CN102834523A - 从酵母菌株生产生物柴油的工艺 - Google Patents

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Abstract

本文公开了与从产油酵母，例如毕赤酵母(Pichia)属的新型酵母分离株生产和提取油和生物柴油有关的方法和组合物。本文还公开了为使用包括粗制甘油和玉米浆(corn steep liquor)在内的廉价原材料高密度生产酵母提供发酵条件的方法。

Description

从酵母菌株生产生物柴油的工艺
相关专利申请的交叉引用 
本申请要求在2009年10月29日递交的印度临时专利2514/MUM/2009的申请日利益，通过引用将其全部并入本文。 
技术领域
本公开内容涉及产油酵母，包括库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)，毕赤酵母(Pichia)属的一个种，以及以登记号MTCC 5493保藏的新型库德里阿兹威毕赤酵母菌株，并涉及从产油酵母生产油和生物柴油。 
背景 
生物柴油是对于全球变暖、能源危机和枯竭的化石燃料供应的对环境有益的解决方法。如今，生物柴油(例如，脂肪酸甲酯，“FAME”)是给予从生物的、可再生资源中产生的可生物降解且无毒的清洁的燃烧替代燃料的名字。生物柴油可直接使用或可以以任何水平与石油产品例如石油柴油混合。 
在解决与温室气体有关的环境问题方面，生物柴油具有明显的益处并给农民提供新的收入。然而，传统的富含油的农作物受限于土地利用度，以及关于使用饲料和粮食作物用于燃料的环境和社会问题。以绿色且可持续的方式生产生物柴油而不竞争粮食作物的替代方式是使用微生物。自然界中存在几种微生物，这些微生物当在氮限制条件下生长时能够积累或储存油/脂质至多达其干重的60％的固有能力。这些脂质通常由80％-90％的具有与许多植物种子油相似的脂肪酸组成的三酰甘油组成(Ratledge，C.， Evans，C.T.(1984)Influence of nitrogen metabolism on lipid accumulation in oleaginous yeasts，J.Gen.Microbiol.130：1693-704；Ykema A，Verbree EC，Kater MM，Smit H(1988)Optimization of lipid production in the oleaginous yeast Apiotrichum curvatum in whey permeate.Appl Microbiol Biotechnol 29：211-218)。这些生物体被称作产油微生物。 
微生物油，也称作单细胞油，由某些产油微生物例如酵母、真菌、细菌和显微藻类产生(Ma，Y.L.(2006)Microbial oils and its research advance.Chin.J.Bioprocess.Eng.4(4)：7-11.)。已表明这些微生物油可用作生产生物柴油的原料。与其他植物油和动物脂肪相比，生产微生物油具有许多优点：与植物相比微生物具有短的生命周期，因此收获的时间更短，需要较少的劳力，微生物油的产生较少受地点、季节和气候的影响，且更容易放大(Li，Q.，Wang，M.Y.(1997)Use food industry waste to produce microbial oil.Science and Technology of Food Industry 6：65-69.)。因此，微生物油具有将来变成用于生产生物柴油的一种主要油原料的巨大潜力。尽管不是新概念，该领域的工作非常有限(Li，Qiang.，Wei，Du.，Dehua，Liu.(2008)Perspectives of microbial oils for biodiesel production.Appl.Microbiol.Biotechnol.80：749-756.)。 
迄今研究的用于生产生物柴油的微生物细胞包括细菌、酵母和真菌。优选的真菌属包括被孢霉属(Mortierella)、须霉属(Phycomyces)、虫霉属(Entomophthora)、腐霉属(Pythium)、破囊壶菌(Thraustochytrium)、布拉氏霉(Blakeslea)、根毛霉属(Rhizomucor)和曲霉属(Aspergillus)。已研究的示例性的细菌包括丙酸杆菌属(Propionibacterium)的那些细菌。研究的藻类包括腰鞭毛虫(dinoflagellate)和/或属于隐甲藻属(Crypthecodinium)、紫球藻属(Porphyridium)或菱形藻属(Nitschia)，例如寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)。 
已研究了酵母例如耶罗维亚酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、毛孢子菌属(Trichosporon)和脂质酵母属(Lipomyces)以获得其微生物油的性质，且在这些产油酵母中，弯曲隐球 酵母(Cryptococcus curvatus)已引起注意，因为其可利用廉价的碳源例如乳清渗透物(Ykema，A.(1989)Lipid production in the oleaginous yeast Apiotrichum curvatum.PhD thesis.Free University Amsterdam，The Netherlands.)和其他富含碳水化合物的农业或食品加工废料积累大量的油，多达细胞干重的60％(Ratledge，C.(1991)Microorganisms for lipids.Acta.Biotechnol.11：429-438)。弯曲隐球酵母(C.curvatus)产生的酵母油类似植物种子油如棕榈油(Davies，R.J.(1988)Yeast oil from cheese whey；process development.在：Moreton RS(编)Single cell oil.Longman，London的第99-145页)。还已研究了毕赤属和酵母属的酵母，例如西弗毕赤酵母(Pichia ciferrii)。 
