KR101763358B1 - 막걸리 또는 이의 부산물을 이용한 배지 조성물 및 제조 방법 - Google Patents

막걸리 또는 이의 부산물을 이용한 배지 조성물 및 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 폐 자원인 막걸리 부산물을 이용하여 제조된 배지 조성물 및 이를 제조하는 방법, 그리고 이를 이용하여 미생물을 배양하여 배양물을 생산하는 방법에 관한 발명이다.

Description

막걸리 또는 이의 부산물을 이용한 배지 조성물 및 제조 방법 {Medium composition utilizing starch-enriched brewery waste and method for producing the same}
본 발명은 폐 자원인 막걸리 부산물을 이용하여 제조된 배지 조성물 및 이를 제조하는 방법, 그리고 이를 이용하여 바이오디젤 생산용 고지질 함유 미생물을 포함한 미생물을 배양하는 방법에 관한 발명이다.
최근 무분별한 화석연료 사용으로 대기 중의 이산화탄소(CO2) 농도가 급증하였고, 이로 인한 지구온난화로 전 세계 곳곳에는 기상이변과 해수면 상승으로 농작물 및 인명 피해가 잇따르고 있다. 이에 따라 화석연료 의존도가 높은 운송 연료를 대체 할 친환경 대체 에너지 개발이 시급해졌다.
바이오디젤은 경유 대체 연료로서 기존의 경유에 비해 독성이 적고 황화물 또는 방향족 화합물이 포함되어 있지 않으며 대기 중으로 방출하는 오염물질의 배출량 또한 적다. 바이오디젤은 주로 식물성, 동물성 지방 또는 폐기름을 원료로 가공되는데, 이는 식용자원에 대한 경쟁을 야기 할 수 있고, 또한 기존 원료는 바이오디젤의 수요가 꾸준히 늘어났음에도 불구하고 공급량에 한계를 지니었다. 따라서 급증하는 에너지 요구량을 만족시키면서 지속 가능한 대안으로서, 타 바이오매스에 비해 면적 당 생산 가능한 양이 월등히 많은 미생물을 통한 바이오디젤 생산이 각광받고 있다.
바이오디젤 생산에 사용되는 미생물은 세포 내에 많게는 60%의 지질을 축적 할 수 있다. 이러한 지질 고함량의 미생물들은 섭취하는 영양원의 종류와 방법에 따라 분류 할 수 있는데, 미세조류와 같이 광합성을 통해 대기 중의 CO2로부터 유기물을 직접 합성하는 독립영양(phototroph)생물과 효모나 곰팡이와 같이 주변에 존재하는 유기물질을 이용해 살아가는 종속영양(heterotroph)생물이 있다. 특히 종속영양미생물은 유기물을 직접 섭취하여 성장하기 때문에 독립영양미생물에 비해 훨씬 빠른 성장속도로 고농도 배양이 가능하다. 또한 독립영양생물로 알려진 미세조류 또한 조건에 따라 독립영양과 종속영양을 병행하는 혼합영양(mixotroph)이 가능하며, 유기물 공급에 의한 미세조류의 성장 효율 향상이 꾸준히 보고 되고 있다. 하지만 종속영양의 높은 생산성과 효율이라는 장점에도 불구하고 유기물 공급으로 인한 단가 상승은 바이오디젤의 경제성을 저하시키는 큰 요인으로 작용할 수도 있다. 따라서 미생물 배양에 필요한 기질의 원료를 싼 가격으로 공급 가능한 대체 자원을 찾는 것이 필요하다.
한편, 막걸리는 누룩균을 이용하여 증자미를 당화시킨 뒤, 효모로 알코올 발효를 진행하여 얻는 한국의 전통주이다. 이러한 쌀 기반의 주류들은 생산 과정에서 흔히 쌀지게미 또는 주박이라 불리는 부산물이 발생하게 되는데, 이는 원료 쌀의 20%의 양에 이른다. 막걸리 주박에는 발효에 쓰였던 쌀 찌꺼기와 폐효모 세포, 발효 과정에서 발생된 다양한 유기물질들이 존재하게 된다. 이러한 막걸리의 부산물, 즉 주박은 폐기물로서 버려지거나 동물사료로 쓰이는데 그쳤지만, 최근에는 주박의 항혈전, 항균 활성, 항산화, 항염증 활성 등의 생리활성 기능에 대한 연구가 다수 진행되었고, 활성 효모 포자 생산을 위해 대체 배지로서 이용한 연구(Lim, Y. S., K. Kim, and S. M. Bae. "Producton of Yeast Spores from Rice Wine Cake." Korean Journal of Microbiology and Biotechnology (2004)) 등도 보고되고 있다.
본 발명의 목적은 폐자원인 막걸리 부산물을 유용한 자원으로서 사용한 미생물 배양 배지 조성물 및 그 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 미생물 배양 배지를 사용하여 균체 생성량 및 지질 함량이 높은 미생물을 배양방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 미생물 배양 배지를 사용하여 배양한 미생물 배양물로부터 우수한 효율로 바이오디젤을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명자들은 막걸리 또는 이의 부산물을 용출 처리하여 얻어지는 미생물 배양용 배지 조성물을 개발하였고, 이를 이용하여 폐자원인 막걸리 부산물을 유용한 자원으로 처리하면서, 미생물을 효율적으로 배양하여 바이오매스 및 그에 따른 바이오디젤 생산량을 효율적으로 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일 예는 막걸리 또는 이의 부산물을 용출 처리하여 얻어지며, 포도당 함량 5.0 g/L 내지 200 g/L를 함유하는 막걸리 용출물을 포함하는 미생물 배양용 배지 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는 막걸리 또는 이의 부산물을 물과 혼합하여 막걸리 부산물 용액을 제조하는 단계; 및 상기 막걸리 부산물 용액을 용출 처리하여 막걸리 부산물의 용출물을 얻는 단계를 포함하는, 미생물 배양용 배지 조성물 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는 막걸리 또는 이의 부산물을 물과 혼합하여 막걸리 부산물 용액을 제조하는 단계; 상기 막걸리 부산물 용액을 용출 처리하여 막걸리 부산물의 용출물을 얻는 단계; 및 상기 용출물을 배지로 사용하여 미생물을 배양하여 배양물을 얻는 단계를 포함하는, 미생물 배양물 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 막걸리 또는 이의 부산물을 물과 혼합하여 막걸리 부산물 용액을 제조하는 단계; 및 상기 막걸리 부산물 용액을 용출 처리하여 막걸리 부산물의 용출물을 얻는 단계; 상기 용출물을 배지로 사용하여 미생물을 배양하여 배양물을 얻는 단계; 및 상기 배양물로부터 바이오디젤을 추출하는 단계를 포함하는, 바이오디젤 생산 방법 에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 자세히 설명하고자 한다.
