CN101838667B - 一种三孢布拉氏霉菌发酵生产番茄红素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了基于三孢布拉氏霉菌生物学特性的罐批发酵方法，该方法包括母种的茄子瓶斜面培养、种液的15L-150L-1500L种子罐扩大培养、正负菌1∶10混合的10m3发酵罐发酵培养。优选地，在番茄红素的罐批发酵的步骤中还包括将孢子囊用已灭菌的生理盐水洗脱接入一级种子培养基的接种方式，发酵结束番茄红素的产量在800mg/L。本发明还提供基于番茄红素理化特性的后提取方法，该方法包括发酵产物的预处理、番茄红素的提取、浓缩、结晶、脱溶的步骤。优选地，在番茄红素后提取的步骤中还包括三次循环提取和三步脱溶的步骤，三次循环提取后番茄红素的提取率在85％以上，三步脱溶后番茄红素的溶剂残留量可控制在50ppm以内。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物发酵生产番茄红素的方法，具体地涉及一种基于三孢布拉氏霉菌生物学特性、通过液体深层发酵实现番茄红素工业化大生产的方法。
背景技术
番茄红素(lycopene)是一种脂溶性不饱和碳氢化合物，是类胡萝卜素的一种，分子式为C40H56，相对分子质量为536.85，熔点为174℃(反式)，与β-胡萝卜素是同分异构体。番茄红素是许多类胡萝卜素生物合成的中间体，经过环化可形成其它类胡萝卜素，但在动物体内无法合成只能从食物中摄取。番茄红素是一种功能优越的类胡萝卜素，由于它卓越的生理功能，从而成为当前医药保健研究领域的热点之一。在自然界中番茄红素主要存在于番茄、石榴及西瓜等水果蔬菜中，尤其在番茄中，番茄红素占类胡萝卜素总量的80％左右。长期以来，由于番茄红素不是维生素A(VA)源，因而主要应用于食品添加剂行业，但近十年来的研究表明，番茄红素是所有类胡萝卜素中最强的单线态氧淬灭剂，它的抗氧化功能也优于其它类胡萝卜(如α-、β-胡萝卜素)。此外，大量研究表明番茄红素对肺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、消化道癌、乳腺癌等癌症均有抑制作用。美国哈佛药物学校和哈佛公众健康学校经过六年分别对47894名男性作了详细研究，研究表明在46种水果和蔬菜中，只有番茄产品对前列腺癌具有可度量的抑制作用。有实验表明每日服用6.5mg番茄红素可有效防治前列腺癌。动物细胞培养实验证明番茄红素可以抑制乳腺癌细胞的增殖和生长，动物实验表明经注射番茄红素的小白鼠患乳腺癌的几率明显低于对照组。随着研究的进一步深入，其潜在的应用前景正在受到人们的广泛关注。
现阶段，番茄红素的制备技术主要有三条路线，分别是化学合成法、天然产物提取法和微生物发酵法。三条技术路线比较如下：
| 天然产物提取法 | 化学合成法 | 微生物发酵法 | |
| 产品类别 | 天然番茄红素 | 化学合成番茄红素 | 天然番茄红素 |
| 产品安全性 | 无毒性，抗癌 | 过量使用有毒性，致癌 | 无毒性，抗癌 |
| 技术产业化水平 | 小批量生产 | 工业化 | 工业化 |
| 经济性 | 生产成本高 | 生产成本低 | 生产成本较低 |
番茄红素第一代生产技术采用的是天然产物提取法。这种方法从番茄中直接提取番茄红素，产品具有天然、绿色、无毒的优点。但由于其原料来源具有很大的局限性，不能进行大规模工业化生产，且生产成本很高。化学合成法是番茄红素第二代生产技术。化学合成法解决了原料来源的局限性，同时也降低了生产成本，适应了工业化生产的要求。但采用这种技术生产的产品，溶剂和重金属残留量高，过量食用时有对人体有毒副作用，可致癌。因此人们进一步寻求高品质、低成本的生产技术，微生物发酵法正是适应这一需求发展起来的。微生物发酵法生产的产品具有天然、绿色、无毒、无溶剂残留和无重金属残留的优点，且生产原料来源广泛而廉价，6％番茄红素油树脂生产成本(400-600元/kg)比天然产物提取法(1300-1500元/kg)低得多。
