CN105969709A - 一种重组大肠杆菌菌株及用其制备番茄红素的方法 - Google Patents
一种重组大肠杆菌菌株及用其制备番茄红素的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105969709A CN105969709A CN201610292894.5A CN201610292894A CN105969709A CN 105969709 A CN105969709 A CN 105969709A CN 201610292894 A CN201610292894 A CN 201610292894A CN 105969709 A CN105969709 A CN 105969709A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fermentation
- lycopene
- medium
- seed
- glucose
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
- C12P5/007—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons containing one or more isoprene units, i.e. terpenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
- C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
- C12Y205/01029—Geranylgeranyl diphosphate synthase (2.5.1.29)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供一种利用重组大肠杆菌高密度培养生物转化生产番茄红素的方法,属于微生物发酵领域。本方法所用的种子培养基和发酵培养基均为化学成分确定的培养基,培养基成本低廉,不含有任何有机态氮源。本方法采用菌体生长和诱导转化期脱偶联的生物转化法生产番茄红素,有效保证了较快的菌体生长速度,节省了生产的时间成本。利用本发明的发酵培养基和方法高密度培养大肠杆菌,并通过诱导、转化,以葡萄糖为底物生产番茄红素,菌体密度(OD600nm)和番茄红素产量分别达到200和3.2g/L发酵液,发酵周期36小时。
Description
技术领域:
本发明涉及一种大肠杆菌(Escherichia coli)的新菌株及通过高密度培养该菌株制备生产番茄红素的方法,属于微生物发酵领域。
背景技术:
高密度培养(HCDC)即高密度发酵,一般指培养液中工程菌的菌体干重浓度达到50g/L以上,对工程大肠杆菌而言,其OD600nm值达到150以上。与传统微生物发酵培养相比,高密度培养具有菌体密度高,产物的细胞水平量高,单位体积设备的生产能力高,生物量的分离费用低,生产周期短,生产效率高等优点。但随着菌体密度增加,也会随之出现一些问题,例如培养物中溶氧不足;代谢产物乙酸的堆积对菌体生长和外源蛋白表达的抑制;工程菌质粒稳定性下降;底物浓度对细胞增长存在的抑制性作用等。
番茄红素(Lycopene)是一种多元不饱和碳氢化合物,属于类胡萝卜素家族,是一种抗氧化剂,它是构成番茄红色色素的主要成分。番茄红素在医药、食品以及化妆品领域有重要的应用,比如它具有防病抗癌、增强机体免疫力和抗衰老的生理功能,可有效防止“自由基”对人体造成的伤害。番茄红素无毒无害,可以添加到食品中,以增加食品的营养价值。近年来,番茄红素相关的产品研发已成为国际上新药研究的热点。
目前国际上番茄红素的生产主要有天然提取、化学合成和微生物发酵法等。番茄中番茄红素的含量很低,利用天然提取法生产番茄红素不仅产量低,而且价格昂贵,无法满足市场需求;化学合成法以紫罗酮作为原料,虽价格比天然提取法低廉,但有中间产物残留,其中不安全因素较多,如毒性和致癌性。而微生物发酵法具有成本低、反应条件温和、产率高、易于大规模培养、环境友好等优点。随着生物工程领域相关技术的快速发展,利用微生物发酵生产番茄红素已成为目前的研究热点之一。