상기 막걸리 또는 막걸리 부산물은 막걸리 제조 후 얻어지는 막걸리 부산물을 그대로 사용하거나 물을 첨가하여 희석하여 사용할 수 있다. 막걸리 부산물은 쌀 찌꺼기 및 효모 및 기타 발효 산물들을 포함할 수 있다. 막걸리 부산물의 대부분을 이루는 쌀은 전분으로서 간단한 효소적, 화학적 과정을 거쳐 미생물이 이용 가능한 포도당으로 쉽게 전환이 가능하여 미생물의 탄소원으로 이용 가능하다. 또한 동시에 미생물 성장에 필수적인 질소, 인 등의 영양원들은 폐효모 세포 속에 풍부하게 존재한다. 따라서 막걸리 부산물은 미생물 배양에 필요한 요소들을 고루 갖춘 고부가 가치의 폐자원이라 할 수 있겠고, 간단한 처리를 통해 버려지는 폐기물을 바이오디젤과 더 나아가 오메가-3 지방산과 같은 미생물 유래 고부가 가치 물질로도 전환할 수 있다.
본 발명의 배지 조성물에 포함되는 상기 막걸리 용출물은 용출처리전 전질소 함량 100중량부를 기준으로 용출처리후 전질소 함량(TN 비율) 100 초과 내지 1000일 수 있다.
본 발명의 배지 조성물에 포함되는 상기 막걸리 부산물의 용출물은 총 질소, 그리고 미량 원소를 추가로 포함할 수 있다. 상기 포도당은 5 내지 200g/L로 포함하는 것을 특징으로 하는 것이며, 바람직하게는, 15 내지 180g/L로 포함할 수 있다. 상기 총 질소는 0.5 내지 5.0g/L로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.5 내지 4.0g/L 로 포함될 수 있다. 또한 상기 미량 원소는 나트륨(Na), 인(P), 칼륨(K), 황(S), 칼슘(Ca), 마그네슘(Mg), 붕소(B), 망간(Mn) 및 철(Fe)로 이루어진 군에서 선택된 1이상일 수 있다.
상기 막걸리 부산물의 용출물은 막걸리 부산물을 용출처리하여 얻어지는 것으로서, 바람직하게는, 상기 용출 처리는 교반, 가열, 가압, 초음파 처리, 및 효소 첨가 방법으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 방법으로 수행될 수 있다. 이들은 모두 세포의 물리적 파쇄 및 전분으로부터의 포도당의 용출 처리를 위해 사용되는 방법들로서, 본 막걸리 부산물의 폐효모 영양원 용출을 위한 파쇄 및 전분의 가수분해를 증진시키기 위한 화학적 처리와 동시에 행해질 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 막걸리 용출물은 막걸리 또는 이의 부산물을, 교반, 가열, 가압, 초음파 처리, 및 효소 분해법으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 처리방법으로 수행될 수 있다. 바람직하게는 상기 용출 처리는 교반기, 오토클레이브, 및 쏘니케이터로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 사용하여 수행될 수 있다.
또한 상기 용출 단계에서 일정 온도까지는 온도가 높아질수록 전분의 가수분해 효율이 높아지지만 너무 높은 온도에서는 전분의 호화 현상에 의해 재 냉각시 굳어져 미생물 배지로서의 사용이 불가하다. 효모 용출 또한 온도가 높아짐에 따라 늘어나지만 너무 높은 온도는 영양원들을 파괴시키거나 변형시켜 배지로서 적합하지 않게 될 수 있다. 이에 따라 막걸리 부산물로부터 포도당을 용출하는 바람직한 온도는 20 내지 120℃ 범위일 수 있으며, 예를 들면 20 내지 80℃ 범위일 수 있다.
또한 상기 용출 단계에서 교반 및 초음파 처리에 의한 용출을 하는 경우, pH는 pH 2 내지 pH 10으로, 바람직하게는 pH 2 내지 pH 10에서 사용할 수 있다. 특히 pH 4에서는 포도당 함량이 매우 높아 배지로서 유용성을 극대화시킬 수 있다.
다만, 가열 및 가압에 의한 용출 처리, 예를 들어 오토클레이브를 이용하여 용출 하는 경우에는 산성인 조건으로서, pH 1 내지 3이 바람직한데, 더 높은 pH에서는 전분의 과도한 호화가 일어나 점도가 큰 용액이 되고, 이후에 다시 온도가 낮아지면서 반고체의 젤을 형성(노화, retrogradation)하여 미생물의 배지로 사용하기에 적합하지 않게 된다. 산성인 조건은 호화 온도를 높이거나, 전분 분자의 재배열을 방해하므로 pH2에서는 전분의 호화 및 노화가 비교적 잘 일어나지 않고 역시 높은 효율로 포도당을 얻을 수 있다.
오토클레이브를 이용하여 고온 및 고압 조건에서 처리하는 방법은, 구체적으로 100 내지 120℃ 온도범위, 바람직하게는 120℃ 온도, 15 내지 20psi 압력범위 및 15 내지 30분 동안, 바람직하게는 15 내지 25분 동안 이루어질 수 있다. 오토클레이브는 흔히 미생물을 접종하기 이전에 배지 및 도구들을 멸균하는 장비로서, 멸균과 포도당 및 영양원의 용출을 동시에 이루어 낼 수 있다.
