CN104561154B - 一种辅酶q10发酵工艺及控制策略 - Google Patents

一种辅酶q10发酵工艺及控制策略 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种辅酶Q10发酵工艺及控制策略。采用类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)发酵生产辅酶Q10，提供了辅酶Q10发酵的具体操作方法，建立了工艺调控的标准，通过观察发酵过程中菌型变化，以菌型过渡期作为判断工艺参数调整的时间及幅度的依据，辅酶Q10发酵水平有了大幅度的提升，生产水平稳定，降低发酵成本。

Description

一种辅酶Q10发酵工艺及控制策略
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种辅酶Q10发酵工艺及控制策略。
背景技术
辅酶Q10结合在动植物、微生物细胞内线粒体膜上，是呼吸链一个重要的递氢体，是一种有效的生化药物，具有很多重要的生理作用。多项数据证明辅酶Q10对人类的健康及疾病治疗越来越重要，近期研究发现辅酶Q10具有抗衰老作用，已经广泛应用到化妆品及保健品领域，国内外需求进一步扩大。
辅酶Q10的生产方法主要有动植物组织提取法、化学合成法以及微生物发酵法三种。其中动植物提取法成本太高，不适合工业化生产；化学合成法反应复杂，副产物多，成本也较高，目前国内外大多都是采用微生物发酵法。微生物发酵法有如下优点：(1)产品为天然品，生物活性好，易于人体吸收；(2)原料来源广泛，利于工业化生产。
要提高辅酶Q10发酵产量主要从两个方面进行优化：一是选育出辅酶Q10高产菌株，二是优化发酵培养基和发酵工艺。确定生产菌株及发酵培养基后，需要对发酵条件进行优化，摇瓶及小罐试验阶段可以通过单因素等其他统计学的方法来进行优化，在生产上利用这一手段去优化时情况较复杂且工作量大，微生物发酵过程长，发酵结果具有一定的波动性，对最终结果分析造成一定的干扰，影响判断，重复性低，效率低等缺点。
本发明提供了一种辅酶Q10发酵的具体操作方法，建立了一个工艺参数调控的标准，通过观察发酵过程中菌型变化，以各个菌型过渡期作为判断工艺参数调整的时间及幅度的依据，只需观察菌型的变化即可掌握菌型过渡期，恰当的调整发酵工艺参数使菌体正常的过渡到下一个菌型，具有易控性及简便性，波动性小，从而使辅酶Q10发酵水平有了大幅度的提升，生产水平稳定，降低发酵成本。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种辅酶Q10工艺及控制策略，建立以菌体在发酵过程中菌型过渡期作为判断工艺参数调整的时间点及调整幅度的技术手段，为辅酶Q10发酵提供最优发酵条件，从而提高辅酶Q10发酵产量。
本发明步骤如下：
1)平板培养
配置平板培养基，所述的平板培养基的组分为：葡萄糖2.0～4.0g/L，酵母粉1.0～3.0g/L，蛋白胨1.0～3.0g/L，琼脂粉20～30g/L，消前pH6.8～7.2，于121℃灭菌25～30min。
从平板上挑取一个外观圆润、边缘光滑、颜色较深的单菌落于装有10～14mL无菌水试管后充分打散，稀释到一定梯度后吸取少量菌液于平板上涂布，于32～34℃培养5～7天。
2)母瓶培养
配置母瓶培养基，所述母瓶培养基的组分为：氯化铵1.7～2.5g/L，蛋白胨0.7～1.5g/L，味精0.4～1.2g/L，玉米浆0.4～1.2g/L，葡萄糖2～6g/L，磷酸氢二钠0.35～0.55g/L，磷酸二氢钠0.35～0.55g/L，三氯化铁0.08～0.12g/L，硫酸镁1.4～2.2g/L，氯化钾1.4～2.2g/L，硫酸铜0.02～0.06g/L，氯化锌0.0006～0.00014g/L，碳酸氢钙5.6～7.2g/L，辅液I。其中辅液I组分为：盐酸硫胺1～3g/L，核黄素1.8～2.4g/L，吡哆素10～15g/L，叶酸0.5～1.5g/L，烟酸12～16g/L，烟酸胺12～16g/L，泛酸钙0.2～0.6g/L，苯丙氨酸0.4～1.2g/L，茄尼醇4～8g/L。除辅液I之外于121℃灭25～30min，辅液I于118℃灭20～25min，按体积比0.2～0.6％加到母瓶培养基中。
从平板上挑取25～30个外观圆润、边缘光滑、颜色较深的单菌落于装有10～14mL无菌水试管充分打散，每个母瓶接2.3～3.2mL菌悬液，培养条件为转速220～240rpm，温度32～34℃，培养25～30h，待残糖为0.5～1.5g/L时按5～10％接种量接入一级种子罐。
3)一级种子罐培养
配置一级种子培养基，所述的一级种子培养基的组分为：氯化铵2～4g/L，蛋白胨0.8～1.6g/L，味精0.6～1.8g/L，玉米浆0.6～1.8g/L，葡萄糖4.8～9.6g/L，磷酸氢二钠0.4～0.8g/L，磷酸二氢钠0.4～0.8g/L，三氯化铁0.08～0.14g/L，硫酸镁1.6～3.2g/L，氯化钾1.6～2.4g/L，硫酸铜0.02～0.06g/L，氯化锌0.0006～0.00014g/L，碳酸氢钙5.6～7.2g/L，辅液II。其中辅液II组分为：盐酸硫胺10～15g/L，核黄素0.5～1.5g/L，吡哆素1.5～2.5g/L，叶酸0.25～0.75g/L，烟酸6～12g/L，烟酸胺6～12g/L，泛酸钙0.15～0.45g/L，苯丙氨酸0.2～0.6g/L，茄尼醇3～9g/L。
