CN106755148A - 一种基于碳氮流定向调控的混菌发酵“一锅法”生产微生物油脂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明适用于生物质资源转化利用技术领域，提供一种基于碳氮流定向调控的混菌发酵“一锅法”生产微生物油脂的方法，具体的，通过敲除里氏木霉的主要β‑葡萄糖苷酶基因，使得混菌发酵过程中，其主要利用生物质原料中的氮源合成纤维素酶，将生物质主要水解为自身难代谢的寡糖，同时创造诱发产油酵母油脂过量积累的氮源胁迫环境；产油酵母弯曲隐球酵母则在氮限制下，将水解所得的寡糖转运至胞内大量导向油脂合成。本方法实现非常简单，可以有效避免混菌发酵过程中非产油菌株消耗过多碳源导致油脂产量低的突出问题，实现生物质原料中碳/氮源的定向转化，显著提高油脂产量和得率，充分利用了生物质资源，从产油微生物菌体提取的微生物油脂可作为制备生物柴油和油脂化工产品的原料。

Description

一种基于碳氮流定向调控的混菌发酵“一锅法”生产微生物油 脂的方法

技术领域

本发明属于生物质转化利用技术领域，尤其涉及一种基于碳氮流定向调控的混菌发酵“一锅法”生产微生物油脂的方法，该方法能够显著提高混菌发酵转化生物质生产油脂产量和得率。

背景技术

自然界中某些酵母菌、霉菌、细菌和藻类在特定条件下，能够以碳水化合物、碳氢化合物、二氧化碳等为碳源，在体内合成并贮存大量油脂，凡是可以在胞内积累油脂并超过细胞干重20％w/w(这里w/w表示质量比，下同)的微生物称为产油微生物。微生物油脂，尤其是产油酵母产生的油脂，其主要成份是甘油三酯，脂肪酸组成与商品化的动植物油脂相似，可作为生物柴油的替代原料。相对于动植物油脂，微生物油脂生产周期短，不受季节与气候限制，原料来源广，基本不占用额外耕地资源，易于实现规模生产，是极具潜力的新型油脂资源。利用生物质资源中的碳水化合物制备微生物油脂，作为生物柴油和功能性油脂的替代原料，是生物炼制的一个崭新研究方向。然而，基于生物质原料的复杂特性，当前产油酵母转化生物质原料制备油脂面临油脂产量低和工艺流程长的突出问题。

诱导产油酵母油脂的过量积累通常需要营养限制，其中氮限制是当前诱导油脂过量积累最有效的策略。生物质原料来源广泛，利用其培养产油酵母，有可能大幅度降低原料成本，并使规模化制备微生物油脂的原材料得到保障。然而，生物质原料，尤其是草本生物质和农业废弃生物质，除可提供碳水化合物外，还富含微生物生长繁殖必需的其它营养组分，其中较高的氮含量，特别不利于诱发微生物过量积累油脂，导致油脂产量和油脂得率较低。研究发现，只要实现低氮营养胁迫，产油酵母就能够高效地积累油脂。因此，过量氮源的移除是将生物质高效转化为微生物油脂的关键。采用化学或生物的方法，部分脱除生物质原料中的氮、磷等组分，实现营养胁迫，可诱发油脂的过量积累。然而，这些策略增加了操作工艺，并导致碳水化合物的损失，经济性很差。

另外，当前利用生物质原料制备微生物油脂还存在着工艺流程长的突出问题。统合生物加工(Consolidated bioprocessing,CBP)是指将纤维素酶的生产、酶水解、己糖和戊糖油脂发酵进行高度整合，由同一株菌完成的技术。由于产油酵母本身并不具备纤维素酶的生产能力，采用重组策略获得的产油酵母工程菌产酶性能一般，当前尚未见产油酵母采用CBP技术直接转化生物质高效制备微生物油脂的报道。

