CN105349588A

CN105349588A - 利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法

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Publication number: CN105349588A
Application number: CN201510872194.9A
Authority: CN
Inventors: 张明亮; 祁峰; 黄建忠; 徐威; 江贤章; 孙磊
Original assignee: Fujian Normal University
Current assignee: Fujian Normal University
Priority date: 2015-12-02
Filing date: 2015-12-02
Publication date: 2016-02-24
Anticipated expiration: 2035-12-02
Also published as: CN105349588B

Abstract

本发明公开了一种利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法，包括：(1)将能够直接在未脱毒的甘蔗渣水解液中生长的裂殖壶菌菌株培养，得到种子液；(2)将所述种子液接种至利用所述未脱毒的甘蔗渣水解液制成的发酵培养液中，发酵培养，得到二十二碳六烯酸。本发明的生产裂殖壶菌的方法成本低，易控制，裂殖壶菌产量高且DHA含量高。

Description

利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法

技术领域

本发明涉及一种生产二十二碳六烯酸的方法，特别是利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法。

背景技术

二十二碳六烯酸(DHA，C22:6n-3)是一种对人体健康非常有益的ω-3族脂肪酸。人类的大脑皮层、视网膜、睾丸以及精子中DHA含量特别丰富，DHA是大脑结构脂肪酸不可或缺的成分之一。DHA对治疗动脉粥样硬化、高甘油三酯血症、高血压和癌症有非常良好的效果，对婴幼儿智力及视力的发育起着重要的作用，DHA还具有预防冠心病，降低心脏病患者猝死几率，预防老年痴呆和延缓衰老等作用。人类由于缺少合成ω-3族脂肪酸所需的酶，不能自身合成DHA，只能从食物中摄取。此外，动物卵细胞和精子中富含DHA，DHA在细胞结构、物质代谢和能量代谢等起非常重要的作用，它能够促进动物生长，增强动物免疫力，因而，DHA在饲料行业也有广泛的应用，将富含DHA的油脂或微生物菌体作添加剂加入到饲料中具有重要的意义。传统上DHA从深海鱼油中提取，受鱼的品种、季节、地理位置的影响而不稳定，且鱼油中还富含胆固醇和其他不饱和脂肪酸成分，导致DHA提取纯化成本较高，产量也有限。

裂殖壶菌(Schizochytriumsp.)又称裂壶藻，能够合成DHA，由于其繁殖方式为裂殖，生长周期短，且细胞内脂肪酸和DHA含量高等优势，被认为是生产DHA较理想的菌种。裂殖壶菌属于异养微生物，目前的菌体培养多采用有机氮源和碳源，例如鱼蛋白胨、酵母浸膏、玉米浆粉等，通常认为这些对于裂殖壶菌积累丰富的多不饱和脂肪酸，高糖如葡萄糖或甘油是必不可少的，因此，当前利用裂殖壶菌生产DHA成本非常高。

我国是农业大国，甘蔗是常见的木质纤维素，甘蔗榨糖处理后的甘蔗渣利用效率并不高。发明人认为，甘蔗渣中的纤维素和半纤维素的含量较高，其酸水解后可产生大量的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和少量氮源，可能会满足裂殖壶菌生长代谢对于碳源的要求。如果能够利用可再生的甘蔗渣水解液作为培养基来培养裂殖壶菌，则裂殖壶菌发酵生产DHA的成本会大大降低，同时也能够节约大量能源。但是，纤维素水解后除了产生细胞生长必需的碳源和氮源之外，往往还存在木质素降解的副产物如甲酸、乙酸、5-羟甲基糠醛等对细胞有毒性的物质，野生型的裂殖壶菌根本无法在纤维素水解液中生长。这一问题的常规解决思路和方法是将纤维素水解液进行脱毒处理，使其满足裂殖壶菌的生长要求，但脱毒过程耗时耗力，而且二次污染严重。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用裂殖壶菌发酵方法生产二十二碳六烯酸的方法，该方法能够直接利用未脱毒的甘蔗渣水解液发酵生产裂殖壶菌，或者进一步生产二十二碳六烯酸，该方法无需对甘蔗渣水解液进行脱毒处理，成本低廉。

