CN105925653B - 含有β-胡萝卜素的微胶囊及脂肪粉 - Google Patents
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Abstract
本发明提供含有β‑胡萝卜素的微胶囊或脂肪粉，所述β‑胡萝卜素由三孢布拉霉突变株发酵所获得，其特征在于：所述三孢布拉霉突变株于2014年8月8日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为：三孢布拉霉BT7251(+)CCTCC M 2014378;三孢布拉霉BT7603(‑)CCTCC M 2014379。本发明的三孢布拉霉突变株进行常规的发酵培养后，可获得较高产量的β‑胡萝卜素。同时，整个发酵工艺简单，便于控制，有利于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种含有β-胡萝卜素的微胶囊及脂肪粉。
背景技术
β-胡萝卜素是500多种胡萝卜素中的一种，是维生素A的前体，也称维生素A原，它的稀溶液呈橙黄色至黄色。β-胡萝卜素广泛存在于植物、藻类和真菌中，但动物和人体内不能合成胡萝卜素，必须从外界摄取。作为食品添加剂，β-胡萝卜素能起到色素和营养强化剂的作用，同时β-胡萝卜素是强力抗氧化剂，有抑制癌细胞增殖和提高机体免疫力等作用。独有的营养价值和药用疗效使胡萝卜素受到世界各国医学界和食品商的重视。
目前β-胡萝卜素的制备方法主要包括以下几种：一、化学合成，即采用有机化工原料，通过化学合成反应，人工合成β-胡萝卜素。化学合成法生产胡萝卜素技术复杂、难度大、活性低、毒性强，不能完全被人体吸收，并对人体产生一定程度的毒副作用，不少国家已限制使用。二、植物提取法，即从植物原料，例如胡萝卜等植物中采用有机溶剂，如石油醚、氯仿、丙酮、乙醚、乙醇等萃取β-胡萝卜素。但是，使用该方法需要消耗大量的原材料，且提取收率不高，很难适应于大规模的工业化生产。三、生物发酵法，即利用微生物培养技术，通过微生物的培养，利用微生物在其体内合成β-胡萝卜素，然后自微生物体内分离得到β-胡萝卜素。该方法的生产成本低，β-胡萝卜素产品纯度高，回收率高，可达90％以上。因此，采用微生物发酵法生产β-胡萝卜素有广阔的应用前景。特别的，用三孢布拉霉菌株发酵生产β一胡萝卜素，其工艺的安全性高，成本低廉，且着色能力强，因此受到生产厂商的格外青睐。
专利申请号为201210208891.0的中国专利申请公开了一种利用三孢布拉氏霉菌发酵制备β-胡萝卜素的方法，包括将三孢布拉氏霉菌ATCC14271(+)和ATCC14272(-)活化后，经过种子培养，在优选的发酵工艺条件下按一定的接种量和接种比接入发酵培养基中发酵，最终得到β-胡萝卜素含量较高的菌丝体。但是，使用该菌种制得的β-胡萝卜素产量较低，最高产量不超过1.3g/L。
发明内容
本发明的目的是提供一种含有β-胡萝卜素的微胶囊及脂肪粉。
为达到上述目的，本发明提供含有β-胡萝卜素的微胶囊，所述β-胡萝卜素由三孢布拉霉突变株发酵所获得，其特征在于：所述三孢布拉霉突变株于2014年8月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为：三孢布拉氏霉Blakeslea trispora BT7251(+)CCTCC M 2014378；三孢布拉氏霉Blakesleatrispora BT7603(-)CCTCC M2014379；或
含有β-胡萝卜素的脂肪粉，所述β-胡萝卜素由三孢布拉霉突变株发酵所获得，其特征在于：所述三孢布拉霉突变株于2014年8月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为：三孢布拉氏霉Blakesleatrispora BT7251(+)CCTCC M 2014378；三孢布拉氏霉Blakeslea trispora BT7603(-)CCTCC M 2014379。
本发明的有益效果在于：三孢布拉霉突变株进行常规的发酵培养后，可获得较高产量的β-胡萝卜素。同时，整个发酵工艺简单，便于控制，有利于工业化生产。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。
三孢布拉霉突变株的选育方法
1)取市售的三孢布拉霉正菌(保藏编号为：CCTCCAF97006(+))和三孢布拉霉负菌(保藏编号为:CCTCCAF96002(-))为出发菌株。
2)将两株出发菌株培养5天至孢子成熟。
3)通过纱布或滤纸过滤得到纯的孢子液，将孢子液注入到无菌培养皿，经无菌风风干，成为菌斑。将含菌斑的培养皿无菌移入高能粒子束注入机中，经过高能离子束注入诱变。
