CN115074262B - 一种圆红冬孢酵母培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种圆红冬孢酵母培养工艺，包括以下步骤：S1：菌种激活：先从YPD斜面培养基上保存的圆红冬孢酵母挑取少量菌体转移到新配制的培养中，置于28℃恒温培养箱中活化培养36‑48h，获得新的斜面培养菌种。本发明以圆红冬孢酵母菌株出发，通过了解圆红冬孢酵母的菌落形态，测定圆红冬孢酵母的生长曲线，比较鉴定、提取圆红冬孢酵母的油脂含量的方法，最后确定了以下的条件能有最高的油脂提取率，可以为发展利用圆红冬孢酵母生产微生物油脂打下根基。
Description
技术领域
本发明涉及菌种培养技术领域，尤其涉及一种圆红冬孢酵母培养方法。
背景技术
为解决日趋严重的能源短缺与环境恶化问题,世界各国大力开发可再生液体燃料,其中生物柴油足最具发展潜力的生物能源产品。日前以动植物油脂生产生物柴油面临成本高、原料总量缺口大.供给季节性强等不利于规模化生产的难题。而且,持续扩大传统油料作物种植获取生物柴油生产原料将存在着与人争粮、与粮争地等问题。因此,开拓新的油脂资源是降低生物柴油价格和保障生物柴油产业可持续发展的关键。
圆红冬孢酵母作为较佳的生物油生产菌种，其培养意义重大，现有的菌种均通过放置于定温发酵一定时间，没有发挥其最佳的效果，造成菌种菌群的数量不达标，无法实现最佳的发酵效果。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种圆红冬孢酵母培养方法。
本发明提出的一种圆红冬孢酵母培养方法，包括以下步骤：
S1：菌种激活：先从YPD斜面培养基上保存的圆红冬孢酵母挑取少量菌体转移到新配制的培养中，置于28℃恒温培养箱中活化培养36-48h，获得新的斜面培养菌种；
S2：菌种分裂：通过斜面活化培养后，用接种环在无菌环境下从培养好的新鲜菌种斜面上挑取菌体接入装有50ml己灭过菌的液体种子培养基250ml三角瓶中，并在28℃、转速为180-200 r/min的条件下摇瓶培养24h-48h；
S3：菌种实验培养基：将种子液以10%的接种量接入装有1L产油脂培养基的3L三角瓶中进行摇瓶发酵，在28℃和 180 rpm下振荡培养120h和设置6个不同碳氮比。
S4：确定碳氢比并培养菌种：根据培养环境的温度、湿度等参数改变，制作相应的圆红冬孢酵母生长图，并找到拐点，记录碳氢比，将此碳氢比下的产油脂培养基重新接种圆红冬孢酵母菌体培养即可。
优选地，所述YPD斜面培养基包括蛋白胨、酵母粉、葡萄糖和琼脂。
优选地，所述产油脂培养基包括MgSO4·7H2 O、KH2PO4、(NH4)2S04、CaCl2、FeCl3·6H2O、FeCl3·7H2O、MnSO4·H2O、酵母粉和葡萄糖，且其中酵母粉为调节碳氢比的物料。
优选地，在圆红冬孢酵母培养方法后期，还采用了酵母培养增殖装置进行培养增殖，所述装置包括多个串联的环形管道式培养腔体，相邻两培养腔体之间的通路通过可开闭的第一挡板控制开闭；所述培养腔体包括外壁和套设在外壁内的内壁；所述外壁与内壁之间设置有第一温度调节层；所述外壁和内壁均为导热材料；所述第一温度调节层包括密集排列的多个第一半导体制冷片；所述培养腔体内部中心沿其长度方向设置有空心的内温度调节棒；所述内温度调节棒内部填充有固-液相变材料；所述内温度调节棒可连通外界循环其内部的固-液相变材料；所述固-液相变材料的相变温度在酵母菌的安全温度范围内；所述内温度调节棒外表面设置有第二温度调节层；所述第二温度调节层也包括密集排列的多个第二半导体制冷片；所述内温度调节棒棒体为导热材料；所述培养腔体的外壁上分别沿其切线方向设置有分别可开闭的用于补充所需无菌气体的进气管以及用于补充所需培养液及菌体的进料管。