本发明提供如下技术方案：

一种利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法，该方法采用能够直接在未脱毒的甘蔗渣水解液中生长的裂殖壶菌菌株作为菌体进行发酵。

具体地，本发明的利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法，包括如下步骤：

(1)将能够直接在未脱毒的甘蔗渣水解液中生长的裂殖壶菌菌株培养，得到种子液；

(2)将所述种子液接种至利用所述未脱毒的甘蔗渣水解液制成的发酵培养液中，发酵培养，得到二十二碳六烯酸；

其中，所述未脱毒的甘蔗渣水解液是甘蔗渣水解液原液或者甘蔗渣水解液原液的稀释液；所述甘蔗渣水解液原液是将甘蔗渣进行酸热处理，再调节pH至5～7得到的；所述发酵培养液添加有盐分。

根据本发明的方法，优选地，步骤(1)的裂殖壶菌菌株通过如下方法选育：

(1’)制备裂殖壶菌初始菌体的菌悬液；

(2’)将所述菌悬液涂布于甘蔗渣水解液固体培养基上培养；

所述甘蔗渣水解液固体培养基由甘蔗渣水解液，加入盐分和琼脂制成；所述甘蔗渣水解液的浓度使菌体的死亡率高于90％；

所述甘蔗渣水解液，是将甘蔗渣进行酸热处理，再调节pH至5～7得到的甘蔗渣水解液原液或由所述甘蔗渣水解液原液稀释得到的稀释液；

(3’)挑选所述甘蔗渣水解液固体培养基上成活的单菌落，分别传代培养；

(4’)选择能够稳定传代且菌体DHA产量高的菌株。

步骤(1’)中所述裂殖壶菌初始菌体可以为市售的任何裂殖壶菌菌体，优选为能够高产DHA的裂殖壶菌菌体。根据本发明一种实施方式，所述裂殖壶菌初始菌体采用裂殖壶菌(Schizochytriumsp.)，为科学研究领域流通使用的菌种，可以直接从市面上购买获得，也可以从保存有该菌种的相关的科研单位(例如福建师范大学)索取。

根据本发明的方法，优选地，步骤(1)采用的裂殖壶菌菌株为通过上述选育方法得到的裂殖壶菌菌株Schizochytriumsp.FNU1，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCCM2015636。更优选地，所述菌株是经过活化的。活化方法可采用本领域的常规方法。

根据本发明的方法，步骤(1)中种子液可以采用本领域通常发酵培养方法制得，所述发酵培养方法可以采用含有葡糖糖、蛋白胨、酵母浸膏和盐分的培养基，所述盐分按照培养裂殖壶菌的常规配方添加即可。通常直接使用海水晶就能够满足盐分需要。海水晶是海水及盐化工的产物，主要是通过对海水或卤水进行蒸发、离心、浓缩等一系列过程并加入微量元素而生产出来的。采用市售的海水晶都可以满足需求。优选地，步骤(1)可通过一级培养或多级培养，例如2～3级培养，得到种子液。通过多级培养更有利于菌株的增殖和后期的发酵培养。根据本发明一种优选的实施方式，步骤(1)首先将所述裂殖壶菌接种于种子培养液中，培养24～36h，得到一级种子液；再将所述一级种子液以5～25vt％，优选为10～20vt％的接种量接种于种子培养液中，培养24～36h，得到二级种子液。优选地，所述种子培养液的配方为：葡萄糖30～60g/L、蛋白胨10～20g/L、酵母浸膏5～15g/L，海水晶20～30g/L。优选地，步骤(1)培养温度为25～30℃，振摇培养，振摇转速为180～220r/min。