4)将正、负菌株的菌斑分别用无菌水洗脱，获得的正菌和负菌分别按照一对一的关系接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基平板上的距离中心1/3距离处，于27℃，湿度50％的恒温培养箱培养5天，此时可见正、负菌株匍匐菌丝在平板的中心处结合在一起，产生红色物质。
5)用30mm的打孔器将平板中心的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基取出，置于玻璃试管中捣碎，加入5ml的乙酸乙酯浸泡，直至琼脂的红色褪尽，取上层乙酸乙酯检测色素在455nm处的吸光值。
6)从吸光值较高样品中选出30个平板，进行第二轮高能离子束注入诱变，再进行第4和第5步的操作，得到吸光值较高的3个平板。
7)从3个平板中获得三株正、负菌株，3株正、负菌株进行液体摇瓶培养，根据摇瓶发酵培养的结果，筛选β-胡萝卜素含量最高的正、负菌株，获得本发明的三孢布拉霉突变株。该三孢布拉霉菌株于2014年8月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号：三孢布拉氏霉Blakeslea trispora BT7251(+)CCTCCM 2014378；三孢布拉氏霉Blakeslea trispora BT7603(-)CCTCC M 2014379。
8)它具有以下生理生化特性：
1、正、负菌生长于PDA斜面培养基，在27℃下生长2天后，在培养基表面会形成白色菌落，并进入对数生长期，正株菌丝浅黄色，负株菌丝鲜黄色，第4天菌丝布满整个斜面。
2、孢子形成于第3天，第4天布满整个斜面；正株孢子黑，较为疏松，负菌孢子较小，非常密集。
3、用于培养的培养基中可利用的碳源为：葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉等。可利用的氮源主要为酵母粉、酵母浸膏、酵母浸粉、黄豆饼粉或玉米粉。
本发明三孢布拉霉菌株的应用
以下均利用本发明的三孢布拉霉菌株作为起始菌种，使用不同的制备方法来制备β-胡萝卜素。
方法1
(1)菌种活化：无菌环境下将三孢布拉霉正、负菌株分别接种到斜面PDA培养基中，置于培养箱内，27℃培养5d，待三孢布拉霉正、负菌株分别长出孢子后，在无菌条件下，用无菌生理盐水将斜面培养基中孢子刮洗下来，并配制成均匀的孢子悬液，使正、负菌株孢子悬液的浓度分别达到：103～106个孢子/mL，103～106个孢子/mL。
(2)种子培养：正、负菌株分别以孢子悬液的方式接种到种子培养基中，种子培养基装在1000mL的三角瓶中，装液量100mL，培养温度为27℃，转速220r/min，正、负菌培养时间为18小时，得到三孢布拉霉正、负菌株种子液。
(3)种子扩大培养：最终发酵罐的体积为2m3，依次选用容积为10L，100L的种子罐扩大培养种子液，种子罐中培养基装量为60％(体积比)，将步骤(2)的摇瓶种子发酵液按照正、负菌株比例为1：10的比例接种到种子罐中进行种子扩大培养，其中种子培养基为：碳源为葡萄糖；氮源为酵母粉和玉米粉；无机盐为磷酸二氢钾、硫酸镁；植物油为：玉米油。
(4)发酵培养：种子罐中菌浓达到20％后，通过移种管道接入到装有1.2m3发酵培养基的2m3发酵罐中进行培养，发酵培养基同种子培养基配方，接种量5％(体积比)，温度：27℃±1℃；转速：200r/min；风量：2vvm；溶氧控制：20％以上；周期：120h；罐压:0.12Mpa。pH通过氢氧化钠调节到6.8，在72前流加40g/L的植物油。
(5)检测。
A、标准曲线制作
取10mgβ-胡萝卜素标准品，溶于1L乙酸乙酯中，制成母液。分别取2.5ml、5ml、7.5ml、10ml、12.5ml定容至25ml。测量β-胡萝卜素各浓度在455nm处的吸光值，根据吸光值和β-胡萝卜素的浓度做标准曲线y＝ax+b(x单位为mg/L)，R2＝0.999。
B、发酵液样品处理和检测
a.将取v1mL发酵液用纱布过滤并用压片机压干，得到湿菌体，称取湿菌体湿重，记录重量ω1。计算菌体湿重浓度c1(g/L)＝1000*w1/v1。
b.称取湿菌体0.02-0.03克，称重并记录重量w2(g)。
c.将称重后的湿菌体置于匀浆器中，在匀浆器中加入3ml乙酸乙酯研磨提取直至菌渣无色为止。
d.将提取液移入25毫升容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度并摇匀。
e.用1毫升胖肚吸管吸取1毫升上述溶液，转移至10毫升容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度摇匀。
