CN105087688A - 一种微生物油脂的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备微生物油脂的方法。以含有葡萄糖和甘露糖的生物基材料为原料，有氧发酵获得发酵菌体，并从发酵菌体中提取微生物油脂。该方法能够同步转化葡萄糖和甘露糖，消除混合糖发酵中的葡萄糖效应，消除二次生长现象，底物转化速率快，显著缩短生产时间、降低能量消耗，大大节约了微生物油脂发酵的生产成本，为微生物油脂的规模化生产提供了新途径，具有较大应用前景。

Description

一种微生物油脂的生产方法

技术领域

本发明属于微生物油脂的生产，特别涉及一种利用产油微生物转化含有葡萄糖和甘露糖的酵母菌渣制备微生物油脂的方法。

背景技术

产油酵母、霉菌、细菌和一些藻类等产油微生物在一定条件下，将可发酵性糖转化为胞内油脂，称为微生物油脂。据报道，部分产油微生物在胞内积累的油脂可以达到自身干重的70％以上(LiYH,ZhaoZB,BaiFW.High-densitycultivationofoleaginousyeastRhodosporidiumtoruloidesY4infed-batchculture.EnzymeMicrobTechnol,2007,41(3):312-317)。利用微生物生产油脂，不受场地、季节及气候的影响，不占用农田耕地，生产时间短，容易实现油脂生产的规模化、连续化。微生物油脂制得的生物柴油与动、植物油制得的生物柴油组成相似，因此，开发微生物油脂可以为生物能源产业发展提供新原料，具有重要的应用前景。

随着工业生物技术的发展，会出现大量废弃酵母菌渣。酵母菌渣主要水解产物是葡萄糖、甘露糖、氨基酸和其他一些营养物质。另外还有一些含有葡萄糖、甘露糖的生物基材料，如魔芋。通过发酵技术充分利用这些资源，生产微生物油脂，将显著降低微生物油脂生产成本。

微生物在利用含有葡萄糖和其他单糖的混合物时，绝大多数微生物优先利用葡萄糖，待葡萄糖耗尽或浓度很低时才开始利用其他碳源，这种现象被称为碳代谢阻遏，亦称葡萄糖效应(NicholsNN,DienBS,BothastRJ.Useofcataboliterepressionmutantsforfermentationofsugarmixturestoethanol.ApplMicrobiolBiotechnol,2001,56(1-2):120-125)。葡萄糖效应会使得微生物生长和产物的生成过程出现延滞期，即二次生长现象，该现象会导致发酵周期延长和发酵效率降低。因此，寻找能够同步高效利用葡萄和甘露糖的微生物对于提高发酵效率具有重要意义。

解除葡萄糖相应的相关研究已有文献报道。在连续发酵过程中，将葡萄糖浓度维持在一个较低水平，并且在一个较合适的稀释速率下实现葡萄糖和木糖的步利用(KastnerJ,JonesW,RobertsR.SimultaneousutilizationofglucoseandD-xylosebyCandidashehataeinachemostat.JIndMicrobiolBiot,1998,20(6):339-343)第二，通过筛选葡萄糖磷酸转移酶突变株，也能解除葡萄糖抑制作用，这已在葡萄糖和木糖同步利用实现(DienB,NicholsN,BothastR.FermentationofsugarmixturesusingEscherichiacolicataboliterepressionmutantsengineeredforproductionofL-lacticacid.JIndMicrobiolBiot,2002,29(5):221-227)。最后，选育天然的能够同步利用葡萄糖和甘露糖的菌株是最为可靠和有效的途径。

发明内容

葡萄糖效应这一常见现象使得微生物在连续、批式-补料发酵时产生生长和产物积累出现二次增长现象。二次增长现象可导致油脂发酵过程周期延长、效率降低、生产成本提高。发明人认为利用天然的或者人工改造的微生物菌株，解除二次增长现象这一瓶颈，可显著促进底物的代谢效率，改善微生物油脂的技术经济性。因此，发明人利用大量产油微生物进行了科学实验，发现部分产油微生物菌株具有同步利用葡萄糖和甘露糖的生理特性。

本发明在于提供一种同步利用葡萄糖和甘露糖产油微生物，生产一种或多种脂肪酸及其衍生物的微生物油脂。本发明工艺简便、方法易行、可高效利用和转化成分复杂的碳源，如产油酵母菌渣的水解产物，改善微生物油脂生产的技术经济性。

本发明通过以下技术方案予以实现：

1、制备产油培养基。通过下述方法的一种或它们的必要组合方法实现：

A.将葡萄糖和甘露糖混合，制成总糖质量浓度为2％-10％的水溶液，葡萄糖和甘露糖的相对比例为95:5至5:95。添加其他必要的营养成分，pH3.0-8.0，灭菌后备用；