一种非常有潜力的替代方案是混菌发酵，即采用高产纤维素酶的霉菌和高产油脂的产油酵母共培养的方式，可实现生物质原料的“一锅法”制备微生物油脂。理想状态下，前者利用生物质中不利于微生物激发油脂积累的过量氮源的合成纤维素酶，水解生物质为后者提供足够的碳源，同时创造诱发产油酵母油脂过量积累的氮源胁迫环境；而后者则主要在氮源营养胁迫下，将水解所得的碳水化合物导向油脂合成。然而，当前混菌发酵技术仍然存在着纤维素酶生产、微生物生长及油脂积累不协调的突出问题；霉菌消耗过多的营养成分，尤其是碳源，导致用于合成油脂的碳源显著减少，油脂产量低下。因此，混菌发酵时，实现生物质原料中碳、氮源转化的定向调控，是强化油脂生产的关键。为了更高效的利用生物质资源，需要开发一种简单的调控方法，实现生物质原料中碳、氮源的定向转化，解决混菌发酵过程中非产油菌株消耗过多碳源导致油脂产量低的突出问题，显著提高油脂产量和得率，对混菌发酵技术高效制备微生物油脂具有重要意义。

发明内容

鉴于上述问题，本发明的目的在于提供一种基于碳氮流定向调控的混菌发酵“一锅法”生产微生物油脂的方法，旨在解决当前混菌发酵过程中非产油菌株消耗过多碳源导致油脂产量低的突出问题，本方法能够显著提高油脂产量和得率。

本发明提出一种基于碳氮流定向调控的混菌发酵“一锅法”生产微生物油脂的方法，具体包括如下步骤：

预处理生物质原料，调整固液质量比至5％-20％，不添加或者少量添加营养成分，调节pH至4.0-6.0，高温湿热灭菌，制备混菌发酵培养基；

将里氏木霉主要的β-葡萄糖苷酶基因敲除，获得里氏木霉工程菌；

挑取里氏木霉工程菌和产油酵母，分别接种于对应的液体种子培养基中，得到工程菌种子液和产油酵母种子液；

将两种种子液接种至所述混菌发酵养基中，于25℃-37℃通气培养，直至培养基中碳水化合物及其聚合物浓度低于5g/L，终止发酵，固液分离收集沉淀物；

沉淀物采用酸热-有机溶剂法提取油脂。

本发明的有益效果是：

里氏木霉是一株高产纤维素酶的菌株，其纤维素酶系具有很高的外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶活力，而β-葡萄糖苷酶活性极低，可将纤维素不完全水解为纤维寡糖；产油酵母如弯曲隐球酵母则具有高效的寡糖转运系统和很高的胞内β-葡萄糖苷酶活性，能高效转运和代谢纤维寡糖并大量积累油脂；本发明首先敲除里氏木霉的关键β-葡萄糖苷酶基因，然后将里氏木霉工程菌和弯曲隐球酵母混合培养，根据重组里氏木霉和弯曲隐球酵母酶谱互补性和寡糖代谢能力的差异，使得混菌发酵时，前者主要利用生物质原料中的过量氮源营养合成纤维素酶，水解生物质为自身难代谢的寡糖，同时创造诱发产油酵母油脂过量积累的氮源胁迫环境；而后者则主要在氮源营养胁迫下，将水解所得的寡糖主要导向油脂合成，最终实现生物质原料中碳、氮流的定向自调控，显著提高油脂产量和得率。另外，本发明采用混菌发酵，将纤维素酶的生产、酶水解和油脂发酵高度整合，实现了生物质“一锅法”转化高效制备微生物油脂。综上所述，本发明为生物质经济、高效转化制备酵母油脂提供新的方法。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明通过合理选择产纤维素酶的菌株和产油酵母菌株，并对产纤维素酶菌株的酶谱进行改造，使得混菌培养时，前者的主要目的是利用生物质原料中过量的氮源营养合成纤维素酶，水解生物质为自身难代谢的寡糖，同时创造诱发产油酵母油脂过量积累的氮源胁迫环境；而后者则主要在氮源营养胁迫下，将水解所得的寡糖转运至胞内主要导向油脂合成，最终显著提高混菌发酵生产油脂的产量和得率。方法极其简单，避免了当前混菌发酵技术中非产油菌株消耗过多碳源导致油脂产量低的突出问题，显著提高油脂产量和得率，具有明显的技术优势。

