CN108467879B - 一种用于红霉素发酵的合成培养基 - Google Patents

一种用于红霉素发酵的合成培养基 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物发酵工程领域，涉及一种用于红霉素发酵的合成培养基。本发明提供了一种含有葡萄糖，丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，七水硫酸镁，柠檬酸三钠，六水氯化钴，四硼酸钠，三氯化铁，氯化铜，钼酸铵和碳酸钙的培养基。本发明的培养基，适合于红霉素生产菌如红色糖多孢菌的生长，且可以极为显著地提高红霉素的产量。

Description

一种用于红霉素发酵的合成培养基
技术领域
本发明属于生物发酵工程领域，更具体地，本发明涉及一种用于红霉素发酵的合成培养基。
背景技术
红霉素A(Erythromycin A)是一种广泛使用的广谱大环内脂抗生素。主要的用来治疗由革兰氏阳性细菌引起的疾病[1]。红霉素(Erythromycin，简称EM)属大环内酯类广谱抗生素，其毒副作用小等因素，其已成为主要的抗生素产品之一。
在过去的几十年中，研究人员对红霉素A的合成进行了大量的研究，并通过不停的发酵优化，不断提高工业红霉素A的产量[2,3]。然而，发酵优化对于红霉素A合成的提高已经做到了极限，为了进一步了解红霉素A合成与发酵条件之间的关系，深入了解红霉素A的代谢机理和规律，研究人员将目光转向了对红霉素A合成过程中的代谢分析[4-7]。在对红霉素A代谢机制研究过程中，研究人员发现了许多红霉素A合成的规律和原理。在进行代谢机理研究过程中，由于复合培养的成分过于复杂，不利进行代谢分析，而采用合成培养基更有利于红霉素A代谢机理的研究。
然而，本领域中，目前研究过程中采用的合成培养基的红霉素产量都非常低，在这种条件下对于红霉素A合成机理的研究的准确性可能会大打折扣。为了有效地进行红霉素A代谢机理的研究，找到一种能够高产红霉素的合成培养基是非常必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于红霉素发酵的合成培养基。
在本发明的第一方面，提供一种用于红霉素发酵的合成培养基，所述的培养基包括以下组分：
Figure BDA0001231377770000021
在一个优选例中，所述的培养基包括以下组分：
Figure BDA0001231377770000022
Figure BDA0001231377770000031
在另一优选例中，所述的培养基的pH值为7±0.2。
在另一优选例中，所述的培养基的pH值为7±0.1。
在本发明的另一方面，提供一种制备用于红霉素发酵的合成培养基的方法，所述方法包括：提供葡萄糖，丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，七水硫酸镁，柠檬酸三钠，六水氯化钴，四硼酸钠，三氯化铁，氯化铜，钼酸铵，碳酸钙作为原料，混合，获得所述的合成培养基。
在一个优选例中，调节所述用于红霉素发酵的合成培养基的pH值为7±0.2；更佳的为7±0.1。
在本发明的另一方面，提供所述的用于红霉素发酵的合成培养基的用途，用于发酵生产红霉素。
在本发明的另一方面，提供所述的合成培养基的用途，用于培养红色糖多孢菌，发酵生产红霉素；或用于提高红色糖多孢菌生产红霉素的产量。
在本发明的另一方面，提供一种发酵生产红霉素的方法，所述方法包括：以所述的合成培养基作为发酵培养基，利用红色糖多孢菌发酵生产红霉素。
在本发明的另一方面，提供一种用于生产红霉素的试剂盒，所述的试剂盒中包括所述的合成培养基。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、分别采用本发明中优化的合成培养基以及以前采用的合成培养基进行发酵，在发酵过程中红霉素产量的变化情况。
图2、分别采用本发明中优化的合成培养基以及以前采用的合成培养基进行发酵，在发酵过程中取样测定的菌体干重的结果。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，研究开发了一种新的适合于高效生产红霉素(Erythromycin A)的培养基配方。本发明的培养基，适合于红霉素生产菌如红色糖多孢菌的生长，且可以呈数量级地提高红霉素的产量。
如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