根据本发明的方法，优选地，步骤(2)中，所述未脱毒的甘蔗渣水解液原液是利用甘蔗渣制得的，制备方法为：将甘蔗渣与pH值为0.3～1.5的酸液按照固液比为1:3～6混合，于120～150℃下反应60～120min，过滤，调节pH至5～7，得到所述甘蔗渣水解液原液。所述酸液的氢离子浓度为0.01～0.06mol/L。所述酸可以为能够满足上述pH值的各种酸，例如可以选自硫酸、硝酸、盐酸和磷酸。实施时，可以将pH值换算成体积浓度，以方便配备，以硫酸为例，浓度可以为0.005～0.03mol/L，优选为0.01～0.02mol/L。采用碱液调节pH，所述碱液可以是氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液、氢氧化钙水溶液、氨水中的一种或几种等。优选地，所述碱液采用氢氧化钙溶液。所述甘蔗渣为甘蔗榨糖后所得。优选地，所述甘蔗渣经过干燥处理，含水量在5wt％以下。根据本发明一种优选的实施方式，所述的干燥处理的温度为60～80℃，时间2～3天，可选地，同时增加鼓风操作，以增强干燥效果。例如，可采用鼓风干燥箱进行干燥处理。根据本发明的选育方法，优选地，所述甘蔗渣在干燥前或干燥后进行粉碎处理，优选在干燥后进行粉碎处理。根据本发明优选的实施方式，所述甘蔗渣粉碎至粒径为2～20mm时，更有利于充分、快速地进行酸水解反应。更优选地，所述甘蔗渣粉碎后利用网筛进行过滤得到甘蔗粉。根据本发明优选的实施方式，所述网筛的孔径小于16mm。

根据本发明的方法，步骤(2)中所述的盐分按照培养裂殖壶菌的常规配方添加即可。通常，所述盐分中的阳离子构成元素包括Na、Mg、K、N，还可包括Fe，所述盐分中的阴离子构成元素包括S和P。优选地，所述盐分包括Na₂SO₄、NaCl、MgSO₄、(NH₄)₂SO₄和KH₂PO₄，最好还含有微量元素。根据本发明一种优选的实施方式，所述盐分的组成为1～5g/L的Na₂SO₄、0.5～1g/L的MgSO₄、0.25～0.5g/L的(NH₄)₂SO₄、1～3g/L的KH₂PO₄、10～20g/L的海水晶。所述海水晶如前所述。

需要说明的是，本发明所述的裂殖壶菌菌株选育方法中提到的“甘蔗渣水解液”与上述步骤(1)和(2)中的制备方法甘蔗渣水解液相同，这里不再赘述。

根据本发明的方法，步骤(2)所述发酵培养可以采用摇瓶培养或发酵罐培养。

根据本发明的方法，优选地，步骤(2)所述发酵培养采用发酵罐培养。所述发酵培养分段进行。优选地，初始采用的发酵培养液的量为发酵罐总容量的40～60vt％，连续或间断地向发酵罐内流加发酵培养液，优选为连续流加方式。其中，初始采用的发酵培养液采用所述甘蔗渣水解液原液的1～20倍稀释液，更优选为1～10倍稀释液，再优选为1～5倍稀释液，更优选为甘蔗渣水解液原液。发明人发现，采用所述优选的发酵培养液，更有利于缩短菌株发酵延滞期。

根据本发明的方法，优选地，控制所述发酵培养液的流加速度使发酵过程中发酵培养液的总糖浓度维持在2～4wt％。

根据本发明的方法，优选地，步骤(2)中，发酵温度控制25～30℃，发酵培养的总时间可以为80～130h，优选为100～120h。

根据本发明的方法，优选地，发酵的前1/5～1/4的时间期间内控制发酵培养液中碳氮比为40～60，发酵的后1/7～1/3的时间期间内控制发酵培养液中碳氮比为80～100。

根据本发明的方法，优选地，发酵培养过程中，通过添加碱液调节发酵培养液的pH为5～7。优选地，在发酵的前1/2～7/10的时间期间内添加氨水用于维持pH，之后采用氢氧化钠溶液维持pH。

根据本发明的方法，优选地，通过控制发酵通气比和搅拌速度，使发酵的前1/6～1/4的时间期间内溶氧量(DO)控制在8～12％，优选为约10％，在发酵的后1/7～1/3时间期间内控制DO为低于5％，在发酵中期控制DO在5～8％，优选为5～6％。根据本发明优选的实施方式，发酵通气比为1.0～2.0L/(min·L)，搅拌速度200～400r/min。

