CN106318984B - 一种产油微生物制脂肪酸甘油脂的方法及其甘油脂和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用产油微生物制备脂肪酸甘油脂的方法。直接以脂肪酸为酰基供体，或补充甘油或甘油与葡萄糖的混合物后，以产油酵母为全细胞催化剂，有氧发酵获得含油脂菌体，并从菌体中提取微生物油脂。该方法能够获得含有多种脂肪酸并以一种为主的油脂，经分离提取后，在研究患有脂肪代谢疾病病体内甘油酯代谢情况中的应用，以及作为精细化学品、医药、食品添加剂或材料中间体，为微生物油脂的高值化生产提供了新途径，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物油脂的生产，特别涉及一种利用以产油酵母或产油霉菌为全细胞催化剂，脂肪酸为酰基供体，必要时补充甘油或葡萄糖或甘油与葡萄糖组合，进行全细胞催化制备甘油脂的方法。
背景技术
产油酵母、霉菌、细菌和一些藻类等产油微生物在一定条件下，将可发酵性糖转化为胞内油脂，称为微生物油脂。据报道，部分产油微生物在胞内积累的油脂可以达到自身干重的70％以上(Li YH,Zhao ZB,Bai FW.High-density cultivation of oleaginousyeast Rhodosporidium toruloides Y4 in fed-batch culture.Enzyme MicrobTechnol,2007,41(3):312-317)。利用微生物生产油脂，不受场地、季节及气候的影响，不占用农田耕地，生产时间短，容易实现油脂生产的规模化、连续化。微生物油脂在脂肪酸组成上与动、植物油油脂相似，因此，开发微生物油脂可以为生物能源产业发展提供新原料，具有重要的应用前景。
随着社会生活的不断发展，人们对于油脂化学品的需求量剧增的同时也呈现出产品需求种类的多样化。油脂化学品广泛应用于化妆品、食品、制药、润滑剂、去污剂等(JinMJ,Slininger PJ,Dien BS,et al.Microbial lipid-based lignocellulosicbiorefinery:feasibility and challenges.Trends Biotechnol.,2014,33(1),43-54.),还可用于追踪人类脂肪代谢途径，研究甘油酯在患有脂肪代谢疾病病人员体内代谢情况(Cascio G,Schiera G.and Liegro ID.Dietary fatty acids in metabolic syndrome,diabetes and cardiovascular diseases.Curr.Diabetes Rev.,2012,8,2-17.Renata Mand Dariush M.Trans fatty acids:effects on metabolic syndrome,heart diseaseand diabetes.Nat Rev Endocrinol.,5(6):335-344.)。充分开发利用微生物油脂，拓宽其应用范围，将显著提高其自身价值，同时降低微生物油脂生产成本。
目前，利用产油酵母发酵生产时，绝大多数微生物积累的脂肪酸以油酸、棕榈酸、硬脂酸为主，另外还能少量积累亚油酸、肉豆蔻酸、亚麻酸、二十碳酸、二十二碳酸和二十四碳酸等。利用产油生产这类脂肪酸，用途虽广，但是限制了其进一步的开发潜力。因此，拓宽产油酵母油脂产物的图谱提高微生物油脂经济价值具有重要意义。
产油酵母和霉菌具有较强的油脂代谢和储存能力，拓宽产油微生物油脂产物的图谱相关研究已有文献报道。首先，通过基因改造提高多不饱和脂肪酸的生产(Xue Z,SharpePL,Hong SP,et al.Production of omega-3 eicosapentaenoic acid by metabolicengineering of Yarrowia lipolytica.Nature Biotechnol.2013,31,734-740.)。第二，通过合成生物学手段开发利用产油酵母自身的异戊二烯途径生产高价值的产品(Zhou YJ,Gao W,Rong QX,et al.“Modular pathway engineering of diterpenoid synthases andthe mevalonic acid pathway for miltiradiene production”J.Am.Chem.Soc.2012,134(6),3234–3241.)。最后，利用天然代谢网络，利用产油微生物自身对于脂肪酸积累的偏好性生产所需的产品(
M,Laakso S.Esterification of conjugated linoleicacid by yeasts for increasing thevalue of plant materials.ProcessBiochem.2014,49,1831-1837)。
发明内容