目前，生产酵母油比生产植物油更昂贵。因此，当可生产带有高附加值的特定油时，单细胞油发酵将是经济上可行的。因此，之前的方法已使用工艺工程产生更高的脂质产率、更高的细胞脂质含量，和更高的生物质生产，所有这些都适合使工艺在经济上更可行。已报道增加培养物中产油微生物的细胞密度的不同的培养方式，包括补料分批发酵和连续发酵。然而，现有技术没有侧重于从发酵培养基中有效提取油。 
发明概述 
本文公开了称为库德里阿兹威毕赤酵母的新型、分离的产油酵母菌株，该菌株已以微生物典型培养物保藏中心(“MTCC”)登记号5493保藏。本文还公开了发酵产油酵母例如库德里阿兹威毕赤酵母的某些方法、发酵产油酵母例如库德里阿兹威毕赤酵母的方法、提取由产油酵母例如库德里阿兹威毕赤酵母产生的油的方法和由产油酵母例如库德里阿兹威毕赤酵母生产生物柴油的方法。在某些实施方式中，这些方法使用廉价且经济的组分和工艺。 
因此，本文公开了库德里阿兹威毕赤酵母的分离的酵母细胞，MTCC保藏号为5493。在某些实施方式中，分离的酵母细胞能够在产油条件下将其重量的至少50％，或约50％累积成油。在某些实施方式中，分离的酵母细胞处于培养基中。在某些实施方式中，培养基包括粗制甘油、玉米浆(corn steep liquor)和酵母自溶物。 
本文还公开了以登记号MTCC 5493保藏的库德里阿兹威毕赤酵母菌株。本文还公开了库德里阿兹威毕赤酵母MTCC 5493的生物学纯培养物。本文还公开了包含库德里阿兹威毕赤酵母MTCC 5493的分离的酵母细胞的微生物组合物。本文还公开了包含由分离的酵母细胞产生的油的组合物。在某些实施方式中，分离的酵母细胞是库德里阿兹威毕赤酵母，MTCC保藏号5493。在某些实施方式中，油包括至少约10％的棕榈酸、至少约8％的棕榈油酸、至少约1％的硬脂酸、至少约41％的油酸、至少约15％的亚油酸和至少约6％的亚麻酸。在某些实施方式中，已对提取的油进行酯交换。 
本文还公开了包括分离的酵母细胞和培养基的组合物。在某些实施方式中，培养基包括约1％w/v的粗制甘油，约2％w/v的玉米浆、约0.5％w/v的酵母自溶物、其中组合物具有约5.5的pH。在某些实施方式中，酵母细胞包括MTCC保藏号为5493的库德里阿兹威毕赤酵母。 
本文还公开了用于培养酵母细胞以诱导细胞产生油的方法。在某些实施方式中，该方法包括提供包含约1％w/v的粗制甘油、约2％w/v的玉米浆、约0.5％w/v的隐球酵母自溶物的培养基，其中所述培养基具有约5.5的pH；和使用补料分批发酵在约28℃下在培养基中发酵酵母细胞至少约100小时。在某些实施方式中，酵母细胞包括MTCC保藏号为5493的库德里阿兹威毕赤酵母。在某些实施方式中，发酵持续进行至少约110小时。在某些实施方式中，补料分批发酵包括在发酵期间加入甘油。在某些实施方式中，所加入的甘油包括粗制甘油。在某些实施方式中，当发酵的甘油浓度低于约8g/L时向培养基中加入甘油。在其他实施方式中，发酵持续到酵母细胞的OD在约110和150之间。在某些实施方式中，发酵产生以干重计至少约14％的油产率。在其他实施方式中，发酵产生以干重计至少约20％的油产率。又在其他实施方式中，发酵后经发酵的细胞生物质以干重计为至少约30g/L。在某些实施方式中，酵母细胞包括MTCC保藏号为5493的库德里阿兹威毕赤酵母。 
本文还公开了用于生产包括脂肪酸甲酯的油的方法。在某些实施方式 中，该方法包括在产油条件下培养分离的酵母细胞；和从培养的酵母细胞中提取油。在某些实施方式中，对提取的油进行酯交换。在某些实施方式中，在产油条件下培养包括提供包含约1％w/v的粗制甘油、约2％w/v的玉米浆、约0.5％w/v的隐球酵母自溶物的培养基，其中培养基具有约5.5的pH；和使用补料分批发酵在约28℃下在培养基中发酵酵母细胞至少约100小时。在某些实施方式中，酵母细胞包括MTCC保藏号为5493的库德里阿兹威毕赤酵母。 
本文还公开了用于生产包含脂肪酸甲酯的生物柴油的方法。在某些实施方式中，该方法包括在产油条件下培养酵母细胞，例如MTCC保藏号为5493的库德里阿兹威毕赤酵母；从培养的酵母细胞中提取油；并对提取的油进行酯交换。 
本文还公开了用于生产包括脂肪酸甲酯的生物柴油的方法。在某些实施方式中，该方法包括在产油条件下培养包括MTCC保藏号为5493的库德里阿兹威毕赤酵母的酵母细胞；和通过直接酯交换提取脂肪酸甲酯。在其他实施方式中，该方法包括在产油条件下培养包括MTCC保藏号为5493的库德里阿兹威毕赤酵母的酵母细胞；和从培养的酵母细胞中分离脂肪酸甲酯。又在其他实施方式中，该方法包括在产油条件下培养分离的酵母细胞，例如MTCC保藏号为5493的库德里阿兹威毕赤酵母；和从培养的酵母细胞中分离脂肪酸甲酯。 
因此，本文公开了以MTCC登记号5493鉴定的库德里阿兹威毕赤酵母的分离的酵母细胞。在某些实施方式中，分离的酵母细胞能够在产油条件下将其重量的约50％累积成油。在某些实施方式中，分离的酵母细胞处于培养基中。在某些实施方式中，培养基包括粗制甘油、玉米浆和酵母自溶物。 
本文还公开了以登记号MTCC 5493保藏的库德里阿兹威毕赤酵母菌株的分离的酵母细胞。本文还公开了库德里阿兹威毕赤酵母MTCC 5493的生物学纯培养物。本文还公开了包括库德里阿兹威毕赤酵母MTCC 5493的分离的酵母细胞的微生物组合物。本文还公开了包括由分离的酵母细胞产生的油的组合物；在某些实施方式中，分离的酵母细胞为库德里阿兹威 毕赤酵母，MTCC保藏号为5493。在某些实施方式中，油包括至少约10％的棕榈酸、至少约8％的棕榈油酸、至少约1％的硬脂酸、至少约41％的油酸、至少约15％的亚油酸和至少约6％的亚麻酸。在某些实施方式中，已对提取的油进行酯交换。 
本文还公开了包括分离的酵母细胞和培养基的组合物。在某些实施方式中，培养基包括约1％w/v的粗制甘油、约2％w/v的玉米浆、约0.5％w/v的酵母自溶物，其中组合物具有约5.5的pH。在某些实施方式中，酵母细胞包括MTCC保藏号为5493的库德里阿兹威毕赤酵母。 
本文还公开了用于培养酵母细胞以诱导细胞产生油的方法。在某些实施方式中，该方法包括提供包括约1％w/v的粗制甘油、约2％w/v的玉米浆、约0.5％w/v的隐球酵母自溶物的培养基，其中所述培养基具有约5.5的pH；和使用补料分批发酵在约28℃下在培养基中发酵酵母细胞至少约100小时。在某些实施方式中，酵母细胞包括MTCC保藏号为5493的库德里阿兹威毕赤酵母。在某些实施方式中，发酵进行至少约110小时。在某些实施方式中，补料分批发酵包括在发酵期间加入甘油。在某些实施方式中，所加入的甘油包括粗制甘油。在某些实施方式中，当发酵的甘油浓度低于约8g/L时向培养基中加入甘油。在其他实施方式中，发酵持续到酵母细胞的OD在约110和150之间。在某些实施方式中，发酵产生以干重计至少约14％的油产率。在其他实施方式中，发酵产生以干重计至少约20％的油产率。又在其他实施方式中，发酵后经发酵的细胞生物质以干重计为至少约30g/L。在某些实施方式中，酵母细胞包括MTCC保藏号为5493的库德里阿兹威毕赤酵母。 
