CN106635837B - 一株高效产油丝状真菌卷枝毛霉q-531及其应用 - Google Patents

一株高效产油丝状真菌卷枝毛霉q-531及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株高效产油丝状真菌卷枝毛霉Q‑531及其应用，该高效产油丝状真菌分类命名为卷枝毛霉（Mucor circinelloides）Q‑531，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2016364，保藏日期为2016年7与4日，保藏地址为中国武汉武汉大学。本发明通过固态发酵工艺将桑树枝条直接转化为微生物油脂，油脂产量最高达42.43±4.01 mg/gds，并且纤维素酶酶活最高达1.39±0.09 FPU/gds。此外，真菌细胞中的最大油脂含量为28.8±2.85%。本发明利用卷枝毛霉研究以农林废弃物（桑树枝条）固态发酵产油，不仅合理利用废弃资源提高了油脂产量，而且还降低了生产成本利于产业化。

Description

一株高效产油丝状真菌卷枝毛霉Q-531及其应用
技术领域
本发明涉及农林废弃物的再利用技术领域，具体涉及一株高效产油丝状真菌卷枝毛霉Q-531及其应用。
背景技术
随着人类社会经济的发展，能源危机和环境保护已成为目前两大全球性的问题。面对化石燃料的快速消耗，地球上的不可再生资源越来越少，越来越多的国家迫切寻求新能源和可再生能源以满足自身的需求。木质纤维素生物质作为地球上最丰富的资源，正是因为其丰富且廉价以及可再生的特点，被认为是一种很有前景的可替代原料。有资料表明，全世界每年的植物体生长量高达1.6×1011吨干重。农林废弃物作为木质纤维素生物质的一部分，例如玉米秸秆、小麦秸秆、稻草和甘蔗蔗渣等，都可作为原料经生物转化成高附加值的产物，如生物酒精、生物柴油等。
微生物油脂又称单细胞油脂(single cell oil，SCO)，可作为一种重要的能源物质，被广泛用于生产生活的各个方面。以生物柴油为例，作为一种潜在的石油替代品，阻碍其工业化发展的原因在于利用大量的可食用植物油作为原料进行生产，不仅提高了成本而且还造成了食物与燃料的竞争。微生物产油因其具有以下优势：微生物生长周期短，生长发育迅速，便于培养，合成与代谢能力强，易于通过基因工程技术进行改造；微生物产油占用的空间少，不受场地、气候或季节等外界因素的影响，能连续大规模生产生物油脂，并且与农业生产相比所需的劳动力低；微生物生长所需的原料来源广泛且价格低廉，与焚烧木质纤维素生物质处理方法相比，用农林废弃物作为培养基发酵产油，既可以废物再利用，又能保护环境；微生物油脂安全可靠，可产生高附加值的功能性油脂；微生物油脂脂肪酸成分的特殊性，可作为一种很有商业前景的生物柴油优质原料。此外，微生物油脂中所含有的多不饱和脂肪酸，如γ-亚麻酸(GLA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)等更是对人体健康有着积极的作用。
固态发酵(Solid-state Fermentation,SSF)技术被广泛用于产油真菌的培养，这是因为固态发酵培养环境最大限度的模拟了微生物生长的自然条件状况。与液态发酵(Submerged Fermentation，SmF)相比，固态发酵有很多优点，比如无需特定的生物反应器，技术简单易学便于实际应用，发酵过程环保绿色可持续，能够降低能源的消耗，前期投入的资金较少并且能够降低下游的加工成本，没有废水废物产生等。此外，真菌在固态发酵过程中扮演着极其重要的角色，这是由于真菌菌丝的不断伸展蔓延使其能够有效地开拓和穿透固体培养基，更为重要的是，在没有自由水存在的情况下，它们可以充分利用基质中的结合水来生长。
以木质纤维素为原料的微生物固态发酵产油有着更广阔的发展前景和独特的优势。由文献可知，第一次有研究者尝试利用产油微生物将木质纤维素生物质通过固态发酵直接生产生物油脂是在2007年，他们所用的多株真菌都有能力从小麦秸秆与麸皮混合物中进行固态发酵产油，产油量在19-42mg/gram dry substrate(gds)之间，不过所用真菌的纤维素酶活性很低，在0.31-0.69FPU/gds之间。Lin等人于2010年发现A.oryzae A-4可以利用小麦秸秆发酵产油，油产量达到了36.6mg/gds并且其纤维素酶活性可达到了1.69FPU/gds。Dey等人也发现了利用稻草和麦麸通过Alternaria sp.进行固态发酵产油，其纤维素酶活性可达到1.21FPU/gds，油产量高达60.3mg/gds。M.elongate PFY也是另一株被报道出具有高产油的真菌，同样利用稻草，产油量达到70.7mg/gds，但没有纤维素酶活的数据。A.tubingensis TSIP9直接将PPF和EFB生物转化为油脂，油产量分别为31.1mg/gds和37.5mg/gds，然而这株菌的纤维素酶活性都很低，小于1.3U/gds。