CN116144516B - 一株产丁二酸的酿酒酵母及其应用 - Google Patents

一株产丁二酸的酿酒酵母及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株产丁二酸的酿酒酵母及其应用，属于生物工程技术领域。所述酿酒酵母已于2023年2月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2023098，保藏地址为中国武汉，武汉大学。本发明的酿酒酵母FMME‑SuA912，表现出耐受低pH的能力，可以在pH 3.5条件下正常生长并发酵产丁二酸。经发酵罐扩大培养，发酵120h丁二酸产量和产率分别达到了41.8g/L和0.34g/g，具有低pH发酵生产丁二酸的工业化应用潜力。

Description

一株产丁二酸的酿酒酵母及其应用
技术领域
本发明涉及一株产丁二酸的酿酒酵母及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
丁二酸(琥珀酸)是一种重要的C4平台化合物，被美国能源部列为12种最有潜力大宗生物基化学品中的首位。作为合成通用化学品的起始原料，丁二酸在食品、化学、医药以及其他领域有广泛的应用。
丁二酸的传统生产方法是化学合成法，但由于石油资源的减少和环境污染日益严重等问题，化学合成方法的弊端日益显现。而通过发酵法生产丁二酸，能够摆脱对不可再生的战略资源石油的依赖，利用可再生资源，固定二氧化碳减轻温室效应，展现出良好的发展前景。目前研究较多的发酵制备丁二酸的微生物菌株主要包括产丁二酸放线杆菌、产琥珀酸曼氏杆菌、产琥拍酸厌氧螺菌、谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌和酿酒酵母等，生产菌株决定了发酵产量、得率及生产强度，进而决定生物转化经济性的参数，生产菌株也决定了配套的发酵及下游分离工艺，从而决定了琥珀酸的总体生产成本。丁二酸放线杆菌、产琥珀酸曼氏杆菌、产琥拍酸厌氧螺菌遗传背景不清晰，需要在严格厌氧的环境中发酵生产丁二酸，工业化应用中很难实现；而大肠杆菌(Escherichia coli)具有遗传背景清晰、基因操作容易、培养基成分简单等特点，已经成为发酵生产丁二酸的主要研究对象。通过适应性进化、阻断冗余代谢支路、强化丁二酸合成路径、提供充足还原力和能量、控制氧化还原平衡等代谢工程策略改造E.coli，已经成功构建多种生产丁二酸的E.coli，最新报道中，利用E.coli FMME-N-26发酵生产丁二酸的产量和厌氧阶段葡萄糖得率分别达到119.2g/L和1.08g/g，但发酵过程中需要添加大量中和剂碳酸镁，控制在pH6.0-7.0。相较于细菌生产菌株，酵母具有耐高酸和高渗透压的特点。酵母作为生产菌株最大的优势在于能在低pH条件下进行发酵，发酵过程中不加入或少加入pH调节剂，可以有效的减少发酵过程中无机盐的产生，降低了微生物污染的风险，简化下游提取纯化的过程，进而降低丁二酸分离成本。虽然报道Reverdia公司可以利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在pH 3.0条件下好氧发酵生产丁二酸达到100g/L的产量(Metabolic Engineering,2015,28:223-239)，但并没有明确的信息表明他们这株生产菌株的来源和改造方法。S.cerevisiae的TCA循环还原支路代谢能力十分弱，丁二酸也并不是酿酒酵母的代谢终产物，通常需要利用代谢工程手段改造获得高产菌株。Yan等构建了丙酮酸脱羧酶缺陷型S.cerevisiae，并重新构建一条完整的TCA循环还原支路，构建起一条还原途径合成丁二酸，pH 3.8环境中该菌株产13g/L丁二酸(BioresourceTechnology,2014,156:232-239)，但无法达到工业化生产水平。开发一种耐低pH、并且可以高效生产丁二酸的酿酒酵母工程菌株可以降低微生物污染的风险，同时减少中和剂的添加，简化下游提取纯化的过程，进而降低丁二酸生产和分离的成本，具有极大的工业应用价值，但目前公开的酿酒酵母工程菌并不具备耐低pH、同时高效生产丁二酸的功能。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种耐低pH并高效生产丁二酸的酿酒酵母。