f.用可见光分光光度计在454nm处检测样品吸光度y1。
g.根据吸光值以及标准曲线计算乙酸乙酯溶液中β-胡萝卜素的含量。
x1(mg/L)＝(y1-b)/a
h.β-胡萝卜素发酵产量计算公式为：P(g/L)＝x1*10*0.025*c1/w2/1000。
i.若无e步骤，则产量计算公式为P(g/L)＝x1*0.025*c1/w2/1000。
最终测得β-胡萝卜素发酵产量为3.2g/L。
方法2
(1)菌种活化：无菌环境下将三孢布拉霉正、负菌株分别接种到斜面PDA培养基中，置于培养箱内，27℃培养5d，待三孢布拉霉正、负菌株分别长出孢子后，在无菌条件下，用无菌生理盐水将斜面培养基中孢子刮洗下来，并配制成均匀的孢子悬液，使正、负菌株孢子悬液的浓度分别达到：103～106个孢子/mL，103～106个孢子/mL。
(2)种子培养：正、负菌株分别以孢子悬液的方式接种到种子培养基中，种子培养基装在1000mL的三角瓶中，装液量100mL，培养温度为27℃，转速220r/min，正、负菌培养时间为18小时，得到三孢布拉霉正、负菌株种子液。
(3)种子扩大培养：最终发酵罐的体积为12m3，依次选用容积为10L，100L，2m3的种子罐扩大培养种子液，种子罐中培养基装量为60％(体积比)，将步骤(2)的摇瓶种子发酵液按照正、负菌株比例为1：15的比例接种到种子罐中进行种子扩大培养，其中种子培养基为：碳源为葡萄糖；氮源为酵母浸粉和玉米粉；无机盐为磷酸二氢钾、硫酸镁；植物油为：棉籽油。
(4)发酵培养：种子罐中菌浓达到20％后，通过移种管道接入到装有7m3发酵培养基的12m3发酵罐中进行培养，发酵培养基同种子培养基配方，接种量15％(体积比)，温度：27℃±1℃；转速：200r/min；风量：2vvm；溶氧控制：25％以上；周期：120h；罐压:0.12Mpa。通过氢氧化钠调节到6.8，在72前流加40g/L的植物油。
(5)检测。
A、标准曲线制作
取10mgβ-胡萝卜素标准品，溶于1L乙酸乙酯中，制成母液。分别取2.5ml、5ml、7.5ml、10ml、12.5ml定容至25ml。测量β-胡萝卜素各浓度在455nm处的吸光值，根据吸光值和β-胡萝卜素的浓度做标准曲线y＝ax+b(x单位为mg/L)，R2＝0.999。
B、发酵液样品处理和检测
a.将取v1mL发酵液用纱布过滤并用压片机压干，得到湿菌体，称取湿菌体湿重，记录重量ω1。计算菌体湿重浓度c1(g/L)＝1000*w1/v1。
b.称取湿菌体0.02-0.03克，称重并记录重量w2(g)。
c.将称重后的湿菌体置于匀浆器中，在匀浆器中加入3ml乙酸乙酯研磨提取直至菌渣无色为止。
d.将提取液移入25毫升容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度并摇匀。
e.用1毫升胖肚吸管吸取1毫升上述溶液，转移至10毫升容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度摇匀。
f.用可见光分光光度计在454nm处检测样品吸光度y1。
g.根据吸光值以及标准曲线计算乙酸乙酯溶液中β-胡萝卜素的含量。
x1(mg/L)＝(y1-b)/a
h.β-胡萝卜素发酵产量计算公式为：P(g/L)＝x1*10*0.025*c1/w2/1000。
i.若无e步骤，则产量计算公式为P(g/L)＝x1*0.025*c1/w2/1000。
最终测得β-胡萝卜素发酵产量为3.5g/L。
方法3
(1)菌种活化；无菌环境下将三孢布拉霉正、负菌株分别接种到斜面PDA培养基中，置于培养箱内，27℃培养5d，待三孢布拉霉正、负菌株分别长出孢子后，在无菌条件下，用无菌生理盐水将斜面培养基中孢子刮洗下来，并配制成均匀的孢子悬液，使正、负菌株孢子悬液的浓度分别达到：103～106个孢子/mL，103～106个孢子/mL。
(2)种子培养；正、负菌株分别以孢子悬液的方式接种到种子培养基中，种子培养基装在1000mL的三角瓶中，装液量100mL，培养温度为27℃，转速220r/min，正、负菌培养时间为18小时，得到三孢布拉霉正、负菌株种子液。
(3)种子扩大培养；最终发酵罐的体积为45m3，依次选用容积为10L，100L，2m3，12m3的种子罐扩大培养种子液，种子罐中培养基装量为60％(体积比)，将步骤(2)的摇瓶种子发酵液按照正、负菌株比例为1：20的比例接种到种子罐中进行种子扩大培养，其中种子培养基为：碳源为葡萄糖；氮源为酵母粉和玉米粉；无机盐为磷酸二氢钾、硫酸镁；植物油为：毛豆油。