生物来源的油脂在化工生产中起到重要的作用。目前利用产油微生物进行发酵产油脂存在的问题是，生产的油脂中脂肪酸图谱偏窄，而且集中于油酸和棕榈酸，而硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、棕榈油酸含量低，造成其应用范围窄、经济性差。发明人认为以产油酵母或霉菌为平台，脂肪酸为酰基供体，采用全细胞催化的方式，可显著促进底物的代谢效率，拓宽微生物油脂的产品图谱，改善微生物油脂的技术经济性。因此，发明人利用大量产油微生物进行了科学实验，发现部分产油微生物菌株具有优良的全细胞催化生产油酯的生理特性。
本发明在于提供一种以产油酵母或产油霉菌为全细胞催化剂，以常见脂肪酸或常见脂肪酸与13C全标记脂肪酸的混合物为酰基供体，直接或补充甘油、葡萄糖、蔗糖中的一种或几种后，全细胞催化生产制备微生物油脂的方法。本发明工艺简便、方法易行、可高效利用和转化脂肪酸和甘油并合成甘油酯，该甘油酯可以用于精细化学品、医药、食品添加剂和材料中间体，能够有效改善改善微生物油脂生产技术的经济性。
本发明通过以下技术方案予以实现：
以脂肪酸为脂肪酰基供体，以产油酵母或产油霉菌作为全细胞催化剂，在水相中反应获得含有多种脂肪酸的甘油脂。
反应环境为培养基，培养基中接种产油微生物种子，接种量(以干细胞(Dry cellweight，DCW)计)为0.5g/L-30g/L，微生物与脂肪酸的质量比为5/100至60/100；在pH值3.0-8.0，温度15℃-40℃下有氧发酵，至发酵液中脂肪酸浓度低于1g/L。
所述产油酵母为斯达式油脂酵母Lipomyces属、丝孢酵母Trichosporon属、隐球酵母Cryptococcus属、冬孢酵母Rhodosporidium属中的一种或二种以上；所述产油霉菌为Mortierella属、Mucor属或Endomycopsis属菌株中的一种或二种以上。
所述脂肪酸为十碳酸、十一碳酸、月桂酸、十三碳酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、13C全标记的十碳酸、十一碳酸、月桂酸、十三碳酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸中的一种或二种以上。
在水相中反应后，弃上清，沉淀经2000-10000g离心3-30min，然后用1/5发酵体积的乙醇、石油醚各洗涤一次，置于60-110℃，烘干过夜，获得菌体，提取获得油脂。
反应环境为产油微生物的培养基，培养基为液体培养基，培养基中含有甘油、葡萄糖、蔗糖中的一种或二种或三种，其中甘油、葡萄糖、蔗糖中的一种或二种或三种的总量不高于脂肪酸质量的20％，上述物质在培养基中的总浓度2-50g/L；
培养基中还含有维持pH所需的缓冲盐，上述缓冲盐为3-(N-吗啉基)丙磺酸、2-(N-吗啡啉)乙磺酸磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸钾、磷酸、盐酸或硫酸中的一种或二种以上；
所述产油微生物培养在有氧条件下进行，培养温度15℃-40℃，pH值3.0-8.0。
所获得含多种脂肪酸的甘油脂，底物脂肪酸占总脂肪酸质量的40％-95％。
按照本发明所述方法制备得到的脂肪酸甘油酯可以在制备诊断脂肪代谢病标记物中应用。所述甘油酯用于精细化学品、医药、食品添加剂和材料中间体。
具体技术方案为：
1、制备产油培养基。通过下述方法的一种或它们的必要组合方法实现：
A.将脂肪酸制成质量浓度为0.5％-10％的乳浊液，pH 3.0-8.0，灭菌后备用；或，
B.将脂肪酸制成质量浓度为0.5％-10％的乳浊液，并添加不高于脂肪酸质量20％的甘油，pH 3.0-8.0，灭菌后备用；或，
C.将脂肪酸制成质量浓度为0.5％-10％的乳浊液，并添加不高于于脂肪酸质量20％的甘油和葡萄糖的混合物，pH 3.0-8.0，灭菌后备用；
培养基中还含有维持pH所需的缓冲盐，如3-(N-吗啉基)丙磺酸、2-(N-吗啡啉)乙磺酸磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸钾、磷酸、盐酸、硫酸中的一种或几种组合。
2、产油微生物培养。向步骤1所述培养基中接种产油微生物种子，接种量(以干细胞(Dry cell weight，DCW)计)为0.5g/L-30g/L，在15℃-40℃下有氧发酵，至发酵液中脂肪酸浓度低于1g/L。
3、菌体收集和微生物油脂提取。培养结束后，采用离心、过滤或其他必要的方法浓缩收集产油微生物细胞。参照文献(李植峰，张玲、沈晓京等.四种真菌油脂提取方法的比较研究。微生物学通报,2001,28(6):72-75)使用酸热-有机溶剂法提取获得油脂，计算菌体油脂含量。将所得油脂进行甲酯化，并进行气相色谱检测。
本发明使用的产油微生物菌体油脂含量可超过细胞干重20％(w/w)，并且具有转运和积累脂肪酸的生理特性的微生物，它们包括但不限于油脂酵母Lipomyces属、丝孢酵母Trichosporon属、隐球酵母Cryptococcus属、冬孢酵母Rhodosporidium属，油脂酵母Lipomyces，Mortierella属、Mucor属和Endomycopsis属菌株。这些菌株可以直接从包括中国普通微生物菌种管理中心(CGMCC)及美国典型培养物保藏中心(ATCC)等菌种保藏机构购买或从自然界中分离，也可以使用与原来菌株性状不同的人工或自然突变菌株。
