CN113151061A

CN113151061A - 一种葡萄糖抑制型耐氧己酸菌

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Publication number: CN113151061A
Application number: CN202110311823.6A
Authority: CN
Inventors: 方尚玲; 董孝元; 郭志豪; 常煦; 晋湘宜; 陈茂彬; 李良; 李小强; 李俊薇
Original assignee: Hubei University of Technology; Angel Yeast Co Ltd; Wuhan Yashibo Technology Co Ltd
Current assignee: Hubei University of Technology; Angel Yeast Co Ltd; Wuhan Yashibo Technology Co Ltd
Priority date: 2021-03-24
Filing date: 2021-03-24
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2041-03-24
Also published as: CN113151061B

Abstract

本发明涉及酿酒微生物及酿酒技术领域，具体涉及一种葡萄糖抑制型耐氧己酸菌，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCCM 2020881。本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌具有耐氧、高产己酸的特性，但在高葡萄糖培养基中产己酸能力会被抑制，当培养基中同时含有葡萄糖和乙醇时，葡萄糖含量高于0.5％时，随着葡萄糖浓度的增高对产己酸的抑制效果越强。本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌的产己酸的能力可达到10.61g/L，且耐氧性较好，在液体培养时，装液量为20％产酸能力仍可大于2g/L。

Description

一种葡萄糖抑制型耐氧己酸菌

技术领域

本发明涉及酿酒微生物及酿酒技术领域，具体涉及一种葡萄糖抑制型耐氧己酸菌。

背景技术

浓香型大曲酒发酵采用独特的泥窖发酵工艺，属于多种微生物群的共同发酵，是一个复杂的生物化学反应体系。研究发现，浓香型白酒以己酸乙酯为主体香味物质，己酸乙酯含量多少直接影响大曲酒的质量。它来源于栖息在窖泥中一类梭状芽孢杆菌-己酸菌所产己酸与酒醅中酵母产生的乙醇的化合。在发酵过程中，己酸与己酸乙酯的生成主要在窖泥与酒醅接触的界面上进行，梭状芽孢杆菌在环境条件适宜时，通过下列途径合成己酸乙酯：

(1)乙醇和乙酸结合生成丁酸，丁酸再与乙醇结合生成己酸。

CH₃CH₂OH+CH₃COOH→CH₃(CH₂)₂COOH+H₂O

CH₃(CH₂)₂COOH+CH₃CH₂OH→CH₃(CH₂)₄COOH

(2)己酸与乙醇发生酯化反应，生成浓香型白酒的主体香己酸乙酯。

CH₃(CH₂)₄COOH+CH₃CH₂OH→CH₃(CH₂)₄COOC₂H₅+H₂O

人们很早就在生产实践过程中发现，浓香型大曲酒产酒质量的优劣与泥窖的窖龄有关。一般而言，发酵窖池窖龄越长，产酒质量越好。但是，新建窖池依靠自然老熟要达到老窖的标准，需要经过漫长的岁月，短则数十年长则几十年。同时，发酵窖池由于自然环境的变化、窖池内生化反应作用等综合原因，使得窖泥中的营养成分的缺失及酸碱度的变化，己酸菌生长繁殖与代谢受到抑制，引起窖池老化、功能退化，产酒质量下降的现象。己酸菌作为窖泥中关键功能菌，在窖泥中含量多少决定了窖泥的质量。己酸菌是浓香型白酒窖泥中关键的功能菌，对产己酸和己酸乙酯起着决定性作用。其在窖泥中含量的多少决定了窖泥功能的强弱，直接影响浓香型大曲酒的质量。

目前分离出的己酸菌多为在厌氧培养箱内或厌氧罐/厌氧袋内加除氧剂分离得到，多为厌氧菌或兼性厌氧菌，实验成本较高。薛正楷等人(“一株窖泥己酸菌株的多相鉴定及产酸研究”，酿酒科技，2016年6月)公开了从窖泥中筛选出的一株速生梭菌，在真空培养箱中培养15天测得己酸为547.26mg/100mL。专利CN103525743A公开了一株生孢梭菌，在厌氧工作站进行培养产己酸能力为 9000mg/L。目前公开的己酸菌大多培养条件较为严格，需要放置在专门的厌氧培养箱或厌氧罐等设备内进行培养，不利于己酸菌的工业化培养及应用。

