CN109370928A - 一种产朊假丝酵母及其制备方法 - Google Patents

一种产朊假丝酵母及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及真菌发酵技术领域，具体涉及一种产朊假丝酵母及其制备方法，所述产朊假丝酵母由含有冬虫夏草发酵营养液的培养基培养制备而成。以冬虫夏草发酵营养液为母液，加入碳源、氮源和无机盐得到培养液，对培养液进行灭菌处理，将产朊假丝酵母培养菌种接种到培养液中进行发酵培养即得。由于发酵冬虫夏草营养液中含有大量的碳源、氮源及一些代谢的有机成分是产朊假丝酵母良好的培养基，可以补充一部分产朊假丝酵母生长所需的营养物质，以发酵冬虫夏草营养液为母液培养产朊假丝酵母可以很大程度上节约培养基原料，最大限度的利用了冬虫夏草发酵营养液，提高了产品附加值，资源合理化利用。

Description

一种产朊假丝酵母及其制备方法
技术领域
本发明涉及真菌发酵技术领域，具体涉及一种产朊假丝酵母及其制备方法。
背景技术
产朊假丝酵母(Candida utilis)，又叫产朊圆酵母或食用圆酵母，是一种形 态结构简单，以芽殖为主的真菌，其有细胞较大，代谢旺盛，生长繁殖快，能 形成较好的絮体，易适用于多种不同的生物反应器，对环境适应性强等特点。 产朊假丝酵母的细胞呈圆形、椭圆形或腊肠形，以多边出芽方式进行无性繁殖， 形成假菌丝。
产朊假丝酵母是目前人类使用量较大的一种微生物。因产朊假丝酵母体内 含有丰富的蛋白质、脂质、糖和各种维生素等，以及发酵过程中会产生酶、辅 酶、核糖核酸、甾醇等和一些新陈代谢的中间产物而被广泛应用于食品、医药、 实验研究和畜牧业中。随着畜牧业的发展，保证家畜必需的蛋白饲料越来越缺 乏。饲料蛋白严重缺乏已引起人们的高度重视。由于单细胞蛋白饲料具有原料 来源丰富、生产周期短、生产效率高、生产不受季节气候制约及发酵生产占地 面积小等优点，而被作为饲料蛋白缺口的填补物受到广泛的研究。
目前，在单细胞蛋白的应用中，产朊假丝酵母主要应用于精饲料添加剂或 青贮饲料添加剂中，产朊假丝酵母为一种高产蛋白物生物，且其本身就是一株 动物肠道有益菌，对维持动物肠道菌群平衡和为动物提供营养物质、提高动物 日增重等方面有很好的应用价值。
目前，国内外未曾见到有关利用发酵冬虫夏草营养液生产产朊假丝酵母蛋 白饲料的有关报道。
发酵冬虫夏草经发酵过程分离菌丝所得的营养液富含大量营养物质，主要 组成为蛋白质、氨基酸、多糖等，目前没有综合开发利用，只当做肥料进行处 理，资源浪费较严重，产品附加值非常低，如果直接丢弃就更加浪费，而且会 造成环境污染，需要经过灭菌等特殊处理才可以排放，成本较高。这不仅浪费 了大量能源、人力、物力和财力，而且对环境存在安全隐患。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种产朊假丝酵母，该产朊假丝酵母 是由含有冬虫夏草发酵营养液的培养基培养制备而成，由于发酵冬虫夏草营养 液中含有大量的碳源、氮源及一些代谢的有机成分是产朊假丝酵母良好的培养 基，可以补充一部分产朊假丝酵母生长所需的营养物质，以发酵冬虫夏草营养 液为母液培养产朊假丝酵母可以很大程度上节约培养基原料；本发明利用冬虫 夏草发酵营养液培养产朊假丝酵母生产单细胞蛋白饲料添加剂，最大限度的利 用了冬虫夏草发酵营养液，提高产品附加值。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种产朊假丝酵母，所述产朊假丝酵母由含有冬虫夏草发酵营养液的培养 基培养制备而成。
进一步地，所述产朊假丝酵母由以下步骤制备得到：
(1)以冬虫夏草发酵营养液为母液，加入20～40g/L碳源，3～7g/L氮源和 1～3g/L无机盐，调节pH至4.5～7，得到培养液