본 발명에서 포도당 및 영양원의 용출 방법 중 하나는 초음파 처리하는 것으로서, 상온에서 10 내지 30 kHz 파장의 초음파를 조사할 수 있으며, 20kHz에서, 1 내지 40%, 바람직하게는 20 내지 30%의 증폭 조건으로 쏘니케이터를 사용하여 이루어질 수 있다. 또한 상기 쏘니케이터는 10 내지 90분 동안, 더욱 바람직하게는 30 내지 60분 동안 이루어질 수 있다. 초음파는 세포 파쇄 및 세포 내 물질의 용출을 위해 흔히 쓰이는 장비로서, 고에너지의 초음파가 순간적으로 수력학적 공동현상을 일으키며 세포 조직을 파쇄시킨다.
또한 상기 용출 처리 과정으로서 효소를 첨가하는 방법을 사용하는 경우에는 전분 분해 효소를 사용하여 당을 가수분해하는 것일 수 있으며, 상기 전분 분해 효소는 알파-아밀레이즈(alpha-amylase), 글루코아밀레이즈(glucoamylase or Amyloglucosidase), 베타-아밀레이즈(bata-amylase), 이소아밀레이즈(isoamylase), 플루라네이즈(pullulanase), 알파글루코시데이즈(alpha-glucosidase)로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 사용할 수 있다. 바람직하게는 알파-아밀레이즈 (alpha-amylase), 글루코아밀레이즈(glucoamylase)일 수 있다.
상기 배지 조성물을 적용하는 미생물로서는 본 발명의 배지 조성물을 이용가능 한 원핵 및 진핵미생물 군에서 선택되는 1 이상일 수 있으며, 바람직하게는 발효 및 기타 산물 생산에 쓰이는 미세조류 또는 효모이다.
본 발명에서 사용되는 미세조류는 독립영양생물(photoautotroph)로서 태양을 에너지원으로 하고, 대부분의 조건에서 이산화탄소를 탄소원으로 하여 성장하는 광합성 생물체로서 다른 광합성 생물체, 특히 육상 생물에 비하여 생장 속도가 높은 장점을 지니고 있는바 단위면적 당 높은 생산성을 나타내고 있다. 또한 일부 미세조류는 독립영양(phototrophy) 조건에서보다 혼합영양(mixotrophy) 조건에서 훨씬 나은 생장성을 보이므로, 혼합영양을 통한 미세조류 배양은 미세조류 유래 물질 생산의 상용화를 위한 획기적 방안이다. 미세조류는 해양 또는 담수 환경에서 서식하고 있으며, 바다 생태계에 있어 최하위에 위치하여 주로 어류 치어의 먹이로 이용되고 있다. 미세조류 바이오매스는 단백질, 탄수화물, 비타민, 미네랄과 같은 영양 성분이 풍부하게 포함되어 있고, 특히 어류 치어의 성장에 반드시 필요한 지질 또한 포함되어 있다.
상기 미세조류의 예로는 Ankistrodesmus sp., Botryococcus sp., Botryococcus sp., Chaetoceros sp., Chlorella sp., Chlorococcum sp., Crypthecodinium sp., Dunaliella sp., Ellipsoidion sp., Euglena sp., Haematococcus sp., Isochrysis sp., Monodus sp., Monallanthus sp., Nannochloris sp. Neochloris sp., Nitzschia sp., Oocystis sp., Pavlova sp., Phaeodactylum sp., Porphyridium sp., Scenedesmus sp., Skeletonema sp., Spirulina sp., Thalassiosira sp., Tetraselmis sp., Ettlia sp.을 배양할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 효모의 예로는 Saccharomyces sp., Apiotrichum sp., Rhodotorula sp., Apiotrichum sp., Cryptococcus sp., Yarrowia sp., Rhodosporidium sp., Lypomyces sp., Trichosporon sp., Candida sp., Pseudozyma sp., Zygolipomyces sp. 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 배지 조성물은 단독으로 미생물 배양에 사용되거나, 다른 배지를 첨가제로 더욱 포함할 수 있으며, 본 발명에 따른 배지 조성물이 첨가제로서 다른 배지에 더욱 포함되어 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 상기 배지 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 예에 따르면 막걸리 부산물을 물과 혼합하여 막걸리 부산물 용액을 제조하는 단계; 및 상기 막걸리 부산물 용액을 용출 처리하여 막걸리 부산물의 용출물을 얻는 단계를 포함하여, 미생물 배양용 배지 조성물을 제조할 수 있다.
상기 배지 조성물에 관한 사항은 배지 조성물 제조 방법에 적용될 수 있다.
상기 미생물 배지 조성물 제조방법에서 원료로서 사용되는 막걸리 부산물은 막걸리 제조 후 얻어지는 쌀찌꺼기, 발효산물, 효모 또는 이를 모두 포함하는 주박일 수 있다.
상기 막걸리 부산물 용액은 용출 처리 방법에 따라 적절한 pH로 조절될 수 있다. 특히 막걸리 부산물에 포함된 효모에 대한 용출 효율은 해당 효모종의 자기소화(autolysis) 효소 의존적이므로 매번 종에 따른 pH 영향을 받는 동시에, 외부의 높은 pH 조건은 활성 OH라디컬 수의 증가로 효모의 세포벽 공격을 더욱 용이하게 만든다. 바람직하게는, pH 2 내지 10, 더욱 바람직하게는 pH 4 내지 7에서 이루어질 수 있다.
또한, 상기 제조방법의 포도당은 5 내지 200g/L로 포함하는 것을 특징으로 하는 것이며, 바람직하게는, 15 내지 180g/L로 포함할 수 있다.
상기 제조방법의 총 질소는 0.5 내지 5.0g/L로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.5 내지 4.0g/L 로 포함될 수 있다.
상기 제조방법의 미량 원소는 나트륨(Na), 인(P), 칼륨(K), 황(S), 칼슘(Ca), 마그네슘(Mg), 붕소(B), 망간(Mn) 및 철(Fe)로 이루어진 군에서 선택된 1이상일 수 있다.
상기 제조방법에서 용출 처리 과정은 교반, 가열, 가압, 초음파 처리, 및 효소 첨가 방법으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 방법으로 수행될 수 있으며, 바람직하게는 상기 용출 처리는 교반기, 오토클레이브, 및 쏘니케이터로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 사용하여 수행될 수 있다.
