CN108384737A - 一株高产酸醋酸菌及其在酿造高酸度醋中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株高产酸醋酸菌及其在酿造高酸度醋中的应用，属于生物技术领域。该醋酸菌属于葡萄糖醋杆菌属，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2017563。将该菌株作为发酵菌种，以食用酒精或果酒、粮食酒为主要原料，采用分段补料法启动发酵和半连续发酵相结合的发酵方式酿造得到高酸度醋，总酸可达到90‑120g/L(以乙酸计)，产酸速率最高达8.19g/(L·h)，高于已报道醋酸菌的产酸速率(0.1‑3.5g/(L·h))。利用该菌株进行醋酸发酵可显著提高生产效率，增加企业效益。该高产酸醋酸菌及其发酵工艺适合用于高酸度醋的生产。

Description

一株高产酸醋酸菌及其在酿造高酸度醋中的应用
技术领域
本发明涉及一株高产酸醋酸菌及其在以乙醇为主要底物发酵生产高酸度醋中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
高酸度醋酸度高，不仅具有较好的保鲜效果和较强的杀菌能力，运输和储存成本低，而且其生产设备自动化程度高、生产效率高，备受食品、医疗、美容等行业青睐。
醋酸菌是一类能够氧化乙醇或糖类生成乙酸等有机酸的微生物的总称。到目前为止，已报道醋酸菌共有16个属，发现的醋酸菌绝大数为醋酸杆菌属、葡萄糖杆菌属和葡萄糖醋杆菌属。在国内，厂家经常选择中科As l.41、沪酿1.01和从醋醅或自然界中分离得到的醋酸菌酿造食醋或果醋。但这些菌种大多属于醋酸杆菌属，当醋酸含量达到到6％时，产物抑制效应加剧，醋酸菌的产酸活性降低，产酸速率减慢，严重影响了醋酸的产量和质量。因此，选育产酸浓度高、产酸速率快的耐酸醋酸菌对国内酿醋行业具有重大意义。
研究发现葡萄糖醋杆菌能够在高酸度条件下存活并保持代谢活性，因此在高酸度醋中占主导地位。在国外，研究者从工业醋和葡萄酒醋等高酸度液态醋中分离得到的Ga.europaeus、Ga.intermedius、Ga.oboediens和Ga.entanii耐酸性较强，其中Ga.europaeus能够耐受10％醋酸，在欧洲国家被广泛应用于高酸度醋的生产。因此，本发明尝试从处于发酵状态的高酸度醋酸发酵液中筛选高产酸优质醋酸菌并将其应用于酿造高酸度醋。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一是筛选一株适合工业化酿造高酸度醋的醋酸菌，为实现此目的，拟采用以下技术方案：
本发明提供的醋酸菌属于葡萄糖醋杆菌属，该菌株现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2017563，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2017年9月27日，建议的分类命名为Gluconacetobacter entanii HSMC-9。
本发明还提供了应用上述醋酸菌酿造高酸度醋的方法，按照下述步骤进行：
将初始发酵培养基投入到发酵罐中，设置发酵温度为30℃、通氧量为0.8vvm，当发酵罐参数稳定后对溶氧仪进行校正，设定培养基溶氧量为100％，发酵过程中发酵液的溶氧量以与该数值的比值百分数表示，将上述醋酸菌的种子液按照10％(v/v)接种于初始发酵培养基中，采用分段补料法启动发酵，当产酸速率减慢且发酵液酒精度低于1.0％vol时开始进行半连续发酵，即可酿造得到高酸度醋，在醋酸发酵过程中调整搅拌转速使发酵液溶氧量控制在20-60％。