(2)灭菌：对培养液进行灭菌处理；
(3)发酵：将产朊假丝酵母培养菌种以7％～10％的接种量接种到上述培养液 中，在25～35℃下发酵培养14～22h，即得。
优选地，所述产朊假丝酵母由以下步骤得到：
(1)以冬虫夏草发酵营养液为母液，加入40g/L碳源，5g/L氮源和1g/L无 机盐，调节pH至5.5，得到培养基；
(2)灭菌：对培养基进行灭菌处理；
(3)接种：将产朊假丝酵母培养菌种以7.5％接种量接入到上述培养基中在 28℃下发酵培养14h，即得。
优选地，所述碳源为菊糖，碳源为牛肉蛋白胨，无机盐为KH2PO4。
进一步地，所述产朊假丝酵母培养菌种由以下步骤制备得到：
1)菌种活化：将产朊假丝酵母冻干菌种用无菌水稀释打匀后制成原始菌液， 取原始菌液涂布于麦芽汁固体培养基上，在30～35℃下培养3～5天，挑取单菌落 接种于麦芽汁固体培养基斜面试管，待菌种长满整个试管斜面后转接一次，备 用；
2)从斜面培养基上挑取菌种，接种于发酵培养基中，摇匀，置于振荡培养箱 中摇床发酵培养，30～35℃摇床培养20～24h，转速为130～150r/min，形成产朊假 丝酵母培养菌种。
进一步地，所述发酵培养基为YPD培养基，其组成是葡萄糖2％，蛋白胨 2％，酵母浸粉1％，余量为蒸馏水。
进一步地，本发明所述的冬虫夏草发酵营养液是中国被毛孢菌种经液体深 层发酵培养所得培养物分离菌丝体后的发酵液。
优选地，所述的产朊假丝酵母可用于生产单细胞蛋白饲料添加剂。
与现有技术相比，本发明产朊假丝酵母及其制备方法具有以下优点：
(1)由于发酵冬虫夏草营养液中含有大量的碳源、氮源及一些代谢的有机成 分，是产朊假丝酵母良好的培养基。
(2)发酵冬虫夏草经发酵过程分离菌丝所得的营养液富含大量营养物质，主 要组成为蛋白质、氨基酸、多糖等，目前没有综合开发利用，只当做肥料进行 处理，资源浪费较严重，产品附加值非常低，如果直接丢弃就更加浪费，而且 会造成环境污染，需要经过灭菌等特殊处理才可以排放，成本较高，这不仅浪 费了大量能源、人力、物力和财力，而且对环境存在安全隐患。因此，本发明 制备产朊假丝酵母最大限度的利用了冬虫夏草发酵营养液，提高了产品附加值， 资源合理化利用。
(3)产朊假丝酵母的培养基及培养条件是影响产朊假丝酵母菌株能否生产出 高含量蛋白质的重要参数，通过多次实验，确定出最佳培养基和最佳培养条件， 可以获得最大酵母菌体量。
具体实施方式
为使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例进 一步阐述本发明。
一种产朊假丝酵母，所述产朊假丝酵母由含有冬虫夏草发酵营养液的培养 基培养制备而成。
进一步地，所述产朊假丝酵母由以下步骤制备得到：
(1)以冬虫夏草发酵营养液为母液，加入20～40g/L碳源，3～7g/L氮源和 1～3g/L无机盐，调节pH至4.5～7，得到培养液
(2)灭菌：对培养液进行灭菌处理；
(3)发酵：将产朊假丝酵母培养菌种以7％～10％的接种量接种到上述培养液 中，在25～35℃下发酵培养14～22h，即得。
优选地，所述产朊假丝酵母由以下步骤得到：
(1)以冬虫夏草发酵营养液为母液，加入40g/L碳源，5g/L氮源和1g/L无 机盐，调节pH至5.5，得到培养基；
(2)灭菌：对培养基进行灭菌处理；
(3)接种：将产朊假丝酵母培养菌种以7.5％的接种量接入到上述培养基中 在28℃下发酵培养14h，即得。
进一步地，所述碳源选自菊糖、葡萄糖和蔗糖中的任意一种或多种；所述 碳源选自牛肉蛋白胨、鱼蛋白胨、酵母浸粉和氯化铵中的任意一种或多种；所 述无机盐选自KH2PO4、NaCl、K2HPO4和CaCl2中的任意一种或多种。
