CN101638677A - 发酵法生产花生四烯酸的方法 - Google Patents
发酵法生产花生四烯酸的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101638677A CN101638677A CN200910111655A CN200910111655A CN101638677A CN 101638677 A CN101638677 A CN 101638677A CN 200910111655 A CN200910111655 A CN 200910111655A CN 200910111655 A CN200910111655 A CN 200910111655A CN 101638677 A CN101638677 A CN 101638677A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture medium
- arachidonic
- fermentative production
- add
- seed
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及发酵法生产花生四烯酸方法。其特征是利用麸皮，加水煮沸，加入葡萄糖和KH2PO4，培养出种子培养基；采用产花生四烯酸的普通被孢霉保藏菌种，制成孢子悬液，继续扩大培养，获得发酵法生产花生四烯酸的种子扩大培养基；黄豆加水，浸泡、煮沸，降温至60℃后，加入a－淀粉酶和糖化酶，保温、过滤，得黄豆糖化液；在黄豆糖化液中，加入酵母粉，牛肉膏，NaNO3和KH2PO4，调节pH为6.0－6.4，配制成发酵培养基；在发酵培养基中，加入的种子培养基形成混合培养基进行发酵培养，发酵结束后，抽滤、烘干至恒重、粉碎，石油醚抽提油脂，再经分离纯化油脂得花生四烯酸纯品。本发明具有：原料易购，价格低廉，培养基制配方便，发酵工艺简便，产量在1.35－1.55g/L，适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种发酵法生产花生四烯酸(Arachidonic Acid，简称AA)的方法。
技术背景
花生四烯酸是全顺式Δ-5，8，11，14-二十碳四烯酸，分子式为C20:H32:O2，花生四烯酸属于ω-6脂肪酸，由于人体内不具备相应的酶系统来合成特定的不饱和双键，因此被认为是人体必需脂肪酸。在多数花生四烯酸代谢途径中，它被磷醋化形成细胞膜磷脂，对维持细胞膜结构非常关键。因其含有4个不饱和双键，使得分子具有很大的流动性，即使在0℃以下也能保持液体状态，这也保证了在生理温度下哺乳动物的细胞膜具有一定的流动性。同时它还参与调节各种细胞活动，如调节细胞增殖、细胞生长、调节免疫系统功能(Weems YS，et al.，2007，Prostaglandins Other Lipid Mediat.84：163-173.)等；此外它对婴幼儿的神经系统，尤其是大脑的发育至关重要(Maekawa M，et al.，2009，PLoSONE.4：5085.)。另外，双键也是花生四烯酸抗氧化作用的来源，它可以在无酶介导的条件下发生氧化反应，也可以通过以下三种氧化酶进行反应：环氧化酶(cycloocygenase，COX)、脂氧化酶(lipoxygenase，LOX)、细胞色素P450，其反应产物包括前列腺素、血栓烷、白细胞三烯(Zarini S，et al.，2006，J BiolChem.281：10134-10142.)以及其他生物活性产物。而这些生物活性物质对细胞信号传导、蛋白的代谢、血液流变学、血管弹性、白细胞功能和血小板激活等具有重要的调节作用，且花生四烯酸本身也具有很好的生物活性(Cowpland C，et al.，2006，Clin Exp Pharmacol Physiol.33：183-188.)。研究发现，当用葡萄糖和卡巴可(carbacol)刺激细胞后，花生四烯酸的含量分别增加一倍和十倍，推测相关的生理反应都可能由释放的花生四烯酸来介导(Liu BH，et al.，2005，J Anim Sci.83：1516-1525.)。花生四烯酸作为人体必需脂肪酸发挥着无可替代的作用，其应用前景广阔。
