CN116396882A - 一种nrk生产菌、生产nrk的方法以及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种NRK生产菌、生产NRK的方法以及应用，属于工程菌技术领域。本发明从污泥中筛选出一株新型NRK生产菌NRK5‑1(Enterobacterkobei2020T51)，其粗酶液可催化生成142.5μmol/LNMN。对筛选出的菌株Enterobacterkobei2020T51进行发酵条件优化构建高效表达体系，最佳发酵条件：1％葡萄糖、3％多价蛋白胨、0.75％KH2PO4和0.03％MgSO4·7H2O，初始pH7.0的发酵培养基，40℃、200rpm恒温摇床培养16h进行发酵，适宜该菌表达NRK且酶活高，采用最佳发酵条件所得的粗酶液进行酶转化反应，NMN产量达332.23μmol/L，底物转化率为33.22％，为优化前的2.3倍。
Description
技术领域
本发明属于工程菌技术领域，尤其涉及一种NRK生产菌、生产NRK的方法以及应用。
背景技术
烟酰胺单核苷酸(NMN)作为辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的关键前体，对人类身体健康具有重要意义，如NMN具有改善缺血性心脑组织损伤、修复氧化相关的身体机能障碍、治疗代谢性疾病等重要作用。人体临床试验表明，NMN具有良好的安全性，且可有效促进身体机能。基于其人体安全性和生物活性，NMN被广泛地应用于食品原料、药品、保健品及护肤品等行业。因此有必要探寻经济且高效的NMN生产方法降低NMN原料成本。
目前技术较为成熟的化学法合成NMN易出现手性问题，且有机溶剂的残留也限制了其在市场中的应用。而酶法制备NMN具备有反应简便、产品活性高及污染程度低等优点，代表了制备NMN的发展趋势。根据底物不同，酶法合成NMN的路径主要分为烟酰胺(NAM)路径和烟酰胺核糖(NR)路径两种。其中烟酰胺核糖路径为烟酰胺核糖激酶(NRK)单酶催化，NRK催化底物烟酰胺核糖和ATP合成NMN。烟酰胺核糖路径在工业化酶法制备NMN有一定的应用，但该路径的应用有其瓶颈所在：NRK来源狭隘，被表征的NRK来源也较为稀有，亟需筛选和表达酶学性质优良的NRK来提高烟酰胺核糖路径的生产效率。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种可高效合成NRK的NRK生产菌，具有高催化活性。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种NRK生产菌，所述NRK生产菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24913。
本发明还提供了一种生产NRK的方法，包括如下步骤：发酵培养上述NRK生产菌，对所得发酵菌液进行破碎处理，得到含有NRK的粗酶液。
优选的，所述发酵培养的发酵培养基包括0％-5％的碳源、1％-3.5％的氮源、0％-1.25％的KH2PO4和0.01％-0.06％的MgSO4·7H2O。
优选的，所述碳源包括鼠李糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖和可溶性淀粉。
优选的，所述氮源包括牛肉粉、酵母提取物、牛肉膏、多价蛋白胨、胰蛋白胨。
优选的，所述发酵时培养基的pH值为6.0-8.0。
优选的，所述发酵培养的条件为：25℃-40℃、振荡培养8h-24h。
优选的，所述振荡培养为摇床振荡培养，所述摇床的转速为150r/min-220r/min。
本发明还提供了一种上述NRK生产菌在制备NMN中的应用。
优选的，包括如下步骤：发酵培养上述NRK生产菌，破碎处理所得菌液得粗酶液，将粗酶液与含有ATP和NR的母液混匀反应，得NMN。
本发明的有益效果：
本发明从污泥中筛选出一株新型NRK生产菌NRK5-1(Enterobacter kobei2020T51)，其粗酶液可催化生成142.5μmol/L NMN。对筛选出的菌株Enterobacter kobei2020T51进行发酵条件优化构建高效表达体系，采用最佳发酵条件：1％葡萄糖、3％多价蛋白胨、0.75％KH2PO4和0.03％MgSO4·7H2O，初始pH 7.0的发酵培养基，40℃、200rpm恒温摇床培养16h进行发酵，适宜该菌表达NRK且酶活高，采用最佳发酵条件所得的粗酶液进行酶转化反应，NMN产量达332.23μmol/L，底物转化率为33.22％，为优化前的2.3倍。
