CN102373244B - 一种花生四烯酸的微生物发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种花生四烯酸的微生物发酵方法，将产花生四烯酸的普通被孢霉菌种接于PDA斜面；固料培养基包含液体组分与固料组分，固料组分选择麸皮、大米、小米中的一种或几种，并与液体组分按10：7比例混合，80~100℃蒸煮20~30min，晾干至散开不结团；将新鲜的产花生四烯酸普通被孢霉菌种斜面加15~25mL无菌水洗下孢子，制成孢子悬液，均匀接入固料培养基，24~26℃培养2~3天，作为一级发酵的母种；以200～300ml无菌水洗下上述固料种子表面的孢子，制成孢子悬液，按体积百分比为5~10%接种量接入一级发酵罐，同时通过控制发酵前后期的温度，采用变温培养，以及在发酵过程另外补加2次辅料，促进菌体生长和油脂合成，有效提高了花生四烯酸发酵水平，缩短周期，降低成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种花生四烯酸的微生物发酵方法。
背景技术
花生四烯酸(Arachidonic acid)即全顺5，8，11，14二十碳四烯酸，它是一种多价不饱和脂肪酸，也被称为5，8，11，14-花生酸，简称ARA或AA。
花生四烯酸是一种重要的人体必需脂肪酸，在体内不能自身合成，必须由食物供给，是人体前列腺素合成的重要前体物质，也是人体中含量最高，分布最广的一种多不饱和脂肪酸，主要存在于器官肌肉和血液组织中，与磷脂结合成结构脂类起着重要作用。花生四烯酸在调节心脏兴奋性、参与神经内分泌、促进细胞分裂、抑制血小板凝集、抗炎症、抗癌、抗脂质氧化、促进脑组织发育和保护视力等方面具有独特的生物活性，被广泛应用于食品、化妆品、饲料及其添加剂、婴儿配方奶粉、生物制药等领域。花生四烯酸广泛存在于动物体中，主要来源于动物的肾上腺、肝脏以及沙丁鱼、鸡蛋黄等，但含量较低，一般低于0.2%(wt/wt)。
因人体内的花生四烯酸主要靠从外界摄取，所以加强对花生四烯酸的研究与开发具有十分重要的作用。目前人们主要利用微生物发酵法获得花生四烯酸，而种子的扩大培养是发酵生产的关键步骤，母种质量的优劣对生产质量和产量起着至关重要的作用，但现有技术中生产花生四烯酸油脂的大多数母种都是采用液体发酵培养法，获得的产品中仍然存在着油脂中花生四烯酸含量偏低、微生物生长周期长、培养工艺未达到最优化或发酵所采用的培养基成本高等问题，限制了花生四烯酸的大规模工业化生产。
发明内容
本发明的目的，是要提供一种花生四烯酸的微生物发酵方法，它摒弃传统的液体发酵培养方法，采用固料培养花生四烯酸母种，所获菌种细胞的生长活力强、同步性较好、生理状态稳定，移种至发酵罐后能迅速生长，缩短延迟期，并能保持稳定的产品收得率。
本发明是这样实现的，所述一种花生四烯酸的微生物发酵方法，其步骤如下：
（1）产花生四烯酸普通被孢霉发酵固料种子培养
（ⅰ）菌种活化：采用斜面菌种活化，试管斜面培养基为PDA固体培养基，将产花生四烯酸的普通被孢霉菌种接于PDA斜面，24~26℃培养2~3天。
（ⅱ）固料种子培养基的制备：