微生物发酵法生产番茄红素所用的菌株分为野生微生物菌株和代谢工程菌株两类。野生微生物菌株以三孢布拉霉(Blakeslea trispora)为主,最高产量约为3.7g/L,但霉菌生产周期较长,生产的时间成本较高。代谢工程菌以工程大肠杆菌(Escherichia coli)为主,利用基因工程的方法,以微生物内源或外源的MEP途径或者外源的MVA途径合成IPP和DMAPP,再引入外源的CrtE、CrtB和CrtI基因,最终合成番茄红素。
发明内容
本发明人已做过广泛的研究,以提供一种通过发酵以工业规模实现制备番茄红素的方法。
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种大肠杆菌菌株(Escherichia coli),该菌株生产周期较短,生产的时间成本较低。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种高密度培养方法,该方法能实现高菌体密度、高外源蛋白表达量、高目标产物产量。
本发明提供了一种高密度培养工程大肠杆菌生物转化生产番茄红素的方法。本方法有如下优势:
(1)所用的种子培养基和发酵培养基均为化学成分确定的培养基,该培养基成本低廉,不含有任何有机态氮源,如酵母浸提物、蛋白胨等。
(2)本方法采用菌体生长期和诱导、转化期脱偶联的生物转化法生产番茄红素,有效保证了较快的菌体生长速度,节省了生产的时间成本。
(3)本方法在菌体生长期采用了指数补料‐恒速补料相结合的分段补料方式,既保证了菌体生长所需营养的供给,又可根据发酵设备的自身限制最大限度地保证发酵液中氧气的供应,菌体密度(OD600nm)达到200。
(4)利用本发明的发酵培养基和方法高密度培养大肠杆菌,并通过诱导、转化,以葡萄糖为底物生产番茄红素,菌体密度(OD600nm)和番茄红素产量分别达到200和3.2g/L发酵液,发酵周期36小时。
本发明的重组大肠埃希氏菌(Escherichia coli)菌株Mva‐10‐Yk,已于2016年3月11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏号为:CGMCC No.12203,保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的高密度培养的培养基,其中包括种子培养基、发酵培养基和补料培养基。
所述的种子培养基,按g/L记,包括:柠檬酸1.1‐2;磷酸二氢钾9‐15.2;磷酸氢二铵2‐4;七水合硫酸镁0.1‐1.5;葡萄糖2‐5;硫酸链霉素0.05‐2;硫酸卡那霉素0.05‐1.5。
所述种子培养基中的七水合硫酸镁和葡萄糖需要分别单独灭菌后与其他成分混合。
所述种子培养基中的硫酸链霉素和硫酸卡那霉素需分别单独用无菌滤膜过滤灭菌后与其他成分混合。
所述种子培养基在灭菌之前需用浓度为5M的氨水调节pH至6.5‐7.5。
所述发酵培养基,按g/L记,包括:柠檬酸1.1‐2.0;磷酸二氢钾9‐15.2;磷酸氢二铵2‐4;七水合硫酸镁0.1‐1.5;葡萄糖10‐25;以及维生素B1 3‐10mg/L;微量元素I 10‐20ml/L;聚醚类消泡剂0.1‐2ml/L。
所述发酵培养基中的微量元素I,包括:800‐1000mg/L乙二胺四乙酸二钠,100‐250mg/L六水合氯化钴,1500‐2500mg/L四水合氯化亚锰,90‐150mg/L二水合氯化铜,200‐500mg/L硼酸,250‐400mg/L二水合钼酸钠,1000‐2500mg/L二水合乙酸锌,5‐10g/L柠檬酸铁。
所述发酵培养基中的七水合硫酸镁和葡萄糖需要分别单独灭菌后与其他成分混合。
所述发酵培养基中的维生素B1,微量元素I,需分别单独用无菌滤膜过滤灭菌后与其他成分混合。
所述补料培养基中,包括:葡萄糖400‐600g/L;七水合硫酸镁1.0‐2.0g/L;微量元素II 10‐20ml/L。