또한 상기 용출 단계에서 일정 온도까지는 온도가 높아질수록 전분의 가수분해 효율이 높아지지만 너무 높은 온도에서는 전분의 호화 현상에 의해 재 냉각시 굳어져 미생물 배지로서의 사용이 불가하다. 효모 용출 또한 온도가 높아짐에 따라 늘어나지만 너무 높은 온도는 영양원들을 파괴시키거나 변형시켜 배지로서 적합하지 않게 될 수 있다. 이에 따라 막걸리 부산물로부터 포도당을 용출하는 바람직한 온도는 20 내지 120℃ 범위일 수 있으며, 예를 들면 20 내지 80℃ 범위일 수 있다.
또한 상기 용출 단계에서 교반 및 초음파 처리에 의한 용출을 하는 경우, pH는 pH 2 내지 pH 10으로, 바람직하게는 pH 2 내지 pH 10에서 사용할 수 있다. 특히 pH 4에서는 포도당 함량이 매우 높아 배지로서 유용성을 극대화시킬 수 있다.
다만, 가열 및 가압에 의한 용출 처리, 예를 들어 오토클레이브를 이용하여 용출 하는 경우에는 산성인 조건으로서, pH 1 내지 3이 바람직한데, 더 높은 pH에서는 전분의 과도한 호화가 일어나 점도가 큰 용액이 되고, 이후에 다시 온도가 낮아지면서 반고체의 젤을 형성(노화, retrogradation)하여 미생물의 배지로 사용하기에 적합하지 않게 된다. 산성인 조건은 호화 온도를 높이거나, 전분 분자의 재배열을 방해하므로 pH2에서는 전분의 호화 및 노화가 비교적 잘 일어나지 않고 역시 높은 효율로 포도당을 얻을 수 있다.
오토클레이브를 이용하여 고온 및 고압 조건에서 처리하는 방법은, 구체적으로 100 내지 120℃ 온도범위, 바람직하게는 120 ℃ 온도, 15 내지 20psi 압력범위 및 15 내지 30분 동안, 바람직하게는 15 내지 25분 동안 이루어질 수 있다. 오토클레이브는 흔히 미생물을 접종하기 이전에 배지 및 도구들을 멸균하는 장비로서, 멸균과 포도당 및 영양원의 용출을 동시에 이루어 낼 수 있다.
본 발명에서 포도당 및 영양원의 용출 방법 중 하나는 초음파 처리하는 것으로서, 상온에서 10 내지 30 kHz 파장의 초음파를 조사할 수 있으며, 20kHz에서, 1 내지 40%, 바람직하게는 20 내지 30%의 증폭 조건으로 쏘니케이터를 사용하여 이루어질 수 있다. 또한 상기 쏘니케이터는 10 내지 90분 동안, 더욱 바람직하게는 30 내지 60분 동안 이루어질 수 있다. 초음파는 세포 파쇄 및 세포 내 물질의 용출을 위해 흔히 쓰이는 장비로서, 고에너지의 초음파가 순간적으로 수력학적 공동현상을 일으키며 세포 조직을 파쇄시킨다.
상기 용출 처리된 막걸리 부산물 용액은 그 자체로 미생물 배양 배지에 첨가하여 사용될 수 있으나, 상등액을 채취하여 사용하는 것이 바람직하다.
상기 제조방법에서 상등액의 pH가 6 내지 8 이 되도록 조절하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 사용하는 미생물에 따라 바람직한 범위로 조절할 수 있다.
바람직하게는 상기 미생물은 발효 및 기타 산물 생산에 쓰이는 미세조류 또는 효모로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상인 것일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 배지 조성물을 이용하여 미생물 배양물을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 예에 따르면 막걸리 부산물을 물과 혼합하여 막걸리 부산물 용액을 제조하는 단계; 상기 막걸리 부산물 용액을 용출 처리하여 막걸리 부산물의 용출물을 얻는 단계; 및 상기 용출물을 배지로 사용하여 미생물을 배양하여 배양물을 얻는 단계를 포함하여 미생물 배양물을 생산할 수 있다.
상기 배지 조성물에 관한 사항은 미생물 배양물 생산 방법에 적용될 수 있다.
상기 미생물의 배양조건은 선택된 미생물의 통상의 배양 조건에 따라 배양할 수 있다.
상기 미생물 배양물 생산방법은 상기 배양물을 추출하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 추출 방법은 물리적 방법 및/또는 화학적 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 물리적 방법으로는 미생물을 초음파 또는 마이크로파와 같은 파동을 이용하여 미생물의 세포벽을 파괴한 뒤 목적하는 성분만을 선택적으로 추출하거나 열분해 방식을 이용하여 미생물을 구성하는 단백질, 탄수화물 등의 성분을 분해하여 목적하는 성분만을 선택적으로 추출한다. 한편, 화학적 방법은 유기용매 등을 사용하여 미생물에 포함된 목적하는 성분을 선택적으로 용해시키는 용매 추출법에 의해 수행될 수 있으며, 바람직한 유기용매로는 헥산(hexane), 에테르(ether), 클로로포름(chloroform) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 헥산을 사용한다. 상기 용매 추출법은 통상의 교반 추출 장치에 의해 수행될 수 있다.
상기 방법을 미생물로서 미세조류에 적용하여 생산되는 미생물 배양물은 지질일 수 있으며, 미세조류로부터 추출되는 지질함량은 본 발명에 따라 증가되어 C16:0, C16:1, C18:0, C18:1, C18:2, C18:3을 주로 하는 지질 20 내지 50 건조질량% 의 고함량으로 지질을 포함하는 미생물 배양물을 얻을 수 있다.
또한 본 발명은 상기 배지 조성물을 이용하여 바이오디젤을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 예에 따르면 막걸리 부산물을 물과 혼합하여 막걸리 부산물 용액을 제조하는 단계; 및 상기 막걸리 부산물 용액을 용출 처리하여 막걸리 부산물의 용출물을 얻는 단계; 상기 용출물을 배지로 사용하여 미생물을 배양하여 배양물을 얻는 단계; 및 상기 배양물로부터 바이오디젤을 추출하는 단계를 포함하여 바이오디젤을 생산할 수 있다.