本文还公开了用于生产包含脂肪酸甲酯的油的方法。在某些实施方式中，该方法包括在产油条件下培养分离的酵母细胞，和从培养的酵母细胞中提取油。在某些实施方式中，对提取的油进行酯交换。在某些实施方式中，在产油条件下培养包括提供包含约1％w/v的粗制甘油、约2％w/v的玉米浆、约0.5％w/v的隐球酵母自溶物的培养基，其中培养基具有约5.5的pH；和使用补料分批发酵在约28℃下在培养基中发酵酵母细胞至少约100小时。在某些实施方式中，酵母细胞包括MTCC保藏号为5493的库 德里阿兹威毕赤酵母。 
本文还公开了用于生产包含脂肪酸甲酯的生物柴油的方法。在某些实施方式中，该方法包括在产油条件下培养酵母细胞，例如MTCC保藏号为5493的库德里阿兹威毕赤酵母，从培养的酵母细胞中提取油，并对提取的油进行酯交换。 
本文还公开了用于生产包含脂肪酸甲酯的生物柴油的方法。在某些实施方式中，该方法包括在产油条件下培养包括MTCC保藏号为5493的库德里阿兹威毕赤酵母的酵母细胞和通过直接酯交换提取脂肪酸甲酯。在其他实施方式中，该方法包括在产油条件下培养包括MTCC保藏号为5493的库德里阿兹威毕赤酵母的酵母细胞和从培养的酵母细胞中分离脂肪酸甲酯。又在其他实施方式中，方法包括在产油条件下培养分离的酵母细胞，例如，MTCC保藏号为5493的库德里阿兹威毕赤酵母和从培养的酵母细胞中分离脂肪酸甲酯。 
附图简述 
以下附图形成本说明书的部分并被包括以进一步说明本公开内容的某些方面，通过结合详细说明参考一个或多个附图可更好地理解这些方面。 
图1示出了接种密度对库德里阿兹威毕赤酵母(以MTCC登记号5493保藏)的生物质生产的影响。 
图2示出了培养基的pH对库德里阿兹威毕赤酵母的生物质生产的影响。 
图3示出了种龄对库德里阿兹威毕赤酵母的生物质生产的影响。 
图4示出了碳源对库德里阿兹威毕赤酵母的生物质生产的影响。 
图5示出了甘油浓度对库德里阿兹威毕赤酵母的生物质生产的影响。 
图6示出了氮源对库德里阿兹威毕赤酵母的生物质生产的影响。 
图7示出了玉米浆浓度对库德里阿兹威毕赤酵母的生物质生产的影 响。 
图8示出了对于产生库德里阿兹威毕赤酵母的生物质的分批发酵曲线。 
图9示出了对于产生库德里阿兹威毕赤酵母的生物质的补料分批发酵曲线。 
图10示出了使用低成本培养基产生库德里阿兹威毕赤酵母的补料分批发酵曲线。 
图11示出了使用来源于生物柴油工业的粗制甘油的高细胞密度发酵。 
图12示出了不含麦芽汁的补料分批发酵。 
图13示出了27L水平下的无麦芽汁存在的补料分批发酵的放大试验期间的曲线。 
图14示出了使用去油隐球酵母作为氮源的补料分批发酵。 
图15示出了使用具有相同组成的种子培养基和生产培养基的补料分批发酵。 
图16示出了使用具有相同组成的种子培养基和生产培养基的补料分批发酵的放大试验。 
详述 
I.定义 
如本文使用的术语“库德里阿兹威毕赤酵母”指毕赤酵母属的一个种。一个实例是以MTCC登记号5493保藏的新型酵母菌株。 
术语“生物柴油”是指包含长链烷基(甲基、丙基或乙基)酯的柴油燃料。生物柴油可包括从酵母分离到的油的脂肪酸甲酯(“FAME”)，包括FAME的化学变体或修饰。 
关于从酵母分离的油或由酵母产生的油，本文使用的术语“油”是指产生于酵母的脂质(例如脂肪酸甲酯)或从酵母分离到的脂质或总的脂质内容物。 
如本文使用的术语“产油条件”是指酵母将产生油的生长或发酵条件。这些条件可包括具有过量的碳和有限量的其他营养成分，尤其是氮的培养基。在某些实施方式中，当生长培养基中的碳源与氮源之比为约40-50时实现“产油条件”。在某些实施方式中，当抑制三羧酸循环，改变代谢途径，蛋白合成停止并激活脂质累积过程时实现“产油条件”。在某些实施方式中，当与对照条件下的同一酵母菌株相比，产油酵母菌株中的NAD-IDH活性减小或缺乏，且产油酵母菌株可不再利用乙酸作为碳源，而可利用甘油或乳酸作为碳源时实现“产油条件”。 
如本文使用的，术语“约”和无论是否被术语约定量的一般范围的使用是指所包括的数字不限于本文提供的精确数字，并意图是指大体处于所引用的范围而不偏离本发明的范围的范围。如本文使用的，“约”将被本领域普通技术人员理解并将根据其使用背景在一定程度上变化。如果存在使用就其使用背景对本领域普通技术人员来讲不清楚的术语，“约”将指多至加或减具体术语的10％，包括加或减5％、1％、0.1％、0.01％，或通常指当使用标准测量程序时所观察到的标准差。 
如本文使用的，术语“酯交换(transesterification)”或“酯交换(transesterifying)”指交换酯的有机基团R″与醇的有机基团R′的过程。以下示出了图解反应。 
Figure BDA00001784287100091
如本文使用的，术语“培养”指细胞(例如，酵母细胞)在人为控制的条件下生长的过程。在某些实施方式中，培养包括发酵。 
如本文使用的，术语“培养基”或“生长培养基”或“发酵培养基”指为支持微生物或细胞，例如酵母细胞的生长而设计的液体或凝胶。 
如本文使用的，术语“酵母细胞生物质”指通过发酵或其他培养方法产生的酵母细胞。在某些实施方式中，已通过离心收集酵母细胞生物质并在一定程度上与培养基或发酵培养基分开。“经发酵的酵母细胞生物质”指通过发酵产生的酵母细胞。 
如本文使用的，术语“以干重计”指当已去除至少某些液体部分时组合物的质量。例如，为确定经发酵的酵母细胞生物质的干重，在10,000rpm下离心1ml的培养物10分钟。用蒸馏水洗涤生物质沉淀两次并在40℃下干燥至恒定质量(通常24h)。在该实施例中，通过重量分析确定生物质，并以克每毫升、克每升等单位提供。 
如本文使用的，术语“以干重计的油产率”指由以干重计测量的单位酵母细胞生物质生产产生的油的量。例如，如果以干重计的酵母细胞生物质是32.8g/L，且从该生物质提取到7g的油，则以干重计油产率是21％。 
如本文使用的，术语“分离的”当与酵母菌株结合使用时，是指完全或基本不含非酵母组分的酵母细胞，这些非酵母组分通常伴随着于其天然形成环境中发现的酵母细胞或与之相互作用。因此，分离的酵母细胞是一种不再存在于其天然环境中的酵母细胞，并且例如生长在实验室中或保存在例如实验室中的培养物中。 