以骆驼瘤胃中筛选获得生产丁二酸的酿酒酵母为出发菌株，诱变适应性进化筛选获得了一株耐受低pH(pH≤3.0)并高产丁二酸的突变菌株FMME-SuA912，进一步优化了突变株的发酵培养基成分和条件，在pH 3.5的条件下，丁二酸产量达到41.8g/L，筛选出能耐受低pH的酵母菌株生产丁二酸，减少了中和剂的添加，简化下游分离纯化工艺的难度，降低生产成本，对生物法生产丁二酸具有重要意义。
本发明的第一个目的是提供一株产丁二酸的酿酒酵母FMME-SuA912(Saccharomyces cerevisiae FMME-SuA912)，所述酿酒酵母已于2023年2月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2023098，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
本发明的第二个目的是提供一种生产丁二酸的方法，所述方法是以葡萄糖为碳源，以玉米浆为氮源，利用所述的酿酒酵母FMME-SuA912进行发酵。
在本发明的一种实施方式中，所述玉米浆的浓度为5-20g/L。
在本发明的一种实施方式中，当葡萄糖浓度低于10g/L时，补加葡萄糖，使葡萄糖浓度维持在10～50g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵中控制pH在3.5～4.5
在本发明的一种实施方式中，所述发酵过程的溶氧为20～30％。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵的温度为28-35℃。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基具体为(每L)：葡萄糖30～70g，玉米浆5～20g，尿素2g，KH2PO4 4g，MgSO4 2g，ZnSO4 10mg，FeSO4 1.2mg，CuSO4 1.0mg，MnSO42mg。
本发明的第三个目的是提供所述酿酒酵母FMME-SuA912或用所述酿酒酵母生产丁二酸的方法在生产丁二酸和/或其衍生物中的应用。
本发明的第四个目的是提供所述酿酒酵母FMME-SuA912或用所述酿酒酵母生产丁二酸的方法在制备可降解新材料中的应用。
有益效果:
本发明通过诱变和适应性进化选育到的酿酒酵母FMME-SuA912，表现出低pH下积累丁二酸的能力，可以在pH 3.5条件下正常生长并发酵产丁二酸。在5L发酵罐水平的发酵中，发酵120h丁二酸的产量和产率分别达到了41.8g/L和0.34g/g，该菌株具有低pH发酵生产丁二酸的工业化应用潜力。
生物材料保藏
本发明所提供的酿酒酵母FMME-SuA912(Saccharomyces cerevisiae FMME-SuA912)，已于2023年2月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2023098，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
附图说明
图1：5L发酵罐中FMME-SuA912和FMME-SuA001发酵过程曲线(A)菌体OD600值；(B)琥珀酸产量；(C)葡萄糖含量。
图2：最优条件下5L发酵罐中FMME-SuA912发酵过程曲线。
具体实施方式
有机酸丁二酸使用高效液相色谱法检测，色谱柱：Aminex HPX-87H；流动相：5mmol/LH2SO4；流速：0.6mL/min；温度：35℃；进样量：10μL；检测器：紫外检测器。
葡萄糖测定方法：使用深圳西尔曼生物传感分析仪M-100进行分析。
葡萄糖得率的计算：葡萄糖得率(％)＝丁二酸最高产量(g/L)/总葡萄糖添加(g/L)×100。
种子培养基：葡萄糖10g，酵母浸膏5g，大豆蛋白胨4g，用蒸馏水定容1L，用氢氧化钠溶液调pH7.0～7.2，121℃灭菌30min。
平板培养基：葡萄糖10g，酵母浸膏5g，大豆蛋白胨4g，用蒸馏水定容1L，用氢氧化钠溶液调pH7.0～7.2，121℃灭菌30min。
筛选液体培养基：葡萄糖15g，酵母浸膏5g，大豆蛋白胨4g，使用100g/L丁二酸母液调节pH 3.0、3.5、4.0、4.5，用蒸馏水定容至1L，121℃灭菌30min。
筛选固体培养基：葡萄糖15g，酵母浸膏5g，大豆蛋白胨4g，琼脂30g，100g/L丁二酸母液调节pH 5.0，用蒸馏水定容至1L，121℃灭菌30min。
发酵培养基：葡萄糖70g，玉米浆10g，尿素2g，KH2PO4 4g，MgSO4 2g，ZnSO4 10mg，FeSO4 1.2mg，CuSO4 1.0mg，MnSO4 2mg，蒸馏水定容至1L，121℃灭菌30min。摇瓶发酵所用发酵培养基不调节pH，发酵罐发酵所用发酵培养基用氢氧化钠调节pH。发酵中所用中和剂为4mol/L氢氧化钠溶液。
