BR102015018119A2 - Process of biomass rich production in pigs for use in animal nutrition and / or fish employing agricultural waste amilace - Google Patents

Abstract

processo de produção de biomassa rica em pufas para uso em nutrição animal e/ou peixes empregando resíduos agroindustriais amiláceos a presente invenção consiste na utilização de resíduos agroindustriais de alto teor amiláceo para a produção de biomassa microbiana ou óleo rico em ácidos graxos poli-insaturados, para uso em alimentação animal e/ou peixes. mais especificamente, descreve processos de fermentação (cultivo) onde microrganismos oleaginosos capazes de acumular lipídios com alto teor de pufas são propagados, em condição adequada, sobre resíduos do processamento de alimentos como cereais, raízes e tubérculos, provenientes de agroindústrias brasileiras, e que funcionam como meio de cultura suplementado de nutrientes e suporte físico dos meios de cultura. a biomassa obtida nesses cultivos pode usada diretamente como um componente de alto teor de pufas para rações animais e/ou peixes, ou ser processado para a extração de óleos usado como ingrediente para a formulação de alimentos ou suplementos nutracêuticos para fins de nutrição animal e/ou peixes.

Description

PROCESSO DE PRODUÇÃO DE BIOMASSA RICA EM PUFAS PARA USO EM NUTRIÇÃO ANIMAL E/OU PEIXES EMPREGANDO RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS AMILÁCEOS

Campo da Invenção [001] . A presente invenção trata da produção de biomassa rica em PUFAs, ácidos graxos poli-insaturados, para aplicação na nutrição animal como alimento nutracêutico rico em ácidos graxos essenciais, a partir da polpa residual obtida da industrialização de matérias primas amiláceas. Meios alternativos utilizando subprodutos e resíduos agroindustriais são propostos para diminuir os custos de matéria prima necessária para a produção de biomassa microbiana rica em PUFAs.

Histórico da Invenção [002] . O uso de óleo de organismos unicelulares (SCO, single cell oils) como fonte de ácidos graxos essenciais tem aumentado nos últimos anos, comparado às fontes de origem animal e vegetal, devido às suas vantagens econômicas (Ratledge, 1992). Alguns microrganismos são capazes de produzir mais de 20% (P/P) de lipídeos totais, com uma elevada proporção de ácidos graxos poli-insaturados (AGPI), também conhecidos pela sigla PUFA (Polyunsatured Fatty Acids). Esses óleos são reconhecidamente benéficos para a saúde de seres humanos e outros animais. Os gêneros mais usados para produção de PUFAs são: Pythium, Morfierella, Porphyrídium, Thraustochytríum, Chlorella (Ratledge and Wynn, 2002), Lypomyces, Yarrowia, Rhodotorula (Ratledge, 1987) entre outros.

[003] . A fonte clássica de óleos ricos em PUFAS é animal (peixes), mas essa rota de produção é cara, é ambientalmente insustentável, e pode ser substituída pela produção através de microrganismos.

[004] . "Óleo de organismos unicelulares" é o termo usado para identificar lipídeos produzidos por diversas classes de microrganismos. Este óleo é adequado para ser usados na alimentação humana e animal ou em outros produtos, onde comumente óleos de origem animal ou vegetal são comumente empregados. É necessário reforçar que só alguns organismos podem acumular lipídeos: microrganismos produtores de 20% ou mais de lipídeos em relação ao peso seco são considerados oleaginosos (principalmente leveduras e fungos). Entretanto, existem alguns microrganismos capazes de acumular mais de 70% de lipídeos em relação à biomassa seca (Huang, Zong, WuandLiu; 2009).

[005] . A FDA (Food and Drug Administration) atribuiu o grau GRAS (Generally Recognized As Safe) para o ácido docosahexaenoico (DHA, ou ácido 22:6 n-3 Δ4, 7, 10, 13, 16,19-Docosahexaenoico) e para o ácido araquidônico (ARA, ou ácido 20:4 Δ5, 8, 11,14 n-6 eicosatetraenóico), com fórmula molecular C20H32O2.) originados de Mortierella alpina, em Maio de 2001, para seu uso em fórmulas nos Estados Unidos da América. Um incremento importante (mais de 50%) da produção de fórmulas infantis aconteceu nos EUA desde a primeira fórmula comercializada em Fevereiro de 2001.

[006] . São muitas as empresas que investem na produção de ácidos graxos essenciais e de ácidos graxos poli-insaturados como ARA e DHA especificamente a partir de fontes microbianas como algas e fungos, sob condições controladas. Esses ácidos graxos são extraídos quando as células são lisadas por métodos químicos ou físicos, e geralmente empregando solventes. O processo de refinamento é maior quando o produto final é destinado a consumo humano ou sua aplicação em medicamentos, mas para seu uso em alimentação animal o processo de refinamento é mais simples.

[007] . DHA é utilizado como aditivo na nutrição animal, pois promove uma lustrosa pelagem e de aparência saudável em cachorros e gatos. Em peixes (naturalmente ricos em PUFAs), óleos ricos em PUFAs são essenciais para promover rápido ganho de peso com a qualidade nutricional esperada.

[008]. Os ácidos graxos são importantes para o correto desenvolvimento de todo organismo, especialmente os PUFAs, os quais são divididos em dois grupos principais: ο ω-6 e co-3 (dependendo da posição da última dupla ligação da cadeia).Essas duas classes desempenham um rol importante no desenvolvimento e funcionamento do cérebro; ácido docosahexaenóico (DHA) e ácido araquidônico (ARA) de origem microbiana são adicionadas em fórmulas infantis em substituição a fontes animais (Vadivelan & Venkateswaran, 2014).

[009] . Os ácidos graxos formam parte das paredes celulares, preservam a fluidez da membrana celular (Higashiyama, Fujikawa, Park, & Shimizu, 2002), atuam como precursores de mediadores biológicos como os envolvidos na modulação da resposta inflamatória, liberação de citocinas, agregação plaquetária, resposta imune e trombose (Uauy, Mena, & Rojas; 2000). A suplementação na dieta com n-3 e n-6 PUFA pode incrementar a concentração desses ácidos graxos em tecidos reprodutivos, assim como a secreção uterina de PGF2a, que acelera a involução uterina após o parto e otimização da taxa de concepção em gados (Childs et al., 2007). Uma ingesta de alimentos com maior porcentagem de ARA comparado com outros ácidos graxos é necessária para o correto desenvolvimento neurológico e neurofisiológico (Brick, Garfield, Hoffman, Uauy, Birch; 2000), assim como também para a acuidade visual (Weiler, 2000).