本发明方法具体包括如下步骤：

步骤S101、预处理生物质原料，调整固液质量比至5％-20％，不添加或者少量添加营养成分，调节pH至4.0-6.0，高温湿热灭菌，制备混菌发酵培养基。

本步骤所采用的预处理方法为常用的物理、化学、物理化学或生物的生物质预处理方法。

本步骤不添加或添加少量的营养成分，包括磷源、硫源和维生素，如硫酸盐、磷酸盐、硫胺素等或它们的组合，其中磷源占混菌发酵培养基总质量的0.01％-2％、硫源占混菌发酵培养基总质量的0.01％-1％、维生素占混菌发酵培养基总质量的0.001％以内。

本步骤所适用的生物质原料为主要成份为纤维素、半纤维素、木质素和粗蛋白的生物质材料。包括玉米秸秆、玉米芯、稻草、稻壳和麦秆等农业生物质，水葫芦、浮萍和稗子等杂草，柳枝稷和芒草等能源植物中的一种或二种以上组合。

步骤S102、于无菌操作环境中，挑取里氏木霉工程菌和产油酵母，分别接种于各自液体种子培养基中培养，作为一种优选实施方式，于25℃-37℃通气培养12-48h，得到工程菌种子液和产油酵母种子液。

本步骤中里氏木霉工程菌株所用的液体种子培养基可为营养丰富的培养基或产酶诱导培养基；产油酵母所用的液体种子培养基为营养丰富的培养基。比如里氏木霉工程菌株所用的液体种子培养基为PDA或产酶诱导培养基；产油酵母选择弯曲隐球酵母，所用的液体种子培养基为YEPD培养基。

本步骤中，里氏木霉工程菌为产纤维素酶的菌株，为已敲除其主要的β-葡萄糖苷酶基因如bgl1/Cel3a、Cel1a或Cel1b等的里氏木霉Trichoderma reesei工程菌株，产油微生物为弯曲隐球酵母Cryptococcus curvatus。以上菌株可以直接从美国典型培养物保藏中心(ATCC)、中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)、英国国家菌株保藏中心(UKNCC)或德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)等菌种保藏机构购买或从自然界中分离，也可以使用与原来菌株性状不同的人工或自然突变菌株。

步骤S103、将这两种种子液接种至所述混菌发酵养基中，接种总量为2％-20％(v/v)，即接种的两种种子液与混菌发酵养基的体积比为2％-20％，工程菌种子液和产油酵母种子液的接种比例为0.2:1至1:0.2(v/v)，于25℃-37℃通气培养，直至培养基中碳水化合物及其聚合物浓度之和低于5g/L，终止发酵，固液分离收集沉淀物。

步骤S104、所得沉淀物使用酸热-有机溶剂法提取油脂。

这里收集得到的沉淀物为微生物菌体，菌体中含未被利用的生物质，然后从收集的菌体中抽提获得油脂，计算菌体油脂产量。所述微生物油脂主要为长链脂肪酸及其衍生物的甘油酯，经转酯化后，可制成生物柴油，比如在酸催化条件下转酯化制备生物柴油；或参照文献(里伟，等.过程工程学报,2007,7(1):137–140)的方法，提取微生物油脂，在酶催化条件下转酯化制备生物柴油。另外，微生物油脂含有的不饱和脂肪酸还可用于制备其他高附加值产品。