II.分离新型产油酵母菌株 
筛选从多种腐烂的水果样品中分离到的酵母以获得其产油能力。从Ghansoli水果市场，Navi Mumbai，India收集了八种不同的腐烂的水果样品(芒果、番石榴、橙子、石榴、葡萄、香蕉、木瓜和人心果(chikku))。剥掉果皮并将果皮加入到250-mL锥形烧瓶中的100ml的包含(以g/L计)葡萄糖20、蛋白胨5、酵母提取物5、麦芽汁3、KH2PO41和MgSO4·7H2O0.5的富含葡萄糖的培养基中。将样品在28℃下的孵育箱摇床上以200转每分钟(“rpm”)孵育48小时(“h”)以富集酵母。 
然后对以上富集的酵母培养物进行系列10倍稀释并将来自从10-6至10-12范围内的稀释液的0.1ml小份涂布到MGYP琼脂(1％葡萄糖、0.5％蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.3％麦芽汁、2％琼脂和5ml链霉素溶液)上。将平板在28℃孵育72h，并进一步通过实施例13中详述的溶剂萃取法(Folch，J.，M.Lees和G.H.Sloane Stanley(1957)J.Biol.Chem.226：497.)根据其脂质生产能力筛选分离到的酵母菌落。 
然后将鉴定为具有产油潜力的分离的酵母送至IMTECH(Institute of Microbial Technology(微生物技术研究所)，Chandigarh，India)以基于对26S核糖体RNA基因的D1/D2结构域测序而鉴定。发现酵母菌株是库德 里阿兹威毕赤酵母的新型亚种。 
为专利目的，在2009年10月15日根据布达佩斯条约在国际专利生物体保藏中心IMTECH(Institute of Microbial Technology(微生物技术研究所)，Chandigarh，India)以保藏号MTCC 5493保藏了该分离的酵母菌株。 
新型库德里阿兹威毕赤酵母菌株可培养在通常用于培养酵母的培养基中。营养要求可包括氮源例如蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏、玉米浆、氯化铵、硝酸钠和硫酸铵，和碳源例如葡萄糖、半乳糖、淀粉、阿拉伯糖、甘油、甘露醇、蔗糖和果糖。 
可在不对生长造成不利影响的一系列条件下，或在为获得期望的生长速度或生长方式的条件(例如，在产油条件下)下进行培养。评价了用于最大生长和油生产的各种物理和化学参数，例如，pH、接种密度和种龄。另外，作为营养参数检验了不同的碳源和氮源(有机的和无机的)。作为例子而不是限制，培养物可在从约5.0至约7.0的pH范围内的有氧条件下生长，接种密度为1-5％，且种龄为6至24小时。 
本发明还提供了通过提取由分离的酵母菌株积累的油和对其进行酯交换生产生物柴油的工艺。 
III.实施方式 
在某些实施方式中，提供了包括具有MTCC登记号5493的种名为库德里阿兹威毕赤酵母(P.kudriavzevii)的新型毕赤酵母菌株的组合物。在某些实施方式中，组合物包括分离的库德里阿兹威毕赤酵母细胞，其中该细胞能够在产油条件下将其重量的至少50％，例如约50％积累成油。在某些实施方式中，分离的库德里阿兹威毕赤酵母细胞位于包括氮源、碳源和啤酒酵母或酵母自溶物的培养基中。 
在某些实施方式中，提供了筛选和分离能够积累油的新型酵母菌株(例如，产油酵母)的方法。例如，在某些实施方式中，在富集酵母的条件下培养可能包含产油酵母的样品。在某些实施方式中，这些条件包括富含葡萄糖的培养基。在一个示例性的实施方式中，该培养基包含：20g/L葡萄糖、5g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、3g/L麦芽汁、1g/L KH2PO4和 0.5g/L MgSO4·7H2O。在某些实施方式中，涂布富集培养物的样品以便于可评价单独菌落的脂质生产能力。在某些实施方式中，筛选并检测(例如，通过溶剂萃取方法)单独的菌落以获得其脂质生产能力。 
在某些实施方式中，提供了最大化产油酵母生长条件的方法。在某些实施方式中，生长条件涉及发酵产油酵母以生产并提取由酵母产生的油，和/或以使用由酵母产生的油生产生物柴油。因此，在某些实施方式中，生长条件也是“产油条件”。在某些实施方式中，通过评价一个或多个以下参数确定生长条件或产油条件：1)经发酵的酵母生物质；2)经发酵的酵母的光密度(“O.D.”)；3)每单位经发酵的酵母生物质的成本；4)每单位从经发酵的酵母提取的油的成本；和5)每单位由酵母产生的油生产的生物柴油的成本。在某些实施方式中，提供了库德里阿兹威毕赤酵母的生长条件(产油条件)，以便于达到以下的一个或多个：期望的经发酵的库德里阿兹威毕赤酵母的生物质，经发酵的库德里阿兹威毕赤酵母的光密度(“O.D.”)；每单位经发酵的库德里阿兹威毕赤酵母的生物质的成本；每单位从经发酵的库德里阿兹威毕赤酵母提取的油的成本；和每单位由库德里阿兹威毕赤酵母产生的油生产的生物柴油的成本。 
在某些实施方式中，提供了通过提供某些营养和生理参数而最大化产油酵母的生长条件(产油条件)的方法。在某些实施方式中，这些参数使得酵母生物质、油生产、单位发酵生物质的成分、由经发酵的酵母产生的油的单位成本，或由酵母产生的油生产的生物柴油的单位成本中的一个或多个方面的产率提高。作为例子而不是限制，生理和营养参数包括种龄、接种密度和发酵培养基的pH、碳源、碳源浓度、氮源、氮源浓度和发酵方式，例如分批发酵或补料分批发酵。 
在某些实施方式中，提供了通过提供某些营养和生理参数而最大化产油酵母生长条件(产油条件)并节约产生酵母生物质、油和/或生物柴油的成本的方法。因此，在某些实施方式中，廉价的原材料被用于生长和发酵培养基中以最大化生长条件(和产油条件)。作为例子而不是限制，廉价的原材料包括玉米浆(CSL)、粗制甘油和去油的酵母自溶物，例如去油的隐球酵母自溶物。在某些实施方式中，用于产油酵母生长的培养基包括约1％w/v的粗制甘油、约2％w/v的玉米浆、约0.5％w/v的酵母自溶物，其 中生长培养基具有约5.5的pH。在某些实施方式中，使用廉价的原材料例如玉米浆、粗制甘油和去油的酵母自溶物提供了库德里阿兹威毕赤酵母的生长条件(产油条件)。 