保藏说明
本发明NRK生产菌NRK5-1(Enterobacter kobei 2020T51)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2022年5月19日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.24913。
附图说明
图1为HPLC各组分出峰图，其中(a)为NMN标准品出峰图，图(b)为ATP标准品出峰图，图(c)为NR标准品出峰，图(d)为NMN、ATP、NR混合样出峰图；
图2为HPLC法测定的NMN标准曲线；
图3为菌株生成NMN的产量；
图4为NRK5-1菌落形态；
图5为NRK5-1革兰氏染色结果；
图6为NRK5-1 SEM扫描电镜结果；
图7为琼脂糖电泳胶图，其中M为DNA Ladder Mix marker，1为NRK5-1 PCR产物；
图8为菌株NRK5-1的BLAST结果；
图9为以菌株NRK5-1及其相关属种16S rDNA序列为基础构建的系统进化树；
图10为碳源种类对Enterobacter kobei 2020T51菌体生长和NMN生成量的影响，其中—□—代表OD600，—■—代表NMN产量，1-7分别对应鼠李糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖和淀粉；
图11为葡萄糖浓度对Enterobacter kobei 2020T51菌体生长和NMN生成量的影响，其中—■—代表OD600，—●—代表NMN产量；
图12为氮源种类对Enterobacter kobei 2020T51菌体生长和NMN生成量的影响，其中—□—代表OD600，—■—代表NMN产量，1-7分别对应牛肉粉、酵母提取物、牛肉膏、多价蛋白胨、蛋白胨、尿素和氯化铵；
图13为胰蛋白胨浓度对菌种Enterobacter kobei 2020T51菌体生长和NMN生成量的影响，其中—■—代表OD600，—●—代表NMN产量；
图14为KH2PO4浓度对Enterobacter kobei 2020T51菌体生长和NMN生成量的影响，其中—■—代表OD600，—●—代表NMN产量；
图15为MgSO4·7H2O浓度对Enterobacter kobei 2020T51菌体生长和NMN生成量的影响，其中—■—代表OD600，—●—代表NMN产量；
图16为初始pH对Enterobacter kobei 2020T51菌体生长和NMN生成量的影响，其中—■—代表OD600，—●—代表NMN产量；
图17为摇床转速对Enterobacter kobei 2020T51菌体生长和NMN生成量的影响，其中—■—代表OD600，—●—代表NMN产量；
图18为发酵温度对Enterobacter kobei 2020T51菌体生长和NMN生成量的影响，其中—■—代表OD600，—●—代表NMN产量，a为25℃，b为30℃，c为37℃，d为40℃。
具体实施方式
本发明提供了一种NRK生产菌，所述NRK生产菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24913。
本发明采用如下筛选模型：土壤采集→含NR的富集培养基进行富集培养→选择性平板筛选菌株→HPLC法检测酶活→平板划线纯化菌株→NRK生产菌甘油管保存，成功从上海舒泽生物科技研究所排污口处的污泥中筛选获得上述NRK生产菌。对其进行16S rDNA测序，结果表明本发明NRK生产菌(NRK5-1)的16S rDNA长度为1431bp，具体核苷酸序列如SEQID NO.1所示。综合BLAST同源性比对和系统发育树，将该菌株命名为Enterobacter kobei2020T51。
本发明还提供了一种生产NRK的方法，包括如下步骤：发酵培养上述NRK生产菌，对所得发酵菌液进行破碎处理，得到含有NRK的粗酶液。