Cheirsilp and Kitcha两位研究者继续研究A.tubingensis TSIP9固态发酵产油，利用EFB和PK的混合物，产油量达到了39.5mg/gds，但是纤维素酶活性依然很低，只有2.35U/gds。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一株新的高效产油丝状真菌卷枝毛霉Q-531。本发明的另一目的是提供一种利用该产油丝状真菌卷枝毛霉Q-531固态发酵桑树枝条生产微生物油脂的应用。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一株高效产油丝状真菌，其分类命名为卷枝毛霉(Mucor circinelloides)Q-531，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2016364，保藏日期为2016年7与4日，保藏地址为中国武汉武汉大学。
所述的卷枝毛霉Q-531在制备微生物油脂中的应用。
所述的应用，制备微生物油脂的方法为固态发酵。
所述的应用，制备微生物油脂的原料为固态发酵桑树枝条。
卷枝毛霉Q-531是从南京市紫金山采集得到的腐朽树枝、腐烂潮湿落叶中分离筛选所得，其主要特征表现为：树枝和落叶呈黑褐色，腐烂状态，表面长有白色或褐色的菌丝。
提取卷枝毛霉Q-531菌株的基因组DNA，使用真菌通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增，将得到的PCR碱基序列(SEQ ID NO.1所示)在NCBI数据库中进行同源序列分析，所得结果被鉴定为一株新的卷枝毛霉，命名为卷枝毛霉(Mucor circinelloides)Q-531。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点如下：
1)本发明以桑树枝条为原料进行微生物固态发酵产油，利于桑树枝条废弃物的资源化利用。
2)本发明通过固态发酵工艺将桑树枝条直接转化为微生物油脂，油脂产量最高达42.43±4.01mg/gds，并且纤维素酶酶活最高达1.39±0.09FPU/gds。此外，真菌细胞中的最大油脂含量为28.8±2.85％，可见M.circinelloidesQ-531属于产油微生物。其中脂肪酸成分主要为棕榈酸(C16:0，18.42％)、油酸(C18:1，33.89％)、亚油酸(C18:2，14.45％)以及γ-亚麻酸(C18:3n6，22.52％)。75.95％的不饱和脂肪酸含量有利于生物柴油的生产。
3)本发明利用卷枝毛霉研究以农林废弃物(桑树枝条)固态发酵产油，不仅合理利用废弃资源提高了油脂产量，而且还降低了生产成本利于产业化。
附图说明
图1是M.circinelloidesQ-531的油脂产量和生物量随固态发酵时间的变化结果图；
图2是M.circinelloidesQ-531的油脂产量和纤维素酶活随固态发酵时间的变化结果图；
图3是木质纤维素生物质在固态发酵过程中主要成分的变化结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
固态发酵培养基的配置：将桑树枝条摊开置于空地处，风干5天除去其水分，然后用剪刀剪成2-3cm的长条，用超细粉碎机粉碎，过40目筛，得到的粉末置于80℃鼓风干燥箱中，烘24小时，之后置于干燥器中保存待用；称取桑树枝条粉末30g于250mL锥形瓶中，并加入MS溶液90mL，使培养基的湿度保持在70-80％。MS溶液的配置为(NH4)2SO4 1.7g、KH2PO42.0g、MgSO4·7H2O 0.5g、CaCl2·2H2O 0.2g、FeSO4·7H2O 0.01g、ZnSO4·7H2O 0.01g、MnSO4·4H2O 0.001g、CuSO4·5H2O 0.0005g和0.1％Tween-80(w/v)，加1000mL蒸馏水，pH6.0。
固态发酵培养：从4℃冰箱中取出保存有M.circinelloides Q-531的PDA平板于28℃生化培养箱中，活化菌种2-3天。在灭菌台上，向已活化过的平板中加20mL左右的无菌水，用接种针轻轻地将菌丝上孢子刮于无菌水中，混匀，无菌过滤，制成孢子悬液(约1×107spores/mL)。用无菌枪头吸取5mL的孢子悬液接种到固态发酵培养基中，接种好的平板培养在温度为28℃，湿度为70-80％左右的人工气候箱中培养12天，每隔2天取样测试。
取样测试方法：取发酵后的基质(包含菌丝体)5克，用蒸馏水反复冲洗2-3次，除去附着在基质上无机盐，离心并冷冻干燥48小时至恒重，置于干燥器中保存待用。
