CN105368885B - 一种强化圆红冬孢酵母产α-亚麻酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种强化圆红冬孢酵母产α‑亚麻酸的方法，包括以下步骤：1)将活化的圆红冬孢酵母在YEPD培养基培养；2)收集步骤1)培养而得的圆红冬孢酵母菌体，接种至补料发酵培养基进行补料发酵，所述补料发酵培养基含有碳源、氮源和无机盐，所述碳源优选为含有葡萄糖和木糖的混合碳源，补料发酵过程中，总碳氮比始终维持在100:0.7～1.5。本发明的方法操作简单易控，α‑亚麻酸产量能够达到总油脂的5％以上。

Description

一种强化圆红冬孢酵母产α-亚麻酸的方法

技术领域

本发明涉及一种利用微生物产α-亚麻酸的方法，尤其是强化圆红冬孢酵母产α-亚麻酸的方法。

背景技术

微生物油脂(Microbial oil)又称单细胞油脂(SCO,single celloil)，是由酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物在一定条件下，利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂作为碳源，在菌体内产生的大量油脂。与传统的油脂生产工艺相比，利用微生物生产油脂除了具有油脂含量高外，还有许多特殊的优点：如微生物细胞增殖快，生产周期短；利用微生物生产油脂，比农业生产油脂所需的劳动力少，而且不受场地设施、季节因素和天气变化的限制；微生物生长代谢所需的生物质原料来源广，价格便宜，如淀粉、糖类，以及食品工业和造纸行业的废弃物等都可以加以利用；能进行连续化的大规模生产，生产成本低；目前可以利用基因工程改造、代谢系统重构、细胞诱变等高科技方法，使微生物生产出比动、植物油脂更符合人们需要的高营养油脂或某些特定脂肪酸的油脂。

α-亚麻酸(cisΔ9,12,15)是一种ω-3家族的多不饱和脂肪酸，它在人体内不能合成，必须从体外摄取。如果身体缺乏α-亚麻酸，维生素、矿物质、蛋白质等营养素均不能被有效吸收和利用，而且会导致机体脂质代谢紊乱，进而引起免疫力降低、健忘、疲劳、视力减退、动脉粥样硬化等症状的发生。同时，α-亚麻酸在体内能合成、代谢，转化为机体必需的生命活性因子DHA和EPA，是构成人体组织细胞的主要成分。尤其是婴幼儿、青少年如果缺乏α-亚麻酸，就会严重影响其智力正常发育，这一点已经被世界营养学界所公认。

圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)是自然界中为数不多的可以合成亚麻酸的产油酵母。但是常规的圆红冬孢酵母发酵方法的α-亚麻酸产率很低，所以强化圆红冬孢酵母生产α-亚麻酸具有重要的研究和应用价值。

微生物油脂的产量和组分构成会随着发酵条件的不同而发生变化。已有诸多文献做了相关披露。

中国专利申请CN103642858A公开了一种调控油脂酵母发酵产生的微生物油脂的脂肪酸组成的方法，在油脂酵母的发酵培养基中添加短链水溶性有机酸，就得到含有短链水溶性有机酸的发酵培养基；发酵过后提取微生物油脂，可以获得脂肪酸酯组成显著改变的微生物油脂。这种方法简单可行，能够快速改造产油脂酵母的油脂脂肪酸组成。

中国专利申请CN101153299A公开了一种补料批式发酵粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)生产微生物油脂的方法。在菌体对数生长中期向发酵培养液中补加碳源葡萄糖，并以C/N 40同时进行氮源(硫酸铵或硝酸钾)的补加，这种方法使粘红酵母的油脂含量和产量显著提高。

中国专利申请CN104862349A公开了一种提高粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)油脂产量的培养基，其成分包括葡萄糖、酵母浸粉、磷酸氢二钾、硫酸铵、硫酸钠、七水硫酸镁和螺旋藻蛋白酶解物。这项技术将螺旋藻蛋白酶解物作为功能性促进物直接添加到葡萄糖培养基中，也作为一种有机氮源部分或全部替代葡萄糖培养基中的有机氮源酵母浸粉，从而在较低成本的前提下得到较高的微生物油脂产量。