在本发明中，所述发酵培养的发酵培养基优选的包括0％-5％的碳源、1％-3.5％的氮源、0％-1.25％的KH2PO4和0.01％-0.06％的MgSO4·7H2O，更优选的包括1％-2％的碳源、2％-3％的氮源、0.5％-1％的KH2PO4和0.02％-0.04％的MgSO4·7H2O。在本发明中，所述碳源优选的包括鼠李糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖和可溶性淀粉，更优选的为葡萄糖，所述氮源优选的包括牛肉粉、酵母提取物、牛肉膏、多价蛋白胨、胰蛋白胨，更优选的为牛肉膏或多价蛋白胨。本发明对于上述发酵培养基中的各组分的具体来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品均可。
在本发明中，所述发酵时培养基的pH值优选为6.0-8.0，更优选为6.5-7.0。所述发酵培养的条件优选为25℃-40℃、振荡培养8h-24h，更优选为37℃-40℃、振荡培养14h-20h。所述振荡培养优选为采用摇床振荡培养，所述摇床的转速优选为150r/min-220r/min，更优选为180r/min-220r/min。
本发明还提供了一种上述NRK生产菌在制备NMN中的应用，优选的，包括如下步骤：发酵培养上述NRK生产菌，破碎处理所得菌液得粗酶液，将粗酶液与含有ATP和NR的母液混匀反应，得NMN。
在本发明中，发酵培养的条件同上，在此不再赘述。本发明所述破碎处理优选为超声破碎，所述超声破碎的条件优选为功率30％、工作3s、间歇5s，超声破碎8min。在本发明中，所述母液优选的还含有MgSO4·7H2O，所述母液(酶转化反应母液)更优选为由1mMATP、1mM NR、1mM MgSO4·7H2O的溶液，pH为7.4的PBS缓冲液(溶剂)组成。在本发明中，将粗酶液与含有ATP和NR的母液进行酶转化反应时，所述粗酶液与母液的体积比优选为1：1，所述反应的温度优选为37℃，反应的时间优选为15min。反应结束后，优选的需终止酶转化反应，所述终止方法优选为95℃金属浴灭活1min。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
样品采集于上海舒泽生物科技研究所排污口处的污泥。采集后的污泥立即进行预处理。在污泥样品中分别选择3个无杂物的位点A、B、C，各称取1g泥土于100mL锥形瓶内，加入30mL灭菌过的生理盐水，置于37℃、200r/min的恒温摇床内摇匀20min。取出摇匀后的悬浊液在室温静置至泥土完全沉淀，上层清液即为富集培养的样品。
吸取上层清液按10％(v/v)的接种比例接种于富集培养基内(10mL/50mL锥形瓶)，于37℃、200r/min的恒温摇床内富集培养12h。
将富集培养后的菌液梯度稀释至10-4、10-5和10-6，分别吸取50μL稀释液均匀涂布于平板分离培养基。室温下平放约20min后倒置于37℃生化培养箱隔夜培养12-16h。次日使用无菌枪头挑取平板内形态、颜色具有差异的单菌落接种于种子培养基内(20mL/50mL锥形瓶)。于37℃、200r/min的恒温摇床内培养12h后吸取600μL菌液进行甘油保菌，剩余菌液用于菌株活性的检测及筛选。
将筛选得到的活性较高的菌株进行平板划线分离，挑取长势较好的单菌落接种于种子培养基内(10mL/50mL锥形瓶)。于37℃、200r/min的恒温摇床培养12h后，吸取600μL灭菌过的50％甘油与600μL菌液于无菌1.5mL EP管内，混匀后冷冻保存于-80℃冰箱。
上述实验中所使用的培养基具体成分和制备方法如表1所示。
表1培养基
实施例2
菌株活性测定
以酶转化体系内生成的NMN含量高低作为NRK生产菌筛选的指标：转化体系内生成的NMN含量越高，菌株表达NRK酶的能力越强。
将甘油管内保存的菌液按10％(v/v)的比例接种于种子培养基(10mL/50mL锥形瓶)，并于37℃、200r/min的恒温摇床隔夜培育12h制备种子液。次日吸取1mL种子液按5％(v/v)的比例接种于发酵培养基(20mL/50mL锥形瓶)，并于37℃、200r/min的恒温摇床发酵12h。发酵结束后，使用分光光度计检测菌液OD600值并对其超声处理制备粗酶液。
酶转化反应