[010] . A suplementação de rações animais com biomassa de microrganismos rica em proteínas, lipídios e vitaminas pode ser feita pela adição de microalgas, leveduras e fungos. As algas são normalmente adicionadas diretamente na formulação dos alimentos, enquanto leveduras e fungos são adicionados normalmente em forma de “carcaça celular" após o processo de extração de lipídios.

[011] . Na formulação de alimentos, o odor é considerado como um fator preponderante; a biomassa de alguns organismos, como Mortierello alpino ou Rhodotorula sp. não apresenta um forte odor comparado com alimentos aditivados com outros organismos como algumas microalgas.

[012] . A produção de óleos microbianos para uso como aditivos gera custos substanciais, que podem ser reduzidos pela cuidadosa bioprospecção de microrganismos e o seu cultivo em substratos selecionados, em condições controladas.

[013] . É por esses motivos e benefícios que surge a presente invenção, que apresenta uma alternativa de enriquecimento da formulação de alimento para nutrição animal, a um custo mais baixo que o processamento tradicional de SCOs, através do cultivo de microrganismos selecionados, usando resíduos agroindustriais amiláceos.

Composicãoda biomassa de microrganismos oleaginosos [014] . Os microrganismos empregados para a produção de ácidos graxos poli-insaturados são vários, mas hoje somente duas espécies de fungos são as mais empregadas em escala industrial: Mortierello olpina e Pythium sp. O gênero Mortierello é caracterizado por ser a espécie mais produtiva e inócua (Kyle, 1992 D.J., PCT Patent W092/13086). Outros organismos estão sendo ativamente pesquisados, e podem vir a ser aplicados para a produção industrial de SCOs no futuro próximo.

[015] . O fungo filamentoso Mortierello alpina é o microrganismo atualmente mais utilizado para a produção de PUFAs, especificamente para a produção de ácido araquidônico, para nutrição humana, extraído por métodos químicos. Diversos estudos, como o de Nisha, A., & Venkateswaran, G. (2011), demonstram a inocuidade da ingestão direta da biomassa de Mortierello alpina, avaliada em roedores. Essa biomassa tem grau GRAS - FDA para uso humano.

[016] . Mortierello alpino cultivada em meio com base em glicose e extrato de levedura (GY) por 7 dias a 28°C a 240 RPM numa incubadora agitada apresenta a seguinte composição: 10,75% de fibra crua, 40,95% de proteína, 3,98% de cinzas totais, 3,88% de umidade, 3,57% de carboidratos e 36,87% de ácidos graxos totais dos quais 35,6% é ácido araquidônico (Nisha, A., Rastogi, N. K., & Venkateswaran, G. 2011). A composição de ácidos graxos em Mortierella alpina pode ser manipulada variando as condições de fermentação (por exemplo, agitação, oxigenação, pH, etc.).

[017] . Outro gênero conhecido pela capacidade produtora de ácidos graxos para a alimentação humana é o Pythium spp., capaz de acumular EPA (Stredansky et a/., 2000) pudendo utilizar resíduos industriais tais como resíduo da indústria da soja e glicerol como substrato para a sua produção (Athalye et a/., 2009). A classe à qual pertence Pythium ainda não foi definido exafamente, mas é considerado como um fungo pela ATCC (American Type Culture Collecfion). Segundo o trabalho de Cheng, Walker, Hulbert and Raman (1999), a capacidade lipídica do gênero Phytium pode superar o 50% em relação à biomassa seca e num total de aproximadamente 40 g/L de biomassa seca conseguida com substratos alternativos como soja e óleos vegetais, conseguindo uma produção de até 2 g/L de ARA e 1,4 g/L de EPA.

[018] . Yarrowia lipolytica é uma levedura também conhecida como Candida, Endomycopsisou, Saccharomycopsis lipolytica, caracterizada por produzir grandes quantidades de ácidos orgânicos assim como ácidos graxos (Tsugawaef a/., 1969). Esta levedura também tem o grau GR AS pela FDA, porém na produção em escala industrial normalmente trabalha-se com uma concentração de até 40% de lipídeos totais (Papanikolaou et a/., 2002). A composição química das paredes celulares da levedura Yarrowia lipolytica está conformada por: 70% de carboidratos neutros, 7% de aminoácidos, 15% de proteínas, 5% de lipídeos e 0,8% de fósforo; o maior conteúdo lipídico encontra-se em forma de micelas intracelulares. (Veja and Dominguez, 1986) [019]. Os traustoquitrídeos do gênero Schizochytrium são também usados em escala industrial devido ao seu potencial de acúmulo de lipídios superior a 70% em relação ao peso seco (Gupta et ai, 2012). Esse gênero apresenta uma boa tolerância à salinidade, e atualmente vários processos e novas linhagens vêm sendo avaliados para a produção de PUFAs. O ácido graxo produzido em maior proporção por esse microrganismo é o DHA (30-40% dos lipídeos totais (Yokoyama and Honda, 2007).

Processos de produção de microrqanismos oleaginosos [020]. A produção de biomassa oleaginosa está mais dirigida à produção de DHA, ARA, EPA e outros ácidos graxos essenciais. Existem dois tipos de fermentação (cultivo) utilizados para a produção de biomassa: a fermentação em estado sólido e fermentação submersa. O tipo de fermentação com melhores resultados é a submersa, que apresenta a vantagem de ser de mais fácil ampliação de escala e controle do processo (Shinmen et al., 1989). As produções obtidas dependem também do microrganismo e do meio e condições de cultivo utilizados. Alguns exemplos industrialmente relevantes são descritos a seguir.