美国专利申请US7932077使用基因工程的方法，显著提高了产油的解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)胞内二十碳五烯酸(EPA)的含量，这种方法利用多个嵌合基因，分别表达外源的脱饱和酶、碳链延长酶和酰基转移酶以及敲除了解脂耶氏酵母自身活性不高的脱饱和酶和酰基转移酶，并且优化了发酵条件，使二十碳五烯酸在解脂耶氏酵母胞内的含量达到了25％以上。

这些方法使得某种微生物的总油脂产率或某种特定油脂的产率得到了提升。但是，目前还没有简单有效地强化圆红冬孢酵母产α-亚麻酸的方法。

发明内容

为了解决现有圆红冬孢酵母生产α-亚麻酸产量低的问题，本发明提供了一种强化圆红冬孢酵母产α-亚麻酸的方法,有效地提升了圆红冬孢酵母生产α-亚麻酸的产量。

本发明提供的一种强化圆红冬孢酵母产α-亚麻酸的方法，包括以下步骤：

1)将活化的圆红冬孢酵母在YEPD培养基培养；

2)收集步骤1)培养而得的圆红冬孢酵母菌体，接种至补料发酵培养基进行补料发酵，所述补料发酵培养基含有碳源、氮源和无机盐，补料发酵过程中，总碳氮比始终维持在100:0.7～1.5。

活化的圆红冬孢酵母可以直接采用活化状态的菌株，也可由保藏状态的菌株活化而来。

所述YEPD培养基或称为YPD培养基，即，酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YeastExtract Peptone Dextrose Medium)，按照常规配方配置即可。优选地，按照如下配方配置：8～12g/L酵母粉，8～20g/L蛋白胨，15～25g/L葡萄糖，pH为5.8～6.0。若制固体培养基，加入10～20g/L琼脂粉,优选为15g/L琼脂粉。在本发明的一个优选实施方式中，YEPD培养基按照如下配方配置：10g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，pH＝5.8～6.0。

步骤1)和步骤2)可以在发酵罐中进行。步骤2)中，补料发酵是指，通过补料流加所述碳源维持所需的碳氮比。

根据本发明所述的方法，优选地，步骤2)中，所述碳源为含有葡萄糖和木糖的混合碳源，所述氮源为谷氨酸钠或蛋白胨，所述无机盐含有钾元素、镁元素和磷元素。

根据本发明所述的方法，优选地，步骤2)中，碳源为含有15～25g/L葡萄糖和25～35g/L木糖的混合碳源，氮源为5.8～6.5g/L的谷氨酸钠或4.6～5.5g/L的蛋白胨，所述无机盐包括0.3～0.7wt％的KH₂PO₄、0.1～0.3wt％的K₂HPO₄和0.3～0.7wt％的MgCl₂。以上各成分的含量是指各成分在补料发酵培养基中的含量。补料发酵过程中，通过流加所述碳源的水溶液(即，通过流加含有15～25g/L的葡萄糖和25～35g/L的木糖的混合碳源水溶液),使总碳氮比始终维持在100:0.8～1.2。更优选地，步骤2)中，碳源为含有18～22g/L葡萄糖和28～32g/L木糖的混合碳源，氮源为5.8～6.2g/L的谷氨酸钠或4.6～5.2g/L的蛋白胨，所述无机盐包括0.4～0.6wt％的KH₂PO₄、0.1～0.2wt％的K₂HPO₄和0.4～0.6wt％的MgCl₂，补料发酵过程中，通过流加所述混合碳源的水溶液(即，通过流加含有18～22g/L的葡萄糖和28～32g/L的木糖的混合碳源水溶液)，使总碳氮比始终维持在100:0.9～1.1。根据本发明的一个优选实施方式，步骤2)中，碳源为含20g/L葡萄糖和30g/L木糖的混合碳源，氮源为6.2g/L的谷氨酸钠或4.6g/L的蛋白胨，所述无机盐包括0.52wt％的KH₂PO₄、0.16wt％的K₂HPO₄和0.48wt％的MgCl₂，补料发酵过程中，通过流加所述碳源的水溶液(即，通过流加含有18～22g/L的葡萄糖和28～32g/L的木糖的混合碳源水溶液)，使总碳氮比始终维持在100:1。