所述初始发酵培养基根据乙醇来源的不同分为两种，一种组成为冰醋酸10mL/L、醋酸发酵营养盐2.0g/L，调整食用酒精的添加量使培养基酒精度为4.0％vol，另一种由冰醋酸和果酒或粮食酒配制而成，冰醋酸10mL/L，通过调整果酒或粮食酒的添加量使培养基酒精度为4.0％vol。
所述半连续发酵是指取出发酵罐内30％(v/v)的发酵液，补加等体积乙醇含量(单位mL/L)与放出的成熟发酵液总酸(以乙酸计，单位g/L)数值相当的新鲜发酵液继续进行醋酸发酵。
所述的分段补料法启动发酵是指当发酵液乙醇含量低于1.0％vol时以一定流加速率补加一定量的流加液，使若一次性瞬时加入该体积的流加液可以使发酵罐内发酵液酒精度达到3.0-4.5％vol，当发酵液中乙醇含量再次低于1.0％vol时进行第二次流加补料，在启动发酵过程中共流加补料3-5次，流加速率为0.030-0.100L/(h·L发酵液)。
所述流加液酒精度为12-20％vol，根据乙醇来源的不同分为两种，一种由食用酒精、醋酸发酵营养盐配制而成，另一种为果酒或粮食酒，实际发酵时选用的流加液种类需要与初始发酵培养基种类保持一致。
所述醋酸发酵营养盐是指安琪酵母股份有限公司生产的NS01醋发酵营养盐。
本发明筛选得到的醋酸菌产酸能力强，发酵30-60h发酵液总酸可达90-120g/L(以乙酸计)，产酸速率最高达8.19g/(L·h)，高于已报道醋酸菌的产酸速率(0.1-3.5g/(L·h))，利用该菌株进行醋酸发酵可显著提高生产效率，增加企业效益。
附图说明
图1不同菌株的产酸量；
图2菌株HSMC-1和菌株HSMC-9的系统发育树；
图3醋酸菌HSMC-9在初始发酵培养基发酵过程中的总酸和OD600值变化曲线；
图4利用醋酸菌HSMC-9酿造高酸度酒精醋过程中产酸量和OD600值变化曲线；
图5利用醋酸菌HSMC-9酿造高酸度桑椹果醋过程中产酸量和OD600值变化曲线。
具体实施方式
实施例1高产酸醋酸菌的分离、筛选
1、菌种增殖与纯化
吸取5mL处于发酵状态的高酸度醋酸发酵液，放入盛有100mL增殖培养基的500mL三角瓶中，30℃、200r/min振荡培养36h后进行稀释涂布。用无菌生理盐水将增殖培养基稀释至10-4，每个稀释度分别吸取200μL涂布于分离培养基上，将其放置于30℃培养2-3天。挑取变色圈大且占生长优势的单菌落在分离培养基上进行纯化。当分离培养基上的菌落形态相同且在显微镜下观察到的个体形态大体一致时停止纯化，共得到10株菌株，依次编号为HSMC-1～HSMC-10。挑取变色圈大的单菌株接种于斜面保藏培养基上，30℃培养48h后置于4℃冰箱内备用。
增殖培养基组成：葡萄糖20g/L，酵母提取物20g/L，MgSO 4·7H2O 6.0g/L，KH2PO40.5g/L，无水乙醇3％(体积分数，下同)。
分离培养基组成：葡萄糖10g/L，酵母提取物10g/L，鱼粉蛋白胨3g/L，琼脂20g/L，0.04％(m/v)溴甲酚紫50mL/L，无水乙醇3％，pH 7.0。
斜面保藏培养基：葡萄糖10g/L，酵母提取物10g/L，鱼粉蛋白胨3g/L，琼脂20g/L，无水乙醇3％。
2、醋酸菌初筛与复筛
将斜面保藏的菌株分别接种于装有50mL增殖培养基的250mL三角瓶中，30℃、200r/min振荡培养48h，将培养液5000r/min离心10min，取5mL上清液用0.1mol/L NaOH溶液中和至pH7.0，滴加5％(m/v)氯化铁溶液数滴煮沸，形成红褐色絮状沉淀者为阳性，反之为阴性。筛选得到6株疑似醋酸菌的菌株，分别为HSMC-1、HSMC-3、HSMC-4、HSMC-8、HSMC-9、HSMC-10。