消前用液氨将二级种子培养基pH调至6.4～6.7，除辅液II之外于121℃灭25～30min后降至培养温度并通空气保压，辅液II装容器于118℃灭20～28min。待母瓶残糖＜0.5～1g/L时即可一级移入种子罐，移种前将母瓶的菌液和辅液II分别装进一个耐压的容器，在火焰保护下用差压法由接种口先压入消好的辅液II，再压入母瓶种子液，接种量为5％～10％，辅液II用量为0.4～0.8％，一级种子罐培养条件为罐压0.03～0.04MPa，vvm0.6～0.8，罐温为32～34℃，转速180～220rpm，培养周期16～24h。待残糖降至0.5～1.5g/L，菌型均匀且无菌度合格后，将一级种子移入二级种子罐，接种量为5～10％。
4)二级种子罐培养
配置二级种子罐培养基，所述培养基组分为氯化铵2.6～3.8g/L，蛋白胨1.6～3.2g/L，味精0.6～1.2g/L，玉米浆0.6～1.2g/L，葡萄糖10～15g/L，磷酸氢二钠0.6～1.2g/L，磷酸二氢钠0.6～1.2g/L，三氯化铁0.15～0.25g/L，硫酸镁3～6g/L，氯化钾1.6～2.4g/L，硫酸铜0.02～0.06g/L，氯化锌0.0005～0.0015g/L，碳酸氢钙5.6～7.2g/L，辅液III。其中辅液III组分为盐酸硫胺10～20g/L，核黄素1.5～3g/L，吡哆素2～4g/L，叶酸0.4～1.0g/L，烟酸15～25g/L，烟酸胺15～25g/L，泛酸钙0.001～0.004g/L，苯丙氨酸0.002～0.006g/L，茄尼醇0.04～0.08g/L。
消前用液氨将二级种子培养基pH调至6.4～6.7，除辅液III之外于121℃灭25～30min后降至培养温度并通无菌空气保压，辅液III放入小罐中于120℃灭20～25min后降室温通无菌空气保压。在一级种子移入二级种子罐前先将辅液III通过压差法全部移入二级种子罐，辅液III的用量相对于接后的0.1～0.4％。二级种子罐培养条件为罐压0.03～0.04MPa，vvm 0.6～0.8，罐温为32～34℃，转速180～220rpm，培养周期16～24h待残糖降至0.5～1.5g/L，菌型均匀且无菌度合格后，将二级种子罐移入三级种子罐，接种量为5～10％。
5)三级发酵罐培养
配置三级发酵培养基，所述培养基组分为氯化铵3.6～4.8g/L，蛋白胨0.6～1.2g/L，味精2.0～6.0g/L，玉米浆3.0～6.0g/L，葡萄糖10～15g/L，磷酸二氢钠2.5～3.5g/L，三氯化铁0.8～1.4g/L，硫酸镁6～9g/L，氯化钾1.5～3.0g/L，硫酸铜0.06～0.12g/L，辅液IV。其中辅液IV组分为：盐酸硫胺1～3g/L，核黄素1.8～2.4g/L，吡哆素10～15g/L，叶酸0.5～1.5g/L，烟酸12～16g/L，烟酸胺12～16g/L，泛酸钙0.15～0.45g/L，苯丙氨酸0.25～0.75g/L，茄尼醇2.5～5g/L。
先在配料罐中加入少于配料体积的水，开搅拌，然后逐次加入除辅液IV外培养基其它组分，待搅拌均匀后用泵打入大罐中，再用水清洗配料罐后一并打入发酵罐后，加水至所需要的体积，于121～122℃灭菌30min后冷却通气保正压。辅液IV放入小罐中于120℃灭20～25min后降温通无菌空气保压，接种前通过压差法将辅液IV全部压入三级发酵罐中，用量为0.15～0.45％，通过压差法将二级种子压入三级发酵罐中，初始培养条件为罐压0.03～0.035MPa，转速60～70rpm，vvm0.42～0.46，罐温32～34℃，初始糖浓度10～15g/L，磷浓度0.3～0.4g/L。接种后每隔四个小时取样测糖、磷，并镜检观察菌型，前40h糖控制7～12g/L，磷0.2～0.3g/L，后期至发酵结束糖控制3～6g/L，磷控制0.1～0.15g/L，通过补加液氨控制pH 7.0～7.4。
发酵初期，菌型为小球，菌体出现二分裂时vvm提高至0.48～0.54，在菌体有出现短棒状时vvm提至0.54～0.6，罐压0.035～0.04Mpa，转速提高至75～90rpm。待菌型由短棒状开始转为弯形时提高通气比至vvm 0.6～0.68，罐压为0.45～0.5Mpa，转速提高至95～105rpm。待菌型由弯形转变为大圆球形时vvm降低至0.52～0.58，罐压降至0.035～0.04Mpa，待辅酶Q10含量增长减缓，糖耗速度明显减慢，菌体染色浅，残糖＜0.5～1.5g/L后可以停止发酵。
在本发明的实施方案中，该方法可应用于任何产辅酶Q10的菌种，作为一种具体实施方式，使用的菌种为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)，已于2010年12月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心编号为CGMCC No.4497。