상기 배지 조성물 및 이를 이용한 미생물 배양물 생산방법에 관한 사항은 미생물 배양물 생산 방법에 적용될 수 있다.
상기 바이오 디젤 생산방법은 용출 처리된 막걸리 부산물을 배양액으로 이용함에 따라, 배양된 미세조류로의 바이오매스 함량이 증가되어, 높은 생산률로 바이오 디젤을 생산할 수 있다.
상기 배양물로부터 바이오 디젤로 전환하는 단계는 공지된 전환법에 따라 수행될 수 있다. 상기 전환하는 단계는 에스테르 교환반응을 이용하여 수행될 수 있으며, 상기 에스테르 교환반응으로 염산, 메탄올, 및 황산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 사용하여 수행될 수 있다. 예컨대 지질에 메탄올 및 황산을 첨가한 후 원심분리로 층 분리하여 바이오디젤로 전환할 수 있다.
상기 바이오 연료는 에너지원으로 사용될 수 있는 모든 것을 포함하는 것으로, 예컨대 바이오 연료는 바이오 디젤, 바이오 에탄올, 또는 바이오 플라스틱일 수 있다.
상기 미세조류 배양물 제조하는 방법에서, 미세조류 배양물을 얻는 단계 이후에 미생물 배양물을 농축하는 단계를 추가로 수행할 수 있다. 효과적인 지질 추출을 위해 미세조류 농축 단계를 수행하며, 응집, 삼투 방식 또는 원심분리 방식을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법으로 폐자원인 막걸리 부산물을 유용한 자원으로서 처리할 수 있으며, 미세조류를 이용한 바이오 디젤 생산에 있어 지질 생산량을 효율적으로 증가시킬 수 있다. 따라서 막걸리 부산물의 재처리 및 바이오 디젤 또는 미세조류를 포함한 미생물의 부가 산물을 생산하는 관련 산업에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1는 막걸리 부산물 용액을 교반에 의한 용출 처리 실시한 후 생성된 포도당 양 및 TN ratio를 나타낸 것이다.
도 2는 막걸리 부산물 용액을 오토클레이브에 의한 용출 처리 실시한 후 생성된 포도당 양 및 TN ratio를 나타낸 것이다.
도 3는 막걸리 부산물 용액을 쏘니케이터에 의한 용출 처리 실시한 후 생성된 포도당 양 및 TN ratio를 나타낸 것이다.
도 4는 55℃에서 교반에 의한 용출 처리에 의한 용출물을 이용하여 제조된 배지 및 독립영양에 의한 대조군 배지에서 Ettlia sp. 의 바이오매스 생성량을 나타낸 것이다(PSBW: Pretreated Starch-enriched brewery waste, 55℃ 교반으로 전처리된 막걸리 부산물 배지).
도 5는 55℃에서 교반에 의한 용출 처리에 의한 용출물을 이용하여 제조된 배지 및 독립영양에 의한 대조군 배지에서 Ettlia sp. 의 지질 생성량을 나타낸 것이다.
도 6은 효소에 의해 용출 처리에 의한 용출물의 상등액을 배지로 사용하여 Aurantiochytrium sp. KRS101 을 배양한 결과 생성되는 바이오매스 생성량을 나타낸 것이다(ESBW: Enzymatically pretreated Starch-enriched brewery waste, 효소적 방법으로 전처리된 막걸리 부산물 배지).
도 7은 55℃에서 교반에 의한 용출 처리에 의한 용출물을 이용하여 제조된 배지에서 Yarrowia sp.을 배양한 결과 생성되는 바이오매스 생성량을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 막걸리 부산물 용액 제조
㈜국순당 백세주의 주박을 막걸리 부산물로서 사용하였다. 상기 막걸리 부산물의 수분(moisture)은 39.81±2.01%이고 총 탄수화물(total carbohydrates)은 49.36±1.64%이었다. 막걸리 부산물을 증류수와 2:8 (막걸리부산물:증류수) 비율로 섞어 20% (w/w)인 막걸리 부산물 용액을 만들었다. 만들어진 용액의 초기 pH는 3.85±0.23이다.
실시예 2. 막걸리 부산물의 용출물 제조
상기 실시예 1에서 제조된 막걸리 부산물 용액을 용출 처리하여 용출물을 제조하였다. 용출 처리 후의 포도당 양은 HPLC로 측정하였고, 폐효모에 대한 용출 처리 효율은 아래 식 1의 TN (Total Nitrogen) ratio로 계산하였다.
[식 1]
TN ratio = ( TNK / TN0 ) × 100
(TNK: 용출 처리 후의 TN (mg/L), TN0: 용출 처리 전의 TN (mg/L))
2.1 교반에 의한 용출 처리
상기 실시예 1에서 제조된 막걸리 부산물 용액의 pH를, 10M NaOH 용액 또는 2M H2SO4 용액을 사용하여 pH 2, 4, 7, 10으로 각각 맞추었다. 이후, 상기 막걸리 부산물 용액을 55℃에서, 300rpm, 2시간 동안 교반하여 균일하게 혼합하였다.
생성된 포도당 및 상기 식 1에 따라 계산한 폐효모 전환율의 결과를 도 1에 나타내었다. 포도당 양은 pH2, 4, 7, 10 조건에서 각각 20.7, 25.5, 23.5, 21.0g/L 로 측정되었고, 상기 교반의 방법으로 55℃에서 처리한 후의 포도당 양이 39.6±2.9g/L로 가장 높았다. 온도가 높아질수록 전분의 가수분해 효율이 높아짐에 따라 상온에서 교반시키는 조건보다 포도당 수율이 더 높게 나온 것을 확인할 수 있었다. 또한 폐효모에 대한 용출 처리 효율은 pH 10에서 유의적으로 높았는데, 높은 pH 에서 OH 라디컬 수가 증가하여 효모의 세포벽 공격을 더욱 용이하게 만든다는 것을 확인하였다.
용출 처리 전 막걸리 부산물의 미량 원소 및 상기 교반에 의해 용출 처리한 후 측정한 미량 원소를 비교한 결과는 표 1에 나타내었다. 교반 용출 처리 후 모든 미량원소의 함량이 증가한 것을 확인할 수 있었다.