己酸菌可用于人工窖泥的培养，新老窖池的扩建，固态白酒发酵糟醅的灌窖等，但己酸菌液在应用过程中并不是加入的菌液中所含己酸越高就越好。己酸菌的主要产物己酸对其他微生物的毒害作用较明显，根据王瑞明等人(“己酸对酵母生理代谢的影响”，酿酒科技，1996年6月)的研究，己酸对酵母菌的生长及细胞增殖有明显的抑制作用，己酸浓度为0.05％时，酵母生长就受到影响，己酸浓度为0.1％时，细胞出芽率为0。若在酒醅入窖时加入己酸菌液等物质，将有碍于淀粉糖化发酵。

发明内容

本发明的目的在于提供一种葡萄糖抑制型耐氧己酸菌(Clostridiumcelerecrescens)，所述葡萄糖抑制型耐氧己酸菌已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M 2020881，其分类命名Clostridium celerecrescens JSJ-01(保藏日期：2020年12月9日，保藏地址：中国，武汉，武汉大学)。

进一步的，本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌培养后的形态特征为：表面菌落呈圆形，中间稍凸起，乳白色。

进一步的，本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌的菌株形态特征为：梭状芽孢杆菌，端生芽孢，呈鼓槌状，革兰氏阳性菌。

进一步的，本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌在前期(前3天左右)几乎不产己酸，在第4-5天出现己酸产量的跃迁，后期趋于平稳，第9天左右便可达到己酸最大产量10.61g/L。

进一步的，本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌的最适培养温度在33-37℃，在乙醇添加量为1％-5％时均可生长，最适乙醇添加量为2％。

进一步的，本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌可利用乙醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖为碳源进行生长繁殖，以淀粉、蔗糖、葡萄糖为单独碳源时可产丁酸和丁醇。

进一步的，本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌在乙醇存在情况下会进入由乙醇引导的合成己酸的途径，高产己酸。

进一步的，本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌具有耐氧、高产己酸的特性，在高葡萄糖培养基中，己酸菌的产己酸能力会被抑制，当培养基中同时含有葡萄糖和乙醇时，且葡萄糖含量高于0.5％时，随着葡萄糖浓度的增高，葡萄糖对本发明的耐氧己酸菌产己酸的抑制效果增强。本发明提供的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌所产己酸的能力可达到10.61g/L。此外，本发明提供的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌的耐氧性较好，液体培养时装液量为20％产酸能力仍大于2g/L。

本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌是从湖北某酒厂优质窖泥中分离出来的，该菌株为速生梭菌，具有如下特征：

(1)微生物学形态：

将培养好的发酵液稀释涂布到培养基上(乙醇乙酸钠培养基，ES：酵母膏1％、无水乙酸钠0.5％、MgSO₄·7H₂O 0.02％、K₂HPO₄ 0.04％、(NH₄)₂SO₄ 0.05％，灭菌后加入2％无水乙醇、1％碳酸钙)，倒置平板，放到装有除氧剂的厌氧培养袋内置于35℃培养箱培养7天，观察菌落形态。培养后菌落的形态特征：表面菌落呈圆形，中间稍凸起，乳白色。于1000倍显微镜观察菌株形态，菌株形态特征为：梭状芽孢杆菌，端生芽孢，呈鼓槌状，革兰氏阳性菌。

(2)生物学特性：

本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌在前期(前3天左右)几乎不产己酸，在第4-5天出现己酸产量的跃迁，后期趋于平稳，第9天左右便可达到己酸最大产量10.61g/L。最适培养温度在33-37℃，在乙醇添加量为1％-5％时均可生长，最适乙醇添加量为2％。在装液量为20％-100％情况下均可生长，装液量越高己酸的生成能力越强。

本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌在ES培养基35℃培养7d连续传代数代培养，其培养特征及形态特征均无明显变化，该菌株生物学性状基本稳定。

本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌可利用乙醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖为碳源进行生长繁殖，在以淀粉、蔗糖、葡萄糖为单独碳源时可产丁酸和丁醇，在乙醇存在情况下会进入由乙醇引导的合成己酸的途径，高产己酸。

与现有技术相比，本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌具有如下有益的技术效果：

本发明首次提供一株高葡萄糖抑制产酸的高产己酸的速生梭菌，己酸的生成能力可达到10.61g/L，本发明葡萄糖抑制型耐氧己酸菌菌株耐氧性强，培养条件简单，液体深层培养即可高产己酸。