优选地，所述碳源为菊糖，碳源为牛肉蛋白胨，无机盐为KH2PO4。
优选地，所述产朊假丝酵母培养菌种的接入量为7.5％。
进一步地，所述产朊假丝酵母培养菌种由以下步骤制备得到：
1)菌种活化：将产朊假丝酵母冻干菌种用无菌水稀释打匀后制成原始菌液， 取原始菌液涂布于麦芽汁固体培养基上，在30～35℃下培养3～5天，挑取单菌落 接种于麦芽汁固体培养基斜面试管，待菌种长满整个试管斜面后转接一次，备 用；
2)从斜面培养基上挑取菌种，接种于发酵培养基中，摇匀，置于振荡培养箱 中摇床发酵培养，30～35℃摇床培养20～24h，转速为130～150r/min，形成产朊假 丝酵母培养菌种。
进一步地，所述发酵培养基为YPD培养基，其组成是葡萄糖2％，蛋白胨 2％，酵母浸粉1％，余量为蒸馏水。
进一步地，本发明所述的冬虫夏草发酵营养液是中国被毛孢菌种经液体深 层发酵培养所得培养物分离菌丝体后的发酵液。
优选地，所述的产朊假丝酵母可用于生产单细胞蛋白饲料添加剂。
实施例1
接种所用的产朊假丝酵母培养菌种由以下步骤制备得到：
1)菌种活化：将产朊假丝酵母冻干菌种用无菌水稀释打匀后制成原始菌液， 取原始菌液涂布于麦芽汁固体培养基上，在30℃下培养5天，挑取单菌落接种 于麦芽汁固体培养基斜面试管，待菌种长满整个试管斜面后转接一次，备用；
2)从斜面培养基上挑取菌种，接种于YPD培养基中(葡萄糖2％，蛋白胨 2％，酵母浸粉1％，余量为蒸馏水)，摇匀，置于振荡培养箱中摇床发酵培养， 30℃摇床培养24h，转速为130r/min，形成产朊假丝酵母培养菌种。
实施例2
接种所用的产朊假丝酵母培养菌种由以下步骤制备得到：
1)菌种活化：将产朊假丝酵母冻干菌种用无菌水稀释打匀后制成原始菌液， 取原始菌液涂布于麦芽汁固体培养基上，在35℃下培养3天，挑取单菌落接种 于麦芽汁固体培养基斜面试管，待菌种长满整个试管斜面后转接一次，备用；
2)从斜面培养基上挑取菌种，接种于YPD培养基中(葡萄糖2％，蛋白胨 2％，酵母浸粉1％，余量为蒸馏水)，摇匀，置于振荡培养箱中摇床发酵培养， 35℃摇床培养20h，转速为150r/min，形成产朊假丝酵母培养菌种。
实施例3
本实施例提供一种产朊假丝酵母，所述产朊假丝酵母由含有冬虫夏草发酵 营养液的培养基培养制备而成，主要包括以下步骤：
培养基：该培养基以冬虫夏草发酵营养液为母液，加入40g/L菊糖，5g/L 牛肉蛋白胨和1g/L KH2PO4，调节pH至5.5，得到培养液；
灭菌：对培养液进行灭菌处理，待接种；
接种发酵：将实施例1中的产朊假丝酵母培养菌种以7.5％的接种量接种到 上述培养液中，在28℃下发酵培养14h，即得。
实施例4
本实施例提供一种产朊假丝酵母，所述产朊假丝酵母由含有冬虫夏草发酵 营养液的培养基培养制备而成，主要包括以下步骤：
培养基：该培养基以冬虫夏草发酵营养液为母液，加入20g/L菊糖，3g/L 牛肉蛋白胨和2g/L KH2PO4，调节pH至4.5，得到培养液；
灭菌：对培养液进行灭菌处理，待接种；
接种发酵：将实施例2中的产朊假丝酵母培养菌种以7.5％的接种量接种到 上述培养液中，在35℃下发酵培养14h，即得。
实施例5
本实施例提供一种产朊假丝酵母，所述产朊假丝酵母由含有冬虫夏草发酵 营养液的培养基培养制备而成，主要包括以下步骤：
培养基：该培养基以冬虫夏草发酵营养液为母液，加入20g/L菊糖和蔗糖， 3g/L牛肉蛋白胨和2g/L KH2PO4，调节pH至7，得到培养液；
灭菌：对培养液进行灭菌处理，待接种；
接种发酵：将实施例1中产朊假丝酵母培养菌种以10％的接种量接种到上 述培养液中，在25℃下发酵培养22h，即得。
实施例6最佳培养温度确定
