CN107988104B - 一株产单细胞油脂的隐球菌及粗甘油培养产油脂的方法 - Google Patents

一株产单细胞油脂的隐球菌及粗甘油培养产油脂的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株产单细胞油脂的隐球菌以及以生物柴油副产品粗甘油培养隐球菌产单细胞油脂的方法。该菌株为隐球菌(Cryptococcus curvatus)WZUC01，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC NO.8096。该菌株油脂含量高且主要脂肪酸为棕榈酸、硬脂酸和油酸，其脂肪酸组成适宜用于生产生物柴油。采用流加分批培养法，以经预处理的生物柴油副产品粗甘油培养Cryptococcus curvatusWZUC01，培养160h，生物量和油脂产量分别达到81.37±2.01g/L和66.89±3.15g/L，具有很大的实际应用潜力。

Description

一株产单细胞油脂的隐球菌及粗甘油培养产油脂的方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株产单细胞油脂的隐球菌以及以生物柴油副产品粗甘油培养隐球菌产单细胞油脂的方法。
背景技术
近年来，随着经济与科技的快速发展，人们对煤炭、石油等燃料的需求日益增加，然而，这些燃料的过度消耗引起诸如环境恶化、能源资源趋紧等全球性的问题，这促使人们开始寻找绿色、可再生的替代燃料，生物柴油从而开始进入人们的生活领域且迅猛发展。我国生物柴油生产虽然起步较晚，但依中石化、中石油和中海油《中长期可再生能源发展规划》，至2020年发展到22.7亿升。
生物柴油通常由植物油或动物脂肪与甲醇/乙醇进行酯交换反应生成的，是一种脂肪酸烷基酯的混合物。用于生产生物柴油的植物油通常为大豆油、菜籽油、棕榈油和玉米油。然而，以传统方法生产的生物柴油还存在着一些缺点，比如以油料作物为主要来源的生物柴油的生产，会占用大面积的土地，导致生物柴油与食品行业之间的竞争，从而导致了食品价格的提升；又如生物柴油的生产成本过高，以植物油为原料进行生产的生物柴油，其原料成本占总成本的70～90％；再如以动物脂肪为原料生产的生物柴油通常难以达到运输燃料的标准。因此，人们又开始迫切寻求生产生物柴油的替代原料，产油微生物开始进入人们的视野并被研究者们广泛研究。产油微生物是指一类可以积累超过自身细胞干重20％的微生物，包括微藻、酵母、霉菌和细菌。它们产生的油脂称为微生物油脂，也称单细胞油脂(SCO)。微生物油脂具有诸如生产周期短、产率高、需要劳动力少、土地使用量少、规模易扩大、几乎不受季节、气候和场地的影响等优点，其中产油酵母Cryptococcus curvatus可以积累超过自身细胞干重60％的油脂含量，这吸引了人们的注意。
生物柴油与甘油的产出比约10∶1，副产物含有80％～88％的甘油以及甲醇、皂等，须精制才能应用于化妆品、食品和医药等工业。但精制成本很高，而且生物柴油生产快速发展所产出的粗甘油远远超过精甘油的市场需求，造成精甘油价格急剧下跌，粗甘油则几乎成了工业垃圾，从而推高生物柴油的生产成本，且造成严重的环境问题。推广应用生物柴油的最大阻碍是高昂的成本，因而当前关于生物柴油研究的2个重要方面即为：(1)寻求更易得、更经济的新原料，(2)开发粗甘油的新用途。
国内外对培养隐球菌产单细胞油脂的研究有较多报道，特别是为降低成本，对培养隐球菌产单细胞油脂的适宜的原料进行了大量的研究，包括厌氧发酵过程的代谢产物醋酸(G.Christophe,et al.Biochem Biotechnol,2012,167:1270-1279)、干酪制造过程的副产物干酪乳清(Yeong Hwan Seo,et al.Biochemical Engineering Journal,2014,90:149-153)、玉米芯水解液(Yi-Huang Chang,et al.Fuel,2013,105:711-717.)、纤维素水解液(张杰，等.现代化工，2008,28(2):133-135)、水解的食品废弃物和市政污水(ZhanyouChi et al.Biochem Biotechnol,2011,165:442-453.)、酿造工业的有机废水(Byung-GonRyu.Bioresource Technology,2013,135:357-367)等，当然，这些工农业废弃物因组成复杂且成分不稳定，以之培养隐球菌产单细胞油脂仅仅停留在实验室研究阶段，一时难以实现大规模生产。