根据本发明的方法，优选地，所述种子液以8～15vt％的接种量接种至发酵培养液中，发酵过程控制温度在25～30℃。

根据本发明的方法，优选地，步骤(2)中，发酵通气比为1.0～2.0L/(min·L)，搅拌速度200～400r/min。

可选地，所述利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法还包括如下步骤：

(3)将步骤(2)发酵培养得到的裂殖壶菌提取二十二碳六烯酸。

根据本发明的方法，步骤(3)中，从发酵培养得到的裂殖壶菌中提取二十二碳六烯酸可以采用领域内的常规方法。通常包括离心沉淀菌体、重悬酸解、萃取、去除有机溶剂等步骤。在本发明的一个优选实施方式中，包括如下步骤：8000～10000r/min离心上述所得发酵培养液，得到菌体；用生理盐水洗涤所述菌体2～3遍，最后用6～8mol/L的HCl溶液重悬，60～80℃酸解30～90min；萃取油脂，优选地，温度70～80℃，时间60～90min，重复2～3次，合并上清液，吹干有机溶剂得到含二十二碳六烯酸的油脂。

根据本发明的方法，步骤(3)中，优选地，可以将提取的油脂酯化，并测定油脂含量和DHA的含量。具体步骤为：将油脂，有机溶剂和催化剂混合，60～65℃热反应60～90min，得到衍生化油脂。优选地，所述的有机溶剂为正己烷和甲醇混合，所述催化剂为浓盐酸；所述油脂、正己烷、甲醇、浓盐酸的质量体积比为10mg:2～3mL:1～3mL:0.1～0.3mL。油脂含量及DHA含量可以采用GC-MS法测定。

与现有的裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法相比，本发明的方法采用的裂殖壶菌突变菌种Schizochytriumsp.FNU1是经特殊选育的，其能够在未脱毒的甘蔗渣水解液培养液中快速增殖，并具有较高的、稳定的油脂和DHA生产能力，而野生型的裂殖壶菌则几乎不能在未脱毒的甘蔗渣水解液培养液中稳定增殖，甚至不能存活。由于采用了该突变菌株，本发明采用的甘蔗渣水解液无需再进行复杂的加酶和脱毒处理，因而成本更低，且步骤少，操作简单，易于控制。甘蔗渣属于制糖工业的废弃物，是一种纤维素和半纤维素含量较高的可再生资源，来源广泛，成本低廉，本发明的方法提高了甘蔗渣的利用价值。另外，本发明用甘蔗渣水解液进行DHA生产，发酵培养液除了水解液，只添加少量几种无机盐，无需添加例如鱼蛋白胨、酵母浸膏、玉米浆粉等高成本原料，因而成本更低。

在发酵培养过程中，发明人发现，上述优选的流加发酵方式能够有效地降低甘蔗渣水解液对菌株的毒害作用，使得菌株发酵延滞期缩短，大幅提高生产效率。另外，发酵过程中采取本发明的溶氧分段和碳氮比分段策略，显著提高了DHA产量。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。

以下实施例中使用的裂殖壶菌FNU1的保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏单位地址为中国湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为2015年10月23日，保藏编号为CCTCCNO：M2015636；分类命名为裂殖壶菌FNU1(Schizochytriumsp.FNU1)。采用的海水晶为天津汉沽同兴海水晶厂生产。

本发明中，所述稀释液的稀释倍数解释如下：N倍稀释液是指稀释液的体积为原液的N倍，当N为1时，实际上未经稀释，之所以稀释倍数可以为1，完全是为了表述方便。

菌体中油脂含量、DHA含量测定的GC-MS条件：仪器型号为安捷伦6890N-5975C，HP-INNOWAX极性毛细管柱，0.25μm×250μm×30m；载气：He；载气流量：1.0mL/min，恒定流量；上样模式：分流，分流比20:1；进样量1μL；进样口温度280℃；检测器温度280℃；升温程序：150℃保持1min，10℃/min升温至200℃，2℃/min升温至220℃，保持5min。240℃后运行3min，溶剂延迟时间3min，扫描方式：全扫描。

制备例1

甘蔗渣水解液的制备方法，包括以下步骤：

(1)取榨糖后的甘蔗渣，置于鼓风干燥箱内，于60℃下干燥3天，至其含水量低于5wt％；

(2)将干燥后的甘蔗渣用粉碎机粉碎，过筛，得到粒径为2～20mm的甘蔗渣粉；

(3)将甘蔗渣粉与0.01mol/L的H₂SO₄溶液按照固液比为1:6混合，于120℃下反应60min，过滤，滤液采用Ca(OH)₂调节至pH5，静置1h，过滤，得到甘蔗渣水解原液。