其中，相邻两培养腔体之间通过连接管连通，所述连接管同时与两培养腔体的外壁相切；所述第一挡板铰接在前一道培养腔体的出料口处，通过转动实现在闭合连接管的同时使前一道培养腔体保持循环通路，而在打开连接管的同时使前一道培养腔体的循环通路闭合。
其中，后一道培养腔体的进料口处铰接有第二挡板；所述第二挡板通过转动实现在闭合连接管的同时使后一道培养腔体保持循环通路，而在打开连接管的同时使后一道培养腔体的循环通路闭合。
其中，所述第一挡板为多孔结构，且表面蒙附有防水透气膜；一抽气管连通连接管向外抽气使连接管内保持负压。
其中，所述外壁外表面均匀设置有多片环形导热片；所述环形导热片与外壁长度方向垂直。
其中，多个培养腔体整体上下分布。
其中，所述内壁内表面设置有螺旋膛线或圆滑凸起；
其中，所述酵母培养增殖方法为：
①将初始酵母菌混合培养液通过进料管以一定的速度注入培养腔体中，同时以连续或脉冲的形式通过进气管向培养腔体内注入压缩的利于酵母菌培养的无菌气体，由于进气管与进料管均与培养腔体相切，因此可使酵母菌混合培养液在培养腔体内循环流动，同时内壁内表面的螺旋膛线或圆滑凸起能够使混合培养液具有更强的紊流，促进酵母菌混合培养液的物质交换和气体溶解，便于其中的培养液和气体更新以及温度的均匀；培养腔体中的多余气体和废弃穿过防水透气膜和第一挡板通过抽气管抽出，从而保障培养腔体中的气压稳定和气体新鲜度；
②通过第一半导体制冷片和第二半导体制冷片从内外两个方向同时对培养腔体内的酵母菌混合培养液的温度进行精确的控制，以保障酵母菌高效的培养增殖，固-液相变材料不仅可通过循环流动以及自身较大的比热容在突发情况下半导体制冷片故障或失效时快速的排除多余的热量，而且能够通过自身固-液相变特点自动平衡酵母菌混合培养液的温度，在一段时间内避免酵母菌大规模死亡；
③在设定培养时间达成后，第一挡板和第二挡板分别向前一道培养腔体和后一道培养腔体内旋转，使流动的酵母菌培养液在惯性作用下从上一道培养腔体通过连接管进入下一道培养腔体内，完成后，第一挡板和第二挡板重新闭合，前一道培养腔体继续注入新的酵母菌混合培养液或更之前一道培养腔体的酵母菌混合培养液，后一道培养腔体继续培养之前的酵母菌培养液，直至在进行N道培养后达成培养增殖目标后排出。
本发明中的有益效果为：
本发明以圆红冬孢酵母菌株出发，通过了解圆红冬孢酵母的菌落形态，测定圆红冬孢酵母的生长曲线，比较鉴定、提取圆红冬孢酵母的油脂含量的方法，最后确定了以下的条件能有最高的油脂提取率，可以为发展利用圆红冬孢酵母生产微生物油脂打下根基。
2、本发明设置多级串联可循环动态培养的培养腔体，相比传统的采用罐体进行静态培养增殖，能够实现连续脉动且动态的培养增殖，显著提高生产效率和生产连贯性，减少菌体在培养增殖完成后到后道工序之间所需的停留时间，提高菌体成品成活率和培养效率；将菌体的培养增殖过程分割成多段连续进行，从而实现连续性、可控性、且能减少部分菌体不合格对整体的影响，减少废弃率。