花生四烯酸主要来源有植物、动物组织、鱼油以及微生物和微藻类等，但花生四烯酸在动物组织中含量低，一般小于0.2％(wt/wt)，来源也有限，而微生物发酵法则为生产花生四烯酸开辟了新途径，它具有不受原材料及气候限制、生长周期短、培养工艺简单、花生四烯酸含量高等特点，近几年已成为国内外研究的热点。尤其是日本、美国等国家已先后问世了卜亚麻酸、二高-Y一亚麻酸、花生四烯酸的发酵产品，现正着手开发二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸的发酵产品。国内在这一领域的研究起步较晚。虽对微生物发酵生产花生四烯酸方面作了初步的研究，但还存在着生物量偏低，生长周期长的问题，因此离大规模生产花生四烯酸还存在一定的距离。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种发酵法生产花生四烯酸的方法。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
首先利用麸皮，加水煮沸，加入葡萄糖和KH2PO4，培养出种子培养基。
采用产花生四烯酸的普通被孢霉保藏菌种，制成孢子悬液，继续扩大培养，获得发酵法生产花生四烯酸的种子扩大培养基。
黄豆加水，浸泡、煮沸，降温至60℃后，加入a-淀粉酶和糖化酶，保温、过滤，得黄豆糖化液。
在黄豆糖化液中，加入酵母粉，牛肉膏，NaNO3和KH2PO4，调节pH为6.0-6.4，配制成发酵培养基。
在发酵培养基中，加入的种子培养基形成混合培养基进行发酵培养，发酵结束后，抽滤、烘干至恒重、粉碎，石油醚抽提油脂，再经分离纯化油脂得花生四烯酸纯品。
具体过程是：
1、花生四烯酸的种子培养基的制备
取新鲜麸皮，加水煮沸0.5-1.5小时，过滤出麸皮浸汁备用；取麸皮浸汁，分别加入葡萄糖和KH2PO4，搅拌溶解，用少量H3PO4调节浸汁液的pH为6.0～6.4之间。然后置于摇床上，培养温度24～26℃，摇床转速为150～200rpm，培养时间2～3天，培养出种子培养基；采用产花生四烯酸的普通被孢霉保藏菌种，经斜面活化后，无菌水洗下孢子，制成孢子悬液；将孢子悬液在摇床上继续扩大培养2～3天，获得用于发酵法生产花生四烯酸的种子扩大培养基。
具体配方：
麸皮 1000g
水 1200～1800ml
葡萄糖 44～100g
KH2PO4 0.5～2.0g
2、发酵培养基的制备
黄豆糖化液：黄豆加水，浸泡3小时后，煮沸使其充分膨胀，降温至60℃后，同时加入a-淀粉酶和糖化酶，维持温度在55-60℃之间，保温12-14小时，过滤，得黄豆糖化液备用。
具体配方：
黄豆 100g
水 400～600ml
a-淀粉酶 2～2.5g
糖化酶 0.25～1.25g
在黄豆糖化液中，加入酵母粉，牛肉膏，NaNO3和KH2PO4，充分搅拌后配制成发酵培养基，用H3PO4调节发酵培养基的酸碱度，使pH为6.0-6.4。
具体配方：
黄豆糖化液 1000mL
酵母粉 10-20g
牛肉膏 2-6g
NaNO3 2-6g
KH2PO4 0.6-2.6g
3、发酵培养：
在发酵培养基，加入备用的种子培养基，形成混合培养基，混合培养基中种子培养基和发酵培养基的体积比例为1∶1～10；保持混合培养基的温度在26℃～30℃之间，搅拌并通气，搅拌转速为100-250rpm，通气量为1.5-2.0vvm，进行培养，培养时间7～8天。发酵结束后，抽滤，收集菌体40-60℃烘干至恒重、粉碎，石油醚抽提油脂。气相色谱法测定油脂中花生四烯酸含量，再经分离纯化油脂得花生四烯酸纯品。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：原料易购，价格低廉，培养基制配方便，发酵工艺简便，花生四烯酸合成稳定，产量在1.35-1.55g/L，解决了花生四烯酸的发酵生产效率和产量低的问题，适合工业化生产。
具体实施方式
实施例1：
1、花生四烯酸的种子培养基的制备
取新鲜麸皮1000g，加水1300mL，煮沸1小时，取出浸汁；加入葡萄糖100g，KH2PO4 1.5g，用少量H3PO4调节浸汁液的pH至6.2。然后置于摇床上，培养温度为26℃，摇瓶转速为200rpm，培养2天。按普通的产花生四烯酸的被孢霉斜面保藏菌种活化后，用8mL无菌水洗下孢子，按每100mL种子培养基加入8mL孢子悬液接入摇瓶中，并按上述所述的种子培养条件进行种子扩大培养，获得用于发酵法生产花生四烯酸的种子扩大培养基。
2、发酵培养基的制备
200g的黄豆，加入去离子水900mL，浸泡3小时后，煮沸使其充分膨胀，降温至60℃后，同时加入5g的a-淀粉酶和2g的糖化酶，维持温度在55-60℃之间，保温12小时，过滤，得到黄豆糖化液；
取1000mL黄豆糖化液，加入15g酵母粉，5g牛肉膏，5g NaNO3和2gKH2PO4，调节pH为6.0，得到发酵培养基。
3、发酵培养：
取1000mL发酵培养基，加入100mL备用的种子培养基，形成混合培养基，混合培养基中种子培养基和发酵培养基的体积比例为1∶10；保持混合培养基的温度在26℃，搅拌并通气，搅拌转速为200rpm，通气量为2.0vvm，进行培养，培养时间7天。发酵结束后，抽滤，收集菌体50℃烘干至恒重、粉碎，石油醚抽提油脂。气相色谱法测定油脂中花生四烯酸含量，再经分离纯化油脂得花生四烯酸纯品。
