酸/ 200 mg/L的2-甲基组氨酸/ 400 mg/L的硫唑嘌呤）的LB固体培养基中，放入30 ℃培养箱中静置培养12 h。每次初筛选取菌落较大的菌体1000个备用。
3.深孔板复筛
将初筛获得的菌株逐一转接入含有200 μL培养基的深孔板中，深孔板培养基包括葡萄糖2%，酵母粉0.5%，蛋白胨1%，磷酸氢二钾0.2%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.1%，柠檬酸钠0.1%。将深孔板放入30 ℃，150 r/min的摇床中培养48 h。培养结束后，用孔板离心机离心，将上清液稀释50倍，取80 μL稀释液加入20 μL Pauly溶液混合后静置 5min，放入酶标仪中检测470 nm处的吸光值。选取吸光值较大的菌体50个备用。
4.摇瓶发酵检测
将复筛获得的菌体逐一转入含有30 mL种子培养基的摇瓶中，摇瓶种子培养基组成与深孔板培养基相同。将摇瓶放入30 ℃，200 r/min的摇床中培养12 h。培养结束后，取3mL种子液转移到含有30 mL发酵培养基的摇瓶中。摇瓶发酵培养基包括葡萄糖10%，酵母粉0.8%，玉米浆1%，硫酸铵2%，磷酸二氢钾0.2%，硫酸镁0.1%。将摇瓶放入30 ℃，200 r/min的摇床中培养48 h。培养结束后，离心机离心取上清液，稀释50倍后再用高效液相色谱测定其中组氨酸的含量。
高效液相色谱条件为：色 谱 柱：C18 4.6mm×25cm×5μm，柱 温：25℃ ，检测波长：260nm，流速：1.0ml/min，进样量：20μl，流动相：0.01mol/L磷酸氢二钾溶液，用磷酸调节pH6.0：甲醇90：10
5.菌种进化关系
按照1-4的方法逐步筛选出具有不同组氨酸或嘌呤结构类似物抗性并且组氨酸产量最高的突变株TA517、MH335以及JL026，菌种的进化关系以及摇瓶发酵组氨酸产量如附图1所示。
实施例3 利用粘质沙雷氏菌突变株 Serratia marcescens JL026发酵生产组氨酸
以 Serratia marcescens JL026为生产菌株，接种到含有9L种子培养基的15 L发酵罐中进行种子培养，接种量为8%，培养温度为30 ℃，pH7.0，溶氧控制在30%，残糖控制在2%，培养周期为12 h。种子培养完成后，接种到含有20 L发酵培养基的50 L发酵罐中进行组氨酸发酵，接种量为9%，培养温度为30 ℃，pH 7.0，溶氧控制在25%，残糖控制在1%，发酵周期为45h。发酵完成后，发酵液中组氨酸浓度可达40 g/L，糖酸转化率可达16%。
所述发酵罐种子培养基为：葡萄糖 4-5%，酵母粉 0.5-1%，甜菜碱 0.1-0.5%，磷酸氢二钾 0.12-0.25%，玉米浆3.5-5.0%，硫酸铵 0.5-0.9%，硫酸镁0.05-0.08%，硫酸锰 1-5mg/L，硫酸亚铁 5-10mg/L，生物素 0.2-0.8mg/L，VB1 0.2-0.6mg/L， 消泡剂 0.8-1.2ml/L；
所述的发酵罐发酵培养基为：葡萄糖 4-10%，酵母粉 0.5-0.8%，甜菜碱 0.1-0.6%，磷酸氢二钾 0.12-0.3%，玉米浆3.5-7%，硫酸铵 0.5-1.2%，硫酸镁0.050-12%，硫酸锰1-5mg/L，硫酸亚铁 5-12mg/L，生物素 0.2-0.7mg/L，VB1 0.2-0.7mg/L，硫酸锌0.005-0.15%， 消泡剂 0.8-1.5ml/L；
实施例4粘质沙雷氏菌突变株 Serratia marcescens JL026和出发菌株 Serratia  marcescens ATCC8100对组氨酸或嘌呤结构类似物的耐受性检验
将突变株 Serratia marcescens JL026和出发菌株 Serratia marcescensATCC8100接种于含有LB培养基的摇管中，放入30 ℃，200 r/min的摇床中培养12 h。将培养好的种子液用生理盐水稀释108倍，再用移液器吸取10 μL菌液均匀涂布至含有不同浓度组氨酸或嘌呤结构类似物的LB固体培养基中。每个浓度3个平行，对照为LB固体培养基。将所有固体培养基同时放入30 ℃培养箱中静置培养12 h。平板菌落计数计算致死率和致死浓度，结果如表1所示 。
表1 组氨酸或嘌呤结构类似物抗性检测
Figure 575100DEST_PATH_IMAGE002
需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南巨龙生物工程股份有限公司
<120> 一株粘质沙雷氏菌突变株以及发酵生产组氨酸的方法
<130> 1
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 299
<212> PRT
<213> 粘质沙雷氏菌
<400> 1
Met Leu Asp Lys Thr Arg Leu Arg Ile Ala Met Gln Lys Ser Gly Arg
1               5                   10                  15
Leu Ser Glu Glu Ser Gln Glu Leu Leu Ala Arg Cys Gly Ile Lys Ile
            20                  25                  30
Asn Leu Gln Gln Gln Arg Leu Ile Ala Phe Ala Glu Asn Met Pro Ile
        35                  40                  45
Asp Ile Leu Arg Val Arg Asp Asp Asp Ile Pro Gly Leu Val Met Asp
    50                  55                  60
Gly Val Val Asp Leu Gly Ile Ile Gly Glu Asn Val Leu Glu Glu Glu
65                  70                  75                  80
Leu Leu Ser Arg Arg Ala Gln Gly Glu Asp Pro Arg Tyr Phe Thr Leu
                85                  90                  95
Arg Arg Leu Asp Phe Gly Gly Cys Arg Leu Ser Leu Ala Thr Pro Leu
            100                 105                 110
Asp Ala Glu Tyr Ala Gly Pro Gln Ser Leu Gln Asp Ala Arg Ile Ala
        115                 120                 125
Thr Ser Tyr Pro His Leu Leu Lys Gln Tyr Leu Asp Lys Gln Gly Val
    130                 135                 140