根据本发明所述的方法，优选地，步骤1)中，圆红冬孢酵母在YEPD培养基培养至OD₆₀₀为10以上。更优选地，培养至OD₆₀₀为12～15。

根据本发明所述的方法，优选地，步骤2)中，补料发酵的时间为80～150h。更优选地，补料发酵的时间为100～140h。

根据本发明所述的方法，优选地，步骤1)中，圆红冬孢酵母在YEPD液体培养基中培养，培养条件为28～30℃，180～230rpm，培养40～60h；步骤2)中，补料发酵的时间为100～130h。根据本发明的一个优选的实施方式，步骤1)中，圆红冬孢酵母在YEPD液体培养基中培养，培养条件为30℃，200rpm，培养48h；步骤2)中，补料发酵的时间为120h。

根据本发明所述的方法，优选地，步骤2)中，收集步骤1)培养而得的圆红冬孢酵母菌体的方法为：7000～9000rpm离心，收集菌体，用浓度为15～25mM，pH＝6.5～7的磷酸盐缓冲液洗涤菌体，再次离心收集菌体。根据本发明的一个优选的实施方式，步骤2)中，收集步骤1)培养而得的圆红冬孢酵母菌体的方法为：8000rpm离心，收集菌体，用20mM，pH＝6.8的磷酸盐缓冲液洗涤菌体，再次离心收集菌体。

根据本发明所述的方法，所述圆红冬孢酵母的菌株为本领域通常采用的那些，优选地，所述圆红冬孢酵母的菌株为如下a)或b)的菌株：

a)圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)ACCC 20341；

b)培育自a)的菌株。

其中，a)的菌株在本领域主要科研机构(例如福建师范大学)都有保存，可以进行索取。也可以直接从保藏机构购买，例如，a)的圆红冬孢酵母ACCC 20341可以从中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)购得。培育自a)的菌株可以由a)的菌株经过各种本领域已经披露的培育方法得到。例如，a)的圆红冬孢酵母ACCC 20341可以经过常温常压等离子(Atmospheric and room temperature plasma)诱变，得到可以在未脱毒的纤维素水解液中生长代谢的菌株圆红冬孢酵母(R.toruloides)M18(参考文献：Feng Qi,Yuki Kitahara,Zitian Wang,Xuebing Zhao,Wei Du,Dehua Li.Novel mutant strains ofRhodosporidiumtoruloides by plasma mutagenesis approach and their tolerancefor inhibitors in lignocellulosichydrolyzate.Journal of Chemical Technologyand Biotechnology.2014,89(5):735–742)。

根据本发明所述的方法，优选地，步骤2)得到的发酵液用有机溶剂提取总油脂，所述有机溶剂可以为本领域采用的各种提取微生物总油脂的有机溶剂。优选地，所述有机溶剂为体积比为2～5:1的正己烷和乙醇，更优选为体积比为2.5～3.5:1的正己烷和乙醇。

根据本发明所述的方法，优选地，提取总油脂的方法为：7000～9000rpm离心所得发酵液，用pH＝6.5～7的磷酸盐缓冲液洗涤离心的菌体，最后用浓度为5～7mol/L的盐酸重悬，70～90℃水浴酸解30～100min；加入所述有机溶剂萃取其中的油脂，重复萃取3～5次，合并上清液，蒸发所述有机溶剂后即得含α-亚麻酸的总油脂。根据本发明的一个优选的实施方式，提取总油脂的方法为：8000rpm离心所得发酵液，用pH＝6.8的磷酸盐缓冲液洗涤离心的菌体，最后用6mol/L的盐酸重悬，80℃水浴酸解40min；加入所述有机溶剂萃取其中的油脂，重复萃取3次，合并上清液，蒸发所述有机溶剂后即得含α-亚麻酸的总油脂。