实施例2：
1、花生四烯酸的种子培养基的制备
取新鲜麸皮1000g，加水1800mL，煮沸0.5小时，取出浸汁；加入葡萄糖40g，KH2PO4 1.0g，用少量H3PO4调节浸汁液的pH至6.4。然后置于摇床上，培养温度为28℃，摇瓶转速为150rpm，培养2天。按普通的产花生四烯酸的被孢霉斜面保藏菌种活化后，用8mL无菌水洗下孢子，按每100mL种子培养基加入8mL孢子悬液接入摇瓶中，并按上述所述的种子培养条件进行种子扩大培养，获得用于发酵法生产花生四烯酸的种子扩大培养基。
2、发酵培养基的制备
200g的黄豆，加入去离子水400mL，浸泡3小时后，煮沸使其充分膨胀，降温至60℃后，同时加入4.0g的a-淀粉酶和1.0g的糖化酶，维持温度在55-60℃之间，保温14小时，过滤，得到黄豆糖化液；
取1000mL黄豆糖化液，加入10.0g酵母粉，3.0g牛肉膏，3.0g NaNO3和0.6g KH2PO4，调节pH为6.0，得到发酵培养基。
3、发酵培养：
取1000mL发酵培养基，加入300mL备用的种子培养基，形成混合培养基，混合培养基中种子培养基和发酵培养基的体积比例为1∶3；保持混合培养基的温度在30℃，搅拌并通气，搅拌转速为250rpm，通气量为1.5vvm，进行培养，培养时间8天。发酵结束后，抽滤，收集菌体50℃烘干至恒重、粉碎，石油醚抽提油脂。气相色谱法测定油脂中花生四烯酸含量，再经分离纯化油脂得花生四烯酸纯品。
实施例3
1、花生四烯酸的种子培养基的制备
取新鲜麸皮1000g，加水1500mL，煮沸1.5小时，取出浸汁；加入葡萄糖60g，KH2PO4 0.5g，用少量H3PO4调节浸汁液的pH至6.3。然后置于摇床上，培养温度为26℃，摇瓶转速为150rpm，培养2天。按普通的产花生四烯酸的被孢霉斜面保藏菌种活化后，用8mL无菌水洗下孢子，按每100mL种子培养基加入8mL孢子悬液接入摇瓶中，并按上述所述的种子培养条件进行种子扩大培养，获得用于发酵法生产花生四烯酸的种子扩大培养基。
2、发酵培养基的制备
200g的黄豆，加入去离子水500mL，浸泡3小时后，煮沸使其充分膨胀，降温至60℃后，同时加入4.5g的a-淀粉酶和1.5g的糖化酶，维持温度在55-60℃之间，保温13小时，过滤，得到黄豆糖化液；
取1000mL黄豆糖化液，加入15.0g酵母粉，6.0g牛肉膏，3.0g NaNO3和2.6g KH2PO4，调节pH为6.0，得到发酵培养基。
3、发酵培养：
取1000mL发酵培养基，加入200mL备用的种子培养基，形成混合培养基，混合培养基中种子培养基和发酵培养基的体积比例为1∶5；保持混合培养基的温度在30℃，搅拌并通气，搅拌转速为250rpm，通气量为1.5vvm，进行培养，培养时间7天。发酵结束后，抽滤，收集菌体55℃烘干至恒重、粉碎，石油醚抽提油脂。气相色谱法测定油脂中花生四烯酸含量，再经分离纯化油脂得花生四烯酸纯品。
实施例4：
1、花生四烯酸的种子培养基的制备
取新鲜麸皮1000g，加水1800mL，煮沸1.0小时，取出浸汁；加入葡萄糖80g，KH2PO4 1.2g，用少量H3PO4调节浸汁液的pH至6.2。然后置于摇床上，培养温度为28℃，摇瓶转速为220rpm，培养2天。按普通的产花生四烯酸的被孢霉斜面保藏菌种活化后，用8mL无菌水洗下孢子，按每100mL种子培养基加入8mL孢子悬液接入摇瓶中，并按上述所述的种子培养条件进行种子扩大培养，获得用于发酵法生产花生四烯酸的种子扩大培养基。
2、发酵培养基的制备
200g的黄豆，加入去离子水1200mL，浸泡3小时后，煮沸使其充分膨胀，降温至60℃后，同时加入4.0g的a-淀粉酶和0.5g的糖化酶，维持温度在55-60℃之间，保温14小时，过滤，得到黄豆糖化液；
取1000mL黄豆糖化液，加入20.0g酵母粉，2.0g牛肉膏，6.0g NaNO3和2.0g KH2PO4，调节pH为6.0，得到发酵培养基。
3、发酵培养：
取1000mL发酵培养基，加入1000mL备用的种子培养基，形成混合培养基，混合培养基中种子培养基和发酵培养基的体积比例为1∶1；保持混合培养基的温度在26℃，搅拌并通气，搅拌转速为150rpm，通气量为1.5vvm，进行培养，培养时间8天。发酵结束后，抽滤，收集菌体60℃烘干至恒重、粉碎，石油醚抽提油脂。气相色谱法测定油脂中花生四烯酸含量，再经分离纯化油脂得花生四烯酸纯品。
Claims (11)
1、发酵法生产花生四烯酸的方法，其特征是：
首先利用麸皮，加水煮沸，加入葡萄糖和KH2PO4，培养出种子培养基；
采用产花生四烯酸的普通被孢霉保藏菌种，制成孢子悬液，继续扩大培养，获得发酵法生产花生四烯酸的种子扩大培养基；
黄豆加水，浸泡、煮沸，降温至60℃后，加入a-淀粉酶和糖化酶，保温、过滤，得黄豆糖化液；