[021]. O gênero Mortierello produz biomassa rica em ARA. Barclay e William (1996) obtiveram até 22 g/L de biomassa. e 0,84 g/L/dia de ARA. Na patente de Akimoto, Higashiyama e Shimizu (2009): feita para a empresa Suntory utilizando a linhagem mutada SAM 2239, foi obtido um teor alto de ARA, de 75,1% em relação aos ácidos graxos totais. A empresa Martek Biosciences Co., aplica a patente desenvolvida por (Kyle, D.J 2011) na qual aminoácidos são adicionados como aditivos, sob condições especificas controladas, onde concentrações superiores a 24 g/L, com conteúdo de 51,2% de ARA, foram obtidas. Produções de 5,35g de lipídeos / lOOg de substrato (trigo aditivado com amido de milho) foram obtidas em fermentação em estado sólido (Xuemei et al.,2015), confirmando a eficácia do uso de substratos amiláceos.

[022] . O gênero Schizochytrium, reconhecido como um bom produtor de DHA, tem uso em desenvolvimento. Os melhores resultados registrados atualmente foram os obtidos em um processo de fermentação de batelada alimentada (Fed-Batch), onde 61,76 g/L de biomassa seca foram produzidos, equivalendo a 20,3 g/L de DHA por dia (Huang et ai, 2012). Alguns autores como Li et ai, 2015 afirmam que a mistura de fontes de carbonos como glicerol com glicose pode incrementar a produção de biomassa e DHA em até 15%.

[023] . Pythium é um dos microrganismos também empregados para a produção de ARA e EPA na formulação de leites infantis e de adultos, na patente desenvolvida por Kyle, 2007; o autor propõe o uso de substratos de baixo custo, por exemplo, proteínas e lactose, resíduo da indústria de laticínios empregando fermentação em bateladas em tanques agitados, obtendo aproximadamente 25 g/L de biomassa seca que contem até 40% de lipídeos totais, que é usado para a formulação do produto Simulac".

[024] . Wen e Athalye, 2009, registraram a patente onde empregam glicerol derivado da produção de biodiesel como fonte de carbono, conseguindo 6,3 g/L de biomassa seca com uma concentração de 14,71 mg/g de biomassa seca.

[025] . Existem outros microrganismos também estudados que são produtores de ácidos graxos, como a levedura do gênero Cryptococcus spp. mais a produção em escala industrial ainda não é um fato devido aos custos de produção e refinamento do produto final (Beavan et al 1992).Várias espécies de algas também têm sido estudadas, algumas espécies como Chlorella spp. produzem ácidos graxos essenciais de interesse em nutrição humana, como por exemplo o ácido gama linolênico (GLA) (Miura et al., 1993), e a alga verde Parietochloris incisa que produz ácido araquidônico (mais do 50% dos ácidos graxos totais) (Bigogno, C., Khozín-Goldberg, I., Alderstein, D., & Cohen, Z„ 2002).

Substratos [026] . Nos últimos anos, a utilização de resíduos agroindustriais como substratos tem aumentado consideravelmente. O Brasil, um dos maiores produtores agrícolas mundiais, tem desenvolvido tecnologias que empregam resíduos agroindústrias amiláceos, como mandioca, milho, arroz, batata, como substrato para processos fermentativos, resolvendo também problemas de contaminação e evitando gastos adicionais no tratamento de resíduos. A viabilização da produção de bioprodutos a partir de resíduos e subprodutos da indústria agrícola, agrega valor econômico a essas baratas matérias primas (Pandey, Soccol, Nigam, 2000).

[027] . O Brasil encontra-se entre os dez países de maior consumo de batata in natura (Pinelli et ai, 2006) e sua industrialização está em crescimento, consequentemente cresce a geração de resíduos com um alto poder poluidor. Cresce também a quantidade de resíduos gerados pela indústria da soja em forma de farelo, milho como farelo (9,43 milhões de toneladas), mandioca como bagaço (26,04 milhões de toneladas), manipueira (15,63 milhões de toneladas) e arroz como casca (1,55 milhões de toneladas), farelo (9,56 milhões de toneladas) segundo Woiciechowski et al. (2013).

Resíduos amiláceos da agroindústria brasileira.

[028] . A polpa residual de batata é um resíduo formado após um processo de peneiramento do descasque da batata e pelo permeado (após sedimentação da própria casca de batata, devido ao alto teor de umidade), este resíduo é composto de amido, celulose, hemicelulose, pectina, proteína, aminoácidos livres e sais, com propriedades de um coloide típico (Mayer, Hillebrandt; 1997). Resíduos sólidos como bagaço e casca das raízes da mandioca resultam da separação da fécula, contendo aproximadamente 60% de amido residual, componente mais importante para a sua utilização como substrato fonte de carbono na formulação de meios de cultura alternativos. Esses resíduos são também empregados na nutrição animal.

[029] . O Brasil é o segundo maior produtor de arroz mundialmente (FAO, 2013), porém a quantidade de resíduos como arroz quebrado, casca e o farelo são consideráveis e o valor comercial é baixo, sendo comumente destinados para alimentação animal. O arroz quebrado contém 78% de carboidratos e o farelo 43%, ambos na forma de amido, o que os torna em alternativas para utilização em processos de fermentação.

[030] . O farelo de trigo no Brasil atinge as 200 mil toneladas por ano, a concentração de carboidratos totais é de aproximadamente 80,7%; o amido presente no farelo é hidrolisado para o seu aproveitamento em fermentações alcoólicas; esse amido pode ser aproveitado no processo de fermentação para a produção de ácidos graxos.

[031] . Esses resíduos podem tornar-se poluentes ambientais quando não há destinação adequada. Na presente invenção os resíduos amiláceos da agroindústria brasileira são usados como uma fonte de carbono devido ao seu alto teor de carboidratos.