下面通过具体实施例来对本发明进行说明。以下实施例选取了典型的木质纤维素和粗甘油原料为材料培养典型产油微生物的例子，有助于了解本发明，但不以任何形式限制将本发明应用于其他材料或产油酵母菌株。

对比例1

1)水葫芦培养基的制备：称取100g过20目筛的水葫芦，加入1L 2％(w/w)的H₂SO₄中，按照固液比10％(w/w)，于120℃预处理60min；调整固液比至8％(w/w)，调整pH至5.2后于121℃灭菌20min后备用；

2)在PDA液体种子培养基中接入绿色木霉Trichoderma viride ATCC 28038(购自美国典型微生物菌种保藏管理中心)，于28℃，200rpm振荡培养24h，得绿色木霉种子液；在YEPD液体种子培养基中接入弯曲隐球酵母Cryptococcus curvatus ATCC 20509(购自美国典型微生物菌种保藏管理中心)，于30℃，200rpm振荡培养24h，得产油酵母种子液；

3)向步骤1)所得培养基中同时接入步骤(2)制备的两种种子液，接种总量10％(v/v)，里氏木霉种子液和产油酵母种子液的接种比例0.5:1(v/v)，在30℃下通气培养120h；

4)终止发酵，此时发酵液中已检测不到可发酵性糖；固液分离收集沉淀，采用酸热法提取油脂，油脂量1.9g/L，油脂得率为2.4g/100gds。

对比例2

1)水葫芦培养基的制备：称取100g过20目筛的水葫芦，加入1L 2％(w/w)的NaOH中，按照固液比10％(w/w)，于80℃预处理60min；调整固液比至8％(w/w)，调整pH至5.0后于121℃灭菌20min后备用；

2)在PDA液体种子培养基中接入里氏木霉Trichoderma reesei QM 9414，于30℃，200rpm振荡培养24h，得里氏木霉种子液；在YEPD液体种子培养基中接入弯曲隐球酵母C.curvatus ATCC 20509，于30℃，200rpm振荡培养24h，得产油酵母种子液；

3)向步骤1)所得培养基中同时接入步骤(2)制备的两种种子液，接种总量为10％(v/v)，里氏木霉种子液和产油酵母种子液的接种比例0.5:1(v/v)，在30℃下通气培养120h；

4)终止发酵，此时发酵液中已检测不到可发酵性糖；固液分离收集沉淀，采用酸热法提取油脂，油脂量3.5g/L，油脂得率为4.4g/100gds。

实施例1

1)水葫芦培养基的制备：水葫芦预处理同对比例1的步骤1)，调整固液比至8％(w/w)，调整pH至5.2后于121℃灭菌20min后备用；

2)采用同源双交换，构建Trichoderma reesei QM 9414 β-葡萄糖苷酶基因缺失突变体△cel1a△cel1b；在PDA液体种子培养基中接入该工程菌株，于30℃，200rpm振荡培养24h，得工程菌种子液；在YEPD液体种子培养基中接入弯曲隐球酵母C.curvatus ATCC20509，于30℃，200rpm振荡培养24h，得产油酵母种子液；

3)向步骤1)所得培养基中同时接入步骤(2)制备的两种种子液，接种总量为10％(v/v)，工程菌种子液和产油酵母种子液的接种比例0.5:1(v/v)，在30℃下通气培养120h；

4)终止发酵，此时发酵液中已检测不到可发酵性糖；固液分离收集沉淀，采用酸热法提取油脂，油脂量5.5g/L，油脂得率为6.9g/100gds。

实施例2

1)玉米秸秆培养基的制备：参照文献(Li BZ,et al.Bioresour Technol,2010,101:1285–1292)，称取50g过40目筛的玉米秸秆，氨和玉米秸秆质量比2:1(w/w)，于140℃氨爆处理5min；调整固液比至15％(w/w)，调整pH至5.0后于121℃灭菌15min后备用；