所述补料培养基中的微量元素II,包括:900‐1200mg/L乙二胺四乙酸二钠,400‐600mg/L六水合氯化钴,1200‐2400mg/L四水合氯化亚锰,100‐300mg/L二水合氯化铜,200‐500mg/L硼酸,300‐250mg/L二水合钼酸钠,1500‐2500mg/L二水合乙酸锌,1‐4g/L柠檬酸铁。
所述补料培养基中的葡萄糖和七水合硫酸镁需要分别单独灭菌后与其他成分混合。
所述发酵培养基中的微量元素II,需单独用无菌滤膜过滤灭菌后与其他成分混合。
本发明提供的一种应用所述培养基高密度培养重组大肠杆菌生物转化生产番茄红素的方法。
所述的高密度培养,是指菌体增长阶段与诱导、转化阶段脱偶联的培养方式,具体地,该方法包括种子培养阶段,菌体增长阶段,诱导转化阶段。
所述高密度培养中的种子培养阶段,是指将冻存的菌种以1‐5%的接种量,接种到装有20‐100ml种子培养基的500ml三角瓶;于摇床30‐39℃,180‐280rpm的条件下培养5‐12小时得到一级种子;再将一级种子以2‐10%的接种量,接种到装有20‐100ml种子培养基的500ml三角瓶;于摇床30‐39℃,180‐280rpm的条件下培养5‐12小时得到二级种子,二级种子的OD600nm为1.5‐4.0。
所述高密度培养中的菌体增长阶段,是指将二级种子以2%‐10%的接种量接种到发酵培养基装液量为30‐60%的发酵罐中,发酵罐通气量为1‐5vvm,转速为200‐1200rpm,溶氧控制在15‐35%,溶氧偶联转速,pH为6.5‐7.5,以浓度为5‐10M氨水控制pH,培养温度为29‐39℃;发酵时间为5‐8h时,发酵液中初始葡萄糖耗尽,立即启动补料培养基的补料,补料速率分布在7‐28ml/(L·h),从补料起始时间开始,每2‐5h取出少量发酵液,测量其OD600nm,直至发酵时间为18‐25h,发酵液OD600nm的增长速率减慢,该时间点OD600nm为160‐185。
所述菌体增长阶段的补料速率是指采用指数补料‐恒速补料相结合的方式,具体地,以7‐10ml/(L·h)起始,并以每小时1.05‐1.35的倍率增长,模拟指数 补料;直至发酵罐转速和通气量达到上限时,补料速率不再增加,并维持该时刻补料速率不变,进行恒速补料。
所述的诱导转化阶段,是指菌体增长阶段结束后,向发酵液中加入终浓度为0.002‐0.2%的L‐阿拉伯糖,调整补料速率,诱导生产番茄红素的相关酶表达,并以补料培养基中的葡萄糖为底物,生物转化产生番茄红素。
所述诱导转化阶段的的调整补料速率,包括将补料速率调整至15‐30ml/(L·h),进入诱导转化期6小时后,番茄红素产量明显增加,补料速率按每小时0.4‐0.9倍的倍率减慢,直至发酵时间达到36小时放罐。
产物番茄红素的检测方法:
发酵过程中可留取发酵液样品于‐20℃保存,用于产物检测。
样品化冻后摇匀,取发酵液样品离心8000rpm,5min后弃上清,将沉淀震荡散开,向沉淀中加入等体积丙酮,充分萃取30min。12000rpm离心5min,测定其474nm吸光值。
番茄红素浓度与A474nm的标准曲线如图1所示。
利用本方法,发酵结束时菌体密度(OD600nm)和番茄红素产量分别达到150‐200和2.4‐3.2g/L发酵液,发酵周期36小时。其生物量和产物体积产量随发酵时间的变化曲线如图2所示。
附图说明:
图1番茄红素标准曲线图
图2生长曲线及产物曲线图
具体实施方式:
实施例1
重组大肠杆菌高密度培养的培养基制备
种子培养基,按g/L记,包括:柠檬酸1.7;磷酸二氢钾13;磷酸氢二铵4;七水合硫酸镁1.0;葡萄糖5;硫酸链霉素0.05;硫酸卡那霉素0.05。
所述种子培养基中的七水合硫酸镁和葡萄糖需要分别单独灭菌后与其他成分混合。
所述种子培养基中的硫酸链霉素和硫酸卡那霉素需分别单独用无菌滤膜过滤灭菌后与其他成分混合。
所述种子培养基在灭菌之前需用浓度为5M的氨水调节pH至7.0。
发酵培养基,按g/L记,包括:柠檬酸1.7;磷酸二氢钾15;磷酸氢二铵4;七水合硫酸镁0.9;葡萄糖20;以及维生素B1 5mg/L;微量元素I 10ml/L;聚醚类消泡剂0.5ml/L。