如图1可以看出，M.circinelloidesQ-531具有典型产油真菌的关键特征。真菌生物量和油脂产量在固态发酵的前6天时间里快速增长，并在发酵培养的第6天，油脂产量达到最大值为42.43±4.01mg/gds。然而第6天之后，油脂产量急剧减少，但生物量仍然保持增长，并在发酵第8天达到最大值为134.56±1.41mg/g，之后稍微有所下降，在固态发酵第10天趋于稳定。
由图2所示，M.circinelloides Q-531的纤维素酶活性在固态发酵的前六天时间里快速增加，并在发酵的第6天达到最大值为1.39±0.09FPU/gds；与此同时，真菌油脂产量也增长到最大值为42.43±4.01mg/gds。结果表明，M.circinelloides Q-531能够将木质纤维素生物质直接转化为微生物油脂；更为重要的是，高纤维素酶活性促进油脂生产，同时也说明了油脂产量的关键一步就是利用微生物将固态发酵原料生物转化为可直接被吸收利用的糖单体。
油脂脂肪酸成分分析如表1所示：M.circinelloidesQ-531的主要脂肪酸成分是豆蔻酸(C14:0)、棕榈酸(C16:0)、棕榈油酸(C16:1)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)、γ-亚麻酸(C18:3n6)，其中在发酵的第6天，油酸(C18:1)含量达到最大值为33.89％，同时亚油酸(C18:2)也达到最大值为14.45％，在固态发酵的第2天，棕榈酸(C16:0)、棕榈油酸(C16:1)和硬脂酸(C18:0)的含量都是整个发酵过程中最大的，分别为18.42％、5.56％和5.87％，在固态发酵的第12天，γ-亚麻酸(C18:3n6)达到最大值为22.52％。
表1M.circinelloidesQ-531在不同固态发酵阶段总油脂中脂肪酸分布的变化
表中，SFA：saturated fatty acids，饱和脂肪酸；MUFA:mono-unsaturated fattyacids，单不饱和脂肪酸；PUFA:poly-unsaturated fatty acids，多不饱和脂肪酸。
固态发酵过程中桑树枝条中的主要成分的变化如图3所示：在开始固态发酵之前，木质纤维素生物质，即桑树枝条，其主要成分包括了纤维素、半纤维素和木质素，含量分别为45.11±1.05％、31.39±1.18％和17.36±1.48％。随着固态发酵的过程，相较于半纤维素和木质素的含量，纤维素含量明显减少，在发酵的第8天下降到41.48±0.88％，之后含量变化趋于稳定。在固态发发酵的12天中，半纤维素的含量从31.39±1.18％减少到28.71±1.15％，且在第10天开始，才有明显下降。从固态发酵的第10天开始，木质素的含量才开始明显减少，到发酵第12天减少到15.1±1.33％。在整个发酵过程中，纤维素、半纤维素和木质素含量分别减少了5.92％、5.11％和2.25％。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京林业大学
<120> 一株高效产油丝状真菌卷枝毛霉Q-531及其应用
<130> 100
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 616
<212> DNA
<213> Mucor circinelloides
<400> 1
cttccgtagg gtgaacctgc ggaaggatca ttaaataatc aataattttg gcttgtccat 60
tattatctat ttactgtgaa ctgtattatt acttgacgct tgagggatgc tccactgcta 120
taaggatagg cggtggggat gttaaccgag tcatagtcaa gcttaggctt ggtatcctat 180
tattatttac caaaagaatt cagaattaat attgtaacat agacctaaaa aatctataaa 240
acaactttta acaacggatc tcttggttct cgcatcgatg aagaacgtag caaagtgcga 300
taactagtgt gaattgcata ttcagtgaat catcgagtct ttgaacgcaa cttgcgctca 360
ttggtattcc aatgagcacg cctgtttcag tatcaaaaca aaccctctat ccaacatttt 420
tgttgaatag gaatattgag agtctcttga tctattctga tctcgaacct cttgaaatgt 480
acaaaggcct gatcttgttt gaatgcctga actttttttt aatataaaga gaagctcttg 540
cggtaaactg tgctggggcc tcccaaataa tactcttttt aaatttgatc tgaaatcagg 600
cgggatacca aattct 616