3、本发明的培养腔体采用内外设置半导体制冷片，不仅能够增加与酵母菌混合培养液的接触面积，提高热传导率和传导均匀性，而且能够通过控制电流大小和方向精确双向控制温度，从而保障酵母菌处于最适宜的培养温度，以保障酵母菌高效的培养增殖，同时通过固-液相变材料不仅可通过循环流动以及自身较大的比热容在突发情况下半导体制冷片故障或失效时快速的排除多余的热量，而且能够通过自身固-液相变特点自动平衡酵母菌混合培养液的温度，在一段时间内避免酵母菌大规模死亡。
4、本发明利用进气管与进料管均与培养腔体相切的特点，不仅可以根据设计和计算结构向培养腔体内进给酵母菌和培养液以及补充酵母菌所需气体，而且利用冲击的进液和进气，能够为培养腔体内的混合培养液提供循环转动的动力，可使酵母菌混合培养液在培养腔体内循环流动，同时内壁内表面的螺旋膛线或圆滑凸起能够使混合培养液具有更强的紊流，促进酵母菌混合培养液的物质交换和气体溶解，便于进一步的的培养液和气体更新以及温度的均匀；且培养腔体中的多余气体和废弃穿过防水透气膜和第一挡板通过抽气管抽出，从而保障培养腔体中的气压稳定和气体新鲜度。
附图说明
图1为本发明的方法示意图；
图2为本发明的菌种生长曲线图；
图3为本发明酵母培养增殖装置的结构示意图；
图4为本发明内温度调节棒的径向剖视示意图；
图5为本发明第二挡板的剖视示意图。
图中：1、培养腔体；11、外壁；12、内壁；13、第一温度调节层；14、第一半导体制冷片；15、内温度调节棒；16、固-液相变材料；17、第二温度调节层；18、第二半导体制冷片；2、第一挡板；21、防水透气膜；22、抽气管；3、进气管；4、进料管；6、连接管；7、第二挡板。
实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
参见图1和2，一种圆红冬孢酵母培养方法，包括以下步骤：
S1：菌种激活：先从YPD斜面培养基上保存的圆红冬孢酵母挑取少量菌体转移到新配制的培养中，置于28℃恒温培养箱中活化培养36-48h，获得新的斜面培养菌种；
S2：菌种分裂：通过斜面活化培养后，用接种环在无菌环境下从培养好的新鲜菌种斜面上挑取菌体接入装有50ml己灭过菌的液体种子培养基250ml三角瓶中，并在28℃、转速为180-200 r/min的条件下摇瓶培养24h-48h；
S3：菌种实验培养基：将种子液以10%的接种量接入装有1L产油脂培养基的3L三角瓶中进行摇瓶发酵，在28℃和 180 rpm下振荡培养120h和设置6个不同碳氮比。
S4：确定碳氢比并培养菌种：根据培养环境的温度、湿度等参数改变，制作相应的圆红冬孢酵母生长图，并找到拐点，记录碳氢比，将此碳氢比下的产油脂培养基重新接种圆红冬孢酵母菌体培养即可。
其中，YPD斜面培养基包括蛋白胨、酵母粉、葡萄糖和琼脂。
其中，产油脂培养基包括MgSO4·7H2 O、KH2PO4、(NH4)2S04、CaCl2、FeCl3·6H2O、FeCl3·7H2O、MnSO4·H2O、酵母粉和葡萄糖，且其中酵母粉为调节碳氢比的物料。
具体的，参照图2，在YPD培养基中培养菌种的生长曲线，在30min时最多，故会在YPD培养基中培养30min最佳，其中菌种检测通过标记，并对其标记吸光率检测，记录其菌种数量，其中YPD培养基(w/v)的配方为：蛋白胨——2.0-2.5%，酵母粉——1.0-1.2%，葡萄糖——1.8-2.1%，在配置后不调节其pH，菌种需求，再在YPD培养基基础上加入2.0-3.0%的琼脂，在115-120℃下灭菌30min。
本发明中，产油脂培养基(w/v)的配方为：