将产朊假丝酵母培养菌种以10.00％的接种量接入发酵培养基，菊糖质量浓 度为20g/L，牛肉蛋白胨质量浓度为5g/L，KH2PO4质量浓度为2g/L，以发酵 冬虫夏草营养液为母液，装液量100/250mL，pH值6，分别在26℃、28℃、30℃、 32℃、34℃温度条件下，150r/min振荡培养20小时，测定此时培养液的OD600值，确定最佳培养温度。
随着培养温度的不断升高，OD600值先增高后降低，在培养温度达到28℃时， 菌体最多，OD600达到最大值，因此当培养温度为28℃时，酵母菌的菌体量达到 最大。
实施例7最佳培养基pH值确定
将酵母培养菌液以10.00％的接种量接入发酵培养基，蔗糖质量浓度为20 g/L，牛肉蛋白胨质量浓度为5g/L，KH2PO4质量浓度为2g/L，以发酵冬虫夏草 营养液为母液，装液量100/250mL，pH值分别为4.5、5.5、6.0、6.5、7.0时， 30℃，150r/min振荡培养20小时，测定此时培养液的OD600值(，确定最佳 培养温度。
培养pH值不同，将直接影响产朊假丝酵母生长效果。随着pH值的不断升 高，OD600值先增高后降低，在pH值达到5.5时，OD600达到最大值，因此当pH 值为5.5时，酵母菌的菌体量达到最大。
实施例8最佳菌种接种量确定
将酵母培养菌液分别以2.50％、5.00％、7.50％、10.00％、12.50％的接种量 接入发酵培养基，蔗糖质量浓度为20g/L，牛肉蛋白胨质量浓度为5g/L，KH2PO4质量浓度为2g/L，以发酵冬虫夏草营养液为母液，装液量100/250mL，pH值6， 30℃，150r/min振荡培养20小时，测定此时培养液的OD600值，确定最佳接种 量。
接种量不同，将直接影响产朊假丝酵母生长效果。随着接种量的不断增大， OD600值先增大后降低，在接种量达到7.50％时，OD600达到最大值，因此当接 种量为7.50％时，酵母菌的菌体量达到最大。
实施例9：产朊假丝酵母10L罐发酵培养验证
本实施例以实验得出的最佳培养基以及最佳培养条件为依据进行产朊假丝 酵母10L罐发酵培养验证，着重研究产朊假丝酵母在最佳培养条件下培养获得 的干物质量以及粗蛋白含量，具体如下：
1.实验材料
菌种来源：
实验所用产朊假丝酵母为购买的菌种。
培养基及培养条件为：
菊糖40g/L，牛肉蛋白胨5g/L，KH2PO4质量浓度1g/L，以发酵冬虫夏草 营养液为母液，装液量7/10L，培养液pH为5.5，发酵温度为28℃。
2.实验方法
2.1菌种活化及种子培养
(1)菌种活化
将冻干菌种用1ml无菌水稀释打匀后制成原始菌液，吸取原始菌液100μl 涂布于麦芽汁固体培养基上，30℃培养箱培养3天，挑取单菌落接种于麦芽汁 固体培养基斜面试管，待菌种长满整个试管斜面后转接一次备用。
(2)菌种培养
发酵培养基制备：YPD培养基(葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母浸粉1％， 蒸馏水)，装入三角瓶的1/2，制备好的培养基进行高压蒸汽灭菌冷却待接种；
从复壮传代的斜面培养基上挑取一环菌体，置入100ml已制备完毕的液体 培养基中，摇匀。置于振荡培养箱中摇床培养，培养条件为30℃，转速为130 r/min，培养时间为24小时，形成接种菌种。
2.2 10L罐初始发酵实验
在10L发酵罐实验中，本着节约实验成本的原则，发酵罐装液量控制在7L。 初始发酵试验条件为：接种量7.5％，发酵温度28℃，通气量设定为4L/min(同 摇床转速200r/min)，罐压0.03～0.05Mpa，初始pH 5.5，培养14h。
2.3干物质含量的测定
取其中2L的发酵液盛托盘于鼓风干燥箱中在60℃下干燥过夜，直至发酵液 浓缩干燥成干物质，称量干物质重量，粉碎、研末，测定粗蛋白、水分、粗灰 分含量。