油脂微生物在培养基中碳源充足而氮源缺乏时,代谢活动转为以消耗碳源并合成和积累油脂为主,将过量的碳水化合物转化为油脂，因此,培养基中碳、氮源浓度及C/N比是影响微生物油脂含量的主要因素(Gill Co，et al.Appl Environ Microbiol,1977,33(2):231-239)。因此隐球菌的培养一般经历两阶段：第一阶段氮源充足，主要进行细胞生长；第二阶段，碳源充足氮源限制，主要合成和积累油脂，而过高浓度的碳源或氮源又将抑制其生长和油脂积累，因此补料分批发酵是其最适宜的方式。如Meesters等采用分批补料发酵以甘油为碳源培养Cryptococcus curvatus产油脂，起始甘油浓度为16g/L，以溶氧水平控制补料，结果发酵50h的生物量达118g/L，油脂生产速率为0.59g/L/h，细胞油脂含量为25％，油脂得率系数为0.11g/g甘油(P.A.E.P.Meesters,et al.Microbiol Biotechnol,1996,45:575-579)。Yi Cui等以经预处理的生物柴油的副产品粗甘油培养Cryptococcuscurvatus，通过Box-Behnken设计和响应面分析，得出适宜的温度、pH和甘油浓度分别为30.2℃、6.0和19.8g/L，在适宜条件下，生物量和油脂含量分别为7.11±0.36g/L和38.53±1.88％；采用流加分批培养，依消耗的溶氧水平流加粗甘油，培养12天后生物量和油脂含量分别为44.53g/L和49％(Yi Cui,et al.Biomass and Bioenergy,2012,47:410-417)。
鉴于上述培养产油酵母Cryptococcus curvatus积累油脂用于生产生物柴油的研究现状，从自然界分离或采用育种方法寻找优良的种质资源，以及研究以生物柴油副产品粗甘油等工农业废弃物作为廉价原料培养产油酵母Cryptococcus curvatus产油脂仍然是最终实现大规模生产的技术瓶颈。特别是我国生产生物柴油的原料主要为餐厨废油和废弃动物脂肪，与欧美主要以植物油为原料相比，其副产物粗甘油因色泽、气味以及其它微量组分的原因更加难以精制，以之为碳源培养隐球菌生产油脂，无论从环境保护还是生产成本来讲，更具有现实意义；而且因粗甘油杂质更复杂，所以其积累的油脂更适宜于用于生产生物柴油。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一株油脂含量高且主要脂肪酸为棕榈酸、硬脂酸和油酸从而适宜于生产生物柴油的优良的隐球菌，其特点为该菌株为采用常规分离方法从采自浙江省温州市瓯海区茶山镇瓯柑园的干牛粪中分离获得，经26SrDNA序列测定并将测序结果通过GenBank Blast进行比对分析，属于Cryptococcus属(即Cutaneotrichosporon属)，与Cryptococcus curvatus(即Cutaneotrichosporonoleaginosus)的同源性为99.99％，编为Cryptococcus curvatus WZUC01。
本发明提供的一株油脂含量高且主要脂肪酸为棕榈酸、硬脂酸和油酸从而适宜于生产生物柴油的隐球菌，该菌株为Cryptococcus curvatus WZUC01，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC NO.8096。
本发明还提供以经过预处理的生物柴油副产品粗甘油培养Cryptococcuscurvatus WZUC01产油脂的方法。
本发明还提供产单细胞油脂的隐球菌的应用，隐球菌WZUC01所产的油脂用于生产生物柴油。
所述生物柴油副产品粗甘油的预处理方法为将生物柴油副产品粗甘油与水以1:4的体积比混合后，调pH至6.5沉淀皂类，4000r/min下离心10min去皂，120℃下高压蒸汽灭菌去甲醇。
所述生物柴油副产品粗甘油培养Cryptococcus curvatus WZUC01产油脂的方法，包括如下步骤：
1)保藏菌株Cryptococcus curvatus WZUC01接种于种子培养基中培养得活化菌液；
2)将步骤1)所得活化菌接种于种子培养基中培养得种子；
3)将步骤2)所得种子接种于限氮发酵培养基中培养得含油脂的隐球菌。
所述限氮发酵培养基含有无机盐溶液、粗甘油、酵母粉和NH4Cl，pH为5～6；
所述无机盐含有KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4、CaCl2·2H2O、FeCl3·6H2O和ZnSO4·7H2O。
优选地，步骤1)和2)所述种子培养基组成为：粗甘油20g/L、酵母粉20g/L、蛋白胨20g/L、pH自然；
优选地，步骤1)培养时间为48～72h，温度为30～35℃，在转速150～160r/min下培养；
步骤1)所得活化菌以6～8％的体积百分比接种于步骤2)的种子培养基中，培养时间32～48h，温度为30～35℃，在转速150～160r/min下培养。
优选地，步骤2)所得种子以8～10％的体积百分比接种于步骤3)的限氮发酵培养基中培养。
所述限氮发酵培养基中粗甘油的浓度小于90g/L；C/N质量比为100以上。更优选地，所述限氮发酵培养基的组成为：无机盐溶液10ml/L、粗甘油30～60g/L、酵母粉0.75g/L、NH4Cl 0.25g/L。
所述无机盐的组成为：KH2PO4 350g/L、Na2HPO4 100g/L、MgSO4 75g/L、CaCl2·2H2O5g/L、FeCl3·6H2O 0.5g/L、ZnSO4·7H2O 0.5g/L。
优选地，步骤3)的培养温度为25～45℃，优选为30～35℃，以NaOH或HCl调pH为5～6，在氧饱和度大于30％下培养。
优选地，步骤3)每隔22～24h一次性补加30g/L粗甘油，粗甘油总补加量210g/L；培养72～96h一次性补加0.25g/L NH4Cl和0.75g/L酵母粉。
本发明能够达到以下技术效果：