本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌在葡萄糖含量高时产己酸会受到抑制，菌株生长旺盛，葡萄糖含量越高本发明的己酸菌产己酸能力被抑制越强。根据生产实践经验，若酒醅入窖时便加入己酸菌液将不利于淀粉的糖化发酵，使得出酒率下降。在白酒生产中，本发明的己酸菌菌株的高葡萄糖抑制产己酸的性质可保证其在葡萄糖等碳源存在的情况下快速生长，但不产己酸，葡萄糖基本被消耗掉再开始产己酸，可保证发酵的正常进行，不影响出酒率，同时有助于提高酒质。

附图说明

为了更清楚的说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见的，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它附图。

图1为本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌在ES固体培养基上厌氧袋内厌氧培养的菌落图；

图2为本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌在1000倍显微镜菌体形态图。

具体实施方式

下面将结合具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通的技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明的保护范围。

实施例1本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌的菌株筛选

本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌(Clostridium celerecrescens)分离自湖北某酒厂优质老窖泥，采用ES(乙醇乙酸钠)培养基：酵母膏1％、无水乙酸钠 0.5％、MgSO₄·7H₂O 0.02％、K₂HPO₄ 0.04％、(NH₄)₂SO₄ 0.05％，灭菌后再加入 2％无水乙醇、1％碳酸钙。取适量窖泥加入ES培养基量为90％的试管内，置于35℃培养箱静置培养7天，观察产气情况，将产气情况好的试管置于80℃水浴锅中水浴10min，然后各取1mL菌液加入装有ES培养基的试管内进行富集培养，重复4次。然后采用硫酸铜显色法对发酵液中的己酸进行定性检测，具体方法为：取2mL发酵液于试管内，然后加入2mL2％的硫酸铜溶液，混匀后加入2mL 无水乙醚，摇匀后观察上层乙醚溶液的颜色，上层蓝色越深则证明己酸含量越高。

将硫酸铜显色结果较好的发酵液进行梯度稀释然后涂布于ES固体培养基上，倒置放到装有除氧剂的厌氧培养袋内置于35℃培养箱内培养5-7天，观察菌落形态。如图1所示，培养后的己酸菌的形态特征为：表面菌落呈圆形，中间稍凸起，乳白色。如图2所示，于1000倍显微镜观察菌株形态，菌株形态特征为：梭状芽孢杆菌，端生芽孢，呈鼓槌状，革兰氏阳性菌。待菌落长出后分别挑单菌再次划线后接种到ES液体培养基内进行发酵，发酵10-14天后取发酵液进行己酸定性测定以及气相色谱检测。

选取产己酸效果最好的菌株，经菌种鉴定为Clostridium celerecrescens，现保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M 2020881，即为本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌。

实施例2本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌产己酸量的验证

将本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌以5％的接种量接种于装有ES培养基的100mL具塞试管内(ES培养基成分：酵母膏1％、无水乙酸钠0.5％、 MgSO₄·7H₂O 0.02％、K₂HPO₄ 0.04％、(NH₄)₂SO₄ 0.05％，灭菌后再加入2％无水乙醇、1％碳酸钙。)，装液量在90％以上，再加封口膜封好。于33℃下恒温培养 7d作为种子液使用。接种5％的种子液于装有培养基的100mL具塞试管内，装液量在90％以上，再加封口膜封好。于33℃下恒温培养，于第3天开始每天取样用气相色谱检测具塞试管培养基内丁酸和己酸的含量。

表1具塞试管培养己酸菌气相检测结果

培养时间(d)	丁酸含量(g/L)	己酸含量(g/L)
			3	0.60	0.03
4	1.86	3.54
			5	1.55	6.85
6	0.77	7.02
			7	0.92	9.67
8	0.87	9.92
			9	0.77	10.61
10	0.88	9.44
			11	0.98	10.00
12	0.87	10.14
			13	1.28	9.70