在黄豆糖化液中，加入酵母粉，牛肉膏，NaNO3和KH2PO4，调节pH为6.0-6.4，配制成发酵培养基；
在发酵培养基中，加入的种子培养基形成混合培养基进行发酵培养，发酵结束后，抽滤、烘干至恒重、粉碎，石油醚抽提油脂，再经分离纯化油脂得花生四烯酸纯品。
2、根据权利要求1所述的发酵法生产花生四烯酸的方法，其特征是所述的种子培养基制备过程是在新鲜麸皮中加水后煮沸时间0.5-1.5小时，过滤出麸皮浸汁备用；取麸皮浸汁，分别加入葡萄糖和KH2PO4，搅拌溶解，用少量H3PO4调节浸汁液的pH为6.0～6.4之间；然后置于摇床上，培养温度24～26℃，摇床转速为150～200rpm，培养时间2～3天。
3、根据权利要求2所述的发酵法生产花生四烯酸的方法，其特征是所述的培养种子培养基中具体配方是：麸皮1000g，水1200～1800ml，葡萄糖44～100g，KH2PO40.5～2.0g。
4、根据权利要求1所述的发酵法生产花生四烯酸的方法，其特征是所述的培养种子扩大培养基是先采用产花生四烯酸的普通被孢霉保藏菌种，经斜面活化后，无菌水洗下孢子，制成孢子悬液；将孢子悬液在摇床上继续扩大培养2～3天，获得用于发酵法生产花生四烯酸的种子扩大培养基。
5、根据权利要求3所述的发酵法生产花生四烯酸的方法，其特征是所述的培养种子扩大培养基具体配方是麸皮1000g，水1200～1800ml，葡萄糖44～100g，KH2PO40.5～2.0g。
6、根据权利要求1所述的发酵法生产花生四烯酸的方法，其特征是所述的黄豆糖化液制备过程是：黄豆加水，浸泡3小时后，煮沸使其充分膨胀，降温至60℃后，同时加入a-淀粉酶和糖化酶，维持温度在55-60℃之间，保温12-14小时，过滤，得黄豆糖化液备用。
7、根据权利要求5所述的发酵法生产花生四烯酸的方法，其特征是所述的黄豆糖化液制备过程具体配方是：黄豆100g，水400～600ml，a-淀粉酶2～2.5g，糖化酶0.25～1.25g。
8、根据权利要求1所述的发酵法生产花生四烯酸的方法，其特征是所述的发酵培养基制备过程是：在黄豆糖化液中，加入酵母粉，牛肉膏，NaNO3和KH2PO4，充分搅拌后配制成发酵培养基，用H3PO4调节发酵培养基的酸碱度，使pH为6.0-6.4。
9、根据权利要求7所述的发酵法生产花生四烯酸的方法，其特征是所述的发酵培养基制备过程具体配方是：黄豆糖化液1000mL，酵母粉10-20g，牛肉膏2-6g，NaNO32-6g，KH2PO40.6-2.6g。
10、根据权利要求1所述的发酵法生产花生四烯酸的方法，其特征是所述的发酵培养基制备过程是：在发酵培养基，加入备用的种子培养基，形成混合培养基，混合培养基中种子培养基和发酵培养基的体积比例为1∶1～10；保持混合培养基的温度在26℃～30℃之间，搅拌并通气，搅拌转速为100-250rpm，通气量为1.5-2.0vvm，进行培养，培养时间7～8天。
11、根据权利要求1、9所述的发酵法生产花生四烯酸的方法，其特征是所述的发酵培养基制备过程是：发酵结束后，抽滤，收集菌体40-60℃烘干至恒重、粉碎，石油醚抽提油脂；气相色谱法测定油脂中花生四烯酸含量，再经分离纯化油脂得花生四烯酸纯品。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200910111655A CN101638677A (zh) | 2009-05-06 | 2009-05-06 | 发酵法生产花生四烯酸的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200910111655A CN101638677A (zh) | 2009-05-06 | 2009-05-06 | 发酵法生产花生四烯酸的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101638677A true CN101638677A (zh) | 2010-02-03 |
Family
ID=41613857
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200910111655A Pending CN101638677A (zh) | 2009-05-06 | 2009-05-06 | 发酵法生产花生四烯酸的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101638677A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102373244A (zh) * | 2011-11-30 | 2012-03-14 | 厦门金达威集团股份有限公司 | 一种花生四烯酸的微生物发酵方法 |