(1)酶转化反应母液：配置含有1mM ATP、1mM NR、1mM MgSO4·7H2O的溶液，溶剂选用pH为7.4的PBS缓冲液。
(2)酶转化反应方法：吸取50μL粗酶液与50μL母液于1.5mL EP内轻柔吹打混匀，置于37℃生化培养箱孵育反应15min。孵育结束后，立即将样品置于95℃金属浴灭活1min以终止酶转化反应。
HPLC法检测NMN
选择100％磷酸二氢钠溶液分离反应体系内的ATP、NMN、NR；选择甲醇与磷酸二氢钠流动相进行梯度洗脱将反应体系内的杂物洗脱干净，具体洗脱程序见表2。
HPLC检测条件：使用ChromCore C18反相色谱柱(5μM，4.6×250mm)；流动相：A＝0.1mol/L NaH2PO4·2H2O(pH 5.5)，B＝100％甲醇；柱温为25℃；流速为1.0mL/min；进样量为20μL；紫外检测为254nm。
表2 HPLC洗脱程序
(1)进样处理：吸取酶转化反应液100μL与700μL pH 7.4的PBS缓冲液混合，使用孔径为0.22μm的微孔滤膜将其过滤至色谱进样瓶内(进样瓶内样液体积应大于500μL)后冷冻保存于冰箱-20℃。考虑检测时长与仪器损耗，每个样品做2组平行实验。
(2)HPLC法检测NMN标准曲线的测定：分别配置浓度为8、10、15、20、25、50、100μmol/L的NMN标准品各1mL，溶剂使用pH为7.4的PBS缓冲液。利用软件Origin 2019b处理数据并绘制以NMN浓度为横坐标、样品峰面积为纵坐标的标准曲线。
结果如图1和图2所示。由图1可以看出产物NMN和底物ATP、NR三种标准样品的保留时间分别为4.161min、6.161min、6.491min。将这三种标准样品混合后进样，NMN、ATP、NR的出峰时间分别为4.150min、6.212min、6.569min，混合后各标准样品的保留时间与单针进样保留时间基本吻合，说明此HPLC检测方法具备良好可重复性。从图2中可以看出NMN样品峰宽较窄、峰型较好，峰面积准确度较高；且产物NMN与底物ATP、NR的保留时间间隔在2min上，达到了良好的分离效果。由图2可以看出，NMN标准品在0-100μmol/L范围内时，使用高效液相色谱仪测定的NMN拟合出的标准曲线线性良好，其R2达到0.9997。后续根据标准曲线方程y＝1.0102x-2.1334计算反应体系内的NMN含量。
将挑取的菌株使用HPLC法测定转化体系内NMN含量，最终筛选出5株具有较高酶活性的菌株，其NMN产量如图3所示。将该5菌株分别命名为NRK1-3、NRK2-2、NRK2-5、NRK4-4、NRK5-1。重复对该5株菌株的粗酶液及全细胞进行转化反应，采用HPLC检测反应体系中NMN的含量。结果依旧是NRK5-1菌株的NMN产量最高，达142.5μmol/L。且只有粗酶液的转化体系内检测到NMN的生成，全细胞组并未检测到NMN，表明菌株生产的烟酰胺核糖激酶为胞内酶。
实施例3
菌种鉴定(选择实施例2筛选得到的NRK5-1菌株)
形态学鉴定
(1)平板菌落形态观察
取出冰箱-20℃内甘油管保存的菌液，按10％(v/v)比例接种至种子培养基(10mL/50mL锥形瓶)活化12h，次日将种子液梯度稀释至10-4、10-5和10-6并均匀涂布至平板分离培养基。将平板倒置于37℃的生化培养箱内培养约14h，次日观察平板菌落形态。在生化培养箱经过14h的培养长成的菌落如图4所示：菌落形状为圆形，颜色乳白，不透明，其表面光滑且向上凸起，边缘规则，直径在2.5mm以内。
(2)革兰氏染色镜检
涂片：在洁净载玻片上方滴加一滴无菌超纯水。使用接种环挑取平板上生长出的较大菌落于载玻片水滴中，并在载玻片上涂成薄层液面。涂片后将载玻片置于酒精灯上方加热，蒸发水分固定样本。
染色：滴加适量的草酸结晶紫染液于载玻片样品区域，初染1min后用蒸馏水冲洗；滴加碘液媒染1min，使用蒸馏水冲洗碘液并用吹干。滴加95％乙醇进行脱色，流滴使得洗脱液最终无色后吹干。使用番红染液复染1min后使用蒸馏水冲洗并自然风干。
将菌株NRK5-1进行革兰氏染色并使用光学显微镜进行观察，结果如图5所示，菌株经革兰氏染色后呈红色，表明该菌为革兰氏阴性菌。
(3)SEM扫描电镜观察