所述发酵培养基中的微量元素I,包括:800mg/L乙二胺四乙酸二钠,100mg/L六水合氯化钴,1500mg/L四水合氯化亚锰,90mg/L二水合氯化铜,200mg/L硼酸,250mg/L二水合钼酸钠,1000mg/L二水合乙酸锌,5g/L柠檬酸铁。
所述发酵培养基中的七水合硫酸镁和葡萄糖需要分别单独灭菌后与其他成分混合。
所述发酵培养基中的维生素B1,微量元素I,需分别单独用无菌滤膜过滤灭菌后与其他成分混合。
所述补料培养基中,包括:葡萄糖600g/L;七水合硫酸镁1.0g/L;微量元素II 10ml/L。
所述补料培养基中的微量元素II,包括:900mg/L乙二胺四乙酸二钠,400mg/L六水合氯化钴,1200mg/L四水合氯化亚锰,100mg/L二水合氯化铜,200mg/L硼酸,300mg/L二水合钼酸钠,1500mg/L二水合乙酸锌,1g/L柠檬酸铁。
所述补料培养基中的葡萄糖和七水合硫酸镁需要分别单独灭菌后与其他成分混合。
所述发酵培养基中的微量元素II,需单独用无菌滤膜过滤灭菌后与其他成分混合。
实施例2
重组大肠杆菌高密度培养的种子液制备
重组大肠埃希氏菌(Escherichia coli)菌株Mva‐10‐Yk,已于2016年3月11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为:CGMCC No.12203。
高密度培养中的种子培养阶段,是指将冻存的菌种以1%的接种量,接种到装有50ml种子培养基的500ml三角瓶;于摇床37℃,280rpm的条件下培养8小时得到一级种子;再将一级种子以4%的接种量,接种到装有100ml种子培养基的500ml三角瓶;于摇床37℃,280rpm的条件下培养6小时得到二级种子,二级种子的OD600nm为1.5‐2.5。
实施例2中所述的种子培养为:
种子培养基,按g/L记,包括:柠檬酸1.7;磷酸二氢钾13;磷酸氢二铵4;七水合硫酸镁1.0;葡萄糖5;硫酸链霉素0.05;硫酸卡那霉素0.05。
所述种子培养基中的七水合硫酸镁和葡萄糖需要分别单独灭菌后与其他成分混合。
所述种子培养基中的硫酸链霉素和硫酸卡那霉素需分别单独用无菌滤膜过滤灭菌后与其他成分混合。
所述种子培养基在灭菌之前需用浓度为5M的氨水调节pH至7.0。
发酵培养基,按g/L记,包括:柠檬酸1.7;磷酸二氢钾15;磷酸氢二铵4;七水合硫酸镁0.9;葡萄糖20;以及维生素B1 5mg/L;微量元素I 10ml/L;聚醚类消泡剂0.5ml/L。
所述发酵培养基中的微量元素I,包括:800mg/L乙二胺四乙酸二钠,100mg/L六水合氯化钴,1500mg/L四水合氯化亚锰,90mg/L二水合氯化铜, 200mg/L硼酸,250mg/L二水合钼酸钠,1000mg/L二水合乙酸锌,5g/L柠檬酸铁。
所述发酵培养基中的七水合硫酸镁和葡萄糖需要分别单独灭菌后与其他成分混合。
所述发酵培养基中的维生素B1,微量元素I,需分别单独用无菌滤膜过滤灭菌后与其他成分混合。
所述补料培养基中,包括:葡萄糖600g/L;七水合硫酸镁1.0g/L;微量元素II 10ml/L。
所述补料培养基中的微量元素II,包括:900mg/L乙二胺四乙酸二钠,400mg/L六水合氯化钴,1200mg/L四水合氯化亚锰,100mg/L二水合氯化铜,200mg/L硼酸,300mg/L二水合钼酸钠,1500mg/L二水合乙酸锌,1g/L柠檬酸铁。
所述补料培养基中的葡萄糖和七水合硫酸镁需要分别单独灭菌后与其他成分混合。
所述发酵培养基中的微量元素II,需单独用无菌滤膜过滤灭菌后与其他成分混合。
实施例3
重组大肠杆菌高密度培养的菌体增长阶段调控方法
高密度培养中的菌体增长阶段,是指将二级种子以10%的接种量接种到发酵培养基装液量为40%的发酵罐中,发酵罐通气量为1‐3vvm,转速为300‐1200rpm,溶氧控制在20‐30%,溶氧偶联转速,pH为6.8‐7.2,以浓度为5M氨水控制pH,培养温度为37℃;当发酵时间为8h时,发酵液溶氧瞬间上升,即发酵液中初始葡萄糖耗尽,立即启动补料培养基的补料,补料速率从8ml/(L·h)起始,随之以指数补料‐恒速补料相结合的方式调控。,从补料起始时间开始,每2‐5h取出少量发酵液,测量其OD600nm,直至发酵时间为21h,发酵液OD600nm的增长速率减慢,该时间点OD600nm为180。