MgSO4·7H2 O——0.15%，KH2PO4——0.1 %，(NH4)2S04——0.02.%，CaCl2——0.005%，FeCl3·6H2O——0.001%，FeCl3·7H2O——0.002%，MnSO4·H2O——0.0002%，酵母粉0-0.06 %，葡萄糖8.0 %。
其培养基的初始pH为4.0-4.2，在温度116-118℃灭菌35-40 min。
其中通过酵母粉的比例调节不同碳氮比的产油培养基，通过条件酵母提取粉的量来控制不同碳氮比，其中酵母粉的量按照0.01%增长，其对应的的碳氢比为0%、0.02%、0.04%、0.08%、0.12%、0.16%。
其中将种子液培养10-24h后进行接种，然后再产油培养的时间是5d,葡糖糖和酵母提取粉的量分别为“8.0%、0.04%"，则可以通过镜检配合上索氏提取法的方法得出菌体的生长及油脂积累情况，得出的培养温度和碳氢比用量为55℃、“8.0%、0.04%"使其菌种数量和活性均为最盛。
进一步的，参见图3至5，为了使圆红冬孢酵母能够快速增殖，设计了酵母培养增殖装置，该装置包括多个串联的环形管道式培养腔体1，相邻两培养腔体1之间的通路通过可开闭的第一挡板2控制开闭；培养腔体1包括外壁11和套设在外壁11内的内壁12；外壁11与内壁12之间设置有第一温度调节层13；外壁11和内壁12均为导热材料；第一温度调节层13包括密集排列的多个第一半导体制冷片14；培养腔体1内部中心沿其长度方向设置有空心的内温度调节棒15；内温度调节棒15内部填充有固-液相变材料16；内温度调节棒15可连通外界循环其内部的固-液相变材料16；固-液相变材料16的相变温度在酵母菌的安全温度范围内；内温度调节棒15外表面设置有第二温度调节层17；第二温度调节层17也包括密集排列的多个第二半导体制冷片18；内温度调节棒15棒体为导热材料；培养腔体1的外壁11上分别沿其切线方向设置有分别可开闭的用于补充所需无菌气体的进气管3以及用于补充所需培养液及菌体的进料管4。
进一步的，相邻两培养腔体1之间通过连接管6连通，连接管6同时与两培养腔体1的外壁11相切；第一挡板2铰接在前一道培养腔体1的出料口处，通过转动实现在闭合连接管6的同时使前一道培养腔体1保持循环通路，而在打开连接管6的同时使前一道培养腔体1的循环通路闭合。
进一步的，后一道培养腔体1的进料口处铰接有第二挡板7；第二挡板7通过转动实现在闭合连接管6的同时使后一道培养腔体1保持循环通路，而在打开连接管6的同时使后一道培养腔体1的循环通路闭合。
进一步的，第一挡板2为多孔结构，且表面蒙附有防水透气膜21；一抽气管22连通连接管6向外抽气使连接管6内保持负压。
进一步的，外壁11外表面均匀设置有多片环形导热片；环形导热片与外壁11长度方向垂直。
进一步的，多个培养腔体1整体上下分布。
进一步的，内壁12内表面设置有螺旋膛线或圆滑凸起；
酵母培养增殖方法为：
①将初始酵母菌混合培养液通过进料管4以一定的速度注入培养腔体1中，同时以连续或脉冲的形式通过进气管3向培养腔体1内注入压缩的利于酵母菌培养的无菌气体，由于进气管3与进料管4均与培养腔体1相切，因此可使酵母菌混合培养液在培养腔体1内循环流动，同时内壁12内表面的螺旋膛线或圆滑凸起能够使混合培养液具有更强的紊流，促进酵母菌混合培养液的物质交换和气体溶解，便于进一步的的培养液和气体更新以及温度的均匀；培养腔体1中的多余气体和废弃穿过防水透气膜21和第一挡板2通过抽气管22抽出，从而保障培养腔体1中的气压稳定和气体新鲜度；