(4)发酵培养；种子罐中菌浓达到20％后，通过移种管道接入到装有25m3发酵培养基的50m3发酵罐中进行培养，发酵培养基同种子培养基配方，接种量20％(体积比)，温度：27℃±1℃；转速：200r/min；风量：2vvm；溶氧控制：30％以上；周期：120h；罐压:0.12Mpa。通过氢氧化钠调节到6.8，在72前流加40g/L的植物油。
(5)检测：
A、标准曲线制作
取10mgβ-胡萝卜素标准品，溶于1L乙酸乙酯中，制成母液。分别取2.5ml、5ml、7.5ml、10ml、12.5ml定容至25ml。测量β-胡萝卜素各浓度在455nm处的吸光值，根据吸光值和β-胡萝卜素的浓度做标准曲线y＝ax+b(x单位为mg/L)，R2＝0.999。
B、发酵液样品处理和检测
a.将取v1mL发酵液用纱布过滤并用压片机压干，得到湿菌体，称取湿菌体湿重，记录重量ω1。计算菌体湿重浓度c1(g/L)＝1000*w1/v1。
b.称取湿菌体0.02-0.03克，称重并记录重量w2(g)。
c.将称重后的湿菌体置于匀浆器中，在匀浆器中加入3ml乙酸乙酯研磨提取直至菌渣无色为止。
d.将提取液移入25毫升容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度并摇匀。
e.用1毫升胖肚吸管吸取1毫升上述溶液，转移至10毫升容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度摇匀。
f.用可见光分光光度计在454nm处检测样品吸光度y1。
g.根据吸光值以及标准曲线计算乙酸乙酯溶液中β-胡萝卜素的含量。
x1(mg/L)＝(y1-b)/a。
h.β-胡萝卜素发酵产量计算公式为：P(g/L)＝x1*10*0.025*c1/w2/1000。
i.若无e步骤，则产量计算公式为P(g/L)＝x1*0.025*c1/w2/1000。
最终测得β-胡萝卜素发酵产量:4.6g/L。
方法4
(1)菌种活化：无菌环境下将三孢布拉霉正、负菌株分别接种到斜面PDA培养基中，置于培养箱内，27℃培养5d，待三孢布拉霉正、负菌株分别长出孢子后，在无菌条件下，用无菌生理盐水将斜面培养基中孢子刮洗下来，并配制成均匀的孢子悬液，使正、负菌株孢子悬液的浓度分别达到：103～106个孢子/mL，103～106个孢子/mL。
(2)种子培养：正、负菌株分别以孢子悬液的方式接种到种子培养基中，种子培养基装在1000mL的三角瓶中，装液量100mL，培养温度为27℃，转速220r/min，正、负菌培养时间为18小时，得到三孢布拉霉正、负菌株种子液。
(3)种子扩大培养：最终发酵罐的体积为200m3，依次选用容积为10L，100L，5m3，50m3的种子罐扩大培养种子液，种子罐中培养基装量为60％(体积比)，将步骤(2)的摇瓶种子发酵液按照正、负菌株比例为1：25的比例接种到种子罐中进行种子扩大培养，其中种子培养基为：碳源为葡萄糖；氮源为酵母粉和豆饼粉；无机盐为磷酸二氢钾、硫酸镁；植物油为：毛棉油。
(4)发酵培养：种子罐中菌浓达到20％后，通过移种管道接入到装有120m3发酵培养基的200m3发酵罐中进行培养，发酵培养基同种子培养基配方，接种量25％(体积比)，温度：27℃±1℃；转速：200r/min；风量：2vvm；溶氧控制：35％以上；周期：120h；罐压:0.12Mpa。通过氢氧化钠调节到6.8，在72前流加40g/L的植物油。
(5)检测：
A、标准曲线制作
取10mgβ-胡萝卜素标准品，溶于1L乙酸乙酯中，制成母液。分别取2.5ml、5ml、7.5ml、10ml、12.5ml定容至25ml。测量β-胡萝卜素各浓度在455nm处的吸光值，根据吸光值和β-胡萝卜素的浓度做标准曲线y＝ax+b(x单位为mg/L)，R2＝0.999。
B、发酵液样品处理和检测
a.将取v1mL发酵液用纱布过滤并用压片机压干，得到湿菌体，称取湿菌体湿重，记录重量ω1。计算菌体湿重浓度c1(g/L)＝1000*w1/v1。
b.称取湿菌体0.02-0.03克，称重并记录重量w2(g)。
c.将称重后的湿菌体置于匀浆器中，在匀浆器中加入3ml乙酸乙酯研磨提取直至菌渣无色为止。
d.将提取液移入25毫升容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度并摇匀。
e.用1毫升胖肚吸管吸取1毫升上述溶液，转移至10毫升容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度摇匀。
f.用可见光分光光度计在454nm处检测样品吸光度y1。
g.根据吸光值以及标准曲线计算乙酸乙酯溶液中β-胡萝卜素的含量。
x1(mg/L)＝(y1-b)/a
h.β-胡萝卜素发酵产量计算公式为：P(g/L)＝x1*10*0.025*c1/w2/1000。