迄今研究发现，能够生产番茄红素的微生物包括细菌、真菌、藻类以及基因工程菌，其中，三孢布拉氏霉菌(lakeslea trispora)以其生长迅速生物量高、产β-胡萝卜素能力强在发酵法生产番茄红素方面展现出较好的工业化应用前景。三孢布拉氏霉菌是一种毛霉目、三孢菌属的丝状真菌，培养48h每1L发酵液可获50g以上的干菌体，培养5-6d总胡萝卜素的产量在1g/L以上。当使用番茄红素环化酶缺失的三孢布拉霉菌株或者在三孢布拉霉菌株发酵过程中加入专一的抑制环化酶活性的化学抑制剂可获得高产量的番茄红素，且番茄红素占总色素量的95％以上，产量远远高于天然产物提取法。因此，开发一种基于三孢布拉氏霉菌生物学特性、通过液体深层发酵实现番茄红素工业化大生产的方法显得尤为紧迫。
本申请的发明人经过近几年的潜心研究和对发酵法生产番茄红素生产经验的全面总结，设计了一种基于三孢布拉氏霉菌生物学特性、通过液体深层发酵实现番茄红素工业化大生产的方法，并在新疆瑞德莱福生物科技有限公司得到了实践验证，结果表明该方法是一种适用于番茄红素工业化大生产的高新生物技术。
发明内容
本发明的一个方面提供基于三孢布拉氏霉菌生物学特性的罐批发酵方法，该方法包括母种的茄子瓶斜面培养、种液的15L-150L-1500L种子罐扩大培养、正负菌1∶10混合的10m3发酵罐发酵培养。优选地，在番茄红素的罐批发酵的步骤中还包括将孢子囊用已灭菌的生理盐水洗脱接入一级种子培养基的接种方式，发酵结束番茄红素的产量在800mg/L。
其中，营养是决定三孢布拉氏霉菌发酵菌丝体生物量、番茄红素生物合成及β-胡萝卜素积累的关键因素。三孢布拉霉菌是一种产β-胡萝卜素的丝状真菌，β-胡萝卜素是由番茄红素经最后两步环化形成，所以有利于β-胡萝卜素积累的营养因子都将利于番茄红素的生物合成。研究发现，三孢布拉霉菌能在一定比例玉米粉、麦芽浸粉、黄豆粉、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸镁、VB1等原料制成的培养基上菌丝体长势良好、β-胡萝卜素积累量高。
溶氧量是影响三孢布拉氏霉菌菌丝体生长发育的重要因素。三孢布拉氏霉菌是一种嗜氧性微生物，研究发现，液体深层发酵通过调节转速、控制通气量和装液量可以有效的提高发酵液中的溶氧量。
温度是影响三孢布拉氏霉菌菌丝体生长发育的重要因素，也是番茄红素产量稳定的关键。三孢布拉氏霉菌是一种温度敏感型丝状真菌，菌丝体在25℃～30℃均能生长，但以28℃为最适，温度过低或过高，都不利用三孢布拉氏霉菌菌丝体的生长，也不利于番茄红素的生物合成。
pH值是影响三孢布拉氏霉菌番茄红素生物合成及β-胡萝卜素积累的重要因素。pH值是番茄红素环化形成β-胡萝卜素的重要条件，通过添加碳酸钠保持发酵液pH6.6以上有利于番茄红素的积累。
阻断剂是决定三孢布拉氏霉菌生物积累番茄红素的关键因素。三孢布拉氏霉菌液体深层发酵在适当的时间加入合适比例的阻断剂，将使发酵产物主要调控在番茄红素水平。研究发现，吡啶类化合物或三孢酸结构类似物都能明显刺激番茄红素的合成，其中，尤以在发酵2d后添加1.0g/L 2，6-二甲基吡啶或9.5×10-3mmol/L脱落酸阻断效果最好，大量积累番茄红素，几乎无β-胡萝卜素生成。
本发明的另一个方面提供基于番茄红素理化特性的后提取方法，该方法包括发酵产物的预处理、番茄红素的提取、浓缩、结晶、脱溶的步骤。优选地，在番茄红素后提取的步骤中还包括三次循环提取和三步脱溶的步骤，三次循环提取后番茄红素的提取率在85％以上，三步脱溶后番茄红素的溶剂残留量可控制在50ppm以内。
该方法已经在新疆瑞德莱福生物科技有限公司得到了实践验证，结果表明该方法是一种适用于番茄红素工业化大生产的高新生物技术。
具体实施方式
实施例1、基于三孢布拉氏霉菌生物学特性的罐批发酵方法
基于三孢布拉氏霉菌生物学特性的罐批发酵方法包括母种的茄子瓶斜面培养、种液的15L-150L-1500L种子罐扩大培养及正负菌1∶10混合的10m3发酵罐发酵培养几个阶段。经过茄子瓶恒温培养、温度刺激产孢量最大化后，用无菌接种环辅助生理盐水洗脱孢子悬液接种于一级种子罐，待菌丝生理成熟产孢量最大化后，进行移种逐级扩培，混种发酵培养。