在本发明的实施方案中，“消前”调节pH在本领域是指在培养基进行蒸汽高温灭菌前的一个操作，一般都在灭菌前操作。
在本发明的实施方案中，工艺调控依据都是在三级发酵期间通过菌型变化来判断工艺参数调整时间及幅度。
本发明取得有益效果：通过观察发酵过程中菌型变化，以各个菌型过渡期作为判断工艺参数调整的时间及幅度的依据，只需观察菌型的变化即可掌握菌型过渡期，恰当的调整发酵工艺参数使菌体正常的过渡到下一个菌型，具有易控性及简便性，波动性小，从而使辅酶Q10发酵水平有了大幅度的提升，生产水平稳定，降低发酵成本。
本领域中通常按照固定时间去调整通气比、转速、罐压，其辅酶Q10产量要偏低，而本发明首次根据菌型去调整相关工艺参数，其辅酶Q10产量要远远高于前者，从而使辅酶Q10发酵水平有了大幅度的提升，所带来的技术效果是显著的。
附图说明
图1：发酵中的菌体，菌型为二分裂期
图2：发酵中的菌体，菌型为棒状时期
图3：发酵中的菌体，菌型为弯形时期
图4：发酵中的菌体，菌型为大圆球时期
具体实施方式
以下实施例进一步说明了本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1：
将辅酶Q10保藏菌株CGMCCNo.4497进行活化三代后挑取平板上外观圆润饱满、边缘光滑、颜色较深的单菌落稀释涂布接于平板培养基培养。平板培养基组分为：葡萄糖2g/L，酵母粉1g/L，蛋白胨1g/L，琼脂粉2g/L，pH 6.8，培养条件为32℃培养5天，待平板上菌落外观圆润、边缘光滑、颜色较深时即可接入母瓶中进行培养。
母瓶培养基组分为：氯化铵1.7g/L，蛋白胨0.7g/L，味精0.4g/L，玉米浆0.4g/L，葡萄糖2g/L，磷酸氢二钠0.35g/L，磷酸二氢钠0.35g/L，三氯化铁0.08g/L，硫酸镁1.4g/L，氯化钾1.4g/L，硫酸铜0.02g/L，氯化锌0.0006g/L，碳酸氢钙5.6g/L，辅液I。其中辅液I组分为：盐酸硫胺1g/L，核黄素1.8g/L，吡哆素10g/L，叶酸0.5g/L，烟酸12g/L，烟酸胺12g/L，泛酸钙0.2g/L，苯丙氨酸0.4g/L，茄尼醇4g/L。除辅液I之外于121℃灭25min，辅液I于118℃灭20min，按体积比0.2％加到母瓶培养基中。
从平板上挑取25个外观圆润、边缘光滑、颜色较深的的单菌落于装有10mL的无菌水试管中充分打散，每个母瓶接2.3mL菌悬液，母瓶培养条件：转速220rpm，温度32℃，培养时间25h，待残糖为0.5g/L时按5％接种量接入一级种子罐。
一级种子罐培养组分为：氯化铵2g/L，蛋白胨0.8g/L，味精0.6g/L，玉米浆0.6g/L，葡萄糖4.8g/L，磷酸氢二钠0.4g/L，磷酸二氢钠0.4g/L，三氯化铁0.08g/L，硫酸镁1.6g/L，氯化钾1.6g/L，硫酸铜0.02g/L，氯化锌0.0006g/L，碳酸氢钙5.6g/L，辅液II。其中辅液II组分为：盐酸硫胺10g/L，核黄素0.5g/L，吡哆素1.5g/L，叶酸0.25g/L，烟酸6g/L，烟酸胺6g/L，泛酸钙0.15g/L，苯丙氨酸0.2g/L，茄尼醇3g/L。
消前用液氨将一级种子培养基pH调至6.4，除辅液II之外于121℃灭25min后降至培养温度并通无菌空气保压。辅液II于118℃灭20min。移种前将母瓶的菌液和辅液II分别装进耐压容器中，在火焰保护下用压差法将消好的辅液II和母瓶菌液压入一级种子罐，接种量为6％，辅液II用量为0.4％。一级种子罐培养条件为0.03MPa，通气比为vvm 0.6，罐温32℃，转速180rpm，培养时间为16h。待残糖降至0.5g/L，菌型均匀且无菌度合格后，将一级种子通过压差法接入二级种子罐，接种量为5％。
二级培养基组分为氯化铵2.6g/L，蛋白胨1.6g/L，味精0.6g/L，玉米浆0.6g/L，葡萄糖10g/L，磷酸氢二钠0.6g/L，磷酸二氢钠0.6g/L，三氯化铁0.15g/L，硫酸镁3g/L，氯化钾1.6g/L，硫酸铜0.02g/L，氯化锌0.0005g/L，碳酸氢钙5.6g/L，辅液III。其中辅液III组分为盐酸硫胺10g/L，核黄素1.5/L，吡哆素2g/L，叶酸0.4g/L，烟酸15g/L，烟酸胺15g/L，泛酸钙0.001g/L，苯丙氨酸0.002g/L，茄尼醇0.04g/L。
消前用液氨将二级种子培养基pH调至6.4，除辅液III之外于121℃灭25min后降至培养温度并通无菌空气保压，辅液III放入小罐中于120℃灭20min后降温通无菌空气保压。在一级种子移入二级种子罐前先将辅液III通过压差法全部移入二级种子罐，辅液III的用量相对于接后的1％。二级种子罐培养条件为罐压0.03MPa，vvm 0.6，罐温为32℃，转速180rpm，培养周期16h，待残糖降至0.5g/L，菌型均匀且无菌度合格后，将二级种子移入三级发酵罐，接种量为5％。
三级发酵培养基组分为：氯化铵3.6g/L，蛋白胨0.6g/L，味精2.0g/L，玉米浆3.0g/L，葡萄糖10g/L，磷酸二氢钠2.5g/L，三氯化铁0.8g/L，硫酸镁6g/L，氯化钾1.5g/L，硫酸铜0.06g/L，辅液IV。其中辅液IV组分为：盐酸硫胺1g/L，核黄素1.8g/L，吡哆素10g/L，叶酸0.5g/L，烟酸12g/L，烟酸胺12g/L，泛酸钙0.15g/L，苯丙氨酸0.25g/L，茄尼醇2.5g/L。