本发明采用脂肪酸单独培养的方法、脂肪酸与甘油混合的方法、脂肪酸与葡萄糖、甘油混合的方法或者组合必要的方法，制备含有脂肪酸的原料。
本发明的有益效果是：1)技术操作简单有效，生产周期短；2)微生物全细胞催化合成甘油酯，相对于化学催化，条件温和，无毒害废弃物产生，更为绿色环保；3)利用微生物合成C13标记的甘油酯微生物油脂，开拓了微生物油脂的应用范围，为提高微生物油脂价值提供了新的技术。
附图说明
图1为实施例1中全细胞催化产生的油脂脂肪酸组成分析结果。
具体实施方式
下面是具体实施例，它们有助于了解本专利以及不同工艺对微生物油脂生成的影响，但不局限于本发明的内容。
实施例1
1)将13C全标记的油酸-13C18与常见油酸，按照1/19的质量比制成终浓度20g/L乳化液，3-(N-吗啉基)丙磺酸50mM，Tween 80 20g/L，pH 7.0，所得培养基灭菌121℃灭菌后备用；
2)产油酵母Rhodosporidium toruloides CGMCC 2.1389(来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)在液体种子培养基中，于33℃，200转/分钟振荡培养28小时，8000rpm离心5min，弃上清；
3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量(以DCW计)为6g/L，在33℃下通气培养60小时；
4)终止发酵，此时发酵液中残余脂肪酸浓度低于为0.5g/L；将发酵液在5000g离心5min，弃上清，菌体用1/5发酵液体积的乙醇、石油醚各洗涤一遍，105℃干燥过夜，得干菌体20.3g/L，油脂含量71.8％，甘油脂占总油脂的90.7％，含油酸的甘油三酯占总甘油三酯的95％，13C18标记的油酸占总油酸质量的5％。
实施例2
1)将13C全标记的棕榈酸-13C16与常见棕榈酸按1/9的质量比制成乳化液，棕榈酸10g/L，2-(N-吗啡啉)乙磺酸30mM，Tween 80 20g/L，pH5.0，所得培养基灭菌后备用；
2)产油酵母Trichosporon cutaneum CGMCC 2.571(菌株来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)在液体种子培养基中，于30℃，200转/分钟振荡培养24小时，8000rpm离心5min，弃上清；
3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量(以DCW计)为4g/L，在30℃下通气培养48小时；
4)终止发酵，此时发酵液中硬脂酸浓度小于0.3g/L；将发酵液在10000g离心3min，弃上清，菌体用1/5发酵液体积的乙醇、石油醚各洗涤一遍，60℃干燥过夜，得干菌体10.5g/L，油脂含量51.3％，甘油三脂占总油脂的84％，含棕榈酸的甘油三酯占总甘油三酯的87％，含13C全标记的棕榈酸-13C16占总棕榈酸质量的10％。
实施例3
1)将月桂酸制成乳化液，月桂酸10g/L，Tween 80 10g/L，用5M氢氧化钠和4M盐酸调整并保持pH 6.5，所得培养基灭菌后备用；
2)产油酵母Cryptococcus curvatus ATCC 20509(来源于美国典型微生物菌种保藏中心)在液体种子培养基中，于28℃，200转/分钟培养20小时；
3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量(以DCW计)为4g/L，在28℃下通气培养60小时；
4)终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和甘露糖的月桂酸浓度分别为低于0.1g/L和9.9g/L；将发酵液在2000g离心30min，弃上清，菌体用1/5发酵液体积的乙醇、石油醚各洗涤一遍，110℃干燥过夜，得干菌体9.3g/L，油脂含量57.4％，甘油三酯占总油脂的88.5％，含月桂酸的甘油三酯含量占总甘油三酯的48％。
实施例4
1)将癸酸酸制成乳化液，癸酸5g/L，Tween 80 10g/L，用5M氢氧化钠和2M硫酸调整并保持pH 4.5，所得培养基除菌后备用；
2)产油酵母Lypomyces starkeyi CGMCC 2.1560(来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)在液体种子培养基中，于35℃，200转/分钟培养48小时；
3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量(以DCW计)为3g/L，在35℃下通气培养120小时；