3.结果与分析
产朊假丝酵母10L发酵罐培养结果：测得OD600值为1.084，平均干物质量13.57g/L，计算可获得最终干物质含量为95g。
检测粗蛋白、水分、灰分含量如下表1所示：
表1干物质检测指标
分析：产朊假丝酵母10L罐发酵培养实验验证了摇瓶培养实验获得的培养 基及培养条件切实可行，通过实验可获得平均干物质量13.57g/L，检测粗蛋白、 水分、粗灰分含量分别为48.12％、3.29％、4.12％。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施 方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进 行多种变换，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征和 步骤，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必 要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不 违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (9)

1.一种产朊假丝酵母，其特征在于：所述产朊假丝酵母由含有冬虫夏草发酵营养液的培养基培养制备而成。
2.根据权利要求1所述的一种产朊假丝酵母，其特征在于：所述产朊假丝酵母由以下步骤制备得到：
(1)以冬虫夏草发酵营养液为母液，加入20～40g/L碳源，3～7g/L氮源和1～3g/L无机盐，调节pH至5～6，得到培养液
(2)灭菌：对培养液进行灭菌处理；
(3)发酵：将产朊假丝酵母培养菌种以7％～10％的接种量接种到上述培养液中，在27～30℃下发酵培养14～22h，即得。
3.根据权利要求2所述的一种产朊假丝酵母，其特征在于：所述产朊假丝酵母由以下步骤得到：
(1)以冬虫夏草发酵营养液为母液，加入40g/L碳源，5g/L氮源和1g/L无机盐，调节pH至5.5，得到培养基；
(2)灭菌：对培养基进行灭菌处理；
(3)接种：将产朊假丝酵母培养菌种以7.5％的接种量接种到上述培养基中在28℃下发酵培养14h，即得。
4.根据权利要求2～3任一项所述的一种产朊假丝酵母，其特征在于：所述碳源选自菊糖、葡萄糖和蔗糖中的任意一种或多种；所述碳源选自牛肉蛋白胨、鱼蛋白胨、酵母浸粉和氯化铵中的任意一种或多种；所述无机盐选自KH2PO4、NaCl、K2HPO4和CaCl2中的任意一种或多种。
5.根据权利要求4所述的一种产朊假丝酵母，其特征在于：所述碳源为菊糖，碳源为牛肉蛋白胨，无机盐为KH2PO4。
6.根据权利要求2～3任一项所述的一种产朊假丝酵母，其特征在于：所述产朊假丝酵母培养菌种由以下步骤制备得到：
1)菌种活化：将产朊假丝酵母冻干菌种用无菌水稀释打匀后制成原始菌液，取原始菌液涂布于麦芽汁固体培养基上，在30～35℃下培养3～5天，挑取单菌落接种于麦芽汁固体培养基斜面试管，待菌种长满整个试管斜面后转接一次，备用；
2)从斜面培养基上挑取菌种，接种于发酵培养基中，摇匀，置于振荡培养箱中摇床发酵培养，30～35℃摇床培养20～24h，转速为130～150r/min，形成产朊假丝酵母培养菌种。
7.根据权利要求6所述的一种产朊假丝酵母，其特征在于：所述发酵培养基为YPD培养基。
8.根据权利要求1所述的一种产朊假丝酵母，其特征在于：所述冬虫夏草发酵营养液是中国被毛孢菌种经液体深层发酵培养所得培养物分离菌丝体后的发酵液。
9.权利要求1所述的产朊假丝酵母在蛋白饲料中的应用。
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