Estado da Arte [032] . Em inúmeros processos fermentativos os custos das matérias primas utilizadas nos meios de cultura impactam fortemente o preço final do produto (Langer, 2014). A utilização de resíduos agroindustriais na produção de biomassa de microrganismos ricos em PUFAs é uma forma efetiva de reduzir custos de produção. Sabe-se que lipídios de organismos oleaginosos podem atingir um alto valor agregado: o preço do óleo pode variar desde USD 0.30/kg a mais de USD 100.0/kg, e ainda mais se for constituído por um único ácido graxo (Gustone, F. D. 2001. O interesse no estudo e no desenvolvimento comercial de SCOs tem aumentado nos últimos vinte anos (Ratledge and Wynn 2002). Ácidos graxos estão atualmente em alta demanda como suplementos alimentícios, tanto para o público adulto quanto infantil. PUFAS são atualmente bem conhecidos pelos benefícios a saúde: prevenção de doenças coronárias, retinais e cerebrais; assim como sua metabolização para a biossíntese de moléculas bioativas (Serhan, 2005). Muitas dessas fontes microbianas são também empregadas na suplementação das rações para animais após processo de extração de lipídios por causa do seu potencial nutricional.

[033] . O Brasil produz atualmente mais de 1 Gt por ano de vegetais processados destinados à industria de alimentos. A geração de resíduos é considerável, e esses resíduos podem terminar sendo um problema ambiental, caso não tratados convenientemente. Os resíduos podem também apresentar uma alta contaminação microbiológica devido à própria flora que se propaga na decomposição do resíduo, assim como apresentar inconvenientes devido à composição química, por exemplo, os resíduos amiláceos precisam de uma hidrólise prévia para o seu aproveitamento. Resíduos com altos conteúdos protéicos são frequentemente utilizados na formulação de rações (Woiciechowski, 2013).

[034] . Devido à problemática na gestão desses resíduos agroindustriais e da falta de alternativas tecnológicas para uso como substrato na geração de produtos de alto valor comercial, é que surge a presente invenção, com a finalidade de gerar biomassa de microrganismos oleaginosos ricos em ácidos graxos polí-insaturados para sua utilização na formulação de alimentos para nutrição animal e de peixes, de forma sustentável, evitando assim poluição do solo, rios e córregos.

Citação das Figuras [035]. A Figura 1 em anexo proporciona um melhor entendimento do processo proposto, com vistas a produção de biomassa rica em PUFAs para uso em nutrição animal empregando resíduos agroindustriais amiláceos.

[036]. A Figura 1 demonstra igualmente etapas de extração dos óleos brutos da biomassa microbiana após a etapa de fermentação. O processo tecnológico consiste nas etapas de pré-tratamento, fermentação, e pós processamento conforme descrição detalhada da invenção e reivindicações.

Descrição Detalhada da Invenção [037] . Nessa seção são detalhadas as fases para a produção de biomassa rica em PUFAs assim como da extração dos lipídios dos microrganismos oleaginosos produzidos a partir de resíduos amiláceos.

[038] . Na presente invenção resíduos amiláceos (1) de agroindústrias brasileiras, especialmente as de processamento de arroz, milho e outros cereais (produção anual de mais de 100 milhões de toneladas), e de raízes e tubérculos (produção anual de mais de 30 milhões de toneladas) são utilizados como fonte de carbono em processos fermentativos em meio sólida e/ou fermentação submersa para produção de biomassa rica em ácidos graxos essenciais.

[039] , A partir de culturas estoque (2) de microrganismos selecionados, são produzidos inóculos em escala laboratorial, de acordo com particularidades de cada microrganismo; no caso das linhagens estritamente unicelulares, a cultura emerlenmeyer já caracteriza o inóculo, enquanto as culturas de fungos filamentosos são parcialmente desintegradas por homogeneização mecânica. Microrganismos adequados para este processo são os dos gêneros Mortierella, Phytium, Rhodotorula, Condida, Schyzochytrium e Traustochytríum, entre outros.

[040] . Em paralelo à produção de inóculo, é feito o pré-tratamento (3) do substrato (resíduo) amiláceo, que consiste em uma hidrólise ácida ou enzimática, de forma a aumentar o teor de açúcares redutores fermentescíveis, vitaminas e aminoácidos, com eventual filtração para remoção de sólidos suspensos. Após o pré-tratamento, o hidrolisado bruto ou filtrado segue para um processo de fermentação submersa (produção de biomassa rica em lipídios) (4). Em outra implementação deste processo, pode ser feita a fermentação do substrato diretamente (5), usando um ajuste do teor de umidade de forma que a atividade água se situe entre 0,7 e 1; em ambas as fermentações são adicionados micronutrientes específicos para cada espécie de microrganismo, como fosfato, cálcio, magnésio, ferro, manganês e cobre, entre outros.

[041] . Após a fermentação submersa (meio liquido), obtém-se uma biomassa com alta concentração de lipídios e mais especificamente de PUFAs, e para essa mistura é preferencialmente feita a separação da biomassa (6), que segue para posterior processamento (7). No caso da implementação do processo usando fermentação sólida (5), a biomassa oleaginosa com alta concentração de PUFAs é obtida em mistura com resíduos dos substratos sólido, e esse material segue para posterior processamento (7). Em ambas as implementações, a biomassa obtida na secagem (7) já constitui produto e pode ser usada diretamente como suplemento nutricional em ração animal ou de peixes, ou pode ser pós-processada para extração de óleo rico em PUFAs (9) e uma biomassa exaurida rica em proteínas, fibras e carboidratos que pode ser igualmente utilizada com suplemento nutricional em ração animal e/ou peixes. (10).

[042] , Portanto, a partir de microrganismos selecionados e resíduos agroindustriais amiláceas, é obtida uma biomassa microbiana rica em PUFAs, que podem ser concentrados ou usados diretamente para fins de alimentação animal ou de peixes.

Exemplos de implementação do processo: Exemplo 1: Preparação do inóculo [043] . Os microrganismos utilizados no processo de fermentação devem encontrar-se viáveis, porém, os mesmos devem ser repicados a partir de culturas que foram armazenadas a 4°C em meio PDA ou outro alternativo dependendo do microrganismo, e repicadas cada 2 meses.

[044] . Os inóculos de microrganismos fúngicos são preparados em frascos de erlenmeyer de 250 ml contendo 100 ml de meio composto por O, 02% de glicose e 0,01% de extrato de levedura, pH ajustado a 6,0 e esterilização por autoclavagem a 121°C por 15 minutos. Esse meio é inoculado com 3 discos de culturas estoques (placas de petri com o microrganismo ativado) e incubados a 25°C por 72 horas em um shaker orbital com uma agitação de 120 rpm. Após o processo de incubação, 10% v/v da suspensão obtida da homogeneização mecânica assepticamente, é utilizado como inoculo nas fermentações. A concentração final do inóculo oscila entre 6 a 8 mg/ml. O inoculo assim produzido antes do processo de homogeneização mecânica pode ser armazenado sob refrigeração até por 7 dias.