1、本发明提供了一株油脂含量高且主要脂肪酸为棕榈酸、硬脂酸和油酸的适宜于生产生物柴油的优良的菌株，为培养产油酵母Cryptococcus curvatus积累油脂用于生产生物柴油增添了新的优良的种质资源。
2、本发明提供了采用流加分批培养法，以经预处理的生物柴油副产品粗甘油培养Cryptococcus curvatusWZUC01chan产油脂的技术，培养160h，生物量和油脂产量分别达到81.37±2.01g/L和66.89±3.15g/L，具有很大的实际应用潜力。
附图说明
图1是Cryptococcus curvatus WZUC01在限氮培养基中的个体形态。图1A是培养24h，图1B培养48h，放大倍数400倍。
图2是采用MEGA5.0软件，邻位连接法显示菌株WZUC01与相关种的26S rDNA序列系统发育树，进行1000次的相似度重复计算，图中发育树节点只显示Bootstrap值大于70％数值。
图3是Cryptococcus curvatus WZUC01种子的生长曲线。
图4是Cryptococcus curvatus WZUC01在不同粗甘油浓度的限氮培养基中的生长进程。
图5是Cryptococcus curvatus WZUC01补料分批发酵的进程。
图6是Cryptococcus curvatus WZUC01油脂脂肪酸的气相色谱图。
菌株保藏
本发明的Cryptococcus curvatus WZUC01，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏中心登记入册编号为CGMCC NO.8096，保藏起始日期为2013年09月02日。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明提供一株油脂含量高且主要脂肪酸为棕榈酸、硬脂酸和油酸的适宜于生产生物柴油的优良的隐球菌，其特点为该菌株为采用初筛、复筛等过程从采自浙江省温州市茶山镇瓯柑园的干牛粪中分离获得，经26SrDNA序列测定并将测序结果通过GenBank Blast进行比对分析，属于Cryptococcus属(即Cutaneotrichosporon属)，与Cryptococcuscurvatus(即Cutaneotrichosporon oleaginosus)的同源性为99.99％，编为Cryptococcuscurvatus WZUC01。
实施例一：隐球菌(Cryptococcus curvatus)WZUC01的分离和鉴定
(1)初筛
从浙江省温州市茶山镇的瓯柑园采集样品，样品包括土壤、干牛粪和略腐烂瓯柑；土壤样品采集深度为0～10厘米，每个点采样量大于100g。每份样品均称取10g(略腐烂瓯柑取皮称后搅碎)置装有90ml无菌水的三角烧瓶内，振荡摇匀后稀释至适当倍数，取一滴涂布于YPD平板(葡萄糖20g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、琼脂18g/L、pH自然)，在30℃下培养至长出单菌落；挑取非霉菌的单菌落划线接种于新的YPD平板上在相同温度下培养，直至经镜检为纯培养物。共获得105株纯培养物。
将获得的纯培养物分别点种于平板(葡萄糖60g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨10g/L、琼脂18g/L、pH自然)，在30℃下培养5天。挑取平板上少许纯培养物涂布于洁净载玻片上，固定后加苏丹黑B染液染10min，然后用酒精脱色后流水冲洗至无色，干燥后镜检。经苏丹黑B染色镜检，从105株纯培养物中获得9株积累油脂的纯培养物，分别编为#1～#9，并注明各纯培养物的样品来源，然后将9株初筛获得的积累油脂的纯培养物转接于YPD斜面培养后于4℃下保藏。
(2)复筛
将初筛获得的9株纯培养物的斜面保藏菌分别接种于装有100mlYPD培养基(葡萄糖20g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、pH自然))的250ml锥形瓶中，在30℃、150rpm下培养48h，在5000r/min下离心15min后收集菌体，用无菌蒸馏水洗涤3次后配制成OD600＝0.9～1.0的菌悬液，每株纯培养物的菌悬液均各取8ml分别接种于装有100ml限氮发酵培养基的500ml锥形瓶中，每株纯培养物接3瓶，取10ml发酵液在4000r/min下离心10min后取上清液，适当稀释后测定起始葡萄糖浓度，然后在30℃、150r/min下振荡培养。限氮培养基的组成为(g/L)：葡萄糖60、酵母粉10、蛋白胨10，pH自然。定时取样测定葡萄糖浓度，待葡萄糖耗尽或消耗趋于稳定时结束培养，取发酵液10ml在4000r/min下离心10min后弃上清液，沉淀用蒸馏水洗涤后置100℃下烘干测定生物量，剩余发酵液在8000r/min下离心10min后得上清液和沉淀，上清液经适当稀释后测定葡萄糖浓度，沉淀用蒸馏水洗涤后进行冷冻干燥，测定菌体油脂含量和脂肪酸组成。结果见表1。由表1看出，从#1干牛粪样品中分离的#1和#7菌的葡萄糖消耗量、生物量、油脂含量和脂肪酸组成相似，经形态观察确定为同一菌，其油脂含量最高；从#2土壤样品中分离的#3和#5菌的葡萄糖消耗量、生物量、油脂含量和脂肪酸组成也相似，经形态观察也为同一菌。比较表1的油脂含量、脂肪酸组成和葡萄糖油脂得率系数，从#1干牛粪分离获得的#1或#7菌为理想菌株，其油脂含量高、脂肪酸组成适宜于生产生物柴油，编为WZUC01。