B.参照文献方法，将酵母菌渣水解，产物制成含有葡萄糖和甘露糖的水溶液，添加其他必要的营养成分，pH3.0-8.0，灭菌后备用；或，

C.参照文献方法水解含碳水化合物的生物基原料，产物中添加葡萄糖或甘露糖以及其他必要的营养成分，pH3.0-8.0，灭菌后备用；或，

D.参照文献方法水解含碳水化合物的生物基原料，产物中不添加任何其他营养成分，pH3.0-8.0，灭菌后备用。

其他必要的营养成分为：常规的用于产油微生物培养的物质，如酵母粉以及所需无机盐，包括但不限于硫酸铜、硫酸锰、硫酸钠、硫酸锌、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸亚铁、氯化镁、氯化铵、氯化钙中的一种或几种组合。

2、产油微生物培养。向步骤1所述培养基中接种产油微生物种子液，接种量5％-20％(v/v)，在25℃-37℃下有氧发酵，至醪液中残糖浓度低于0.5％。

3、菌体收集和微生物油脂提取。培养结束后，采用离心、过滤或其他必要的方法浓缩收集产油微生物细胞。参照文献(李植峰，张玲、沈晓京等.四种真菌油脂提取方法的比较研究。微生物学通报,2001,28(6):72-75)使用酸热-有机溶剂法提取获得油脂，计算菌体油脂含量。

本发明使用的产油微生物菌体油脂含量可超过细胞干重20％(w/w)，并且具有同步消耗葡萄糖和甘露糖的生理特性的微生物，它们包括但不限于油脂酵母Lipomyces属的菌种，如斯达式油脂酵母Lipomycesstarkeyi。这些菌株可以直接从包括中国普通微生物菌种管理中心(CGMCC)及美国典型培养物保藏中心(ATCC)等菌种保藏机构购买或从自然界中分离，也可以使用与原来菌株性状不同的人工或自然突变菌株。

本发明采用将葡萄糖和甘露糖混合的方法、水解含有葡萄糖单元或甘露糖单元生物原料的方法、或者组合必要的方法，制备含有葡萄糖和甘露糖的碳源。生物基料水解参照文献方法(CaraC，RuizE，OlivaJM，SaezF,CastroE.Conversionofolivetreebiomassintofermentablesugarsbydiluteacidpretreatmentandenzymaticsaccharification.BioresourTechnol,2008,99(6):1869-1876)进行。生物基材料主要含有葡聚糖和甘露聚糖的物质，包括但不限于酿酒酵母、产油酵母菌渣和魔芋。

本发明的有益效果是：

1)为工业生产中的酵母菌渣的利用提供了新途径，本发明技术简单有效，周期短，可解决发酵工业中下游废物的利用问题；

2)微生物同步利用葡萄糖和甘露糖，克服了葡萄糖效应，避免了过程中的二次生长现象；

3)微生物利用葡萄糖和甘露糖积累微生物油脂，开拓了含有葡萄糖/甘露糖为主的生物基材料作底物，为降低微生物油脂生产成本提供了新的途径。

与常规优先利用葡萄糖发酵的过程相比，本发明涉及葡萄糖和甘露糖的同步利用，能够消除发酵过程中的二次生长现象，缩短发酵周期，提高底物转化效率，降低生产成本；与生物转化其他原料制备微生物油脂的方法相比本发明使用的原料是含有葡萄糖和甘露糖的工业生产酵母菌渣，如产油酵母菌渣、酿酒酵母菌渣，具有丰富的潜在资源，发酵获取油脂方法简单易行、成本低而且可控，是一种利用可再生资源生产微生物油脂的新途径。

附图说明

图1为实施例1中底物消耗和生物量生成曲线；

图2为对比实施例1中底物消耗曲线。其中，■葡萄糖；●甘露糖；△生物量。

具体实施方式

下面是具体对比实施例和实施例，它们有助于了解本专利以及不同工艺对微生物油脂生成的影响，但不局限于本发明的内容。

对比实施例1

1)将葡萄糖和甘露糖配制成混合溶液，葡萄糖35g/L，甘露糖35g/L,添加2.0g/L酵母粉，0.1g/L氯化铵，1.0g/L氯化镁，0.1g/L硫酸钠，11.8g/L磷酸二氢钾，3.7g/L磷酸氢二钾，1％(v/v)的微量元素溶液(微量元素母液(mg/L)：二水氯化钙40，七水硫酸亚铁5.5，七水硫酸锌1.0，一水硫酸锰0.76和硫酸1.76，余量为水，pH7.0，所得培养基灭菌121℃灭菌后备用；

2)产油酵母RhodosporidiumtoruloidesAS2.1389(来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)在液体种子培养基中，于35℃，200转/分钟振荡培养18小时；

3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量15％(v/v)，在35℃下通气培养120小时；

4)终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和甘露糖的浓度分别为0.0g/L和20.9g/L；固液分离收集菌体，干燥，得干菌体14.3g/L，油脂含量51.8％。

对比实施例2

1)将葡萄糖和甘露糖配制成混合溶液，葡萄糖53g/L，甘露糖47g/L,添加1.0g/L酵母粉，0.75g/L氯化铵，1.0g/L氯化镁，0.1g/L硫酸钠，微量元素溶液1％(v/v)，余量为水，pH3.0，所得培养基灭菌121℃灭菌后备用；

2)产油酵母TrichosporoncutaneumAS2.571(菌株来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)在液体种子培养基中，于30℃，200转/分钟振荡培养24小时；