Arg Phe Lys Ser Cys Leu Leu Asn Gly Ser Val Glu Val Ala Pro Arg
145                 150                 155                 160
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Ile Cys Asp Leu Val Ser Thr Gly Ala Thr
                165                 170                 175
Leu Glu Ala Asn Gly Leu Arg Glu Val Glu Val Ile Tyr Arg Ser Lys
            180                 185                 190
Ala Cys Leu Ile Gln Arg Asp Gly Glu Met Pro Glu Ala Lys Gln Gln
        195                 200                 205
Leu Ile Asp Arg Leu Met Thr Arg Ile Gln Gly Val Ile Gln Ala Arg
    210                 215                 220
Glu Ser Lys Tyr Ile Met Leu His Ala Pro Ser Glu Lys Leu Asp Glu
225                 230                 235                 240
Ile Val Ala Leu Leu Pro Gly Ala Glu Arg Pro Thr Ile Leu Pro Leu
                245                 250                 255
Ala Gly Ala Gln Asn Arg Val Ala Met His Met Val Ser Ser Glu Thr
            260                 265                 270
Leu Phe Trp Glu Thr Met Glu Lys Leu Lys Ala Leu Gly Ala Ser Ser
        275                 280                 285
Ile Leu Val Leu Pro Ile Glu Lys Met Met Glu
    290                 295
<210> 2
<211> 299
<212> PRT
<213> 粘质沙雷氏菌
<400> 2
Met Leu Asp Lys Thr Arg Leu Arg Ile Ala Met Gln Lys Ser Gly Arg
1               5                   10                  15
Leu Ser Glu Glu Ser Gln Glu Leu Leu Ala Arg Cys Gly Ile Lys Ile
            20                  25                  30
Asn Leu Gln Gln Gln Arg Leu Ile Ala Phe Ala Glu Asn Met Pro Ile
        35                  40                  45
Asp Ile Leu Arg Val Arg Asp Asp Asp Ile Pro Gly Leu Val Met Asp
    50                  55                  60
Gly Val Val Asp Leu Gly Ile Ile Gly Glu Asn Val Leu Glu Glu Glu
65                  70                  75                  80
Leu Leu Ser Arg Arg Ala Gln Gly Glu Asp Pro Arg Tyr Phe Thr Leu
                85                  90                  95
Arg Arg Leu Asp Phe Gly Gly Cys Arg Leu Ser Leu Ala Thr Pro Leu
            100                 105                 110
Asp Ala Glu Tyr Ala Gly Pro Gln Ser Leu Gln Asp Ala Arg Ile Ala
        115                 120                 125
Thr Ser Tyr Pro His Leu Leu Lys Gln Tyr Leu Asp Lys Gln Gly Val
    130                 135                 140
Arg Phe Lys Ser Cys Leu Leu Asn Gly Ser Val Glu Val Phe Pro Arg
145                 150                 155                 160
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Ile Cys Asp Leu Val Ser Thr Gly Ala Thr
                165                 170                 175
Leu Glu Ala Asn Gly Leu Arg Glu Val Glu Val Ile Tyr Arg Ser Lys
            180                 185                 190
Ala Cys Leu Ile Gln Arg Asp Gly Glu Met Pro Glu Ala Lys Gln Gln
        195                 200                 205
Leu Ile Asp Arg Leu Met Thr Arg Ile Gln Gly Val Ile Gln Ala Arg
    210                 215                 220
Glu Ser Lys Tyr Ile Met Leu His Ala Pro Ser Glu Lys Leu Asp Glu
225                 230                 235                 240
Ile Val Ala Leu Leu Pro Gly Ala Glu Arg Pro Gln Ile Leu Pro Leu