如表1所示，具塞试管培养基内前3天生成少量丁酸，几乎未生成己酸，该阶段培养体系内丁酸尚未在本发明己酸菌的作用下进一步转化为己酸；第4-5 天培养内丁酸生成量升高，同时出现己酸产量的跃迁，己酸产量大幅度上升；此后，丁酸含量略微下降，但己酸产量保持持续上升，丁酸为中间产物，丁酸含量的略微下降说明丁酸向己酸转化趋势增强；第7天培养基内己酸产量增长幅度放缓，但依然保持上升的趋势，在发酵的第9天达到己酸最大产量10.61g/L，后期趋于平稳。

由此可见，本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌产己酸能力强，产酸量高，培养周期短且产酸能力稳定。

实施例3验证不同温度对本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌的影响

将本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌以5％的接种量接种于装有ES培养基的100mL具塞试管内(ES培养基成分：酵母膏1％、无水乙酸钠0.5％、MgSO₄·7H₂O 0.02％、K₂HPO₄ 0.04％、(NH₄)₂SO₄ 0.05％，灭菌后再加入2％无水乙醇、1％碳酸钙。)，装液量在90％以上，再加封口膜封好。于33℃下恒温培养7d作为种子液使用。接种5％的种子液于装有培养基的100mL具塞试管内，装液量在90％以上，再加封口膜封好。分别于33℃、34℃、35℃、36℃下恒温培养，于发酵过程取样用气相色谱检测具塞试管培养基内丁酸和己酸的含量。

表2培养温度对己酸菌产酸的影响

如表1-2所示，本发明的葡萄糖耐氧己酸菌在第9天的条件下产己酸含量最高，观察第9天产己酸含量可以得到33、34℃条件下己酸产量分别为10.61、 10.64g/L，说明在33-34℃时产己酸含量较高。

实施例4本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌的装液量实验、

将本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌菌液按照5％接种量接种到装有 90％ES培养基的100ml锥形瓶内，35℃静止培养7天。

将培养好的己酸菌种子液按照5％的接种量分别加入到装液量为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的100ml锥形瓶内，35℃培养10d并检测丁酸和己酸含量。实验结果见表二。

表3装液量实验丁酸和己酸含量检测结果

如表2数据所示，本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌的装液量越高，即氧气含量越少，己酸的生成量越高。当本发明的己酸菌的装液量为100％时，即接近无氧环境下生成的己酸含量为9647.44mg/L，产己酸量较高。本发明的己酸菌在装液量仅有20％时仍可生成将近3g/L的己酸，可见本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌耐氧能力较强，易于培养。

实施例5本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌的葡萄糖抑制产酸实验

以ES培养基作对照，在ES培养基的基础上分别添加0.1％、0.3％、0.5％、 0.7％、1％的葡萄糖，于发酵7d和14d检测发酵过程的丁酸和己酸产量。

如表3所示，在培养基中添加葡萄糖后各组的己酸的产量均低于对照组，当葡萄糖添加量为0.1％-1％时，发酵7d时本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌的己酸产量随着葡萄糖添加量的增大先升高后下降，首先葡萄糖的加入会使菌数增多，菌株会优先利用葡萄糖为碳源进行产丁醇、丁酸等代谢途径，待葡萄糖基本耗尽才会利用乙醇去合成己酸。当发酵7d时，当添加量为0.1％-0.5％的葡萄糖时，葡萄糖含量较少，相对于葡萄糖添加量为0.5％-1％而言，葡萄糖更快被消耗完，己酸菌会更快进入乙醇引导的产己酸代谢途径，因此会出现本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌的己酸产量会出现先升高再下降的趋势。当葡萄糖添加量为0.5％时，此时的己酸的含量最高，发酵至14d时，发酵基本结束，葡萄糖都已被利用，己酸含量降低。可以看出，葡萄糖添加量越高，生成的副产物越多，对产己酸的抑制效果就越强。

由表3可以看出，随着葡萄糖浓度的增高，葡萄糖对本发明的耐氧己酸菌产己酸的抑制效果逐渐增强，本发明菌株具有前期利用葡萄糖等碳源，进行快速生长繁殖，但产己酸能力被抑制，己酸对酵母菌及其他微生物有很强的毒害作用，采用本发明菌株在酿酒过程中不会影响酵母菌的生长代谢，等待糖化、酒化过程基本结束，本发明菌株便开始利用乙醇产己酸。浓香型白酒入窖生产过程中，至少需要30天，足够完成产己酸以及己酸与乙醇酯化生成己酸乙酯，有助于提高酒质。