固料培养基，包含液体组分与固料组分，其中液体组分包括：葡萄糖 7~10 g/L，酵母粉 0.5~1 g/L，蛋白胨 1~5 g/L，NaNO3 0.3~1.0 g/L，KH2PO4 0.1~1.0 g/L，维生素B1 1~3μg/L，维生素K 1~3μg/L，维生素A 1.5~2.0 μg/L，CuSO2·5H2O 0.6~1.5 μg/L，MnSO4 0.5~1.5 μg/L，ZnSO4·7H2O 1.2~1.8 μg/L，NaBr 0.44~0.66μg/L，pH 6.0~6.4之间；固料组分选择麸皮、大米、小米中的一种或几种，并与液体组分按10：7比例混合，80~100℃蒸煮20~30 min，晾干至散开不结团，按200g/瓶分装进规格为1000mL的K氏瓶中，121℃灭菌30min。
（ⅲ）固料种子的培养：将新鲜斜面菌种加15~25mL无菌水洗下孢子，制成孢子悬液，倒入已灭菌固料培养基，轻摇使其尽量混匀，并于24~26℃培养2~3天，分别于12h和24h各摇匀一次，作为一级发酵的母种。
（2）发酵培养
（ⅰ）发酵培养基组分包括：葡萄糖20~25 g/L，酵母粉10~15 g/L，蛋白胨5~10 g/L，氯化钠10~15 g/L，硫酸铵5~8 g/L，KH2PO4 3~6 g/L，CuSO2·5H2O 1.2~1.8 μg/L，MnSO4 1.6~3.2 μg/L，ZnSO4·7H2O 2.4~3.5 μg/L，KNO3 0.66~1.5 μg/L，NaBr 0.88~1.5 μg/L，pH 5.8~6.0，121℃灭菌30min。
（ⅱ）摇瓶发酵培养，即小样发酵培养
以200～300ml无菌水洗下上述固料种子表面的孢子，制成孢子悬液，按体积百分比为5~10%接种量接入摇瓶发酵培养基，培养温度为26~30℃，摇床转速150~200r/min，培养3~5天；发酵结束后收集湿菌体，烘干后提取干菌体中的油脂进行气相色谱检测，检测花生四烯酸收得率。
（ⅲ）发酵罐发酵培养，即中样发酵培养：
以200～300ml无菌水洗下上述固料种子表面的孢子，制成孢子悬液，按体积百分比为5~10%接种量接入一级发酵罐，发酵温度为26~30℃，培养1.5~2.5天；一级发酵至二级发酵的接种量体积百分比为10~20%，发酵温度前期控制在26~30℃，促进菌体生长，后期为促进花生四烯酸油脂合成，将温度下调至18~20℃，培养周期为3~4.5天；为保证菌体生长和合成油脂的需要，整个发酵过程除自动流加经118℃灭菌 25min的重量百分比为40%葡萄糖溶液，以及重量百分比为28%氨水用于控制还原糖在前40h为6～8g/L、40h之后为3～8g/L以及pH为5.8～6.0外，另外进行2次手动补加辅料，补加辅料时间分别为发酵36h和69h，辅料分别由葡萄糖、大豆饼粉、玉米浆粉、橄榄油、磷酸氢二钾及各类微量元素组成，微量元素可以是维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、烟酸、烟酸胺、泛酸钙、叶酸、生物素、叶绿素中的一种或几种的组合；发酵结束后收集湿菌体，烘干后提取干菌体中的油脂进行气相色谱检测，检测花生四烯酸收得率。
本发明所述辅料含量为：葡萄糖10~20 g/L，大豆饼粉8~10 g/L, 玉米浆粉15~20 g/L，橄榄油8~10 g/L，磷酸氢二钾2~4 g/L，维生素B1 20~30 μg/L、维生素B2 2~5 μg/L、维生素B6 6~8 μg/L、维生素B12 1~3 μg/L、烟酸25~30 μg/L、烟酸胺15~25 μg/L、泛酸钙1~3 μg/L、叶酸7~10 μg/L、生物素12~16 μg/L、叶绿素3~6 μg/L；补加辅料体积按发酵液中控制含还原糖量4g/L及pH5.8～6.0为准。