2)采用同源双交换，构建Trichoderma reesei QM 9414 β-葡萄糖苷酶基因缺失突变体△cel3a△cel1a△cel1b；在PDA液体种子培养基中接入该工程菌株，30℃，200rpm振荡培养24h，得工程菌种子液；在YEPD液体种子培养基中接入弯曲隐球酵母C.curvatusATCC 20509，30℃，200rpm振荡培养24h，得产油酵母种子液；

3)向步骤1)所得培养基中同时接入步骤(2)制备的两种种子液，接种总量为10％(v/v)，工程菌种子液和产油酵母种子液的接种比例0.5:1(v/v)，在30℃下通气培养192h；

4)终止发酵，此时发酵液中已检测不到可发酵性糖；固液分离收集沉淀，采用酸热法提取油脂，油脂量11.7g/L，油脂得率为7.8g/100gds。

实施例3

1)稗子培养基的制备：参照文献(Ruan ZH,et al.Biotechnol Bioeng,2013,110:1039–1049)，称取50g直径小于1mm的稗子粉末，加入500mL 2％(w/w)的稀硫酸中，固液比10％(w/w)，于130℃处理60min；调整固液比至5％(w/w)，调整pH至4.8后于121℃灭菌20min后备用；

2)采用同源双交换，构建Trichoderma reesei QM 9414 β-葡萄糖苷酶基因缺失突变体△cel1a，在PDA液体种子培养基中接入该工程菌株，30℃，200rpm振荡培养24h，得工程菌种子液；在YEPD液体种子培养基中接入弯曲隐球酵母C.curvatus ATCC 20509，30℃，200rpm振荡培养24h，得产油酵母种子液；

3)向步骤1)所得培养基中同时接入步骤(2)制备的两种种子液，接种总量为10％(v/v)，工程菌种子液和产油酵母种子液的接种比例0.5:1(v/v)，在28℃下通气培养168h；

4)终止发酵，此时发酵液中已检测不到可发酵性糖；固液分离收集沉淀，采用酸热法提取油脂，油脂量2.7g/L，油脂得率为5.4g/100gds。

实施例4

1)玉米芯培养基的制备：称取50g过20目筛的玉米芯，按20％(w/w)的固液比添加2.5％(w/w)的硫酸浸润24h后，190℃水蒸汽气爆处理3min；调整固液比至12％(w/w)，调整pH至6.0后于121℃灭菌18min后备用；

2)采用同源双交换，构建Trichoderma reesei Rut 30 β-葡萄糖苷酶基因缺失突变体△cel3a，在纤维二糖诱导产酶培养基中接入该工程菌株，30℃，200rpm振荡培养48h，得工程菌种子液；在YEPD液体种子培养基中接入弯曲隐球酵母C.curvatus ATCC 20509，30℃，200rpm振荡培养24h，得产油酵母种子液；

3)向步骤1)所得培养基中同时接入步骤(2)制备的两种种子液，接种总量为10％(v/v)，工程菌种子液和产油酵母种子液的接种比例1:1(v/v)，在37℃下通气培养200h；

4)终止发酵，此时发酵液中已检测不到可发酵性糖；固液分离收集沉淀，采用酸热法提取油脂，油脂量8.1g/L，油脂得率为6.8g/100gds。

实施例5

1)稻草培养基的制备：称取50g过20目筛的稻草粉，按20％(w/w)的固液比添加2.5％(w/w)的硫酸浸润24h后，190℃水蒸汽气爆处理3min；调整固液比至8％(w/w)，调整pH至6.0后于121℃灭菌18min后备用；

2)采用同源双交换，构建Trichoderma reesei ATCC 26921 β-葡萄糖苷酶基因缺失突变体△cel1a△cel1b，在PDA液体种子培养基中接入该工程菌株，28℃，200rpm振荡培养24h，得工程菌种子液；在YEPD液体种子培养基中接入弯曲隐球酵母C.curvatus ATCC20508，30℃，200rpm振荡培养12h，得产油酵母种子液；