在150mL的三角瓶中准确量取20mL蒸馏水，加入2-3滴酚酞指示剂，精确吸取1mL发酵液加入其中，用0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定至溶液变为粉红色且30s不褪色。产酸定量实验结果如图1所示。由图1可以得出菌株HSMC-1和菌株HSMC-9产酸量较高，分别为14.55g/L、15.78g/L，约是菌株HSMC-8产酸量的7倍，是其他四株菌株产酸量的1.80倍。
3、醋酸菌16S rDNA鉴定
对菌株HSMC-1和菌株HSMC-9进行16S rDNA鉴定，将两者的16S rDNA序列上传至NCBI数据库中进行同源性比较，从数据库中挑取9株与待鉴定菌株相似度较高的菌株并下载相应的16S rDNA基因序列，采用邻位相连法构建系统进化树，比对结果和构建的系统发育树分别见表1和图2。从表1和图2可以得出菌株HSMC-1和菌株HSMC-9的16S rDNA序列均与Gluconacetobacter属中编码为NR028909.1的Gluconacetobacter entanii LTH4560的16SrDNA序列相似度达到100％并且三者在系统发育树中处于同一支，因此可以确定菌株HSMC-1和菌株HSMC-9为同一种醋酸菌，均为Gluconacetobacter entanii。因此，将选取HSMC-9作为后续醋酸发酵的菌种。
表1菌株HSMC-1和菌株HSMC-9的16S rDNA与NCBI数据库比对结果
将上述菌株HSMC-9保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2017563。保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2017年9月27日，建议的分类命名为Gluconacetobacter entanii HSMC-9。
实施例2醋酸菌HSMC-9在初始发酵培养基中的发酵情况
1、制备种子液
从斜面上挑取菌株HSMC-9，按照3环/100mL接种于RAE1培养基中，置于30℃、200rpm的培养箱中培养至OD600值为0.8-1.0，然后对菌体进行革兰氏染色并观察其形态，检查是否染菌并判断菌体生长状况。若增殖正常，向种子培养基中按照10％(v/v)接种RAE1培养基，置于30℃、200rpm恒温培养至OD600值为0.8-1.0。
RAE1培养基组成成分：葡萄糖40g/L、酵母提取物10g/L、鱼粉蛋白胨10g/L、十二水合磷酸氢二钠6.8g/L、一水合柠檬酸1.5g/L，无水乙醇2％(体积分数)。
种子培养基组成成分：葡萄糖20g/L、酵母提取物5g/L、鱼粉蛋白胨5g/L、十二水合磷酸氢二钠3.4g/L、一水合柠檬酸0.75g/L，安琪酵母股份有限公司生产的NS01醋发酵营养盐0.8g/L，无水乙醇2％(体积分数)。
2、醋酸发酵
向5.0L通氧发酵罐中投入2.0L初始发酵培养基，设置温度为30℃、通氧量为0.8vvm，待发酵罐参数稳定后对溶氧仪进行校正，设定培养基的溶氧量为100％，发酵过程中发酵液的溶氧量以与该数值的比值百分数表示。按照10％(v/v)接种醋酸菌HSMC-9种子液进行醋酸。在发酵过程中，调整电机搅拌转速使发酵液溶氧量控制在20-60％，并每隔4h测定发酵液OD600值和总酸直至总酸不再增加。根据得到的数据绘制相应变化曲线，实验结果如图3所示。从图3看出醋酸菌HSMC-9在初始发酵液中，第4.0h进入对数生长期，此后OD600值与总酸快速增加，第15.5h OD600值与总酸几乎同时达到最大，分别为1.794和38.93g/L，平均产酸速率为1.84g/(L·h)，基于此得出醋酸菌HSMC-9醋酸发酵过程符合生长偶联型的特点。实验结果表明醋酸菌HSMC-9在初始发酵培养基中延滞期短，产酸速度快，具有较好的发酵性能。
初始发酵培养基组成成分：安琪酵母股份有限公司生产的NS01醋发酵营养盐2.0g/L，95％食用酒精乙醇4.2％(体积分数)，冰醋酸10g/L。