미량 원소 용출 처리 전(mg/L) 교반 용출 처리 후(mg/L)
Na 5.975±0.024 9.393±0.096
P 38.12±0.877 82.76±0.828
K 60.86±0.487 63.70±0.382
S 20.38±0.143 54.47±0.381
Ca 12.46±0.075 26.04±0.260
Mg 10.43±0.021 12.99±0.130
B 0.214±0.001 0.257±0.004
Mn 0.405±0.005 0.606±0.006
Fe 0.013±0.003 0.023±0.003
2.2 고온 및 가압에 의한 용출 처리
상기 실시예 1에서 제조된 막걸리 부산물 용액의 pH를, 10M NaOH 용액 또는 2M H2SO4 용액을 사용하여 pH 2, 4, 7, 10으로 각각 맞추었다. 이후, 상기 막걸리 부산물 용액을 120℃에서 20분간 오토클레이브에서 높은 온도 및 압력을 가하였다.
생성된 포도당 및 상기 식 1에 따라 계산한 폐효모 전환율의 결과를 도 2에 나타내었다. pH 2에서 포도당 양이 30.76g/L 으로 생성되었다. 산성 조건에서는 호화 온도를 높이거나 전분 분자의 재배열을 방해하여 전분의 호화가 일어나지 않으면서도 높은 효율로 포도당을 얻을 수 있는 점을 확인할 수 있었다.
2.3 초음파 처리에 의한 용출 처리
상기 실시예 1에서 제조된 막걸리 부산물 용액의 pH를, 10M NaOH 용액 또는 2M H2SO4 용액을 사용하여 pH 2, 4, 7, 10으로 각각 맞추었다. 이후, 상기 막걸리 부산물 용액을 20kHz, 750W, 25%의 증폭(amplitude)으로 30분간 쏘니케이터에서 초음파를 처리하였다.
생성된 포도당 및 상기 식 1에 따라 계산한 폐효모 전환율의 결과를 도 3에 나타내었다. 포도당은 pH 4에서 29.50g/L 으로 가장 많은 양으로 생성되었고, 폐효모에 대한 용출 처리 효율은 pH가 커질수록 높아졌는데, 이로써 pH 증가에 따른 OH 라디컬 수의 증가가 효모의 세포벽 공격을 더욱 용이하게 만든다는 것을 확인하였다.
2.4 효소에 의한 용출 처리
상기 실시예 1에서 사용된 막걸리 부산물을 증류수와 4:6 (막걸리부산물:증류수) 비율로 섞어 40% (w/w)인 막걸리 부산물 용액을 만들었다. 막걸리 부산물 용액의 pH를, 10M NaOH 용액 또는 2M H2SO4 용액을 사용하여 pH 6.5로 맞추었다. 이후, 65℃에서 alpha-amylase (Novozyme사의 BAN을 사용) 를 막걸리 용액 부피비 1/1000-1/100 수준으로 첨가하고, 효소 반응을 활발히 하기 위해 CaCl2 1g/L 를 첨가하였다. 효소가 첨가된 막걸리 부산물 용액을 2시간동안 교반한 후, 다시 H2SO4로 pH4.5로 만든 뒤, 온도 70℃에서 glucoamylase (Novozyme사의 AMG 사용) 를 막걸리 용액 부피비 1/1000-1/100 수준으로 첨가하였다. 2시간동안 교반한 후 0.2um으로 필터링 하였고 최종 pH를 6.5 내지 7로 조절하였다.
그 결과 포도당은 150-200g/L이 생성되어 상기 실시예 2.1 내지 2.3의 용출 처리 방법에 비하여 매우 우수한 효율로 포도당이 생성됨을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 혼합 영양 미세조류 배양
3.1. 미세조류 배양
실시예 2.1에서 막걸리 부산물 용액을 55℃에서 2시간 교반시켜 제조한 용출물의 상등액을 배지로 사용하였다. 배지의 포도당 양이 각각 5, 10, 15, 20g/L(12.5, 25.0, 37.5, 50.0%)가 되도록 증류수에 혼합하였다.
대조군으로는 독립영양(phototroph) 조건의 BG11 배지를 사용하였다.
상기 제조된 배지에 미세조류로서 Ettlia sp.을 사용하였고 KCTC(YC001, KCTC 12109BP)로부터 분양 받은 것을 사용하였다. 구체적으로, Ettlia sp.를 26℃ 온도 및 100-110μmol photons/m2/s 조건에서 10일간 배양하였다. 모든 실험 조건에는 100-110μmol photons/m2/s의 빛이 LED로 주어졌으며, 공기와 5부피% CO2는 0.3vvm으로 대조군에만 주어졌다.
3.2. 미세조류 배양물의 분석
상기 배양에 따른 미세조류의 생장 결과로서, 바이오매스의 생성량을 도 4에, 배양물로서 생성된 지질 성분 분석 결과를 표 2에, 생성된 지질 함량을 도 5에 나타내었고 이에 따른 지질 생산성을 계산하였다.
바이오매스 생성량에 대한 도 4를 살펴보면, 독립영양에 의한 대조군에서의 생장은 꾸준히 일어나는 반면, 상기 막걸리 부산물 유래의 배지 조성물에 의한 혼합영양 생장은 초반에 급격히 이루어진 뒤 빠른 시일 내에 정지기(stationary phase)에 도달했다. 특히 용출 처리한 막걸리 부산물 용액의 농도가 높아질수록 바이오 매스의 양이 확연히 증가한 것으로 미루어보아, 독립영양만으로는 한계가 있던 미세조류의 고속, 고농도 배양에 획기적인 방법으로서의 가능성을 확인하였다.
다음으로 표 2는 배양 후 생성된 배양물로서 지질의 성분을 분석한 결과를 나타내며, 생성된 지질 100%을 기준으로 각 지질성분의 함량(중량%)를 나타낸다. 미세조류 내 지질 측정을 위해 Gas chromatography (GC, Agilent 7980B)을 이용하였고, 컬럼은 HP-InnoWax column (30m*0.32mm*0.25qm; Agilent)를 사용하였다. 분석 된 결과는 Supelco 37 Component FAME Mix (Sigma-Aldrich, item no. 47885-U) 스탠다드를 통해 각 피크에 해당하는 지질 성분을 알아내었다.