术语“用于红霉素发酵的合成培养基”指含有葡萄糖，丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，七水硫酸镁，柠檬酸三钠，六水氯化钴，四硼酸钠，三氯化铁，氯化铜，钼酸铵和碳酸钙的组合物。在组合物中，所述的葡萄糖，丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，七水硫酸镁，柠檬酸三钠，六水氯化钴，四硼酸钠，三氯化铁，氯化铜，钼酸铵和碳酸钙占培养基总重量的80-100％，较佳地占90-100％，更佳地占95-100％，如98％，99％。
作为本发明的优选方式，用于配制本发明的用于红霉素发酵的合成培养基的各组分的用量如表1所示。
表1
组分 含量 优选量 更优选量
葡萄糖 19～24g/L 20～23g/L 22g/L
磷酸氢二钾 1～6g/L 2～5g/L； 4g/L
磷酸二氢钾 1～5g/L 1.5～4g/L 2g/L
七水硫酸镁 0.5～3g/L 0.8～2.5g/L 1g/L
丙氨酸 0.1～0.6g/L 0.15～0.4g/L 0.2g/L
精氨酸 0.2～1g/L 0.3～0.9g/L 0.8g/L
天冬氨酸 0.2～1g/L 0.3～0.8g/L 0.8g/L
半胱氨酸 0.1～0.8g/L 0.3～0.7g/L 0.6g/L
亮氨酸 0.15～1g/L 0.3～0.9g/L 0.8g/L
异亮氨酸 0.1～0.5g/L 0.15～0.4g/L； 0.2g/L
丝氨酸 0.1～0.8g/L 0.15～0.7g/L 0.2g/L
苏氨酸 0.1～0.9g/L 0.15～0.7g/L 0.2g/L
柠檬酸三钠 1～3g/L 1.4～2.5g/L 1.4g/L
氯化钴 0.001～0.01g/L 0.003～0.009g/L 0.009g/L
四硼酸钠 0.0001～0.001g/L 0.0003～0.0009g/L 0.0006g/L
三氯化铁 0.004～0.0075g/L 0.0.005～0.007g/L 0.0068g/L
氯化铜 0.0001～0.0004g/L 0.0002～0.00035g/L 0.00027g/L
钼酸铵 0.0001～0.0004g/L 0.0002～0.00035g/L 0.00027g/L
碳酸钙 9.1～11.4g/L 10～11.2g/L 11g
在得知本发明的用于红霉素发酵的合成培养基所用的组分及其配方以后，本领域技术人员可方便地进行配制。
本发明的培养基的应用的组分(原料)均为商业化的普通化学产品，价格比较低，制备也非常简单，与现有技术的培养基相比，本发明的新型培养基能显著促进红霉素生产菌如红色糖多孢菌发酵生产红霉素，红霉素的产量得到极为显著的提高，有利于大规模工业化生产。
与已有常用的红霉素合成培养基相比，本发明的培养基中，碳源葡萄糖用量显著提高，从而有利于菌浓提高以及红霉素的所需前体的供应。
与已有常用的红霉素合成培养基相比，本发明的培养基中，氨基酸的种类显著增加，从而有利于提高菌体的活性。
与已有常用的红霉素合成培养基相比，本发明的培养基中，增加了柠檬酸三钠，从而有利于提高菌体内TCA循环的通量，进而提高菌体的能量供应，最终提高菌体活性和红霉素合成。
作为本发明的优选方式，在配制所述的用于红霉素发酵的合成培养基时，先分别准确称取各组分，将它们混合于水中；所述的水较佳地为去离子水。
作为本发明的优选方式，在将组分混合后，进一步包括：将pH调节至7.0±0.2；较佳地调节至7.0±0.1。
作为本发明的优选方式，在将组分混合后，进一步地还包括：在121℃灭菌20-30min。
本发明还提供了发酵生产红霉素的发酵方法，包括：以本发明所述的合成培养基作为发酵培养基，利用红色糖多孢菌发酵生产红霉素。
本发明的有益效果具体如下：
1.本发明的新型培养基成分包括葡萄糖，丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，七水硫酸镁，柠檬酸三钠，六水氯化钴，四硼酸钠，三氯化铁，氯化铜，钼酸铵和碳酸钙，原料易得，用量少，成本低，制备方法简单，有利于大规模工业化生产；
2.本发明的培养基，适合于红霉素生产菌如红色糖多孢菌的生长，且可以呈数量级地提高红霉素的产量。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料与方法
红霉素生产菌种：
红色糖多孢菌E3菌株，保存在专利发明人工作的实验室中。
斜面培养基：
淀粉10g/L，玉米浆13g/L，氯化钠3g/L，硫酸铵3g/L，琼脂20g/L，碳酸钙3g/L，pH＝7。
种子培养基：