制备例2

甘蔗渣水解液的制备方法，包括以下步骤：

(1)取榨糖后的甘蔗渣，置于鼓风干燥箱内，于80℃下干燥2天，至其含水量低于5wt％；

(2)将干燥后的甘蔗渣用粉碎机粉碎，过筛，得到粒径2～16mm的甘蔗渣粉；

(3)将甘蔗渣粉与0.02mol/L的H₂SO₄溶液按照固液比为1:3混合，于150℃下反应120min，过滤，滤液采用Ca(OH)₂调节至pH7，静置1h，过滤，得到甘蔗渣水解原液。

制备例3

甘蔗渣水解液的制备方法，包括以下步骤：

(1)取榨糖后的甘蔗渣，置于鼓风干燥箱内，于70℃下干燥2.5天，至其含水量低于5wt％；

(2)将干燥后的甘蔗渣用粉碎机粉碎，过筛，得到粒径2～15mm的甘蔗渣粉；

(3)将甘蔗渣粉与0.01mol/L的H₂SO₄溶液按照固液比为1:8混合，于140℃下反应200min，过滤，滤液采用Ca(OH)₂调节至pH6，静置2h，过滤，得到甘蔗渣水解原液。

制备例4

发酵培养液的制备：

由制备例1方法制备的甘蔗渣水解液，加入3g/L的Na₂SO₄、0.75g/L的MgSO₄、0.25g/L的(NH₄)₂SO₄、3g/L的KH₂PO₄、20g/L的海水晶，灭菌，得到发酵培养液。

制备例5

发酵培养液的制备：

由制备例2方法制备的甘蔗渣水解液，稀释2倍，加入3g/L的Na₂SO₄、0.75g/L的MgSO₄、0.25g/L的(NH₄)₂SO₄、3g/L的KH₂PO₄、20g/L的海水晶，灭菌，得到发酵培养液。

制备例6

发酵培养液的制备：

由制备例2方法制备的甘蔗渣水解液，稀释3倍，加入3g/L的Na₂SO₄、0.75g/L的MgSO₄、0.25g/L的(NH₄)₂SO₄、3g/L的KH₂PO₄、20g/L的海水晶，灭菌，得到发酵培养液。

制备例7

发酵培养液的制备：

由制备例3方法制备的甘蔗渣水解液，稀释5倍，加入3g/L的Na₂SO₄、0.75g/L的MgSO₄、0.25g/L的(NH₄)₂SO₄、3g/L的KH₂PO₄、20g/L的海水晶，灭菌，得到发酵培养液。

制备例8

发酵培养液的制备：

由制备例1方法制备的甘蔗渣水解液，稀释10倍，加入3g/L的Na₂SO₄、0.75g/L的MgSO₄、0.25g/L的(NH₄)₂SO₄、3g/L的KH₂PO₄、20g/L的海水晶，灭菌，得到发酵培养液。

制备例9

发酵培养液的制备：

由制备例1方法制备的甘蔗渣水解液，稀释15倍，加入3g/L的Na₂SO₄、0.75g/L的MgSO₄、0.25g/L的(NH₄)₂SO₄、3g/L的KH₂PO₄、20g/L的海水晶，灭菌，得到发酵培养液。

制备例10

发酵培养液的制备：

由制备例1方法制备的甘蔗渣水解液，稀释20倍，加入3g/L的Na₂SO₄、0.75g/L的MgSO₄、0.25g/L的(NH₄)₂SO₄、3g/L的KH₂PO₄、20g/L的海水晶，灭菌，得到发酵培养液。

实施例1～5

摇瓶培养生产裂殖壶菌的方法，包括如下步骤：

(1)首先将裂殖壶菌菌株Schizochytriumsp.FNU1接种于种子培养液中，25～30℃下振摇培养24～36h，振摇转速为180～220r/min，得到一级种子液；再将一级种子液以15vt％的接种量接种于新的种子培养液中，25～30℃下振摇培养24～36h，振摇转速为180～220r/min，得到二级种子液，种子培养液的配方为：葡萄糖30g/L、蛋白胨10g/L、酵母浸膏5g/L，海水晶25g/L；