实施例3利用醋酸菌HSMC-9发酵高酸度酒精醋
1、制备种子液
从斜面上挑取菌株HSMC-9，按照3环/100mL接种于RAE1液体培养基中，置于30℃、200rpm的培养箱中培养至OD600值为0.8-1.0，然后对菌体进行革兰氏染色并观察其形态，检查是否染菌并判断菌体生长状况。若增殖正常，向种子培养基中按照10％(v/v)接种RAE1培养基，置于30℃、200rpm恒温培养至OD600值为0.8-1.0。
RAE1培养基组成成分：葡萄糖40g/L、酵母提取物10g/L、鱼粉蛋白胨10g/L、十二水合磷酸氢二钠6.8g/L、一水合柠檬酸1.5g/L，无水乙醇2％(体积分数)。
种子培养基组成成分：葡萄糖20g/L、酵母提取物5g/L、鱼粉蛋白胨5g/L、十二水合磷酸氢二钠3.4g/L、一水合柠檬酸0.75g/L，安琪酵母股份有限公司生产的NS01醋发酵营养盐0.8g/L，无水乙醇2％(体积分数)。
2、分段补料法启动发酵
向5.0L通氧发酵罐中投入2.0L初始发酵培养基，设置温度为30℃、通氧量为0.8vvm，待发酵罐参数稳定后对溶氧仪进行校正，设定培养基的溶氧量为100％，发酵过程中发酵液的溶氧量以与该数值的比值百分数表示。按照10％(v/v)接种醋酸菌HSMC-9种子液进行醋酸。在发酵过程中，调整电机搅拌转速使发酵液溶氧量控制在20-60％，并检测发酵液OD600值、总酸、酒精度变化情况。当发酵液乙醇含量低于1.0％vol时进行分段流加补料。在第12.5h测定发酵液酒精度为1.0％vol，以0.040L/(h·L发酵液)流加速率补加0.41L流加液，使若一次性瞬时加入该体积的流加液可以使发酵罐内发酵液酒精度达到4.5％vol；第18.7h时测定发酵液酒精度为0.7％vol，以0.050L/(h·L发酵液)流加速率补加0.49L流加液，使若一次性瞬时加入该体积的流加液可以使发酵罐内发酵液酒精度达到4.5％vol；在第23.0h时测定发酵液酒精度为0.9％vol，以0.030L/(h·L发酵液)流加速率补加0.59L流加液，使若一次性瞬时加入该体积的流加液可以使发酵罐内发酵液酒精度达到4.5％vol。在第29.2h时发酵液总酸达到93.40g/L(以乙酸计)，酒精度0.9％vol，产酸速率减慢，开始进行半连续发酵。
初始发酵培养基组成成分：安琪酵母股份有限公司生产的NS01醋发酵营养盐2.0g/L，酒精度为20％vol食用酒精200mL/L，冰醋酸10g/L。
流加液组成成分：酒精度为20％vol食用酒精，安琪酵母股份有限公司生产的NS01醋发酵营养盐10.0g/L。
3、半连续发酵
第30.0h时从发酵罐中快速放出0.95L成熟发酵液，再以0.2L/h的流速补加等体积新鲜发酵液进行醋酸发酵。第42.0h时发酵液总酸为97.0g/L(以乙酸计)，酒精度为0.5％vol，进行放料和补料操作即放出0.90L成熟发酵液，以0.2L/h的流速补加等体积新鲜发酵液进行第二批半连续发酵。第59.2h时发酵液总酸为95.3g/L(以乙酸计)，酒精度为0.4％vol，进行放料和补料操作即放出0.85L成熟发酵液，以0.2L/h的流速补加等体积新鲜发酵液进行第三批半连续发酵。第78.5h时总酸为94.7g/L(以乙酸计)，酒精度为0.5％vol，将发酵液全部排出结束发酵。将半连续发酵得到的酒精醋混合，测定总酸为94.90g/L。
新鲜发酵液组成成分：安琪酵母股份有限公司生产的NS01醋发酵营养盐5.0g/L，向酒精度为20％vol的食用酒精中添加适量的水使最终酒精度(单位mL/L)与排出成熟发酵液的总酸(以乙酸计，单位g/L)数值上相等。