淀粉40g/L，蛋白胨20g/L，氯化钠4g/L，糊精20g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，硫酸镁0.25g/L，碳酸钙3g/L，pH＝7。
合成发酵培养基(优化后的)：
葡萄糖22g/L；丙氨酸0.2g/L，精氨酸0.8g/L，天冬氨酸0.8g/L，半胱氨酸0.6g/L，亮氨酸0.8g/L，异亮氨酸0.2g/L，丝氨酸0.2g/L，苏氨酸0.2g/L；磷酸氢二钾4g/L，磷酸二氢钾2g/L，七水硫酸镁1g/L，柠檬酸三钠1.4g/L，六水氯化钴0.009g/L，四硼酸钠0.0006g/L，三氯化铁0.0068g/L，氯化铜0.00027g/L，钼酸铵0.00027g/L，pH＝7。
原合成培养基[8]：
葡萄糖10g/L，硫酸铵5g/L，磷酸氢二钾3g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁0.4g/L，脯氨酸7g/L，硫酸锰0.0024g/L，氯化钴0.003g/L，硫酸锌0.0024g/L，硫酸亚铁0.00036g/L，钼酸钠0.00024g/L，氯化钙0.0012g/L，硫酸铜0.00012g/L。
培养方法——斜面培养：
将甘油管保藏的菌种从-80℃冰箱拿出，吸50微升涂布在平板上，在34℃恒温培养箱培养4-6天。
培养方法——种子瓶培养：
将平板从34℃恒温箱拿出，用接种铲挖块1平方厘米大小的接种在摇瓶培养基里，34℃220rpm培养48小时。
培养方法——48孔板发酵培养：
为了提高合成培养基的筛选效率，本研究采用48孔板进行培养基的筛选，其中单孔深4cm，最大装液量为5mL。首先将培养好的摇瓶种子转入5mL离心管中，在4000rpm条件下离心5min，并除去上清液。接着用30mL 0.9％NaCl溶液清洗菌体3次。清洗完毕，用50mL去离子水重悬菌体。取出的合成培养基0.9mL到48孔板中，再用排枪吸取0.1mL种子悬液到多孔板中。然后在34℃，220rpm条件下培养120h。
后文中，实施例2和实施例3的前半部分都是在48孔板完成的，“3.3红霉素产物浓度比较”则是在5L发酵罐中完成的。
培养方法——5L发酵罐培养：
将种子瓶中的摇瓶培养基导入灭菌50ml离心管4℃离心去除上清液，再用0.9％的氯化钠溶液洗涤菌体2次。将洗好的菌种按照接种量9％接种。在发酵过程中通过调节转速使发酵过程中溶氧在40％以上，同时用葡萄糖和氢氧化钠来调节发酵液pH在7左右。
实施例1、红霉素A产量检测——高通量生物法测定红霉素产量
用于检测的菌种：短小芽孢杆菌Bacillus pumilus CMCC(B)63202购于广东环凯微生物科技有限公司。
检测菌斜面培养基：蛋白胨0.5％，牛肉膏0.3％，磷酸氢二钾0.3％，葡萄糖1％，氯化钠0.5％，琼脂2％，pH＝7。该培养基用来培养检测菌(短小芽孢杆菌)。
检测培养基：蛋白胨0.5％，牛肉膏0.3％，磷酸氢二钾0.3％，葡萄糖1％，氯化钠0.5％，pH＝7。
测定红霉素产量的操作步骤：
(1)茄子瓶培养：将甘油管保藏的菌种从-80℃冰箱拿出，用竹签划线，在37℃培养箱培养5-6天。
(2)菌悬液准备：0.9％无菌氯化钠溶液将短小芽孢杆菌从茄子瓶里洗下，使菌悬液在580nm波长下吸光值在1.0左右，按照5％接种量混入到检测培养基里面，分装在48孔的孔板里，装液量225μl。
(3)样品分析：取25μl不同时间稀释的样品，依次添加到也加入含检测菌的检测培养基里(每个样三个平行)，37℃，150rpm摇床培养，直到空白样品吸光值达到0.6左右(5.5-6.5h)取出发酵液用酶标仪检测。标品对应菌浓吸光值对浓度作图，从而求出红霉素浓度。
实施例2、红霉素A合成培养基优化
为了找到对红霉素合成有促进作用的物质，本发明人进行了大量的筛选，以期从大量的候选物中找出对红霉素的合成有促进作用。本发明人选择了38种物质(包含碳源、氮源、磷源、无机盐、氨基酸、前体、螯合剂、微量元素)作为基本培养基，所采用的物质及其用量列于表1中。
针对前述初步选取的候选物质，本发明人逐个除去培养基中的一种物质，获得的培养基(称为培养基x)进行红色糖多孢菌发酵实验(发酵方法见前面的“培养方法——48孔板发酵培养”部分)；将最终得到的红霉素产量(Cx)与利用基本培养基(称为培养基1)的红霉素的产量(C1)进行对比，若除去某物质后培养基中红霉素的产量升高(即CX/C1>1)，则认为该物质不利于红霉素的合成，将其从红霉素合成培养基中除去。
本次筛选实验的结果如表2所示，表中CX代表缺失了该行所列候选物质的培养基中120h时红霉素的浓度，C1代表含有全部38个物质的合成培养基在120h时红霉素的产量。