②通过第一半导体制冷片14和第二半导体制冷片18从内外两个方向同时对培养腔体1内的酵母菌混合培养液的温度进行精确的控制，以保障酵母菌高效的培养增殖，固-液相变材料16不仅可通过循环流动以及自身较大的比热容在突发情况下半导体制冷片故障或失效时快速的排除多余的热量，而且能够通过自身固-液相变特点自动平衡酵母菌混合培养液的温度，在一段时间内避免酵母菌大规模死亡；
③在设定培养时间达成后，第一挡板2和第二挡板7分别向前一道培养腔体1和后一道培养腔体1内旋转，使流动的酵母菌培养液在惯性作用下从上一道培养腔体1通过连接管6进入下一道培养腔体1内，完成后，第一挡板2和第二挡板7重新闭合，前一道培养腔体1继续注入新的酵母菌混合培养液或更之前一道培养腔体1的酵母菌混合培养液，后一道培养腔体1继续培养之前的酵母菌培养液，直至在进行N道培养后达成培养增殖目标后排出。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种圆红冬孢酵母培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：菌种激活：先从YPD斜面培养基上保存的圆红冬孢酵母挑取少量菌体转移到新配制的培养中，置于28℃恒温培养箱中活化培养36-48h，获得新的斜面培养菌种；
S2：菌种分裂：通过斜面活化培养后，用接种环在无菌环境下从培养好的新鲜菌种斜面上挑取菌体接入装有50ml己灭过菌的液体种子培养基250ml三角瓶中，并在28℃、转速为180-200 r/min的条件下摇瓶培养24h-48h；
S3：菌种实验培养基：将种子液以10%的接种量接入装有1L产油脂培养基的3L三角瓶中进行摇瓶发酵，在28℃和 180 rpm下振荡培养120h和设置6个不同碳氮比；
S4：确定碳氢比并培养菌种：根据培养环境的温度和湿度参数改变，制作相应的圆红冬孢酵母生长图，并找到拐点，记录碳氢比，将此碳氢比下的产油脂培养基重新接种圆红冬孢酵母菌体培养即可；
S5：酵母菌培养增殖方法，所述培养增殖方法采用酵母培养增殖装置进行，所述装置包括多个串联的环形管道式培养腔体(1)，相邻两培养腔体(1)之间的通路通过可开闭的第一挡板(2)控制开闭；所述培养腔体(1)包括外壁(11)和套设在外壁(11)内的内壁(12)；所述外壁(11)与内壁(12)之间设置有第一温度调节层(13)；所述外壁(11)和内壁(12)均为导热材料；所述第一温度调节层(13)包括密集排列的多个第一半导体制冷片(14)；所述培养腔体(1)内部中心沿其长度方向设置有空心的内温度调节棒(15)；所述内温度调节棒(15)内部填充有固-液相变材料(16)；所述内温度调节棒(15)可连通外界循环其内部的固-液相变材料(16)；所述固-液相变材料(16)的相变温度在酵母菌的安全温度范围内；所述内温度调节棒(15)外表面设置有第二温度调节层(17)；所述第二温度调节层(17)也包括密集排列的多个第二半导体制冷片(18)；所述内温度调节棒(15)棒体为导热材料；所述培养腔体(1)的外壁(11)上分别沿其切线方向设置有分别可开闭的用于补充所需无菌气体的进气管(3)以及用于补充所需培养液及菌体的进料管(4)。
2.根据权利要求1所述的一种圆红冬孢酵母培养方法，其特征在于，所述YPD斜面培养基包括蛋白胨、酵母粉、葡萄糖和琼脂。