实施例1：丁二酸生产菌株的筛选与鉴定
(一)丁二酸生产菌株的筛选
1.菌株的富集培养与初筛
取新鲜的骆驼瘤胃内含物20g，在无菌生理盐水中震荡10min，然后转至总体积为100mL的YPD培养基中，28-35℃培养24h后按照30％接种量转接一次。将富集培养后的菌液梯度稀释，涂布于含溴甲酚绿YPD琼脂培养基，28-35℃培养，24-36h后部分菌落周围的平板颜色变为黄色，挑取黄色变色圈大的菌株进行菌种保藏和进一步厌氧发酵。
2.菌株的复筛
将初筛变色圈较大的菌株889株(单菌落乳白色、边缘整齐)接种于24深孔板的种子培养基中28-35℃震荡培养24-48h，按照10％接种量转接于24深孔板中的筛选液体培养基中，28-35℃震荡培养48-96h，使用薄层层析法(TCL)快速定量检测丁二酸，共计95株菌可以生产丁二酸，初步镜检有短杆菌、酵母菌。将镜检初步判断为酵母菌29株，进一步使用摇瓶发酵培养，其中一株酵母菌FMME-SuA001产量最高，丁二酸积累达到2.39g/L。
(二)丁二酸生产菌株的鉴定
(1)菌落及生理生化特征
FMME-SuA001菌株在YPD琼脂培养基培养48h，形成圆形、质地均匀、表面光滑湿润、边缘整齐的白色单菌落。镜检显示菌体为圆形或者卵圆形。能够发酵利用葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖，培养液有酵母的清香。
(2)26S rRNA序列分析
使用真菌DNA提取试剂盒提取该菌株的基因组DNA，以基因组DNA为模板，用真菌26S rRNA通用引物进行PCR扩增，扩增产物送至公司进行测序，测序结果在NCBI中进行Blast比对，结果显示该菌株为酿酒酵母。
正向引物NL 1序列：(5’GCATATCAATAAGCGGAAAAG 3’)，反向引物NL 4序列：(5’GGTCCGTGTTTCAAGACGG 3’)。
综合菌落形态特征和26S rRNA分析，确认该菌株为酿酒酵母，命名为酿酒酵母FMME-SuA001。
实施例2：突变菌株的获得
筛选获得生产丁二酸的酿酒酵母FMME-SuA001为出发菌株，按照如下方法进行筛选：
(1)常压室温等离子体(ARTP)诱变
①菌株活化与制备菌悬液
将酿酒酵母FMME-SuA001菌株接种到装有30mL/500mL种子培养基中，30℃，200rpm震荡培养48h后，按照5％的接种量，将其接种到种子培养基中，30℃培养48h，以下试验所用菌株均为第二代菌液。将菌液离心弃上清，菌体用PBS溶液洗涤3次，再用生理盐水重悬，将菌悬液OD600调至1.0。
②ARTP诱变处理与后培养
取制备好的菌悬液10μL均匀涂抹至已灭菌冷却的不锈钢载片上，并置入ARTP育种机，诱变功率120W，高纯氦气通气量10SLM，处理距离2mm，分别处理0、20、40、60、80、100s，每次诱变结束后将不锈钢载片置于含990μL无菌生理盐水的EP管中，在漩涡器上振荡洗涤1-2min，将诱变菌洗脱下来，进入适应性进化。
(2)适应性进化：
诱变后的菌悬液接入装有50mL/500mL种子培养基中，30℃，200rpm震荡培养48h后，接种至装有50mL/500mL筛选液体培养基(pH 4.5)中，适应性进化过程中，菌株培养3天左右，菌株的细胞浓度提高到OD600为8.0时开始转接，可转接至更低pH的培养基中，分别为pH4.5、4.0、3.5、3.0进行培养，每次转接控制起始细胞浓度为OD600 0.1～0.2，否则继续在当前pH条件下转接培养，该适应性进化过程历时195天。
将经过逐级驯化后得到的菌液稀释涂布于筛选固体培养基上，30℃培养3～4天。从筛选固体培养基上挑取大小适中的单菌落2001个，进行24孔板高通量发酵验证，并挑选丁二酸生产能力较出发菌株优良的菌株再次进行摇瓶发酵验证，共计筛选出13株高产L-丁二酸的菌株，其中一株酿酒酵母生产能力最优，且在pH 3.0的液体培养基中生长，将该菌株命名为酿酒酵母FMME-SuA912(Saccharomyces cerevisiae FMME-SuA912)。进一步验证该菌株的遗传稳定性，以摇瓶发酵的丁二酸产量为检验指标，将诱变进化筛选得到的突变株FMME-SuA912进行20代传代验证，摇瓶发酵结果显示：突变菌株FMME-SuA912的丁二酸酸产量优于出发菌株FMME-SuA001，并且在传代过程中丁二酸产量基本稳定(表1)，说明突变菌株FMME-SuA912具有良好的遗传稳定性，适用于丁二酸的发酵生产。