3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量20％(v/v)，在30℃下通气培养132小时；

4)终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和甘露糖的浓度分别为0.0g/L和31g/L；固液分离收集菌体，干燥，得干菌体26.5g/L，油脂含量51.3％。

对比实施例3

1)将葡萄糖和甘露糖配制成混合溶液，葡萄糖59.5g/L，甘露糖10.5g/L,添加0.8g/L酵母粉，0.1g/L氯化铵，1.0g/L氯化镁，0.1g/L硫酸钠，0.8g/L磷酸二氢钾，1.7g/L磷酸氢二钾，微量元素溶液1％(v/v)，余量为水，pH8.0，所得培养基灭菌121℃灭菌后备用；

2)产油酵母CryptococcuscurvatusATCC20509(来源于美国典型微生物菌种保藏中心)在液体种子培养基中，于28℃，200转/分钟培养20小时；

3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量5％(v/v)，在37℃下通气培养128小时；

4)终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和甘露糖的浓度分别为0.0g/L和9.9g/L；固液分离收集菌体，干燥，得干菌体17.3g/L，油脂含量57.4％。

对比实施例4

按照文献(LiYH,ZhaoZB,BaiFW.EnzymeMicrobialTechnology,2007,41,312)所述的方法培养产油酵母RhodosporidiumtoruloidesAS2.1389提取油脂后，获得菌渣，干燥，粉碎过60目筛，与1.5％(w/w)稀硫酸混合，料液比为1/10(w/w)，100℃消化90分钟；通过补充葡萄糖调整总还原糖浓度为90g/L，其中葡萄糖60g/L，甘露糖24g/L，其他6g/L。在此糖液中加入1.2g/L酵母粉，0.3g/L氯化铵，0.9g/L氯化镁，0.1g/L硫酸钠，0.6g/L磷酸二氢钾，0.3g/L磷酸氢二钾，微量元素溶液1％(v/v)，调pH4。121℃灭菌15分钟后，以20％(v/v)接种量接入产油酵母RhodosporidiumtoruloidesAS2.1389(菌株来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)，于30℃有氧培养130小时。终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和甘露糖浓度为0.3g/L和19.5g/L，其他5g/L。按照实例1的方法进行后处理，得干菌体21.6g/L，油脂含量59.5％。

对比实施例5

以酿酒酵母菌渣为原料，经干燥，粉碎，料液比为1/10(w/w)，加入蜗牛酶20FPU/g和葡甘聚糖酶10FPU/g，37度消化48小时。过滤，通过补充葡萄糖调整总还原糖浓度为70g/L，其中葡萄糖53g/L，甘露糖15g/L，其他还原糖2g/L，调整pH为6，121℃灭菌15分钟后，以15％(v/v)接种量接入产油酵母TrichosporoncutaneumAS2.571(菌株来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液，于37℃有氧培养95小时。终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和甘露糖浓度为0.2g/L和15.0g/L，其他还原糖2g/L。按照实例1的方法后处理，得干菌体15.6g/L，油脂含量33.7％。

实施例1

1)将葡萄糖和甘露糖配制成混合溶液，葡萄糖35g/L，甘露糖35g/L,添加2.0g/L酵母粉，0.1g/L氯化铵，1.0g/L氯化镁，0.1g/L硫酸钠，11.8g/L磷酸二氢钾，3.7g/L磷酸氢二钾，1％(v/v)的微量元素溶液(微量元素母液(mg/L)：二水氯化钙40，七水硫酸亚铁5.5，柠檬酸5.2，七水硫酸锌1.0，一水硫酸锰0.76和硫酸1.76，余量为水，pH7.0，所得培养基灭菌121℃灭菌后备用；

2)产油酵母LypomycesstarkeyiAS2.1560(来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)在液体种子培养基中，于35℃，200转/分钟培养18小时；

3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量15％(v/v)，在35℃下通气培养120小时；

4)终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和甘露糖的浓度分别为0.0g/L和0.9g/L；固液分离收集菌体，干燥，得干菌体23.3g/L，油脂含量62.8％。

比较实施例1和对比例1的实验结果，表明在相同的实验条件下，实施例的生物量和油脂含量分别比对比实施例高出62.9％和22.3％。底物消耗速率分别为0.58g/L/h和0.41g/L/h。对比实施例中存在明显的葡萄糖效应，导致发酵结束时剩余的甘露糖为20.9g/L，占原甘露糖浓度的67％，最终影响了生物量积累和油脂的合成，预计延长发酵周期50小时。

实施例2

1)将葡萄糖和甘露糖配制成混合溶液，葡萄糖53g/L，甘露糖47g/L,添加1.0g/L酵母粉，0.75g/L氯化铵，1.0g/L氯化镁，0.1g/L硫酸钠，微量元素溶液1％(v/v)，余量为水，pH3.0，所得培养基灭菌121℃灭菌后备用；

2)产油酵母LipomycesstarkeyiAS2.1390(来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)在液体种子培养基中，于30℃，200转/分钟培养24小时；