(1)、茄子瓶斜面培养：用无菌接种环辅助10mL无菌水洗脱孢子，取0.2mL孢子悬液涂至平板固体培养基，28.5℃培养20h后挑单菌落接种至茄子瓶斜面固体培养基上，28.5℃培养，正菌培养2周、负菌培养3周可用；其中，固体培养基的成分为(w/v)：玉米粉4.7％、麦芽浸粉1.0％、琼脂粉0.8％，50℃温水调制定容，pH值灭菌前以6.4为宜，纱布、牛皮纸封口，121℃灭菌30min。
(2)、种液的15L-150L-1500L种子罐扩大培养：接种前2d将培养好的斜面母种置于18℃培养48h后，用无菌接种环辅助10mL已灭菌的生理盐水洗脱孢子囊，15个斜面母种的洗脱孢子悬液并瓶于1个250mL无菌三角瓶中，在火焰圈的保护下移种于装有10L种液培养基的15L气升式发酵罐中，28℃恒温培养48h，然后按10％的接种量接入装有100L种液培养基的150L搅拌釜式发酵罐中扩培，28℃恒温培养48h，接着对负菌同上操作按10％的接种量接入装有1000L种液培养基的1500L搅拌釜式发酵罐中扩培，28℃恒温培养48h；其中，150L、1500L搅拌釜式发酵罐的搅拌转速分别为400r/min和280r/min、空气流量分别为12m3/h和120m3/h，种液培养基的成分为(w/v)：玉米粉4.7％、黄豆粉2.3％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸镁500ppm、氯化钙50ppm、硫酸亚铁50ppm、硫酸锰50ppm、硫酸铜50ppm、VB14ppm，冷水调制定容，pH值灭菌前以6.4为宜，121℃灭菌30min。
(3)、正负菌1∶10混合的10m3发酵罐发酵培养：将经过扩培的正负菌按1∶10的比例接种于装有7m3发酵培养基的10m3搅拌釜式发酵罐中，28℃恒温发酵30h后按0.1％的量添加2，6-二甲基吡啶，再28℃恒温发酵72h结束发酵；其中，搅拌转速为200r/min、空气流量为840m3/h，发酵培养基的成分为(w/v)：玉米油10％、玉米粉1.925％、黄豆粉4.4％、磷酸二氢钾0.055％、磷酸氢二钠0.336％、磷酸二氢钠0.018％、VB10.4ppm，冷水调制定容，pH值灭菌前以7.5为宜，121℃灭菌30min。
实施例2、基于番茄红素理化特性的后提取方法
基于番茄红素理化特性的后提取方法包括发酵产物的预处理、番茄红素的提取、浓缩、结晶、脱溶几个阶段。经过罐批发酵得到的发酵产物经过离心脱水、球磨破壁等预处理后，打入提取罐，三次充分循环提取后经过减压浓缩、低温结晶、三步脱溶等处理后，得到番茄红素油树脂，以备6％、10％含量目标产品调配之需。
(1)、发酵产物的预处理
将经过罐批发酵获得的发酵产物50L装入200目的过滤袋中置于SS800三足式离心机中，在1200r/min的转速下离心30min，再按料液比1∶1.5加入无水乙醇，在上述相同工作转速下离心30min，收集干菌体。将得到的干菌体10Kg平均装入4个5L球磨罐中置于QM-2SP20-GL球磨机中，在700r/min的转速下破壁30min，收集破碎菌体。
(2)、番茄红素的循环提取及浓缩
将经过预处理的发酵产物400Kg按料液比1∶1加入400L乙酸乙酯平均打入700L 1、2号提取罐中，在60℃的提取温度、50r/min的转速下搅拌提取30min，然后将提取液放入暂存罐中，开启减压阀门在0.08Mpa的负压下提取液被倒吸入2.5m2刮膜式旋转蒸发器中在70℃、200r/min减压浓缩，蒸发的乙酸乙酯溶剂经过10m2冷凝器在-10℃液化回收到1.5m3溶剂回收罐中，得到的浓缩物打入结晶罐中结晶；然后计量400L乙酸乙酯再被平均打入1、2号提取罐中，在上述相同的提取条件下搅拌提取30min，然后先将1号提取罐的提取液放入暂存罐中，关闭阀门再将2号提取罐的提取液打入1号提取罐中，接着再将暂存罐中的提取液打入2号提取罐中，在上述相同的提取条件下搅拌提取30min，最后将1、2号提取罐中的提取液放入暂存罐中，开启减压阀门在0.08Mpa的负压下提取液被倒吸入2.5m2刮膜式旋转蒸发器中在70℃、200r/min减压浓缩，蒸发的乙酸乙酯溶剂经过10m2冷凝器在-10℃液化回收到1.5m3溶剂回收罐中，得到的浓缩物打入结晶罐中结晶。
(3)、番茄红素的低温结晶
将得到的浓缩物置于200L结晶罐中在-10℃结晶10d，然后放入12-15个50cm×50cm 100目的棉布袋中挂于300L存储罐中过滤3d，将得到的结晶物倒入30L不锈钢桶中以备后续脱溶。