挑取平板上长势较好的菌落接种于种子培养基，于37℃、200r/min的恒温摇床隔夜培育12h。次日将菌液倒入离心管以4000r/min转速离心5min，弃除上清液保留菌体沉淀，使用无菌蒸馏水将离心管底部湿菌体吹打混匀后，吸取一滴重悬液于经75％酒精预处理过的硅片中心处。将载样硅片放入45℃烘箱内对样品进行干燥直至硅片表面无液滴。使用离子溅射镀膜仪对样品进行3次喷金结束制样，准备电镜检测。结果如图6所示，可见菌体形态为短圆杆状、两端平齐，大小为(0.3-0.8)μm×(0.5-1.5)μm，体积较小。
实施例4
NRK5-1分子生物学鉴定
(1)16S rDNA序列测定：
使用生工生物工程有限公司的Ezup柱氏细菌基因组DNA抽提试剂盒提取菌株基因组DNA，具体操作见说明书。以提取的基因组DNA为模板，按表3所示的体系以及表4所示的程序进行PCR扩增，并对16S rDNA的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果如图7所示。目的基因条带明亮，对比marker分析其序列大小大概在1400bp。使用通用引物进行PCR扩增，序列如下：
27F：5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’(SEQ ID NO.2)，其中M代表A/C；
1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID NO.3)
表3 PCR体系
表4 PCR验证程序
将PCR扩增片段移交至生工生物工程(上海)有限公司完成后续16S rDNA序列测定工作。结果表明NRK5-1的16S rDNA长度为1431bp，序列如SEQ ID NO.1所示。
(2)系统进化树的构建：
将由生工测定的16S rDNA序列在NCBI数据库进行比对，结果如图8所示。从中选取与样本菌株相关度最高的菌种进行多重序列比对分析，利用MEGA软件构建系统进化树。使用软件MEGA将NRK5-1和与之相近的菌株排序并构建系统发育树。结果如图9所示，表明与菌株NRK5-1的16S rDNA序列相似度高达100％的菌株大多为大肠杆菌属。Enterobacterkobei与菌株NRK5-1相似度最高。综合BLAST同源性比对和系统发育树，将该菌株命名为Enterobacter kobei 2020T51，进行后续发酵条件的研究。
实施例5
无菌条件下按5％(v/v)的接种比例将1mL活化后的种子培养液接种于20mLpH为7.5的培养基(初始发酵培养基的组分和配比见表1)内，于30℃、200r/min的条件下发酵培养12h。发酵结束后测定菌液OD600值并对剩余菌液超声处理制备粗酶液，超声细胞破碎仪功率为30％，工作3s、间歇5s，对细胞液进行8min超声破碎。经超声破碎后的细胞液在4℃、4000r/min的条件下离心20min，所得上清液即为粗酶液。吸取50μL粗酶液与50μL母液(配置含有1mM ATP、1mM NR、1mM MgSO4·7H2O的溶液，溶剂选用pH为7.4的PBS缓冲液)于1.5mL EP内轻柔吹打混匀，置于37℃生化培养箱孵育反应15min。孵育结束后，立即将样品置于95℃金属浴灭活1min以终止酶转化反应。采用HPLC法检测反应体系中NMN的含量(具体操作同实施例2)。
实施例6
发酵培养基的优化
碳源
(1)在实施例5所述初始发酵培养基的基础上分别用质量浓度为2％的鼠李糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、可溶性淀粉6种碳源替换初始发酵培养基中4％的蔗糖，其余成分及比例保持不变，以考察不同碳源对NRK表达水平的影响。其余均同实施例5。
结果如图10所示。通过观察6种碳源对应的菌液OD600可以看出，果糖和麦芽糖的菌体生长情况最好，剩余四种碳源的生长情况接近且OD600均高于0.8。说明Enterobacterkobei 2020T51对碳源的选择范围较广，6种碳源都可以被该菌株所利用。转化体系内NMN产量可反应NRK酶的活性，从图10中可以看出最利于表达NRK的碳源为葡萄糖，果糖、麦芽糖、可溶性淀粉以及蔗糖的效果略差。半乳糖为最不适合该菌株的生长及代谢的碳源，无论是OD600还是NMN含量均为最低。综合考虑该实验的研究目的为提高菌株产NRK的酶活，选择葡萄糖作为培养基的最佳碳源。葡萄糖碳源的发酵培养基对应的NMN产量为198.18μmol/L，底物转化率为19.81％。