3)向步骤1)所得培养基中先后接入步骤(2)制备的两种种子液，接种总量为10％(v/v)，先接种工程菌种子液，然后接种产油酵母种子液，间隔时间为24h，工程菌种子液和产油酵母种子液的接种比例为0.5:1(v/v)，在34℃下通气培养120h；

4)终止发酵，此时发酵液中已检测不到可发酵性糖；固液分离收集沉淀，采用酸热法提取油脂，油脂量6.3g/L，油脂得率为7.8g/100gds。

实施例6

1)小麦杆培养基的制备：参照文献(Perez JA,et al.Fuel,2008,87:3640–3647)的优化方法，称取50g过20目筛的小麦杆，进行高温水热预处理；调整固液比至15％(w/w)，调整pH至5.0后于121℃灭菌20min后备用；

2)用同源双交换，构建Trichoderma reesei QM 9414 β-葡萄糖苷酶基因缺失突变体△cel3a△cel1a，在CaCO₃诱导产酶培养基中接入该工程菌株，30℃，200rpm振荡培养48h，得工程菌种子液；在YEPD液体种子培养基中接入弯曲隐球酵母C.curvatus ATCC20509，30℃，200rpm振荡培养24h，得产油酵母种子液；

3)向步骤1)所得培养基中同时接入步骤(2)制备的两种种子液，接种总量为10％(v/v)，工程菌种子液和产油酵母种子液的接种比例0.2:1(v/v)，在25℃下通气培养196h；

4)终止发酵，此时发酵液中已检测不到可发酵性糖；固液分离收集沉淀，采用酸热法提取油脂，油脂量10.8g/L，油脂得率为7.2g/100gds。

实施例7

1)浮萍培养基的制备：参照文献(Perez JA,et al.Fuel,2008,87:3640–3647)的优化方法，称取50g过20目筛的浮萍粉，进行高温水热预处理；调整固液比至7％(w/w)，调整pH至5.0后于121℃灭菌20min后备用；

2)用同源双交换，构建Trichoderma reesei QM 9414 β-葡萄糖苷酶基因缺失突变体△cel3a△cel1b，在PDA液体种子培养基中接入该工程菌株，30℃，200rpm振荡培养36h，得工程菌种子液；在YEPD液体种子培养基中接入弯曲隐球酵母C.curvatus ATCC20508，30℃，200rpm振荡培养24h，得产油酵母种子液；

3)向步骤1)所得培养基中先后接入步骤(2)制备的两种种子液，接种总量为2％(v/v)，先接弯曲隐球酵母C.curvatus，48h后再接入T.reesei工程菌，工程菌种子液和产油酵母种子液的接种比例1:0.2(v/v)，在28℃下通气培养144h；

4)终止发酵，此时发酵液中已检测不到可发酵性糖；固液分离收集沉淀，采用酸热法提取油脂，油脂量5.7g/L，油脂得率为8.1g/100gds。

实施例8

1)柳枝稷培养基的制备：参照文献(Varga E,et al.Appl Biochem Biotechnol,2004,113,509–523)的气爆方法，称取50g过40目筛的柳枝稷，进行气爆预处理；调整固液比至12％(w/w)，调整pH至5.5后于121℃灭菌20min后备用；

2)采用同源双交换，构建Trichoderma reesei QM 9414 β-葡萄糖苷酶基因缺失突变体△cel3a△cel1a△cel1b，在PDA液体种子培养基中接入该工程菌株，30℃，200rpm振荡培养24h，得工程菌种子液；在YEPD液体种子培养基中接入弯曲隐球酵母C.curvatusATCC 20509，30℃，200rpm振荡培养24h，得产油酵母种子液；

3)向步骤1)所得培养基中同时接入步骤(2)制备的两种种子液，接种总量20％(v/v)，工程菌种子液和产油酵母种子液的接种比例1:0.5(v/v)，在30℃下通气培养172h；