3.根据权利要求1所述的一种圆红冬孢酵母培养方法，其特征在于，所述产油脂培养基包括MgSO4·7H2 O、KH2PO4、(NH4)2S04、CaCl2、FeCl3·6H2O、FeCl3·7H2O、MnSO4·H2O、酵母粉和葡萄糖，且其中酵母粉为调节碳氢比的物料。
4.根据权利要求1所述的一种圆红冬孢酵母培养方法，其特征在于，相邻两培养腔体(1)之间通过连接管(6)连通，所述连接管(6)同时与两培养腔体(1)的外壁(11)相切；所述第一挡板(2)铰接在前一道培养腔体(1)的出料口处，通过转动实现在闭合连接管(6)的同时使前一道培养腔体(1)保持循环通路，而在打开连接管(6)的同时使前一道培养腔体(1)的循环通路闭合。
5.根据权利要求4所述的一种圆红冬孢酵母培养方法，其特征在于，后一道培养腔体(1)的进料口处铰接有第二挡板(7)；所述第二挡板(7)通过转动实现在闭合连接管(6)的同时使后一道培养腔体(1)保持循环通路，而在打开连接管(6)的同时使后一道培养腔体(1)的循环通路闭合。
6.根据权利要求5所述的一种圆红冬孢酵母培养方法，其特征在于，所述第一挡板(2)为多孔结构，且表面蒙附有防水透气膜(21)；一抽气管(22)连通连接管(6)向外抽气使连接管(6)内保持负压。
7.根据权利要求6所述的一种圆红冬孢酵母培养方法，其特征在于，所述外壁(11)外表面均匀设置有多片环形导热片；所述环形导热片与外壁(11)长度方向垂直；所述内壁(12)内表面设置有螺旋膛线或圆滑凸起。
8.根据权利要求7所述的一种圆红冬孢酵母培养方法，其特征在于，多个培养腔体(1)整体上下分布。
9.根据权利要求8所述的一种圆红冬孢酵母培养方法，其特征在于，所述酵母培养增殖方法为：
①将初始酵母菌混合培养液通过进料管(4)以一定的速度注入培养腔体(1)中，同时以连续或脉冲的形式通过进气管(3)向培养腔体(1)内注入压缩的利于酵母菌培养的无菌气体，由于进气管(3)与进料管(4)均与培养腔体(1)相切，因此可使酵母菌混合培养液在培养腔体(1)内循环流动，同时内壁(12)内表面的螺旋膛线或圆滑凸起能够使混合培养液具有更强的紊流，促进酵母菌混合培养液的物质交换和气体溶解，便于其中的培养液和气体更新以及温度的均匀；培养腔体(1)中的多余气体和废弃穿过防水透气膜(21)和第一挡板(2)通过抽气管(22)抽出，从而保障培养腔体(1)中的气压稳定和气体新鲜度；
②通过第一半导体制冷片(14)和第二半导体制冷片(18)从内外两个方向同时对培养腔体(1)内的酵母菌混合培养液的温度进行精确的控制，以保障酵母菌高效的培养增殖，固-液相变材料(16)不仅可通过循环流动以及自身较大的比热容在突发情况下半导体制冷片故障或失效时快速的排除多余的热量，而且能够通过自身固-液相变特点自动平衡酵母菌混合培养液的温度，在一段时间内避免酵母菌大规模死亡；
③在设定培养时间达成后，第一挡板(2)和第二挡板(7)分别向前一道培养腔体(1)和后一道培养腔体(1)内旋转，使流动的酵母菌培养液在惯性作用下从上一道培养腔体(1)通过连接管(6)进入下一道培养腔体(1)内，完成后，第一挡板(2)和第二挡板(7)重新闭合，前一道培养腔体(1)继续注入新的酵母菌混合培养液或更之前一道培养腔体(1)的酵母菌混合培养液，后一道培养腔体(1)继续培养之前的酵母菌培养液，直至在进行N道培养后达成培养增殖目标后排出。
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