i.若无e步骤，则产量计算公式为P(g/L)＝x1*0.025*c1/w2/1000。
最终测得β-胡萝卜素发酵产量:5.2g/L。
从以上实施例可以看出，使用本发明三孢布拉霉正、负菌株突变株制备β-胡萝卜素，其工艺简单、β-胡萝卜素产量高，且便于进行工业化生产。
制备含有β-胡萝卜素的菌粉。
将以上任一方法所制得的β-胡萝卜素发酵液经离心或板框进行固液分离，得到湿菌体。按照以下参数使用离心喷雾的方式进行干燥即得β-胡萝卜素菌粉。
| 转盘转速rpm | 进料速度kg/h | 进风温度℃ | 出风温度℃ | 风量m<sup>3</sup>/h |
| 4000 | 70 | 190 | 80 | 3300 |
制备含有β-胡萝卜素的微生物油。
将以上任一方法所制得的β-胡萝卜素发酵液经离心或板框进行固液分离，得到湿菌体，加入1:10(m/v)的无水乙醇，混匀后用胶体磨循环破碎1小时，过滤得到乙醇滤液及破碎湿菌体。破碎湿菌体加入1:10(m/v)的乙酸乙酯，55摄氏度下萃取三次，每次1小时。每次过滤得到溶剂相及滤渣。收集溶剂相，真空脱溶后得到含β-胡萝卜素的微生物油。
制备含有β-胡萝卜素的晶体。
将前述制得的含有β-胡萝卜素的微生物油中加入1:1(m/v)的乙酸乙酯，在5摄氏度下缓慢搅拌结晶4小时，过滤，得到含有β-胡萝卜素粗晶体。进一步通过真空干燥脱除溶剂，得到含有β-胡萝卜素晶体成品。
制备含有β-胡萝卜素的油悬液。
将前述制得的β-胡萝卜素晶体成品按目标重量比(例如30％)与葵花籽油混合，抽真空，加热至150摄氏度，搅拌10分钟，待β-胡萝卜素熔融并混合均匀后，快速降温至室温。即制得β-胡萝卜素油悬液。
制备含有β-胡萝卜素的微胶囊。
首先，按照下述配方经3500rpm的剪切机剪切得到壁材溶液。
| 原材料 | 重量kg |
| 变性淀粉 | 30 |
| 固体玉米糖浆 | 25 |
| 麦芽糊精 | 25 |
| 抗坏血酸棕榈酸酯 | 2 |
| 维生素E | 2 |
| 纯水 | 90 |
然后，边剪切边加入前述制得的含有β-胡萝卜素的微生物油16kg，添加完后在8000rpm的转速下继续剪切10min。剪切结束后，在40MPa下进行均质，得到的均质液在下述条件下进行压力式喷雾即可得到β-胡萝卜素的微胶囊。
| 喷雾压力MPa | 进料速度kg/h | 进风温度℃ | 出风温度℃ | 风量m<sup>3</sup>/h |
| 10 | 100 | 220 | 90 | 5000 |
制备含有β-胡萝卜素的脂肪粉。
首先，将前述制得的含有β-胡萝卜素的微生物油16kg与DHA藻油10kg在常温下使用搅拌100rpm混合10min，得到混合油脂。
然后，按照下述配方经4500rpm的剪切机剪切得到壁材溶液。
| 原材料 | 重量kg |
| 变性淀粉 | 20 |
| 阿拉伯胶 | 10 |
| 固体玉米糖浆 | 20 |
| 麦芽糊精 | 20 |
| 抗坏血酸棕榈酸酯 | 2 |
| 维生素E | 2 |
| 纯水 | 90 |
接着，边剪切边加入前述制得的含有β-胡萝卜素和DHA的混合油26kg，添加完后在10000rpm的转速下继续剪切15min。剪切结束后，在40MPa下进行均质，得到的均质液在下述条件下进行离心喷雾即可得到β-胡萝卜素和DHA的混合脂肪粉。
| 转盘转速rpm | 进料速度kg/h | 进风温度℃ | 出风温度℃ | 风量m<sup>3</sup>/h |
| 5000 | 90 | 200 | 85 | 4500 |
Claims (2)
1.含有β-胡萝卜素的微胶囊，所述β-胡萝卜素由三孢布拉霉突变株发酵所获得，其特征在于：所述三孢布拉霉突变株于2014年8月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为：三孢布拉霉BT7251(+)CCTCC M 2014378；三孢布拉霉BT7603(-)CCTCC M 2014379；
所述微胶囊的制备方法包括以下步骤：
首先，按照下述配方经3500rpm的剪切机剪切得到壁材溶液：变性淀粉30重量份、固体玉米糖浆25重量份、麦芽糊精25重量份、抗坏血酸棕榈酸酯2重量份、维生素E 2重量份、以及纯水90重量份；
然后，边剪切边加入含有β-胡萝卜素的微生物油16重量份，添加完后在8000rpm的转速下继续剪切10min；剪切结束后，在40MPa下进行均质，得到的均质液在喷雾压力10MPa、进料速度100kg/h、进风速度220℃、出风速度90℃、以及风量5000m3/h的条件下进行压力式喷雾即可得到β-胡萝卜素的微胶囊；