在高酸度酒精醋发酵过程中，OD600值、产酸量变化情况见图4。从图4中可以看出在分段补料法启动发酵的前期，醋酸菌HSMC-9繁殖较快，活性较高，相应时间段内产酸速率较快，在第22.4h时总酸便达到了74.33g/L，产酸量为64.03g/L；在后期由于流加液的稀释作用和发酵液酸度的增加，OD600值有所减小，醋酸菌比生长率降低，产酸速率减缓，但产酸速率依旧处于较高水平，在第29.2h产酸量达到83.1g/L。在半连续发酵过程中，新鲜发酵液的加入使醋酸菌OD600值大幅度减小，但由于发酵液酸度的降低，醋酸菌比生长率逐渐增加，经过一定时间的恢复后，OD600值呈上升趋势，产酸速率相对加快。由此可以得出，醋酸菌HSMC-9对高浓度醋酸有一定的耐受性，但在其耐酸范围内随着发酵液中醋酸含量的升高，醋酸菌的比生长速率和活力都稍有下降。
实施例4利用醋酸菌HSMC-9发酵高酸度桑椹果醋
1、制备种子液
从斜面上挑取菌株HSMC-9，按照3环/100mL接种于RAE1培养基中，置于30℃、200rpm的培养箱中培养至OD600值为0.8-1.0，然后对菌体进行革兰氏染色并观察其形态，检查是否染菌并判断菌体生长状况。若增殖正常，向种子培养基中按照10％(v/v)接种RAE1培养基，置于30℃、200rpm恒温培养至OD600值为0.8-1.0。
RAE1培养基组成成分：葡萄糖40g/L、酵母提取物10g/L、鱼粉蛋白胨10g/L、十二水合磷酸氢二钠6.8g/L、一水合柠檬酸1.5g/L，无水乙醇2％(体积分数)。
种子培养基组成成分：葡萄糖20g/L、酵母提取物5g/L、鱼粉蛋白胨5g/L、十二水合磷酸氢二钠3.4g/L、一水合柠檬酸0.75g/L，安琪酵母股份有限公司生产的NS01醋发酵营养盐0.8g/L，无水乙醇2％(体积分数)。
2、分段补料法启动发酵
向5.0L通氧发酵罐中投入1.5L初始发酵培养基，设置温度为30℃、通氧量为0.8vvm，待发酵罐参数稳定后对溶氧仪进行校正，设定培养基的溶氧量为100％，发酵过程中发酵液的溶氧量以与该数值的比值百分数表示。按照10％(v/v)接种醋酸菌HSMC-9种子液进行醋酸。在发酵过程中，调整电机搅拌转速使发酵液溶氧量控制在20-60％，并检测发酵液OD600值、总酸、酒精度变化情况。当发酵液乙醇含量低于1.0％vol时进行分段流加补料。在第13.5h测定发酵液酒精度为0.9％vol，以0.060L/(h·L发酵液)流加速率补加0.26L桑椹酒，使若一次性瞬时加入该体积的流加液可以使发酵罐内发酵液酒精度达到3.0％vol；第18.2h时测定发酵液酒精度为0.8％vol，以0.100L/(h·L发酵液)流加速率补加0.38L桑椹酒，使若一次性瞬时加入该体积的流加液可以使发酵罐内发酵液酒精度达到3.0％vol；在第21.5h时测定发酵液酒精度为0.5％vol，以0.080L/(h·L发酵液)流加速率补加0.55L桑椹酒，使若一次性瞬时加入该体积的流加液可以使发酵罐内发酵液酒精度达到3.0％vol。在第26.8h测定发酵液酒精度为0.6％vol，以0.060L/(h·L发酵液)流加速率补加0.64L桑椹酒，使若一次性瞬时加入该体积的流加液可以使发酵罐内发酵液酒精度达到3.0％vol，在第33.0h测定发酵液酒精度为0.5％vol，以0.060L/(h·L发酵液)流加速率补加0.82L桑椹酒，使若一次性瞬时加入该体积的流加液可以使发酵罐内发酵液酒精度达到3.0％vol；在第38.8h时发酵液总酸达到91.50g/L(以乙酸计)，酒精度0.4％vol，产酸速率减慢，开始进行半连续发酵。
初始发酵液组成成分：酒精度为12％vol的桑椹酒340mL/L，冰醋酸10g/L。
流加液组成成分：酒精度为12％vol的桑椹酒。
3、半连续发酵