所述菌体增长阶段的补料速率是指采用指数补料‐恒速补料相结合的方式,具体地,以8ml/(L·h)起始,并以每小时1.2的倍率增长,模拟指数补料;直至发酵罐转速和通气量达到上限时,补料速率不再增加,并维持该时刻补料速率不变,进行恒速补料。
实施例4
重组大肠杆菌高密度培养生物转化生产番茄红素的诱导转化阶段
以实施例3所描述的方法,菌体增长阶段结束后,向发酵液中加入终浓度为0.02%的L‐阿拉伯糖,调整补料速率,诱导生产番茄红素的相关酶表达,并以补料培养基中的葡萄糖为底物,生物转化产生番茄红素。
所述诱导转化阶段的的调整补料速率,是将补料速率调整至25ml/(L·h),进入诱导转化期6小时后,番茄红素产量明显增加,补料速率按每小时0.7倍的倍率减慢,直至发酵时间达到36小时放罐。
产物番茄红素的检测方法:
发酵过程中可留取发酵液样品于‐20℃保存,用于产物检测。
样品化冻后摇匀,取发酵液样品离心8000rpm,5min后弃上清,将沉淀震荡散开,向沉淀中加入等体积丙酮,充分萃取30min。12000rpm离心5min,测定其474nm吸光值。
发酵结束时菌体密度(OD600nm)和番茄红素产量分别达到200和3.2g/L发酵液,发酵周期36小时。
Claims (14)
1.一种重组大肠杆菌(Escherichia coli)菌株Mva‐10‐Yk,该菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏号CGMCC No.12203。
2.一种用重组大肠杆菌菌株制备番茄红素的方法,其特征在于,在高密度培养基中培养重组大肠杆菌的种子培养阶段、菌体增长阶段和诱导转化阶段。
3.根据权利要求2所述的高密度培养基,其特征包括:种子培养基、发酵培养基、补料培养基。
4.根据权利要求3所述的种子培养基,其特征包括:柠檬酸1.1‐2g/L;磷酸二氢钾9‐15.2g/L;磷酸氢二铵2‐4g/L;七水合硫酸镁0.1‐1.5g/L;葡萄糖2‐5g/L;硫酸链霉素0.05‐2g/L;硫酸卡那霉素0.05‐1.5g/L。
5.根据权利要求3所述的种子培养基,其特征在于:在灭菌之前需用浓度为5M的氨水调节pH至6.5‐7.5。
6.根据权利要求3所述的发酵培养基,其特征包括:柠檬酸1.1‐2.0g/L;磷酸二氢钾9‐15.2g/L;磷酸氢二铵2‐4g/L;七水合硫酸镁0.1‐1.5g/L;葡萄糖10‐25g/L;以及维生素B1 3‐10mg/L;微量元素I 10‐20ml/L;聚醚类消泡剂0.1‐2ml/L。
7.根据权利要求6所述的微量元素I,其特征包括:800‐1000mg/L乙二胺四乙酸二钠,100‐250mg/L六水合氯化钴,1500‐2500mg/L四水合氯化亚锰,90‐150mg/L二水合氯化铜,200‐500mg/L硼酸,250‐400mg/L二水合钼酸钠,1000‐2500mg/L二水合乙酸锌,5‐10g/L柠檬酸铁。
8.根据权利要求3所述的补料培养基,其特征在于:葡萄糖400‐600g/L;七水合硫酸镁1.0‐2.0g/L;微量元素II 10‐20ml/L。
9.根据权利要求8所述的微量元素II,其特征在于:900‐1200mg/L乙二胺四乙酸二钠,400‐600mg/L六水合氯化钴,1200‐2400mg/L四水合氯化亚锰,100‐300mg/L二水合氯化铜,200‐500mg/L硼酸,300‐250mg/L二水合钼酸钠,1500‐2500mg/L二水合乙酸锌,1‐4g/L柠檬酸铁。
10.根据权利要求2所述的种子培养阶段,其特征在于:将冻存的菌种以1‐5%的接种量,接种到装有20‐100ml种子培养基的500ml三角瓶;于摇床30‐39℃,180‐280rpm的条件下培养5‐12小时得到一级种子;再将一级种子以2‐10%的接种量,接种到装有20‐100ml种子培养基的500ml三角瓶;于摇床30‐39℃,180‐280rpm的条件下培养5‐12小时得到二级种子,二级种子的OD600nm为1.5‐4.0。