所述含有β-胡萝卜素的微生物油的制备方法包括：将β-胡萝卜素发酵液经离心或板框进行固液分离，得到湿菌体，加入1:10m/v的无水乙醇，混匀后用胶体磨循环破碎1小时，过滤得到乙醇滤液及破碎湿菌体；破碎湿菌体加入1:10m/v的乙酸乙酯，55摄氏度下萃取三次，每次1小时；每次过滤得到溶剂相及滤渣；收集溶剂相，真空脱溶后得到含β-胡萝卜素的微生物油；
所述β-胡萝卜素发酵液采用以下方法中的一种制备得到：
方法1：
(1)菌种活化：无菌环境下将三孢布拉霉正、负菌株分别接种到斜面PDA培养基中，置于培养箱内，27℃培养5d，待三孢布拉霉正、负菌株分别长出孢子后，在无菌条件下，用无菌生理盐水将斜面培养基中孢子刮洗下来，并配制成均匀的孢子悬液，使正、负菌株孢子悬液的浓度分别达到：103～106个孢子/mL，103～106个孢子/mL；
(2)种子培养：正、负菌株分别以孢子悬液的方式接种到种子培养基中，种子培养基装在1000mL的三角瓶中，装液量100mL，培养温度为27℃，转速220r/min，正、负菌培养时间为18小时，得到三孢布拉霉正、负菌株种子液；
(3)种子扩大培养：最终发酵罐的体积为2m3，依次选用容积为10L，100L的种子罐扩大培养种子液，种子罐中培养基装量为60％体积比，将步骤(2)的摇瓶种子发酵液按照正、负菌株比例为1：10的比例接种到种子罐中进行种子扩大培养，其中种子培养基为：碳源为葡萄糖；氮源为酵母粉和玉米粉；无机盐为磷酸二氢钾、硫酸镁；植物油为：玉米油；
(4)发酵培养：种子罐中菌浓达到20％后，通过移种管道接入到装有1.2m3发酵培养基的2m3发酵罐中进行培养，发酵培养基同种子培养基配方，接种量5％体积比，温度：27℃±1℃；转速：200r/min；风量：2vvm；溶氧控制：20％以上；周期：120h；罐压:0.12Mpa；pH通过氢氧化钠调节到6.8，在72h前流加40g/L的植物油；
方法二：
(1)菌种活化：无菌环境下将三孢布拉霉正、负菌株分别接种到斜面PDA培养基中，置于培养箱内，27℃培养5d，待三孢布拉霉正、负菌株分别长出孢子后，在无菌条件下，用无菌生理盐水将斜面培养基中孢子刮洗下来，并配制成均匀的孢子悬液，使正、负菌株孢子悬液的浓度分别达到：103～106个孢子/mL，103～106个孢子/mL；
(2)种子培养：正、负菌株分别以孢子悬液的方式接种到种子培养基中，种子培养基装在1000mL的三角瓶中，装液量100mL，培养温度为27℃，转速220r/min，正、负菌培养时间为18小时，得到三孢布拉霉正、负菌株种子液；
(3)种子扩大培养：最终发酵罐的体积为12m3，依次选用容积为10L，100L，2m3的种子罐扩大培养种子液，种子罐中培养基装量为60％体积比，将步骤(2)的摇瓶种子发酵液按照正、负菌株比例为1：15的比例接种到种子罐中进行种子扩大培养，其中种子培养基为：碳源为葡萄糖；氮源为酵母浸粉和玉米粉；无机盐为磷酸二氢钾、硫酸镁；植物油为：棉籽油；
(4)发酵培养：种子罐中菌浓达到20％后，通过移种管道接入到装有7m3发酵培养基的12m3发酵罐中进行培养，发酵培养基同种子培养基配方，接种量15％体积比，温度：27℃±1℃；转速：200r/min；风量：2vvm；溶氧控制：25％以上；周期：120h；罐压:0.12Mpa；通过氢氧化钠调节到6.8，在72h前流加40g/L的植物油；
方法三：
(1)菌种活化；无菌环境下将三孢布拉霉正、负菌株分别接种到斜面PDA培养基中，置于培养箱内，27℃培养5d，待三孢布拉霉正、负菌株分别长出孢子后，在无菌条件下，用无菌生理盐水将斜面培养基中孢子刮洗下来，并配制成均匀的孢子悬液，使正、负菌株孢子悬液的浓度分别达到：103～106个孢子/mL，103～106个孢子/mL；
(2)种子培养；正、负菌株分别以孢子悬液的方式接种到种子培养基中，种子培养基装在1000mL的三角瓶中，装液量100mL，培养温度为27℃，转速220r/min，正、负菌培养时间为18小时，得到三孢布拉霉正、负菌株种子液；
(3)种子扩大培养；最终发酵罐的体积为45m3，依次选用容积为10L，100L，2m3，12m3的种子罐扩大培养种子液，种子罐中培养基装量为60％体积比，将步骤(2)的摇瓶种子发酵液按照正、负菌株比例为1：20的比例接种到种子罐中进行种子扩大培养，其中种子培养基为：碳源为葡萄糖；氮源为酵母粉和玉米粉；无机盐为磷酸二氢钾、硫酸镁；植物油为：毛豆油；
(4)发酵培养；种子罐中菌浓达到20％后，通过移种管道接入到装有25m3发酵培养基的50m3发酵罐中进行培养，发酵培养基同种子培养基配方，接种量20％体积比，温度：27℃±1℃；转速：200r/min；风量：2vvm；溶氧控制：30％以上；周期：120h；罐压:0.12Mpa；通过氢氧化钠调节到6.8，在72h前流加40g/L的植物油；
方法四：