Exemplo 2: Preparação de extratos dos resíduos amiláceos [045] . Após seleção de um resíduo amiláceo, a moagem e peneiramento deve ser realizado, até obter partículas de tamanho inferiores a 5 mm. A preparação do extrato deve ser executada mantendo uma proporção de 10% (peso/volume) resíduo/água empregando 2% de ácido clorídrico 37% P. A, pode ser também utilizado enzimas amilolíticas. A suspensão é autoclavada por 15 min. a 120°C, e o pH corrigido a 6,0. Caso o extrato possua um teor baixo de açúcar, uma padronização pode ser efetuada adicionando glicose até uma concentração de 60 g/L de açúcares totais, quantificados através do método de DNS (Miller, 1959).

Exemplo 3: Produção de biomassa de Mortierella sdd. rica em PUFAs sob fermentação submersa em escala piloto.

[046] . A produção de biomassa de Mortierella spp. rica em PUFAs é realizada em fermentadores de bancada de 10-L cada um com 5,4 L do extrato de resíduo amiláceo de batata, preparado como no exemplo 2, suplementado com sais conforme o meio de cultura descrito por Hasson e Dostalek (1988) modificado por Mamani (2014). O meio de cultura final é autoclavado a 121°C por 45 minutos, previa adição de antiespumante, pH ajustado a 6,0 com uma taxa de inoculação de 10% v/v como explicada no exemplo 1, agitação de 120 rpm, e aeração de 1 VVM, a 25°C por 7 dias. Dois tipos de fermentação podem ser executados: Batelada e Batelada alimentada. Para o caso de Batelada, as condições são as anteriormente descritas, enquanto para produção por batelada alimentada são adicionados pulsos de extrato dos resíduos com uma concentração de 2% (peso/volume) de açúcares fermentescíveis e 0,3% (peso/volume) de fonte de nitrogênio inorgânico a partir do quarto dia. A quantidade biomassa obtida é superior a 19,9 g/L com um teor de lipídeos totais de mais 25% de acordo com o tipo de fermentação e até 32% de ARA em relação à biomassa seca. Amostragens são feitas cada 12 horas para acompanhar a fermentação.

Exemplo 4: Produção de biomassa de Schizochytrium sdd. rica em PUFAs sob fermentação submersa em escala piloto.

[047] . A produção de biomassa de Schizochytrium spp. rica em PUFAs é realizada em fermentadores de bancada de 5-L cada um com 3 L do extrato de resíduo amiláceo de milho, preparado como no exemplo 2, suplementado com sais como: 3 g/L de fosfato de potássio, 2 g/L de sulfato de amônio, 0,4 g/L de KH2PO4, 18g de sal marinho e com 0,1 g/L de extrato de levedura. O meio de cultura final é autoclavado a 121°C por 45 minutos, pH ajustado a 5,5 com uma taxa de inoculação de 10% v/v, agitação de 120 rpm, aeração de 1 VVM, a 28°C por 3 dias. A quantidade biomassa obtida é de 25 g/L com um teor de lipídeos totais superior a 14,1 % e até 27% de DHA em relação à biomassa seca. Amostragens são feitas a cadal2h para acompanhar a fermentação.

Exemplo 5: Produção de biomassa de Rhodotorula sdd. rica em PUFAs sob fermentação submersa em escala de bancada.

[048] . A produção de biomassa de Rhodotorula spp. rica em PUFAs é realizada em fermentadores de bancada de 5-L cada um com 3 L do meio de cultura que contém: 20,0 g/L de resíduo amiláceo de mandioca (farinha); 1,5 g/L de MgS04; 0,2 g/L de (NH4)2S04; 7 g/L de KH2P04; 0,20 g/L de CaCI2 ; 0,02 g/L de ZnS04.7H20 e com 3,3 g/L de extrato de levedura. O meio de cultura final é autoclavado a 121°C por 45 minutos, o pH é ajustado a 5, com uma taxa de inoculação de 5% v/v, agitação de 150 rpm, aeração de 1VVM, a 28°C por período de7 dias. A quantidade biomassa obtida é de no minimo 11 g/L com um teor de lipídeos totais igual ou superior a 40 % em relação ao peso da biomassa seca. Amostras para avaliar produção de biomassa e acumulo de lipídios totais podem ser realizadas a cada 24h.

Exemplo 6: Produção de biomassa de Asperaillus sdd rica em PUFAS sob fermentação em estado sólido em escola de bancada.

[049]. Resíduo da indústria de trigo é secado a 80°C até obter peso constante, moído e classificado de forma a ter um tamanho de partícula de cerca de 1 a 2 mm. Em bandejas coloca-se o resíduo esterilizado (15 minutos a 120°C), e a biomassa é impregnada com uma solução que contém os seguintes sais: 2 g/L de KH2P04, 1 g/L de MgS04, 1,7 g de (NH4)2S04, 0,5 g/L de CaCI2. 2H20, 0,01 g/L de FeS04.7H20, 0,01 de ZnS04.7H20 e CuS04.5H20, assim como também 1 g/L de extrato de levedura. O substrato é inoculado com 5% V/M de suspensão micelial feita como explicada no exemplo 1 e ajustando a umidade para aproximadamente 50% com água estéril. Após homogeneização o material é incubado dentro de câmaras de cultivo, mantendo uma altura de leito de 2-5 cm, por 7 dias a 29°C. Sob estas condições consegue-se aproximadamente 7 g de biomassa/kg de resíduo com teor lipídico celular de 18%.

Exemplo 7: Produção de biomassa de Mucor spp.rlca em PUFAs sob fermentação em estado semissólido em escala de bancada.