3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量20％(v/v)，在30℃下通气培养132小时；

4)终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和甘露糖的浓度分别为0.0g/L和39g/L；固液分离收集菌体，干燥，得干菌体38.3g/L，油脂含量61.3％。

比较实施例2和对比例2的实验结果，表明在相同的实验条件下，实施例的生物量和油脂含量分别比对比实施例高71.5％和19.9％。底物消耗速率分别为0.76g/L/h和0.52g/L/h。对比实施例中存在明显的葡萄糖效应，导致发酵结束时剩余的甘露糖为31g/L，占原浓度的66％，严重影响了生物量积累和油脂的合成，发酵周期预计延长60小时。

实施例3

1)将葡萄糖和甘露糖配制成混合溶液，葡萄糖59.5g/L，甘露糖10.5g/L,添加0.8g/L酵母粉，0.1g/L氯化铵，1.0g/L氯化镁，0.1g/L硫酸钠，0.8g/L磷酸二氢钾，1.7g/L磷酸氢二钾，微量元素溶液1％(v/v)，余量为水，pH8.0，所得培养基灭菌121℃灭菌后备用；

2)产油酵母LipomycesstarkeyiAS2.1608(来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)在液体种子培养基中，于28℃，200转/分钟振荡培养20小时；

3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量5％(v/v)，在37℃下通气培养128小时；

4)终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和甘露糖的浓度分别为0.0g/L和0.7g/L；固液分离收集菌体，干燥，得干菌体21.3g/L，油脂含量64.5％。

比较实施例2和对比例2的实验结果，表明在相同的实验条件下，实施例的生物量和油脂含量分别比对比实施例高23.1％和12.4％。底物消耗速率分别为0.55g/L/h和0.47g/L/h。对比实施例中存在明显的葡萄糖效应，导致发酵结束时剩余的甘露糖为9.9g/L，占原浓度的94％，影响了生物量积累和油脂的合成，发酵周期预计延长21小时。

实施例4

按照文献(LiYH,ZhaoZB,BaiFW.EnzymeMicrobialTechnology,2007,41,312)所述方法培养产油酵母RhodosporidiumtoruloidesAS2.1389提取油脂后，获得菌渣，干燥，粉碎过60目筛，与1.5％(w/w)稀硫酸混合，料液比为1/10(w/w)，100℃消化90分钟；通过补充葡萄糖调整总还原糖浓度为90g/L，其中葡萄糖60g/L，甘露糖24g/L，其他6g/L。在此糖液中加入1.2g/L酵母粉，0.3g/L氯化铵，0.9g/L氯化镁，0.1g/L硫酸钠，0.6g/L磷酸二氢钾，0.3g/L磷酸氢二钾，微量元素溶液1％(v/v)，调pH4。121℃灭菌15分钟后，以20％(v/v)接种量接入LipomycesstarkeyiCICC1715(菌株源于中国工业微生物菌种保藏管理中心)种子液，于30℃有氧培养130小时。终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和甘露糖浓度为0.3g/L，0.8g/L，其他0.5g/L。按照实例1的方法后处理，得干菌体31.4g/L，油脂含量69.5％。

比较实施例4和对比例4的实验结果，表明在相同的实验条件下，实施例的生物量和油脂含量分别比对比实施例高45.4％和16.8％。底物消耗速率分别为0.69g/L/h和0.54g/L/h。对比实施例中存在明显的葡萄糖效应，导致发酵结束时剩余的甘露糖为19.5g/L，占原浓度的78％，严重影响了生物量积累和油脂的合成，发酵周期预计延长46小时。

实施例5

酿酒酵母菌渣，经干燥，粉碎，料液比为1/10(w/w)，加入蜗牛酶20FPU/g和葡甘聚糖酶10FPU/g，37度消化48小时。过滤，通过补充葡萄糖调整总还原糖浓度为70g/L，其中葡萄糖33g/L，甘露糖15g/L，其他还原糖2g/L，调整pH为6，121℃灭菌15分钟后，以15％(v/v)接种量接入LypomycesstarkeyiQW-M36(L.starkeyiAS2.1560经紫外诱变获得，保存于本实验室)种子液，于37℃有氧培养95小时。终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和甘露糖浓度为0.3g/L和0.8g/L。按照实例1的方法后处理，得干菌体27.6g/L，油脂含量50.7％。

比较实施例5和对比例5的实验结果，表明在相同的实验条件下，实施例的生物量和油脂含量分别比对比实施例高76.9％和50.8％。底物消耗速率分别为0.74g/L/h和0.56g/L/h。对比实施例中存在明显的葡萄糖效应，导致发酵结束时剩余的甘露糖为15.0g/L，占原浓度的100％，发酵周期预计延长27小时。

综合实施例和对比例实验结果，在相同的实验条件下，葡萄糖甘露糖的同步利用能够有效促进油脂发酵效率的提高，且葡萄糖与甘露糖的协同利用与二者比例无关，而葡萄糖效应的存在明显延长油脂发酵周期。因此，葡萄糖、甘露糖同步发酵产微生物产油脂具有显著优势。