先在配料罐中加入少于配料体积的水，开启搅拌，然后逐次加入除辅液IV外培养基其它组分，待搅拌均匀后用泵打入大罐中，再用水清洗配料罐后一并打入发酵罐后，加水至所需要的体积，于121℃灭菌30min后冷却至培养温度并通无菌空气保压。辅液IV放入小罐中于120℃灭20min后降温通无菌空气保压，接种前通过压差法将辅液IV全部压入三级发酵罐中，用量为0.15％，通过压差法将二级种子压入三级发酵罐中，初始培养条件为罐压0.03MPa，转速60rpm，vvm 0.42，罐温32℃，初始糖浓度10g/L，磷浓度0.3g/L。接种后每隔四个小时取样测糖、磷并镜检观察菌型，前40h糖控制7g/L，磷0.2g/L，后期至发酵结束糖控制3g/L，磷控制0.1g/L，过程中通过补加液氨控制pH 7.0。
发酵初期，菌型为小球，菌体出现二分裂时vvm提高至0.48，在菌体有出现短棒状时vvm提至0.54，罐压0.035Mpa，转速提高至75rpm。待菌型由短棒状开始转为弯形时提高通气比至vvm 0.6，罐压为0.45Mpa，转速提高至95rpm。待菌型由弯形转变为大圆球形时vvm降低至0.52，罐压降至0.035Mpa，待辅酶Q10含量增长减缓，糖耗速度明显减慢，菌体染色浅，残糖＜0.5g/L后可以停止发酵。
最终发酵88h，辅酶Q10产量达2600mg/L，干重达80g/L。
实施例2：
将辅酶Q10保藏菌株CGMCCNo.4497进行活化三代后挑取平板上外观圆润饱满、边缘光滑、颜色较深的单菌落稀释涂布后接于平板培养基进行培养。平板培养基组分为：葡萄糖3g/L，酵母粉2g/L，蛋白胨2g/L，琼脂粉2.5g/L，pH 7.0。培养条件为32℃培养6天，待单菌落外观圆润、边缘光滑、颜色较深时即可接入母瓶进行培养。
母瓶培养基组分为：氯化铵2.1g/L，蛋白胨0.11g/L，味精0.8g/L，玉米浆0.8g/L，葡萄糖4g/L，磷酸氢二钠0.45g/L，磷酸二氢钠0.45g/L，三氯化铁0.1g/L，硫酸镁1.8g/L，氯化钾1.8g/L，硫酸铜0.04g/L，氯化锌0.001g/L，碳酸氢钙6.4g/L，辅液I。其中辅液I组分为：盐酸硫胺2g/L，核黄素1.9g/L，吡哆素12.5g/L，叶酸1g/L，烟酸14g/L，烟酸胺14g/L，泛酸钙0.4g/L，苯丙氨酸0.8g/L，茄尼醇6g/L。除辅液I之外于121℃灭28min，辅液I于118℃灭22min，按体积比0.4％加到母瓶培养基中。
挑取25个外观形态饱满的单菌落放于装有12mL的无菌水试管中充分打散，每个母瓶接2.8mL菌悬液，母瓶培养条件：转速230rpm，温度33℃，培养时间28h，待残糖为1g/L时按7.5％的接种量接入一级种子罐。
一级种子罐培养组分为：氯化铵3g/L，蛋白胨1.2g/L，味精1.2g/L，玉米浆1.2g/L，葡萄糖7.2g/L，磷酸氢二钠0.6g/L，磷酸二氢钠0.6g/L，三氯化铁0.012g/L，硫酸镁2.4g/L，氯化钾2.0g/L，硫酸铜0.04g/L，氯化锌0.001g/L，碳酸氢钙6.4g/L，辅液II。其中辅液II组分为：盐酸硫胺12.5g/L，核黄素1.0g/L，吡哆素1.75g/L，叶酸0.5g/L，烟酸9g/L，烟酸胺9g/L，泛酸钙0.3g/L，苯丙氨酸0.4g/L，茄尼醇6g/L。
消前用液氨将一级培养基pH调至6.5，除辅液II之外于121℃灭28min后降至培养温度并通空气保压。辅液II于118℃灭25min。移种前将母瓶的菌液和辅液II分别装进耐压容器中，在火焰保护下用压差法将消好的辅液II和母瓶菌液压入一级种子罐，接种量为7.5％，辅液II用量为0.6％。一级种子罐培养条件为0.035MPa，通气比为vvm 0.7，罐温33℃，转速200rpm，培养时间为16h。待残糖降至1g/L，菌型均匀且无菌度合格后，将一级种子罐通过压差法接入二级种子罐，接种量为7.5％。
二级培养基组分为氯化铵3.2g/L，蛋白胨2.4g/L，味精0.9g/L，玉米浆0.9g/L，葡萄糖12.5g/L，磷酸氢二钠0.9g/L，磷酸二氢钠0.9g/L，三氯化铁0.2g/L，硫酸镁4.5g/L，氯化钾2g/L，硫酸铜0.04g/L，氯化锌0.001g/L，碳酸氢钙6.2g/L，辅液III。其中辅液III组分为盐酸硫胺15g/L，核黄素2.4g/L，吡哆素3g/L，叶酸0.7g/L，烟酸20g/L，烟酸胺20g/L，泛酸钙0.0025g/L，苯丙氨酸0.004g/L，茄尼醇0.06g/L。
消前用液氨将二级种子培养基pH调至6.4，除辅液III之外于121℃灭28min后降至培养温度并通无菌空气保压，辅液III放入小罐中于120℃灭22min后降温通无菌空气保压。在一级种子移入二级种子罐前先将辅液III通过压差法全部移入二级种子罐，辅液III的用量相对于接后的0.25％。二级种子罐培养条件为罐压0.035MPa，通气比vvm 0.7，罐温为32℃，转速200rpm，培养周期18h，待残糖降至1g/L，菌型均匀且无菌度合格后，将二级种子移入三级发酵罐，接种量为7.5％。