[050]. Resíduos da indústria de farinha de mandioca são coletados, peneirados a 3,5 mesh e utilizados para executar uma fermentação semi-sólida para a produção de biomassa de Mucor spp: em frascos de Erlenmeyer de 250ml de capacidade são depositados 100 ml do meio de cultura semissólido, para a propagação da biomassa, que contem: 10 g/L de extrato de levedura e 100 g/L de farinha de tapioca; autoclavado por 15 min. a 120° C, com pH ajustado a 5,5. Após estes processos os frascos são inoculados com 10% V/V da suspensão micelial obtida como explicada no exemplo 1. A fermentação acontece em agitação em um shaker de agitação orbital a 30°C, a 120 rpm por 7 dias. Sob essas condições de fermentação são gerados 15 g/L de biomassa de Mucor spp. contendo 25% de lipídeos totais.

Exemplo 8: Extração do óleo da biomassa seca dos microrqanismos oleaginosos.

[051] . Após o processo de fermentação a biomassa ou mistura de substrato/biomassa é filtrada e lavada, a biomassa é seguidamente secada utilizando ar até alcançar peso constante. Amostras da biomassa ou mistura substrato/biomassa seca, são utilizadas para análise de lipídeos totais, com o método de Bligh-dyer (1959) e os ácidos graxos usando cromatografia de gases. Essa biomassa é triturada e submetida a uma extração sólido-líquido empregando hexano de grau alimentício numa proporção de 1L por cada 200 gramas de biomassa seca a temperatura ambiente a agitação constante, por duas horas. A suspensão é filtrada, o filtrado é evaporado para a recuperação do solvente obtendo óleo cru do microrganismo oleaginoso.

Exemplo 8: Secagem da biomassa de microrqanismos oleaginosos para fins de alimentação animal.

[052] . A biomassa filtrada é novamente lavada e seca usando corrente de ar (biomassa com ácidos graxos poli-insaturados provenientes de fosfolipídios e triglicerídeos remanescentes); a biomassa após esse processo já pode ser disponibilizada para ser adicionada na formulação de ração para nutrição animal.

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Akimoto K, Higashíyama K, Shimizu S (2009).Process for arachidonic acid-containing lipids, US patent 7585651 B2, filed January 28, 2005.

Athalye, Garcia, Wen (2009). Use of Biodiesel-Derived Crude Glycerol for Producing EicosapentaenoicAcid (EPA) by the fungus Phytiumirregulare. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57, 2739-2744.

Barclay, William R. Method for production of arachidonic acid. European Patent Specification 96200072.5, filed January 16, 1996.

Beavan, M., Kligerman, A., Droniuk, R., Drouin, C., Goldenberg, B., Effio, A. (1992). Production of microbial cocoa butter equivalents. Industrial applications of single cell oils pp. 156-18). Champaign, IL: American Oil Chemists Society Press.

Bigogno, C., Khozin-Goldberg, I., Alderstein, D., & Cohen, Z. (2002). Biosynthesis of arachidonic acid in the oleaginous microalga Parieto chlorisincisa (Chlorophyceae): radio labeling studies. Lipids, 37, 209-216.

Brick EE, Garfield S, Hoffman DR, Uauy R, Birch DG 2000. A randomized controlled trial of early dietary supply of long Chain polyunsaturated fatty acids and mental development in term infants. Develop Med Child Neurol. 42: 174-181.

Cheng, Walker, Hulbert, Raman (1999). Fungai production of eicosapentanoic and arachidonic acids from industrial waste streams and crude soybean oil. Biosource technology 67 101:110 Childs, S., J. M. Sreenan, A. A. Hennessy, C. Síanton, M. G. Diskin and D. A. Kenny, (2007). Effect of dietary ra-3 polyunsaturated fatty acid supplementation on hormonal and metabolite concentrations and corpus luteum size in beef heifers. ProceedingsoflrishAgriculturalResearchForum, Tullamore, March, pló.

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa). Disponível em: <http://www.cnpaf. embrapa.br/jornal/092007/ noticias/htm>. Acesso em: maio. 2015 Gupta A, Barrow CJ, Puri M (2012). Omega-3 biotechnology: Thraustochytrids as a novel source of omega-3 oils. Biotechnol Adv [Internet]. Elsevier Inc.; 2012:30(6):1733-45. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/i.biotechadv.2012.02.014 Gustone, F. D. (2001). Production and consumption of rapeseed oil on a global scale. Eur. J. Lipid Sei. Technol. 103, Weincheim, 447 - 449.

Hansson, L., Dostalek, M., (1988). Effect of culture conditions on mycelial growth and production of gamma-linoienic acid by Mortierella ramanniana. Appl. Microbiol. Biotechnol. 28, 240-246.

Higashiyama, K., Fujikawa, S., Park, E. Y., & Shimizu, S. (2002). Production of Arachidonic Acid by Mortierella Fungi, 252-262 Huang, C.,Zong,H.,Wu.,Liu,P.(2009).Microbial oil production from rice straw hydrolisate by Trichosporonfermentans. Bioresur. Technol. 100, 4535-4538).

Huang TY, Lu WC, Chu IM (2012). A fermentation strategy for producing docosahexaenoic acid in Aurantiochytrium limacinum SR21 and increasing C22:6 proportions in total fatty acid. Bioresour Technol [Internet]. Elsevier Ltd; 2012:123:8-14.

Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE). Disponível em: <http://www.ibge.gov. br/home/estatistica/economia/agropecuaria/ censoagro/brasil_2006/default.shtm>. Acessadoem: maio. 2015.

Jiang Y. and Xuan C. (2009). High efficiency method of producing high purity arachidonic acid by air lift type bioreactor. CN100475968 C, filed at December 6; 2004.) Kyle J. David, (2007). Arachidonic acid and methods for the production and use thereof. EP 1801 226 A2, filed 22 January, 1992, Kyle, D.J (2011); Arachidonic acid and methods for the production and use thereof. European patent EP 2322640A1; filed at March 3, 1996.

Langer, E.S., Rader, R.A. (2014). Powders and Bulk Liquids: Economics of Large-scale Culture Media andBuffer Preparation are Changing. BioProcess International, 12, March, p. 10-16.