表1产单细胞油脂微生物复筛结果
Figure BDA0001504344630000071
其中葡萄糖采用3.5-二硝基水杨酸法测定，生物量采用干重法测定，油脂提取和菌体油脂含量测定采用酸热法(马建设等，温州大学学报，2009,30(6):21-24)，脂肪酸组成采用气质联用法(具体方法见实施例九)测定。
葡萄糖生物量得率系数(g/g)＝生物量(g/L)/葡萄糖消耗量(g/L)，葡萄糖油脂得率系数(g/g)＝生物量(g/L)×油脂含量(％)/葡萄糖消耗量(g/L)。
(3)鉴定
图1为菌株WZUC01的个体形态，其中图1A为在限氮培养基培养24h，图1B为在限氮培养基培养48h，以形态特点初步判断为酵母菌。
以菌株WZUC01的基因组DNA为模板扩增26S rDNA D1/D2区，引物序列为：正向引物5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’，反向引物5’-CGGGATCCTACGGCTACCTTGTTACGACTCACCCC-3’，PCR、PCR产物的纯化和测序委托中国工业微生物菌种保藏管理中心完成，测序结果通过GenBank Blast进行比对分析。
菌株WZUC01的26S rDNAD1/D2区由579bp碱基组成，如SEQ ID NO.1所示；通过GenBank Blast进行比对分析，与GenBank中的Cryptococcus属(即Cutaneotrichosporon属)的26S rDNA D1/D2区序列具有很高同源性，与Cryptococcus curvatus(即Cutaneotrichosporon oleaginosus)的同源性为99.99％，编为Cryptococcus curvatusWZUC01。采用MEGA5.0软件，邻位连接法显示菌株WZUC01与相关种的26S rDNAD1/D2区序列系统发育树见图2。
Cryptococcus curvatus WZUC01已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏中心登记入册编号为CGMCC NO.8096，保藏起始日期为2013年09月02日。
实施例二：生物柴油副产品粗甘油的预处理
生物柴油副产品粗甘油取自生物柴油生产企业，为以餐厨废油为原料生产生物柴油的。
将生物柴油副产品粗甘油与水以1:4(V:V)混合后，调pH至6.5，脂肪酸形成脂肪酸盐(皂)沉淀，4000rpm下离心10min去皂得粗甘油，然后在120℃下高压蒸汽灭菌10min(以后用于配制培养基时待培养基配好后灭菌)以去除甲醇。
将经预处理后的粗甘油进行相关成分分析，结果如表2所示。其中矿物质采用原子吸收分光光度法测定，甘油含量采用高碘酸钾法测定(李素敏，中国输血杂志,1999,12(3):179～179)，脂肪酸和甲醇含量采用气相色谱法测定，蛋白质含量采用微量凯氏定氮法测定。
表2预处理后的粗甘油相关成分分析结果
Figure BDA0001504344630000081
实施例三：Cryptococcus curvatus WZUC01种子生长曲线的测定
保藏菌株WZUC01(1.5ml冷冻管融化菌液)接种于装有50ml种子培养基(粗甘油20g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、pH自然，粗甘油指经预处理后的粗甘油所含的甘油量(以下同))的250ml锥形瓶中，在30℃、150r/min下培养48～72h进行活化。活化菌以百分之五的体积比接种于装有100ml种子培养基(粗甘油20g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、pH自然)的500ml锥形瓶内，在30℃、150r/min下培养，定时取样测定生物量(OD600)，以时间对lnOD600作图得Cryptococcus curvatus WZUC01的生长曲线如图3。由图3可知，Cryptococcus curvatus WZUC01在培养31.5h后进入稳定期，因此确定种子培养时间为24～48h。
实施例四：C/N和氮源种类对Cryptococcus curvatus WZUC01生长和积累油脂的影响
保藏菌株WZUC01(1.5ml冷冻管融化菌液)接种于装有50ml种子培养基(粗甘油20g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、pH自然)的250ml锥形瓶中，在30℃、150r/min下培养48h进行活化；活化菌以百分之五的体积比接种于装有100ml种子培养基(粗甘油20g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、pH自然)的500ml锥形瓶内，在30℃、150r/min下培养32h；种子以百分之八的体积比接种于装有100ml的5组C/N和氮源种类不同的限氮发酵培养基的500ml锥形瓶内，在30℃、150r/min下培养至甘油耗尽或趋于稳定为止。