(2)在上述实验中选定的最佳碳源培养基基础上进行调整，分别用质量浓度为0％、1％、2％、3％、4％、5％的最佳碳源，其余成分及比例保持不变，以考察不同最佳碳源浓度对NRK表达水平的影响。其余均同实施例5。
结果如图11所示。当在培养基内加入终浓度为1％的葡萄糖时会促进菌体表达NRK，NMN产量相对于未添加葡萄糖培养基高出1/5。继续增加培养基内葡萄糖浓度，NMN产量呈下降趋势。此外，相对于未加葡萄糖的培养基，加入葡萄糖后菌体生长情况反而略微变差，菌液的OD600约为0.9。综合考虑该实验的研究目的为提高菌株产NRK的酶活，故选择浓度为1％的葡萄糖最佳。此时转化体系内的NMN产量为214.55μmol/L，底物转化率为21.45％。
氮源
(1)在经碳源优化的发酵培养基的基础上进行调整，分别用质量浓度2％的牛肉粉、酵母提取物、牛肉膏、多价蛋白胨、胰蛋白胨替换原培养基中的氮源，其余成分及比例保持不变，以考察不同氮源对NRK表达水平的影响。其余均同实施例5。
结果如图12所示。不同氮源对野生菌NRK表达水平与生长情况的影响均有所不同。在氮源质量浓度均为2％的条件下，尿素、氯化铵两种无机氮源不利于菌株生长，且在转化体系中为未检测到NMN的生成，表明该菌株无法利用无机氮源产酶。有机氮源中胰蛋白胨培养基对应的NMN产量最低，不适于发酵生产NMN；牛肉粉和酵母提取物培养基内菌体生长情况和NMN产物浓度均处于中等水平；多价蛋白胨和牛肉膏培养基发酵的菌体生长情况良好，所对应的NMN产量也相对较高。其中，含牛肉膏的培养基内NRK表达水平最高，分析其原因可能是粉状培养基在生产过程中的干燥环节损失了部分活性成分，而膏状培养基可以保留更多的维生素等营养物质，使得菌株吸收更多养分合成目的蛋白。但考虑到牛肉膏因其本身质地为粘稠膏状，不便于在精密天平上进行称量。而粉状多价蛋白胨在称取的过程中更易定量，且多价蛋白胨为混合蛋白胨，可全面地提供满足该野生菌生长和代谢所需的营养物质。故最终选用多价蛋白胨作为最佳氮源，其所对应的转化体系内的NMN产量为206.33μmol/L，底物转化率为20.63％。
(2)在上述实验中选定的最佳氮源培养基基础上进行调整，分别使用质量浓度为1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％的最佳氮源，培养基中其余成分及比例不变，以考察不同最佳氮源浓度对NRK表达水平的影响。其余均同实施例5。
结果如图13所示。不同浓度的氮源对野生菌NRK表达水平与生长情况的影响也具有一定的差异。随着多价蛋白胨的浓度从1％增加至3.5％，菌液的OD600先增加后下降。分析其原因可能是当氮源浓度低于2％时，培养基里的氮源含量不足以为菌体提高足够的营养物质导致微生物活性的减弱；当氮源浓度高于2.5％时，培养基内的碳氮比例降低可能会导致菌体生命周期缩短而提前自溶，因而出现细胞OD600下降的现象。同样地，当多价蛋白胨的浓度从1％增加至3.5％，转化体系内的NMN产量也呈现先增加后下降的趋势。当多价蛋白胨浓度为3％时，NMN产量达到峰值202.37μmol/L。继续增大氮源浓度NMN产量反而会下降。其原因可能是培养基内过多的氮源会引发复杂的代谢反应而积累不必要的代谢废物，影响胞内蛋白质的合成与折叠，导致NRK活性的降低。综合考虑该实验的研究目的为提高菌株产NRK的酶活，故选择3％的多价蛋白胨作为培养基氮源的最佳浓度，对应的转化体系内NMN产量为202.37μmol/L，底物转化率为20.23％。
KH2PO4含量
在上述实验中经碳源和氮源优化的培养基内分别加入质量浓度为0％、0.25％、0.5％、0.75％、1％、1.25％的KH2PO4，以考察不同浓度的KH2PO4对NRK表达水平的影响。其余均同实施例5。
结果如图14所示。随着KH2PO4的浓度从0.25％增长至1.5％，细菌的生长情况和NRK表达水平均呈现先增加、后降低的趋势。在添加的KH2PO4浓度为0.75％时菌液OD600达到峰值1.523，对应的NMN产量也达到峰值208.27μmol/L，底物转化率达20.82％。因此，本实验得出的研究结论：在发酵培养基中添加浓度为0.75％的KH2PO4最为适宜。
MgSO4·7H2O含量