(4)、番茄红素的三步脱溶
称量30Kg结晶物倒入脱溶锅中，按料液比2∶1加入无水乙醇，在60℃的脱溶温度、0.08MPa工作压力下减压脱溶4h-6h；然后按料液比4∶1加入葵色拉油，在上述相同的条件下减压脱溶24h；接着从脱溶锅底部通入N2，在上述相同的条件下减压脱溶1.5h。最后，收集番茄红素油树脂，以备6％、10％含量目标产品调配之需。
通过上述具体的实施例，更容易理解本发明。上述实施例只是举例性的描述，而不应当被理解为用来限制本发明的范围。
Claims (2)
1.一种基于三孢布拉氏霉菌生物学特性的发酵生产番茄红素罐批发酵方法，其特征在于：茄子瓶斜面培养：用无菌接种环辅助10mL无菌水洗脱孢子，取0.2mL孢子悬液涂至平板固体培养基，28.5℃培养20h后挑单菌落接种至茄子瓶斜面固体培养基上，28.5℃培养，正菌培养2周、负菌培养3周可用；其中，固体培养基的质量体积比为：玉米粉4.7％、麦芽浸粉1.0％、琼脂粉0.8％，50℃温水调制定容，pH值灭菌前为6.4，纱布、牛皮纸封口，121℃灭菌30min；种液的15L-150L-1500L种子罐扩大培养：接种前2d将培养好的斜面母种置于18℃培养48h后，用无菌接种环辅助10mL已灭菌的生理盐水洗脱孢子，15个斜面母种的洗脱孢子悬液并瓶于1个250mL无菌三角瓶中，在火焰圈的保护下移种于装有10L种液培养基的15L气升式发酵罐中，28℃恒温培养48h，然后按10％的接种量接入装有100L种液培养基的150L搅拌釜式发酵罐中扩培，28℃恒温培养48h，接着对负菌同上操作按10％的接种量接入装有1000L种液培养基的1500L搅拌釜式发酵罐中扩培，28℃恒温培养48h；其中，150L、1500L搅拌釜式发酵罐的搅拌转速分别为400r/min和280r/min、空气流量分别为12m3/h和120m3/h，种液培养基的质量体积比为：玉米粉4.7％、黄豆粉2.3％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸镁500ppm、氯化钙50ppm、硫酸亚铁50ppm、硫酸锰50ppm、硫酸铜50ppm、VB14ppm，冷水调制定容，pH值灭菌前为6.4，121℃灭菌30min；正负菌1∶10混合的10m3发酵罐发酵培养：将经过扩培的正负菌按1∶10的比例接种于装有7m3发酵培养基的10m3搅拌釜式发酵罐中，28℃恒温发酵30h后按0.1％的量添加2，6-二甲基吡啶，再28℃恒温发酵72h结束发酵；其中，搅拌转速为200r/min、空气流量为840m3/h，发酵培养基的质量体积比为：玉米油10％、玉米粉1.925％、黄豆粉4.4％、磷酸二氢钾0.055％、磷酸氢二钠0.336％、磷酸二氢钠0.018％、VB10.4ppm，冷水调制定容，pH值灭菌前为7.5，121℃灭菌30min。
2.一种基于番茄红素理化特性的发酵生产番茄红素后提取方法，其特征在于：发酵产物的预处理：将权利要求1中所述方法经过罐批发酵获得的发酵产物50L装入200目的过滤袋中置于SS800三足式离心机中，在1200r/min的转速下离心30min，再按料液比1∶1.5加入无水乙醇，在上述相同工作转速下离心30min，收集干菌体，将得到的干菌体10kg平均装入4个5L球磨罐中置于QM-2SP20-GL球磨机中，在700r/min的转速下破壁30min，收集破碎菌体；番茄红素的循环提取及浓缩：将经过预处理的发酵产物400kg按料液比1∶1加入400L乙酸乙酯平均打入700L1、2号提取罐中，在60℃的提取温度、50r/min的转速下搅拌提取30min，然后将提取液放入暂存罐中，开启减压阀门在0.08MPa的负压下提取液被倒吸入2.5m2刮膜式旋转蒸发器中在70℃、200r/min减压浓缩，蒸发的乙酸乙酯溶剂经过10m2冷凝器在-10℃液化回收到1.5m3溶剂回收罐中，得到的浓缩物打入结晶罐中结晶；然后计量400L乙酸乙酯再被平均打入1、2号提取罐中，在上述相同的提取条件下搅拌提取30min，然后先将1号提取罐的提取液放入暂存罐中，关闭阀门再将2号提取罐