本发明的有益效果是，通过固料培养获得的花生四烯酸母种，菌种细胞的生长活力强、同步性较好、生理状态稳定；通过对发酵工艺的优化，缩短发酵级数，简化发酵工艺，有效降低发酵生产成本，花生四烯酸产量稳定，有较高的收得率。
具体实施方式
本发明所述一种花生四烯酸的微生物发酵方法，由以下实施例作进一步论述。
首先进行产花生四烯酸普通被孢霉发酵固料种子培养：
（ⅰ）菌种活化：采用斜面菌种活化，试管斜面培养基为PDA固体培养基，将产花生四烯酸的普通被孢霉菌种接于PDA斜面，24~26℃培养2~3天；
（ⅱ）固料种子培养基的制备：
固料培养基，包含液体组分与固料组分，其中液体组分包括：葡萄糖 7~10 g/L，酵母粉 0.5~1 g/L，蛋白胨 1~5 g/L，NaNO3 0.3~1.0 g/L，KH2PO4 0.1~1.0 g/L，维生素B1 1~3μg/L，维生素K 1~3μg/L，维生素A 1.5~2.0 μg/L，CuSO2·5H2O 0.6~1.5 μg/L，MnSO4 0.5~1.5 μg/L，ZnSO4·7H2O 1.2~1.8 μg/L， NaBr 0.44~0.66μg/L，pH 6.0~6.4之间；固料组分选择麸皮、大米、小米中的一种或几种，并与液体组分按10：7比例混合，80~100℃蒸煮20~30 min，晾干至散开不结团，按200g/瓶分装进规格为1000mL的K氏瓶中，121℃灭菌30min；
（ⅲ）固料种子的培养：将新鲜斜面菌种加15~25mL无菌水洗下孢子，制成孢子悬液，倒入已灭菌固料培养基，轻摇使其尽量混匀，并于24~26℃培养2~3天，分别于12h和24h各摇匀一次，作为一级发酵的母种。
以下是不同体积的发酵罐培养花生四烯酸的情况分析。
（一）花生四烯酸固料种100L罐发酵培养
新鲜斜面→固料种→30L种子罐→100L发酵罐→GC检测发酵水平。具体过程如下：
新鲜斜面与固料种子的培养同上；以200～300ml无菌水洗下上述固料种子表面的孢子，制成孢子悬液，将固料种子孢子悬液按5%（v/v）接种量接入30L种子罐，接后体积15L，26~30℃，pH5.8~6.0，150r/min，0.03~0.05MPa,通气量0.8~1.1m3/h培养2天；将种子液按10%（v/v）接种量压入100L发酵罐中，接后体积60L，26~30℃，pH5.8~6.0，150r/min，0.03~0.05MPa，通气量1.8~2.8m3/h培养2天，后2.5天发酵温度调为18~20℃。在发酵40h后每8h取样检测花生四烯酸含量。
整个发酵过程除自动流加40%（w/v）葡萄糖溶液（118℃灭菌 25min）和28%（w/v）氨水控制还原糖在前40h为6～8g/L、40h之后为3～8g/L以及pH为5.8～6.0外，另外进行2次手动补料，补料时间分别为发酵36h和69h，辅料分别由葡萄糖、大豆饼粉、玉米浆粉、橄榄油、磷酸氢二钾及各类微量元素组成，微量元素可以是维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、烟酸、烟酸胺、泛酸钙、叶酸、生物素、叶绿素中的一种或几种的组合。其中辅料含量为：葡萄糖10~20 g/L，大豆饼粉8~10 g/L, 玉米浆粉15~20 g/L，橄榄油8~10 g/L，磷酸氢二钾2~4 g/L，维生素B1 20~30 μg/L、维生素B2 2~5 μg/L、维生素B6 6~8 μg/L、维生素B12 1~3 μg/L、烟酸25~30 μg/L、烟酸胺15~25 μg/L、泛酸钙1~3 μg/L、叶酸7~10 μg/L、生物素12~16 μg/L、叶绿素3~6 μg/L。