在上述实验中经碳源、氮源、KH2PO4优化的培养基内分别加入质量浓度为0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％的MgSO4·7H2O，以考察不同浓度的Mg2+对NRK表达水平的影响。其余均同实施例5。
结果如图15所示。随着MgSO4·7H2O的浓度从0.01％增长至0.06％，细菌的生长情况和产生的NRK酶活同KH2PO4一样呈现先增加、后降低的趋势。在添加的MgSO4·7H2O浓度为0.03％时菌液OD600达到峰值1.327，对应的NMN产量也达到峰值218.245μmol/L，底物转化率达21.82％。因此，本实验得出的研究结论，在发酵培养基中添加浓度为0.03％的MgSO4·7H2O最为适宜。
上述实验均做2组平行样进行分析处理。
实施例7
发酵培养条件的优化
初始pH
将优化后的发酵培养基pH分别调节至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0以考察不同初始pH对NRK表达水平的影响。其余均同实施例5。
结果如图16所示。该野生菌在pH 6-7生长状况良好。当培养基pH为6.5时，菌体密度达到最大值，表明该菌的最适pH为6.5，且更适合中性偏微酸的环境。结合葡糖浓度的优化结果，推测偏碱性的环境不利于菌体对碳源的吸收利用。值得注意的是，最适生长的pH未必是NRK表达的最适pH。观察图16可知，当pH从6增至8，NMN产量呈现先增加后降低趋势。当pH为7时NMN产量达到峰值，或因NRK在pH高于7的环境内酶活会受到抑制。综合考虑该实验的研究目的为提高菌株产NRK的酶活，选择pH 7.0作为发酵培养基的最佳pH。此时转化体系内的NMN产量为282.56μmol/L，底物转化率为28.25％。
摇床转速
将优化后的发酵培养基调节至pH 7.0，在无菌环境内按5％(v/v)的接种比例将1mL活化后的种子培养液接种于20mL的培养基内。将温度为30℃的恒温摇床转速分别调至150r/min、180r/min、200r/min、220r/min培养12h后进行取样测定发酵菌液的OD600，以考察不同摇床转速对NRK表达水平的影响。剩余菌液超声处理制备粗酶液进行酶转化反应，采用HPLC法检测反应体系中NMN的含量。具体操作同实施例5。
结果如图17所示。随着转速从150r/min提升至220r/min，野生菌的生物量呈现增长的态势，菌液OD600从1.0114增长至1.2019，说明该菌可以适应较高的剪切力。但转速增大后NMN产量却呈现先增长再略微下降的趋势，当转速为200r/min时NMN产量达到峰值271.2μmol/L。转速增大至220r/min，NMN产量略微下降。表明过高的通气量反而不适于该菌生高水平表达NRK。推测其原因可能是高转速下摇瓶通气得到改善，菌体生长繁殖旺盛的同时也积累了一定的初级和次级代谢产物，对目的蛋白的合成产生了抑制作用。因此，可认为培养本发明菌株最适合的转速为200r/min。此时转化体系内NMN产量达271.2μmol/L，底物转化率为27.12％。
发酵时间与温度
将优化后的发酵培养基调节至最佳pH 7.0，在无菌环境内按5％(v/v)的接种比例将1mL活化后的种子培养液接种于20mL的培养基内。分别在温度设为25℃、30℃、37℃、40℃，转速为200r/min的恒温摇床振荡培养8h至24h，期间每隔4h进行取样测定发酵菌液的OD600，以考察不同发酵时间与温度对NRK表达水平的影响。记录菌液OD600，剩余菌液超声处理制备粗酶液进行酶转化反应，采用HPLC法检测反应体系中NMN的含量。具体操作同实施例5。
结果如图18所示。在25、30、37、40℃4种不同温度下转化体系内NMN的产量都呈现先增加后降低的态势。随着培养温度从25℃增加值40℃，菌体生成NRK的酶活整体呈现增加的趋势。在40℃条件下，菌体培养16h时NMN产量达到峰值332.23μmol/L，说明略微偏高的温度更适合烟酰胺核糖激酶的表达。在菌株生长情况方面，25、30、37℃培养条件下菌液OD600均随着发酵时间的增长而增高。而在40℃条件下，菌液在发酵16h时菌体密度OD600达到峰值1.3，继续增加发酵时长菌体密度开始降低。分析其原因可能是在40℃的高温环境中，长时间的发酵使得菌株衰老、自溶。综合考虑该实验的研究目的为提高菌株产NRK的酶活，选择培养温度40℃、时间16h作为最佳发酵温度与时间。在此条件下转化体系内对应的NMN产量为332.23μmol/L，底物转化率为33.22％。