限氮发酵培养基1(g/L)：粗甘油60、酵母粉10、蛋白胨10、pH自然(C(mol)：N(mol)＝18.3)；限氮发酵培养基2(g/L)：无机盐溶液10ml、粗甘油60、酵母粉0.75、pH自然(C(mol)：N(mol)＝315.8)；限氮发酵培养基3(g/L)：无机盐溶液40ml、粗甘油60、酵母粉0.75、pH自然(C(mol)：N(mol)＝127.1)；限氮发酵培养基4(g/L)：无机盐溶液200ml、粗甘油60、酵母粉0.75、pH自然(C(mol)：N(mol)＝30.4)；限氮发酵培养基5(g/L)：无机盐溶液10ml、粗甘油30、酵母粉0.75、pH自然(C(mol)：N(mol)＝156.3)。无机盐(g/L)：NH4Cl 25、KH2PO4 350、Na2HPO4 100、MgSO4 75、CaCl2·2H2O 5、FeCl3·6H2O0.5、ZnSO4·7H2O 0.5。
限氮培养基2的C(mol)：N(mol)最高，为315.8；限氮培养基3和限氮培养基5的C(mol)：N(mol)其次，分别为127.1和156.3，两者较接近，其区别为限氮培养基3的粗甘油浓度为限氮培养基5的2倍，酵母粉浓度两者一样，而限氮培养基3的NH4Cl浓度为限氮培养基5的4倍；限氮培养基1和限氮培养基4的C(mol)：N(mol)最低，分别为18.3和30.4，两者较接近，其区别为限氮培养基1的氮源为10g/L酵母粉和10g/L蛋白胨，而限氮培养基4的酵母粉仅0.75g.L，其他氮源为NH4Cl。
表3为Cryptococcus curvatus WZUC01在不同的限氮发酵培养基中培养的实验结果。其中粗甘油浓度采用甘油铜比色法测定(阎杰等，中国油脂，2004.29(1):40～43)。
由表1的Cryptococcus curvatus WZUC01油脂含量看出，限氮培养基2最高，其次为限氮培养基3和5，最低为限氮培养基1和4，表明高的C/N有利于隐球菌WZUC01油脂的积累。
限氮培养基1和限氮培养基4的C(mol)：N(mol)(分别为18.3和30.4)接近，粗甘油浓度相同(60g/L)，其区别为限氮培养基1的氮源为10g/L酵母粉和10g/L蛋白胨，而限氮培养基4的酵母粉仅0.75g/L，其他氮源为NH4Cl。从表3的两者生物量、油脂含量、油脂产量、粗甘油生物量得率系数和粗甘油油脂得率系数比较看，无机盐NH4Cl为氮源有利于隐球菌生长和积累油脂。
限氮培养基3和限氮培养基5的C(mol)：N(mol)(分别为127.1和156.3)接近，酵母粉浓度两者一样，其区别为限氮培养基3的粗甘油浓度为限氮培养基5的2倍，而限氮培养基3的NH4Cl浓度为限氮培养基5的4倍。从表3的粗甘油生物量得率系数和粗甘油油脂得率系数比较来看，限氮培养基5大于限氮培养基3，表明高的粗甘油浓度可能会抑制Cryptococcus curvatus WZUC01的生长和油脂积累；但限氮培养基3的生物量、油脂含量和油脂产量均大于限氮培养基5，表明消耗比较多的粗甘油和NH4Cl才能得到比较高的Cryptococcuscurvatus WZUC01生物量和油脂产量。
限氮培养基2和限氮培养基5的氮源种类和浓度一样，限氮培养基2的粗甘油浓度为限氮培养基5的2倍，比较表1看出，限氮培养基2的粗甘油生物量得率系数小于限氮培养基5，两者的粗甘油油脂得率系数接近，而生物量、油脂含量和油脂产量限氮培养基2均大于限氮培养基5，这也表明高的粗甘油浓度可能会抑制Cryptococcus curvatus WZUC01的生长，而消耗比较多的粗甘油才能得到比较高的Cryptococcus curvatus WZUC01生物量和油脂产量。
表3 Cryptococcus curvatus WZUC01在不同的限氮发酵培养基中培养的实验结果
Figure BDA0001504344630000101
Figure BDA0001504344630000111
实施例五、粗甘油浓度对Cryptococcus curvatus WZUC01生长和积累油脂的影响
保藏菌株WZUC01(1.5ml冷冻管融化菌液)接种于装有50ml种子培养基(粗甘油20g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、pH自然)的250ml锥形瓶中，在30℃、150r/min下培养48h进行活化；活化菌以百分之五的体积比接种于装有100ml种子培养基(粗甘油20g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、pH自然)的500ml锥形瓶内，在30℃、150r/min下培养32h；种子以百分之八的体积比接种于装有100ml不同粗甘油浓度的限氮发酵培养基的500ml锥形瓶内，在30℃、150r/min下培养，定时取样测定甘油浓度和生物量，培养结束时测定菌体的油脂含量。
限氮发酵培养基组成(g/L)：无机盐溶液10ml、粗甘油、酵母粉0.75、pH自然。无机盐(g/L)：NH4Cl 25、KH2PO4 350、Na2HPO4 100、MgSO4 75、CaCl2·2H2O 5、FeCl3·6H2O 0.5、ZnSO4·7H2O 0.5。粗甘油浓度分别为30、60、90、120、150、200和300g/L，其中粗甘油浓度为200和300g/L时，将经预处理的粗甘油依测定的甘油含量进行适当的浓缩后加入限氮发酵培养基。