实施例6

1)将葡萄糖和甘露糖配制成混合溶液，葡萄糖5g/L，甘露糖95g/L,添加5.0g/L酵母粉，0.75g/L氯化铵，1.0g/L氯化镁，微量元素溶液1％(v/v)，余量为水，pH3.0，所得培养基灭菌121℃灭菌后备用；

2)产油酵母LipomycesstarkeyiAS2.1390(来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)在液体种子培养基中，于30℃，200转/分钟培养24小时；

3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量15％(v/v)，在30℃下通气培养132小时；

4)终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和甘露糖的浓度分别为0.2g/L和1.3g/L；固液分离收集菌体，干燥，得干菌体37.3g/L，油脂含量64.1％。

实施例7

1)将葡萄糖和甘露糖配制成混合溶液，葡萄糖19g/L，甘露糖1g/L,添加0.5g/L酵母粉，0.15g/L氯化铵，0.1g/L氯化镁，0.05g/L硫酸钠，微量元素溶液0.1％(v/v)，余量为水，pH7.0，所得培养基灭菌121℃灭菌后备用；

2)产油酵母LipomycesstarkeyiAS2.1560(来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)在液体种子培养基中，于30℃，200转/分钟培养24小时；

3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量20％(v/v)，在30℃下通气培养34小时；

4)终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和甘露糖的浓度分别为0.4g/L和0g/L；固液分离收集菌体，干燥，得干菌体7.3g/L，油脂含量31.3％。

实施例8

按照文献(LiYH,ZhaoZB,BaiFW.EnzymeMicrobialTechnology,2007,41,312)所述方法培养产油酵母CryptococcuscurvatusAS20509，提取油脂获得菌渣，干燥，粉碎后，参照文献方法(KootstraA,BeeffinkH,ScottE,SandersJ.Comparisonofdilutemineralandorganicacidpretreatmentforenzymatichydrolysisofwheatstraw.BiochemEngJ,2009,46(2):126-131)与50mM马来酸混合，料液比为1/10(w/w)，浸泡24小时，121℃消化90分钟；调整pH至4.0，加入50FPU蜗牛酶，37℃消化24小时，离心过滤后，添加葡萄糖调整总还原糖浓度为50g/L，其中葡萄糖30g/L，甘露糖15g/L，其他还原糖5g/L，调pH7.5。121℃灭菌15分钟后，以5％(v/v)接种量接入LipomycesstarkeyiAS2.1390(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液，于33℃有氧培养72小时。终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和甘露糖浓度为0g/L和0.8g/L。按照实例1的方法后处理，得干菌体20.6g/L，油脂含量30.5％。

实施例9

按照文献(LiYH,ZhaoZB,BaiFW.EnzymeMicrobialTechnology,2007,41,312)所述方法培养产油酵母TrichosporoncutaneumAS2.571，获取菌渣，干燥，粉碎过30目筛，与1.0％(w/w)稀硫酸混合，料液比为1/10(w/w)，120℃消化30分钟；加氢氧化钙中和过多的硫酸；离心过滤后，调整总还原糖浓度为40g/L，其中葡萄糖15g/L，甘露糖22g/L，其他还原糖3g/L调pH3.5。121℃灭菌15分钟后，以5％(v/v)接种量接入LipomycesstarkeyiAS2.1608(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液，于37℃有氧培养60小时。终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和甘露糖浓度为0.5g/L和0.8g/L。按照实例1的方法后处理，得干菌体15.6g/L，油脂含量62.5％。

实施例10

按照文献(LiYH,ZhaoZB,BaiFW.EnzymeMicrobialTechnology,2007,41,312)所述方法培养产油酵母LypomycesstarkeyiAS2.1560,获得菌渣，干燥，粉碎过18目筛，与2.0％(w/w)稀硫酸混合，料液比为1/5(w/w)，120℃水解15分钟；加碳酸钙中和过多的硫酸；离心过滤后，调整总还原糖浓度为76g/L，其中葡萄糖35g/L，甘露糖35g/L，其他6g/L，调pH7.5。121℃灭菌15分钟后，以10％(v/v)接种量接入LipomycesstarkeyiCICC1715(菌株源于中国工业微生物菌种保藏管理中心)种子液，于33℃有氧培养116小时。终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和甘露糖浓度为0.2g/L和0.4g/L。按照实例1的方法后处理，得干菌体29.8g/L，油脂含量60.4％。

实施例11

培养酵母SporobolomycesroseusJCM8242后，获得菌渣，干燥，与1.2％(w/w)稀硫酸混合，料液比为1/10(w/w)，120℃水解1小时；加氢氧化钙中和过多的硫酸；离心过滤后，调整总还原糖浓度为45g/L，其中葡萄糖15g/L，甘露糖25g/L，其他4g/L，调pH5.5。121℃灭菌15分钟后，以15％(v/v)接种量接入LypomycesstarkeyiQW-M36(L.starkeyiAS2.1560紫外诱变获得，保存于本实验室)种子液，于28℃有氧培养58小时。终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和甘露糖浓度为0.2g/L和0.1g/L。按照实例1的方法进行后处理，得干菌体15.4g/L，油脂含量47.3％。