上述实验均做2组平行样进行分析处理。
经上述实施例可知，本发明采集上海舒泽生物科技研究所排污口处的污泥进行NRK生产菌的筛选，建立菌株筛选模型，最终筛选得到的菌株NRK5-1可转化生成142.5μmol/L NMN，底物转化率达14.25％。对其进行形态学分析：菌落呈圆形、乳白色，光滑透明，边缘规则，向上凸起，直径在2mm以内。菌体形态为短圆杆状，大小为(0.3-0.8)μm×(0.5-1.5)μm，革兰氏染色呈阴性红色。结合分子生物学鉴定，与菌株NRK5-1同源性高达100％的菌株大多为大肠杆菌属，构建系统发育树结果显示Enterobacter kobei NR113321.1与菌株NRK5-1相似度最高。因此鉴定菌株NRK5-1为神户肠杆菌，将其命名为Enterobacter kobei2020T51。对菌株Enterobacter kobei 2020T51进行发酵培养基和发酵条件优化，优化后的条件为：接种于含有1％葡萄糖、3％多价蛋白胨、0.75％的KH2PO4和0.03％的MgSO4·7H2O，发酵培养基初始pH为7.0的培养基，在40℃、200r/min的条件下培养16h。此时，菌株可转化生成332.23μmol/L NMN，底物转化率为33.22％，为优化前的2.3倍。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种NRK生产菌，其特征在于，所述NRK生产菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24913。
2.一种生产NRK的方法，其特征在于，包括如下步骤：发酵培养权利要求1所述NRK生产菌，对所得发酵菌液进行破碎处理，得到含有NRK的粗酶液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的发酵培养基包括0％-5％的碳源、1％-3.5％的氮源、0％-1.25％的KH2PO4和0.01％-0.06％的MgSO4·7H2O。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述碳源包括鼠李糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖和可溶性淀粉。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述氮源包括牛肉粉、酵母提取物、牛肉膏、多价蛋白胨、胰蛋白胨。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵时培养基的pH值为6.0-8.0。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的条件为：25℃-40℃、振荡培养8h-24h。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述振荡培养为摇床振荡培养，所述摇床的转速为150r/min-220r/min。
9.权利要求1所述NRK生产菌在制备NMN中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：发酵培养权利要求1所述NRK生产菌，破碎处理所得菌液得粗酶液，将粗酶液与含有ATP和NR的母液混匀反应，得NMN。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024048593A1 (ja) * | 2022-08-30 | 2024-03-07 | 明治ホールディングス株式会社 | ニコチンアミドモノヌクレオチド産生向上のための組成物 |
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2022
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