                245                 250                 255
Ala Gly Ala Gln Asn Arg Val Ala Met His Met Val Ser Ser Lys Thr
            260                 265                 270
Leu Phe Trp Glu Thr Met Glu Lys Leu Lys Ala Leu Gly Ala Ser Ser
        275                 280                 285
Ile Leu Val Leu Pro Ile Glu Lys Met Met Glu
    290                 295
<210> 3
<211> 900
<212> DNA
<213> 粘质沙雷氏菌
<400> 3
atgctggaca agacacgttt acggatcgca atgcagaagt cgggccgcct gagcgaggaa 60
tcccaggaac tgctggcgcg ctgcggcatc aagatcaacc tgcagcagca gcgtctgatc 120
gccttcgctg aaaacatgcc gatcgatatc ctgcgcgtgc gcgacgacga cattccgggc 180
ctggtgatgg acggcgtggt cgatctgggc atcatcggcg aaaacgtgct ggaagaagag 240
ctgctcagcc gccgcgctca gggcgaagac ccgcgctact tcaccctgcg ccgcctcgat 300
ttcggaggct gccgcctgtc gctggccacc ccgctcgacg ccgaatacgc cggcccgcaa 360
agcctgcagg acgcccgcat cgccacctct tacccgcacc tgctgaagca atacctcgac 420
aagcagggcg tgcgctttaa atcttgcctg ctgaacggct cggtggaagt ggcgccgcgc 480
gccggcctgg ccgacgccat ctgcgatctg gtctctaccg gcgccacgct ggaggccaac 540
ggcctgcgcg aagtggaagt gatctaccgc tccaaggcct gcctgattca gcgcgacggc 600
gaaatgccgg aagccaaaca gcagctgatc gaccgcctga tgacccgcat tcagggcgtg 660
atccaggcgc gtgaatccaa atacatcatg ctgcacgcgc cgagcgaaaa gctggacgag 720
atcgtcgcgc tgctgccggg cgccgaacgc ccgaccattc tgccgctggc cggcgcgcag 780
aaccgcgtgg cgatgcacat ggtgagcagc gaaaccctgt tctgggaaac catggaaaaa 840
ctgaaagcgc tcggcgccag ctcgattctg gtgctgccga ttgaaaagat gatggagtaa 900
<210> 4
<211> 900
<212> DNA
<213> 粘质沙雷氏菌
<400> 4
atgctggaca agacacgttt acggatcgca atgcagaagt cgggccgcct gagcgaggaa 60
tcccaggaac tgctggcgcg ctgcggcatc aagatcaacc tgcagcagca gcgtctgatc 120
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ggcctgcgcg aagtggaagt gatctaccgc tccaaggcct gcctgattca gcgcgacggc 600
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aaccgcgtgg cgatgcacat ggtgagcagc aaaaccctgt tctgggaaac catggaaaaa 840
ctgaaagcgc tcggcgccag ctcgattctg gtgctgccga ttgaaaagat gatggagtaa 900

Claims (5)

1.一株粘质沙雷氏菌突变株，其具有如下特征：①组氨酸酶缺陷；②氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示的ATP-磷酸核糖基转移酶第158位的丙氨酸突变为苯丙氨酸、第252位的苏氨酸突变为谷氨酰胺、第271位的谷氨酸突变为赖氨酸；③具有组氨酸结构类似物或/和嘌呤结构类似物抗性；
所述的一株粘质沙雷氏菌突变株，其分类学命名为粘质沙雷氏菌（Serratia  marcescens），已于2019年12月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.19116。
2.利用权利要求1所述的粘质沙雷氏菌突变株发酵生产组氨酸的方法，其特征在于：具体步骤如下：以所述粘质沙雷氏菌突变株为生产菌株，将所述生产菌株接种到含有种子培养基的发酵罐中进行种子培养，接种量为7-10%，培养温度为30-40 ℃，pH 6.5-7.5，溶氧控制在20-40%，残糖控制在1-3%，培养周期为8-16 h；种子培养完成后，接种到含有发酵培养基的发酵罐中进行组氨酸发酵，接种量为7-10%，培养温度为30-40 ℃，pH 6.5-7.5，溶氧控制在20-40%，残糖控制在1-3%，发酵周期为40-45 h，完成发酵。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述种子培养基中所含的成分及浓度分别为：葡萄糖 4-5%，酵母粉 0.5-1%，甜菜碱 0.1-0.5%，磷酸氢二钾 0.12-0.25%，玉米浆3.5-5.0%，硫酸铵 0.5-0.9%，硫酸镁0.05-0.08%，硫酸锰 1-5mg/L，硫酸亚铁 5-10mg/L，生物素0.2-0.8mg/L，VB1 0.2-0.6mg/L， 消泡剂 0.8-1.2ml/L。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基中所含的成分及浓度分别为：葡萄糖 4-10%，酵母粉 0.5-0.8%，甜菜碱 0.1-0.6%，磷酸氢二钾 0.12-0.3%，玉米浆3.5-7%，硫酸铵 0.5-1.2%，硫酸镁0.050-12%，硫酸锰 1-5mg/L，硫酸亚铁 5-12mg/L，生物素 0.2-0.7mg/L，VB1 0.2-0.7mg/L，硫酸锌0.005-0.15%， 消泡剂 0.8-1.5ml/L。
5.根据权利要求1所述的粘质沙雷氏菌突变株在组氨酸发酵生产方面的应用。
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