表1 FMME-SuA912突变株的遗传稳定性
酿酒酵母FMME-SuA912(Saccharomyces cerevisiae FMME-SuA912)，已于2023年2月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2023098，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
实施例3：在5L发酵罐中FMME-SuA912发酵生产丁二酸的情况
(1)种子液制备
将原始菌株酿酒酵母FMME-SuA001和FMME-SuA912分别在固体平板培养基上划线，30℃恒温培养箱中培养3天，用接种针挑取单菌落挑取一环接入50mL/500mL种子培养基中进行培养，30℃，200rpm震荡培养48h。
(2)5L发酵罐发酵培养
将步骤(1)中制备得到的种子液按照8％接种量接种到发酵罐中，发酵培养基体积为2L，使用氢氧化钠调节pH为5.0，发酵温度为30℃，通气量为1vvm，初始搅拌转速300rpm，当发酵过程中溶氧低于10％时，搅拌和转速关联溶氧控制在10～20％。当葡萄糖浓度低于10g/L时，补加葡萄糖母液，控制葡萄糖浓度在10～70g/L。发酵过程中取发酵液离心，收集上清液用高效液相色谱法检测丁二酸和其他副产物的含量。
结果表明，在pH 5.0的条件下发酵，两个菌株的生长情况基本一致(图1A)，发酵120h时，突变株FMME-SuA912的丁二酸产量达到25.8g/L，与原始菌株FMME-SuA001(15.7g/L)相比，产量提高了64.3％(图1B)。FMME-SuA912和FMME-SuA001中丁二酸的葡萄糖得率分别为0.25g/g和0.21g/g，葡萄糖得率提高了19.0％(图1C)。FMME-SuA912发酵液中副产物主要为乙酸3.25g/L，丙酮酸2.25g/L和苹果酸1.90g/L，相较于原始菌株FMME-SuA001分别降低了37.3％、24.5％和26.1％(表2)。
表2 FMME-SuA001和FMME-SuA912发酵生产丁二酸
实施例4：pH对FMME-SuA912发酵生产丁二酸的影响
将实施例2步骤(1)中制备得到的种子液按照8％接种量接种到发酵罐中，发酵培养基体积为3L，使用氢氧化钠控制pH 3.0～5.0，发酵温度为30℃，通气量为1vvm，初始搅拌转速300rpm，当发酵过程中溶氧低于10％时，搅拌和转速关联溶氧控制在10～20％。当葡萄糖浓度低于10g/L时，补加葡萄糖母液，控制葡萄糖浓度在10～70g/L。发酵过程中取发酵液离心，收集上清液检测丁二酸和葡萄糖的含量。
结果表明(见表3)：随着pH降低菌体量降低，产量略有下降，但是葡萄糖得率提升。当pH 3.5时，虽然丁二酸产量相较于pH 5.0时降低了3.5％，但是中和剂氢氧化钠溶液添加量的体积减少55％，葡萄糖得率提高了16.0％，综合考虑最适发酵pH为3.5。
表3不同pH对突变株FMME-SuA912生产丁二酸的影响
实施例5：氮源对FMME-SuA912发酵生产丁二酸的影响
将实施例3步骤(1)中制备得到的种子液按照8％接种量接种到发酵罐中，发酵培养基中的玉米浆分别以10g/L的酵母浸膏、大豆蛋白胨、玉米浆、豆粕粉替代，初始培养基体积为3L，使用氢氧化钠控制pH 3.5，发酵温度为30℃，通气量为1vvm，初始搅拌转速300rpm，当发酵过程中溶氧低于10％时，搅拌和转速关联溶氧控制在10～20％。当葡萄糖浓度低于10g/L时，补加葡萄糖母液，控制葡萄糖浓度在10～70g/L。发酵过程中取发酵液离心，收集上清液检测丁二酸和葡萄糖的含量。
结果表明(见表4)：①大豆蛋白胨最有利于菌体生长，但不利于产酸。②豆粕粉既不利于产酸和不利于菌体生长；③以廉价玉米浆为氮源时，丁二酸产量高于酵母浸膏为氮源，达到29.9g/L，糖酸转化率一致，因此选用廉价易得的玉米浆为氮源。
表4不同氮源对突变株FMME-SuA912生产丁二酸的影响
进一步对发酵培养基中玉米浆浓度进行优化。结果表明(见表5)：玉米浆浓度为5g/L时，菌体生长受影响，产酸降低；玉米浆浓度提升至15g/L和20g/L时，营养丰富，但是菌体生长快，糖酸转化率降低，同时发酵液的颜色加深，不利于后续分离纯化；因此最适玉米浆浓度为10g/L。
表5玉米浆浓度对突变株FMME-SuA912生产丁二酸的影响
实施例6：葡萄糖浓度对FMME-SuA912发酵生产丁二酸的影响