的提取液打入1号提取罐中，接着再将暂存罐中的提取液打入2号提取罐中，在上述相同的提取条件下搅拌提取30min，最后将1、2号提取罐中的提取液放入暂存罐中，开启减压阀门在0.08MPa的负压下提取液被倒吸入2.5m2刮膜式旋转蒸发器中在70℃、200r/min减压浓缩，蒸发的乙酸乙酯溶剂经过10m2冷凝器在-10℃液化回收到1.5m3溶剂回收罐中，得到的浓缩物打入结晶罐中结晶；番茄红素的低温结晶：将得到的浓缩物置于200L结晶罐中在-10℃结晶10d，然后放入12-15个50cm×50cm100目的棉布袋中挂于300L存储罐中过滤3d，将得到的结晶物倒入30L不锈钢桶中以备后续脱溶；番茄红素的三步脱溶：称量30kg结晶物倒入脱溶锅中，按料液比2∶1加入无水乙醇，在60℃的脱溶温度、0.08MPa工作压力下减压脱溶4h-6h；然后按料液比4∶1加入葵色拉油，在上述相同的条件下减压脱溶24h；接着从脱溶锅底部通入N2，在上述相同的条件下减压脱溶1.5h，最后，收集番茄红素油树脂，以备6％、10％含量目标产品调配之需。
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Free format text: FORMER OWNER: CUI JUNZHANG LEI MING Effective date: 20120112 Owner name: XINJIANG UNIVERSITY Free format text: FORMER OWNER: CHEN HENGLEI Effective date: 20120112 |
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Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 830008 URUMQI, XINJIANG UYGUR AUTONOMOUS REGION TO: 830046 URUMQI, XINJIANG UYGUR AUTONOMOUS REGION |
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Effective date of registration: 20120112 Address after: 830046 No. 14 Shengli Road, Xinjiang, Urumqi Applicant after: Xinjiang University Address before: 830008 No. 21 friendship north road, the Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi Applicant before: Chen Henglei Co-applicant before: Cui Junzhang Co-applicant before: Lei Ming |
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Application publication date: 20100922 Assignee: XINJIANG RUIDELAIFU BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Assignor: Xinjiang University Contract record no.: 2015650000023 Denomination of invention: Method for producing lycopene by fermentation of blakeslea trispora Granted publication date: 20130529 License type: Exclusive License Record date: 20150617 |
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