在某些实施方式中，采用产油酵母生长条件(产油条件)容纳大规模发酵和/或高密度发酵。在某些实施方式中，以较规模体积(例如，5升，“L”)进行油生产；在其他实施方式中，以较大规模体积(例如，27升或更大)进行油生产。在某些实施方式中，在较小的发酵体积中进行油生产并然后将参数放大以用于较大体积的发酵罐。在某些实施方式中，另外提供了从小体积放大后的更大体积发酵罐中的营养和生理参数。在某些实施方式中，使用廉价的原材料例如玉米浆和粗制甘油。在某些实施方式中，产油酵母为库德里阿兹威毕赤酵母，例如以登记号MTCC 5493保藏的酵母菌株。 
在某些实施方式中，提供了使用廉价的原材料(包括粗制甘油和玉米浆)允许在发酵罐中将产油酵母产生至高密度的方法。在某些实施方式中，产油酵母为库德里阿兹威毕赤酵母，例如以登记号MTCC 5493保藏的酵母菌株。 
在某些实施方式中，提供了用于从产油酵母中提取油的方法。在某些实施方式中，在产油条件下发酵产油酵母，并从发酵的细胞中提取油。在某些实施方式中，提取包括裂解经发酵的酵母细胞(例如，通过匀浆或冷冻)并使用极性有机溶剂萃取油。作为例子而不是限制，极性有机溶剂包括氯仿和己烷。在某些实施方式中，用于发酵的生长培养基包括廉价的原材料例如粗甘油和玉米浆。在某些实施方式中，在较大体积(例如27L或更大)中将发酵进行至高密度。因此，在某些实施方式中，提供了有成本效益的、有商业利益的且可行的用于从产油酵母大规模提取油的方法。在某些实施方式中，产油酵母为库德里阿兹威毕赤酵母，例如以登记号MTCC5493保藏的酵母菌株。 
在某些实施方式中，提供了用于从产油酵母生产生物柴油(例如，包括脂肪酸甲酯“FAME”的生物柴油)的方法。在某些实施方式中，提供了使用从以登记号MTCC 5493保藏的新分离到的酵母库德里阿兹威毕赤酵母提取的油生产生物柴油的方法。在某些实施方式中，该方法包括对从产 油酵母中提取的油进行酯交换。在其他实施方式中，该方法包括对产油酵母生物质进行直接酯交换以制备生物柴油。 
在某些实施方式中，提供了有成本效益的、有商业利益的且可行的用于从产油酵母，例如库德里阿兹威毕赤酵母大规模提取油并生产生物柴油的方法。 
在某些实施方式中，提供了筛选并分离能够积累油的新型酵母菌株的方法和组合物。 
在某些实施方式中，提供了证明使用从新分离到的酵母库德里阿兹威毕赤酵母MTCC 5493提取的油生产生物柴油的方法和组合物。 
在某些实施方式中，提供了通过一次一个变量的方法，根据提高的酵母生物质生产而优化生理和营养参数的方法和组合物。 
在某些实施方式中，提供了使用廉价的原材料例如粗制甘油和玉米浆在发酵罐中优化高密度酵母生产的方法。 
在某些实施方式中，提供了方法和组合物以提供用于从经发酵的酵母提取油并对酵母进行酯交换以产生生物柴油的工艺。 
在某些实施方式中，提供了方法和组合物以提供用于直接对酵母生物质进行直接酯交换以制备生物柴油的工艺。 
在某些实施方式中，提供了方法和组合物以提供有成本效益的、有商业利益的且可行的由酵母大规模生产生物柴油的工艺。 
在某些实施方式中，提供了使用廉价的原材料(包括粗制甘油和玉米浆)最大化发酵罐中高密度酵母生产的方法和组合物。 
在某些实施方式中，提供了筛选并分离能够积累油的新型酵母菌株的方法和组合物。在一个实施方式中，本发明描述了通过其基因序列分析表征的新型油积累菌株，库德里阿兹威毕赤酵母MTCC 5493的鉴定。 
在某些实施方式中，提供了使用一次一个变量的方法优化营养和生理参数的方法和组合物。在某些实施方式中，使用这些方法提高酵母生物质的产率。在某些实施方式中，提供了用于酵母的分批发酵和补料分批发酵的方法和组合物。在某些实施方式中，这些方法包括使用粗制甘油和玉米 浆产生酵母生物质。在一个实施方式中，在多至25L规模的大规模发酵罐中发酵酵母。 
在某些实施方式中，提供了从酵母中提取油的方法和组合物。 
在某些实施方式中，提供了对酵母油进行酯交换的方法和组合物。 
在某些实施方式中，提供了对酵母生物质进行直接酯交换以制备生物柴油的方法和组合物。 
IV.实施例 
包括以下实施例以阐述本发明的实施方式。本领域技术人员应当理解以下实施例中公开的技术代表本发明人发现的在实施本发明中运作良好的技术。然而，鉴于本公开内容，本领域技术人员将理解可对所公开的具体实施方式做出许多改变并仍获得类似或相似的结果而不偏离本发明的精神和范围。 
实施例1：产油酵母的筛选和分离 
为获得产油酵母筛选了八种不同的腐烂水果样品(芒果、番石榴、橙子、石榴、葡萄、香蕉、木瓜和人心果)。水果样品收集自Ghansoli水果市场，Navi Mumbai，India。剥掉果皮并将果皮加入到250-mL锥形烧瓶中的100ml的包含(以g/L计)葡萄糖20、蛋白胨5、酵母提取物5、麦芽汁3、KH2PO41和MgSO4·7H2O 0.5的富含葡萄糖的培养基中。在200rpm振荡下，将样品在28℃下的孵箱摇床上孵育48小时以富集酵母。 
实施例2：酵母分离 
然后用无菌蒸馏水对富集的培养物进行系列稀释并将从10-6至10-12范围内的0.1ml小份稀释液涂布到MGYP琼脂平板(1％葡萄糖、0.5％蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.3％麦芽汁、2％琼脂和链霉素(0.2g/L))上。将平板在28℃孵育72h，并将分离的具有典型酵母形态的菌落用于进一步研究。通过溶剂萃取法(Folch等人，1997)进一步筛选约250个分离的菌株的脂质累积，并发现一个菌株在累积油方面是非常有效的，而其他分离的菌株产生的油量可忽略不计(不可测量)。对于酵母，脂质累积过程需要消耗营养成分，通常是氮，以允许过量的碳被掺入到脂质中。因此对该菌株进行了进一步的优化以增加生物质和油生产。 
实施例3：鉴定酵母菌株 
如实施例2中讨论的在累积油方面非常有效的酵母菌株被微生物典型培养物保藏中心，Chandigarh基于对26S核糖体RNA基因的D1/D2结构域的测序鉴定为库德里阿兹威毕赤酵母菌株，并被给予登记号5493。 
本发明人分离了该菌株并将其首次保藏并给予登记号MTCC 5493。 
实施例4：微生物的生长和维持 
将以下实施例5中讨论的实验中使用的酵母菌株库德里阿兹威毕赤酵母MTCC 5493在包含100ml的含有(以g/L计)葡萄糖10、蛋白胨50、酵母提取物5、K2HPO43和KH2PO41的MGYP培养基(pH 5.5)的250ml烧瓶中培养。将培养基在121℃下灭菌20分钟并用2％种子接种物(2ml)接种并在30±1℃下在200rpm下孵育24h。 
如上培养种子接种物。 
实施例5：提高的生物质生产 
以下实施例鉴定到了不同底物的关键平衡和实现微生物脂质发酵的高密度细胞培养的培养方式。 