图3为Cryptococcus curvatus WZUC01在不同粗甘油浓度的限氮培养基中的生长进程，表4为Cryptococcus curvatus WZUC01在不同粗甘油浓度的限氮培养基生长与油脂积累的比较。
表4 Cryptococcus curvatus WZUC01在不同粗甘油浓度的限氮培养基生长与油脂积累的比较
Figure BDA0001504344630000112
Figure BDA0001504344630000121
由表4看出，从比生长速率和粗甘油生物量得率系数来看，随限氮培养基中粗甘油浓度增加而逐渐减少，表明高浓度的粗甘油对Cryptococcus curvatusWZUC01生长具抑制作用；从生物量、油脂含量、油脂产量、粗甘油油脂得率系数来看，随限氮培养基中粗甘油浓度增加而增加，至90g/L时达到最大，继续增加则逐渐降低，表明得到高的生物量和油脂产量需消耗较多的粗甘油，因此流加培养方式可能适宜粗甘油培养Cryptococcus curvatusWZUC01产油脂。
实施例六、pH对Cryptococcus curvatus WZUC01生长和积累油脂的影响
保藏菌株WZUC01(1.5ml冷冻管融化菌液)接种于装有50ml种子培养基(粗甘油20g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、pH自然)的250ml锥形瓶中，在30℃、150r/min下培养48h进行活化；活化菌以百分之五的体积比接种于装有100ml种子培养基(粗甘油20g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、pH自然)的500ml锥形瓶内，在25℃、150r/min下培养32h；种子以百分之八的体积比接种于装有100ml不同初始pH的限氮发酵培养基的500ml锥形瓶内，在30℃、150r/min下培养48h，测定起始和培养结束时的甘油浓度以及培养结束时的生物量和菌体的油脂含量。
限氮发酵培养基组成(g/L)：无机盐溶液10ml、粗甘油30、酵母粉0.75，pH分别为3.82、4.84、5.84(自然)、7.08、8.09；无机盐(g/L)：NH4CL 25、KH2PO4 350、Na2HPO4 100、MgSO4 75、CaCl2·2H2O 5、FeCl3·6H2O 0.5、ZnSO4·7H2O 0.5。
实验结果如表5所示，其中初始pH以1mol/L HCl或1mol/LNaOH用酸度计调。由表5可知，粗甘油培养Cryptococcus curvatus WZUC01产油脂的最适宜的初始pH为5～6。
表5 Cryptococcus curvatus WZUC01在不同初始pH的限氮培养基生长与油脂积累的比较
Figure BDA0001504344630000122
实施例七、温度对Cryptococcus curvatus WZUC01生长和积累油脂的影响
保藏菌株WZUC01(1.5ml冷冻管融化菌液)接种于装有50ml种子培养基(粗甘油20g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、pH自然)的250ml锥形瓶中，在30℃、150r/min下培养48h进行活化；活化菌以百分之五的体积比接种于装有100ml种子培养基(粗甘油20g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、pH自然)的500ml锥形瓶内，在30℃、150r/min下培养32h；种子以百分之八的体积比接种于装有100ml限氮发酵培养基的500ml锥形瓶内，在不同温度和150r/min下培养48h，测定起始和培养结束时的甘油浓度以及培养结束时的生物量和菌体的油脂含量。
限氮发酵培养基组成(g/L)：无机盐溶液10ml、粗甘油30、酵母粉0.75，pH自然；无机盐(g/L)：NH4Cl 25、KH2PO4 350、Na2HPO4 100、MgSO4 75、CaCl2·2H2O 5、FeCl3·6H2O0.5、ZnSO4·7H2O 0.5。
实验结果如表6所示，由表6可知，粗甘油培养Cryptococcus curvatus WZUC01产油脂的最适宜的温度为30～35℃。
表6 Cryptococcus curvatus WZUC01在不同温度下生长与油脂积累的比较
Figure BDA0001504344630000131
实施例八、流加分批培养对Cryptococcus curvatus WZUC01生长和积累油脂的影响