Li J, Liu R, Chang G, Li X, Chang M, Liu Y, et al. (2015). A strategy for the highly efficient production of docosahexaenoic acid by Aurantiochytrium limacinum SR21 using glucose and glycerol as the mixed carbon sources. Bioresour Technol [Internet]. Elsevier Ltd; 2015;177:51-7. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0960852414016484 Mamani, L. D. G. (2014) Enhancement of arachidonic acid production by Morfierella alpina CBS 528.72 under submerged fermentation. Dissertation presented to PPGEBB - UFPR, 83pp.

Mayer, F.; Hillebrandt, J. O. (1997)Potato pulp: microbiological characterization, physical modification, and application of this agricultural waste produet. Applied Microbiology and Biotechnology, Berlin, v. 48, p. 435-440.

Miura, Y. Sode, K. Nakamura, N., Matsunaga, N. Matsunaga, Tadashi., (1992). Production of γ-linolenic acid from the marine green alga Chlorella sp. NKG 04240, 1993, FEMS Microbiology letters 107 pp 163-168 Nisha, A., & Venkateswaran, G. (2011). Effect of Culture Variables on Mycelial Arachidonic acid Production by Mortierella alpina, 232-240. doi: 10.1007/s 11947-008-0146-y, Nisha, A., Rastogi, N. K,.& Venkateswaran, G. (2011). Optimization of media components for enhanced arachidonic acid production by Mortierella alpina under submerged cultivation. Biotechnology and Bioprocess Engineeríng, 16, 229-237.) Pandey, A.; Soccol, C. R.; Nigam, P.; Soccol, V. T.; Vandenberghe, L. P. S.; Mohan, R (2000). Biotechnological potential of agro-industrial residues. II: cassava bagasse. Bioresource Technology, 74, 81-87, Pandey, A.; Soccol, C. R.; Nigam, P.; Soccol, V. T. (2000). Biotechnological potential of agro-industrial residues. I: sugarcane bagasse. Bioresource Technology, v. 74, p.69-80.

Papanikolaou S, Chevalot I, Komaitis M, Marc I, Aggelis G (2002). Single cell oil production by Yarrowia lipolytica growing on an industrial derivative of animal fat in batch cultures. AppI.Microbiol.Biotechnol: 58:308-12.

Pineli, L. L. O.: Moretti, C. L.; Almeida, G. C.; Santos, J. Z.; Onuki, A. C. A.;Nascimento, A. B. G. (2006). Caracterização química e física de batatas ágata e mona lisa minimamente processadas. Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 26, η. 1. p. 127-134, Ratledge, C( 1987). Lipid Biotechnology : A Wonderland for the Microbial Physiologist. J. Am. Oil Chem. Soc. 64 , 1647-1662 Ratledge, C., (1992). Tailor made oils and fats—possibilities for microbial oils. Rev. Française des Corps Gras 39, 325-332..

Ratledge,C.,J.P Wynn (2002). The biochemistry and molecular biology of lipid accumulation in oleaginous microorganisms. Adv.appI.Microbiol.51 :1-51.

Serhan CN. (2005). Special issue on lipoxins and aspirin-triggered lipoxins Prostaglandins LeukotEssent Fatty Acids 73139-321.321.

Shinmen, Y„ Shimizu, S., Akimoto, K„ Kawashima, H., &Yamada,H. (1989). Production of arachidonic acid by Morfierella fungi: selection of a potent producer and opfimization of culfure conditions for large-scale production. Applied Microbiology and Biotechnology, 31, 11-16).

Stredansky, Conti, Solaris (2000). Production of polyunsaturated fatty acids by Phytiumultimumin solid-state cultivation. Enzyme and Microbial Technology 26 304-307.

Tsugawa, R„ Nakase, T„ Koyabashi, T., Yamashita, K., Okumura, S., (1969). Fermentation of n-paraffins by yeast. Part III. -Ketoglutarate productivity of various yeasts. Agric. Biol. Chem. (Tokyo) 33, 929-938.

Yokoyama R, Honda D. (2007). Taxonomic rearrangement of the genus Schizochytrium sensu lato based on morphology, chemotaxonomic characteristics, and 18S rRNA gene phylogeny (Thraustochytriaceae, Labyrinthulomycetes): Emendation for Schizochytrium and erection of Aurantiochytrium and . Mycoscience.48:199-211.

Uauy, R., Mena, P., & Rojas, C. (2000). Essential fatty acids in early life: structural and functional role. Proceedings of Nutrition Society, 59. 3-15.

Vadivelan, G., & Venkateswaran, G. (2014). Production and enhancement of omega-3 fatty acid from Morfierella alpina CFR-GV15: its food and therapeutic application. BioMed Research International, 2014, 657414. doi: 10.1155/2014/657414 Vega R. Dominguez A. (1986). Cell wall composition of the yeast and mycelia forms of Yorrowia lipolytica. Arch. Microbiol 144:124-130.

Weiler, H.A., (2000). Dietary supplementation of arachidonic acid is associated with higher whole body weight and bone mineral density in growing pigs. Pediatr. Res. 47, 692-697.

Wen and Athalye, (2009). Producing eicosapentaenoic acid (EPA) from biodiesel-derived crude glycerol. WO 2009143007 A2. Filed 15 May, 2009.

Woiciechowski, A. L., Carvalho, J. C., Spier, M. R„ Habu, S.( Yamaguishi, C. T., Ghiggi, V., & Soccol, C. R. (2013). Emprego de resíduos agroindustriais em bioprocessos alimentares. Chapter in Biotecnologia de alimentos, coleção Ciência, tecnologia, engenharia de alimentos e nutrição, editora Atheneu, São Paulo, Rio de Janeiro e Belo Horizonte, 12, 143-172.

Xuemei D., Jun H., Bing Y„ Wu, Ke-ying Z., Feng F., Feng Q. Z., Mao Q., Bing X. M„ Gang T., Ping Z., Dai-wen C., Zhiqing H.(2015) Forage grease producing method by solid State fermentation of maize starch and wheat bran by Mortierella isabellina. CN 102399832 A. Filed 8 November, 2011.

REIVINDICAÇÕES

Claims (12)

1. PRODUÇÃO DE BIOMASSA RICA EM PUFAs PARA USO EM NUTRIÇÃO ANIMAL E/OU PEIXES EMPREGANDO RESÍDUOS AMILÁCEOS AGROINDUSTRAIS, caracterizado pelo emprego como substrato principal resíduos ou subprodutos amiláceos de agroindústrias.