4)终止发酵，此时发酵液中残余癸酸的浓度低于1.0g/L；将发酵液在5000g离心10min，弃上清，菌体用1/5发酵液体积的乙醇、石油醚各洗涤一遍，105℃干燥过夜，得干菌体6.3g/L，油脂含量的42.8％，甘油三脂占总油脂含量的84.9％，含癸酸的甘油三酯含量占总甘油三酯的40％。
实施例5
1)将肉豆蔻酸制成乳化液，肉豆蔻酸50g/L，Tween 80 20g/L，用0.1M磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液维持pH 7.5，所得培养基除菌后备用；
2)产油酵母Lipomyces starkeyi CGMCC 2.1608(来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)在液体种子培养基中，于30℃，200转/分钟培养48小时；
3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量(以DCW计)为10g/L，在37℃下通气培养120小时；
4)终止发酵，此时发酵液中残余肉豆蔻酸的浓度＜1.0g/L；将发酵液在5000g离心5min，弃上清，菌体用1/5发酵液体积的乙醇、石油醚各洗涤一遍，105℃干燥过夜，得干菌体36.4g/L，油脂含量62.8％，甘油三脂占总油脂的87％，含肉豆蔻酸的甘油三酯含量占总甘油三脂的75％。
实施例6
1)将亚油酸制成乳化液，亚油酸5g/L，2-(N-吗啡啉)乙磺酸50mM，Tween 80 20g/L，pH 5.5，所得培养基除菌后备用；
2)产油酵母Yarrowia lipolytica CGMCC 2.1398(来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)在液体种子培养基中，于33℃，200转/分钟培养26小时；
3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量(以DCW计)为3g/L，在35℃下通气培养48小时；
4)终止发酵，此时发酵液中残余亚油酸的浓度为0.9g/L；固液分离收集菌体，干燥，得干菌体5.3g/L，油脂含量4 2.8％，甘油三脂占总油脂的83％，含亚油酸的甘油三酯含量占总甘油三酯的40％。
实施例7
1)将甘油和油酸混合液(13C全标记的油酸-13C18与常见油酸按1/19的质量比终浓度20g/L)配制成混合乳化液，甘油4g/L，脂肪酸20g/L，50mM 2-(N-吗啡啉)乙磺酸，Tween80 20g/L，pH 5.5，所得培养基除菌后备用；
2)产油酵母Lipomyces starkeyi CGMCC 2.1390(来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)在液体种子培养基中，于30℃，200转/分钟培养48小时；
3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量(以DCW计)为10g/L，在35℃下通气培养72小时；
4)终止发酵，此时发酵液中残余甘油和油酸的浓度分别为0.0g/L和0.9g/L；将发酵液在5000g离心5min，弃上清，菌体用1/5发酵液体积的乙醇、石油醚各洗涤一遍，105℃干燥过夜，得干菌体26.3g/L，油脂含量56.3％，甘油三酯占总油脂的92％，含油酸甘油三酯占甘油三酯的90％，13C全标记的油酸-13C18占总油酸的5％。
实施例8
1)将甘油和十一酸配制成混合乳化液，甘油2g/L，十一酸10g/L，pH 8.0，所得培养基灭菌121℃灭菌后备用；
2)产油酵母Lipomyces starkeyi CGMCC 2.1608(来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)在液体种子培养基中，于28℃，200转/分钟振荡培养36小时；
3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量(以DCW计)为5g/L，在35℃下通气培养38小时；
4)终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和甘露糖的浓度分别为2.0g/L和0.7g/L；将发酵液在5000g离心5min，弃上清，菌体用1/5发酵液体积的乙醇、石油醚各洗涤一遍，105℃干燥过夜，得干菌体11.3g/L，油脂含量64.5％，甘油三酯占总油脂的87％，含十一酸的甘油三酯占总甘油三酯的84.7％。
实施例9
1)将甘油和肉豆蔻酸混合液(13C全标记的肉豆蔻酸-13C14与常见肉豆蔻酸按1/29的质量比混合)配制成混合乳化液，甘油10g/L，脂肪酸60g/L，50mM 2-(N-吗啡啉)乙磺酸，Tween 80 20g/L，pH 5.5，所得培养基除菌后备用；
2)产油酵母Rhodotorula glutinis CGMCC 2.703(来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)在液体种子培养基中，于30℃，200转/分钟培养48小时；