A.提高酵母生物质的物理-化学因素的选择 
通过以一次一个测定有关毕赤酵母细胞(库德里阿兹威毕赤酵母，MTCC登记号5493)生长的各个物理-化学参数或变量的方法进行实验。将pH、接种密度和接种量作为物理参数来检验，而将不同的碳源和氮源(有机的和无机的)作为营养参数来检验。进一步研究所选择的碳源、氮源和盐以达到用于提高酵母细胞生产(生物质)的特定浓度。在实施例5所述的每个实验中，除非另外指明，如实施例4中所述培养种子接种物和实验批次的细胞。 
B.测定酵母干质量 
对于实施例5-12中所述的实验，如下测定酵母细胞生物质的干重。在10,000rpm下离心1ml的培养物10分钟。用蒸馏水洗涤生物质沉淀两次并在40℃下干燥至恒定质量(通常24h)。通过重量分析确定生物质。 
C.接种密度的影响 
评价了从1至5％(v/v)的接种密度和其对酵母生物质生产的影响。图1表明接种密度未明显影响酵母菌株的生长且因此在所有随后实验中使用1％(v/v)的接种物。 
D.pH对酵母生物质的影响 
研究了初始pH对酵母生物质生产的影响，其中初始pH从5.0变化至7.0。当在pH 5.5下进行发酵时，获得最大光密度16.86(酵母细胞生物质干重为7.2g/L)(图2)。 
E.种龄的影响 
使用生长从6h至24h的不同时间段的接种物测定种龄对酵母生物质的影响。24h的老的接种物似乎提供19.6的最大OD，酵母细胞生物质的干重为8.1g/L(图3)。 
F.不同碳源的影响 
碳源在生物质和脂质生产两方面都起作用。评价了各种碳源包括葡萄糖、半乳糖、淀粉、阿拉伯糖、甘油、甘露醇、蔗糖和果糖对生物质生产的影响。在所有受试碳源中，甘油是最佳碳源(图4)，产生25.35的O.D.和8.3g/L的酵母细胞生物质干重。关于培养基中甘油浓度的进一步优化表明在1％的甘油浓度下获得了最高光密度25.25和7.8g/L的细胞干重(图5)。 
G.不同氮源的影响 
用各种有机和无机氮源包括蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏、玉米浆、氯化铵、硝酸钠和硫酸铵替代培养基中的氮源。发现玉米浆(“CSL”)是最佳氮源(图6)。CSL浓度评价显示在2％CSL下OD升至31.92，细胞干重为9.85g/L(图7)。 
实施例6：7L发酵罐中的放大试验研究 
在生物反应器(Sartorius B-plus，Germany)中以工作体积5升(“L”)进行酵母细胞(库德里阿兹威毕赤酵母，MTCC登记号5493)生产的放大试验。如以下A-C部分所述进行放大试验。 
A.测定油产率 
对于实施例7-12中所述的实验，通过油的量除以用来提取油的细胞的 细胞干重来确定来自经发酵的酵母细胞的油产率。 
B.使用MGYP培养基的分批发酵和补料分批发酵 
为促进高密度生长，将库德里阿兹威毕赤酵母细胞(MTCC 5493)在包含蛋白胨、酵母提取物、麦芽汁和葡萄糖的MGYP培养基中培养。以分批模式或补料分批模式使细胞在发酵罐中生长。在pH 5.5下进行发酵。必要时，通过加入液氨维持运行期间的pH。在3vvm的通气下，在350rpm下维持搅拌。对于分批发酵，运行在28℃下进行48h，在48h内产生24.2的O.D.和8.4g/L的酵母细胞生物质干重(图8)。此后，存在生物质生产的下降。为提高酵母细胞密度，尝试了补料分批发酵。除了当葡萄糖水平下降至5g/L以下时向发酵罐中加入1％葡萄糖作为补料，在用于分批模式的条件下运行发酵罐120h。图9中示出的结果表明在110h内获得了34.5g/L的最大生物质干重。O.D.为101.35。未进行油提取。 
C.使用低成本底物，例如粗制甘油和CSL的补料分批发酵 
为降低发酵培养基的成本，用一种廉价的原材料玉米浆(“CSL”)代替蛋白胨和酵母提取物，并用粗制甘油代替葡萄糖。实施例5中验证了甘油和CSL。发酵罐培养基由2％的粗制甘油、1％的CSL和0.2％的麦芽汁构成。发酵在28℃和5.5的pH下运行120h。在3vvm通气下，在350rpm下搅拌。在孵育17h和65h后，当甘油浓度被降低至8g/L以下时，将粗制甘油(2％)作为补料加入到发酵罐中。甘油水平被升至30g/L。结果表明在112h孵育中获得42g/L的生物质(图10)；112h的O.D.为106。 
实施例7：使用来源于生物柴油工业的粗制甘油的高细胞密度发酵 
在生物反应器(Sartorius C-plus，Germany)中以5.0L的工作体积进行补料分批发酵。为促进高密度生长，将库德里阿兹威毕赤酵母(MTCC5493)细胞生长在包含1％w/v的粗制甘油、2％w/v的玉米浆、0.5％w/v的面包酵母和0.2％w/v的麦芽汁的培养基中。用如以上实施例4中所述制备的20％v/v接种物接种培养基。以补料分批模式在pH5.5下运行发酵罐。必要时，通过加入3N氢氧化钠和/或3N硫酸控制运行期间的pH。发酵参数为在1vvm通气下在700rpm下搅拌。在发酵过程中当甘油水平降至8g/L以下时，向发酵罐中加入总共6％v/v的甘油作为补料，所加入的甘油来自甘油的浓缩储存溶液以使每次补料期间的终浓度为1％。图11中示 出的结果表明在138h的发酵过程中，获得了123的最大O.D.和30.4g/l生物质的干重，其中以干重计油产率为13.76％，随后优化了油提取工艺)。 
实施例8：不含麦芽汁的补料分批发酵 
为了降低培养基成本，排除了培养基中的麦芽汁进行补料分批发酵。所有其他发酵参数保持不变(与实施例7中所述相同)。持续136hr运行发酵罐，并在甘油水平下降至8g/L以下时向发酵罐中加入6％v/v甘油作为补料。加入来自甘油浓缩储存溶液的补料以使每次补料期间的终浓度为1％。图12中示出的结果表明136h内获得了104的最大O.D.和30.1g/L的酵母细胞生物质干重。油产率以干重计为21％。因此，可从培养基中去除麦芽汁而不降低生物质产率。 
实施例9：无麦芽汁存在下补料分批发酵的27L水平的放大试验 
将实施例8中所述的补料分批发酵在Bioflow-5000发酵罐(New Brunswick)中放大至27L。除了在推进器的尖端速度为350rpm下进行搅拌外，所有其他发酵参数保持不变。持续112h运行发酵罐，并如实施例8中所述，在甘油水平下降至8g/L以下时向发酵罐中加入6％v/v甘油作为补料。图13中示出的结果表明112h内获得了96.36的最大O.D.和31.8g/L的酵母细胞生物质干重。测定油产率为以干重计的22％。 
实施例10：使用去油隐球酵母作为氮源的补料分批发酵 