实施例12

按照文献(LiYH,ZhaoZB,BaiFW.EnzymeMicrobialTechnology,2007,41,312)所述方法培养产油酵母RhodotorulalactosaAS2.1514获取菌渣，干燥，粉碎过40目筛，与8％(w/w)稀硫酸混合，料液比为1/20(w/w)，120℃水解30分钟；加氢氧化钙中和过多的硫酸；离心过滤后，调整总还原糖浓度为25g/L，其中葡萄糖10g/L，甘露糖15g/L，调pH7.5。121℃灭菌15分钟后，以10％(v/v)接种量接入LipomyceskononenkoaeCICC1714(菌株源于中国工业微生物菌种保藏管理中心)种子液，于30℃有氧培养38小时。终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和甘露糖浓度为0.1g/L和0.0g/L。按照实例1的方法进行后处理，得干菌体8.7g/L，油脂含量45.5％。

实施例13

按照文献(LiYH,ZhaoZB,BaiFW.EnzymeMicrobialTechnology,2007,41,312)所述方法培养产油酵母RhodotorulamucilaginosaAS2.1515，获得非油菌渣，经干燥，粉碎与5％(w/w)稀硫酸混合，料液比为1/10(w/w)，120℃水解20分钟；加碳酸钙中和过多的硫酸；离心过滤后，调整总还原糖浓度为44g/L，其中葡萄糖25g/L，甘露糖15g/L，其他4g/L，调pH4.5。121℃灭菌15分钟后，以15％(v/v)接种量接入LipomycesstarkeyiAS2.1608(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液，于30℃有氧培养60小时。终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和甘露糖浓度为0.5g/L和0.2g/L。按照实例1的方法后处理，得干菌体14.6g/L，油脂含量40.5％。

实施例14

按照文献(LiYH,ZhaoZB,BaiFW.EnzymeMicrobialTechnology,2007,41,312)所述方法培养产油酵母RhodotorulaminutaAS2.1520，提取油脂后，经干燥，粉碎过20目筛，与4.0％(w/w)稀硫酸混合，料液比为1/5(w/w)，120℃水解2小时；加碳酸钙中和；离心过滤后，添加甘露糖，调整总还原糖浓度为80g/L，其中葡萄糖31g/L，甘露糖46g/L，其他3g/L，调pH6.5。121℃灭菌15分钟后，以5％(v/v)接种量接入LipomycesstarkeyiCICC1715(菌株源于中国工业微生物菌种保藏管理中心)种子液，于35℃有氧培养122小时。终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和甘露糖浓度为0.3g/L和0.8g/L。按照实例1的方法后处理，最终得干菌体25.6g/L，油脂含量59.7％。

实施例15

按照文献(LiYH,ZhaoZB,BaiFW.EnzymeMicrobialTechnology,2007,41,312)所述方法培养产油酵母RhodotorulaglutinisAS2.499，提取油脂后，以其菌渣为原料，干燥，粉碎过60目筛，与2.5％(w/w)稀硫酸混合，料液比为1/15(w/w)，120℃水解75分钟；加氢氧化钙中和过多的硫酸；离心过滤后，添加甘露糖，调整总还原糖浓度为40g/L，其中葡萄糖35g/L，甘露糖30g/L，其他5g/L，调pH6.5。121℃灭菌15分钟后，以10％(v/v)接种量接入LypomycesstarkeyiQW-M36(L.starkeyiAS2.1560紫外诱变获得，保存于本实验室)种子液，于20℃有氧培养50小时。终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和甘露糖浓度为0.1g/L和0.3g/L。按照实例1的方法后处理，得干菌体14.2g/L，油脂含量57.8％。

实施例16

以酵母EndomycopsisburtoniiCICC1365菌渣为原料，干燥，粉碎过60目筛，与8％(w/w)稀硫酸混合，料液比为1/8(w/w)，120℃水解1小时；加氢氧化钙中和过多的硫酸；离心过滤后，添加甘露糖，调整总还原糖浓度为70g/L，其中葡萄糖35g/L，甘露糖30g/L，其他5g/L，调pH3.5。121℃灭菌15分钟后，以12％(v/v)接种量接入LipomycesstarkeyiCICC1715(菌株源于中国工业微生物菌种保藏管理中心)种子液，于20℃有氧培养125小时。终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和甘露糖浓度为0.1g/L和0.3g/L。按照实例1的方法后处理，得干菌体23.3g/L，油脂含量66.5％。

实施例17

培养酵母SchizosaccharomycespombeATCC24843，以其菌渣为原料，干燥，与5％(w/w)稀硫酸混合，料液比为1/8(w/w)，120℃水解75分钟；加氢氧化钙中和过多的硫酸；离心过滤后，添加甘露糖，调整总还原糖浓度为90g/L，其中葡萄糖45g/L，甘露糖40g/L，其他5g/L，调pH4.0。121℃灭菌15分钟后，以20％(v/v)接种量接入LipomycesstarkeyiAS2.1608(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液，于20℃有氧培养132小时。终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和甘露糖浓度为0.1g/L和0.3g/L。按照实例1的方法后处理，最终得干菌体33.7g/L，油脂含量66.5％。