3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量(以DCW计)为25g/L，在35℃下通气培养112小时；
4)终止发酵，此时发酵液中残余甘油和油酸的浓度分别为0.0g/L和0.9g/L；将发酵液在5000g离心5min，弃上清，菌体用1/5发酵液体积的乙醇、石油醚各洗涤一遍，105℃干燥过夜，得干菌体60.3g/L，油脂含量71.3％，甘油三酯占总油脂的89％，含肉豆蔻酸的甘油三酯占总甘油三酯的90％，13C标记的肉豆蔻酸-13C14占总肉豆蔻酸的3.3％。
实施例10
1)将甘油和月桂酸配制成混合乳化液，甘油4g/L，月桂酸27g/L，50mM磷酸盐缓冲液，Tween 80 20g/L，pH 7.5，所得培养基除菌后备用；
2)产油酵母Cryptococcus albidus ATCC 56298(美国典型培养物保藏中心)在液体种子培养基中，于30℃，200转/分钟培养48小时；
3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量(以DCW计)为10g/L，在35℃下通气培养65小时；
4)终止发酵，此时发酵液中残余甘油和油酸的浓度分别为0.0g/L和0.5g/L；将发酵液在5000g离心5min，弃上清，菌体用1/5发酵液体积的乙醇、石油醚各洗涤一遍，105℃干燥过夜，得干菌体23.3g/L，油脂含量61.3％，甘油三脂占总油脂的89％，含月桂酸的甘油三酯含量占甘油三酯的50％。
实施例11
1)将甘油和棕榈酸混合液(13C全标记的棕榈酸-13C16与常见肉豆蔻酸按1/30的质量比混合)13C标记的棕榈酸配制成混合乳化液，甘油5g/L，脂肪酸33g/L，50mM 2-(N-吗啡啉)乙磺酸，Tween 80 20g/L，pH 5.5，所得培养基除菌后备用；
2)产油酵母Rhodotorula minuta CGMCC 2.1517(来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)在液体种子培养基中，于30℃，200转/分钟培养24小时；
3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量(以DCW计)为12g/L，在30℃下通气培养65小时；
4)终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和甘露糖的浓度分别为0.2g/L和1.3g/L；固液分离收集菌体，干燥，得干菌体27.3g/L，油脂含量64.1％，甘油三酯占总油脂的93％，含棕榈酸的甘油三酯占总甘油三酯的85％，13C全标记的棕榈酸占总棕榈酸的3％。
实施例12
1)将甘油和十三酸配制成混合乳化液，甘油2g/L，十三酸10g/L，50mM 2-(N-吗啡啉)乙磺酸，Tween 80 5g/L，pH 5.5，所得培养基除菌后备用；
2)产油酵母Lipomyces starkeyi CICC 1715(源于中国工业微生物菌种保藏管理中心)在液体种子培养基中，于30℃，200转/分钟培养24小时；
3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量(以DCW计)为0.5g/L，在30℃下通气培养10小时；
4)终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和甘露糖的浓度分别为0.4g/L和0g/L；固液分离收集菌体，干燥，得干菌体1.1g/L，油脂含量57.6％，甘油三脂占总油脂的88％，含十三酸甘油三酯的含量占总甘油三脂的89％。
实施例13
1)将甘油和亚油酸配制成混合乳化液，甘油10g/L，亚油酸54g/L，50mM 2-(N-吗啡啉)乙磺酸，pH 6.5，所得培养基除菌后备用；
2)产油霉菌Mortierella isabellina CGMCC 3.3410(来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)在液体种子培养基中，于30℃，200转/分钟培养48小时；
3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量(以DCW计)为5g/L，在35℃下通气培养100小时；
4)终止发酵，此时发酵液中残余甘油和油酸的浓度分别为0.0g/L和0.9g/L；固液分离收集菌体，干燥，得干菌体30.3g/L，油脂含量69.5％，甘油三酯占总油脂的92％，油酸占总脂肪酸的72％，亚油酸占总脂肪酸的15％。
实施例14
1)将葡萄糖、甘油和油酸配制成混合乳化液，葡萄糖2g/L，甘油4g/L，油酸30g/L，50mM 2-(N-吗啡啉)乙磺酸，pH 3.0，所得培养基除菌后备用；
2)产油霉菌卷枝毛霉Mucor circinelloides ITCC 6025(来源于印度典型培养物保藏管理中心)在液体种子培养基中，于30℃，180转/分钟培养36小时；