三级发酵培养基组分为：氯化铵4.2g/L，蛋白胨0.9g/L，味精4g/L，玉米浆4.5g/L，葡萄糖12.5g/L，磷酸二氢钠3g/L，三氯化铁1.1g/L，硫酸镁7.5g/L，氯化钾2.3g/L，硫酸铜0.09g/L，辅液IV。其中辅液IV组分为：盐酸硫胺2g/L，核黄素2.1g/L，吡哆素12.5g/L，叶酸1g/L，烟酸14g/L，烟酸胺14g/L，泛酸钙0.3g/L，苯丙氨酸0.5g/L，茄尼醇3.75g/L。
先在配料罐中加入少于配料体积的水，开搅拌，然后逐次加入除辅液IV外培养基其它组分，待搅拌均匀后用泵打入大罐中，再用水清洗配料罐后一并打入发酵罐后加入至所需要的体积，于121℃灭菌30min后冷却至培养温度并通气保压。辅液IV放入小罐中于120℃灭20min后降温通无菌空气保压，接种前通过压差法将辅液IV全部压入三级发酵罐中，用量为0.3％，通过压差法将二级种子压入三级发酵罐中，初始培养条件为罐压0.03MPa，转速65rpm，通气比为vvm 0.44，罐温33℃，初始糖浓度12.5g/L，磷浓度0.35g/L。接种后每隔四个小时取样测糖、磷并镜检观察菌型，前40h糖控制10g/L，磷0.25g/L，后期至发酵结束糖控制4.5g/L，磷控制0.12g/L，过程中通过补加液氨控制pH 7.2。
发酵初期，菌型为小球，菌体出现二分裂时vvm提高至0.51，在菌体有出现短棒状时vvm提至0.57，罐压0.04Mpa，转速提高至85rpm。待菌型由短棒状开始转为弯形时提高通气比至vvm 0.64，罐压为0.45Mpa，转速提高至100rpm。待菌型由弯形转变为大圆球形时vvm降低至0.55，罐压降至0.035Mpa，待辅酶Q10含量增长减缓，糖耗速度明显减慢，菌体染色浅，残糖＜1g/L后可以停止发酵。
最终发酵88h，辅酶Q10产量达2900mg/L，干重达90g/L。
实施例3：
将辅酶Q10保藏菌株CGMCCNo.4497进行活化三代后挑取平板上外观圆润饱满、边缘光滑、颜色较深的单菌落稀释涂布后接于平板培养基培养。平板培养基组分为：葡萄糖4g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨3g/L，琼脂粉3g/L，pH 7.2。培养条件为32℃培养5天，待单菌落外观圆润饱满、边缘光滑、颜色较深时即可接入母瓶进行培养。
母瓶培养基组分为：氯化铵2.5g/L，蛋白胨1.5g/L，味精1.2g/L，玉米浆1.2g/L，葡萄糖6g/L，磷酸氢二钠0.55g/L，磷酸二氢钠0.55g/L，三氯化铁0.12g/L，硫酸镁2.2g/L，氯化钾2.2g/L，硫酸铜0.06g/L，氯化锌0.0014g/L，碳酸氢钙7.2g/L，辅液I。其中辅液I组分为：盐酸硫胺3g/L，核黄素2.4g/L，吡哆素15g/L，叶酸1.5g/L，烟酸16g/L，烟酸胺16g/L，泛酸钙0.6g/L，苯丙氨酸1.2g/L，茄尼醇8g/L。除辅液I之外于121℃灭30min，辅液I于118℃灭25min，按体积比0.6％加到母瓶培养基中。
挑取25个外观形态饱满的单菌落放于装有14mL的无菌水，充分打散，每个母瓶接3.2mL菌悬液，母瓶培养条件为转速240rpm，温度32℃，培养时间25h，待残糖为1.5g/L时按10％接种量接入一级种子罐。
一级种子罐培养组分为：氯化铵4g/L，蛋白胨1.6g/L，味精1.8g/L，玉米浆1.8g/L，葡萄糖9.6g/L，磷酸氢二钠0.8g/L，磷酸二氢钠0.8g/L，三氯化铁0.14g/L，硫酸镁3.2g/L，氯化钾2.4g/L，硫酸铜0.06g/L，氯化锌0.00014g/L，碳酸氢钙7.2g/L，辅液II。其中辅液II组分为：盐酸硫胺15g/L，核黄素1.5g/L，吡哆素2.5g/L，叶酸0.75g/L，烟酸12g/L，烟酸胺12g/L，泛酸钙0.45g/L，苯丙氨酸0.6g/L，茄尼醇9g/L。
消前用液氨将一级种子培养基pH调至6.7，除辅液II之外于121℃灭30min后降至培养温度并通空气保压。辅液II于118℃灭28min。移种前将母瓶的菌液和辅液II分别装进耐压容器中，在火焰保护下用压差法将消好的辅液II和母瓶菌液压入一级种子罐，接种量为10％，辅液II用量为0.8％。一级种子罐培养条件为0.04MPa，通气比为vvm 0.8，罐温34℃，转速220rpm，培养时间为24h。待残糖降至1.5g/L，菌型均匀且无菌度合格后，将一级种子罐通过压差法接入二级种子罐，接种量为10％。
二级培养基组分为氯化铵3.8g/L，蛋白胨3.2g/L，味精1.2g/L，玉米浆1.2g/L，葡萄糖15g/L，磷酸氢二钠1.2g/L，磷酸二氢钠1.2g/L，三氯化铁0.25g/L，硫酸镁6g/L，氯化钾2.4g/L，硫酸铜0.06g/L，氯化锌0.0015g/L，碳酸氢钙7.2g/L，辅液III。其中辅液III组分为盐酸硫胺20g/L，核黄素3g/L，吡哆素4g/L，叶酸1.0g/L，烟酸25g/L，烟酸胺25g/L，泛酸钙0.004g/L，苯丙氨酸0.006g/L，茄尼醇0.08g/L。