补料体积按发酵液中控制含还原糖量4g/L，pH5.8～6.0为准。发酵结束后收集湿菌体，烘干后提取干菌体中的油脂进行气相色谱检测。其检测结果是，固料种100L发酵培养获得的干菌体收率为89.8 g/L，油脂含量47.8%，花生四烯酸产量为21.3 g/L。发酵结果体现以下优点：①菌种细胞的生长活力强、同步性较好，移种至发酵罐后能迅速生长，延迟期短；②生理状态稳定，保持稳定的生产能力；③简化扩种工艺，缩短发酵周期。
（二）花生四烯酸固料种1000L罐发酵培养
新鲜斜面→固料种→100L发酵罐→1000L发酵罐→GC检测发酵水平。具体过程如下：
（1）菌种、菌种活化、固料种子孢子悬液的制备同上。
（2）二级种子罐（100L）：将制备好的固料种子孢子悬液按5%（v/v）接种量接入二级种子罐，接后体积60L，26~30℃，pH5.8~6.0，150r/min，0.03~0.05MPa，通气量1.8~2.8m3/h的条件下培养2天；
（3）三级发酵罐（1000L）：将种子液按10%（v/v）接种量压入1000L三级发酵罐中，接后体积600L，26~30℃，pH5.8~6.0，150r/min，0.02~0.05MPa，通气量18~28m3/h培养2天，后2.5天发酵温度调为18~20℃。发酵过程流加葡萄糖溶液、氨水，使还原糖、pH值等指标控制在一定范围内，培养4.5天放罐。
整个发酵过程除自动流加40%（w/v）葡萄糖溶液（118℃灭菌 25min）和28%（w/v）氨水控制还原糖在前40h为6～8g/L、40h之后为3～8g/L以及pH为5.8～6.0外，另外进行2次手动补加辅料，补加辅料时间分别为发酵36h和69h，辅料分别由葡萄糖、大豆饼粉、玉米浆粉、橄榄油、磷酸氢二钾及各类微量元素组成，微量元素可以是维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、烟酸、烟酸胺、泛酸钙、叶酸、生物素、叶绿素中的一种或几种的组合。其中辅料含量为：葡萄糖10~20 g/L，大豆饼粉8~10 g/L, 玉米浆粉15~20 g/L，橄榄油8~10 g/L，磷酸氢二钾2~4 g/L，维生素B1 20~30 μg/L、维生素B2 2~5 μg/L、维生素B6 6~8 μg/L、维生素B12 1~3 μg/L、烟酸25~30 μg/L、烟酸胺15~25 μg/L、泛酸钙1~3 μg/L、叶酸7~10 μg/L、生物素12~16 μg/L、叶绿素3~6 μg/L。补料体积按发酵液中控制含还原糖量4g/L，pH5.8～6.0为准。发酵结束后收集湿菌体，烘干后提取干菌体中的油脂进行气相色谱检测。检测结果显示，固料种1000L罐花生四烯酸发酵获得的干菌体收率为90.1g/L，油脂含量48.8%，花生四烯酸产量为23.1 g/L。发酵结果体现以下优点：菌种细胞的生长活力强、同步性较好，移种至发酵罐后能迅速生长，延迟期短；生理状态稳定，保持稳定的生产能力，产能高；简化扩种工艺，降低生产成本。
本发明固料种与传统的液体种花生四烯酸摇瓶发酵的比较
（一）固料种摇瓶发酵流程：新鲜斜面→固料种→摇瓶发酵→油脂提取→GC检测发酵水平。
具体过程如下：
菌种活化：将产花生四烯酸的普通被孢霉菌种接于PDA斜面，24~26℃培养2~3天。固料种子的培养同上。