| CN113004971A (zh) * | 2021-03-15 | 2021-06-22 | 东北农业大学 | 一种萌发调控结合酶法制备功能性粉末油脂的方法 |
-
2009
- 2009-05-06 CN CN200910111655A patent/CN101638677A/zh active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102373244A (zh) * | 2011-11-30 | 2012-03-14 | 厦门金达威集团股份有限公司 | 一种花生四烯酸的微生物发酵方法 |
| CN102373244B (zh) * | 2011-11-30 | 2013-06-26 | 厦门金达威集团股份有限公司 | 一种花生四烯酸的微生物发酵方法 |
| CN113004971A (zh) * | 2021-03-15 | 2021-06-22 | 东北农业大学 | 一种萌发调控结合酶法制备功能性粉末油脂的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101892160B (zh) | 一种海洋真菌裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809及其工业应用 | |
| CN103352062B (zh) | 一种制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法 | |
| CN1986822A (zh) | 用寇氏隐甲藻发酵生产二十二碳六烯酸油脂的方法 | |
| CN105648023B (zh) | 一种微藻混合培养制备油脂的方法 | |
| CN102796675A (zh) | 一种粘红酵母油脂基因工程菌及其构建方法和应用 | |
| JP2015012842A (ja) | 焼酎廃水を培地として使用するスクワレン産生藻類の培養方法 | |
| Afzal et al. | Microalgae: A promising feedstock for energy and high-value products | |
| CN102488087A (zh) | 一种茶籽饼粕的生物脱毒方法 | |
| KR101763358B1 (ko) | 막걸리 또는 이의 부산물을 이용한 배지 조성물 및 제조 방법 | |
| CN103882080A (zh) | 一种制备阿维菌素的有效方法 | |
| CN110218652A (zh) | 一种促进bg-11培养基中微藻生长和油脂积累的方法 | |
| CN104212848A (zh) | 以生物柴油副产物粗甘油为碳源的微生物油脂制备方法 | |
| Li et al. | Enhancement of lipid production in Desmodesmus intermedius Z8 by ultrasonic stimulation coupled with nitrogen and phosphorus stress | |
| KR20100097543A (ko) | 해조류를 이용한 바이오연료의 생산방법 | |
| CN108203729B (zh) | 一种巨藻抗氧化肽的制备方法 | |
| CN109355321A (zh) | 一种利用核桃壳提取液提高微藻油脂产率的方法 | |
| CN105349588A (zh) | 利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法 | |
| CN101654697B (zh) | 一种混菌发酵制备菜籽肽的方法 | |
| CN101638677A (zh) | 发酵法生产花生四烯酸的方法 | |
| CN107841464A (zh) | 一种藻类的培养方法 | |
| Yerizam et al. | Bioethanol production from Chlorella pyrenoidosa by using enzymatic hydrolysis and fermentation method | |
| WO2021056683A1 (zh) | 一株产脂肪酶菌株及其应用 | |
| CN105713935B (zh) | 一种微藻混合培养生产油脂的方法 | |
| CN107460217A (zh) | 一种混合培养制备微藻油脂的方法 | |
| CN101638623A (zh) | 一种用于发酵法生产花生四烯酸的种子培养基制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20100203 |