3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量(以DCW计)为12g/L，在37℃下通气培养84小时；
4)终止发酵，此时发酵液中残余甘油和油酸的浓度分别为0.0g/L和0.9g/L；固液分离收集菌体，干燥，得干菌体40.3g/L，油脂含量71.3％，甘油三酯占总油脂的92％，油酸占总脂肪酸的81％，亚油酸占总脂肪酸的16％。
实施例15
1)将葡萄糖、甘油和亚油酸配制成混合乳化液，葡萄糖3g/L，甘油5g/L，亚油酸混合物(亚油酸-13C18与常规亚油酸的质量比例为1/19)40g/L，Tween 80 20g/L，用5M氢氧化钠调节并保持pH 3.5，所得培养基除菌后备用；
2)产油酵母Rhodotorula lactosa CGMCC 2.1514(来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)在液体种子培养基中，于30℃，200转/分钟培养48小时；
3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量(以DCW计)为10g/L，在20℃下通气培养96小时；
4)终止发酵，此时发酵液中残余甘油和油酸的浓度分别为0.0g/L和0.9g/L；固液分离收集菌体，干燥，得干菌体30.3g/L，油脂含量71.3％，甘油三酯占总油脂的94％，亚油酸占总脂肪酸的40％，13C全标记的亚油酸-13C18占总亚油酸的5％(附图1)。
实施例16
1)将葡萄糖、甘油和棕榈酸配制成混合乳化液，葡萄糖40g/L，甘油10g/L，棕榈酸100g/L，Tween 80 20g/L，用氢氧化钾调节并保持pH 5.5，所得培养基除菌后备用；
2)产油酵母Rhodotorula glutinis CGMCC 2.499(来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)在液体种子培养基中，于30℃，200转/分钟培养48小时；
3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量(以DCW计)为25g/L，在35℃下通气培养140小时；
4)终止发酵，此时发酵液中残余甘油和油酸的浓度分别为0.0g/L和0.9g/L；固液分离收集菌体，干燥，得干菌体88.7g/L，油脂含量71.3％，甘油三酯占总油脂的92％，含棕榈酸的甘油三酯占总甘油三酯的93％。
实施例17
1)将葡萄糖、甘油和肉豆蔻酸配制成混合乳化液，葡萄糖2g/L，甘油5g/L，肉豆蔻酸44g/L，50mM 2-(N-吗啡啉)乙磺酸，pH 6.5，所得培养基除菌后备用；
2)产油霉菌Endomycopsis burtonii CICC 1365(源于中国工业微生物菌种保藏管理中心)在液体种子培养基中，于30℃，200转/分钟培养48小时；
3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量(以DCW)计)为10g/L，在15℃下通气培养42小时；
4)终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖、甘油和油酸的浓度分别为0.0g/L、0.0g/L和0.9g/L；固液分离收集菌体，干燥，得干菌体36.3g/L，油脂含量71.3％，甘油三酯占总油脂的87％，含肉豆蔻酸的甘油三脂占总甘油三酯的94％，
实施例18
1)将葡萄糖、甘油和月桂酸配制成混合乳化液，葡萄糖1g/L，甘油2g/L，月桂酸15g/L，50mM 2-(N-吗啡啉)乙磺酸，Tween 80 10g/L，pH3.0，所得培养基除菌后备用；
2)产油酵母Rhodotorula glutinis CGMCC 2.107(来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)在液体种子培养基中，于30℃，200转/分钟培养48小时；
3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量(以DCW计)为2g/L，在40℃下通气培养12小时；
4)终止发酵，此时发酵液中残余甘油和油酸的浓度分别为0.0g/L和0.9g/L；固液分离收集菌体，干燥，得干菌体4.3g/L，油脂含量71.3％，甘油三酯占总油脂的87％，含月桂酸的甘油三酯占总甘油三酯的85％。
实施例19
1)将葡萄糖、甘油和十一碳酸混合物(十一碳酸-13C11与常见十一碳酸质量比为1/99)配制成混合乳化液，葡萄糖5g/L，甘油9g/L，十一碳酸70g/L，50mM磷酸盐缓冲液，Tween80 20g/L，pH 7.0，所得培养基除菌后备用；
2)产油酵母Lipomyces starkeyi CGMCC 2.1390(来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)在液体种子培养基中，于25℃，200转/分钟培养48小时；