保藏菌株WZUC01(1.5ml冷冻管融化菌液)接种于装有50ml种子培养基(粗甘油20g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、pH自然)的250ml锥形瓶中，在30℃、150r/min下培养48h进行活化；活化菌以百分之五的体积比接种于装有100ml种子培养基(粗甘油20g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、pH自然)的500ml锥形瓶内，在30℃、150r/min下培养32h；种子以百分之十的体积比接种于装有3L限氮发酵培养基的5L发酵罐内，在30℃下培养，在线监测氧饱和度，通过调节转速和空气流量使氧饱和度大于30％，定时取样测定甘油浓度、生物量和菌体油脂含量，当甘油耗尽时补加30g/L粗甘油，至即将进入稳定期(72～96h)时补0.75g/L酵母粉和0.25g/L NH4CL，继续补加粗甘油的培养，直至甘油消耗趋缓、生物量和菌体油脂含量趋稳为止。
限氮发酵培养基组成(g/L)：无机盐溶液10ml、粗甘油30、酵母粉0.75，pH自然；无机盐(g/L)：NH4Cl 25、KH2PO4 350、Na2HPO4 100、MgSO4 75、CaCl2·2H2O 5、FeCl3·6H2O0.5、ZnSO4·7H2O 0.5。
图4是Cryptococcus curvatus WZUC01补料分批发酵的进程。从图4看出，发酵160h后生物量和菌体油脂含量趋于稳定，共消耗210g/L粗甘油，生物量、菌体油脂含量和油脂产量分别为81.37±2.01g/L、82.20±2.58％和66.89±3.15g/L；经计算，生物量产率和油脂产率分别为0.51g/L/h和0.42g/L/h，粗甘油的生物量得率系数和油脂得率系数分别为0.39g/g和0.32g/g。
实施例九、Cryptococcus curvatus WZUC01油脂脂肪酸组成分析
取实施例八流加分批培养结束的发酵液，8000r/min离心10min后，用去离子水洗涤沉淀三次后进行冷冻干燥，用酸热法提取油脂(精确称取约0.030g左右的冷冻干燥的菌体于干燥离心管中，加入4mol/L盐酸2mL，混匀，室温下静置30min使细胞充分裂解，沸水浴3min后立刻速冷至室温；加入氯仿-甲醇(2:1)混合液4mL，充分振荡后于5000rpm下离心5min，取氯仿层，加入等体积的0.1％的NaCl溶液混匀，再于5000rmp下离心5min；取氯仿层于已知质量的干燥管中，40～50℃真空干燥至恒重。)，用BF3-乙醚催化法进行脂肪酸甲酯化(在真空干燥后的油脂中，加入0.5mol/L KOH-甲醇溶液2mL，在65℃的水浴中加热10min，再加入2mL BF3-乙醚，煮沸3min；冷却后，加入100μL十九烷酸甲酯内标、1mL正庚烷振荡摇匀，再煮沸1min，后加入1mL饱和NaCl溶液，静置；分层后，取上层正庚烷相。)，用气相色谱-质谱法测定。
色谱条件：
色谱柱：TG-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)；升温程序：80℃保持1min，以10℃/min的速率升温至200℃，继续以5℃/min的速率升温至250℃，最后以2℃/min的速率升到270℃，保持3min；进样口温度：290℃；载气流速：1.2mL/min；进样量：1μL；不分流进样，开阀时间1min。
质谱条件：
离子源温度：280℃，传输线温度：280℃，溶剂延迟时间：5.00min，扫描范围：30～400amu，离子源：EI源70eV。
脂肪酸种类依37种脂肪酸混合标准品确定；脂肪酸质量测定采用内标法，内标物：十九烷酸甲酯；脂肪酸含量/％＝某脂肪酸质量(mg)/总脂肪酸质量(mg)×100
表7为Cryptococcus curvatus WZUC01油脂脂肪酸组成的测定结果，从表中看出，主要的脂肪酸为棕榈酸(C16.0，31.50％)、硬脂酸(C18.0，16.28％)和油酸(C18.1N9C，39.68％)，其脂肪酸组成适宜于生产生物柴油。
表7 Cryptococcus curvatus WZUC01脂肪酸组成
脂肪酸 含量/％
C12.0 0.04
C14.0 0.79
C15.0 0.04
C16.0 31.50
C16.1 0.80
C17.0 0.27
C17.1 0.14
C18.0 16.28
C18.1N9C 39.68
C18.2N6C 4.93
C20.0 0.72
C20.1 0.12
C20.2 0.02
C20.3N3 0.01
C20.3N6 0.01
C20.4N6 0.03
C20.5N3 0.01
C21.0 0.01
C22.0 0.59
C22.1N9 0.01
C22.2 0.01
C23.0 0.04
C24.0 3.87
C24.1 0.08
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 温州大学
<120> 一株产单细胞油脂的隐球菌及粗甘油培养产油脂的方法
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 579
<212> DNA
<213> Cryptococcus curvatus WZUC01
<400> 1
1 AAGCGGAGGA AAAGAAACTA ACAAGGATTC CCTTAGTAAC GGCGAGTGAA
51 CCGGGAAAAG CTCAAATTTG TAATCTGGCT GTCTTCGATA GTCCGAGTTG