将备好的固料种子加入300mL无菌水洗下固料表面的孢子制成孢子悬液，按10%（v/v）接种量接入摇瓶发酵培养基，装液量为500mL摇瓶装入50mL培养液。培养温度为26~30℃，摇床转速150r/min，培养72h。发酵结束后收集湿菌体，烘干后提取干菌体中的油脂进行气相色谱检测。
（二）液体种摇瓶发酵流程：新鲜斜面→一级种子活化培养→二级摇瓶发酵→油脂提取→GC检测发酵水平。
具体过程如下：
斜面菌种孢子悬液的制备同上；将备好的斜面孢子悬液按1.5%（v/v）接种量接入一级摇瓶种子培养基，26~30℃，150r/min振荡培养24h；将一级摇瓶种子按10%（v/v）移种量移接到二级摇瓶发酵培养基，26~30℃，150r/min振荡培养48h，摇瓶装液量均为500mL摇瓶装入50mL培养液。发酵结束后收集湿菌体，烘干后提取干菌体中的油脂进行气相色谱检测。
固料种与液体种摇瓶发酵结果如表1所示：
表1
表1中液体种与固料种摇瓶发酵结果表明：固料种体现以下优点：①菌种活力较强，生物量较高；②油脂和花生四烯酸含量及花生四烯酸产量均有所提高；③简化种子工艺。
Claims (2)
1.一种花生四烯酸的微生物发酵方法，其步骤如下：
（1）产花生四烯酸普通被孢霉发酵固料种子培养
（ⅰ）菌种活化：采用斜面菌种活化，试管斜面培养基为PDA固体培养基，将产花生四烯酸的普通被孢霉菌种接于PDA斜面，24~26℃培养2~3天；
（ⅱ）固料种子培养基的制备：
固料培养基，包含液体组分与固料组分，其中液体组分包括：葡萄糖 7~10 g/L，酵母粉 0.5~1 g/L，蛋白胨 1~5 g/L，NaNO3 0.3~1.0 g/L，KH2PO4 0.1~1.0 g/L，维生素B1 1~3μg/L，维生素K 1~3μg/L，维生素A 1.5~2.0 μg/L，CuSO2·5H2O 0.6~1.5 μg/L，MnSO4 0.5~1.5 μg/L，ZnSO4·7H2O 1.2~1.8 μg/L，NaBr 0.44~0.66μg/L，pH 6.0~6.4之间；固料组分选择麸皮、大米、小米中的一种或几种，并与液体组分按10：7比例混合，80~100℃蒸煮20~30 min，晾干至散开不结团，按200g/瓶分装进规格为1000mL的K氏瓶中，121℃灭菌30min；
（ⅲ）固料种子的培养：将新鲜斜面菌种加15~25mL无菌水洗下孢子，制成孢子悬液，倒入已灭菌固料培养基，轻摇使其尽量混匀，并于24~26℃培养2~3天，分别于12h和24h各摇匀一次，作为一级发酵的母种；
（2）发酵培养
（ⅰ）发酵培养基组分包括：葡萄糖20~25 g/L，酵母粉10~15 g/L，蛋白胨5~10 g/L，氯化钠10~15 g/L，硫酸铵5~8 g/L，KH2PO4 3~6 g/L，CuSO2·5H2O 1.2~1.8 μg/L，MnSO4 1.6~3.2 μg/L，ZnSO4·7H2O 2.4~3.5 μg/L，KNO3 0.66~1.5 μg/L，NaBr 0.88~1.5 μg/L，pH 5.8~6.0，121℃灭菌30min；
（ⅱ）摇瓶发酵培养，即小样发酵培养
以200～300ml无菌水洗下固料种子表面的孢子制成孢子悬液，按体积百分比为5~10%接种量接入摇瓶发酵培养基，培养温度为26~30℃，摇床转速150~200r/min，培养3~5天；发酵结束后收集湿菌体，烘干后提取干菌体中的油脂进行气相色谱检测，检测花生四烯酸收得率。
2.一种花生四烯酸的微生物发酵方法，其步骤如下：