表4己酸菌在ES及ES+不同浓度葡萄糖(G)培养基中的丁酸及己酸产量

组别	丁酸-7d(mg/L)	丁酸-14d(mg/L)	己酸-7d(mg/L)	己酸-14d(mg/L)
					ES	1715.48	1233.38	6383.74	7696.86
ES+0.1％G	2477.87	1487.31	1848.60	6220.14
					ES+0.3％G	2328.74	823.50	3434.86	5976.05
ES+0.5％G	626.11	692.93	6409.93	6390.96
					ES+0.7％G	596.82	665.90	6051.05	5880.71
ES+1％G	313.10	561.80	5176.91	5111.34

实施例6本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌的发酵罐放大培养

将本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌以5％的接种量接种于装有ES培养基的100mL具塞试管内，装液量在90％以上，再加封口膜封好。33℃恒温培养7d 作为种子液使用。

分别配制4L、8L、16L ES培养基装入5L、10L、20L发酵罐内，115℃灭菌20min后加入1％碳酸钙和2％无水乙醇。发酵罐温度设置为33℃，转速为0。接种量均为5％。于发酵过程开始进行取样，使用气相色谱检测。

表5发酵罐发酵过程数据

如表4所示，使用5L、10L、20L发酵罐培养本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌，装液量为80％时发酵8d-9d己酸产量均>10g/L。可见，本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌在发酵罐中依然具有较强的产己酸能力，较适于工业化生产。实施例7本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌对不同碳源的利用情况

在ES培养基其他成分不变的情况下，使用2.5％的可溶性淀粉、蔗糖、乙醇、葡萄糖来代替乙醇和乙酸钠，探究不同碳源对本发明的己酸菌的影响。于发酵7天检测不同组中本发明的己酸菌的在600nm波长处的吸光值(OD₆₀₀)和发酵液成分。结果发现，在发酵过程中己酸菌可以利用淀粉、蔗糖、葡萄糖这类糖类碳源，使菌体得到大量生长，但在发酵过程中并未生成己酸，反而生成了大量丁醇和丁酸，以及部分乙酸和乙醇。己酸菌在乙醇碳源培养基和ES培养基上菌体生长相对较少，但都生成了己酸和丁酸。

表6本发明的己酸菌在不同培养基中的生长及代谢情况

实施例8本发明己酸菌与其他己酸菌产酸对比

将本发明所提供的己酸菌与其他已报道的己酸菌进行对比，发现在同样使用乙醇乙酸钠培养基培养的情况下。本发明的己酸菌对比同样为液体深层培养的己酸菌，产己酸水平有了显著提升。本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌产己酸能力可达到10.61g/L，比薛正楷等人(“一株窖泥己酸菌株的多相鉴定及产酸研究”，酿酒科技，2016年6月)报道的0.06MPa真空培养箱培养15d的 547.26mg/100mL己酸要明显更高，而且耐氧性更好。与其它已报道的己酸菌相比，本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌菌株耐氧性强，培养条件简单，液体深层培养即可高产己酸。

综合对比，本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌产酸较高，而且耐氧性强，更适合工业应用。

表7本发明的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌与现有己酸菌产酸对比

以上借助具体实施例对本发明做了进一步描述，但是应该理解的是，这里具体的描述，不应理解为对本发明的实质和范围的限定，本领域内的普通技术人员在阅读本说明书后对上述实施例做出的各种修改，都属于本发明所保护的范围。

Claims

1.一种葡萄糖抑制型耐氧己酸菌，保藏号为CCTCC M 2020881。

2.根据权利要求1所述的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌，其特征在于，其菌株形态特征为：梭状芽孢杆菌，端生芽孢，呈鼓槌状，革兰氏阳性菌。

3.根据权利要求1所述的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌，其特征在于，液体培养下装液量为90％时，所述耐氧己酸菌的产己酸量≥10g/L。

4.根据权利要求1所述的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌，其特征在于，液体培养下装液量为20％时，所述耐氧己酸菌的产己酸量≥2g/L。

5.根据权利要求1所述的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌，其特征在于，最适培养温度在33-37℃，在乙醇添加量为1％-5％时均可生长。

6.根据权利要求1所述的葡萄糖抑制型耐氧己酸菌，其特征在于，可利用乙醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖为碳源进行生长繁殖，以淀粉、蔗糖、葡萄糖为单独碳源时可产丁酸和丁醇。