圆红冬孢酵母胞内油脂积累量能够达到细胞干重的60％以上，但是生产出来的油脂一般用作生物柴油等能源用途。本发明通过两段式的发酵培养方法强化了圆红冬孢酵母胞内油脂中α-亚麻酸的产量，可用于保健品，提升了圆红冬孢酵母油脂的利用价值。此外，采用本发明优选的方案，亦即以葡萄糖和木糖作为混合碳源、以谷氨酸钠或蛋白胨为优化氮源来发酵圆红冬孢酵母，并保持发酵过程的碳氮比，这样可以显著增加圆红冬孢酵母胞内合成α-亚麻酸的量。

总体而言，本发明的方法操作简单，α-亚麻酸产率提升显著，过程控制容易，非常适于α-亚麻酸的产业化量产。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。

除非特别声明，本发明的“％”表示重量百分比wt％。本发明的“mM”表示mmol/L。

本发明实施例中未限定配方的YEPD培养基均按照如下配方配置：10g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，pH5.8～6.0。

本发明的实施例所得的总油脂中的α-亚麻酸的含量采用气相色谱-质谱联用仪进行检测，检测条件如下：安捷伦6890N-5975C，HP-INNOWAX极性毛细管柱，0.25μm×250μm×30m；载气：氦气；载气流量：1.0mL/min，恒定流量；上样分流比为20:1；进样量1μL；进样口和检测器温度为280℃；升温程序：180℃保持1min，10℃/min升温至220℃，2℃/min升温至240℃，保持5min。260℃后运行3min，全扫描。

实施例1

采用圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)ACCC 20341作为发酵菌株。

圆红冬孢酵母R.toruloides菌株从斜面保藏培养基活化，斜面保藏培养基组成为YEPD：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，琼脂粉15g/L，pH 5.8～6.0，在115℃下饱和蒸汽灭菌20min。上述保藏的圆红冬孢酵母R.toruloides菌株使用YEPD培养基进行活化，在500mL三角瓶中培养，装液量200mL，30℃，200rpm培养48h至OD₆₀₀＝12。

然后酵母细胞进行离心，收集菌体，接种至10L发酵罐中进行补料发酵培养，装液量6L。补料发酵培养基的成分为：葡萄糖20g/L，木糖30g/L，谷氨酸钠6.2g/L，无机盐KH₂PO₄:0.52％，K₂HPO₄:0.16％，MgCl₂:0.48％。发酵过程中，通过流加含有20g/L的葡萄糖和30g/L的木糖的混合碳源水溶液，保持限氮培养基的总碳氮比为100:1，pH 5.8～6.0；连续补料发酵120h后，发酵停止。取10mL发酵液8000r/min离心，用5mL pH＝6.8的磷酸盐(K₂HPO₄-KH₂PO₄)缓冲液洗涤离心的菌体3遍，然后用5mL浓度为6mol/L的盐酸重悬，80℃水浴酸解40min。然后加入正己烷和乙醇体积比3:1的混合液来萃取其中的油脂，此步重复3次，合并上清液，使用旋转蒸发仪将有机溶剂蒸干即得微生物总油脂。经过气相色谱-质谱仪检测，总油脂中的十八碳三烯酸为α-亚麻酸(cisΔ9,12,15)，α-亚麻酸的产量达到了细胞总油脂的5.01％。

实施例2

采用菌株为圆红冬孢酵母ACCC 20341经过常温常压等离子(Atmospheric androom temperature plasma)诱变得到的可以在未脱毒的纤维素水解液中生长代谢的菌株圆红冬孢酵母R.toruloides M18(参考文献：Feng Qi,Yuki Kitahara,Zitian Wang,Xuebing Zhao,Wei Du,Dehua Li.Novel mutant strains of Rhodosporidiumtoruloidesby plasma mutagenesis approach and their tolerance for inhibitors in lignocellulosichydrolyzate.Journal of Chemical Technology and Biotechnology.2014,89(5):735–742)。