101 TAATCTATAG ACGTGTTTTC CGTGCTGGAC CGTATCTAAG TCCCTTGGAA
151 CAGGGTATCA AAGAGGGTGA CAATCCCGTG CTTGATACGA CCACCAGTGC
201 TCTGTGATAC ACGTTCTACG AGTCGAGTTG TTTGGGAATG CAGCTCAAAA
251 TGGGTGGTAA ATTCCATCTA AAGCTAAATA TTGGCGAGAG ACCGATAGCG
301 AACAAGTACC GTGAGGGAAA GATGAAAAGC ACTTTGGAAA GAGAGTTAAA
351 CAGTACGTGA AATTGTTGAA AGGGAAACGA TTGAAGTCAG TCGTGTTCTT
401 CAGATTCAGC TGGTTCTTCC AGTCTACTTC TGTGGAACGG GTCAACATCA
451 GTTTTGTCCG GTGGATAAAG GTAGTAGGAA TGTGACTCCC CCGGGAGTGT
501 TATAGCCTAT TATTGCATAC ACTGGGTGAG ACTGAGGACT GCAGCTCGCC
551 TTTTGGCCGG TCTTCGGACA CGTTCGAGC

Claims (10)

1.一株产单细胞油脂的隐球菌，其特征在于，该菌株为隐球菌（Cryptococcus curvatus）WZUC01，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC NO.8096。
2.权利要求1所述的产单细胞油脂的隐球菌的应用，其特征在于，隐球菌WZUC01所产的单细胞油脂用于生产生物柴油。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，以处理后的生物柴油副产品粗甘油培养隐球菌WZUC01产单细胞油脂，包括如下步骤：
1）将保藏菌株Cryptococcus curvatus WZUC01接种于种子培养基中培养得活化菌液；
2）将步骤1）所得活化菌液接种于种子培养基中培养得种子；
3）将步骤2）所得种子接种于限氮发酵培养基中培养得含油脂的隐球菌；
其中，所述种子培养基含有粗甘油、酵母粉和蛋白胨；
所述限氮发酵培养基含有无机盐溶液、粗甘油和酵母粉，pH为5~6；
所述无机盐含有KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4、CaCl2•2H2O、FeCl3•6H2O、ZnSO4•7H2O和NH4Cl。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述限氮发酵培养基中粗甘油的浓度小于90 g/L；C/N质量比为100以上。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述种子培养基组成为：粗甘油 20 g/L、酵母粉 20 g/L、蛋白胨20 g/L、pH 自然；
所述限氮发酵培养基组成为：无机盐溶液 10 ml/L、粗甘油30~60 g/L 、酵母粉0.75g/L，pH为5~6；
所述无机盐的组成为：NH4Cl 25 g/L、KH2PO4 350g/L、Na2HPO4 100g/L、MgSO4 75g/L、CaCl2•2H2O 5g/L、FeCl3•6H2O 0.5g/L、ZnSO4•7H2O 0.5g/L。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤1）培养时间为48~72h，温度为30~35℃，在转速150~160 r/min下培养。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤1）所得活化菌以6~8 %的体积百分比接种于步骤2）的种子培养基中，培养时间32~48h，温度为30~35℃，在转速150~160 r/min下培养。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤2）所得种子以8~10 %的体积百分比接种于步骤3）的限氮发酵培养基中，在温度为30~35℃，氧饱和度大于30%下培养。
9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤3）每隔22~24h一次性补加30g/L粗甘油，粗甘油总补加量210g/L；培养72~96h一次性补加0.25g/L NH4Cl和0.75g/L酵母粉。
10.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述粗甘油的制备方法为：将生物柴油副产品粗甘油与水以1:4的体积比混合后，调pH至6.5沉淀皂类， 4000 r/min下离心10 min去皂得粗甘油。
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酵母油脂及用于生物柴油制备研究进展;张国玲等;《化工进展》;20131231;第32卷(第4期);第791-798页 *

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