将实施例2步骤(1)中制备得到的种子液按照8％接种量接种到发酵罐中，发酵培养基中有机氮源为10g/L的玉米浆，初始葡萄糖浓度分别为30、50和70g/L，发酵罐中初始培养基体积为3L，使用氢氧化钠控制pH 3.5，发酵温度为30℃，通气量为1vvm，初始搅拌转速300rpm，当发酵过程中溶氧低于10％时，搅拌和转速关联溶氧控制在10～20％。当葡萄糖浓度低于10g/L时，补加葡萄糖母液，控制葡萄糖浓度在10～30、10～50和10～70g/L(即每一种条件在需要补糖时均补充葡萄糖至初始浓度水平)。发酵过程中取发酵液离心，收集上清液检测丁二酸和葡萄糖的含量。
结果表明(见表6)：菌株在3种不同葡萄糖浓度条件下120h的丁二酸产量分别为29.9g/L、35.9g/L和28.9g/L。因此，丁二酸生产力最佳条件为50g/L葡萄糖浓度，此时丁二酸的葡萄糖得率显著提升，达到0.34g/g。
表6葡萄糖浓度对突变株FMME-SuA912生产丁二酸的影响
实施例7：溶氧对突变株FMME-SuA912生产丁二酸的影响
将实施例3步骤(1)中制备得到的种子液按照8％接种量接种到发酵罐中，发酵培养基中有机氮源为10g/L的玉米浆，初始葡萄糖浓度为50g/L，发酵罐中初始培养基体积为3L，使用氢氧化钠控制pH 3.5，发酵温度为30℃，通气量为1vvm，初始搅拌转速300rpm，当发酵过程中溶氧低于10％时，搅拌和转速关联溶氧分别控制在10～20％、20～30％、30～40％、40～50％。当葡萄糖浓度低于10g/L时，补加葡萄糖母液至初始浓度水平，控制发酵过程中葡萄糖浓度在10～50g/L。发酵过程中取发酵液离心，收集上清液检测丁二酸和葡萄糖的含量。结果表明(见表7)：溶氧水平控制在10～20％时，菌体产酸水平较低；溶氧水平控制在30～40％和40～50％时，菌体生长快，达到最高产量的周期缩短至108h，但是糖酸转化率降低，发酵液中气泡多且粘稠，不利于丁二酸积累；当控制溶氧为20～30％时，发酵前期72h葡萄糖消耗速率很高，菌株的生物量也随之迅速增加，OD600达到49.8，之后后菌株生长进入平稳期。发酵120h时总共消耗了122.9g/L的葡萄糖，丁二酸最终产量和糖酸转化率最高，分别为41.8g/L和0.34g/g(图2)，发酵液中副产物主要为乙酸2.45g/L，丙酮酸4.58g/L和苹果酸0.47g/L。
表7溶氧对突变株FMME-SuA912生产丁二酸的影响
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一株产丁二酸的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FMME-SuA912，其特征在于，所述酿酒酵母已于2023年2月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2023098，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
2.利用权利要求1所述酿酒酵母生产丁二酸的方法，其特征在于，以葡萄糖为碳源，以玉米浆为氮源，将所述酿酒酵母进行发酵。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述玉米浆的浓度为5-20g/L。
4.根据权利要求2或3所述方法，其特征在于，当所述发酵中葡萄糖浓度低于10g/L时，补加葡萄糖，使葡萄糖浓度维持在10-50g/L。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述发酵的pH为3.5-4.5。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述发酵的溶氧为20-30％。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述发酵的温度为28-35℃。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述发酵的培养基每L含有：葡萄糖30～70g，玉米浆5～20g，尿素2g，KH2PO4 4g，MgSO4 2g，ZnSO4 10mg，FeSO4 1.2mg，CuSO41.0mg，MnSO42mg。
9.权利要求1所述酿酒酵母或权利要求2-8任一所述方法在生产丁二酸中的应用。
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