3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量(以DCW计)为15g/L，在35℃下通气培养92小时；
4)终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖、甘油和油酸的浓度分别为0.0g/L、0.0g/L和0.9g/L；固液分离收集菌体，干燥，得干菌体51.7g/L，油脂含量68.7％，甘油三酯占总油脂的91％，含十一碳酸的甘油三酯占总甘油三酯的95％，13C标记的十一碳酸-13C11占总十一碳酸的1％。
实施例20
1)将葡萄糖、甘油和癸酸配制成混合乳化液，葡萄糖1g/L，甘油2g/L，癸酸15g/L，Tween 80 5g/L，0.1M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，用氢氧化钾调节pH 8.0，所得培养基除菌后备用；
2)产油酵母Lipomyces starkeyi CGMCC 2.1390(来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)在液体种子培养基中，于30℃，200转/分钟培养48小时；
3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量(以DCW计)为2g/L，在30℃下通气培养20小时；
4)终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖、甘油和油酸的浓度分别为0.0、0.0g/L和0.9g/L；固液分离收集菌体，干燥，得干菌体10.3g/L，油脂含量69.3％，甘油三脂占总油脂的89％，含癸酸的甘油三酯占总甘油三脂的87％。
实施例21
将葡萄糖、甘油和十三酸配制成混合乳化液，葡萄糖10g/L，甘油4g/L，十三酸14g/L，Tween 80 20g/L，碳酸钠调节pH 4.5，所得培养基除菌后备用；
2)产油酵母Lipomyces kononenkoae CICC 1714(源于中国工业微生物菌种保藏管理中心)在液体种子培养基中，于30℃，200转/分钟培养48小时；
3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量(以DCW计)为7g/L，在35℃下通气培养36小时；
4)终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖、甘油和脂肪酸的浓度分别为0.0g/L、0.0g/L和0.9g/L；固液分离收集菌体，干燥，得干菌体19.4g/L，油脂含量65.6％，甘油三酯占总甘油酯的92％，含十三酸的甘油三酯占总甘油三酯的89％。
实施例22
1)将肉豆蔻酸、硬脂酸、油酸、亚油酸按照25:35:35:5的比例混合后制成乳化液，总脂肪酸浓度为50g/L，加入10g/L的甘油和20g/L的葡萄糖，Tween 80 20g/L，0.2M磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液维持pH 6.5，所得培养基除菌后备用；
2)产油酵母Cryptococcus curvatus ATCC 20509(来源于美国典型微生物菌种保藏中心)在液体种子培养基中，于30℃，200转/分钟培养24小时；
3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量(以DCW)计)为15g/L，在30℃下通气培养80小时；
4)终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖、甘油和脂肪酸的浓度分别为0.0g/L，0.1g/L和1.9g/L；固液分离收集菌体，干燥，得干菌体49.7g/L，油脂含量57.4％，TAG的含量78.5％，所得油脂中肉豆蔻酸、硬脂酸、油酸、亚油酸的含量分别为35％、20％、39％和6％，脂肪酸组成类似可可脂，可以作为可可脂替代品。
上述实施例中所得油脂用途举例说明
实施例1中所得的甘油脂，添加到小鼠食物中，研究油酸甘油酯在其体内的代谢，了解油脂代谢相关疾病的机理。选取雄性的C57BL/6小鼠40只，体重(15±1)g，适应性喂养1周，随机分为对照组和高脂组各20只。对照组给予普通基础饲料，实验组喂养高脂饲料(基础饲料中添加实施例1中的油脂，使饲料64％能量来自脂肪，24％能量来自碳水化合物，12％能量来自蛋白质，喂养6周。自由饮水，每周称重1次。两组小鼠禁食12h后，各随即取10只摘眼球取血，制血清，-80℃保存待测。取附睾周围及腹部皮下脂肪组织，液氮速冻，-80℃保存备用，采用ELISA法测定血清中PAI-1的水平。剩余的两组小鼠则采用同位素示踪法对油脂代谢进行追踪和采用代谢组学对小鼠肝脏、腹部皮下脂肪组织以及血液中脂肪酸的构成进行分析。结果表明高脂组小鼠体质量、血清PAI-1的水平比对照组分别高15％和200％。高脂肪组小鼠肝脏、腹部皮下脂肪组织以及血液中13C全标记脂肪酸含量占到总脂肪酸的4.7％，4.9％和5.1％，对照组组内13C全标记脂肪酸<1％。