消前用液氨将二级种子培养基pH调至6.7，除辅液III之外于121℃灭30min后降至培养温度并通无菌空气保压，辅液III放入小罐中于120℃灭25min后降温通无菌空气保压。在一级种子移入二级种子罐前先将辅液III通过压差法全部移入二级种子罐，辅液III的用量相对于接后的0.4％。二级种子罐培养条件为罐压0.04MPa，通气比vvm 0.8，罐温为34℃，转速220rpm，培养周期24h，待残糖降至1.5g/L，菌型均匀且无菌度合格后，将二级种子移入三级发酵罐，接种量为10％。
三级发酵培养基组分为：氯化铵34.8g/L，蛋白胨1.2g/L，味精6.0g/L，玉米浆6.0g/L，葡萄糖15g/L，磷酸二氢钠3.5g/L，三氯化铁1.4g/L，硫酸镁9g/L，氯化钾3.0g/L，硫酸铜0.12g/L，辅液IV。其中辅液IV组分为：盐酸硫胺3g/L，核黄素2.4g/L，吡哆素15g/L，叶酸1.5g/L，烟酸16g/L，烟酸胺16g/L，泛酸钙0.45g/L，苯丙氨酸0.75g/L，茄尼醇5g/L。
先在配料罐中加入少于配料体积的水，开搅拌，然后逐次加入除辅液IV培养基的其它组分，待搅拌均匀后用泵打入大罐中，再用水清洗配料罐后一并打入发酵罐后加入至所需要的体积，于121℃灭菌30min后冷却至培养温度并通气保压。辅液IV放入小罐中于120℃灭20min后降温通无菌空气保压，接种前通过压差法将辅液IV全部压入三级发酵罐中，用量为0.45％，通过压差法将二级种子压入三级发酵罐中，初始培养条件为罐压0.035MPa，转速70rpm，vvm0.46，罐温34℃，初始糖浓度15g/L，磷浓度0.4g/L。接种后每隔四个小时取样测糖、磷并镜检观察菌型，前40h糖控制12g/L，磷0.3g/L，后期至发酵结束糖控制6g/L，磷控制0.15g/L，过程中通过补加液氨控制pH 7.4。
发酵初期，菌型为小球，菌体出现二分裂时vvn提高至0.54，在菌体有出现短棒状时vvm提至0.6，罐压0.04Mpa，转速提高至90rpm。待菌型由短棒状开始转为弯形时提高通气比至vvm 0.68，罐压为0.05Mpa，转速提高至105rpm。待菌型由弯形转变为大圆球形时vvm降低至0.58，罐压降至0.04Mpa，待辅酶Q10含量增长减缓，糖耗速度明显减慢，菌体染色浅，残糖＜1.5g/L后可以停止发酵。
最终发酵88h，辅酶Q10产量达3500mg/L，干重达110g/L。
实施例4：对照例
将辅酶Q10保藏菌株CGMCCNo.4497进行活化三代后挑取平板上外观圆润饱满、边缘光滑、颜色较深的单菌落稀释涂布后接于平板培养基培养。平板培养基组分为：葡萄糖4g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨3g/L，琼脂粉3g/L，pH 7.2。培养条件为32℃培养5天，待单菌落外观圆润饱满、边缘光滑、颜色较深时即可接入母瓶进行培养。
母瓶培养基组分为：氯化铵2.5g/L，蛋白胨1.5g/L，味精1.2g/L，玉米浆1.2g/L，葡萄糖6g/L，磷酸氢二钠0.55g/L，磷酸二氢钠0.55g/L，三氯化铁0.12g/L，硫酸镁2.2g/L，氯化钾2.2g/L，硫酸铜0.06g/L，氯化锌0.0014g/L，碳酸氢钙7.2g/L，辅液I。其中辅液I组分为：盐酸硫胺3g/L，核黄素2.4g/L，吡哆素15g/L，叶酸1.5g/L，烟酸16g/L，烟酸胺16g/L，泛酸钙0.6g/L，苯丙氨酸1.2g/L，茄尼醇8g/L。除辅液I之外于121℃灭30min，辅液I于118℃灭25min，按体积比0.6％加到母瓶培养基中。
挑取25个外观形态饱满的单菌落放于装有14mL的无菌水，充分打散，每个母瓶接3.2mL菌悬液，母瓶培养条件为转速240rpm，温度32℃，培养时间25h，待残糖为1.5g/L时按10％接种量接入一级种子罐。
一级种子罐培养组分为：氯化铵4g/L，蛋白胨1.6g/L，味精1.8g/L，玉米浆1.8g/L，葡萄糖9.6g/L，磷酸氢二钠0.8g/L，磷酸二氢钠0.8g/L，三氯化铁0.14g/L，硫酸镁3.2g/L，氯化钾2.4g/L，硫酸铜0.06g/L，氯化锌0.00014g/L，碳酸氢钙7.2g/L，辅液II。其中辅液II组分为：盐酸硫胺15g/L，核黄素1.5g/L，吡哆素2.5g/L，叶酸0.75g/L，烟酸12g/L，烟酸胺12g/L，泛酸钙0.45g/L，苯丙氨酸0.6g/L，茄尼醇9g/L。
消前用液氨将一级种子培养基pH调至6.7，除辅液II之外于121℃灭30min后降至培养温度并通空气保压。辅液II于118℃灭28min。移种前将母瓶的菌液和辅液II分别装进耐压容器中，在火焰保护下用压差法将消好的辅液II和母瓶菌液压入一级种子罐，接种量为10％，辅液II用量为0.8％。一级种子罐培养条件为0.04MPa，通气比为vvm 0.8，罐温34℃，转速220rpm，培养时间为24h。待残糖降至1.5g/L，菌型均匀且无菌度合格后，将一级种子罐通过压差法接入二级种子罐，接种量为10％。