(1)菌种活化：无菌环境下将三孢布拉霉正、负菌株分别接种到斜面PDA培养基中，置于培养箱内，27℃培养5d，待三孢布拉霉正、负菌株分别长出孢子后，在无菌条件下，用无菌生理盐水将斜面培养基中孢子刮洗下来，并配制成均匀的孢子悬液，使正、负菌株孢子悬液的浓度分别达到：103～106个孢子/mL，103～106个孢子/mL；
(2)种子培养：正、负菌株分别以孢子悬液的方式接种到种子培养基中，种子培养基装在1000mL的三角瓶中，装液量100mL，培养温度为27℃，转速220r/min，正、负菌培养时间为18小时，得到三孢布拉霉正、负菌株种子液；
(3)种子扩大培养：最终发酵罐的体积为200m3，依次选用容积为10L，100L，5m3，50m3的种子罐扩大培养种子液，种子罐中培养基装量为60％体积比，将步骤(2)的摇瓶种子发酵液按照正、负菌株比例为1：25的比例接种到种子罐中进行种子扩大培养，其中种子培养基为：碳源为葡萄糖；氮源为酵母粉和豆饼粉；无机盐为磷酸二氢钾、硫酸镁；植物油为：毛棉油；
(4)发酵培养：种子罐中菌浓达到20％后，通过移种管道接入到装有120m3发酵培养基的200m3发酵罐中进行培养，发酵培养基同种子培养基配方，接种量25％体积比，温度：27℃±1℃；转速：200r/min；风量：2vvm；溶氧控制：35％以上；周期：120h；罐压:0.12Mpa；通过氢氧化钠调节到6.8，在72h前流加40g/L的植物油。
2.含有β-胡萝卜素的脂肪粉，所述β-胡萝卜素由三孢布拉霉突变株发酵所获得，其特征在于：所述三孢布拉霉突变株于2014年8月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为：三孢布拉霉BT7251(+)CCTCC M 2014378；三孢布拉霉BT7603(-)CCTCC M 2014379；
所述脂肪粉的制备方法包括以下步骤：
首先，将含有β-胡萝卜素的微生物油16重量份与DHA藻油10重量份在常温下搅拌100rpm混合10min，得到混合油脂；
然后，按照下述配方经4500rpm的剪切机剪切得到壁材溶液：变性淀粉20重量份、阿拉伯胶10重量份、固体玉米糖浆20重量份、麦芽糊精20重量份、抗坏血酸棕榈酸酯2重量份、维生素E 2重量份、以及纯水90重量份；
接着，边剪切边加入含有β-胡萝卜素和DHA的混合油脂26重量份，添加完后在10000rpm的转速下继续剪切15min；剪切结束后，在40MPa下进行均质，得到的均质液在转盘转速5000rpm、进料速度90kg/h、进风速度200℃、出风速度85℃、以及风量4500m3/h条件下进行离心喷雾即可得到β-胡萝卜素和DHA的混合脂肪粉；
所述含有β-胡萝卜素的微生物油的制备方法包括：将β-胡萝卜素发酵液经离心或板框进行固液分离，得到湿菌体，加入1:10m/v的无水乙醇，混匀后用胶体磨循环破碎1小时，过滤得到乙醇滤液及破碎湿菌体；破碎湿菌体加入1:10m/v的乙酸乙酯，55摄氏度下萃取三次，每次1小时；每次过滤得到溶剂相及滤渣；收集溶剂相，真空脱溶后得到含β-胡萝卜素的微生物油；
所述β-胡萝卜素发酵液采用以下方法中的一种制备得到：
方法1：
(1)菌种活化：无菌环境下将三孢布拉霉正、负菌株分别接种到斜面PDA培养基中，置于培养箱内，27℃培养5d，待三孢布拉霉正、负菌株分别长出孢子后，在无菌条件下，用无菌生理盐水将斜面培养基中孢子刮洗下来，并配制成均匀的孢子悬液，使正、负菌株孢子悬液的浓度分别达到：103～106个孢子/mL，103～106个孢子/mL；
(2)种子培养：正、负菌株分别以孢子悬液的方式接种到种子培养基中，种子培养基装在1000mL的三角瓶中，装液量100mL，培养温度为27℃，转速220r/min，正、负菌培养时间为18小时，得到三孢布拉霉正、负菌株种子液；
(3)种子扩大培养：最终发酵罐的体积为2m3，依次选用容积为10L，100L的种子罐扩大培养种子液，种子罐中培养基装量为60％体积比，将步骤(2)的摇瓶种子发酵液按照正、负菌株比例为1：10的比例接种到种子罐中进行种子扩大培养，其中种子培养基为：碳源为葡萄糖；氮源为酵母粉和玉米粉；无机盐为磷酸二氢钾、硫酸镁；植物油为：玉米油；
(4)发酵培养：种子罐中菌浓达到20％后，通过移种管道接入到装有1.2m3发酵培养基的2m3发酵罐中进行培养，发酵培养基同种子培养基配方，接种量5％体积比，温度：27℃±1℃；转速：200r/min；风量：2vvm；溶氧控制：20％以上；周期：120h；罐压:0.12Mpa；pH通过氢氧化钠调节到6.8，在72h前流加40g/L的植物油；
方法二：