배지 C16:0(%) C16:1(%) C18:0(%) C18:1(%) C18:2(%) C18:3(%) 기타( % )
PSBW 12.5% 19.26 9.13 3.58 40.30 12.81 6.05 8.89
PSBW 25.0% 20.91 8.26 2.78 39.26 13.76 5.09 9.96
PSBW 37.5% 36.29 5.46 2.87 32.11 11.16 4.31 7.82
PSBW 50.0% 36.34 5.56 3.15 28.15 10.94 4.20 11.66
상기 배양에 따라 생산된 지질 함량(lipid contents)에 대한 도 5를 살펴보면 독립영양에 의한 대조군(29.0±1.7%)에 비해 용출 처리한 막걸리 부산물 용액을 함유한 배지의 지질 함량이, 포도당이 5g/L 인 경우 43.4±3.4, 포도당이 10g/L인 경우 37.9±1.1%로 월등히 높은 것을 확인할 수 있다.
지질생산성(lipid productivity)을 아래 식 2에 의하여 계산하였으며, 그 결과, 대조군이 193.3mg/L/d인 반면, 상기 용출 처리한 막걸리 부산물 용액을 함유한 경우(전처리 된 막걸리 부산물 양 25.0%인 경우) 244.2mg/L/d로 대조군에 비해 매우 높은 값을 나타내는 것을 확인하였다.
[식 2]
지질생산성(lipid productivity, mg/L/day)= 바이오매스생산량(mg/L)×(지질 함량%/100)/배양 일 수(day)
3.3 미세조류 배양물의 지질특성 분석
실시예 3.1 에서 배양한 Ettlia sp.의 배양물로부터 지질을 추출하였다.
추출된 지질의 함량을 정성분석하여 표준 값(European Standard EN 14214, UNE-EN 14214, 2003. Automotive fuels. Fatty acid methyl esters (FAME) for diesel engines. Requirements and test methods)과 비교한 결과를 표 3에 나타내었다.
미세조류 내 지질을 추출 및 전환하기 위해 다음과 같은 단계를 거쳤다. 세포배양액(10ml)을 채취하여 원심분리 한 미생물 펠렛을 증류수 및 PBS 용액으로 세척 한 뒤 다시 원심분리하여 깨끗한 미생물 펠렛을 얻는다. 동결건조기로 4일간 충분히 건조한다. 동결건조된 시료 각 10mg을 클로포름:메탄올 (2:1, v/v) 2ml를 주입한 후 상온에서 볼텍스 믹서로 섞는다. standard와의 비교를 위해 heptadecanoic acid (C17:0) 내부표준물질을 함유한 클로로포름을 1ml 넣는다. 메탄올 1ml와 황산 300ul을 첨가한 뒤 볼텍스 믹서로 섞은 뒤, 100℃에서 20분간 방치한다. 상온으로 냉각 시킨 후 증류수 1ml를 주입하여 볼텍스 믹서로 섞는다. 원심분리를 통해 층분리하여, 아랫층만을 뽑아 GC 분석을 위한 용기에 담는다.
지질의 정성 및 정량 분석을 위해 Gas chromatography (GC, Agilent 7980B)을 이용하였고, 컬럼은 HP-InnoWax column (30m*0.32mm*0.25qm; Agilent)를 사용하였다. 분석 된 결과는 Supelco 37 Component FAME Mix (Sigma-Aldrich, item no. 47885-U) 스탠다드를 통해 각 피크에 해당하는 지질 성분을 알아내어 대조하였다.
배지 세탄값 산화안정도 (h) CFPP (℃) 요오드값
(g I 2 /100g)
BG11
(control)		 61.02 13.68 0.05 56.77
PSBW 12.5% 60.00 11.83 -4.78 70.03
PSBW 25.0% 59.98 11.16 -5.53 70.02
PSBW 37.5% 62.50 13.16 -0.55 57.90
PSBW 50.0% 62.70 13.37 0.08 54.47
Standard >51 >6 <0, <-10
(summer, winter)		 <120
추출된 지질은 세탄 값, 산화 안정도, CFPP 및 요오드 값에서 표준 값을 만족시켜 우수하게 미생물의 배지로서 사용할 수 있음을 확인하였다.
실시예 4. 종속 영양 미세조류 배양
4.1 바다소금을 첨가한 ESBW 배지를 이용한 배양
대조군으로는 일반 배지(General medium)으로서, Glucose 60g/L, Yeast extract 10g/L, KH2PO4 9g/L 및 Sea salt 15g/L을 포함하는 배지를 사용하였다.
실시예 2.4에서 효소에 의해 용출 처리된 막걸리 부산물 용액의 상등액을 배지로 사용하였다. 배지의 포도당 양이 각각 60g/L 가 되도록 증류수에 혼합하였다(ESBW 배지). 상기 희석된 ESBW 배지에 바다소금(Sea salts) 15g/L을 첨가하고 교반하여 미세조류 배양용 배지를 제조하였다.
미세조류는 종속 영양 미세조류로서, 해수종인 Aurantiochytrium sp. KRS101 을 사용하였고 KRIBB (한국생명공학연구원)으로부터 얻은 것을 사용하였다. Aurantiochytrium sp. KRS101를 쉐이킹 인큐베이터에서 28℃, 150rpm의 조건으로 배양하였다. 상기 배양에 따른 미세조류의 생장 결과로서, 바이오매스의 생성량을 도 6에 나타내었다.
상기 결과, 효소로 용출 처리한 막걸리 부산물 용액을 포함하는 배지의 경우 일반 배지만을 사용한 대조군에 비하여 60시간까지 비교적 높은 생장을 나타내었고 총 생장량 역시 우수한 결과를 보여주는 것을 확인하였다.
4.2. 일반배지를 혼합한 ESBW 배지를 이용한 배양
대조군으로는 일반 배지(General medium)으로서, Glucose 60g/L, Yeast extract 10g/L, KH2PO4 9g/L 및 Sea salt 15g/L을 포함하는 배지를 사용하였다.