4)终止发酵，此时发酵液中已检测不到可发酵性糖；固液分离收集沉淀，采用酸热法提取油脂，油脂量9.2g/L，油脂得率为7.7g/100gds。

实施例9

1)芒草培养基的制备：参照文献(Park JY,et al.Bioresour Technol,2010,101:6805–6811)，称取50g过40目筛的芒草进行生石灰预处理；调整固液比至10％(w/w)，调整pH至5.0后于121℃灭菌20min后备用；

2)采用同源双交换，构建Trichoderma reesei QM 9414 β-葡萄糖苷酶基因缺失突变体△cel3a△cel1b，在PDA液体种子培养基中接入该工程菌株，30℃，200rpm振荡培养24h，得工程菌种子液；在YEPD液体种子培养基中接入弯曲隐球酵母C.curvatus ATCC20509，30℃，200rpm振荡培养24h，得产油酵母种子液；

3)向步骤1)所得培养基中同时接入步骤(2)制备的两种种子液，接种总量为10％(v/v)，工程菌种子液和产油酵母种子液的接种比例1:0.5(v/v)，在32℃下通气培养180h；

4)终止发酵，此时发酵液中已检测不到可发酵性糖；固液分离收集沉淀，采用酸热法提取油脂，油脂量7.5g/L，油脂得率为7.5g/100gds。

实施例10

1)稻壳培养基的制备：参照文献(Zhang J,et al.Bioresour Technol,2011,102:4480–4488)，以稻壳为原料，干燥，粉碎过40目筛，并用2.5％的硫酸浸渍18h,190℃蒸汽处理3min后，稀释至料液比为10％(w/w)，调pH 4.8后于121℃灭菌20min后备用；

2)采用同源双交换，构建Trichoderma reesei QM 9414 β-葡萄糖苷酶基因缺失突变体△cel3a△cel1a△cel1b，在PDA液体种子培养基中接入该工程菌株，30℃，200rpm振荡培养24h，得工程菌种子液；在YEPD液体种子培养基中接入弯曲隐球酵母C.curvatusATCC 96219，30℃，200rpm振荡培养24h，得产油酵母种子液；

3)向步骤1)所得培养基中同时接入步骤(2)制备的两种种子液，接种总量为10％(v/v)，工程菌种子液和产油酵母种子液的接种比例0.2:1(v/v)，在30℃下通气培养168h；

4)终止发酵，此时发酵液中已检测不到可发酵性糖；固液分离收集沉淀，采用酸热法提取油脂，油脂量5.7g/L，油脂得率为5.7g/100gds。

实施例11

1)棉花秆培养基的制备：参照文献(Singh P,et al.Word J Microbiol Biot,2008,24,667–673)生物预处理的方法，称取50g过40目筛的棉花秆，采用白腐真菌固态发酵预处理；调整固液比至16％(w/w)，调整pH至4.0后于121℃灭菌20min后备用；

2)采用同源双交换，构建Trichoderma reesei QM 9414 β-葡萄糖苷酶基因缺失突变体△cel1b，在PDA液体种子培养基中接入该工程菌株，30℃，200rpm振荡培养24h，得工程菌种子液；在YEPD液体种子培养基中接入弯曲隐球酵母C.curvatus ATCC 20509，30℃，200rpm振荡培养24h，得产油酵母种子液；

3)向步骤1)所得培养基中同时接入步骤(2)制备的两种种子液，接种总量为10％(v/v)，工程菌种子液和产油酵母种子液的接种比例1:0.5(v/v)，在30℃下通气培养240h；