表2、首次筛选
Figure BDA0001231377770000101
Figure BDA0001231377770000111
根据上述表1的结果，本发明人选择CX/C1小于1的组分，培养基中还含有26种物质。为了进一步减少培养基中的组分的数量，本发明人以这26种物质作为基本培养基(C’1)再进行进一步筛选。逐个除去培养基中的一种物质，获得的培养基进行红色糖多孢菌发酵实验。将最终得到的红霉素产量(C’x)与利用基本培养基(C’1)的红霉素的产量进行对比，若除去某物质后培养基中红霉素的产量升高(即C’X/C’1>1)，则认为该物质不利于红霉素的合成，将其从红霉素合成培养基中除去。
本次筛选实验的结果如表3所示。
表3、二次筛选
Figure BDA0001231377770000112
Figure BDA0001231377770000121
根据表2，除去C’X/C’1>1的成分后，选择其中的19种物质，即：葡萄糖、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、柠檬酸三钠、氯化钴、四硼酸钠、三氯化铁、氯化铜、钼酸铵、碳酸钙。
实施例3、Plackett-Burman实验
在实施例2中，得到的培养基中含有19个成分。为了进一步得到对红霉素影响最大组分，本发明人通过Plackett-Burman实验来分析19个成分中哪些组分对红霉素的合成影响较大。Plackett-Burman实验设计如表5所示，各个因子的浓度见表4，其中1、-1分别表示各成分浓度的最高值和最低值。红色糖多孢菌发酵120h后测定各培养基中的红霉素浓度见表4。根据Design Expert软件对产物浓度分析，对各物质进行增加和减少。浓度增加的有：葡萄糖，精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，亮氨酸，柠檬酸三钠，氯化钴，四硼酸钠，氯化铁，碳酸钙；浓度降低的有：磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，七水硫酸镁，丙氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸，氯化铜，钼酸铵。
表4、Plackett-Burman实验中各成分的浓度
Figure BDA0001231377770000131
Figure BDA0001231377770000141
表5、Plackett-Burman实验各培养基浓度及产物浓度表
Figure BDA0001231377770000142
Figure BDA0001231377770000151
其中A指葡萄糖，B磷酸氢二钾，C磷酸二氢钾，D七水硫酸镁，E是丙氨酸，F精氨酸，G天冬氨酸，H半胱氨酸，J亮氨酸，K异亮氨酸，L丝氨酸，M苏氨酸，N柠檬酸三钠，O氯化钴，P四硼酸钠，Q三氯化铁，R氯化铜，S钼酸铵，T碳酸钙。Ery指红霉素。
根据Plackett-Burman实验，确定各物质浓度范围如表6。
表6
Figure BDA0001231377770000152
Figure BDA0001231377770000161
具体的3种优化的合成培养基的成分和浓度如表7所示。
表7
组合物1(g/L) 组合物2(g/L) 组合物3(g/L)
葡萄糖 22 20 24
磷酸氢二钾 4 2 5
磷酸二氢钾 2 4 1.5
七水硫酸镁 1 0.8 2.5
丙氨酸 0.2 0.5 0.1
精氨酸 0.8 0.3 0.9
天冬氨酸 0.8 0.9 0.3
半胱氨酸 0.6 0.7 0.2
亮氨酸 0.8 0.3 0.9
异亮氨酸 0.2 0.4 0.1
丝氨酸 0.2 0.7 0.3
苏氨酸 0.2 0.3 0.7
柠檬酸三钠 1.4 1.2 2.5
氯化钴 0.009 0.002 0.007
四硼酸钠 0.0006 0.0002 0.0009
三氯化铁 0.0068 0.005 0.0072
氯化铜 0.00027 0.00015 0.00035
钼酸铵 0.00027 0.00035 0.00015
碳酸钙 11 10 11.3
3.3红霉素产物浓度比较
采用本发明中优化的合成培养基(表6中组合物1的培养基)进行红色糖多孢菌发酵(“培养方法——5L发酵罐培养”)，与以前采用的合成培养基进行比较，来确定红霉素产量的变化情况。