실시예 2.4에서 효소에 의해 용출 처리된 막걸리 부산물 용액의 상등액을 일반 배지의 첨가제로서 사용하였다. 일반 배지에 추가로 약 60g/L의 포도당을 포함하도록 환산하여 막걸리 부산물 용액을 첨가하였다. 바다소금(sea salt)은 기존 배지에 이미 포함되어 있으므로 더 첨가해주지 않았다.
미세조류는 종속 영양 미세조류로서, 해수종인 Aurantiochytrium sp. KRS101 을 사용하였고 KRIBB (한국생명공학연구원)으로부터 얻은 것을 사용하였다. Aurantiochytrium sp. KRS101 을 쉐이킹 인큐베이터에서 28℃, 150rpm의 조건으로 배양하였다. 상기 배양에 따른 미세조류의 생장 결과로서, 바이오매스의 생성량을 도 6에 나타내었다.
상기 결과, 효소로 용출 처리한 막걸리 부산물 용액을 일반 배지에 첨가하여 사용하는 경우 일반 배지만을 사용한 대조군에 비하여 60시간까지 매우 급속한 생장을 나타내었고 총 생장량 역시 매우 우수한 결과를 보여주는 것을 확인하였다.
실시예 5. 효모 배양
실시예 2.1에서 얻어진 막걸리 부산물의 용출액으로서 55℃ 및 pH4에서 2시간 교반시킨 막걸리 부산물 용액의 상등액을 배지 (PSBW)로 사용하였다.
대조군으로는 한정 배지(defined medium)로서, 1L 한정 배지 당 표 4의 함량의 성분을 포함하는 조성으로 구성되는 배지를 사용하였다.
성분 함량
Glucose 20g
Ammonium chloride 0.5g
Potassium dihydrogen phosphate 2.7g
Sodium phosphate, dibasic, anhydrous, assay 0.95g
Magnesium sulfate, anhydrous, assay 0.097g
* Trace element solution 1ml
** Vitamin solution 1ml
Yeast extract 10mg 10mg

* Trace element solution
Hydrochloric acid (25%, 7.7M) 10ml
Iron(II) chloride tetrahydrate 1.5g
Zinc chloride 70mg
Manganese(II) chloride tetrahydrate 100mg
Boric acid 6mg
Cobalt chloride hexahydrate 190mg
Copper(II) chloride dehydrate 2mg
Nickel(II) chloride hexahydrate 240mg
Disodium molybdate dehydrate 36mg
Distilled water 990ml
** vitamins solution (1L)
Vitamin B12 100mg
P-aminobenzoic acid 80mg
D(+)-biotin 20mg
Nicotinic acid 200mg
Calcium pantothenate 100mg
Pyridoxine hydrochloride 300mg
Thiamine-HCl 200mg
Distilled water 1L
상기 제조된 배지에 효모를 배양하였다. 배양 미생물은 효모인 Yarrowia sp. 을 사용하였고 직접 분리 한 종을 사용하였다. Yarrowia sp.를 쉐이킹 인큐베이터에서 28℃, 150rpm의 조건으로 84시간동안 배양하였다. 상기 배양에 따른 효모의 생장 결과로서, 바이오매스의 생성량을 도 7에 나타내었다.
상기 결과, 84시간 뒤 대조군인 한정 배지에서 배양한 경우 생성된 바이오매스는 5.4g/L인 반면, 교반으로 용출 처리한 막걸리 부산물 용액을 포함하는 배지의 경우 15.0g/L가 생성된 것으로 나타나, 막걸리 부산물을 이용한 배지에서 효모가 매우 우수한 생장 효과가 있음을 확인하였다.

Claims (21)

  1. 막걸리 또는 이의 부산물을 용출 처리하여 얻어지며, 포도당 함량 5.0 g/L 내지 200 g/L를 함유하는 막걸리 용출물을 포함하는 에틀리아(Ettlia) 속 미세조류 배양용 배지 조성물로서,
    상기 용출 처리는 20 내지 80℃ 온도범위에서 교반하는 것이고,
    상기 에틀리아 속 미세조류는 바이오매스 생성 특성을 갖는 것인, 배지 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 막걸리 부산물은 막걸리 제조후 얻어지는 쌀찌꺼기 또는 효모 또는 주박인 것인, 배지 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 막걸리 용출물은 아래 식 1에 의해 산출된 TN 비율이 100 내지 1000인 것인, 배지 조성물.
    [식 1]
    TN 비율 = ( TNK / TN0 ) × 100
    (TNK: 용출 처리 후의 TN (mg/L), TN0: 용출 처리 전의 TN (mg/L))
  4. 제1항에 있어서, 상기 막걸리 부산물의 용출물은 총 질소(total nitrogen)를 0.5 내지 5g/L로 포함하고;
    미량 원소, 비타민, 및 물을 추가로 포함하는, 배지 조성물.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 20 내지 80℃ 온도범위에서 교반에 의한 용출 처리는 교반기를 사용하여 수행되는 것인, 배지 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제4항에 있어서, 상기 미량 원소는 나트륨(Na), 인(P), 칼륨(K), 황(S), 칼슘(Ca), 마그네슘(Mg), 붕소(B), 망간(Mn) 및 철(Fe)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 배지 조성물.
  13. 막걸리 또는 이의 부산물을 물과 혼합하여 막걸리 부산물 용액을 제조하는 단계; 및 상기 막걸리 부산물 용액을 용출 처리하여 막걸리 부산물의 용출물을 얻는 단계를 포함하는, 에틀리아(Ettlia) 속 미세조류 배양용 배지 조성물의 제조 방법으로서,
    상기 용출 처리는 20 내지 80℃ 온도범위에서 교반하여 당을 가수분해하는 것이고,
    상기 에틀리아 속 미세조류는 바이오매스 생성 특성을 갖는 것인, 제조방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 막걸리 부산물은 막걸리 부산물은 막걸리 제조 후 얻어지는 주박 또는 효모 또는 쌀 찌꺼기인 것인, 방법.
  15. 삭제
  16. 제13항에 있어서, 상기 20 내지 80℃ 온도범위에서 교반에 의한 용출 처리는 교반기를 사용하여 수행되는 것인, 제조 방법.
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
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