Claims (8)

1.一株高效产油丝状真菌，其分类命名为卷枝毛霉（Mucor circinelloides）Q-531，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2016364，保藏日期为2016年7与4日，保藏地址为中国武汉武汉大学。
2.权利要求1所述的卷枝毛霉Q-531在制备微生物油脂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：制备微生物油脂的方法为固态发酵。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：固态发酵培养基中含有桑树枝条。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：固态发酵培养基的制备方法为：将桑树枝条摊开置于空地处，风干5天除去水分，然后用剪成2-3 cm的长条，用超细粉碎机粉碎，过40目筛，得到的粉末置于80℃鼓风干燥箱中，烘24小时，之后置于干燥器中保存待用；称取桑树枝条粉末30g于250mL锥形瓶中，并加入MS溶液90mL，使培养基的湿度保持在70-80%。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的MS溶液的组分为：（NH4）2SO4 1.7 g、KH2PO4 2.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、CaCl2·2H2O 0.2 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、ZnSO4·7H2O0.01 g、MnSO4·4H2O 0.001 g、CuSO4·5H2O 0.0005 g和0.1% Tween-80，加1000 mL蒸馏水，pH 6.0。
7.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，固态发酵培养方法为：从4℃冰箱中取出保存有M. circinelloides Q-531的PDA平板于28℃生化培养箱中，活化菌种2-3天；在灭菌台上，向已活化过的平板中加无菌水，用接种针轻轻地将菌丝上孢子刮于无菌水中，混匀，无菌过滤，制成孢子悬液；用无菌枪头吸取孢子悬液接种到固态发酵培养基中，接种好的平板培养在温度为28℃，湿度为70-80%人工气候箱中培养5-10天。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，固态发酵培养6天。
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Application publication date: 20170510

Assignee: NANJING YUANYI ENVIRONMENT BIOLOGICAL ENGINEERING CO., LTD.

Assignor: Nanjing Forestry University

Contract record no.: X2019320000250

Denomination of invention: Efficient oil-producing filamentous fungus mucor circinelloides Q-531 and application thereof

Granted publication date: 20190416

License type: Common License

Record date: 20191114