表6中组合物1的培养基：葡萄糖22g/L；丙氨酸0.2g/L，精氨酸0.8g/L，天冬氨酸0.8g/L，半胱氨酸0.6g/L，亮氨酸0.8g/L，异亮氨酸0.2g/L，丝氨酸0.2g/L，苏氨酸0.2g/L；磷酸氢二钾4g/L，磷酸二氢钾2g/L，七水硫酸镁1g/L，柠檬酸三钠1.4g/L，六水氯化钴0.009g/L，四硼酸钠0.0006g/L，三氯化铁0.0068g/L，氯化铜0.00027g/L，钼酸铵0.00027g/L，碳酸钙11g/L，pH＝7。
原合成培养基：葡萄糖10g/L，硫酸铵5g/L，磷酸氢二钾3g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁0.4g/L，脯氨酸7g/L，硫酸锰0.0024g/L，氯化钴0.003g/L，硫酸锌0.0024g/L，硫酸亚铁0.00036g/L，钼酸钠0.00024g/L，氯化钙0.0012g/L，硫酸铜0.00012g/L。
在发酵过程中，12小时取样一次，分别测红霉素浓度和菌体干重，红霉素产量曲线如图1所示，本发明中优化的合成培养基在120小时红霉素产量达到1113mg/L，而以前采用的合成培养基的产量只有81.9mg/L。本发明优化的合成培养基产量比普通培养基产量提高13.6倍，呈现了极其优异的技术效果。
采用如上同样的发酵方法，本发明人也采用本发明中优化的合成培养基(表6中组合物2的培养基)进行了发酵，结果发现该合成培养基产量比普通培养基产量提高10倍以上，呈现了极其优异的技术效果。
采用如上同样的发酵方法，本发明人也采用本发明中优化的合成培养基(表6中组合物3的培养基)进行了发酵，结果发现该合成培养基产量比普通培养基产量提高10倍以上，呈现了极其优异的技术效果。
实施例4、菌体生长曲线
采用本发明中优化的合成培养基(表6中组合物1的培养基)进行发酵过程(“培养方法——5L发酵罐培养”)中，取样测得的菌体干重DCW如图2所示。可以看出，应用本发明优化的合成培养基培养，菌浓很显著地高于原始培养基。
总结
综上，本发明中提供了一种用于红霉素A生产的合成培养基。本发明的一种优化的培养基中的红霉素A的产量达到1113mg/L，而普通合成的红霉素A产量只有81.9mg/L，优化后的一种合成培养基中红霉素A产量提高了13.6倍。采用本合成培养基更有利于对红霉素A的合成和代谢调控机理进行分析，为进一步提高红霉素A的工业产量奠定了基础。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (12)

1.一种用于红霉素发酵的合成培养基，其特征在于，所述的培养基由以下组分组成：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
2.如权利要求1所述的合成培养基，其特征在于，所述的培养基由以下组分组成：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
3.如权利要求1所述的合成培养基，其特征在于，所述的培养基的pH值为7±0.2。
4.如权利要求1所述的合成培养基，其特征在于，所述的培养基的pH值为7±0.1。
5.如权利要求1或2所述的合成培养基，其特征在于，各组分混合于水。
6.一种制备用于红霉素发酵的合成培养基的方法，其特征在于，所述方法包括：提供葡萄糖，丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，七水硫酸镁，柠檬酸三钠，六水氯化钴，四硼酸钠，三氯化铁，氯化铜，钼酸铵，碳酸钙作为原料，混合，获得如权利要求1～2任一所述的合成培养基。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，调节所述用于红霉素发酵的合成培养基的pH值为7±0.2。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，调节所述用于红霉素发酵的合成培养基的pH值为7±0.1。
9.权利要求1～2任一所述的用于红霉素发酵的合成培养基的用途，其特征在于，用于发酵生产红霉素。
10.权利要求1～2任一所述的合成培养基的用途，其特征在于，用于培养红色糖多孢菌，发酵生产红霉素；或用于提高红色糖多孢菌生产红霉素的产量。
11.一种发酵生产红霉素的方法，其特征在于，所述方法包括：以权利要求1～2任一所述的合成培养基作为发酵培养基，利用红色糖多孢菌发酵生产红霉素。
12.一种用于生产红霉素的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括权利要求1～2任一所述的合成培养基。
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