4)终止发酵，此时发酵液中已检测不到可发酵性糖；固液分离收集沉淀，采用酸热法提取油脂，油脂量9.7g/L，油脂得率为6.1g/100gds。

实施例12

参照文献(Li YH,et al.Enzyme Microb Technol,2007,41:312–317)的方法，从实施例10获得菌体中提取微生物油脂，得到0.50g。参照文献(里伟，等.过程工程学报，2007,7(1),137–140)的方法，取0.40g油脂在酶催化条件下转酯化制备和纯化生物柴油，得到0.38g，生物柴油收率95％，所得生物柴油的辛烷值为59，适合作为柴油的替代品。

通过比较对比例1和对比例2的实验结果发现，将里氏木霉和弯曲隐球酵母共发酵，油脂产量和油脂得率均比较高，这主要是因为里氏木霉所产酶系中β-葡萄糖苷酶活力较低，其水解木质纤维素得到大量纤维二糖，而弯曲隐球酵母具有很强的转运和代谢纤维二糖的能力。进一步通过比较对比例1、2和实施例1的实验结果发现，将里氏木霉的主要β-葡萄糖苷酶基因进行敲除，油脂产量和油脂得率进一步得到显著提高。实施例3-11表明，采用里氏木霉工程菌和弯曲隐球酵母共发酵生产微生物油脂方法，油脂产量和油脂得率都非常高，有助于碳氮流定向调控，以及生物质资源“一锅法”高产微生物油脂。因此，采用本发明方案培养产油微生物的油脂产量和原料利用效率均有提高，当大量生产时，可以明显降低成本。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于碳氮流定向调控的混菌发酵“一锅法”生产微生物油脂的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：

预处理生物质原料，调整固液质量比至5％-20％，不添加或者少量添加营养成分，调节pH至4.0-6.0，高温湿热灭菌，制备混菌发酵培养基；

将里氏木霉主要的β-葡萄糖苷酶基因敲除，获得里氏木霉工程菌；

挑取里氏木霉工程菌和产油酵母，分别接种于对应的液体种子培养基中，得到工程菌种子液和产油酵母种子液；

将两种种子液接种至所述混菌发酵养基中，于25℃-37℃通气培养，直至培养基中碳水化合物及其聚合物浓度之和低于5g/L，终止发酵，固液分离收集沉淀物；

沉淀物采用酸热-有机溶剂法提取油脂。

2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述预处理方法为物理、化学、物理化学或生物的生物质预处理方法。

3.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述混菌发酵培养基中不添加或者少量添加营养成分，包括磷源、硫源和维生素，其中磷源占混菌发酵培养基总质量的0.01％-2％、硫源占混菌发酵培养基总质量的0.01％-1％、维生素占混菌发酵培养基总质量的0.001％以内。

4.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述生物质原料为主要成份为纤维素、半纤维素、木质素和粗蛋白的生物质材料。

5.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述里氏木霉工程菌为已敲除主要的β-葡萄糖苷酶基因如bgl1/Cel3a、Cel1a或Cel1b的里氏木霉Trichoderma reesei工程菌株，所述产油酵母为具有高效的寡糖转运系统和胞内β-葡萄糖苷酶活性的产油酵母，如弯曲隐球酵母Cryptococcus curvatus。

6.如权利要求1所述方法，其特征在于，接种时，里氏木霉工程菌和产油酵母同时接入，或者先接入一种菌株然后再接种另一种菌株，接种时间间隔为12-48h。

7.如权利要求1所述方法，其特征在于，收集得到的沉淀物含产油微生物菌体，其含有的油脂是一种或多种长链脂肪酸及其衍生物的油脂。

8.如权利要求1-7任一项所述方法，其特征在于，将里氏木霉工程菌和产油酵母接种于对应的液体种子培养基中，接种温度为25℃-35℃，然后通气培养12-48h，得到工程菌种子液和产油酵母种子液。

9.如权利要求1-7任一项所述方法，其特征在于，将两种种子液接种至所述混菌发酵养基步骤中，接种总量体积比为2％-20％，并且工程菌种子液和产油酵母种子液的接种体积比为0.2:1-1:0.2。