二级培养基组分为氯化铵3.8g/L，蛋白胨3.2g/L，味精1.2g/L，玉米浆1.2g/L，葡萄糖15g/L，磷酸氢二钠1.2g/L，磷酸二氢钠1.2g/L，三氯化铁0.25g/L，硫酸镁6g/L，氯化钾2.4g/L，硫酸铜0.06g/L，氯化锌0.0015g/L，碳酸氢钙7.2g/L，辅液III。其中辅液III组分为盐酸硫胺20g/L，核黄素3g/L，吡哆素4g/L，叶酸1.0g/L，烟酸25g/L，烟酸胺25g/L，泛酸钙0.004g/L，苯丙氨酸0.006g/L，茄尼醇0.08g/L。
消前用液氨将二级种子培养基pH调至6.7，除辅液III之外于121℃灭30min后降至培养温度并通无菌空气保压，辅液III放入小罐中于120℃灭25min后降温通无菌空气保压。在一级种子移入二级种子罐前先将辅液III通过压差法全部移入二级种子罐，辅液III的用量相对于接后的0.4％。二级种子罐培养条件为罐压0.04MPa，通气比vvm 0.8，罐温为34℃，转速220rpm，培养周期24h，待残糖降至1.5g/L，菌型均匀且无菌度合格后，将二级种子移入三级发酵罐，接种量为10％。
三级发酵培养基组分为：氯化铵34.8g/L，蛋白胨1.2g/L，味精6.0g/L，玉米浆6.0g/L，葡萄糖15g/L，磷酸二氢钠3.5g/L，三氯化铁1.4g/L，硫酸镁9g/L，氯化钾3.0g/L，硫酸铜0.12g/L，辅液IV。其中辅液IV组分为：盐酸硫胺3g/L，核黄素2.4g/L，吡哆素15g/L，叶酸1.5g/L，烟酸16g/L，烟酸胺16g/L，泛酸钙0.45g/L，苯丙氨酸0.75g/L，茄尼醇5g/L。
先在配料罐中加入少于配料体积的水，开搅拌，然后逐次加入除辅液IV培养基的其它组分，待搅拌均匀后用泵打入大罐中，再用水清洗配料罐后一并打入发酵罐后加入至所需要的体积，于121℃灭菌30min后冷却至培养温度并通气保压。辅液IV放入小罐中于120℃灭20min后降温通无菌空气保压，接种前通过压差法将辅液IV全部压入三级发酵罐中，用量为0.45％，通过压差法将二级种子压入三级发酵罐中，初始培养条件为罐压0.035MPa，转速70rpm，vvm0.46，罐温34℃，初始糖浓度15g/L，磷浓度0.4g/L。接种后每隔四个小时取样测糖、磷并镜检观察菌型，前40h糖控制12g/L，磷0.3g/L，后期至发酵结束糖控制6g/L，磷控制0.15g/L，过程中通过补加液氨控制pH 7.4。
发酵培养至15h时vvm提高至0.54，28h时vvm提高至0.6，罐压0.04Mpa，转速提高至90h。45h时通气比提高至0.68vvm，罐压0.05Mpa，转速提高至105rpm。64h时vvm降至0.58，罐压降至0.04Mpa，待辅酶Q10含量增长减缓，糖耗速度明显减慢，菌体染色浅，残糖＜1.5g/L后可以停止发酵。
最终发酵88h，辅酶Q10产量达2400mg/L，干重达90g/L。
实施例1-4所用的培养基配方、接种量以及发酵温度相同，并且通气比、转速、罐压调整的幅度都相同，唯一不同是通气量、转速、罐压是调整标准不同，实施例1-3均按照菌型去调整相关工艺参数，实施例4(对照例)按照固定的时间去调整。从结果可以看出，实施例4按照固定时间去调整通气比、转速、罐压，其辅酶Q10产量要偏低，而实施例1-3根据菌型去调整相关工艺参数，其辅酶Q10产量要远远高于前者，所带来的技术效果是显著的。根据固定时间调整相关工艺参数的所要进行下一步调整方向不够明确，没有一个固定的标准，很可能因为发酵过程中的一些异常因素而影响最终的工艺调整方向的判断。

Claims (1)

1.一种辅酶Q10发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)菌种传代：采用平板培养进行菌种传代，从平板上挑取外观圆润、边缘光滑、颜色较深的单菌落装于有10～14mL无菌水试管后充分打散，稀释到一定梯度后吸取少量菌液于平板上进行涂布，于32～34℃培养5～7天；
2)母瓶培养：从平板上挑取25～30个外观圆润、边缘光滑、颜色较深的单菌落于装有10～14mL无菌水试管充分打散，每个母瓶接2.3～3.2mL菌悬液，培养条件为转速220～240rpm，温度32～34℃，培养25～30h；
3)一级种子培养：待母瓶残糖降至0.5～1.5g/L时按接种量5～10％接入一级种子罐中，一级种子罐培养条件为罐压0.03～0.04MPa，vvm 0.6～0.8，罐温为32～34℃，转速180～220rpm，培养周期16～24h；
4)二级种子培养：待一级种子残糖降至0.5～1.5g/L时按接种量为5～10％接入二级种子罐，二级种子罐培养条件为罐压0.03～0.04MPa，vvm 0.6～0.8，罐温为32～34℃，转速180～220rpm，培养周期16～24h；
5)三级发酵培养：待二级种子残糖降至0.5～1.5g/L时按接种量为5～10％接入三级发酵罐中，三级发酵罐初始培养条件为0.03～0.035MPa，转速60～70rpm，vvm 0.42～0.46，罐温32～34℃，初始糖浓度10～15g/L，磷浓度0.3～0.4g/L，接种后每隔四个小时取样测糖、磷并镜检观察菌型，前40h糖控制7～12g/L，磷0.2～0.3g/L，后期至发酵结束糖控制3～6g/L，磷控制0.1～0.15g/L，通过补加液氨控制pH 7.0～7.4；