11.根据权利要求2所述的菌体增长阶段,其特征在于:将二级种子以2%‐10%的接种量接种到发酵培养基装液量为30‐60%的发酵罐中,发酵罐通气量为1‐5vvm,转速为200‐1200rpm,溶氧控制在15‐35%,溶氧偶联转速,pH为6.5‐7.5,以浓度为5‐10M氨水控制pH,培养温度为29‐39℃;发酵时间为5‐8h时,发酵液中初始葡萄糖耗尽,立即启动补料培养基的补料,补料速率分布在7‐28ml/(L·h),采用指数补料‐恒速补料相结合的方式进行;从补料起始时间开始,每2‐5h取出少量发酵液,测量其OD600nm,直至发酵时间为18‐25h,发酵液OD600nm的增长速率下降,该时间点OD600nm为160‐185。
12.根据权利要求11所述的指数补料‐恒速补料相结合的方式补料,其特征在于:以7‐10ml/(L·h)起始,并以每小时1.05‐1.35的倍率增长,模拟指数补料;直至发酵罐转速和通气量达到上限时,补料速率不再增加,并维持该时刻补料速率不变,进行恒速补料。
13.根据权利要求2所述的诱导转化阶段,其特征在于:菌体增长阶段结束后,向发酵液中加入终浓度为0.002‐0.2%的L‐阿拉伯糖,调整补料速率,诱导生产番茄红素的相关酶表达,并以补料培养基中的葡萄糖为底物,生物转化产生番茄红素。
14.根据权利要求13所述的调整补料速率,其特征在于:将补料速率调整至15‐30ml/(L·h),进入诱导转化期6小时后,番茄红素产量明显增加,补料速率按每小时0.4‐0.9倍的倍率减慢,直至发酵时间达到36小时放罐。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2016101846577 | 2016-03-28 | ||
CN201610184657 | 2016-03-28 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105969709A true CN105969709A (zh) | 2016-09-28 |
Family
ID=56992719
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201610292894.5A Pending CN105969709A (zh) | 2016-03-28 | 2016-05-05 | 一种重组大肠杆菌菌株及用其制备番茄红素的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN105969709A (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107119033A (zh) * | 2017-05-02 | 2017-09-01 | 中国科学院微生物研究所 | 一种用重组大肠杆菌菌株制备麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法 |
CN110777100A (zh) * | 2019-11-29 | 2020-02-11 | 宁波酶赛生物工程有限公司 | 一种大肠杆菌发酵方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103243066A (zh) * | 2013-05-30 | 2013-08-14 | 武汉大学 | 一种生产番茄红素的菌株及其应用 |
CN103740633A (zh) * | 2014-01-22 | 2014-04-23 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一株生产番茄红素的重组菌及其应用 |
-
2016