(1)菌种活化：无菌环境下将三孢布拉霉正、负菌株分别接种到斜面PDA培养基中，置于培养箱内，27℃培养5d，待三孢布拉霉正、负菌株分别长出孢子后，在无菌条件下，用无菌生理盐水将斜面培养基中孢子刮洗下来，并配制成均匀的孢子悬液，使正、负菌株孢子悬液的浓度分别达到：103～106个孢子/mL，103～106个孢子/mL；
(2)种子培养：正、负菌株分别以孢子悬液的方式接种到种子培养基中，种子培养基装在1000mL的三角瓶中，装液量100mL，培养温度为27℃，转速220r/min，正、负菌培养时间为18小时，得到三孢布拉霉正、负菌株种子液；
(3)种子扩大培养：最终发酵罐的体积为12m3，依次选用容积为10L，100L，2m3的种子罐扩大培养种子液，种子罐中培养基装量为60％体积比，将步骤(2)的摇瓶种子发酵液按照正、负菌株比例为1：15的比例接种到种子罐中进行种子扩大培养，其中种子培养基为：碳源为葡萄糖；氮源为酵母浸粉和玉米粉；无机盐为磷酸二氢钾、硫酸镁；植物油为：棉籽油；
(4)发酵培养：种子罐中菌浓达到20％后，通过移种管道接入到装有7m3发酵培养基的12m3发酵罐中进行培养，发酵培养基同种子培养基配方，接种量15％体积比，温度：27℃±1℃；转速：200r/min；风量：2vvm；溶氧控制：25％以上；周期：120h；罐压:0.12Mpa；通过氢氧化钠调节到6.8，在72h前流加40g/L的植物油；
方法三：
(1)菌种活化；无菌环境下将三孢布拉霉正、负菌株分别接种到斜面PDA培养基中，置于培养箱内，27℃培养5d，待三孢布拉霉正、负菌株分别长出孢子后，在无菌条件下，用无菌生理盐水将斜面培养基中孢子刮洗下来，并配制成均匀的孢子悬液，使正、负菌株孢子悬液的浓度分别达到：103～106个孢子/mL，103～106个孢子/mL；
(2)种子培养；正、负菌株分别以孢子悬液的方式接种到种子培养基中，种子培养基装在1000mL的三角瓶中，装液量100mL，培养温度为27℃，转速220r/min，正、负菌培养时间为18小时，得到三孢布拉霉正、负菌株种子液；
(3)种子扩大培养；最终发酵罐的体积为45m3，依次选用容积为10L，100L，2m3，12m3的种子罐扩大培养种子液，种子罐中培养基装量为60％体积比，将步骤(2)的摇瓶种子发酵液按照正、负菌株比例为1：20的比例接种到种子罐中进行种子扩大培养，其中种子培养基为：碳源为葡萄糖；氮源为酵母粉和玉米粉；无机盐为磷酸二氢钾、硫酸镁；植物油为：毛豆油；
(4)发酵培养；种子罐中菌浓达到20％后，通过移种管道接入到装有25m3发酵培养基的50m3发酵罐中进行培养，发酵培养基同种子培养基配方，接种量20％体积比，温度：27℃±1℃；转速：200r/min；风量：2vvm；溶氧控制：30％以上；周期：120h；罐压:0.12Mpa；通过氢氧化钠调节到6.8，在72h前流加40g/L的植物油；
方法四：
(1)菌种活化：无菌环境下将三孢布拉霉正、负菌株分别接种到斜面PDA培养基中，置于培养箱内，27℃培养5d，待三孢布拉霉正、负菌株分别长出孢子后，在无菌条件下，用无菌生理盐水将斜面培养基中孢子刮洗下来，并配制成均匀的孢子悬液，使正、负菌株孢子悬液的浓度分别达到：103～106个孢子/mL，103～106个孢子/mL；
(2)种子培养：正、负菌株分别以孢子悬液的方式接种到种子培养基中，种子培养基装在1000mL的三角瓶中，装液量100mL，培养温度为27℃，转速220r/min，正、负菌培养时间为18小时，得到三孢布拉霉正、负菌株种子液；
(3)种子扩大培养：最终发酵罐的体积为200m3，依次选用容积为10L，100L，5m3，50m3的种子罐扩大培养种子液，种子罐中培养基装量为60％体积比，将步骤(2)的摇瓶种子发酵液按照正、负菌株比例为1：25的比例接种到种子罐中进行种子扩大培养，其中种子培养基为：碳源为葡萄糖；氮源为酵母粉和豆饼粉；无机盐为磷酸二氢钾、硫酸镁；植物油为：毛棉油；
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1545923A (zh) * | 2003-12-03 | 2004-11-17 | 广州优宝工业有限公司 | 天然β－胡萝卜素微胶囊及其制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 添加水溶性微胶囊脂肪粉对断奶仔猪生长性能及消化率的影响;董森;《中国优秀硕士学位论文全文数据库，农业科技辑》;20090415(第04期);第9页第1.6节 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| CN105861323A (zh) | 2016-08-17 |
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