实施例3所制备的甘油酯因含有月桂酸，经分离可作为精细化学品、医药中间体、材料中间体。
实施例5中所得甘油酯，分离后可以作为食品、药品、饮料的添加剂。
实施例6中的油脂可以作为功能性油脂，用于生产保健品。
实施例10中的油脂，所得油脂可以用作食品添加剂、药物中间体。
实施例17中所得油脂经过分离提纯，可用于防粘剂、润滑油、抗尘剂和浑浊剂。
实施例12和实施例21中所得含十三酸的油脂，可用作生产香皂、洗涤剂、化妆品表面活性剂、化学纤维油剂以及农副除草剂和杀虫剂的原料。
实施例22中所得油脂可以作为可可脂的替代品，用于巧克力、奶制品的生产。
Claims (6)
1.一种产油微生物制脂肪酸甘油酯的方法，其特征在于：以脂肪酸为脂肪酰基供体，以产油微生物作为全细胞催化剂，在水相中反应获得含有多种脂肪酸的甘油酯；
所述脂肪酸为十碳酸、十一碳酸、月桂酸、十三碳酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、13C全标记的十碳酸中的一种或二种以上，
所述反应的反应环境为：
A.将脂肪酸制成质量浓度为0.5%-10%的乳浊液，pH 3.0-8.0，灭菌后备用，所述的产油微生物为Rhodosporidium toruloides，Trichosporon cutaneum，Cryptococcus curvatus，Lypomyces starkeyi，Yarrowia lipolytica中的一种；
或，B. 将脂肪酸制成质量浓度为0.5%-10%的乳浊液，并添加不高于脂肪酸质量20%的甘油，pH 3.0-8.0，灭菌后备用，所述的产油微生物为Lipomyces starkeyi ，Rhodotorula glutinis，Cryptococcus albidus， Mortierella isabellina中的一种；或，C. 将脂肪酸制成质量浓度为0.5%-10%的乳浊液，并添加不高于脂肪酸质量20%的甘油和葡萄糖的混合物，pH 3.0-8.0，灭菌后备用，所述的产油微生物为Rhodotorula lactosa，Lipomyces starkeyi ，Lipomyces kononenkoae，Cryptococcus curvatus中的一种。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：反应环境为培养基，培养基中接种产油微生物种子，接种量以干细胞（Dry cell weight，DCW）计为0.5 g/L-30 g/L，微生物与脂肪酸的质量比为5/100至60/100；在pH值3.0-8.0，温度15℃-40℃下有氧发酵，至发酵液中脂肪酸浓度低于1g/L。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：在水相中反应后，经2000-10000 g离心3-30 min，弃上清，沉淀先后用乙醇、石油醚各洗涤一次， 60-110℃，烘干过夜，获得干菌体，提取获得油脂。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：甘油、葡萄糖的一种或二种的总量不高于脂肪酸质量的20%，上述物质在培养基中的总浓度为2-50 g/L；
培养基中还含有维持pH所需的缓冲盐，上述缓冲盐为3-(N-吗啉基）丙磺酸盐、2-（N-吗啡啉）乙磺酸盐、柠檬酸盐、碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸钾、磷酸盐中的一种或二种以上；培养基pH范围为3.0-8.0。
5.一种按照权利要求1-4任一所述的方法制备得到的脂肪酸甘油酯，其特征在于：所获得含多种脂肪酸的甘油酯，底物脂肪酸占总脂肪酸质量的40%-95%。
6.一种权利要求5所述的脂肪酸甘油酯在制备诊断脂肪代谢病标记物中的应用。
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| Low-cost lipid production by an oleaginous yeast cultured in non-sterile conditions using model waste resources;Santamauro et al.;《Biotechnology for Biofuels》;20141231;第7卷(第34期);全文 * |
| Yarrowia lipolytica as an oleaginous cell factory platform for production of fatty acid-based biofuel and bioproducts;Ali Abghari等;《Frontiers in Energy Research》;20121231(第2期);全文 * |
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