（1）产花生四烯酸普通被孢霉发酵固料种子培养
（ⅰ）菌种活化：采用斜面菌种活化，试管斜面培养基为PDA固体培养基，将产花生四烯酸的普通被孢霉菌种接于PDA斜面，24~26℃培养2~3天；
（ⅱ）固料种子培养基的制备：
固料培养基，包含液体组分与固料组分，其中液体组分包括：葡萄糖 7~10 g/L，酵母粉 0.5~1 g/L，蛋白胨 1~5 g/L，NaNO3 0.3~1.0 g/L，KH2PO4 0.1~1.0 g/L，维生素B1 1~3μg/L，维生素K 1~3μg/L，维生素A 1.5~2.0 μg/L，CuSO2·5H2O 0.6~1.5 μg/L，MnSO4 0.5~1.5 μg/L，ZnSO4·7H2O 1.2~1.8 μg/L， NaBr 0.44~0.66μg/L，pH 6.0~6.4之间；固料组分选择麸皮、大米、小米中的一种或几种，并与液体组分按10：7比例混合，80~100℃蒸煮20~30 min，晾干至散开不结团，按200g/瓶分装进规格为1000mL的K氏瓶中，121℃灭菌30min；
（ⅲ）固料种子的培养：将新鲜斜面菌种加15~25mL无菌水洗下孢子，制成孢子悬液，倒入已灭菌固料培养基，轻摇使其尽量混匀，并于24~26℃培养2~3天，分别于12h和24h各摇匀一次，作为一级发酵的母种；
（2）发酵培养
（ⅰ）发酵培养基组分包括：葡萄糖20~25 g/L，酵母粉10~15 g/L，蛋白胨5~10 g/L，氯化钠10~15 g/L，硫酸铵5~8 g/L，KH2PO4 3~6 g/L，CuSO2·5H2O 1.2~1.8 μg/L，MnSO4 1.6~3.2 μg/L，ZnSO4·7H2O 2.4~3.5 μg/L，KNO3 0.66~1.5 μg/L，NaBr 0.88~1.5 μg/L，pH 5.8~6.0，121℃灭菌30min；
（ⅱ）发酵罐发酵培养，即中样发酵培养：
以200～300ml无菌水洗下固料种子表面的孢子制成孢子悬液，按体积百分比为5~10%接种量接入一级发酵罐，发酵温度为26~30℃，培养1.5~2.5天；一级发酵至二级发酵的接种量体积百分比为10~20%，发酵温度前期控制在26~30℃，促进菌体生长，后期为促进花生四烯酸油脂合成，将温度下调至18~20℃，培养周期为3~4.5天；为保证菌体生长和合成油脂的需要，整个发酵过程除自动流加经118℃灭菌 25min的重量百分比为40%葡萄糖溶液，以及重量百分比为28%氨水用于控制还原糖在前40h为6～8g/L、40h之后为3～8g/L以及pH为5.8～6.0外，另外进行2次手动补加辅料，补加辅料时间分别为发酵36h和69h，所述辅料含量为：葡萄糖10~20 g/L，大豆饼粉8~10 g/L, 玉米浆粉15~20 g/L，橄榄油8~10 g/L，磷酸氢二钾2~4 g/L，维生素B1 20~30 μg/L、维生素B2 2~5 μg/L、维生素B6 6~8 μg/L、维生素B12 1~3 μg/L、烟酸25~30 μg/L、烟酸胺15~25 μg/L、泛酸钙1~3 μg/L、叶酸7~10 μg/L、生物素12~16 μg/L、叶绿素3~6 μg/L；补加辅料体积按发酵液中控制含还原糖量4g/L及pH5.8～6.0为准；发酵结束后收集湿菌体，烘干后提取干菌体中的油脂进行气相色谱检测，检测花生四烯酸收得率。
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