- 2016-05-05 CN CN201610292894.5A patent/CN105969709A/zh active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103243066A (zh) * | 2013-05-30 | 2013-08-14 | 武汉大学 | 一种生产番茄红素的菌株及其应用 |
CN103740633A (zh) * | 2014-01-22 | 2014-04-23 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一株生产番茄红素的重组菌及其应用 |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107119033A (zh) * | 2017-05-02 | 2017-09-01 | 中国科学院微生物研究所 | 一种用重组大肠杆菌菌株制备麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法 |
CN110777100A (zh) * | 2019-11-29 | 2020-02-11 | 宁波酶赛生物工程有限公司 | 一种大肠杆菌发酵方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102787158B (zh) | 一种发酵法生产天然β-胡萝卜素的方法和应用 | |
CN103255093A (zh) | 一种嗜酸乳杆菌的制备方法 | |
CN105087680A (zh) | 一种乳酸菌发酵培养基及高产量生产乳酸的工艺 | |
CN105506048B (zh) | 一种利用三孢布拉霉菌制备β-胡萝卜素的发酵方法 | |
CN102771314A (zh) | 培育富硒北冬虫夏草的方法 | |
CN101555454B (zh) | 一种同步式提高异养小球藻的生物量和叶黄素的方法 | |
CN102132881A (zh) | 一种灵芝稻谷食品的制备方法 | |
CN105441525A (zh) | 一种通过共培养提高以蔗糖为碳源下红球藻虾青素产率的方法 | |
CN103276019B (zh) | 一种促进三孢布拉氏霉菌中番茄红素合成的方法 | |
CN110301299A (zh) | 一种制备富硒酵母和利用富硒酵母生产液体菌种种植富硒食用菌的方法 | |
CN111560321A (zh) | 一种海洋红酵母高效发酵工艺 | |
CN101812497A (zh) | 一种虾青素的工业制备方法 | |
CN114729297B (zh) | 一种异养培养雨生红球藻生产虾青素的方法 | |
CN110272849A (zh) | 可显著提高钝顶螺旋藻生长速度和营养物质含量的方法 | |
CN105969709A (zh) | 一种重组大肠杆菌菌株及用其制备番茄红素的方法 | |
CN103966271A (zh) | 发酵生产dha的方法 | |
CN103396953B (zh) | 一种分阶段补料法培养小球藻的方法 | |
CN113046253A (zh) | 一种提高马克斯克鲁维酵母耐热性的培养方法 | |
CN103911419A (zh) | 一种双菌株联合发酵生产l-缬氨酸的方法 | |
CN114561304B (zh) | 一种提升红法夫酵母菌株产虾青素的发酵工艺 | |
CN109609385A (zh) | 一种雨生红球藻的培养方法 | |
CN101838667B (zh) | 一种三孢布拉氏霉菌发酵生产番茄红素的方法 | |
CN103798523A (zh) | 一种同源性瘤胃微生态调控剂的制备方法及应用 | |
CN108998493B (zh) | 一种高产虾青素发酵培养基的配方技术及应用 | |
CN105803034B (zh) | 一种利用植物生长调节剂naa诱导淡水蛋白核小球藻zf藻株高效积累类胡萝卜素的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160928 |