实施例18

参照文献(KatoK,WatanabeT,MatsudaK.AgriculturalBiologicalChemistry,1970,34,532)所述方法将白毛魔芋白毛魔芋粉(AmorphophallusniimuraiYamamoto)用30FPU甘露糖酶和15FPUMan5C酶水解1小时，pH5.0，30℃，离心，调整总还原糖浓度为100g/L，其中葡萄糖60g/L，甘露糖36g/L，其他4g/L，调pH7.0。121℃灭菌15分钟后，以15％(v/v)接种量接入LypomycesstarkeyiQW-M36(L.starkeyiAS2.1560紫外诱变获得，保存于本实验室)种子液，于20℃有氧培养140小时。终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和甘露糖浓度为0.1g/L和0.3g/L。按照实例1的方法进行后处理，得干菌体38.1g/L，油脂含量60.5％。

实施例19

参照文献(KatoK,MatsudaK.BiologicalChemistry,1969,33:1446)所述方法将大魔芋葡粉(AmorphophallusgigantiflorusHayata)用10％(w/v)稀硫酸酸水解100℃水解0.5小时，固液比1/10，加入氢氧化钙中和，离心过滤后，调整总还原糖浓度为75g/L，其中葡萄糖42g/L，甘露糖25g/L，其他3g/L，调pH8.0。121℃灭菌15分钟后，以20％(v/v)接种量接入LipomyceskononenkoaeCICC1714(菌株源于中国工业微生物菌种保藏管理中心)种子液，于20℃有氧培养126小时。终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和甘露糖浓度为0.1g/L和0.3g/L。按照实例1的方法后处理，得干菌体28.3g/L，油脂含量56.5％。

实施例20

参照文献(KatoK,MatsudaK.BiologicalChemistry,1969,33:1446)所述方法将干燥的梗序磨芋(AmorphophallusstipitatusEngl.)，经粉碎过20目筛，用8％(w/v)硫酸在80℃水解2小时，固液比1/15，加氢氧化钙中和，离心过滤后，调整总还原糖浓度为50g/L，其中葡萄糖33g/L，甘露糖13g/L，其他4g/L，调pH4.0。121℃灭菌15分钟后，以10％(v/v)接种量接入LipomycesstarkeyiAS2.1390(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液，于20℃有氧培养70小时。终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和甘露糖浓度为0.1g/L和0.3g/L。按照实例1的方法后处理，得干菌体18.1g/L，油脂含量56.3％。

实施例21

参照文献(KatoK,MatsudaK.BiologicalChemistry,1969,33:1446)所述方法将固液比为1/20的滇魔芋粉(AmorphophallusyunnanensisEngl.)用3％(w/v)硫酸，100℃，水解3小时，用氢氧化钙中和后离心过滤，调整总还原糖浓度为20g/L，其中葡萄糖11g/L，甘露糖7g/L，其他2g/L，调pH5.0。121℃灭菌15分钟后，以20％(v/v)接种量接入LypomycesstarkeyiQW-M36(L.starkeyiAS2.1560紫外诱变获得，保存于本实验室)种子液，于20℃有氧培养30小时。终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和甘露糖浓度为0.1g/L和0.3g/L。按照实例1的方法后处理，得干菌体7.1g/L，油脂含量38.5％。

实施例22

参照文献(KatoK,MatsudaK.BiologicalChemistry,1969,33:1446)所述方法将东川魔芋粉(AmorphophallusmaireiLevl.)用5％(w/v)硫酸水解，固液比1/10，100℃保温4小时，加氢氧化钙中和，离心过滤后，调整总还原糖浓度为60g/L，其中葡萄糖35g/L，甘露糖20g/L，其他5g/L，调pH3.0。121℃灭菌15分钟后，以5％(v/v)接种量接入LipomyceskononenkoaeCICC1714(源于中国工业微生物菌种保藏管理中心)种子液，于37℃有氧培养100小时。终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和甘露糖浓度为0.1g/L和0.3g/L。按照实例1的方法后处理，得干菌体20.1g/L，油脂含量66.5％。

实施例23

参照文献(KatoK,MatsudaK.BiologicalChemistry,1969,33:1446)所述方法将灰斑魔芋粉(Amorphophallusmicro-appendiculatusEngl)用1.2％(w/v)硫酸，固液比1/5，121℃水解2小时，离心过滤后，调整总还原糖浓度为80g/L，其中葡萄糖47g/L，甘露糖30g/L，其他3g/L，调pH4.0。121℃灭菌15分钟后，以10％(v/v)接种量接入LipomyceskononenkoaeCICC1714(菌株源于中国工业微生物菌种保藏管理中心)种子液，于35℃有氧培养120小时。终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和甘露糖浓度为0.1g/L和0.3g/L。按照实例1的方法后处理，得干菌体26.7g/L，油脂含量60.4％。