第39.0h时从发酵罐中快速放出1.20L成熟发酵液，再以0.35L/h的流速补加等体积新鲜发酵液进行醋酸发酵。第53.6h时发酵液总酸为91.0g/L(以乙酸计)，酒精度为0.4％vol，进行放料和补料操作即放出1.20L成熟发酵液，以0.35L/h的流速补加等体积新鲜发酵液进行第二批半连续发酵。第73.2h时发酵液总酸为91.3g/L(以乙酸计)，酒精度为0.5％vol，进行放料和补料操作即放出1.20L成熟发酵液，以0.35L/h的流速补加等体积新鲜发酵液进行第三批半连续发酵。第94.5h时总酸为90.7g/L(以乙酸计)，酒精度为0.5％vol，将发酵液全部排出结束发酵。将半连续发酵得到的桑椹果醋混合，测定总酸为90.90g/L。
新鲜发酵液组成成分：向桑椹酒中添加适量的水使最终酒精度(单位mL/L)与排出成熟发酵液的总酸(以乙酸计，单位g/L)数值上相等。
在高酸度桑椹果醋发酵过程中，OD600值、产酸量变化情况见图5。从图5中可以看出，在桑椹果醋酿造过程中，OD600值、产酸量变化趋势和酿造高酸度酒精醋过程中OD600值、产酸量变化趋势大体一致。但由于桑椹酒的酒精度较低，在启动发酵和半连续发酵过程中，补加料液对醋酸菌浓度的稀释作用更加明显，从而导致产酸速率偏低，发酵周期有所延长。

Claims (8)

1.一株高产酸醋酸菌，其特征在于保藏编号为CCTCC NO：M2017563，建议的分类命名为Gluconacetobacter entanii HSMC-9。
2.利用权利要求1所述的醋酸菌酿造高酸度醋的方法，其特征在于按照下述步骤进行：
将初始发酵培养基投入到发酵罐中，设置发酵温度为30℃、通氧量为0.8vvm，当发酵罐参数稳定后对溶氧仪进行校正，设定培养基溶氧量为100％，发酵过程中发酵液的溶氧量以与该数值的比值百分数表示，将上述醋酸菌的种子液按照10％(v/v)接种于初始发酵培养基中，采用分段补料法启动发酵，当产酸速率减慢且发酵液酒精度低于1.0％vol时开始进行半连续发酵，酿造得到高酸度醋，在醋酸发酵过程中调整搅拌转速使发酵液溶氧量控制在20-60％，。
3.根据权利要求2所述的醋酸菌酿造高酸度醋的方法，其特征在于所述初始发酵培养基根据乙醇来源的不同分为两种，一种组成为冰醋酸10mL/L、醋酸发酵营养盐2.0g/L，调整食用酒精的添加量使培养基酒精度为4.0％vol。
4.根据权利要求2所述的醋酸菌酿造高酸度醋的方法，其特征在于所述初始发酵培养基根据乙醇来源的不同分为两种，另一种由冰醋酸和果酒或粮食酒配制而成，冰醋酸10mL/L，通过调整果酒或粮食酒的添加量使培养基酒精度为4.0％vol。
5.根据权利要求2所述的醋酸菌酿造高酸度醋的方法，其特征在于所述半连续发酵是指取出发酵罐内30％(v/v)的发酵液，补加等体积乙醇含量(单位mL/L)与放出的成熟发酵液总酸(以乙酸计，单位g/L)数值相当的新鲜发酵液继续进行醋酸发酵。
6.根据权利要求2所述的醋酸菌酿造高酸度醋的方法，其特征在于所述的分段补料法启动发酵是指当发酵液乙醇含量低于1.0％vol时以一定流加速率补加一定量的流加液，使若一次性瞬时加入该体积的流加液可以使发酵罐内发酵液酒精度达到3.0-4.5％vol，当发酵液中乙醇含量再次低于1.0％vol时进行第二次流加补料，在启动发酵过程中共流加补料3-5次，流加速率为0.030-0.100L/(h·L发酵液)。
7.根据权利要求2所述的醋酸菌酿造高酸度醋的方法，其特征在于所述流加液酒精度为12-20％vol，根据乙醇来源的不同分为两种，一种由食用酒精、醋酸发酵营养盐配制而成。
8.根据权利要求2所述的醋酸菌酿造高酸度醋的方法，其特征在于所述流加液酒精度为12-20％vol，根据乙醇来源的不同分为两种，另一种为果酒或粮食酒，实际发酵时选用的流加液种类需要与初始发酵培养基种类保持一致。
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