为使该工艺在经济上更可行，用从其他发酵收集的去油弯曲隐球酵母(Cryptococcus curvatus)的酵母细胞代替培养基中的面包酵母自溶物。所有其他培养基组分和发酵条件与实施例8中所述相同。发酵罐培养基由1％w/v的粗制甘油、2％w/v的CSL和0.5％w/v的隐球酵母自溶物组成。在28℃和5.5的pH下进行发酵。持续136h运行发酵罐，并如实施例8中所述，在甘油水平下降至8g/L以下时向发酵罐中加入7.5％v/v甘油作为补料。图14中示出的结果表明在136h内获得了144的最大O.D.和40.6g/L的酵母细胞生物质干重。测定油产率为以干重计的14.8％。 
实施例11：使用具有相同组成的种子培养基和生产培养基的补料分批发酵 
在所有之前的批次中，种子接种物总是生长在MGYP培养基中，如实 施例4所述。然而，生物柴油是应具有竞争性定价的商品；因此，每一点的节约是正当的。因此，种子接种物生长在与生产中使用的培养基相同的低成本培养基中，该培养基由1％w/v的粗制甘油、2％w/v的CSL和0.5％w/v的隐球酵母自溶物组成。 
用20％v/v的种子接种物接种补料分批发酵的培养基并在28℃和5.5的pH下进行发酵。除了持续114h运行发酵罐并在甘油水平下降至8g/L时将4.5％v/v的甘油加入到发酵罐中作为补料以外，所有其他参数与实施例10中所述的相同。 
加入来自甘油浓缩储存溶液的补料以使每次补料期间的终浓度为1％。图15中示出的结果表明114h内获得了116.5的最大O.D.和31.8g/L的酵母细胞生物质干重。油产率以干重计为20.16％。减少甘油补料的量以保证充分利用甘油和在发酵结束时去除任何残余甘油。 
实施例12：使用具有相同组成的种子培养基和生产培养基的补料分批发酵的放大试验 
以27L规模进行实施例11中所述的补料分批发酵的放大试验。发酵罐培养基和接种培养基都由1％w/v的粗制甘油、2％w/v的CSL和0.5％w/v的隐球酵母自溶物组成。向补料分批发酵培养基中以20％v/v加入种子接种物，并在28℃和5.5的pH下进行发酵。除了发酵规模(5L对27L)和发酵罐，其他参数与实施例11中所述的参数相同，在该实施例中使用来自New Brunswick的Bioflow-5000发酵罐。持续134h运行发酵罐，并在甘油水平下降至8g/L以下时向发酵罐中加入4.5％v/v甘油作为补料。加入来自甘油浓缩储存溶液的补料以使每次补料期间的终浓度为1％。图16中示出的结果表明134h内获得了111.6的最大O.D.和32.8g/L的酵母细胞生物质干重。计算油产率为以干重计的21.5％。 
实施例13：从酵母细胞中提取油(Folch的油提取方法) 
将通过任何以上实施例中所述的发酵方法产生的酵母生物质与20体积的氯仿∶甲醇(2∶1)混合物(1g于20ml的溶剂混合物中)一起匀浆。分散后，在室温下在轨道振荡器上过夜搅拌整个混合物。离心匀浆液并回收液相。用0.2体积(对于20ml为4ml)的水或5％硫酸钠/NaCl溶液洗涤溶剂。漩涡混合几秒钟后，低速(2000rpm)离心混合物以将两相分开。 通过虹吸去除上层相之后，在真空下在旋转蒸发器中或如果体积小于2-3ml的话在氮气流下蒸发包含脂质的下层氯仿相。 
可选择地，可使用正己烷-异丙醇进行从酵母生物质中提取油。使用了3∶2比例的正己烷：IPA。在典型的批次中，将50克(细胞干重)的细胞与5.4L的正己烷和3.6L的IPA混合并在室温下搅拌过夜。为完全分离正己烷层，向混合物中加入1L的水并搅拌。回收正己烷层并在旋转蒸发器中蒸发以回收油。 
实施例14：对从酵母提取的油进行酯交换 
为了生产生物柴油，如以上实施例13中所述的，对从库德里阿兹威毕赤酵母(MTCC保藏号5493)提取的油进行酯交换。通常，向10g的油中加入0.8ml的甲醇并在150rpm下充分混合1h。用H2SO4(0.1％)酸化混合物并在35℃、150rpm下持续1h进行酸化反应。在恒速搅拌下，将溶解在甲醇的NaOH(0.4％)缓慢加入到反应混合物中。在150rpm恒速搅拌下，将反应混合物在70℃保持1h。然后静置反应混合物以相分离；移出包含FAME(生物柴油)的上层相并分析该上层相。 
实施例15：通过直接酯交换从酵母细胞提取FAME 
按照Lee等人的步骤通过直接酯交换提取FAME。简单来讲，向10ml的甲醇硫酸(于甲醇中的0.1％硫酸)混合物中加入如任何以上实施例中所述发酵的冻干的细胞(1g)并剧烈混合。加入10ml的氯仿并在80℃下加热混合物2h。在酯交换期间向混合物中加入合成的抗氧化剂(没食子酸丙酯)，并然后冷却混合物。然后向混合物中加入20ml的水并剧烈振荡。静置混合物(12h)发生相分离后，从氯仿萃取物中回收FAME。 
实施例16：匀浆发酵液并提取油 
为去除用于收集细胞团的离心步骤，进行发酵液的直接匀浆。在4℃下在800巴的压力下在匀浆器中对发酵液进行匀浆以破碎细胞。1L细胞通过的时间是4min。采用通过5次以破碎细胞。将匀浆的细胞与己烷(1∶2比例的匀浆的细胞∶己烷)混合以提取油。在50L的搅拌罐中以950rpm持续1h进行提取工艺。相分离后，去除水层并向己烷层加入异丙醇(“IPA”)，浓缩己烷层以回收油。 
实施例17：通过GC分析FAME 
通过装备有火焰离子化检测器的气相色谱(Agilent系列)分析如实施例16所述提取的FAME酯。在Supelco omega wax 250毛细管熔凝硅石柱(30mx0.25m)上进行分析。烤箱时间-温度特征是：140℃(起始)，每分钟4℃升至240℃，240℃(10min)，总的运行时间为30分钟。使用每种FAME各自的标准(Sigma)进行FAME的鉴定和量化。 
实施例18：脂质的对比分析 
将实施例17中所述的从库德里阿兹威毕赤酵母(MTCC 5493)提取的油的脂肪酸含量与弯曲隐球酵母油和麻风树油的脂肪酸含量进行对比。 
通过使用比例为3∶2的正己烷∶IPA进行弯曲隐球酵母的油萃取。将离心的湿细胞(500g)与9L的正己烷∶IPA(3∶2)混合并室温搅拌过夜。向混合物中加入水(1L)以完全分离正己烷层，这一过程在搅拌后立即发生。通过在旋转蒸发器中蒸发溶剂从正己烷层中回收油。通过在Soxhlet装置中用石油醚萃取压碎的麻风树籽获得麻风树油。种子中的油被萃取在溶剂中，然后在旋转蒸发器中蒸发溶剂以获得油。 