使用YEPD培养基对上述诱变R.toruloides M18进行活化，在500mL三角瓶中培养，装液量200mL，30℃，200rpm培养48h至OD₆₀₀＝12。然后酵母细胞进行离心，收集菌体，接种至10L发酵罐中进行补料发酵培养，装液量6L。

使用纤维素水解液作为补料培养基的主要成分：取榨糖后的500g甘蔗渣粉置于1000ml圆底烧瓶中，按液固比10：1(w/w)加入0.5％的稀硫酸溶液，搅拌均匀后于121℃处理1小时，反应结束后将甘蔗渣挤压、过滤得水解液。用Ca(OH)₂将水解液中和至pH6.0，旋蒸浓缩得甘蔗渣水解液，稀释20倍后待用，稀释后的水解液中葡萄糖10g/L，木糖22g/L。添加葡萄糖和木糖至终浓度分别为20g/L和30g/L，蛋白胨4.6g/L，无机盐KH₂PO₄:0.52％，K₂HPO₄:0.16％，MgCl₂:0.48％；发酵过程中，通过流加含有20g/L的葡萄糖和30g/L的木糖的混合碳源水溶液，保持限氮培养基的总碳氮比为100:1，pH 5.8～6.0；连续补料发酵120h后结束。取10mL发酵液8000r/min离心，用5mL pH＝6.8的磷酸盐缓冲液洗涤离心的菌体3遍，然后用5mL浓度为6mol/L的盐酸重悬，80℃水浴酸解40min；加入正己烷和乙醇体积比3:1的混合液来萃取其中的油脂，此步重复3次，合并上清液，使用旋转蒸发仪将机溶剂蒸干即得微生物总油脂。经过气相色谱-质谱仪检测，总油脂中的十八碳三烯酸为α-亚麻酸(cisΔ9,12,15)，α-亚麻酸的产量达到了细胞总油脂的5.12％。

比较例1

采用圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)ACCC 20341作为发酵菌株。圆红冬孢酵母R.toruloides菌株从YEPD斜面保藏培养基活化，在含有YEPD液体培养基的500mL三角瓶中培养，装液量200mL，30℃，200rpm培养48h至OD₆₀₀＝10。

对获得的酵母细胞进行6000rpm离心收集菌体，接种至10L发酵罐中进行补料发酵培养，装液量6L。补料发酵培养基的成分为：葡萄糖20g/L，谷氨酸钠6.0g/L,无机盐KH₂PO₄:0.52％，K₂HPO₄:0.16％，MgCl₂:0.48％。发酵过程中，通过流加含有20g/L葡萄糖的碳源水溶液，保持限氮培养基的总碳氮比为40:1，pH 5.8～6.0；连续补料发酵120h后，发酵停止。取10mL发酵液8000r/min离心，用5mL pH＝6.8的磷酸盐(K₂HPO₄-KH₂PO₄)缓冲液洗涤离心的菌体3遍，菌体用5mL浓度为6mol/L的盐酸重悬，80℃水浴酸解40min。然后加入正己烷和乙醇体积比3:1的混合液来萃取其中的油脂，此步重复3次，合并上清液，使用旋转蒸发仪将有机溶剂蒸干即得微生物总油脂。经过气相色谱-质谱仪检测，总油脂中的十八碳三烯酸为α-亚麻酸(cisΔ9,12,15)，α-亚麻酸的产量为细胞总油脂的2.28％。

比较例2

采用圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)ACCC 20341作为发酵菌株。圆红冬孢酵母R.toruloides菌株从YEPD斜面保藏培养基活化，在含有YEPD液体培养基的500mL三角瓶中培养，装液量200mL，30℃，200rpm培养48h至OD₆₀₀＝10。