(2)将得到的二级种子液以10vt％的接种量分别接种至制备例4、7～10的发酵培养液中，25～30℃下振摇培养120h，振摇转速为220r/min，得到发酵培养液。

实施例6～8

发酵罐发酵生产裂殖壶菌的方法，包括如下步骤：

(1)首先将裂殖壶菌菌株Schizochytriumsp.FNU1接种于种子培养液中，25℃下振摇培养24h，振摇转速为220r/min，得到一级种子液；再将一级种子液以15vt％的接种量接种于新的种子培养液中，25℃下振摇培养36h，振摇转速为220r/min，得到二级种子液，种子培养液的配方为：葡萄糖30g/L、蛋白胨10g/L、酵母浸膏5g/L，海水晶25g/L；

(2)将得到的二级种子液以10vt％的接种量接种至15L发酵罐中，发酵罐内发酵培养液分别采用制备例4、5、6的发酵培养液，初始装量为8L；发酵过程中向发酵罐内连续流加制备例4的发酵培养液，控制流加速度使发酵培养液的总糖浓度维持在2～4wt％；发酵前60h加入氨水，控制发酵培养液的pH在6，之后停止加入氨水，改加1mol/L的氢氧化钠溶液控制pH在6，从而控制发酵培养液的碳氮比在合适的水平上；控制发酵通气量和搅拌速度，使发酵前24h的OD维持在10％左右，24～84h期间OD维持在5％左右，84h之后OD控制在低于5％，发酵时间共120h。

试验例1

实施例1～8的裂殖壶菌的菌体生物量和油脂、DHA产量测定，测定方法为：

将所得发酵培养液于8000r/min转速下离心，得到菌体，用生理盐水洗涤2次后均分为两份，一份于80℃下干燥60h，计算生物量，另一份用于提取油脂与油脂组分分析。

提取油脂的方法为：将菌体用6mol/L的盐酸溶液重悬，于80℃下酸解60min，加入正己烷-乙醇(3:1，v/v)萃取2次，合并上清液，吹干有机溶剂，得到油脂；将油脂加入正己烷、甲醇和浓盐酸，其中油脂、正己烷、甲醇、浓盐酸的质量体积比为10mg：2mL：1mL：0.1mL，于65℃下酯化反应60min，采用GC-MS测定菌体油脂含量、油脂中DHA含量，并计算DHA产量。

DHA产量＝菌体生物量×菌体油脂含量×油脂中DHA含量

试验结果见表1：

表1

本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。

Claims

1.一种利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述甘蔗渣水解液原液的制备方法如下：

将甘蔗渣与氢离子浓度为0.01～0.06mol/L的酸液按照固液比为1:3～6混合，于120～150℃下反应60～120min，过滤，调节pH至5～7，得到所述甘蔗渣水解液原液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述盐分中的阳离子构成元素包括Na、Mg、K和N，所述盐分中的阴离子构成元素包括S和P。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)采用发酵罐培养，初始的发酵培养液的量为发酵罐总容量的40～60vt％，连续或间断地向发酵罐内流加发酵培养液；所述的发酵培养液均采用所述甘蔗渣水解液原液的1～5倍稀释液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，发酵过程中控制发酵培养液的流加速度以使发酵培养液的总糖浓度维持在2～4wt％。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，发酵温度为25～30℃，发酵培养的总时间为80～130h。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，发酵的前1/5～1/4的时间期间内控制发酵培养液中碳氮比为40～60，发酵的后1/7～1/3的时间期间内控制发酵培养液中碳氮比为80～100。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，控制发酵的前1/6～1/4的时间期间内的溶氧量为8～12％，在发酵的后1/7～1/3时间期间内的溶氧量低于5％，在发酵中期的溶氧量在5～8％。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，发酵通气比为1.0～2.0L/(min·L)，搅拌速度200～400r/min。

10.根据权利要求1～9任一项所述的方法，其特征在于，所述裂殖壶菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM2015636。