发酵初期，菌型为小球，菌体出现二分裂时vvm提高至0.48～0.54，在菌体有出现短棒状时vvm提至0.54～0.6，罐压0.035～0.04Mpa，转速提高至75～90rpm，待菌型由短棒状开始转为弯形时提高通气比至vvm 0.6～0.68，罐压为0.45～0.5Mpa，转速提高至95～105rpm，待菌型由弯形转变为大圆球形时vvm降低至0.52～0.58，罐压降至0.035～0.04Mpa，待辅酶Q10含量增长减缓，糖耗速度明显减慢，菌体染色浅，残糖＜0.5～1.5g/L后停止发酵；
其中，采用的菌种为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)，已于2010年12月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.4497；
所述的平板培养基组分为：葡萄糖2.0～4.0g/L，酵母粉1.0～3.0g/L，蛋白胨1.0～3.0g/L，琼脂粉20～30g/L，消前pH6.8～7.2，于121℃灭菌25～30min；
所述的母瓶培养基的组分为：氯化铵1.7～2.5g/L，蛋白胨0.7～1.5g/L，味精0.4～1.2g/L，玉米浆0.4～1.2g/L，葡萄糖2～6g/L，磷酸氢二钠0.35～0.55g/L，磷酸二氢钠0.35～0.55g/L，三氯化铁0.08～0.12g/L，硫酸镁1.4～2.2g/L，氯化钾1.4～2.2g/L，硫酸铜0.02～0.06g/L，氯化锌0.0006～0.00014g/L，碳酸氢钙5.6～7.2g/L，辅液I；其中辅液I组分为：盐酸硫胺1～3g/L，核黄素1.8～2.4g/L，吡哆素10～15g/L，叶酸0.5～1.5g/L，烟酸12～16g/L，烟酸胺12～16g/L，泛酸钙0.2～0.6g/L，苯丙氨酸0.4～1.2g/L，茄尼醇4～8g/L；除辅液I之外于121℃灭25～30min，辅液I于118℃灭20～25min，按体积比0.2～0.6％加到母瓶培养基中；
一级种子培养基组分为：氯化铵2～4g/L，蛋白胨0.8～1.6g/L，味精0.6～1.8g/L，玉米浆0.6～1.8g/L，葡萄糖4.8～9.6g/L，磷酸氢二钠0.4～0.8g/L，磷酸二氢钠0.4～0.8g/L，三氯化铁0.08～0.14g/L，硫酸镁1.6～3.2g/L，氯化钾1.6～2.4g/L，硫酸铜0.02～0.06g/L，氯化锌0.0006～0.00014g/L，碳酸氢钙5.6～7.2g/L，辅液II；其中辅液II组分为：盐酸硫胺10～15g/L，核黄素0.5～1.5g/L，吡哆素1.5～2.5g/L，叶酸0.25～0.75g/L，烟酸6～12g/L，烟酸胺6～12g/L，泛酸钙0.15～0.45g/L，苯丙氨酸0.2～0.6g/L，茄尼醇3～9g/L；消前用液氨将一级培养基初始pH调至6.4～6.7，除辅液II之外于121℃灭25～30min后降至培养温度并通空气保压，辅液II装容器于118℃灭20～28min；
二级种子培养基组分为氯化铵2.6～3.8g/L，蛋白胨1.6～3.2g/L，味精0.6～1.2g/L，玉米浆0.6～1.2g/L，葡萄糖10～15g/L，磷酸氢二钠0.6～1.2g/L，磷酸二氢钠0.6～1.2g/L，三氯化铁0.15～0.25g/L，硫酸镁3～6g/L，氯化钾1.6～2.4g/L，硫酸铜0.02～0.06g/L，氯化锌0.0005～0.0015g/L，碳酸氢钙5.6～7.2g/L，辅液III；其中辅液III组分为盐酸硫胺10～20g/L，核黄素1.5～3g/L，吡哆素2～4g/L，叶酸0.4～1.0g/L，烟酸15～25g/L，烟酸胺15～25g/L，泛酸钙0.001～0.004g/L，苯丙氨酸0.002～0.006g/L，茄尼醇0.04～0.08g/L；消前用液氨将二级种子培养基初始pH调至6.4～6.7，除辅液III之外于121℃灭25～30min后降至培养温度并通无菌空气保压，辅液III放入小罐中于120℃灭20～25min；
三级培养基组分为氯化铵3.6～4.8g/L，蛋白胨0.6～1.2g/L，味精2.0～6.0g/L，玉米浆3.0～6.0g/L，葡萄糖10～15g/L，磷酸二氢钠2.5～3.5g/L，三氯化铁0.8～1.4g/L，硫酸镁6～9g/L，氯化钾1.5～3.0g/L，硫酸铜0.06～0.12g/L，辅液IV；其中辅液IV组分为：盐酸硫胺1～3g/L，核黄素1.8～2.4g/L，吡哆素10～15g/L，叶酸0.5～1.5g/L，烟酸12～16g/L，烟酸胺12～16g/L，泛酸钙0.15～0.45g/L，苯丙氨酸0.25～0.75g/L，茄尼醇2.5～5g/L，三级培养基于121～122℃灭菌25～30min，辅液IV于120～121℃灭20～25min。
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