库德里阿兹威毕赤酵母和弯曲隐球酵母的脂肪酸特征与麻风树油的脂肪酸特征相当，表明酵母油适合用于生产生物柴油。这是第一次表明毕赤酵母菌株积累油(产油的)。一般来讲，认为毕赤属是酵母分子遗传技术的载体且已被充分研究。因此，由于了解该酵母菌株和其操作容易性，为提高油生产而进一步操作毕赤酵母菌株将是一项容易的多的任务。毕赤酵母的油组合物由存在于麻风树油中的所有已知的脂肪酸组成，麻风树油是众所周知的用于生产生物柴油的来源。因此，还认为来自毕赤酵母的油适合于生产生物柴油。 
表1油样品的对比分析 
  脂肪酸类型   麻风树油   隐球酵母油   库德里阿兹威毕赤酵母油
  C14:0(肉豆蔻酸) -   02.43％ -
  C16:0.(棕榈酸)   14.66％   34.48％   10.89％
[0159] 
  C16:1(棕榈油酸)   0.94％   01.47％   8.22％
  C18:0(硬脂酸)   6.86％   6.84％   1.80％
  C18:1(油酸)   39.08％   38.98％   41.36％
  C18:2(亚油酸)   32.48％   07.62％   15.88％
  C18:3(亚麻酸)   0.30％   00.84％   6.65％
  C20:0(花生酸)   0.24％   0.85％ -
  未知   5.44％   6.1％   15.20％
因此，本公开内容描述了用于由产油酵母例如以登记号MTCC 5493保藏的库德里阿兹威毕赤酵母生产脂质的简单补料分批工艺。该工艺特征是包含粗制甘油和CSL的低成本培养基。使用这些工业副产物增加了生物质和脂质生产力，同时减少了生产成本。 
因此，虽然我们已描述了本发明的基本新颖性特征，将应理解各种省略和替代和形式和细节的改变可以是可能的而不偏离本发明的精神。例如，明确期望以基本相同的方式发挥基本相同的功能以实现相同结果的那些成分和/或方法步骤的所有组合落在本发明的范围内。 

Claims (28)

1.一种以MTCC登记号5493保藏或鉴定的库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)的分离的酵母细胞。
2.以MTCC登记号5493保藏或鉴定的库德里阿兹威毕赤酵母菌株的分离的酵母细胞。
3.根据权利要求1所述的分离的酵母细胞，其中所述酵母细胞位于培养基中。
4.根据权利要求3所述的分离的酵母细胞，其中所述培养基包括：
粗制甘油；
玉米浆；和
酵母自溶物。
5.一种组合物，包括由权利要求1所述的分离的酵母细胞产生的油。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述油包括：
至少约10％的棕榈酸，
至少约8％的棕榈油酸，
至少约1％的硬脂酸，
至少约41％的油酸，
至少约15％的亚油酸，和
至少约6％的亚麻酸。
7.根据权利要求5所述的组合物，其中所提取的油已经受酯交换。
8.一种组合物，包括：
a)权利要求1所述的分离的酵母细胞；和
b)一种培养基，包括：
约1％w/v的粗制甘油，
约2％w/v的玉米浆，
约0.5％w/v的酵母自溶物，
其中所述组合物具有约5.5的pH。
9.一种用于培养权利要求2所述的分离的酵母细胞以诱导所述细胞产生油的方法，所述方法包括：
a)提供包含以下的培养基：
约1％w/v的粗制甘油，约2％w/v的玉米浆，约0.5％w/v的酵母自溶物，其中所述培养基具有约5.5的pH；
b)使用补料分批发酵在约28℃下在所述培养基中发酵权利要求2所述的酵母细胞至少约100小时。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述发酵持续进行至少约110小时。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述补料分批发酵包括在所述发酵期间加入甘油。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所加入的甘油包括粗制甘油。
13.根据权利要求11所述的方法，其中当发酵的甘油浓度低于约8g/L时向所述培养基中加入甘油。
14.根据权利要求9所述的方法，其中发酵持续到所述酵母细胞的O.D.在约110和150之间。
15.根据权利要求9所述的方法，其中所述发酵产生以干重计至少约14％的油产率。
16.根据权利要求9所述的方法，其中所述发酵产生以干重计至少约20％的油收率。
17.根据权利要求9所述的方法，其中发酵后经发酵的细胞生物质以干重计为至少约30g/L。
18.一种用于生产包含脂肪酸甲酯的油的方法，所述方法包括：
a)在产油条件下培养权利要求1所述的分离的酵母细胞；
b)从所培养的酵母细胞中提取所述油。
19.根据权利要求18所述的方法，还包括对所提取的油进行酯交换。
20.根据权利要求18所述的方法，其中在产油条件下培养包括：
a)提供包含以下的培养基：
约1％w/v的粗制甘油，约2％w/v的玉米浆，约0.5％w/v的酵母自溶物，其中所述培养基具有约5.5的pH；
b)使用补料分批发酵在约28℃下在所述培养基中发酵权利要求1所述的酵母细胞至少约100小时。
22.一种用于生产包含脂肪酸甲酯的生物柴油的方法，所述方法包括：
a)在产油条件下培养权利要求2所述的分离的酵母细胞；
b)从所培养的酵母细胞中提取油；
c)对所提取的油进行酯交换。
23.一种用于生产包含脂肪酸甲酯的生物柴油的方法，所述方法包括：
a)在产油条件下培养包括MTCC登记号为5493的库德里阿兹威毕赤酵母的酵母细胞；
b)通过直接酯交换提取脂肪酸甲酯。
24.一种用于生产包含脂肪酸甲酯的生物柴油的方法，所述方法包括：
a)在产油条件下培养包括MTCC登记号为5493的库德里阿兹威毕赤酵母的酵母细胞；
b)从培养的酵母细胞中提取脂肪酸甲酯。
25.一种用于生产包含脂肪酸甲酯的生物柴油的方法，所述方法包括：
a)在产油条件下培养权利要求1所述的分离的酵母细胞；
b)从培养的酵母细胞中提取脂肪酸甲酯。
26.根据权利要求1所述的分离的酵母细胞，其中所述细胞能够在产油条件下将其重量的约50％累积成油。
27.一种库德里阿兹威毕赤酵母MTCC 5493的生物学纯培养物。
28.一种包括库德里阿兹威毕赤酵母MTCC 5493的分离的酵母细胞的微生物组合物。
29.以上要求保护的以MTCC登记号5493保藏或鉴定的库德里阿兹威毕赤酵母的分离的酵母细胞、其组合物及其在生物柴油中的应用方法，在本文在实施例和附图中充分示例说明。
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