实施例24

参照文献(KatoK,MatsudaK.BiologicalChemistry,1969,33:1446)所述方法将湄公魔芋粉(Amorphophallusmekongensis)用12％(w/v)硫酸，固液比1/10，75℃水解1小时，氢氧化钙中和，离心过滤后，调整总还原糖浓度为100g/L，其中葡萄糖55g/L，甘露糖38g/L，其他7g/L，调pH6.0。121℃灭菌15分钟后，以15％(v/v)接种量接入LipomyceskononenkoaeCICC1714(菌株源于中国工业微生物菌种保藏管理中心)种子液，于33℃有氧培养144小时。终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和甘露糖浓度为0.1g/L和0.3g/L。按照实例1的方法后处理，得干菌体35.8g/L，油脂含量66.5％。

实施例25

参照文献(KatoK,MatsudaK.BiologicalChemistry,1969,33:1446)所述方法将紫芋粉(ColocasiatonoimoNakai)用10％(w/v)硫酸80℃，酸水解1.5小时，固液比1/10，加氢氧化钙中和，离心过滤后，调整总还原糖浓度为80g/L，其中葡萄糖73g/L，甘露糖4g/L，其他3g/L，调pH7.0。121℃灭菌15分钟后，以5％(v/v)接种量接入LipomyceskononenkoaeCICC1714(源于中国工业微生物菌种保藏管理中心)种子液，于30℃有氧培养115小时。终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和甘露糖浓度为0.1g/L和0.3g/L。按照实例1的方法后处理，得干菌体26.4g/L，油脂含量66.5％。

实施例26

参照文献(KatoK,MatsudaK.BiologicalChemistry,1969,33:1446)所述方法将红芋粉(ColocasiakonishiiHayata)用1％(w/v)硫酸121℃水解1小时，固液比1/8，加碳酸钙中和后，离心过滤，调整总还原糖浓度为70g/L，其中葡萄糖62g/L，甘露糖3g/L，其他5g/L，调pH8.0。121℃灭菌15分钟后，以20％(v/v)接种量接入LipomyceskononenkoaeCICC1714(源于中国工业微生物菌种保藏管理中心)种子液，于28℃有氧培养98小时。终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和甘露糖浓度为0.1g/L和0.3g/L。按照实例1的方法进行后处理，得干菌体25.7g/L，油脂含量45.8％。

实施例27

参照文献(KatoK,MatsudaK.BiologicalChemistry,1969,33:1446)所述方法将红头芋粉(ColocasiakotoensisHayata)用2％(w/v)硫酸121℃水解0.5小时，固液比1/15，用氢氧化钙中和，离心过滤后，调整总还原糖浓度为50g/L，其中葡萄糖46g/L，甘露糖5g/L，其他4g/L，调pH6.0。121℃灭菌15分钟后，以15％(v/v)接种量接入LipomyceskononenkoaeCICC1714(菌株源于中国工业微生物菌种保藏管理中心)种子液，于20℃有氧培养60小时。终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖和甘露糖浓度为0.1g/L和0.3g/L。按照实例1的方法后处理，得干菌体18.1g/L，油脂含量56.7％。

Claims (8)

1.一种微生物油脂的生产方法，其特征在于：采用葡萄糖和甘露糖混合物为碳源，培养产油微生物，生产并获得含有一种或二种以上脂肪酸及其衍生物的油脂；葡萄糖和甘露糖混合物的碳源中，葡萄糖和甘露糖的相对质量比例为5:95至95:5。

2.按照权利要求1所述微生物油脂的生产方法，其特征在于：所述产油微生物为具有同步利用葡萄糖和甘露糖能力的产油酵母。

3.按照权利要求1或2所述微生物油脂的生产方法，其特征在于：

所述产油酵母为油脂酵母Lipomyces属菌株。

4.按照权利要求1所述微生物油脂的生产方法，其特征在于：培养产油微生物的培养基为液体培养基，培养基的水溶液中除所述碳源外的其它组份为常规微生物培养基所需无机盐，包括但不限于硫酸铜、硫酸锰、硫酸钠、硫酸锌、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸亚铁、氯化镁、氯化铵、氯化钙中的一种或二种以上组合；

碳源在培养基中的含量为20g/L至100g/L。

5.按照权利要求1所述微生物油脂的生产方法，其特征在于：所述产油微生物培养在有氧条件下进行，培养温度20℃-37℃，pH3.0-8.0。

6.按照权利要求1所述微生物油脂的生产方法，其特征在于：所述葡萄糖和甘露糖混合物是通过葡萄糖和甘露糖混合制得，或将酵母菌菌渣水解制得，或其他含有葡萄糖和/或甘露糖的生物基材料水解制得。

7.按照权利要求6所述微生物油脂的生产方法，其特征在于：所述酵母菌渣来自但不限于酿酒酵母Scharamyces、毕赤酵母Pichia、裂殖酵母Schizosaccharomyces、油脂酵母Lipomyces、丝孢酵母Trichosporon、隐球酵母Cryptococcus、红酵母Rhodotorula、红冬胞酵母Rhodosporidium、掷孢酵母属Sporobolomyces中的一种或二种以上酵母在生产过程中产生的菌渣。

8.按照权利要求6所述微生物油脂的生产方法，其特征在于：所述生物基材料来自但不限于魔芋属Amorphophallus和芋属Colocasia作物中的一种或二种以上。