2. PRODUÇÃO DE BIOMASSA RICA EM PUFAs PARA USO EM NUTRIÇÃO ANIMAL E/OU PEIXES EMPREGANDO RESÍDUOS AMILÁCEOS AGROINDUSTRAIS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser um processo fermentativo, incluindo fermentação submersa, semissólida e em estado sólido.

3. PRODUÇÃO DEBIOMASSA RICA EM PUFAs PARA USO EM NUTRIÇÃO ANIMAL E/OU PEIXES EMPREGANDO RESÍDUOS AMILÁCEOS AGROINDUSTRAIS, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de que a biomassa obtida da fermentação pode ser incorporada à ração como fonte de ácidos graxos essenciais, sem a necessidade de uma prévia extração.

4. PRODUÇÃO DE BIOMASSA RICA EM PUFAs PARA SEU USO EM NUTRIÇÃO ANIMAL E/OU PEIXES, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de utilizar múltiplos microrganismos capazes de acumular na biomassa altas concentrações de lipídios ricos em ácidos graxos essenciais, entre eles os gêneros Morfierella, Schizochytrium, Yarrowia, Lipomyces, Rhodotorula, entre outros.

5. PRODUÇÃO DEBIOMASSA RICA EM PUFAs PARA USO EM NUTRIÇÃO ANIMAL E/OU PEIXES EMPREGANDO RESÍDUOS AMILÁCEOS AGROINDUSTRAIS, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de que a fermentações para produção de biomassa rica em lipídios ser realizadas com uso de resíduos amiláceos obtidos da indústria brasileira de batata frita, processamento de mandioca em farinha e fécula, beneficiamento de arroz e beneficiamento de milho, entre outros, como substrato.

6. PRODUÇÃO DE BIOMASSA RICA EM PUFAs PARA USO EM NUTRIÇÃO ANIMAL E/OU PEIXES EMPREGANDO RESÍDUOS AMILÁCEOS AGROINDUSTRAIS, de acordo com as reivindicações 1,2 e 4, caracterizado pela adição de uma fonte de nitrogênio complementar, incluindo extrato de levedura, sais de amônio, e sais minerais, ao meio de fermentação.

7. PRODUÇÃO DE BIOMASSA RICA EM PUFAs PARA USO EM NUTRIÇÃO ANIMAL E/OU PEIXES EMPREGANDO RESÍDUOS AMILÁCEOS AGROINDUSTRAIS, de acordo com as reivindicações 1,2 e 5, caracterizado pelo fato de que microrganismos filamentosos podem ser homogeneizados mecanicamente antes da inoculação, de forma a aumentar a quantidade de unidades formadoras de colônias.

8. PRODUÇÃO DE BIOMASSA RICA EM PUFAs PARA USO EM NUTRIÇÃO ANIMAL E/OU PEIXES EMPREGANDO RESÍDUOS AMILÁCEOS AGROINDUSTRAIS de acordo com as reivindicações 1,2 e 5, caracterizado pelo fato de que a fermentação submersa pode ser realizada com o hidrolisado ácido ou enzimático dos resíduos amiláceos para obtenção de açúcares redutores.

9. PRODUÇÃO DE BIOMASSA RICA EM PUFAs PARA USO EM NUTRIÇÃO ANIMAL E/OU PEIXES EMPREGANDO RESÍDUOS AMILÁCEOS AGROINDUSTRAIS, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de que a biomassa pode ou não ser secada para seu uso posterior.

10. PRODUÇÃO DE BIOMASSA RICA EM PUFAs PARA USO EM NUTRIÇÃO ANIMAL E/OU PEIXES EMPREGANDO RESÍDUOS AMILÁCEOS AGROINDUSTRAIS, de acordo com as reivindicações 1,2 e 4, caracterizada pelo fato de as células microbianas/biomassa produzidas terem teor lipídico superior a 20%.

11. PRODUÇÃO DE BIOMASSA RICA EM PUFAs PARA USO EM NUTRIÇÃO ANIMAL E/OU PEIXES EMPREGANDO RESÍDUOS AMILÁCEOS AGROINDUSTRAIS, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de poder ser utilizada como suplemento nutricional na ração para alimentação de animais domesticados.

12. PRODUÇÃO DE BIOMASSA RICA EM PUFAs PARA USO EM NUTRIÇÃO ANIMAL E/OU PEIXES EMPREGANDO RESÍDUOS AMILÁCEOS AGROINDUSTRAIS, caracterizado pelo seguinte processo: A) Fermentação em meio sólida e/ou fermentação submersa de resíduos amiláceos (1) e de raízes e tubérculos; B) A partir de culturas estoque (2) de microrganismos selecionados são produzidos inóculos, enquanto as culturas de fungos filamentosos são parcialmente desintegradas por homogeneização mecânica: C) Em paralelo à produção de inóculo, é feito o pré-tratamento (3) do substrato (resíduo) amiláceo, com eventual filtração para remoção de sólidos suspensos. D) Após o pré-tratamento, o hidrolisado bruto ou filtrado segue para um processo de fermentação submersa (produção de biomassa rica em lipídios) (4) e adição de micronutrientes; ou a fermetação do substrato ocorre diretamente (5) usando um ajuste do teor de umidade de forma que a atividade água se situe entre 0,7 e 1 e adição de micronutrientes; E) Após a fermentação submersa (meio liquido), obtém-se uma biomassa com alta concentração de lipídios e mais especificamente de PUFAs, e para essa mistura é preferencialmente feita a separação da biomassa (6), que segue para posterior processamento (7); F) No caso da implementação do processo usando fermentação sólida (5), a biomassa oleaginosa com alta concentração de PUFAs é obtida em mistura com resíduos dos substratos sólido, e esse material segue para posterior processamento (7).G) A biomassa obtida na secagem (7) constitui produto e pode ser usada diretamente como suplemento nutricional em ração animal ou de peixes, ou pode ser pós-processada para extração de óleo rico em PUFAs (9) e uma biomassa exaurida rica em proteínas, fibras e carboidratos que pode ser igualmente utilizada com suplemento nutricional em ração animal e/ou peixes. (10).