对获得的酵母细胞进行6000rpm离心收集菌体，接种至10L发酵罐中进行补料发酵培养，装液量6L。补料发酵培养基的成分为：葡萄糖10g/L，木糖20g/L，蛋白胨4.6g/L,无机盐KH₂PO₄:0.52％，K₂HPO₄:0.16％，MgCl₂:0.48％。发酵过程中初始培养基的碳氮比为100:1，发酵过程pH 5.8～6.0，只流加含有10g/L的葡萄糖和20g/L的木糖的混合碳源水溶液，并不控制碳氮比；连续补料发酵120h(补料总量为800mL)后，发酵停止。取10mL发酵液8000r/min离心，用5mL pH＝6.8的磷酸盐(K₂HPO₄-KH₂PO₄)缓冲液洗涤离心的菌体3遍，菌体用5mL浓度为6mol/L的盐酸重悬，80℃水浴酸解40min。然后加入正己烷和乙醇体积比3:1的混合液来萃取其中的油脂，此步重复3次，合并上清液，使用旋转蒸发仪将有机溶剂蒸干即得微生物总油脂。经过气相色谱-质谱仪检测，总油脂中的十八碳三烯酸为α-亚麻酸(cisΔ9,12,15)，α-亚麻酸的产量为细胞总油脂的1.98％。

根据以上实施例和比较例的对比可以看出，本发明的强化圆红冬孢酵母产α-亚麻酸的方法通过易于操作的简单手段使得圆红冬孢酵母产α-亚麻酸的能力得到了有效强化，α-亚麻酸的产量得到了显著提升。

本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。

Claims (8)

1.一种强化圆红冬孢酵母产α-亚麻酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将活化的圆红冬孢酵母在YEPD培养基培养；

2)收集步骤1)培养而得的圆红冬孢酵母菌体，接种至补料发酵培养基进行补料发酵以得到发酵液；

其中，所述的补料发酵培养基含有碳源、氮源和无机盐；碳源为由15～25g/L的葡萄糖和25～35g/L的木糖组成的混合碳源，氮源为5.8～6.5g/L的谷氨酸钠或4.6～5.5g/L的蛋白胨，所述无机盐包括0.3～0.7wt％的KH₂PO₄、0.1～0.3wt％的K₂HPO₄和0.3～0.7wt％的MgCl₂，补料发酵过程中，通过流加含有15～25g/L的葡萄糖和25～35g/L的木糖的混合碳源水溶液，使总碳氮比始终维持在100:0.8～1.2。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，圆红冬孢酵母在YEPD培养基培养至OD₆₀₀为10以上。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤2)中，补料发酵的时间为80～150h。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：

步骤1)中，所述的YEPD培养基为YEPD液体培养基；培养条件为28～30℃，180～230rpm，培养40～60h；和

步骤2)中，补料发酵的时间为100～130h。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，收集步骤1)培养而得的圆红冬孢酵母菌体的方法为：7000～9000rpm离心，收集菌体，用浓度为15～25mM、pH＝6.5～7的磷酸盐缓冲液洗涤菌体，再次离心收集菌体。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述圆红冬孢酵母的菌株为如下a)或b)的菌株：

a)圆红冬孢酵母ACCC 20341；

b)培育自a)的菌株。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将步骤2)得到的发酵液用有机溶剂提取含α-亚麻酸的总油脂，所述有机溶剂为体积比为2～5:1的正己烷和乙醇。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，提取总油脂的方法为：7000～9000rpm离心所述发酵液以得到离心后的菌体；用pH＝6.5～7的磷酸盐缓冲液洗涤离心后的菌体；用浓度为5～7mol/L的盐酸重悬洗涤后菌体，70～90℃酸解30～100min；将所述有机溶剂加入酸解后的菌体中萃取总油脂，重复萃取3～5次，合并上清液；将所述上清液蒸发以除去所述有机溶剂后即得含α-亚麻酸的总油脂。